PARASITOLOGIA DIGESTIVA EN PEQUEÑOS RUMINATES TOMA DE MUESTRAS: El hallazgo de huevos o larvas en las heces puede indicar la presencia de infecciones parasitarias y facilitar el diagnóstico de enfermedades parasitarias. Los huevos y las larvas pueden ser identificados y cuantificados. Para este fin, el material fecal puede ser procesado por: 1. Un frotis directo en un microscopio para una identificación preliminar de huevos. 2. Una técnica de flotación para concentrar los huevos y separar los detritos para su identificación y conteo. 3. Cultivo de heces para eclosionar los huevos y desarrollar las larvas hasta su tercer estadio para su identificación. Los huevos y larvas producidos por helmintos adultos en el animal hospedero, generalmente son eliminados en las heces. LISTA DE EQUIPO o o o o o o o

Botella de tapa-rosca con boca ancha, capacidad mínima 30 ml Recipientes de plástico con tapas, capacidad mínima de 30 ml Guantes desechables para toma de muestras Bolsas de plástico Marcador para etiquetado Contenedor térmico para transportación de muestras Refrigerador en laboratorio apropiado para almacenamiento de muestras fecales.

PROCEDIMIENTO: Las muestras para examen parasitológico deben ser, preferentemente, tomadas directamente del recto. Se deben usar guantes desechables apropiados. La toma de muestras puede ser más fácil de realizar en animales grandes que en animales más pequeños. Animales pequeños como los cabritos pueden ser inducidos a defecar insertando un dedo humedecido en el recto y proporcionando masaje hasta que el esfínter se relaje. Si es un hato el que está siendo examinado, las muestras deberán ser tomadas de varios animales seleccionados al azar o de animales afectados por helmintos parásitos, dependiendo de las circunstancias.

Las heces pueden contener patógenos dañinos (bacterias, virus, etc). Se deben emplear procedimientos apropiados de higiene y seguridad. Se deben observar las regulaciones locales sobre salud y seguridad.

Las muestras pueden ser colectadas del suelo si se ve al animal defecando. Las muestras colectadas de esta manera deben ser frescas para que sean apropiadas para un examen parasitológico. Si se está examinando un hato, se deben tomar varias muestras provenientes de diferentes animales. Precaución!!! Las heces colectadas del suelo deben ser frescas, de otra manera, podrían estar contaminadas con nematodos de vida libre. Llenar el recipiente a toda su capacidad antes de cerrar con la tapa o atar el guante desechable tan cerca de las heces como sea posible. Es importante excluir el aire del recipiente dado que esto retardará el desarrollo de los huevos. Cada muestra deberá ser cuidadosamente etiquetada con la identificación del animal del que se tomaron las heces, la fecha y el lugar de colecta. Las muestras deberán ser empacadas en un contenedor térmico para su transportación al laboratorio. Tan pronto como las muestras lleguen al laboratorio deberán ser almacenadas en un refrigerador a una temperatura de 4 °C hasta que estas sean procesadas. Las muestras pueden ser mantenidas en refrigeración hasta por tres semanas sin presentar cambios significativos en la cuenta de huevos y en su morfología. Precaución!!! Las muestras NO deben ser mantenidas en el congelador de la heladera, es decir, congelar las muestras a – 20ºC. Las heces pueden ahora ser procesadas usando las siguientes técnicas: Frotis fecal McMaster Flotación Cultivo de larvas Baermann Si no es posible almacenar las muestras en un refrigerador por algún tiempo después de su colección, se puede añadir formalina a las heces para preservar los huevos. La concentración final de formaldehido en la mezcla deberá ser de al menos 3% (por ejemplo mezclando 1 ml de formalina concentrada por cada 10 ml de heces). Precaución!!! Las heces fijadas con formalina no pueden ser usadas para cultivo fecal. PRUEBA SIMPLE DE FLOTACIÓN EN TUBO: PROPÓSITO La prueba simple de flotación en tubo es una prueba cualitativa para la detección de huevos de nematodos y cestodos. Es un método útil en estudios preliminares para establecer qué grupos de parásitos están presentes. Los huevos son separados del material fecal y concentrados por un fluido de flotación con una gravedad específica apropiada. LISTA DE EQUIPO o o o o o o o o o o

Dos vasos o recipientes de plástico Colador de té o estopilla de doble capa Probeta o recipiente graduado por volumen Tenedor, abate lenguas o varillas para revolver Tubo de ensayo Gradilla para tubos de ensayo Microscopio Portaobjetos y cubreobjetos Báscula o cucharilla pregraduada Fluido de flotación

PROCEDIMIENTO      

Pesar o medir usando una cucharilla precalibrada aproximadamente 3 g de heces y poner dentro del recipiente 1. Verter 50 ml de fluido de flotación dentro del recipiente 1. Revolver o mezclar las heces y el fluido de flotación cuidadosamente con un abate lenguas o un tenedor. Verter la suspensión fecal, a través de un colador de té o doble capa de estopilla, dentro del recipiente 2. Verter la suspensión fecal del recipiente 2 en el tubo de ensayo colocado en una gradilla. El tubo de ensayo es llenado cuidadosamente hasta el tope con la suspensión dejando un menisco convexo en el extremo superior del tubo.

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Colocar cuidadosamente un cubreobjetos en el extremo superior del tubo de ensayo.

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Dejar reposar el tubo de ensayo durante 20 minutos.

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Retirar cuidadosamente el cubreobjetos del tubo de ensayo junto con la gota de fluido adherida a este. Colocar el cubre objetos sobre un portaobjetos limpio.

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Examinar usando un microscopio compuesto con aumento de 10 x 10

CONTEO DE HUEVOS POR LA TÉCNICA DE MC MASTER: PROPÓSITO La técnica McMaster es usada para demostrar y contabilizar huevos de helmintos en muestras fecales. Es el método más ampliamente utilizado para este propósito. Precaución !!! Si bien proporciona una valiosa ayuda diagnóstica, se requiere de cuidado con la interpretación de los datos obtenidos, debido a que tanto los resultados cualitativos como cuantitativos pueden ser influenciados por toda una variedad de factores. La técnica McMaster utiliza cámaras de conteo que posibilitan el examen microscópico de un volumen conocido de suspensión fecal (2 x 0.15 ml). Por lo tanto, si se usan un peso de heces y un volumen de líquido de flotación conocidos para preparar la suspensión, entonces el número de huevos por gramo de heces (h.p.g.) puede ser calculado. Las cantidades son elegidas de tal manera que la cuenta de huevos fecales puede ser fácilmente derivado al multiplicar el número de huevos dentro de las áreas marcadas por un simple factor de conversión. La cámara de McMaster tiene dos componentes, cada uno marcado con una rejilla sobre la superficie superior. Cuando la cámara es llenada con una suspensión de heces en fluido de flotación, muchos de los detritos se irán al fondo mientras los huevos flotan hacia la superficie, en donde pueden ser fácilmente vistos y los que están dentro del la rejilla pueden ser contados.

LISTA DE EQUIPO o o o o o o o

Dos vasos o recipientes de plástico Una báscula Un colador de té, estopilla o servilletas dentales Probeta graduada Instrumento para mezclar (tenedor, espátula, abate lenguas) Pipetas Pasteur y goteros de hule Fluido de flotación (la solución a escoger dependerá de la especie que se espera esté presente y la disponibilidad de reactivos)

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Cámara de conteo McMaster Microscopio compuesto

PROCEDIMIENTO 

Pesar 4 gramos de heces y colocar dentro del recipiente.

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Añadir 56 ml del fluido de flotación seleccionado.

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Revolver cuidadosamente los contenidos de los recipientes con un tenedor, abate lenguas o espátula. Filtrar la suspensión fecal con un colador de té o doble capa de estopilla o toalla dental hacia adentro del segundo recipiente. Revolver el filtrado en el recipiente dos con una pipeta Pasteur. Utilizando la pipeta, retirar una sub-muestra mientras el filtrado es mezclado. Revolver el fluido y llenar el primer compartimiento de la cámara de conteo McMaster con la sub-muestra. Mezclar de nuevo el fluido y llenar el segundo compartimiento con otra sub-muestra. Dejar reposar la cámara de conteo por 5 minutos.Es importante dejar reposar la cámara para permitir que los huevos floten hacia la superficie y que los detritos se vayan al fondo de la cámara. Examinar la sub-muestra del filtrado bajo un microscopio compuesto con aumento de 10 x 10. Identificar y contar todos los huevos dentro del área gravada de ambas cámaras.

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Trichuris ovis

Nematodirus battus

Nematodirus filicollis

Strongyloides papillosus

Toxocara vitulorum

Moniezia

Fasciola hepatica

Paramphistomum

Strongyle

ANALISIS E INTERPRETACION DE RESULTADOS: El número de huevos por gramo puede ser calculado de la siguiente manera:

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Contar el número de huevos dentro de la rejilla de cada cámara, ignorando aquellos fuera de los cuadros Multiplicar el total por 50 – esto da la cantidad de huevos por gramo de heces (h.p.g.)

Por ejemplo:

12 huevos observados en la cámara 1 y 15 en la cámara 2 = (12 +15) x 50 = 1350 h.p.g. Precaución !!! No tardar más del tiempo recomendado para el conteo dado que el fluido de flotación puede deformar o destruir huevos delicados. Por consiguiente, se recomienda procesar únicamente pocas muestras a la vez. Cuando se interpretan los resultados de McMaster, se debe recordar que una variedad de factores puede influir en la ocurrencia, reconocimiento y número de huevos de helmintos hallados en una muestra fecal. En particular, el número de huevos no es necesariamente indicativo del número de gusanos presentes. Las razones para esto incluyen: o Los huevo son producidos solamente por gusanos hembras, adultas, fértiles (o hermafroditas) y por tanto, podrán estar ausentes en infecciones con parásitos inmaduros de un solo sexo. o La producción diaria de huevos por hembras fértiles está influenciada por factores fisiológicos del hospedero tales como estrés o lactación (incremento) o inmunidad (decremento). o La quimioterapia también puede afectar la producción de huevos e.g. corticosteroides (incremento) o dosis sub-letales de antihelmínticos (decremento). o Algunos alimentos y piensos pueden tener un efecto similar e.g. forrajes ricos en taninos (decremento). o La concentración de huevos (por gramo de heces) está influenciada por el volumen diario de heces producido por el hospedero, la tasa de pasaje de la ingesta a través del intestino, y la distribución de los huevos en la masa fecal o Algunos tipos de huevos son más pesados que otros y podrían no flotar bien en soluciones de baja gravedad específica (e.g. Fasciola) o Algunos huevos de diferentes especies son indistinguibles (particularmente trichostrongílidos y strongílidos). Esto complica la interpretación clínica debido a que algunas especies (e.g. Haemonchus) producen muchos más huevos por día que otras (e.g. Ostertagia).