Reproducción Animal Laboratorio 10 Diluyentes y Extensión del Semen Objetivos: Estudiar la preparación de diluyentes y la extensión del semen. Nota: el término generalmente usado es dilución, pero es preferible extensión de semen, ya que los espermatozoides permanecen individualmente inalterados, pero se reduce su número por volumen dado de semen. En esta discusión se usarán indistintamente ambos términos.

Información previa: El objeto de un medio de dilución o extensión del semen, es incrementar el volumen del eyaculado para que un gran volumen de vacas puedan ser inseminadas por un determinado reproductor. Un diluyente apropiado no solamente debería incrementar el volumen del eyaculado, sino también debería ayudar en la preservación y longevidad de los espermatozoides. El semen puede ser extendido entre 30 a 250 veces, dependiendo del número de espermatozoides presentes en el eyaculado original y el del conocimiento de la fertilidad (basado en registros de servicio) del reproductor en cuestión. La extensión del semen es una de las ventajas de la inseminación artificial. En el servicio natural, un eyaculado podría fertilizar una vaca, pero en la I.A. y el uso de diluyentes, un eyaculado puede ser usado para 300 a 1.000 vacas. Como el espermatozoide no sobrevive por un periodo largo de tiempo, aún a bajas temperaturas, es necesario que el extensor sea utilizado para mejorar o mantener el medio alrededor del espermatozoide, proporcionando una fuente de energía, proveyendo protección contra los productos del metabolismo espermático y los cambios de temperatura. Un diluyente deseable debería: 1) poveer energía y nutrientes al espermatozoide, 2) proveer acción amortiguadora del pH para compensar los cambios debido a la formación de ácido láctico, 3) proveer protección contra el enfriamiento rápido y el shock térmico, 4) mantener una presión osmótica óptima y el balance de electrolitos en el medio, 5) inhibir el crecimiento de microorganismos patógenos y 6) incrementar el volumen del semen original para que el semen pueda ser usado en muchos animales. El extensor debería ser económico, relativamente simple de preparar bajo condiciones rutinarias y sus ingredientes disponibles a través de firmas proveedoras de drogas. Los materiales usados para la extensión del semen son variados y diferentes, al menos, algunos componentes empleados varían de un laboratorio de procesamiento de semen a otro y aún desde países a países. No existe el mejor diluyente; sin embargo la experiencia y el uso continuo indica que algunos diluyentes son mejores que otros, a juzgar por los resultados de campo. Ningún diluyente de semen puede tornar un semen de baja calidad en un semen de calidad altamente fértil. La habilidad intrínseca de los espermatozoides para resistir el procesamiento, congelamiento, almacenaje y transporte, son factores inherentes que varían ampliamente entre los toros y aún entre eyaculados de un mismo reproductor considerando periodos de tiempo amplios. Sin embargo, se encuentran en centros de inseminación artificial, toros que producen frecuentemente espermatozoides altamente viables y mantienen una tasa de concepción a campo sobre el promedio del stud. Hay siempre aquellos toros padres que son promedio, y de seguro, toros que están por debajo del promedio en las tasas de no retorno al primer servicio. La viabilidad y capacidad fecundante del esperma no está necesariamente de acuerdo con el potencial genético del reproductor donante.. Desafortunadamente, algunos viejos toros padres, con la Diferencia Predecible mas alta para la producción de leche, no producen el semen de mayor fertilidad. La mayoría de aquellos toros mantenidos en los stud, producen semen de fertilidad suficientemente alta, que bajo apropiados procedimientos y la utilización de métodos, validan su continuo uso y contribución genética. Las características más comunes de la mayoría de los diluyentes de semen en cuanto a los componentes involucrados son:

1.

azúcares simples como glucosa, fructosa o galactosa, que sirven como fuente de energía para el semen,

2.

la yema de huevo o leche que sirven como protección contra el shock frío,

3.

amortiguadores de pH, de los cuales los mas conocidos son el citrato de sodio y el buffer Tris,

4.

los antibióticos, incluida la sulfanilamida, la cual es además de un agente antibacteriano es un inhibidor de la actividad metabólica, aunque no es actualmente usada hoy en día. Los principales antibióticos son la penicilina y la estreptomicina, las cuales inhiben la mayoría de los microorganismos encontrados en el semen. De estos dos, la estreptomicina es la mas importante por su acción inhibitoria contra el Vibrio fetus. Otros antibióticos tales como kanamicina y amikacina son también usados ampliamente,

5.

en el caso del semen congelado, el glicerol se adiciona para proteger a los espermatozoides contra los efectos del congelamiento, reduciendo particularmente la formación de cristales de hielo intracelular durante el procesamiento.

El semen es isotónico con los fluidos corporales, sangre, leche y otras secreciones (punto de congelamiento: -0,56 ºC) Los diluyentes de semen deberían ser isotónicos (o isosmóticos). El pH debería ser cercano al neutro (6,8 a 7,00), ya que el semen varía desde ligeramente alcalino a ligeramente ácido, dependiendo de la especie y la estimulación sexual. Procedimiento Familiarizarse con los usos y preparación de algunos de los diluyentes mas comunes. Generalmente el semen se conserva refrigerado a 5ºC o bien congelado a –196 ºC, previa dilución. Diluyentes para semen refrigerado bovino (conservado en heladera a 5ºC) 

Diluyente Citrato – Yema

El citrato de sodio es un buffer para la dilución del semen propuesto por Scherstin en 1936. En 1941 – 42, Salisbury y sus colaboradores de la Universidad de Cornell desarrollaron el diluyente Citrato – Yema, el cual se prepara de la siguiente manera:



1.

Preparar una solución de citrato de sodio (Na 3C6H5O7.2H2O) al 2,92%. Disolver el citrato en una cantidad menor de agua bidestilada tibia hasta total disolución y luego enrasar al nivel que corresponda. Guardar en frasco caramelo a 5ºC. El pH del buffer es de 6,7 a 6,8. Una ventaja de esta solución buffer es que liga efectivamente al calcio y a otros metales pesados y dispersan los glóbulos de grasa en la yema de huevo, haciendo posible la observación de espermatozoides individuales en el examen microscópico, lo que no ocurre con el fosfato.

2.

Yema de huevo. Los huevos deben ser frescos y de campo, preferiblemente de no mas de un día de su postura y libre de enfermedades. Deben ser: (a) lavados en agua tibia con detergente y enjuagados con abundante agua corriente y luego con agua destilada; (b) desinfectados con alcohol etílico al 70% y luego secados; (c) partir los huevos y separar la clara; (d) colocar la yema sobre papel de filtro estéril y hacer rolar la yema para eliminar los residuos de la clara; (e) punzar la yema y obtener la cantidad deseada de la misma, cuidando de no incluir la membrana vitelina.

3.

Para preparar 100 ml de diluyente citrato yema, mezclar 80 ml de citrato y 20 ml de yema de huevo.

4.

Adicionar antibióticos.

5.

Homogenizar cuidadosamente la yema y el citrato en una probeta con la ayuda de un homogenizador de vidrio, evitando la formación de espuma.

Diluyente a base de Leche

El diluyente a base de leche se utiliza para el procesamiento de semen congelado. Se utiliza leche fresca o pasteurizada, calentada por 10 minutos a 92 – 95 ºC para destruir enzimas nocivas. Un procedimiento adecuado para su preparación sería: (a) usar leche fresca descremada, pasteurizada y homogenizada; (b) calentar la leche en un recipiente de vidrio pirex en un baño maría a 95ªC por 10 minutos; (c) remover del calor y dejar enfriar a temperatura ambiente; (d) colocar la leche en un recipiente estéril, filtrándola para eliminar la nata; (e) usar este extender adicionando antibióticos. Los diluyentes citrato - yema y leche son diluyentes bases, usados extensamente en los centros de inseminación artificial. Hay muchas variaciones que se han desarrollado en base a estos dos por el agregado de azúcares, yema, glicerol.

Antibióticos: se recomienda una mezcla de (a) penicilina G sódica, 1.000 UI/ml, y (b) estreptomicina, 1.000 mg/ml. Otros antibióticos usados son la kanamicina, gentamicina y amikacina.

Diluyentes para semen congelado (conservado en termos de NL a –196ºC) 

Diluyente azucarados

Pueden utilizarse distintos tipos de azúcares para preparar diluyentes adecuados, tales como refinosa y lactosa, que se adaptan muy bien para el procesamiento de semen congelado. Solución (buffer) de rafinosa al 18,5%: (a) pesar 185 g de rafinosa pura y (b) disolverla en agua bi-destilada a volumen final de 1.000 ml. Puede reemplazarse por una solución de lactosa al 11%, en cuyo caso pesar 110 g de lactosa. Solución A

Solución B

80% de buffer

70% de buffer

20% de yema de huevo

20% de yema de huevo

Antibióticos

10% glicerol p.a. antibióticos



Leche descremada Solución A

Solución B

80% de leche descremada termo-tratada

70% de leche descremada termo-tratada

20% de yema de huevo

20% de yema de huevo

Antibióticos

10% glicerol p.a. Antibióticos

Dilución del semen Procedimiento: cuando se diluye el semen debe ponerse extrema precaución para evitar el shock térmico. El semen y el diluyente deben estar a la misma temperatura cuando son mezclados. Una vez que el semen es recolectado, debe esperarse unos minutos hasta que alcance la temperatura ambiente del laboratorio o enfriado gradualmente hasta los 23ºC. Una vez alcanzada esta temperatura se procede a diluir el semen y programar un lento enfriamiento para alcanzar una temperatura de 5ºC en el plazo de 90 minutos, controlando que cada 10 minutos el semen descienda 2ºC. Como el glicerol es ligeramente tóxico para los espermatozoides, se acostumbra a preparar dos soluciones diluyentes, una sin glicerol y la otra conteniendo el doble del glicerol estipulado. Una vez establecida la proporción de dilución, el semen a temperatura ambiente se diluye a la mitad de la dilución final establecida y se procede a bajar la temperatura hasta 5ºC. Una vez alcanzada esta temperatura, se completa la dilución con la solución B conteniendo glicerol. Para ello el volumen restante se fraccione en tres partes iguales, dejando pasar 10 minutos entre cada fracción. Debe tenerse la precaución de que la solución B esté a la misma temperatura del semen (5ºC). Una vez agregada la última fracción glicerolada, se deja en heladera a 5ºC durante un lapso de no menos de 30 minutos. Esta etapa se denomina etapa de equilibración, y tiene por objeto dar el tiempo necesario para que el glicerol penetre en la célula espermática desalojando agua. Esto evita la formación de grandes cristales de hielo durante el congelamiento, lo que comprometería la viabilidad del espermatozoide.

Cálculo de la tasa de dilución El objeto de la dilución o extensión del semen es servir tantas vacas como sea posible y obtener la más alta tasa de concepción. El número de espermatozoides viables por ml es un factor importante que influencia la tasa de concepción. Hay una relación entre los espermatozoides necesarios para una máxima tasa de concepción y el nivel de fertilidad del toro. En la mayoría de los toros el nivel de fertilidad no puede ser mejorado incrementando los espermatozoides por encima del número óptimo.

Sullivan (1970) condujo un estudio usando semen congelado en el cual se inseminaron 57.130 vacas con toros Holando. La tasa de NR a los 60 – 90 días fue significativamente mas baja para las dosis de inseminación conteniendo 5 millones de espermatozoides mótiles pos-descongelamiento, comparado con dosis de 10 y 15 millones. Estos datos fueron luego examinados sobre la base del %NR de los toros utilizados. Los toros fueron divididos en tres grupos: bajo (72,6% NR), medio (75,4 %NR) y alto (77,0 %NR). Cuando las concentraciones de espermatozoides progresivamente mótiles fueron comparados, hubo un incremento de la fertilidad de cada grupo cuando los espermatozoides fueron incrementados de 5 a 10 millones por dosis . Sin embargo, cuando el número fue incrementado de 10 a 15 millones por dosis, el %NR incrementó 1,7 unidades de porcentaje en el grupo de baja fertilidad, 0,9 %NR en el grupo de media fertilidad y decreció 1,5 unidades de porcentaje en la tasa de NR en el grupo de alta fertilidad.. Datos similares fueron obtenidos sobre servicios con Angus y Hereford sobre vacas lecheras. La tasa de NR fue más alta con 10 millones de espermatozoides progresivamente mótiles al descongelamiento que con 5 o 15 millones. Los investigadores concuerdan en general, que el semen refrigerado debería contener al menos unos 5 a 10 millones de espermatozoides con motilidad progresiva por ml, como dosis de inseminación. En el caso de semen congelado, mueren aproximadamente entre un 15 al 40% de los espermatozoides en el proceso de congelamiento – descongelamiento, por lo que el número total de espermatozoides por dosis debería incrementarse. La mayoría de los informes técnicos recomiendan entre 10 a 20 millones de espermatozoides con motilidad progresiva al descongelamiento. Actualmente, con envases en pajuelas y la automatización lograda, algunos trabajos indican que 8 millones de espermatozoides con motilidad progresiva son suficientes para obtener la mas alta tasa de concepción. Sin embargo, es esencial el conocimiento de del nivel de fertilidad de cada toro y la tasa de sobreviva de sus espermatozoides al descongelamiento. El número de espermatozoides totales por dosis de semen congelado debería tener entre 20 y 30 millones, para lograr unos 10 a 20 millones con motilidad progresiva al descongelamiento.

Preguntas 1.

¿Cual es el propósito de la dilución o extensión del semen?

2.

¿Cuáles son los requerimientos básicos de un diluyente de semen?

3.

¿Cómo se compara la motilidad espermática entre un semen puro y un semen diluido?

4.

¿Qué es la presión osmótica y por qué es importante en la dilución del semen?

5.

¿Qué es una solución isotónica y por qué es esta característica importante en los diluyentes?

6.

¿Qué precauciones se siguen para el enfriamiento del semen desde su recolección hasta la dilución final?

7.

¿Cuál es la función de la yema de huevo, del glicerol, de los azúcares y la de varias sales en la dilución del semen?

8.

Nombre dos diluyentes básicos para semen bovino y describa su fórmula.

9.

Si una muestra de semen de 8 ml en volumen, tiene un estimado de 1.500 millones de espermatozoides por ml y una motilidad del 70%, ¿cuánto debería ser extendido el semen para tener una dotación de 20 millones de espermatozoides vivos por ml por dosis de inseminación?

10. ¿Cuál es el propósito de los antibióticos en el diluyente?, ¿qué antibióticos son usado y en que nivel por ml de diluyente?