GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2015 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE LABORATORIO N°1 PROTEINAS Introducción: Los aminoácidos son compuestos orgánicos con un grupo ácido (carboxilo -COOH) y un grupo básico (amina -NH2), unido al carbono  (carbono inmediato al carboxilo), es decir son  - aminoácidos. Presentan actividad óptica (excepto la glicina) y la configuración “L” es la de mayor interés bioquímico. Los aminoácidos pueden establecer enlaces covalentes entre el grupo carboxilo de uno y el grupo amina de otro, denominados “uniones peptídicas”, de tipo amida y que se producen con pérdida de agua. Los polímeros formados por hasta diez aminoácidos unidos por uniones peptídicas se llaman péptidos, los que poseen más de 10 residuos de aminoácidos pero menos de 50 se denominan polipéptidos y los que superan ese número se denominan proteínas. Las proteínas son macromoléculas formadas por un gran número de aminoácidos. Poseen una estructura muy compleja, por lo que se la describe en distintos niveles de organización: - Estructura Primaria: se refiere al número e identidad de los aminoácidos que componen la molécula y al ordenamiento de estas unidades en la cadena polimérica (secuencia de aminoácidos). Las cadenas son lineales, no poseen ramificaciones por la naturaleza de la unión peptídica. - Estructura Secundaria: es la disposición espacial regular y repetitiva que adopta la cadena polimérica. Puede ser  -hélice,  -lámina o lámina plegada, o bien disponer la cadena en una estructura irregular, en tal caso se habla de una disposición al azar. Estas estructuras se mantienen unidas por puentes de hidrógeno. - Estructura Terciaria: se refiere a la arquitectura tridimensional completa de una cadena de resíduos de aminoácido. De acuerdo con la forma final se clasifican en globulares y fibrosas. Estas conformaciones se mantienen unidas por fuerzas de atracción o repulsión electrostática, enlaces de hidrógeno, presencia de cadenas hidrofóbicas e hidrofílicas y puentes disulfuro según el tipo de aminoácidos que constituyan la molécula. - Estructura Cuaternaria: es la disposición espacial de las subunidades polipeptídicas constituyentes de las proteínas formadas por más de una cadena polipeptídica o monómero (proteínas oligoméricas, mero: parte). Las fuerzas responsables de mantener en posición a las diferentes subunidades son las mismas que en el caso anterior. La secuencia de aminoácidos de una proteína es el principal determinante de su conformación espacial, propiedades y características funcionales. Los requerimientos estructurales para que una proteína cumpla su papel fisiológico son muy rigurosos, no solo es necesario mantener el número y tipo de aminoácidos constituyentes, además, cada uno de ellos debe ocupar una posición definida en la cadena. Alteraciones en ese ordenamiento o sustituciones de aminoácidos pueden afectar la capacidad funcional de la molécula hasta tornarla inútil. Cuando las proteínas son sometidas a la acción de agentes físicos como calor, agitación mecánica, radiaciones, etc., o agentes químicos como ácidos o álcalis fuertes, detergentes iónicos, agentes caotrópicos (urea, guanidina), solventes orgánicos, metales pesados, etc., pueden sufrir alteraciones en su conformación al modificarse las fuerzas que mantienen unidas las estructuras. Esta desorganización estructural resulta en la pérdida de las propiedades naturales y funcionalidad de la proteína. El proceso se denomina desnaturalización y se pierden las estructuras cuaternaria, terciaria y secundaria de la proteína, de modo irreversible en la mayoría de los casos. La estructura primaria no se ve afectada ya que los agentes desnaturalizantes no atacan la unión peptídica. Sin embargo, experimentalmente se comprobó que la desnaturalización proteica en algunos casos puede ser reversible cuando los tratamientos desnaturalizantes no son tan drásticos. Las proteínas desnaturalizadas (ej. la clara de huevo calentada) son menos solubles y precipitan, pierden su capacidad de cristalizar, tienen mayor reactividad química y son más fácilmente atacadas por enzimas.

GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2015 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE 1- Reacción de Biuret Fundamento: Los péptidos y proteínas forman complejos de coordinación con el ión cúprico (Cu++). Cada ion Cu++ se liga a la cadena aminoacídica por 4 valencias de coordinación aportadas por pares electrónicos libres de átomos de nitrógeno (figura 1). Los iones Cu++ reaccionan tanto con los N de las uniones peptídicas (dando color rojo) como con los N de grupos amino libres (dando color azul) lo que da por resultado un color violáceo. Utilidad: Esta reacción es muy utilizada para poner en evidencia la presencia de polímeros de aminoácidos e incluso cuantificarlos en fluidos biológicos (orina, sangre, líquido cefalorraquídeo, etc.). La cuantificación se basa en el hecho que los complejos coloreados absorben energía, de modo que a mayor cantidad de complejo coloreado formado, mayor será la cantidad de energía absorbida. Esta energía, de una longitud de onda específica (540nm) para cada compuesto, se puede determinar utilizando un equipo de laboratorio. O C

C O

HN

NH

R CH

HC R Cu2+

O C

C O

HN

NH

R CH

HC R

Figura 1: Complejo de coordinación entre Cu2+ y nitrógeno proteico Materiales: - Tubos de ensayos - Pipetas - Propipetas - Baño termostático - Gradillas Reactivos: - Reactivo EDTA/Cu: complejo EDTA/Cu 13 mmol/l en NaOH 875 mmol/l y alquil aril poliéter (AAP) - Agua destilada - Muestra: suero Procedimiento: Rotular tres tubos de ensayo: 1, 2 y 3 y proceder según el siguiente esquema de trabajo: - Tubo1: 50 l de agua destilada + 3,5 ml del reactivo EDTA/Cu. (control negativo) - Tubo2: 50 l de suero + 3,5 ml del reactivo EDTA/Cu. - Tubo3: 50 l de suero diluido al medio con solución fisiológica + 3,5 ml del reactivo EDTA/Cu. Mezclar por agitación e incubar durante 15 minutos a 37°C en baño termostático. Observar los colores generados en cada tubo y las intensidades. Resultados: - Tubo1: coloración azul del reactivo EDTA/Cu. - Tubo2: coloración violeta intenso del complejo proteína – Cu. - Tubo3: coloración violeta pálido del complejo proteína – Cu. 2- Prueba de Heller Fundamento: Es una prueba específica e importante por su facilidad de realización. Se fundamenta en la acción desnaturalizante de un agente químico (Ácido Nítrico: HNO3) sobre las proteínas presentes en una muestra, poniéndose en evidencia el resultado por la disminución de la estabilidad de las mismas en disolución, lo cual provoca su precipitación. Utilidad: Se trata de una prueba para la detección de proteínas en orina utilizando ácido nítrico como reactivo. Los fluidos biológicos poseen una cantidad de proteínas que los caracterizan, por

GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2015 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE ejemplo en el plasma de un individuo normal (caninos, felinos, equinos, etc.) en ayunas hay 68g/dL, pero en la orina no debería detectarse proteínas, ya que durante el proceso de formación de la misma se realiza un filtrado de la sangre, siendo retenidas en el cuerpo evitando que se pierdan. Sin embargo en determinadas situaciones fisiológicas y patológicas las proteínas pueden aparecer en la orina y por ello hay pruebas de laboratorio que permiten detectarlas. Materiales: - Tubos de ensayos - Pipetas -Propipetas - Gradillas Reactivos: - Ácido Nítrico concentrado - Agua destilada - Muestra: Orina Procedimiento: Rotular tres tubos de ensayo con los números 1 (control negativo), 2 (control positivo) y 3 (Muestra problema). Colocar en el tubo 1, 4ml de agua destilada, en el tubo dos 4ml de muestra control positivo y en el tubo 3, 4 ml de muestra problema. Inclinar los tubos a 45º sobre la mesada y agregar a cada uno, lentamente por las paredes, 1 ml de ácido nítrico concentrado. Reservar los tubos en una gradilla y observar el resultado. Resultado: La visualización de un anillo insoluble blanquecino en la zona de separación de ambas fases líquidas, pone en evidencia la presencia de proteínas desnaturalizadas indicando positividad de la prueba. ENZIMAS Introducción: Las enzimas son catalizadores biológicos en la mayoría de los casos de naturaleza proteica, ya que se ha descripto la actividad catalítica en moléculas de ARN (Ribozimas), que aumentan la velocidad de reacciones químicas en seres vivos. Actúan disminuyendo la energía de activación de la reacción química. Como todo catalizador, no se consume durante las reacciones que cataliza y a diferencia de los catalizadores inorgánicos, son específicas para cada reacción química y permiten que éstas ocurran en condiciones de temperatura, presión y pH compatibles con la vida. Las enzimas se clasifican según el tipo de reacción que catalizan en seis grupos: - oxidorreductasas - transferasas - hidrolasas - liasas - ligasas - isomerasas Estructuralmente, las enzimas poseen un sitio activo, que es la región mediante la cual se une a su sustrato. Esta región posee una estructura tridimensional determinada por residuos de aminoácidos distribuidos espacialmente de manera precisa. La actividad enzimática puede modificarse al variar la concentración enzimática, concentración del sustrato, por acción de cambios de temperatura, pH y presencia de inhibidores entre otros. 1- Reacción de Reconocimiento y Desnaturalización de Catalasa Fundamento: La catalasa es una enzima que se encuentra en las células de los tejidos animales y vegetales que posee la función de catalizar la hidrólisis de un producto tóxico que se genera durante el metabolismo celular, el peróxido de hidrógeno (H2O2) generando agua y oxígeno según la siguiente reacción. Pertenece a la categoría de las oxidorreductasas (EC1.11.1.6)

GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2015 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE Utilidad: Realizaremos las siguientes pruebas para poner en evidencia la presencia de catalasa en tejido animal (visualizando los productos finales de la reacción que cataliza) y para destacar la importancia de la estructura tridimensional de las enzimas para mantener su funcionalidad. La existencia de catalasa en los tejidos animales, se aprovecha para utilizar el agua oxigenada como desinfectante cuando se aplica sobre una herida. Como muchas de las bacterias patógenas son anaerobias (no pueden vivir en presencia de oxígeno), mueren con el desprendimiento de oxígeno que se produce cuando la catalasa de los tejidos actúa sobre el agua oxigenada. Materiales: - Tubos de ensayos - Pipetas - Pinza - Propipetas - Gradillas Reactivos: - Peróxido de Hidrógeno (Agua oxigenada) - Muestra: Tejido hepático de ave fresco y hervido previamente Procedimiento: Rotular dos tubos de ensayo: 1 y 2. Introducir en el tubo 1 trocitos de hígado fresco y en el 2 trocitos de tejido hepático previamente hervido en agua. Añadir a cada tubo 5 ml de agua oxigenada. Observar

Figura 2: Esquema del procedimiento de la Reacción de Reconocimiento y Desnaturalización de Catalasa

Resultados: la observación de burbujas se corresponde con la presencia de oxígeno, uno de los subproductos de la reacción. Dicha observación correlaciona con la presencia de la enzima funcional. La ausencia de burbujeo puede asociarse con pérdida de funcionalidad enzimática por desnaturalización térmica de la catalasa. ACIDOS NUCLEICOS Introducción: son sustancias del más alto rango biológico, a ellos se atribuyen importantes funciones tales como ser reservorio de la información genética y responsables de su transmisión de una célula a otra célula hija o de una individuo a otro. Poseen un rol fundamental en el proceso de síntesis proteica ya que dirigen el ensamblaje correcto de aminoácidos. Los ácidos nucleicos, ADN y ARN son estructuras poliméricas de doble y simple cadena respectivamente. En el ADN el monómero constituyente recibe el nombre de desoxirribonucleótido mientras que para ARN, su denominación es ribonucleótido y químicamente están constituidos por un azúcar, una base nitrogenada (púrica o pirimidica) y un grupo fosfato que al pH celular le confiere cargas negativas. Al azúcar se unen las bases nitrogenadas por enlace N-glicosídicos y los grupos fostato por enlaces de tipo fosfoéster. Luego cada nucleótido se une a otro mediante enlaces fosfodiéster establecidos entre el grupo fosfato de un nucleótido con el oxhidrilo 3´de otro. Se genera de este modo una monohebra que se mantiene unida a otra cadena “Complementaria” por enlaces Puente de hidrógeno, en el caso de ADN. Electroforesis de ADN

GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2015 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE La electroforesis es una técnica empleada para separar moléculas basándose en propiedades como tamaño, conformación o carga eléctrica. Consiste en utilizar una matriz o soporte semisólido con una estructura molecular porosa, a través de la cual pueden migrar moléculas de diferentes tamaños cuando se aplica un campo eléctrico, en un medio conductor de la corriente eléctrica (buffer de corrida). Las moléculas más pesadas migran más lentamente que las más livianas o de menor tamaño. Por tener las moléculas de ADN y ARN cargas negativas, estas moléculas se mueven hacia el polo positivo del soporte semisólido (agarosa en nuestro caso). Las matrices que se utilizan son muy variadas y su elección depende de la finalidad de la electroforesis. Una de las más utilizadas es la compuesta por agarosa (polisacárido obtenido de algas), polvo blanco, que se disuelve en un medio iónico a altas temperaturas. A la agarosa disuelta, en caliente, se le agrega un colorante que permita la visualización de las moléculas separadas (tradicionalmente, Bromuro de etidio) y luego se vierte en una plataforma cuadrada o rectangular que contiene un dispositivo similar a un peine cuyos dientes servirán como impresión para generar un hueco (pocillo) donde se depositarán las muestras a separar. Una vez solidificada la matriz con el colorante, se retira el peine con sumo cuidado. Se traslada el gel a la cuba de electroforesis que contiene el buffer de corrida y se cargan (siembran) las muestras problemas en cada pocillo generado. Antes de la siembra, se mezcla la muestra problema con un buffer de siembra que contiene entre otros componentes, un colorante (en general azul de bromofenol) que posibilita la visualización del cargado como así también el avance del frente de corrida. Se aplica un campo eléctrico y se espera a que la separación ocurra. Cuando se ha completado la electroforesis, se procede a la etapa de revelado mediante la visualización por transiluminación con luz UV, ya que el bromuro de etidio además de intercalarse entre las bases de los ácidos nucleicos, emite una radiación fluorescente al ser irradiado con luz ultravioleta, observándose en caso positivo, bandas rojo- anaranjadas. Si se siembran varias muestras una junto a otra en el gel, se producirán separaciones paralelas, mostrando cada una bandas de distintos tamaños correspondientes a cada componente de la mezcla. Si las separaciones son incompletas, se dará un solapamiento entre bandas haciendo indistinguibles dos o más componentes. Existen marcadores especiales que contienen una mezcla de moléculas de ADN de tamaños conocidos, llamados marcadores de peso molecular, que se siembran en cada proceso de separación electroforética con la finalidad de comparar las alturas de las bandas de dicho marcador con aquellas provistas por las muestras problema para determinar su tamaño. 1- Electroforesis de Ácido Desoxirribonucleico Preparación de Agarosa 1,5% Pesar 1,5g de agarosa y agregar buffer TBE (EDTA, ácido bórico, tris) 1.0X hasta alcanzar un volumen final de 100ml. Disolver la agarosa por calentamiento en microondas. Agregar 3µl de solución de Bromuro de etidio (10mg/ml) y volcar sobre plataforma de acrílico con peine. Dejar solidificar. Retirar el peine y disponer en cuba de electroforesis con buffer TBE 1.0x. Siembra, Corrida y Revelado Mezclar 2l de buffer de siembra (azul de bromofenol, glicerol y agua) y 10l de solución de ADN. Homogeneizar con pipeta automática y sembrar en cada pocillo del gel preparado con anterioridad. Correr a 100voltios durante 25minutos. Retirar el gel y observar el ADN por transiluminación con luz UV.

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Foto 1: electroforesis en gel de agarosa

BIOSEGURIDAD DEL LABORATORIO N°1 Riesgos químicos: ACIDO NITRICO: Ingestión: Corrosivo. Dolor abdominal, sensación de quemazón, shock. Inhalación: Sensación de quemazón, tos, dificultad respiratoria, pérdida del conocimiento. Piel: Puede causar severas quemaduras. Ojos: Quemaduras graves e irritación ocular. PERÓXIDO DE HIDROGENO: El peróxido de hidrógeno es muy irritante en concentraciones altas, ya que causa quemaduras temporales al desprenderse en la reacción el oxígeno. La ingestión de soluciones diluidas de peróxido de hidrógeno puede inducir vómitos, leve irritación gastrointestinal, distensión gástrica, y en raras ocasiones, erosiones o embolismo (bloqueo de los vasos sanguíneos por burbujas de aire) gastrointestinal. Ingerir soluciones de 10-20% de concentración produce síntomas similares, sin embargo, los tejidos expuestos pueden también sufrir quemaduras. Ingerir soluciones aún más concentradas, además de lo mencionado anteriormente, puede también producir rápida pérdida del conocimiento seguido de parálisis respiratoria. BROMURO DE ETIDIO: Es una sustancia fuertemente mutagénica y es irritante a los ojos, piel, mucosas y el tracto respiratorio. Los efectos sanitarios de la exposición a este compuesto no han sido todavía investigados profundamente. Se sospecha que puede ser cancerígeno y teratogénico por su cualidad de mutagenicidad, aunque no hay ninguna prueba concluyente de ninguno de estos efectos. Si se ingiere, se inhala o se absorbe por la piel, esta sustancia puede tener efectos nocivos. Riesgo de Incendio: En estos laboratorios trabajaremos con mecheros de Bunsen por lo que tendremos que tomar las medidas necesarias para evitar quemaduras e incendios. Riesgo eléctrico: Verificar las instalaciones eléctricas así como el mantenimiento de los equipos empleados. En estos laboratorios utilizaremos el baño termostático. Riesgos Biológicos: TEJIDOS (hígado), SUERO Y ORINA: Siempre que se manipule material biológico se deben tomar ciertas precauciones como el uso de guantes, barbijos, antiparras, guardapolvos o delantales y evitar ingestión y contacto con mucosas.