La cadena respiratoria Los compuestos NADH y FADH2, originados fundamentalmente en el ciclo de Krebs, pero también en otros procesos catabólicos, albergan el poder reductor que les confieren los electrones "energéticos" que transportan. Esa energía será liberada, poco a poco, a lo largo de la cadena respiratoria ubicada en la membrana interna de las mitocondrias o en la membrana celular de los procariotas. Tanto el NADH como el FADH 2 ceden los electrones a la cadena formada de transportadores y, a medida que pasan de uno a otro, los electrones van liberando energía. Esa energía permite el bombeo de protones, lo que genera un gradiente electroquímico, entre la matriz mitocondrial y el espacio intermembrana (mitocondria) o entre el citoplasma y el espacio periplásmico (procariotas). La fuerza protón-motriz generada, impulsa los protones a través de las ATP sintasas, permitiendo la unión del ADP a un grupo fosfato, con la consiguiente formación de ATP. El conjunto de estos procesos, que culminan con la formación de ATP, constituyen la fosforilación oxidativa. Los electrones que han sido impulsados a lo largo de la cadena respiratoria, deben unirse a un aceptor final. En la respiración aerobia el aceptor último de electrones es el O2, que al unirse con H+ del medio, forma H2O como producto final.  La cadena respiratoria en Escherichia coli

E. coli es un microorganismo procariota por lo tanto carece de organelas internas y los componentes enzimáticos de la cadena respiratoria están ubicados en la membrana citoplasmática. La cadena respiratoria está integrada por dos grupos diferentes de enzimas: a) las deshidrogenasas: son flavoproteínas o metaloflavoproteínas que oxidan sustratos específicos (NADH, succinato, D-lactato, glicerol-3-fosfato, etc.) y reducen quinonas

(siendo la ubiquinona-8 o la menaquinona-8 la especie predominante en células crecidas en aerobiosis o anaerobiosis, respectivamente), b) las oxidasas terminales: oxidan a las quinonas reducidas y entregan los electrones al aceptor final (oxígeno, fumarato o nitrato). Estos sistemas de oxidasas terminales están constituidos por citocromos; el complejo del citocromo bo y el complejo del citocromo bd. El predominio de uno u otro sistema depende de la presión de oxígeno: alta presión, citocromo bo; baja presión, citocromo bd. En la Figura 1 se esquematiza un modelo de la cadena respiratoria aeróbica en E. coli. Complejo citocromo nH+

bo/bd

2H+

2H+

QH2

Periplasma

QH2 Membrana

A Q

Q 2e-

S´H2

S

½ O2+2H+ Deshidrogenasas

B

Citoplasma ½ O2+2H+

H2O SH2

interna 2eH2O

S

Esquema de la cadena respiratoria aeróbica de E. coli. Distintos sustratros (S´H2, SH2) interactúan con sus respectivas deshidrogenasas (A, B) reduciéndolas, éstas a su vez reducen ubiquinona-8 (Q) a ubiquinol-8 (QH2), el cual transfiere los equivalentes de reducción a cualquiera de las oxidasas terminales (complejo del citocromo bd, complejo del citocromo bo). Finalmente, las oxidasas transfieren los electrones al oxígeno para formar agua. A y B representan, respectivamente, a deshidrogenasas que generan o no gradiente electroquímico de protones. Ejemplos: A, NDH-1; B, NDH-2, D-LDH, SDH. Adaptado de Cronan y col., 1987. Cytoplasmic membrane, vol 1 pp. 31-55. Esherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology, American Society for Microbiology, Washington, DC.

 La cadena respiratoria en plantas Las plantas, al ser organismos pluricelulares, presentan organelas internas en su estructura, de manera que los componentes de la cadena respiratoria se ubican en la membrana de las mitocondrias. En plantas superiores y algunas algas, hongos y protistas, la cadena respiratoria se bifurca a nivel de la ubiquinona, por lo que existen dos vías de transporte de electrones hacia el oxígeno: la vía clásica de la Citocromo oxidasa (que comparte con animales) y la vía de la oxidasa alternativa (AOX), que no está presente en animales y es insensible al KCN pero se inhibe por el agregado de derivados hidroximatos como el SHAM (ácido salicilhidroxámico). Esta vía alternativa no está acoplada a la generación de ATP pero si lleva a la producción de calor. En la siguiente figura se esquematiza los componentes de la cadena respiratoria de plantas superiores. ESPACIO INTERMEMBRANA H+

H+

I

III II

UQ

H+ Cit.

IV

AOX

MI Cox

NADH

½ O2

Succinato +

NAD

SHAM

Fumarato

KCN H2O

MATRIZ Esquema de la cadena respiratoria mitocondrial de plantas. Se indica la bifurcación de la cadena de transporte a partir de UQ. Complejo I, NADH deshidrogenasa; Complejo II, succinato deshidrogenasa; Complejo III, citocromo bc1; Complejo IV, citocromo oxidasa (COX); AOX, oxidsasa alternativa; UQ, ubiquinona. SHAM, ácido salicilhidroxámico, inhibidor de AOX; KCN, cianuro de potasio, inibidor de COX. Adaptado de Vanlerberghe y McIntoch, 1997. Ann. Rev Plant Physiol. Plant Molecular Biol., vol. 48 pp.703-734.

Los peróxidos y los metales de transición (Fe/Cu) en relación con el estrés oxidativo Una consecuencia del metabolismo aeróbico es la producción de especies reactivas del oxígeno, que pueden interaccionar con las biomoléculas (DNA, lípidos, proteínas, etc.) provocando su alteración y degradación, con el consecuente daño celular. Toda situación de desbalance, ya sea por un aumento en la generación de esas especies reactivas o por una disminución en los sistemas defensivos, provoca lo que se denomina "estrés oxidativo".  Especies reactivas del oxígeno (ERO) El oxígeno es una especie triplete capaz de aceptar un electrón por vez, pero su potencial redox es bajo (Em=-0,16V), por lo que existen pocas biomoléculas capaces de transferirle un electrón. Es decir, no puede directamente oxidar aminoácidos o ácidos nucleicos. Sin embargo, si es capaz de oxidar lentamente las flavinas reducidas de la mayoría de las enzimas redox, presentes en la cadena respiratoria (NDH-2, succinato deshidrogenasa, sulfito reductasa y fumarato reductasa). Esta oxidación da lugar a la generación de especies más reactivas que el oxígeno, capaces de dañar las biomoléculas. Entre las especies derivadas del oxígeno, algunas son radicales libres tales como: radical hidroxilo (HO•), superóxido (O2•-), peroxilo (RO2•), óxido nítrico (NO•) y otras, que sin ser radicales libres, son también muy reactivas y son la fuente de muchos radicales libres, entre ellos se encuentran: peróxido de hidrógeno (H2O2), peróxidos orgánicos (RHO2), ácido hipocloroso (HClO), oxígeno singlete ('O2) y ozono (O3).  ¿Cómo y porqué se originan las ERO?

El O2•- y H2O2 son muy reactivos y pueden reaccionar con los clusters hierro-azufre de grupos tioles de las proteínas, los cuales no pueden reaccionar directamente con el oxígeno (Reacción 1).

O2

-0,33V

+0,94V

O2•-

H2O2

+0,38V

OH-+ HO•

+2,33V

H2O

Sin embargo, no son lo suficientemente potentes como para oxidar los ácidos nucleicos. El daño oxidativo sobre el DNA es debido a otra especie reactiva derivada del oxígeno, HO• (Reacción 3). Men++ reductor oxidado

Me(n+1)++ reductor?

Me(n+1)++ OH-+ HO•

Men++ H2O2 HO• + DNA

(2) (3)

(4)

H2O + lesión

Los mecanismos propuestos para la formación de las ERO involucran una reacción de Fenton sitio-específica donde participa un metal reducido (Me(n-1)+) que reacciona con el peróxido de hidrógeno (HO-OH) o con un hidroperóxido orgánico (RO-OH) produciendo la ruptura del enlace peroxilo (-O-O-) (Reacción 3). Los peróxidos pueden también reaccionar con el radical superóxido y generar radicales libres más reactivos mediante la reacción de Haber-Weiss, también catalizada por metales de transición (Reacción 5 y 6): Fe/Cu •-

O2 + HO• + OH-

HO-OH + O2

Fe/Cu RO-OH + O2•-

O2 + RO• + OH-

(5)

(6)

Moléculas como el H2O2 o radicales poco reactivos, pueden generarse en un lugar de la célula y trasladarse a otro lugar de ésta o aún migrar a células vecinas y ejercer allí su acción. Otros radicales, como el HO•, son tan reactivos que al originarse reaccionan

(1)

inmediatamente con moléculas próximas ya sean ácidos grasos, hidratos de carbono, proteínas o DNA. El radical HO• al atacar al DNA, puede hacerlo tanto sobre la desoxirribosa como sobre las bases púricas y pirimídicas. Por esto las ERO están implicadas en el desarrollo de enfermedades como el cáncer o el síndrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y de varias enfermedades degenerativas como ser aterosclerosis, injuria por reperfusión posisquémica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, artritis reumatoidea y esclerosis lateral amiotrófica.

Protocolo de trabajo  Practico nº 1 Cadena Respiratoria y Consumo de oxígeno Estudio de la cadena respiratoria en plantas Se determinará el consumo de oxígeno en muestras de flavedo de limones. Las muestras se tomarán de la parte coloreada de la cáscara del limón (flavedo) cuidando de no retirar nuestras de albedo (porción blanca de la cáscara), hasta alcanzar el peso requerido (50 mg) y se picará finamente. El consumo de O 2 de las muestras se determinará en suspensiones de 2 ml en buffer fosfato de sodio 50 mM pH 7,5 en ausencia y presencia de diferentes inhibidores: KCN 10 mM como inhibidor de la vía de los citocromos y SHAM 5mM como inhibidor de la vía alternativa de la cadena respiratoria. Se evaluará el grado de inhibición obtenido con cada uno de los compuestos, respecto al consumo de oxígeno en ausencia de los mismos.

Estudio de la cadena respiratoria en suspensiones bacterianas Se prepararán suspensiones celulares (Abs560nm=0,4) conteniendo 0,5% de glicerol como sustrato respirable a partir de cultivos de células crecidas hasta fase exponencial en medio LB. En dichas suspensiones se determinará comparativamente el consumo de oxígeno en presencia o ausencia de t-BOOH 5mM y Cu 1mM. De esta forma se analizará la participación del metal en este proceso. También se estudiará la respuesta frente a los mismos inhibidores probados para las muestras de flavedo de limones.

 Practico nº 2 Cadena Respiratoria y Producción de Especies reactivas del oxígeno (ERO) Determinación de niveles intracelulares de ERO La formación de ERO se determinará mediante el uso de la sonda 2´,7´dichlorofluorescein diacetato (H2DCFDA). Este compuesto como tal no fluoresce pero tiene características lipofílicas que le permiten difundir libremente al interior de la célula. En la membrana este compuesto es atacado por esterasas que hidrolizan y liberan el diacetado de la molécula convirtiéndola en una sustancia hidrofílica (H2DCF), que es incapaz de salir del compartimiento citosólico. Cuando esta sonda es oxidada por las ERO, se transforma en DCF, que si fluoresce. Hay una gran cantidad de sustancias que pueden oxidar a esta molécula pero especialmente el H2O2 es una de las ejerce un mayor efecto. La determinación de EROs se llevará a cabo midiendo la intensidad de fluorescencia en un espectrofluorómetro (ISS-PCI (Champaign, IL, USA)) o mediante el uso de un microscopía de fluorescencia Olympus BX51TF (Tokio, Japón).

490 nm

519 nm

490 nm

Protocolos de trabajo Determinación de la formación de ERO por espectroscopía de fluorescencia 1) Preparar 10 ml de una suspensión de Abs 560nm=0,5 en buffer fosfato de sodio 50 mM (pH=7,0) a partir de células de E. coli crecidas aeróbicamente en medio LB hasta Abs560nm=2,0. 2) Incubar 30 min a 37ºC en baño agitado en oscuridad en presencia de 10 μM de la sonda fluorescente. 3) Transferir a 4 tubos eppendorf (2 ml) y centrifugar (10000 rpm 5 min) para eliminar la sonda que no haya ingresado a la célula. Resuspender en el mismo volumen con buffer fosfato. 4) Transferir a tubos de vidrio los 2 ml de células, las cuales serán sometidas a diferentes tratamientos con: Control (sin sustancia), CuSO4 50 μM, t-BOOH 1 mM o una combinación de ambos compuestos. 5) Incubar las muestras 10 min a 37ºC en baño agitado. 6) Finalizado el tiempo de incubación transferir 1,5 ml a tubos eppendorf y lavar dos veces con buffer fosfato de sodio 50 mM (pH=7,0). 7) Sonicar las muestras durante 2 min en frio para liberar la sonda oxidada. 8) Para medir la intensidad de fluorescencia se realizará una dilución ½ con el buffer de trabajo y a la muestra se la excitará a una longitud de onda de 490 nm y se medirá la emisión a 519 nm. Determinación de la formación de ERO por microscopía de fluorescencia 1) Preparar 10 ml de una suspensión de Abs 560nm=1 en buffer fosfato de sodio 50 mM (pH=7,0) a partir de células de E. coli crecidas aeróbicamente en medio LB hasta Abs560nm=2,0.

2) Tranferir a tubos de vidrio 2 ml de células, las cuales serán sometidas a diferentes tratamientos con: Control (sin sustancia), CuSO4 50 μM y una combinación de t-BOOH 1 mM y Cu2+ 50 μM. 3) Incubar 10 min a 37ºC en baño agitado 4) Transferir a 3 tubos eppendorf (2 ml) y centrifugar (10000 rpm 5 min). Lavar 3 veces con buffer fosfato. 5) Transferir a tubos de vidrio los 2 ml de células e Incubar 30 min a 37ºC en baño agitado en oscuridad en presencia de 10 μM de la sonda fluorescente. 6) Finalizado el tiempo de incubación transferir 1,5 ml a tubos eppendorf y lavar 1 vez con buffer fosfato de sodio 50 mM (pH=7,0). 7) Colocar 15 o 20 µl entre porta y cubre y mirar al microscopio.

Determinación de la formación de ERO en extractos celulares. Medición directa 1) Para observar la formación de ERO, se partirá de la misma suspensión inicial de Abs560nm=0,5 la cual se sonicará por 5 min. 2) En la cubeta de medición se adicionará secuencialmente, el fluorescente y una fuente de carbono (Glucosa) para mantener la cadena respiratoria funcionando, y diferentes especies generadores de ERO como 50 μM de CuSO4, 1 mM de t-BOOH o 5 mM KCN (inhibidor de citocromos). 3) La intensidad de la fluorescencia será registrada durante 5 min después de adicionar cada uno de dichos compuestos o de una mezcla de ellos.