Carrera de Ingeniería Agronómica Cátedra de Microbiología Agrícola Año 2014

Serie Didáctica Microorganismos relacionados al ciclo biogeoquímico del carbono 1. Ciclo del Carbono A nivel mundial, el carbono se cicla a través de los cuatro depósitos principales de C: la atmósfera, los suelos, los océanos y otros ambientes acuáticos, así como los sedimentos y rocas de la corteza terrestre, siendo éste último el mayor depósito, con largo tiempo de renovación. Las formas más rápidas de transferencia global del carbono son por vía del CO2 de la atmósfera. Este constituye un depósito muy importante, con un tiempo de residencia muy corto. El carbono mineral en la forma de gas (CO2) es fijado a través de la fotosíntesis por las plantas verdes y algunos microorganismos en forma de carbohidratos, proteínas, lípidos y otros compuestos orgánicos. Estos compuestos orgánicos son incorporados al suelo por aportes de los restos vegetales, animales y de microorganismos y por aportes de exudados de las raíces vivas (rizodepósitos), denominándose a esta materia orgánica del suelo “materia orgánica fresca”, diferenciándose así de la “materia orgánica nativa o humus”, formada por procesos de descomposición y resíntesis. La composición química de los compuestos orgánicos, que se incorporan al suelo, tiene como elemento predominante al C con tenores de hasta 60%, y el N varía entre 0,13 a 15%. La composición química elemental (C, N; P; S y K) de algunas plantas, organismos y residuos se representa en la tabla 1. Tabla 1. Análisis elemental de la materia seca de algunas plantas, organismos y residuos Material orgánico Bacteria Actinomicete Hongo Lombriz Alfalfa Maíz Madera Estiércol

C

N

50 50 44 46 44 45 …. 37

15 11 3,4 10 1,4 3,3 0,13 2,8

P % 3,2 1,5 0,6 0,9 0,2 0,28 0,006 0,54

S

K

1,1 0,4 0,4 0,8 0,17 0,44 0,005 0,7

…. 1,8 0,6 1,1 0,9 0,9 0,03 5,1

Todos estos componentes, de origen biológicos, no se acumulan indefinidamente, ya que son sometidos a una serie de procesos que conducen a su biodegradación con participación de equipos enzimáticos especializados de los microorganismos, principales responsables de esa descomposición y cuya biomasa microbiana está renovándose permanentemente. De los restos orgánicos incorporados al suelo, parte se utiliza para mantener el crecimiento de la biomasa microbiana, parte es transformada en sustancias minerales solubles o gaseosas (mineralización) y parte se estabiliza en forma de sustancias humificadas 1 Cátedra de Microbiología Agrícola-FAyA-UNSE. 2014. Prof Titular Ing Msc Ada Albanesi; JTP Ing. Mag. Analia Anriquez; Ayud. Prof. Ing. Juan Silberman

(humificación). En todos estos procesos intervienen los microorganismos desempeñando un rol clave en el ciclo del C. Los microorganismos que participan en la fijación de C son aquellos capaces de reducir el CO2, entre los que se encuentran algas, bacterias fotosintéticas (cianobacterias) y bacterias quimioautótrofas. Por otra parte, la mineralización del C, es catalizada por enzimas pertenecientes a diferentes grupos fisiológicos entre los cuales se encuentran celulolíticos, amilolíticos, ligninolíticos, entre otros, que participan en la degradación de los constituyentes orgánicos que llegan al suelo (Tabla 2). Tabla 2. Componentes orgánicos del carbono que ingresa al suelo, enzimas actuantes y productos. Componentes Celulosa, Hemicelulosa Pectina

Enzimas celulasa, glucosidasas, hemicelulasas pectinmetilesterasa, galacturonasa

Almidón Quitina Ac. nucleicos

amilasas, glucosidasas quitinasa, quitinobiasa nucleasas, nucleosidasa, nucleotidasa, aminohidrolasa proteinasa, peptidasa, deshidrogenasas y oxidasas fosfatasas, fitasas arilsulfatasas lacasa, peroxidasa, fenoloxidasa

Proteínas y péptidos Ésteres fosfatados Ésteres sulfatados Lignina

Productos ác. orgánicos, azúcares, ác. urónicos ác. péctico, etanol, ác. galacturónico, glucosa, arabinosa glucosa, maltosa glucosamina, ác. acético, glucosa, NH3 bases nitrogenadas, PO4-3 aminoácidos, ác. orgánicos, NH3 alcohol, inositol, HPO4-2 alcohol, SO4ác. aromáticos, compuestos fenólicos

El contenido de C de los suelos varía, con los tipos pedológicos, las regiones climáticas, prácticas de manejo, vegetación, etc. Los valores oscilan entre 1 y 3% en suelos minerales, 6 a 10% en praderas y, en turbas, los valores superan el 30-40% del peso seco de las mismas. Entre los compuestos carbonados degradados por los microorganismos del suelo se encuentran la celulosa, la hemicelulosa, la quitina, y el almidón. A continuación se describen los tres procesos más importantes: 2. Biodegradación 2.1. Celulólisis. Es el proceso biológico de la degradación de la celulosa. La celulosa es uno de los constituyentes vegetales más importantes, representando un 15 % del peso seco de las leguminosas y gramíneas jóvenes y más del 50 % en materiales leñosos. La celulosa interviene en la formación del suelo, del humus y, además, es de gran aplicación industrial. 2.2.1. Constitución de la celulosa La celulosa es el compuesto orgánico más abundante incorporado al suelo. Es el principal polisacárido constituyente de la pared celular de las células vegetales. La celulosa consiste en moléculas extremadamente largas, sin ramificar, formadas por una serie de unidades de D-glucosa, de 2000 a 10.000 y hasta a veces más de 15000, según la especie vegetal. Estas glucosas están unidas mediante una unión β entre el carbono 1 (C1) de una glucosa y el C4 de la siguiente (Figura 1).

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Figura 1. Estructura de la celulosa Es insoluble en agua, ácidos y álcalis diluidos. Soluble en ácidos y álcalis concentrados. La glucosa, celobiosas, y celulosas sustituídas (carboxi-metil celulosa y carboxietilcelulosa por ejemplo) son solubles en agua. Dentro del vegetal, las cadenas de celulosa se asocian a otras mediante uniones puente de hidrógeno, formando fibrillas, entre las cuales se distinguen mallas cristalinas (altamente ordenadas que le dan la característica de insolubilidad, rigidez y resistencia al ataque enzimático) separadas por regiones amorfas. Las mallas están fuertemente unidas por puentes H o por fuerzas de Van der Waals. Según la estructura, la orientación de las fibrillas, la proporción de constituyentes secundarios, la celulosa se comporta de manera diferente frente a la biodegradación. Las fibrillas están cementadas por una matriz constituida por otros polimeros: las hemicelulosas y la pectina. En paredes secundarias se encuentra la lignina. 2.2.2. Microorganismos celulolíticos Los microorganismos que atacan la celulosa están distribuidos en toda la sistemática: bacterias, actinomicetos, hongos y protozoos, que presentan un complejo enzimático, conocido como celulasa. Las especies celulolíticas no son muy numerosas dentro de cada grupo y llegan de distinta manera a la celulosa. En bacterias se pueden agrupar tres grupos fisiológicos: a) anaeróbicos fermentativos: Gram positivos (Clostridium, Ruminococus) Gram negativos (Acetivibrio). b) bacterias aeróbicas Gram-positivas; Cellulomonas y Thermobifida c) bacterias aeróbicas deslizantes. Pertenecientes a los grupos Cytophaga y Sporocytophaga, están ampliamente distribuidos en suelos y aguas. Degradan la celulosa formando colonias diseminadas y no producen enzimas solubles sino que las celulasas permanecen unidas a las células. Entre las bacterias existen diferencias en la estrategia de degradación de celulosa, según se trate de los grupos aeróbicos o anaeróbicos. Con algunas excepciones, los anaeróbicos degradan celulosa a través de un complejo enzimático celulósico (celulosomas). Los grupos aeróbicos, incluyendo los hongos, degradan la celulosa a través de la excreción de celulasas extracelulares libres o asociadas a la célula. Los componentes de estos sistemas celulósicos pueden clasificarse según su acción catalítica y se pueden encontrar tres tipos de actividades enzimáticas: a) Endoclucanasas: actúan en las porciones amorfas de las fibras de celulosa y rompen los enlaces β -1,4 glucosídicos generando oligosacáridos de distintas longitudes. b) Exoglucanasas que incluyen celodextrinasas y celobiohidrolasas. Actúan en los extremos reductores y no reductores de la celulosa liberando glucosa (glucanohidrolasas) o celobiosa (celobiohidrolasa). c) B-glucosidasa: hidrolizan las unidades de celobiosa en monómeros de glucosa. Estos tres sistemas actúan de forma cooperativa en la degradación de celulosa 3 Cátedra de Microbiología Agrícola-FAyA-UNSE. 2014. Prof Titular Ing Msc Ada Albanesi; JTP Ing. Mag. Analia Anriquez; Ayud. Prof. Ing. Juan Silberman

2.2.3. Mecanismos de acción Los microorganismos utilizan diferentes mecanismos para llevar a cabo la hidrólisis de la celulosa. Los hongos celulolíticos tienen la capacidad de penetrar en los residuos celulósicos y excretan las celulasas en sitios internos de las partículas celulósicas. En estos sistemas las enzimas no forman complejos y son denominados sistemas no agregativos. Por el contrario, las bacterias anaeróbicas carecen de la capacidad de penetrar en este material y presentan sistemas agregativos. a) No agregativos: estos sistemas están compuestos por tres tipos de enzimas: i) β -1,4-endoglucanasas ii) Celobiohidrolasas y iii) β -glucosidasas b) Agregativos: los microorganismos que forman complejos celulósicos (celulosomas) se encuentran en general, en ambientes anaeróbios donde existen formando consorcios con otros microorganismos celuloliticos o no. En bacterias anaeróbias pertenecientes a los géneros Clostridium, Acetivibrio, Bacteroides y Ruminococcus, las enzimas que participan en la degradación de la celulasa se encuentran localizadas en la superficie formando estos complejos multienzimáticos extracelulares denominados celulosomas. En hongos: una espora del hongo celulolítico se pone en contacto con la planta o un fragmento de madera, germina y penetra en la celulosa a través de la cutícula externa y la pared celular. Las divisiones se hacen sobre todo en la célula y la digestión de las membranas por el interior. El ataque es entonces, de adentro hacia afuera. Las enzimas son exocelulares y pueden actuar a distancia. En actinomycetes: el ataque también se produce de adentro hacia afuera. En bacterias: se observan a nivel de las regiones amorfas, pero no penetran en el lumen de las fibras, salvo que éstas estén lesionadas. Actúan por íntimo contacto, ya sea de la bacteria o de la enzima que segrega (exoenzima). Sólo penetran las bacterias móviles. Las enzimas son inducibles o adaptativas, y en los hongos son constitutivas. Las enzimas constitutivas están previstas dentro del complejo enzimático, se forman siempre, sea cual fuere la naturaleza del ambiente. Las inducibles se sintetizan sólo en respuesta a la presencia en el medio de compuestos específicos, conocidos con el nombre de inductores. 2.2.4. Condiciones ecológicas que regulan el proceso de celulólisis en el suelo.  Temperatura: existen representantes mesófilos, termófilos, psicrófilos. Puede fluctuar de 5ºC a 50ºC, pero lo óptimo es de 28ºC. En el suelo la mayoría de las especies son mesófilas.  pH: la flora celulolítica es muy amplia, de manera que a cada pH hay un grupo de microorganismos actuantes. A pH bajo se ven favorecidos los hongos, a pH neutro o básico, las bacterias. Los menos afectados por cambios de pH son las bacterias anaerobias.  Humedad y aereación: se necesita óptimas condiciones de humedad, ya que las enzimas que actúan son hidrolíticas. El proceso es más lento en suelos anegados o suelos con pobre intercambio de gases.  Sustancias asociadas: la lignina retrasa el proceso, dificulta la acción enzimática. Se la separa por medio de álcalis, acelerando la degradación. La pectina y la hemicelulosa favorecen la degradación, actúan como factores de crecimiento. También algunas proteínas como las lactoglobulinas. Algunos colorantes, especialmente los ácidos, en baja concentración, estimulan la actividad enzimática.  Celulosa y balance de nitrógeno: la descomposición biológica de la celulosa es acompañada de un consumo nitrogenado por los microorganismos en donde el carbono de la celulosa es utilizado para los requerimientos energéticos. 4 Cátedra de Microbiología Agrícola-FAyA-UNSE. 2014. Prof Titular Ing Msc Ada Albanesi; JTP Ing. Mag. Analia Anriquez; Ayud. Prof. Ing. Juan Silberman

Aproximadamente, la relación de la celulosa descompuesta con el N asimilable es de 30/1, es decir que para metabolizar 30 g. de celulosa los microbios deben tener a su disposición 1 g de N totalmente asimilable. El rendimiento de utilización del C es de alrededor del 20 al 30 %, por cada 100 g de celulosa descompuesta hay síntesis de 20 a 30 g de sustancia celular. Estos rendimientos son distintos para hongos (más elevados) y para bacterias (más débiles). Si se introduce material vegetal en el suelo, de acuerdo al contenido de nitrógeno que lleve el material, será distinto la velocidad de degradación de la celulosa. Si la cantidad de N es menor que 1,2 %, es pobre en nitrógeno, el proceso no puede llevarse a cabo si no se suministra nitrógeno extra. Si la cantidad de nitrógeno va de 1,3 a 1,8 % es óptimo. No se toma N del suelo y la descomposición es rápida. Si la cantidad es mayor de 1,8 %, hay pérdidas por amonificación. 2.3. Amilólisis El almidón representa una reserva para los vegetales en tallos, bulbos, rizomas, frutos y semillas. Es un polímero de alfa glucosa en uniones α 1-4 y 1-6 de amilosa y amilopectina (Figura 2).

Figura 2. Estructura del amidón La biodegradación en el suelo es rápida, mayor velocidad de desaparición que la celulosa, hemicelulosa y otros polisacáridos, y se realiza tanto en aerobiosis como en anaerobiosis. 2.3.1. Microflora amilolítica: La microflora es abundante, una multiplicidad de bacterias poseen las enzimas específicas, son Gram positivas o Gram negativas, esporuladas o asporógenas, aerobias o anaerobias. Bacterias: Achromobacter, Bacillus, Clostridium, Micrococcus, Pseudomonas, Flavobacterium, Cytophaga, Serratia, Sarcina. Actinomicetes: Micromonospora, Nocardia, Streptomyces. Hongos: Aspergillus, Fusarium, Rhizopus. 2.3.2. Proceso enzimático: La hidrólisis es catalizada por amilasas inducibles. Se reconocen tres tipos: α amilasa, β amilasa y una glucosidasa. La α amilasa es una endoenzima que actúa sobre la amilosa y la amilopectina. Con amilosa se acumulan grandes cantidades de maltosa y pequeñas cantidades de glucosa y maltotriosa. β amilasa es una exoenzima, que actúa desde los extremos de la molécula, liberando maltosa, dextrina y oligosacáridos; y la glucosidasa lo transforma en glucosa, asimilada por las células. 2.3.3. Ecología: El almidón es descompuesto en todos los tipos de suelos por acción de una microflora poco específica. La composición de la población estará condicionada a las características del medio: temperatura, aeración, pH, etc. 5 Cátedra de Microbiología Agrícola-FAyA-UNSE. 2014. Prof Titular Ing Msc Ada Albanesi; JTP Ing. Mag. Analia Anriquez; Ayud. Prof. Ing. Juan Silberman

2.4. Degradación de lignina La lignina constituye otro polímero natural muy importante responsable del 25% de la fitomasa seca producida anualmente en la biósfera. Se encuentra en tejidos esenciales como el xilema y el esclerénquima y está asociada íntimamente con la celulosa. Las dificultades para su extracción y purificación son enormes por lo que los datos cuantitativos presentados en la bibliografía son aleatorios, se citan valores de 18 – 35 % en bosques, 21-31 % en pajas, y hasta 35% en mantillos forestales. Como se aprecia, importantes cantidades de esta sustancia fuertemente polimerizada e insoluble en agua, deben ser degradadas cada año. Las ligninas no constituyen un compuesto homogéneo de compuestos y su estructura varía con los vegetales y, dentro de una especie, con su grado de madurez. Resisten la hidrólisis ácida en agua caliente y solventes orgánicos pero se solubilizan en álcalis. La lignina es un derivado modificado del benceno y contiene solo 3 elementos: C, H y O. La estructura básica es aromática, formada por polímeros de unidades fenil propano con grupos hidroxilos y carbonilos. 2.4.1. Microflora ligninolítca: La microflora ligninolítca degrada lingnina para alimentarse de la celulosa de la madera. Se piensa que la degradación de la lignina brinda muy poca energía al microorganismo, suficiente para vivir pero no para crecer. Esto explica la ausencia de un mecanismo ezimático específico para la despolimerzación de la lignina. Se piensa que también intervienen procesos degradativos de naturaleza química. El nivel de enzimas que participan es bajo y algunos autores sugieren que el proceso estaría mediatizados por:  Oxigenasas, que rompen anillos aromáticos, fenol oxidasas, lacasas, tirosinasas peroxidasas. Las formación de radicales libres por acción de fenol oxidasas puede ocasionar ruptura de enlaces entre anillos aromáticos y la cadena lateral con propano  Celobiosa: quinona reductasa, activa la degradación de celulosa y lignina por hongos de la podredumbre blanda En ambientes aeróbicos, el polímero de lignina es degradado biológicamente por enzimas no específicas a productos más simples y CO2 o sufre una complexación con otros constituyentes para formar humus. En ambientes anaeróbicos, la lignina y el humus son difíciles de degradar (recalcitrantes), se acumulan y contribuyen a la formación de turberas. Los hongos imperfectos y los basidiomicetes son los microorganismos más activos en la degradación de lignina. Descubrimientos recientes reportaron la presencia de enzimas peroxidasas ligninoliticas en hongos ectomicorrícicos y el potencial de degradación de lignina de Alfaproteobacterias, Gammaproteobacterias y Actinomicetes. 3. Bibliografía consultada Frioni, L. 2006. Microbiología: Básica, ambiental y agrícola. Facultad de Agronomía. Universidad Nacional de la República, Uruguay. Baldrian, P., Lindahl, B. 2011. Decomposition in forest ecosystems: after decades of research still novel findings. Fungal Ecology 4: 359-361 De Angelis, K., Allgaier, M., Chavarria, Y., Fortney, Y., Hugenholtz, P., Simmons, B., Sublette, K., Silver, W., Hazen, T. 2011. Characterization of Trapped LigninDegrading Microbes in Tropical Forest Soil. PLoS ONE 6(4): e19306. doi:10.1371/journal.pone.0019306 Cerri, C.C., F. Andreux, B.P. Eduardo. 1992. O ciclo do carbono no solo. Em Microbiologia do solo, (coord) Cardoso, E.J.B:N., S.M.Tsai, M.C.P. Neves. Campinas, Sociedade Brasileira de Ciência do Solo.

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Castillo Rodríguez F., M.D.Roldan Ruiz, R. Blasco Plá, M.J. Huertas Romera, F. J. Caballero Domínguez, C. Moreno-Vivián, M. Martinez Luque-Romero. 2005. Biotecnología ambiental. Editorial Tebar, S.L., Madrid. 616 pag.

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Guía de Trabajo Práctico Nº5 Cuantificación y diversidad de grupos funcionales relacionado con el ciclo del C Objetivos: Que el estudiante:

- Aprenda a cuantificar y evaluar diversidad de grupos fisiológicos de microorganismos que participan en la degradación de compuestos carbonados, tales como almidón y celulosa. - Conozca el importante rol de la microflora del suelo en los ciclos biogeoquímicos. Actividades 1) Determinar presencia de microorganismos celulolíticos sobre tierra empastada. a- Colocar suelo en cajas de Petri con humedad suficiente, y aplicar un disco de papel de filtro sobre la superficie. Incubar en cámara húmeda a 28ºC, 5 días. b- Observar el desarrollo entre el cuarto y quinto día de la siembra, pudiendo aparecer fundamentalmente dos tipos de colonias: i- colonias brillantes, de color ocre, anaranjado o amarillo, poco extendidas que atacan intensamente el papel, posiblemente pertenece al género Cytophaga. ii- colonias opacas, de diversos colores que atacan poco el papel, posiblemente se trate de Cellvibrio. Además podrán aparecer desarrollo fúngico que cubren en gran extensión el papel. c- ¿Cuántos morfotipos observa? ¿Los mismos permiten una primera aproximación de la diversidad genética de los microorganismos celulolíticos? ¿Por qué? 2) Determinar UFC de microorganismos celulolíticos aerobios de un suelo A. Realizar diluciones- suspensiones de suelo de 10-1 a 10-5 (dos suelos con diferente uso). De cada dilución sembrar 0,1 mL en cajas de Petri en medio sólido CMC: (K2HPO4, 1,67g; KH2PO4, 0,87 g; NaCl, 0,05g; MgSO4.7H2O, 0,1g; CaCl2, 0,04g; FeCl2, 0,004g; Na2MoO4.2H2O, 0,005g; biotina, 0,01g; ácido nicotínico, 0,02g; ácido pantoténico, 0,01g; NH4Cl, 1g; agar 15 g; carboximetil celulosa, 10g; H2O, 1000 mL, pH 7) con 3 repeticiones e incubar a 30 ºC durante 24 – 48 hs. 3) Determinar el número más probable de microorganismos amilolíticos de un suelo Realizar suspensiones-diluciones de suelo (dos suelos con diferente uso) de 10-1 a 10-10. Sembrar 1 mL de cada dilución con 3 repeticiones en medio líquido para amilolíticos (nitrato de amonio 1 g, almidón soluble 1,5 g, extracto de suelo 10 mL, solución salina estándar 10 mL, solución de oligoelementos 1 mL, agua destilada 1000 mL). Incubar a 30 ºC durante 7 días. a- Observar los tubos incubados ¿Cómo se manifiesta el crecimiento de microorganismos amilolíticos? d- Determinar el número de microorganismos amilolíticos por gramo de suelo, empleando la tabla de Mc Crady (Tabla 1). 8 Cátedra de Microbiología Agrícola-FAyA-UNSE. 2014. Prof Titular Ing Msc Ada Albanesi; JTP Ing. Mag. Analia Anriquez; Ayud. Prof. Ing. Juan Silberman

4) De las colonias aisladas en medio sólido se realizó la extracción de ADN de 25 colonias tomadas al azar y se amplificó mediante PCR la región que codifica para el ARNr 16S. Posteriormente se realizó la secuenciación. a- Usando las secuencias de ARNr 16S provistas por la cátedra (en archivo adjunto) correspondientes a los datos de secuenciación de las 25 colonias, ingresar a la web de National Center for Biotechnology Information para identificar el microorganismo. b- ¿Qué nivel de resolución ofrece 16S? c- Calcular el índice de diversidad de Shannon. d- ¿Qué importancia tiene la diversidad microbiana en la ecología de suelos?

Tabla 1. Tabla de MC Crady (3 tubos/dilución) Nºcaracterístico 000 001 010 011 020 100 101 102 110 111 120 121 130 200

Nº microorg 0,0 0,3 0,3 0,6 0,6 0,4 0,7 1,1 0,7 1,1 1,1 1,5 1,6 0,9

Nºcaracterístico 201 202 210 211 212 220 221 222 223 230 231 232 300 301

Nº microorg 1,4 2,0 1,5 2,0 3,0 2,0 3,0 3,5 4,0 3,0 3,5 4,0 2,5 4,0

Nºcaracterístico 302 310 311 312 313 320 321 322 323 330 331 332 333

Nº microorg 6,5 4,5 7,5 11,5 16,0 9,5 15,0 20,0 30,0 25,0 45,0 110,0 140,

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