MAESTRÍA EN MICOLOGÍA MÉDICA – UNNE Trabajo práctico - Identificación de levaduras
Módulo III – Dermatomicosis
Infecciones por levaduras En la toma, transporte y procesamiento de las muestras se siguen las mismas normas que las correspondientes a las dermatofitosis (Ver guía Módulo III, 1ra. Parte) •
Materiales necesarios Portaobjetos estériles (puede hacerse por flameado con mechero Bunsen) se preparan de a pares. Sindesmótomos de punta curva o recta Bisturí tipo Collins Mango de bisturí y hojas N° 15 de punta redonda Cureta de Brocq Tijeras Pinzas diente de ratón Pinza de depilar Hisopos Alcohol Cinta adhesiva transparente Hojas de papel blanco para envolver portas y anotar los datos del paciente y el número de identificación en el SIL Control de calidad: Colocar una gota del reactivo entre porta y cubreobjetos y observar al microscopio con objetivo de 40X. No deben aparecer hifas, esporas de hongos, levaduras ni bacterias.
Procesamiento de las escamas 1. Examen directo • • • • •
Una porción de las escamas o pelos obtenidos se colocan sobre un portaobjetos estéril con la ayuda de un sindesmótomo. El portaobjetos debe contener la identificación de la muestra Sobre un cubreobjetos se coloca una gota de KOH o sus variantes y se cubre el material con este cubre. Se calienta suavemente hasta que comience a desprender burbujas. Si la preparación contiene DMSO, no se calienta y se deja reposar. Aplastar suavemente el material con ayuda de un papel absorbente. El material está listo para ser observado microscópicamente con óptica seca (objetivo de 10-20-40X).
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Módulo III – Dermatomicosis
En caso de hisopados (fauces, flujos vaginales, etc.) el examen directo puede realizarse sin agregar KOH para aclarar la muestra. Solamente se coloca una gota del material del hisopo sobre un portaobjetos esterilizado y luego el cubreobjetos y se observa con objetivo seco (10-40X). Luego se quita el cubreobjetos y el material puede extenderse y teñirse con Gram si es necesario (para visualizar mejor las levaduras y ver microbiota acompañante). En el caso de sospecha de infección por bacterias queratinofílicas (Nocardia/Corynebacterium minutissimum, Nocardia/Corynebacterium tenuis); luego de observar las escamas aclaradas con KOH, se recogen dichas escamas del porta y del cubreobjetos mediante el agregado de agua destilada, en un tubo cónico y luego se centrifugan a 3000 rpm durante 5 min. Se vuelca todo el sobrenadante; con el sedimento se preparan improntas colocando unas gotas del material en pequeños círculos (2-3) sobre un portaobjetos, se deja secar, se fija con calor y luego se colorea con azul de metileno o Giemsa, debe tenerse mucho cuidado al lavar los preparados para que no se despeguen las escamas (lavar por inmersión). Si se sospecha la presencia de Malassezia en las escamas, estas deben procesarse aclarándolas con KOH-tinta Parker Quink azul-negro permanente. También pueden ser teñidas con azul de metileno al 1%. Si las escamas son muy escasas pueden recogerse con cinta adhesiva transparente y pegar la cinta sobre un portaobjetos, luego se añade por los costados KOH-tinta o azul de metileno y se espera que penetre debajo de la cinta por capilaridad. Se deja unos minutos antes de observar microscópicamente. Si las escamas son muy escasas también pueden adherirse al portaobjetos con una gota de suero estéril, se dejan secar y luego se tiñen 5 minutos y se lavan por inmersión muy cuidadosamente. Se miran con objetivo de inmersión.
2. Cultivos Las escamas cutáneas se siembran en 2-3 tubos con los medios de Sabouraud, lactrimel, donde Candida y otras levaduras crecen perfectamente, evitar medios con cicloheximida que inhiben el desarrollo de algunos hongos levaduriformes. La siembra se hace con gancho que se esteriliza a la llama y se enfría en el fondo del tubo de cultivo, de manera que algo del medio quede adherido al gancho. Se toman las escamas y se siembran en 3-4 puntos haciendo pequeñas incisiones en el medio a 1 cm de distancia una de la otra. Los cultivos se incuban a temperatura ambiente (25-28 °C) durante 2 semanas. Las levaduras crecen más rápidamente que los dermatofitos pero los cultivos deben mantenerse ese tiempo porque si en el examen directo no se observaron hifas o levaduras, pueden crecer dermatofitos u otros hongos filamentosos en los cultivos. Los hisopados se siembran en los mismos medios antes mencionados y también pueden sembrarse medios con sustratos cromogénicos para iniciar la identificación presuntiva de las levaduras (siempre en placa y para obtener colonias aisladas).
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Medios cromogénicos Existen varios medios comerciales en nuestro país, en polvo o ya preparados en placa. Entre los primeros se encuentra CHROMagar Candida®, Brilliance Candida® (Oxoid), ambos se preparan según las indicaciones de los fabricantes, el primero solamente requiere disolver el polvo en agua y calentar hasta que el medio está completamente transparente pero sin hervir para evitar deterioro de los sustratos cromogénicos; el segundo tiene una mezcla de antibióticos que no está incluida en el polvo y debe añadirse a la preparación del medio. Ambos brindan resultados similares (1). Entre los medios preparados en placa está Candida ID® (bioMérieux).
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Identificación Para realizar la identificación correcta de las levaduras debemos partir de una única colonia aislada. Existen numerosas marchas de identificación, aquí les presentamos la utilizada por nosotros. Debe tenerse en cuenta que el medio cromogénico y la micromorfología solamente permiten la identificación presuntiva. Los métodos manuales o automatizados de identificación dan habitualmente muy buenos resultados pero siempre debe partirse de colonias aisladas y cultivos puros, y acompañarlos de los métodos presuntivos antes mencionados para ver la concordancia de los resultados y no cometer errores. El método clásico de identificación es la realización del auxanograma de carbono (estudio de la asimilación de diferentes fuentes de carbono), el auxanograma de
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nitrógeno (utilización de fuentes de nitrógeno) y el zimograma (capacidad de fermentación de distintos azúcares). A esto deben sumarse otras pruebas complementarias, la siembra en medios para favorecer la producción de ascosporas, etc. Esto demanda varios días de trabajo y consumo de muchos tubos y placas. Por otra parte, los equipos de identificación comerciales permiten obtener resultados desde 4 a 48 horas, con mucho menos trabajo y cuentan con bases de datos que permiten la identificación correcta de las levaduras frecuentes en la clínica micológica. En nuestro medio los más utilizados son API (20C, ID32) métodos manuales o semiautomáticos de bioMerieux, Vitek 2 que es un sistema de tarjetas automatizadas de bioMerieux, ELIchrom (ELItech Group) que es una galería con 7 sustratos cromogénicos y 11 sustratos convencionales como azúcares, urea, cichoheximida, Microscan, RapID Yeast Plus (Remel).
ELIchrom
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Medios de cultivo útiles para la identificación y diferenciación de levaduras AGAR LECHE Droga Agar Agua destilada Tween 80 % Leche
Cantidad 2g 100 ml 1 ml 1 ml
Disolver el agar en el agua calentando hasta ebullición y luego agregar el Tween. Fraccionar en tubos con tapa a rosca, colocando 10 ml de medio en cada uno. Esterilizar en autoclave a 1 atm durante 15 minutos. Guardar en la heladera hasta el momento de uso. Fraccionar leche pasteurizada (abrir el envase en el momento de preparar) en criotubos estériles con 1 ml cada uno. También puede utilizarse leche descremada en polvo esterilizada. En el momento de usar fundir un tubo de agar y agregar en forma estéril 100 µl de leche por tubo. Homogeneizar y distribuir 3 ml por portaobjetos esterilizado en una caja de Petri estéril con papel de filtro húmedo o algodón humedecido para mantener el cultivo en cámara húmeda. Utilidad: este medio es utilizado para observar la formación de tubos germinativos (3 horas a 37 °C) y luego la de clamidoconidios a las 48-72 h a 28 °C. También es un buen medio para observar la micromorfología de diversas levaduras.
AGAR NIGER (Medio de Staib)
Droga Semillas de Guizotia pulverizadas Glucosa KH2PO4 Creatinina Agar Agua destilada csp.
Cantidad 50 g 10 g 1g 1g 15 g 1000 ml
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Pulverizar las semillas en molinillo de café o similar. Mezclar con 300 ml de agua y autoclavar 15 minutos a 1 atm. Filtrar por gasa y al filtrado se le agregan los demás componentes y se lleva a 1 litro con agua destilada. Fundir y fraccionar en tubos de 10 ml cada uno. Esterilizar en autoclave a 1 atm durante 15 minutos. Guardar en heladera hasta el momento de su uso. Para evitar el desarrollo de hongos ambientales se agrega solución de difenilo (0,1 ml a cada tubo de 10 ml) después de autoclavar y con el medio a 45 °C. La solución de difenilo se prepara disolviendo 1 g de difenilo en 100 ml de etanol 95%. Luego se añade asépticamente al medio de cultivo. Al momento de usar, proceder como con el medio de agar leche.
Agar harina de maíz Este medio comercializa en polvo y se prepara de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Para prepararlo en forma casera: Droga Harina de maíz Agar Agua desmineralizada csp.
Cantidad 42 g 12 g 1l
Calentar la harina de maíz en 1 litro de agua a 60 °C durante 1 hora, luego filtrar por papel y restituir el volumen con más agua hasta llegar a 1 litro. Agregar el agar y calentar hasta divolverlo. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 min.
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Agar tabaco*
Droga
Cantidad
Preparación del extracto de tabaco
Tabaco para pipa, (Exeter, Nobleza-Picardo)** 50 g Agua destiada 1l Hervir 30 min y luego filtrar por varias capas de gasa. Luego se añade al filtrado: Agar 20 g Agua csp 1000 l Disolver el agar, luego autoclavar a 121°C, 15 min. pH 5.4. Verter en placas de Petri *Khan ZU, Ahmad S, Mocadas E, Chandy R. J Clin Microbiol 2004. ** En el trabajo original se utilizan el tabaco de 2 atados de cigarrillos Marlboro.
Opacidad en medio con Tween 80*
Droga
Cantidad Peptona 10 g Cloruro de sodio 5g Cloruro de calcio 1g Agua destilada 1000 ml Autoclavar a 121°C 15 min y dejar enfriar hasta 50 °C, agregar: Tween 80 5 ml Verter en placas de Petri * Slifkin M. J Clin Microbiol 2000
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Medio de cloruro de sodio 11% Droga Extracto de levadura Peptona Glucosa Cloruro de sodio Agar Agua
Cantidad 1g 2g 2g 11 g 3g 100 ml
Se disuelven los componentes en agua, se agrega el agar. Se esteriliza por autoclavado a 121 °C durante 15 min. Se vierte en placas de Petri. Se pueden sermbrar varios aislamientos en la misma placa con multiinoculador o sembrando en puntos separados. Como control de calidad debe sembrarse una cepa de C. albicans y una de C. dubliniensis
Medio de Gorodkowa Droga Glucosa Cloruro de sodio Peptona Agar Agua corriente
Cantidad 1g 5g 10 g 20 g 1l
Esterilizar por autoclavado a 121 °C durante 15 min.
Medios para pruebas de asimilación de fuentes de carbono y de nitrógeno (Auxanograma). Medio base de nitrógeno para pruebas de asimilación de fuentes de carbono Droga Medio base de nitógeno (YNB Difco) Agar de alta pureza Agua destilada
Cantidad 6,7 g 20 g 1000 ml
Disolver el YNB y añadir el agar. Fraccionar en tubos con 20 ml y esterilizar por autoclavado a 121 °C durante 15 minutos.
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Para realizar el auxanograma de carbono se utilizan los siguientes azúcares: glucosa, galactosa, lactosa, maltosa, sacarosa, rafinosa, trehalosa, D-glucosamina, celobiosa, ametil-D-glucósido, melizitosa, inulina, almidón soluble, sorbosa, arabinosa, ribosa, ramnosa, D-xilosa, L-arabinosa
Medio base de carbono para pruebas de asimilación de fuentes de nitrógeno Droga Medio base de carbono (YCB Difco) Agar de alta pureza Agua destilada
Cantidad 11,7 g 20 g 1000 ml
Disolver el YCB en el agua y añadir el agar. Fraccionar en tubos con 20 ml y esterilizar por autoclavado a 121 °C durante 15 minutos. Sirve para probar la capacidad de asimilación de nitrato. Se prueba con nitrato de sodio y como control positivo se utiliza sulfato de amonio o peptona. Para realizar las pruebas de asimilación existen diferentes metodologías. Una de ellas consiste en incorporar una suspensión de la levadura a estudiar en el medio de cultivo y luego colocar discos impregnados con los distintos azúcares (auxanograma de carbono) o las fuentes de nitrógeno (auxanograma de nitrógeno) o bien hacer pequeños orificios que se llenan con soluciones al 20% de los diferentes sustratos y se observa el halo de desarrollo alrededor. Otra posibilidad es incorporar 1 azúcar en cada placa y sembrar varios aislamientos con un multiinoculador y observar para cada aislamiento con qué azúcar crece. Estudio de utilización de otros sustratos: etanol, glicerol, meso-eritritol, ribitol, galactitol, D-manitol, D-glucitol, D-gluconato, DL-lactato, succinato, salicina, citrato, mio-inositol, medio libre de vitaminas, 2-ceto-D-gluconato, cicloheximida 0,01% o 0,1%. Pruebas de fermentación. Se utilizan los siguientes azúcares: glucosa, galactosa, sacarosa, maltosa, lactosa, rafinosa. Estas pruebas se llevan a cabo en 6 tubos con 2 ml de agua peptonada al 1% y 1 de los azúcares a probar (al 2%); después de hervirlas 10 min para expulsar el oxígeno se siembra la suspensión de levadura en estudio cuidando de no hacer burbujas. Se cubre con 1 ml solución de vaspar (vaselina-parafina en partes iguales) y se incuba a 37 °C y se observa la producción de gas. Puede hacerse también utilizando campanas de Durham. Otras características: capacidad de crecimiento a distintas temperaturas
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Medio CHROM-Pal’s Droga Cantidad Polvo de semillas de girasol 50 g Hervir 30 min en 1 l de agua y filtrar por gasa. Este es el extracto de semilla. Añadir: Creatinina 1g Glucosa 1g KH2PO4 1g Agar 15 g Llevar a pH 5,5 luego agregar el agar y autoclavar a 110 °C por 20 min. Preparar el CHROMagar según las indicaciones del fabricante. Se mezclan partes iguales de ambos medios a 45-55 °C y luego se vierte en placas y se deja solidificar. Sirve para diferenciar morfológicamente C. albicans (colonias lisas de color verde claro y no producen clamidoconidios) de C. dubliniensis (colonias rugosas de color verde azulado y producción de clamidoconidios)
Tomado de: Sahand IH, Moragues MD, Eraso E, Villar-Vidal M, Quindós G, Pontón J. Suplementation of CHROM agar Candida medium with Pal’s medium for rapid identification of Candida dubliniensis. J. Clin. Microbiol. 2005; 43: 5768-70
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Medios utilizados para el aislamiento e identificación de levaduras lipofílicas Medio de Dixon Droga
Cantidad 60 g 20 g 10 ml 2,5 g 0,5 g 0,5 g 1l
Extracto de malta Bilis de buey Tween 40 Monooleato de glicerol Cloranfenicol Cicloheximida Agua desmineralizada Ajustar el pH a 6,0-6,5 y luego añadir Agar 15 g Disolver el agar y esterilizar por autoclave a 115 °C durante 15 min.
Medio de Dixon modificado Droga Extracto de malta Peptona Bilis de buey Tween 40 Glicerol Ácido oleico Cloranfenicol Cicloheximida Agua desmineralizada Ajustar el pH a 6,0-6,5 y luego añadir Agar
Cantidad 36 g 10 g 20 g 10 ml 2 ml 2g 0,5 g 0,5 g 1l 15 g
Disolver el agar y esterilizar por autoclave a 115 °C durante 15 min.
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Medio de Leeming – Notman Droga Peptona Glucosa Extracto de levadura Bilis de buey Tween 60 Glicerol Glicerol monoestearato Cloranfenicol Leche de vaca descremada Agua desmineralizada Agar
Cantidad 10 g 5g 0,1 g 4g 0,5 ml 1 ml 0,5 g 0,5 g 10 ml 1l 12 g
Disolver el agar y esterilizar por autoclave a 115 °C durante 15 min.
Medio de Tween 60-esculina Droga Peptona Glucosa Extracto de levadura Citrato amónico-férrico Esculina Tween 60 Agar Agua desmineralizada
Cantidad 10 g 10 g 2g 0,5 g 1g 5 ml 15 g 1l
Disolver todas las drogas en el agua, ajustar el pH a 7,4 y añadir el agar. Distribuir en tubos con 8 ml de medio y esterilizar a 115 °C durante 15 min. Medio CHROMagar-tween Droga CHROM agar en polvo Tween 40 Agua destilada
Cantidad 56,3 g 10 ml 1000 ml
Mezclar los componentes y calentar cuidadosamente hasta disolución total. No debe hervir.
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Agar Cremophor (aceite de castor) Droga Agar Sabouraud glucosado en polvo Cremophor Agua destilada
Cantidad 65 g 10 ml 1000 ml
Disolver los elementos y luego esterilizar autoclavando a 121 °C durante 15 min.
