Métodos de Estudio en

Biología Celular

A. INFORMACIÓN MORFOLÓGICA

Microscopía Óptica Microscopía Electrónica Técnicas Cito-histológicas Cultivo in vitro de células y tejidos B. ORIENTACIÓN SOBRE LA COMPOSICIÓN QUÍMICA Citoquímica-Histoquímica Inmunohistoquímica Autorradiografía

C. SEPARACIÓN DE COMPONENTES CELULARES Fraccionamiento Celular Ultracentrifugación Citometría de Flujo D. INFORMACIÓN ANALÍTICA A NIVEL MOLECULAR Cromatografía Electroforesis

Estructura

Unidad de Medida

Valor (mm)

Método de estudio

Organos, Tejidos y Células grandes

Milímetro (mm)

1

Simple Vista Lupa

Células y Organelos grandes

Micrómetro (µm)

1 x 10-3

Microscopio Optico

Componentes Celulares, Macromoléculas

Nanómetro (nm)

1 x 10-6

Microscopio Electrónico

Angström (Ä)

1 x 10-7

Microscopio Electrónico

Estructuras Moleculares

Microscopía

“todo instrumento que permite la observación de objetos pequeños o ver detalles de una muestra determinada que a simple vista no se percibiría”

Microscopio Óptico

Partes de un Microscopio Sistema mecánico está constituido por una serie de piezas en las que van instaladas las lentes que permiten el movimiento para el enfoque.

Sistema óptico comprende un conjunto de lentes dispuestas de tal manera que producen el aumento de las imágenes que se ven a través de ellas

Cabezal Revolver Brazo o Columna Platina

Tornillos de enfoque Pie o Base

Oculares

Objetivos

Condensador Diafragma Fuente de Luz

Oculares

Tienen la función de ampliar la imagen. Están formados por dos lentes dispuestos en un tubo corto. Los más utilizados son los de: 1OX, 12,5X y 15X.

Objetivos

Permiten ampliar la imagen del objeto. El número varía con el tipo de microscopio y el uso.

Objetivos

Secos 5X, 10X, 20X, 40X y 60X

Inmersión: 100X

Condensador

Está formado por un sistema de lentes que concentran los rayos luminosos sobre el plano de la preparación. Se halla debajo de la platina y presenta un sistema de cremallera que permite su movimiento.

Diafragma

Tiene la función de regular la cantidad de luz que entra en el condensador.

Fuente de iluminación

Dirige los rayos luminosos hacia el condensador

Pie o Base

Constituye el soporte sobre el cual se apoya el microscopio. Puede tener forma rectangular o bien de Y.

Brazo o Columna

Es una pieza colocada en la parte posterior del aparato Sostiene el cabezal en su porción superior y por el extremo inferior se une al pie.

Platina

Es una pieza plana donde se coloca la preparación. Presenta un orificio que permite el paso de la luz. Tiene tornillos laterales que permiten recorrer la preparación.

Cabezal

Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular o binocular.

Revolver

Es una pieza giratoria que sostiene los objetivos. Permite cambiar los objetivos y observar una muestra en diferentes aumentos.

Tornillos de enfoque

El macrométrico aproxima el enfoque El micrométrico consigue el enfoque correcto

Tipos

de Microscopios

Contraste de Fases • Permite ver células y tejidos sin teñir, o sea vivos • Los materiales producen un retraso de fases en los rayos que los atraviesan • Los cambios son ampliados y convertidos en cambios en la intensidad de luz • Las células se observan en diferentes tonos de gris

Interferencia • Permite ver células y tejidos sin teñir • Se basa en los mismos principios que el contraste de fases • Proporciona resultados cuantitativos e información sobre propiedades físicas de los materiales • Detecta cambios en el índice de refracción de la luz, además de revelar las discontinuidades de fase

Fluorescencia • Permite observar sustancias fluorescentes naturales o materiales teñidos • Tiene alta sensibilidad, detecta la mínima cantidad de fluorescencia • Las sustancias fluorescentes absorben luz de una longitud de onda y emiten luz de mayor longitud de onda • Si se iluminan con luz azul o violeta (onda corta) emiten luz amarilla o verde (onda larga)

luz intensa (onda corta)  filtro excitador  material  filtro supresor (pasa long. onda mayores)  fondo oscuro y materiales brillantes

Microscopio Invertido • Es una variante del microscopio común que tiene invertida la posición de los objetivos • La luz de la fuente de iluminación llega desde encima de la platina • Facilita el trabajo botellas o tubos de cultivo. • Es usado en laboratorios de microbiología

Microscopio Confocal

• Utiliza iluminación láser y permite ver material grueso como secciones o cortes • La imagen es captada por un detector que la transfiere a PC con analizador de imágenes

Microscopio Confocal

Microscopio Confocal 1. Constituye una herramienta ideal para examinar estructuras y funciones celulares. 2. Pueden observarse tejidos intactos o secciones gruesas sin necesidad de hacer cortes histológicos

3. Se obtiene un aumento notable resolución, con respecto a otros MO.

en

la

4. Permite hacer reconstrucciones en 3 dimensiones más precisas que con otros métodos.

Microscopio de Campo Oscuro

• Es un microscopio común cuyo sistema condensador está modificado para dirigir la luz desde los lados • Sólo la luz difractada por la preparación pasa al ocular y se hace visible. • La muestra aparece iluminada sobre un fondo oscuro.

Microscopio de Campo Oscuro

• Permite ver partículas y células vivas que están debajo de la resolución del microscopio común • Es usada en el estudio de pequeñas células móviles, que son invisibles con la microscopía óptica común.

Microscopio de Polarización

• similar al MO pero difiere en el agregado de dos filtros polarizadores de luz • estos hacen que el fondo de la imagen sea oscuro y las estructuras observada aparezcan brillantes • solamente se pueden ver las estructuras que son refringentes

Campo Claro

Contraste de Fases

Adecuado para analizar células y tejidos previamente fijados y coloreados

Células y tejidos transparentes e incoloros de hasta 10 µm de espesor, que no pueden ser teñidos o no se desea teñir

Interferencia

Células y tejidos transparentes de algunos cientos de µm de espesor

Campo Oscuro

Materiales transparentes e incoloros que muestran poco contraste en campo claro (células, plancton, bacterias, cristales, esporas, polen, etc...)

Fluorescencia

Estudio de células o tejidos con fluorescencia propia o tratados con fluorocromos

Polarización

Materiales refringentes tales como colágeno, microtúbulos, quitina, celulosa, cristales, etc...

Breve historia de la Microscopía

• 1608 Janssen construye un microscopio con dos lentes convergentes (microscopio compuesto).

• 1665 Hooke utiliza un microscopio compuesto para estudiar cortes de corcho y describe las células.

• 1674 Leeuwenhoek descubre los protozoarios.

• 1828 W. Nicol desarrolla el microscopio con luz polarizada.

Breve historia de la Microscopía • 1833 Brown describe el núcleo de la célula. • 1838 Schleiden y Schwann proponen la teoría celular. • 1857 Kolliker describe las mitocondrias en células musculares. • 1879 Flemming describe el comportamiento de los cromosomas durante la mitosis en células animales. • 1881 Retzius describe la mayoría de los tejidos animales con un microscopio de luz. • 1882 Koch usa anilina para teñir e identifica las bacterias que causan la tuberculosis y el cólera. • 1886 Zeiss fabrica lentes que permiten resolver estructuras en los límites teóricos de la luz visible. • 1898 Golgi describe por primera vez el aparato de Golgi tiñendo células con nitrato de plata.

Breve historia de la Microscopía • 1908 Köhler y Siedentopf desarrollan el microscopio de fluorescencia. • 1930 Lebedeff diseña y construye el primer microscopio de interferencia. • 1932 Zernike inventa el microscopio de contraste de fases. • 1937 Ernst Ruska y Max Knoll, físicos alemanes, diseñan el primer microscopio electrónico. • 1952 Nomarski inventa y patenta el sistema de contraste de interferencia diferencial para el microscopio de luz. • 1981 Aparece el microscopio de efecto túnel (MET).

Microscopio Electrónico

Microscopio Electrónico • permite observar la ultraestructura de las células • tiene un poder de resolución de 0,3 nm • se basa en la propiedad de los haces electrones de ser desviados en un campo electromagnético • la imagen se forma por la dispersión de los electrones que son desviados por el objeto observado • la dispersión depende del espesor del objeto y del número atómico de los átomos que lo componen • a mayor número atómico ocurre una mayor dispersión de electrones

Microscopio Electrónico de Transmisión • en el MET el material a analizar debe ser fino, porque los electrones tienen escaso poder de penetración, usualmente entre 7 y 15 nm • para ello la muestra es incluida en resinas de epoxi y se corta con un ultramicrótomo, equipado con una cuchilla de diamante, que permite hacer cortes de alrededor de 20 nm • una sola célula bacteriana, puede cortarse en cinco o seis secciones muy finas, que son examinadas después individualmente con el microscopio electrónico. • para el estudio de las membranas celulares se emplea la técnica de congelación y fractura de las células. • para superficies celulares pueden prepararse réplicas de carbono evaporando sobre la superficie de las células una fina capa de carbono

Microscopio de Transmisión (MET)

Microscopio Electrónico de Barrido • a diferencia del MET, el MEB permite obtener imágenes tridimensionales de los objetos. • en este caso un haz fino de electrones recorre la superficie del material. • los electrones dispersados por el material son recogidos por una pantalla de video. • para aumentar el poder dispersante de los electrones, suelen utilizarse sustancias químicas para revestir los materiales.

Microscopio de Barrido (MEB)

Leucoplastos

Escherichia coli

Técnicas

Cito-histológicas

“son todos los procedimientos a través de los cuales una muestra se transforma en una preparación adecuada para estudio microscópico”

Pasos de las Técnicas Citohistológicas 1. Obtención de la muestra

2. Fijación 3. Deshidratación 4. Inclusión 5. Cortes histológicos 6. Tinción

7. Montaje

1. Obtención de la muestra • Para muestras obtenidas a partir de animales, este debe estar vivo y anestesiado. • Los fragmentos deben ser pequeños, no mayores a 5 mm de espesor. • Se deben cortar con un instrumento muy afilado.

• Luego de extraída, la muestra debe ser sumergida inmediatamente en fijador.

2. Fijación • Es un método que permite conservar la morfología y composición de células y tejidos

• Consiste en matar a las células para que mantengan la estructura que poseían en vida • Se debe realizar inmediatamente después de extraer la muestra para evitar el deterioro • Los fragmentos de tejido deben ser lo más pequeño posible, para que el fijador penetre rápidamente. • Tiene además la finalidad de endurecer los tejidos, volviéndolos resistentes para las etapas siguientes.

3. Deshidratación • las piezas al ser retiradas del fijador están embebidas en agua • ello impide que sean penetradas por la parafina • en primer lugar, se deben deshidratar los tejidos sumergiéndolos en líquidos sin agua • generalmente se utiliza una serie creciente de alcohol etílico

4. Inclusión

• Sirve para obtener cortes finos de tejido porque cuanto más firme más delgado será el corte. • Lo más común es la inclusión en parafina, previo tratamiento con benceno o tolueno. • Se emplean moldes de papel o de metal, dónde se coloca la muestra y se vierte la parafina a 60ºC. • Se recortan los bloques en forma de pirámide cuadrangular y se adhieren a un taquito de madera

5. Cortes Histológicos

• Para observar tejidos en MO, se deben obtener láminas delgadas. • En casi todos los casos el elemento utilizado para los cortes es el micrótomo. • Son instrumentos de gran precisión que proporcionan cortes delgados parejos y de espesor graduable. • Los cortes más corrientes son los de 4-6 micrones. • Los cortes se extienden en agua tibia y se introduce el portaobjetos cubierto adhesivo.

6. Coloración o Tinción

1. Para obtener contraste y realizar observaciones morfológicas o estructurales. 2. Para identificar sustancias, moléculas o estructuras específicas.

Colorantes Animales (carmín) Naturales

Vegetales (hematoxilina, orceína)

Ácidos: sales con base incolora y ácido coloreado (eosina). Básicos: sales con base coloreada y ácido incoloro (azul de metileno). Artificiales o Sintéticos

Neutros: sales en que el ácido y la base son coloreados. Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro. Indiferentes: no forman sales, tiñen sustancias que tienen poder mayor disolvente que el líquido en que están disueltas (Sudán lll, rojo escarlata).

7. Montaje • Permite conservar las estructuras durante muchos años. • Luego de la coloración, se deshidrata el corte y se procede a la aclaración y montaje definitivo. • La deshidratación se realiza con alcoholes crecientes y la aclaración con xilol o alcohol. • Lo más común es efectuar la aclaración con xilol y luego montar la preparación en Bálsamo de Canadá. • También es frecuente la aclaración en alcohol absoluto y el montaje en Euparal.