UNIVERSIDAD ROVIRA I VIRGILI DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA I BIOTEGNOLOGÍA FACULTAD DE ENOLOGÍA

CARACTERIZACIÓN DE LOS ECOTIPOS DE Vitis vinifera L. EXISTENTES EN LA ACTUALIDAD EN EL GERMOPLASMA NATURAL DE LA ISLA DE LANZAROTE MEDIANTE LAS TÉNICA DE LOS SSR (Repetición de Secuencias Simples) O MICROSATÉLITES.

MEMÒRIA DE LOS RESULTADOS DE LA INVESTIGACIÓN

TECN ENOL TECNOLOGIA

ENOLÒGICA

Tarragona, Noviembre 2013 1

RESUMEN El origen de la vid se remonta a la Era Terciaria y desde entonces ha sufrido modificaciones genéticas, ya sea mediante mutaciones somáticas y naturales para permitir su adaptación y evolución, o por la acción del hombre, mejorándola genéticamente para incrementar su producción, calidad y resistencia a enfermedades. Todo ello ha contribuido al aumento de potencial genético de Vitis vinifera incrementado su biodiversidad y favoreciendo la distribución generalizada de la misma. Aunque existen factores adversos que han frenado e incluso mermado esta evolución, es la erosión genética la que amenaza en mayor medida la riqueza varietal de las especies de Vitis. Las vías de actuación de la misma son la pérdida de formas silvestres, la reducción del número de variedades cultivadas en una determinada región (cambio en su encepamiento), el uso continuado de los mismos clones y el efecto del cambio climático. Más recientemente otro factor influye en esta pérdida, se trata de la globalización de los mercados. Las bodegas, el consumidor y las modas han obligado a la elaboración de caldos a partir de unas pocas variedades, con lo cual se obtienen vinos cada vez más homogéneos, y por lo tanto con menos características típicas y diferenciadoras que sólo se pueden conseguir con el uso de variedades autóctonas y/o minoritarias. Dicha tipicidad será capaz de dotar al producto final de características distintivas y únicas, por lo que será primordial identificar y salvaguardar estas variedades. Las Islas Canarias son uno de los pocos reductos donde podemos encontrar una importante biodiversidad de variedades autóctonas. Sus condiciones edafoclimáticas junto con su peculiar historia, han propiciado la aparición de nuevas variantes de una misma variedad o ecotipos, así como la posible aparición de nuevos genomas derivados de variedades ya existentes. La situación geográfica de las Islas Canarias junto con algún factor edáfico por determinar, contribuyó a mantenerlas aisladas de la devastación de la filoxera que en el siglo XIX asoló los viñedos de Europa. Con lo cual es más que probable que nos encontremos ante uno de los viñedos más antiguos del viejo continente. Por otro lado, el hecho de que las islas fueran un lugar de paso de las rutas comerciales entre el continente europeo y el Nuevo Mundo durante los siglos XV y XVI, favoreció la posibilidad de que se introdujeran nuevas variedades traídas de otros lugares. Todo ello ha podido contribuir a la creación de nuevos tipos de vides, procedentes de cruzamientos naturales o dirigidos por el hombre, y como consecuencia originar una compleja, rica y gran diversidad varietal pudiendo haber, incluso, variedades aún por identificar. Actualmente con el desarrollo de los marcadores moleculares la tarea de identificación de variedades ha dejado de ser tediosa y subjetiva, como la basada en un análisis exclusivo del fenotipo, para ser altamente rigurosa y repetitiva. Una de las técnicas moleculares más usadas es la técnica de los microsatélites o SSR (Simple Sequence Repeads), por ser una técnica relativamente sencilla y altamente reproducible. En este trabajo hemos realizado un estudio de caracterización de variedades cultivadas en la isla de Lanzarote mediante la técnica de los SSR, donde es más que probable que las características climáticas, edáficas y su particular historia hayan contribuido a crear una biodiversidad propia en relación a otros lugares de la península e incluso de las islas. 2

ABSTRACT

Grapevine origin dates back to the Tertiary, since then, it has been subjected to genetic modifications. Somatic modifications allowed adaptation and evolution of grapevine; on the other hand the human activity improved them genetically in order to increase their productivity, quality and resistance to plagues. All these factors have contributed to the increase of the richness in genetic potential and general distribution of the species. Although there are adverse factors that contributed to an evolutionary stuck, the genetic erosion by different ways (loss of wild species, variety reduction in a region due to the change in their stocking, the continuous use of the same clones and the climatic change effects) threatens the varietal richness of the species. Recently, it has appeared other factor affecting to this loss: the market globalization. Wineries, consumers and trends have forced the wine elaboration from a few varieties, obtaining more similar wines and with reduced typical and differentiating characteristics. Increase of wine original characteristics is only possible using autochthonous varieties which give unique and distinctive organoleptic properties. For that reason, identifying and preserve these varieties is the most important. Canary Islands possibly are one of the few regions where we can find an important biodiversity related to autochthonous varieties and where is a big richness and it has propitiate the appearance of new varieties or ecotypes. The geographical situation of Canary Islands contributed to maintain the vineyards isolated from the filoxera that produced the devastation of European grapevines during the XIX century. So probably, here we can find the oldest vineyards in Europe. During the XV and XVI Centuries Canary Islands were a cross of commercial routes between Europe and America. This fact could be the reason why new varieties were introduced from other countries. All of these have contributed to create new varieties from natural crossing or human directed crossing. The result is a complex and huge variety of grapevines, moreover it could exist unidentified varieties. Nowadays, thanks to the molecular markers the varietal identification is less hard and subjective compared to the phenotypical analyses, being more rigorous and reproducible. One of the most used molecular techniques is the microsatellites study or SSR (Simple Sequence Repeads), due to its simplicity and highly reproducibility. In this work, we have performed a characterization study of varieties from Lanzarote Island using the SSR technique. In this region, the clime and edaphic conditions have contributed to create new ecotypes compared to other Canary Islands and peninsular regions.

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INTRODUCCION Si analizamos la bibliografía podemos ver que existen entre 10.000 y 20.000 variedades de vid cultivadas en el mundo. Esta gran diversidad viene dada por el remoto origen de esta especie que se remonta a la Era Terciaria, lo cual conlleva una larga evolución hasta nuestros días marcada por la acción de cuatro importantes fenómenos. La primera causa de diversidad procede de la multiplicación sexual que da lugar a plantas muy próximas (hermanos) con una carga genética muy similar, pero con ciertas y mínimas diferencias. La segunda es la necesidad de adaptación a las distintas condiciones edafoclimáticas desde sus orígenes hasta la actualidad, lo cual implica procesos de selección natural a lo largo de cientos de años. Son los llamados híbridos naturales (Cabello y col. 2004). La tercera razón de diversidad es la mutación somática que mediante pequeñas variaciones en el genoma da lugar, dentro de una variedad, a nuevas formas varietales siempre que, la manifestación morfológica del cambio producido en el genoma se diferencie claramente del original. El ejemplo más claro a nivel de variedades españolas se produce en la Garnacha, de la que tenemos diferentes formas varietales: Garnacha tinta, Garnacha blanca, Garnacha gris y Garnacha peluda, y un poco más alejada genéticamente la Garnacha tintorera, seguramente por acumulación de más mutaciones (Cabello y col. 2004). Y la cuarta y última razón se debe a la acción directa del hombre actuando como un mejorador entre individuos de la misma especie, o entre distintas especies, con el fin de optimizar sus características obteniendo variedades mejoradas en cuanto a volumen de producción, calidad de producción, resistencia a determinadas plagas… Denominados híbridos artificiales (Cabello y col. 2004).

Es por tanto lógico poder pensar que en determinados hábitats reducidos y más o menos aislados puedan aparecer, lo que se ha venido denominando, “Ecotipos”. Son nuevos “tipos” de Vitis vinifera L. que perduran en el tiempo, aumentando su diferenciación con sus ancestros. Este vocablo hace referencia a una subpoblación genéticamente diferenciada que está restringida a un hábitat específico, un ambiente particular o un ecosistema definido, y con unos límites de tolerancia determinados para los factores ambientales existentes. Pero esta riqueza varietal se ve amenazada por lo que se conoce como erosión genética, término que define la pérdida de potencial genético o de material vegetal: -La pérdida de formas silvestres. Sólo las más resistentes a las distintas adversidades y afecciones han podido sobrevivir, además el hombre con sus cultivos ha provocado la disminución de sus hábitats naturales. (Vinos y viñedos. Septiembre 2012). -La reducción del número de variedades cultivadas en una determinada región y el cambio en su encepamiento. En las distintas zonas vinícolas a causa de las exigencias, gustos, tendencias y hábitos de los consumidores, se reducen y homogenizan el tipo de variedades de vid cultivadas, y se introducen variedades nuevas originarias de otras zonas, de probada calidad, con el fin de mejorar los productos locales. Todo ello conlleva la sustitución de las variedades autóctonas de la zona, por otras más universales y de mayor prestigio, lo que comporta un cambio importante en su encepamiento, término que hace referencia al conjunto de cultivares que configuran el grupo de variedades características de una determinada zona (González Díaz y col 1996). 4

-El uso continuado de los mismos clones. Un clon es el material vegetal obtenido por multiplicación vegetativa de una sola planta. El conjunto de todos los clones diferentes que se cultivan en un viñedo antiguo es lo que denominamos “variedad población” (Muñoz-Organero y col. 2001). La selección de clones se efectúa analizando dicha población y eligiendo una cepa madre de características adecuadas, realizando la multiplicación vegetativa de dicha cepa aseguramos que su descendencia tendrá las mismas características varietales que ésta. La selección clonal es necesaria, pero sin duda reduce la variabilidad de cada variedad al elegir sólo los clones superiores. - El cambio climático. No está claro si producirá una pérdida total de material genético, pero si introducirá en la especie un gran cambio de difícil predicción. Lo que sí es cierto es que distintos estudios apuntan a que un incremento progresivo en la temperatura y el cambio en el régimen pluviométrico como el que se está produciendo, provocará la reducción de la estación de crecimiento lo cual llevará a un descenso en la producción. Las temperaturas crecientes permitirán la expansión de las áreas adecuadas para el cultivo de la vid de modo que zonas que ahora son demasiado frías para el crecimiento de la vid sean óptimas (desplazamiento hacia el norte y noroeste de la línea de Wagner). Al mismo tiempo, áreas que ahora son apropiadas para variedades típicas como Cabernet sauvignon pueden llegar a ser apropiadas para otro tipo de cultivares. Además, se espera que las variedades que ahora son generalmente cultivadas en terrenos llanos se cambien a áreas con una elevación más alta para alcanzar sus requisitos en cuanto a temperatura. Por otro lado, parece ser que también incrementará la frecuencia de eventos climáticos extremos durante las etapas vegetativas sensibles (es decir, la brotación, la floración, la polinización, el cuajado, el envero) con consecuencias en la calidad y cantidad de producción (es decir, daño en los brotes, acumulación de azúcar en las bayas, etc.) (Moriondo y col. 2008). Hoy en día, existen también otro tipo de causas de pérdida de recursos fitogenéticos de esta especie, menos científicas pero igual de eficaces, son las denominaciones de origen (DO) y la globalización de los mercados, ya que han provocado una restricción en el número de variedades empleadas, tendiendo al uso de aquellas más ampliamente extendidas, en detrimento de las variedades tradicionales locales. Así pues la continuada acción de la erosión genética, se traduce en una disminución de variedades utilizadas en la elaboración de los distintos vinos, con lo cual el producto final es cada vez más homogéneo. Sólo la utilización de variedades autóctonas o minoritarias pueden dotarlos de más tipicidad y características únicas, que los hagan más especiales y apreciados ante el consumidor, así lo propone Christophe Marquet (2007), que ve el uso de variedades autóctonas como una de las ventajas competitivas a la hora de posicionar en el mercado nuestra marca de vino DO, ante la bajada del consumo total de vino, aunque destaca la buena marcha y aumento del vino con denominación de origen. Los consumidores de los vinos con DO buscan autenticidad en la compra, y lo podemos conseguir ofreciendo: Tradición en los conocimientos de elaboración, Variedades autóctonas diferenciadas a escala mundial y que permiten peculiaridades únicas y con elaboraciones de vinos especiales tipo Malvasías (Christophe Marquet 2007). Actualmente, en España hay 73 Denominaciones de Origen (DO) que abarcan prácticamente todas las comunidades autónomas (Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente, Mapa de las Denominaciones de Origen Protegidas de Vinos de España), cada una de ellas presenta la Lista de 5

Variedades Autorizadas y Preferentes para la elaboración de sus vinos. Se cultivan 89 variedades de vid en las distintas Denominaciones de Origen españolas, de las cuales 76 de ellas son autóctonas, cultivadas en España desde antiguo y con una gran tradición (Muñoz-Organero y col. 2011). Actualmente, como variedades autorizadas, aparecen 13 variedades que proceden de otros países, fundamentalmente Francia y Alemania. Algunas como la Cabernet sauvignon se ha extendido por casi todas las zonas y actualmente existe un cierto incremento de la variedad Syrah (Cabello y col. 2013). Es precisamente la inclusión de estas pocas variedades foráneas, para la elaboración de nuestros caldos, en detrimento de variedades autóctonas o minoritarias (variedades cuya superficie de cultivo es muy baja, por debajo de 1000 ha a escala nacional, y que se encontraban citadas como variedad cultivada antes del ataque filoxérico y no pueden ser incluidas en el listado de variedades protegidas) lo que hace que los vinos sean cada vez más homogéneos. Las Denominaciones de Origen e Indicaciones Geográficas constituyen el sistema utilizado en nuestro país para el reconocimiento de una calidad superior, consecuencia de características propias y diferenciales, debidas al medio geográfico en el que se producen las materias primas, se elaboran los productos, y a la influencia del factor humano que participa en las mismas. Estas características propias, típicas y diferenciadoras, se ven muy acentuadas en las Islas Canarias por su rica diversidad, pues sus vides provienen de distintas zonas debido al modelo de conquista que sufrieron las islas y a su situación geográfica, que las convirtió en un cruce de caminos de las distintas rutas comerciales entre el Viejo y el Nuevo Mundo. Además tienen también, un clima oceánico tropical y se ven afectadas por el régimen de vientos Alisios que genera en las islas el anticiclón de las Azores, con lo cual las viñas han debido adaptarse a condiciones climáticas distintas a las originales. Asimismo éstas, son viñas que no sufrieron la gran y devastadora plaga de la filoxera, que asoló los viñedos europeos en el siglo XIX, considerándose a las Islas Canarias, uno de los últimos reductos de vides pre-filoxéricas. Dentro de este oasis de singularidad, destaca la isla de Lanzarote donde las condiciones extremas del clima y el terreno, son el caldo de cultivo propicio para poder realizar los hallazgos de nuevos ecotipos que perseguimos. En Lanzarote, la escasez de lluvias y la proximidad del caluroso continente africano, es paliada por la humedad traída desde el Atlántico por los vientos Alisios, los cuales condensan la humedad del océano sobre la porosa ceniza volcánica, que cubre totalmente el suelo de la isla, y actúa a modo de una oscura esponja que retiene el rocío y se lo transmite a las parras durante el día. Una lentísima osmosis que permite que se produzcan sobre la ceniza volcánica excelentes frutos, algo que los isleños han sabido utilizar sabiamente. En esta isla se tuvieron que replantar todas las viñas debido a las erupciones volcánicas del siglo XVIII (1730 -1736), con una técnica agrícola novedosa como es el cultivo en arenado o “enarenado natural”, como se le conoce al peculiar terreno de Lanzarote (González Morales, A. 2011). El viticultor, con ingenio, ha sabido sortear la pobreza del suelo volcánico y usarlo con buen fin para su provecho, confeccionando hoyos en forma de embudo en la capa de ceniza volcánica hasta llegar cerca de la tierra vegetal y allí en el fondo de éstos, que a veces tienen más de dos metros de profundidad, planta de 1 a 3 vides por hoyo, construyendo para la defensa de estos hoyos del viento constante, muros de piedra en forma semicircular, de 60 – 70 cm. de altura, cada uno de los cuales protegen la cepa de ser cubierta por la ceniza volcánica. (Vinos y viñedos, Septiembre 2011). Con lo cual podemos afirmar que la Comunidad Canaria, y en especial Lanzarote, posee una riqueza varietal en Vitis vinifera digna de ser considerada por su singularidad. Por lo que es imprescindible y necesario, catalogarla y estudiarla en profundidad para poder preservarla y conservarla en bancos de germoplasma 6

para su futura utilización en programas de mejora o en reintroducciones con garantía de autenticidad varietal. En resumen, el objetivo de este trabajo es la de caracterizar e identificar la diversidad de la isla de Lanzarote, mediante la técnica de los SSR, para hallar nuevos ecotipos de las variedades que podríamos llamar genéricas o autóctonas o registradas actualmente en Lanzarote y de esta manera conocer su importancia real versus la obtención de variedades que sean de interés comercial, es decir, que a partir de ellas se puedan crear nuevos vinos autóctonos, que tengan tipicidad y consecuentemente originalidad para ser distribuidos tanto en los mercados nacionales como internacionales.

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MATERIAL Y MÉTODOS El material vegetal de este estudio parece, en principio, muy homogéneo pues la mayoría de entradas corresponden a la variedad Malvasía volcánica o también conocida como Malvasía de Lanzarote. Variedad por excelencia representativa de las Islas Canarias y en particular de la isla de Lanzarote. Entre las variedades cultivadas en Lanzarote encontramos: Malvasía, Listan Blanco, Listan Negro, Negramoll, Pedro Ximénez, Breval, Moscatel, Moscatel Negro, Burra Blanca, y todas forman parte del muestro recogido, cuya relación encontramos en la Tabla 1. Tabla 1.Muestras recolectadas para su posterior análisis.

Código LAB 1LZ 2LZ 3LZ 4LZ 5LZ 6LZ 7LZ 8LZ 9LZ 10LZ 11LZ 12LZ 13LZ 14LZ 15LZ 16LZ 17LZ 18LZ 619LZ 20LZ 21LZ 22LZ 23LZ 24LZ 25LZ 27LZ 28LZ 29LZ 30LZ 31LZ 32LZ 33LZ 34LZ 36LZ 37LZ 39LZ 40LZ 41LZ 42LZ

Código Madera LB4291A MV2B LB4483C LN4D MV10085E MV11066F MO7G LB4928H LN9I LB32310J MV11K MV46712L MV13M MV14N MO15O MO16P MV1517Q MV126718R LN206619S MV20T MV21U MV947622V LN207923W LB24X MV 190125Y MV200927AA DI28AB MV29AC DS137430AD MV67531AE LN104432AF LN15233AG LN12034AH MV100036AJ MOP74237AK MVP39AM BR198840AN LN41AO MV42AP

Variedad LISTAN BLANCO MALVASÍA VOLCÁNICA LISTAN BLANCO LISTÁN NEGRO MALVASÍA VOLCÁNICA MALVASÍA VOLCÁNICA MOSCATEL LISTAN BLANCO LISTÁN NEGRO LISTAN BLANCO MALVASÍA VOLCÁNICA MALVASÍA VOLCÁNICA MALVASÍA VOLCÁNICA MALVASÍA VOLCÁNICA MOSCATEL MOSCATEL MALVASÍA VOLCÁNICA MALVASÍA VOLCÁNICA LISTÁN NEGRO MALVASÍA VOLCÁNICA MALVASÍA VOLCÁNICA MALVASÍA VOLCÁNICA LISTÁN NEGRO LISTAN BLANCO MALVASÍA VOLCÁNICA MALVASÍA VOLCÁNICA DIEGO MALVASÍA VOLCÁNICA DESCONOCIDA MALVASÍA VOLCÁNICA LISTÁN NEGRO LISTÁN NEGRO LISTÁN NEGRO MALVASÍA VOLCÁNICA MOSCATEL (PEREJIL) MALVASÍA(ENTRE MALVASÍA Y LISTÁN) BREVAL LISTÁN NEGRO MALVASÍA VOLCÁNICA

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Color Tamaño Baya BL BL BL NG BL BL BL BL NG BL BL BL BL BL BL BL BL BL NG BL BL BL NG BL BL BL BL BL BL BL NG NG NG BL BL BL BL NG BL

PQ PQ PQ MD PQ PQ GR PQ MD PQ PQ PQ PQ PQ GR GR PQ PQ MD PQ PQ PQ MD PQ PQ PQ GR PQ PQ PQ MD GR PQ PQ PQ MD PQ MD PQ

Antigüedad 80 80 40 40 80 15 15 80 80 90 90 20 10 12 100 100 40 80 40 40 40 12 80 80 60 120 50 80