Universidad Nacional del Nordeste Facultad de Medicina

Maestría en Micología Médica

Director:

Dr. Ricardo Negroni

Coordinadores:

Dra. Alicia Arechavala Dr. Gustavo E. Giusiano

Unidad Temática

Diagnóstico Inmunológico de las micosis

Maestría en Micología Médica

Diagnóstico Inmunológico de las micosis – Dr. Ricardo Negroni

Como ya fue mencionado, aún no está totalmente comprendido el papel de los anticuerpos en la respuesta inmune frente a los agentes fúngicos; sin embargo, la producción de inmunoglobulinas específicas contra los distintos agentes etiológicos de las micosis es de gran utilidad para el diagnóstico serológico. En las micosis sistémicas endémicas se producen anticuerpos en concentración elevada y proporcional a la gravedad de la infección. Estos anticuerpos pueden ser fácilmente detectados por diferentes reacciones inmunológicas que se convierten así en herramientas de gran valor para el diagnóstico y también para el seguimiento de estas patologías. En las formas agudas o subagudas pueden utilizarse técnicas que permiten la detección de anticuerpos de tipo IgM como la aglutinación directa, hemaglutinación o precipitación en tubo. Sin embargo, sus resultados son positivos solamente en las primeras etapas de la enfermedad y se negativizan en plazos cortos independientemente de la evolución de la afección. Las técnicas que permiten evidenciar anticuerpos IgG son las más utilizadas para el diagnóstico de formas subagudas y crónicas y además permiten seguir la evolución de estas enfermedades. El incremento de micosis en huéspedes inmunocomprometidos que no tienen capacidad para formar anticuerpos adecuadamente, ha requerido el desarrollo de técnicas inmunológicas que permitan detectar antígenos y/o metabolitos circulantes. En ocasiones, la combinación de métodos destinados a detectar anticuerpos con técnicas de demostración de antígenos permite llegar o acercarse al diagnóstico de formas graves de estas micosis. 1. Métodos de detección de anticuerpos circulantes 1.1. Inmunodifusión (ID) La prueba más difundida y mejor estandarizada es la inmunodifusión en medios gelosados (agar o agarosa), ya que para su realización no es necesario contar con equipos costosos, es muy fácil de realizar y permite obtener resultados en 48-72 h. Esta es una técnica que se puede emplear como tamiz, probando diferentes antígenos fúngicos, ya que posee sensibilidad adecuada y gran especificidad (< 1% de reacciones cruzadas con antígenos bien controlados). Además puede servir en el seguimiento como técnica semicuantitativa mediante diluciones seriadas del suero del paciente. En nuestro medio se utiliza para el diagnóstico serológico de paracoccidioidomicosis, histoplasmosis, coccidioidomicosis, aspergilosis broncopulmonar, candidiasis sistémica y en Norteamérica también se usa para diagnóstico de blastomicosis. Siempre deben emplearse controles positivo y negativo simultáneamente con las muestras clínicas. 1.2. Contrainmunoelectroforesis (CIE) La contrainmunoelectroforesis es una técnica que tiene mayor sensibilidad que la inmunodifusión pero que mantiene casi la misma especificidad. Se realiza la prueba de la manera recomendada por Conti-Díaz que consiste en la contrainmunoelectroforesis a la que se agrega una inmunodifusión secundaria, de este modo es posible detectar anticuerpos contra parcelas antigénicas de movilidad catódica que, de otra manera, se perderían. Para su realización se requiere agarosa, y contar con una cuba y fuente de

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poder para poder realizar la corrida electroforética. Tiene gran valor en pacientes con formas localizadas, aspergilosis broncopulmonar alérgica y es la que brinda mayor proporción de resultados positivos en enfermos con histoplasmosis asociada al SIDA, también puede aplicarse al diagnóstico de la esporotricosis. 1.3. Prueba de fijación de complemento (FC) Otra prueba, estandarizada desde la década de 1970, es la fijación de complemento, que tiene mayor sensibilidad que la inmunodifusión pero tiene hasta un 25% de reacciones cruzadas, en especial con títulos bajos. Cuando esto sucede, se recomienda repetirla en tres semanas ya que el título de anticuerpos específicos suele aumentar 4 ó más veces en tanto que las reacciones cruzadas con antígenos heterólogos suelen mantener títulos estables o aumentar mucho menos que con el antígeno homólogo. El uso combinado de esta técnica con la ID también permite excluir las reacciones cruzadas. FC es la técnica ideal para el seguimiento ya que permite confeccionar curvas serológicas. Sin embargo, en las últimas décadas ha disminuido su empleo ya que es una técnica engorrosa, con muchos pasos, utilización de mucho material y varias causas de error. En ocasiones podría ser reemplazada por el EIA, pero todavía no existen muchos equipos comerciales y los métodos caseros son más difíciles de estandarizar y comparar resultados interlaboratorios. Esta última técnica también presenta el mismo inconveniente que la FC con respecto a las reacciones cruzadas y por lo tanto su uso es más adecuado para seguimiento o acompañada de otros métodos más específicos.

2. Métodos de detección de antígenos 2.1. Aglutinación de partículas de látex (AL) Este método es utilizado universalmente para la detección de antígeno polisacárido capsular de Cryptococcus neoformans. En la actualidad existen numerosos equipos comerciales, habitualmente cuentan con controles positivos y negativos y proteasa para destruir complejos inmunes y así aumentar la sensibilidad y especificidad, evitando los falsos positivos en especial por factor reumatoideo. Esta técnica puede utilizarse con suero o LCR y es útil para el diagnóstico y para el seguimiento de la criptococosis ya que los títulos suelen ser proporcionales a la gravedad de la enfermedad y van disminuyendo conforme el tratamiento es efectivo; es un alerta acerca de las recaídas ya que aumenta en esos casos. El seguimiento debe realizarse siempre con el mismo reactivo ya que como fue mencionado no todos tienen el mismo nivel de detección y por lo tanto los títulos no son comparables. La AL también ha sido usada para el diagnóstico de la candidiasis aunque en ese caso la sensibilidad es baja debido a que los antígenos mananos de Candida se combinan rápidamente con anticuerpos y forman complejos inmunes que son eliminados de circulación (corta vida media); para aumentar la sensibilidad de esta prueba se requiere la concentración de muestras (suero u orina) o la determinación en varias muestras seriadas. 2.2. Elisa Este método es apto para la detección de antígenos o anticuerpos, tiene gran sensibilidad aunque presenta reacciones cruzadas si se intenta buscar anticuerpos. Se han utilizado diversas variables de esta metodología para aumentar especificidad y

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sensibilidad y muchas de ellas incluyen el uso de anticuerpos monoclonales con ese objetivo. En la actualidad es una técnica difundida para detectar galactomanano de Aspergillus (para diagnóstico de aspergilosis invasora) y también hay equipos para evidenciar glucuronoxilomanano de Cryptococcus, mananos de la pared de Candida y para diagnóstico de histoplasmosis en huéspedes inmunocomprometidos.

Otras técnicas: Numerosos investigadores han desarrollado gran variedad de pruebas inmunológicas para el diagnóstico de las micosis, la mayoría de ellas no se han comercializado y se han empleado solamente en centros especializados. La inmunofluorescencia se utiliza en equipos comerciales para el diagnóstico de neumocistosis, también por esta técnica se detectan anticuerpos antimicelio de Candida La utilización de western blot y dot blot ha sido exitosa en el diagnóstico de algunas formas clínicas de histoplasmosis, blastomicosis y paracoccidioidomicosis.

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