formación de colonias en tres líneas celulares diferentes que no expresan la SLC5A8, pero no en tres líneas celulares que sí expresan SLC5A8. Por lo tanto, los autores propusieron a SLC5A8 como un gen supresor de tumores en cáncer de colon, pero no aportaron ninguna explicación al efecto supresivo, pero observaron una alta concentración de sodio intracelular en ovocitos de X. laevis que expresan la SLC5A8 (Li et al., 2003).

Varias publicaciones en 2004, reportaron que en ovocitos de X. laevis que expresan la SLC5A8 se observan corrientes inducidas por monocarboxilatos en condiciones de Voltage-Clamp (Coady et al., 2004; Gopal et al., 2004; Miyauchi et al., 2004). Los monocarboxilatos (entre ellos lactato, piruvato, acetato, propionato, butirato y nicotinato) serían sustratos de SLC5A8. Como era de esperarse para un transportador pasivo de yodo, ninguna corriente inducida por el yodo fue observada en estos experimentos. Un aumento en la captación de monocarboxilatos fue observada en ovocitos que expresan la SLC5A8, en comparación con los ovocitos control. En consecuencia, se propuso que el rol fisiológico de SLC5A8 es el transporte acoplado al sodio de lactato en el riñón y de butirato en el colon.

Por décadas, se ha observado que la fibra en la dieta reduce el riesgo de cáncer de colon. En el lumen del colon, monocarboxilatos (como el butirato) son producidos por fermentación bacteriana, y se ha propuesto que estos podrían ser responsables del efecto supresor de tumores de la fibra. Adicionalmente, se ha mostrado que el butirato es un inhibidor de las deacetilasas de histonas (HDACs). La inhibición de las HDACs promueve la diferenciación en las células epiteliales de colon, pero induce apoptosis en las células tumorales. Así, se propuso que SLC5A8 puede funcionar como un cotransportador sodio/monocarboxilatos (butirato, propionato y piruvato), y que el efecto supresor de tumores de la proteína estaría relacionado con la inhibición de las HDACs inducida por el aumento en la concentración de estos monocarboxilatos, mediada por su captación a través de SLC5A8. Para soportar esta hipótesis, realizaron experimentos en los que muestran que la expresión de genes 75

involucrados en la apoptosis o en la sobrevida celular es modificada (Ganapathy et al., 2008), y que la expresión de SLC5A8 induce muerte celular en células de la línea MCF-7 (células tumorales de seno) en presencia de piruvato (Thangaraju et al., 2006), o en células de la línea SW480 (células de cáncer de colon) en presencia de butirato (Thangaraju et al., 2008) o piruvato (Thangaraju et al., 2009). Sin embargo, esta hipótesis no explica el rol fisiológico de SLC5A8 en la tiroides.

Los primeros análisis realizados sobre un ratón invalidado para la proteína SLC5A8 han sido muy informativos (Frank et al., 2008). Primero, la pérdida de la expresión de SLC5A8 no incrementa la susceptibilidad a la formación de tumores en el colon. Adicionalmente, no se observaron diferencias en el transporte de butirato o propionato en el colon, lo que es explicado por los autores por una captación predominante de estos monocarboxilatos por otros transportadores o por una difusión facilitada. Sin embargo, la pérdida de la expresión de SLC5A8 alteró la reabsorción de lactato en el riñón y en las glándulas salivares, y la captación dependiente de sodio de lactato en el colon. Estos resultados confirman una relación entre el transporte de monocarboxilatos y la expresión de SLC5A8, pero sugieren que esta actividad de transporte no está directamente relacionada con la función supresora de tumores a través de la inhibición de HDACs. Además, no se encontró ninguna disfunción en la tiroides en los ratones invalidados para SLC5A8, indicando que esta proteína no es indispensable para el normal funcionamiento de la tiroides.

Los resultados obtenidos con el ratón invalidado para SLC5A8 sugieren que la pérdida de la expresión de esta proteína no es importante en la inducción de tumores. Sin embargo, es extraño el creciente número de publicaciones que reportan el silenciamiento por metilación del gen que codifica para SLC5A8 en cáncer en diferentes órganos: colon (Li et al., 2003), recto (Dong et al., 2005), estómago (Ueno et al., 2004), tiroides (Lacroix et al., 2004, Porra et al., 2005), cerebro (Hong et al., 2005), próstata (Park et al., 2007), páncreas (Park et al., 76

2008), cabeza y cuello (Bennett et al., 2008), y en sangre (Whitman et al., 2008). Por lo tanto, se requiere una mejor comprensión de la función de SLC5A8 y su efecto supresor de tumores.

En esta parte del trabajo, se presentan experimentos que por primera vez asocian la expresión de SLC5A8 con una actividad tipo canal implicada en la regulación de la glándula tiroides por el yodo. Dicha actividad tipo canal podría también explicar el efecto antiproliferativo de la expresión de SLC5A8 y su función supresora de tumores.

A. 1. MATERIALES Y MÉTODOS

a. Plásmidos

La región codante del gen que codifica para la proteína hSLC5A8 fue subclonada en un plásmido pcDNA3.1 (Invitrogen, Cergy Pontoise, France) como ha sido descrito previamente (Rodriguez et al., 2002). Para el seguimiento de la transfección transitoria de SLC5A8 en células de mamífero, el ADNc de SLC5A8 fue subclonado en un plásmido pIRES-EGFP (Clontech, St-Quentin-en-Yvelines, France). De igual forma, se construyó un plásmido derivado con ADNc que codifica una proteína SLC5A8 fusionada por el extremo C-terminal a una proteína Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP).

b. Cultivo celular

Se cultivaron células de la línea HEK-293 (Human Embryonic Kidney), o HeLa (derivada de cáncer de cérvix) en medio de cultivo DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino, 10 mM L-glutamina y 0.01 mg/mL de gentamicina, en una atmósfera húmeda con 5% de CO2. 77

Todos los medios de cultivo, suplementos y reactivos se obtuvieron de Invitrogen (Cergy Pontoise, France).

c. Transfecciones

Las células HEK fueron sembradas en cajas de cultivo de 35 mm de diámetro cubiertas con 10 mg/mL de poli-L-lisina (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France), a una densidad de 3 x 106 células/75 cm². En general, las transfecciones se realizaron al día siguiente, a aproximadamente 40% o menos de confluencia, utilizando el reactive FuGENE 6 (Roche, Meylan, France), siguiendo el protocolo propuesto por el fabricante. Para cada experimento, la eficiencia de transfección fue estimada utilizando un ensayo de fluorescencia con la proteína EGFP. Usualmente, entre el 30 y el 50% del total de las células expresaron la proteína SLC5A8.

d. Medidas electrofisiológicas en células transfectadas de mamífero

Las células transfectadas expresaron la proteína EGFP, tomando una coloración verde bajo una luz ultravioleta en un microscopio de fluorescencia Nikon. Células individuales transfectadas fueron estudiadas utilizando la técnica de Patch-Clamp. La solución externa contenía 150 mM de NaCl, 1mM de MgCl2, 2 mM de CaCl2 y 10 mM de HEPES, y se ajustó el pH a 7.4 con NaOH. La solución interna (o solución de pipeta) contenía 150 mM de KCl, 3 mM de MgCl2, 5 mM de EGTA y 10 mM de HEPES, y se ajustó el pH a 7.2 con KOH. La célula bajo estudio fue constantemente perfundida con ayuda de un sistema de microperfusión (0.01 mL/min) a temperatura ambiente, y el potencial de reposo fue fijado a -60 mV. Las células fueron perfundidas con soluciones 0.1 mM de diferentes monocarboxilatos (butirato, propionato, piruvato, nicotinato y lactato; Sigma-Aldrich), de ácidos hipohalosos 1 µM (ver abajo), y soluciones de yodo oxidado 1 µM. La corriente requerida para mantener el 78

potencial fijado fue registrada con ayuda de un Multi Clamp 700A from Axon Instruments (Molecular Devices, Sunnyvale, USA).

e. Preparación de los ácidos hipohalosos

Una solución stock de HOCl se preparó por dilución de una solución concentrada de NaOCl (Sigma-Aldrich) en agua, hasta una concentración final de 30 mM. Esta solución stock fue diluida en la solución externa, antes de adicionarla a las células. El HOI/I2 se preparó mezclando volúmenes iguales de NaI 35 mM (Sigma-Aldrich) y HOCl 30 mM durante 60 minutos.

f. Preparación del ARNc de SLC5A8 y aislamiento e inyección de ovocitos de X. laevis

El ARNc de SLC5A8 fue sintetizado a partir de un vector de clonación pcDNA3.1 (ver arriba) con el mMessage mMachine T7 Ultra kit (Ambion, Applied Biosystems, Courtaboeuf, France), siguiendo las recomendaciones del fabricante. Partes de los lóbulos de ovarios fueron removidos de hembras de X. laevis anestesiadas (compradas en el Centre d’Elevage du CNRS, Montpellier, France) e incubados durante 4 horas a 18 °C en una solución de Ringer libre de calcio (Ori) que contenía 2 mg/ml de colagenasa (tipo A, (Sigma-Aldrich)), 1 mg/ml de inhibidor de tripsina (Sigma-Aldrich) and 0.1 mg/ml de gentamicina (Invitrogen)). Los ovocitos en etapa de desarrollo V-VI fueron microinyectados (microinyector Nanoject II, Drummond, Broomall, PA, USA) con 23 ng de ARNc de SLC5A8 y conservados en solución Ori a 18°C hasta el momento de ser utilizados en los experimentos. La composición de la solución Ori fue: 110mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl2 y 5 mM de HEPES (pH 7.5).

79

g. Medidas electrofisiológicas de ovocitos de X. laevis inyectados

Para estudiar las corrientes asociadas a la SLC5A8 clonada en los ovocitos, se utilizó la técnica de Voltage Clamp convencional de dos microelectrodos. Todos los experimentos fueron realizados con los ovocitos de 4 a 6 días después de la inyección del ARNc de SLC5A8. El potencial de reposo de los ovocitos se fijó a -40 mV y la corriente necesaria para mantener dicho potencial fue medida (Dagan TEV-200A Two Electrode Voltage Clamp). Durante los experimentos, cada ovocito se mantuvo bajo perfusión constante (con un flujo de aproximadamente 1.5 mL/min) con una solución experimental (TpNa) que contenía: 100 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 1 mM de CaCl2 y 10 mM de HEPES (pH 7.5), suplementado con monocarboxilatos o yodo, según lo indicado. La solución de pipeta contenía KCl 3 M.

h. Medidas de la concentración de hormonas en el suero

La concentración de las hormonas T3 y T4 en el suero fue medida por RIAs, por duplicado, en el suero de ratones invalidados para el gen que codifica la proteína SLC5A8. Estos ratones fueron previamente desarrollados en la Unidad TIRO (Trabajo en publicación).

i. Ensayos de proliferación celular in vitro

Las células de la línea HEK-293 fueron sembradas en cajas de cultivo de 12 pozos cubiertas con 10 mg/mL de poli-L-lisina (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France), a una densidad de 1 x 106 células/75 cm². En general, las transfecciones se realizaron al día siguiente, a aproximadamente 30% o menos de confluencia, utilizando el reactivo FuGENE 6 (Roche, Meylan, France), siguiendo el protocolo propuesto por el fabricante. Las células fueron 80

cultivadas en medio DMEM suplementado con 10% SFB en tres condiciones experimentales: 1) Medio control, 2) medio sin piruvato y 3) medio suplementado con 0.1 mM de una forma no metabolizable de vitamina C (ácido D-ascórbico; Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France). Se prepararon tres pozos para cada condición experimental y 9 imágenes, correspondientes al mismo campo (determinado por marcas en la caja de cultivo) fueron tomadas por pozo, para cada día. La adquisición de imágenes se realizó 1, 2 y 3 días después de la transfección, utilizando un microscopio Zeiss Axiovert 200M equipado con una cámara CoolSnap CCD (Photometric) y el programa METAView (Roper Scientific, Evry, France). Las células que expresaron la proteína SLC5A8 fusionada con la EGFP fueron contadas utilizando una imagen de fluorescencia y las células totales utilizando una imagen de contraste de fase del mismo campo.

j. Análisis estadístico

El Error Estándar de la Media (S.E.M por sus siglas en inglés) fue calculado para todos los experimentos utilizando el programa Excel. Igualmente, se realizó una prueba t de Student para determinar diferencias significativas, utilizando el programa SigmaStat (Systat Software Inc., London, UK).

A. 2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

a. La transfección transitoria de SLC5A8 en células de mamífero induce una conductancia de sodio activada por monocarboxilatos y bajas concentraciones de yodo oxidado

Las Corrientes inducidas por monocarboxilatos ya han sido descritas en ovocitos de X. laevis inyectados con el ARNc de SLC5A8, así como la captación de monocarboxilatos marcados 81

radioactivamente en células de mamíferos que expresan la SLC5A8. Juntos, estos resultados indicarían que la SLC5A8 es un cotransportador sodio/monocarboxilatos. En este trabajo se investigó si las corrientes inducidas por los monocarboxilatos pueden ser observadas en células de mamífero que expresen la SLC5A8. Células de la línea HEK-293 fueron transfectadas de forma transitoria con el ADNc que codifica la proteína SLC5A8. Un primer set de experimentos fue realizado con el ADNc que codifica para la proteína SLC5A8 fusionada a la proteína EGFP, lo que permitió verificar la expresión de esta proteína a nivel de la membrana plasmática de las células. Los experimentos de Patch-Clamp fueron realizados 48 horas después de la transfeccción. Como se ilustra en la Figura 10A con un experimento típico, los monocarboxilatos estudiados (butirato, propionato, piruvato, nicotinato y lactato) inducen una corriente de entrada en las células HEK que expresan SLC5A8. Aunque la concentración de las soluciones de monocarboxilatos siempre fue la misma (0.1 mM), de una célula a otra la amplitud de las corrientes fue variable. Esta variación puede estar relacionada con diferencias en la expresión de proteínas de una célula a otra. En general, para todas las células, los cinco monocarboxilatos estudiados indujeron corrientes de la misma amplitud relativa, siendo las corrientes de mayor intensidad las de propionato y nicotinato. Se observaron corrientes de menor intensidad con butirato y corrientes muy pequeñas con lactato y piruvato. Ninguna corriente significativa fue observada en células HEK-293 control (transfectadas sólo con la proteína EGFP).

En trabajos anteriores se postuló que la SLC5A8 puede catalizar una difusión facilitada de yodo, siendo este un transporte no acoplado (Rodriguez et al., 2002). Sin embargo, ninguna corriente asociada a la presencia de yodo fue observada en ovocitos de X. laevis que expresan la SLC5A8 (Coady et al., 2004; Miyauchi et al., 2004). En este trabajo se investigó si el yodo puede inducir corrientes en células de mamíferos que expresen la SLC5A8. Altas concentraciones de yoduro no indujeron ninguna corriente significativa en células HEK transfectadas con el ADNc de SLC5A8. Pero, sorpresivamente, soluciones no preparadas recientemente de bajas concentraciones de yoduro indujeron corrientes en estas células. En 82

la Figura 10B se muestra un registro representativo obtenido con una solución 1 µM de yodo que fue preparada al menos una semana antes de ser utilizada. Es sabido que el yodo en solución a bajas concentraciones alcanza un equilibrio de diferentes especies, conocidas como especies oxidadas de yodo (I2, HOI, OI-, IO3-, etc.), por lo que el sustrato inductor de las corrientes observadas podría ser una de dichas especies oxidadas de yodo. Así, para verificar esta hipótesis, se prepararon soluciones de HOI por oxidación de NaI en presencia de HOCl que, a su vez, fue preparado por dilución de una solución de NaOCl. Una corriente comparable a la obtenida con el yodo a baja concentración fue obtenida con esta solución (marcada como HOI/I2; Figura 10B). Estas corrientes se encontraron con soluciones de HOI/I2 de 1 µM y 50 µM (Tabla 2). De igual forma, este mismo tipo de corrientes fueron observadas con soluciones de Cl oxidado (HOCl).

83

Figura 10: Registros representativos de las Corrientes obtenidas en células HEK-293 que expresan la SLC5A8. (A) registro típico de las corrientes inducidas por monocarboxilatos. (B) Registros representativos de las corrientes inducidas por el yodo oxidado. (C) Comparación de las corriente inducidas por yodo oxidado en células HEK-293 transfectadas con el ADNc que codifica la proteína de fusión SLC5A8/EGFP, o las proteínas SLC5A8 y EGFP de forma separada.

Como se muestra en la Figura 10B, la amplitud de las corrientes observadas en presencia de yodo oxidado varía fuertemente de un experimento a otro. En la mayoría de experimentos, la amplitud observada de la corriente fue de entre 30 y 200 pA, que corresponde a aproximadamente

la

misma

amplitud

que

las

corrientes

observadas

con

los

monocarboxilatos. Algunas veces la amplitud de las corrientes fue menor (Figura 10). En 49 84

de los 138 experimentos realizados, no se observó ninguna corriente asociada al yodo oxidado, aunque las corrientes asociadas a los monocarboxilatos sí fueron observadas en la misma célula (Tabla 2). En pocos experimentos se observó una amplitud de corriente asociada al yodo oxidado superior a 4000 pA (Figura 10B). La razón de esta variabilidad no ha sido completamente determinada. En el caso de las grandes amplitudes, podría deberse a la presencia de complejos de unión entre las células HEK, lo que permitiría registrar la actividad de membrana de varias células al hacer el registro electrofisiológico de una de ellas. De igual forma, debe tenerse en cuenta que las especies de yodo oxidado son moléculas muy inestables (Kessler y Hooge, 2007), y que la expresión de SLC5A8 es tóxica para las células (Thangaraju et al., 2006).

Número de células parched con corriente inducida por monocarboxylate Corrientes significativa inducida por HOI

Corriente no detectada inducida por HOI

Nativa SLC5A8

50

26

EGFP-fusionada SLC5A8

39

23

Corrientes significativa inducida por HOX

Corriente no detectada inducida por HOX

HOI/I2 1 µM

16

7

HOCl 1 µM

4

3

HOI/I2 50 µM

6

2

Proteína expresada

HOX

Tabla 2: Número de células HEK-293 que mostraron corrientes inducidas por monocarboxilatos, que también mostraron Corrientes inducidas por especies oxidadas de yodo (HOI) o por moléculas oxidadas (HOX). Los experimentos se realizaron 48 después de la transfección transitoria de las células con SLC5A8. EGFP: Enhanced Green Fluorescent Protein.

Teniendo en cuenta las bajas concentraciones de yodo utilizadas, la amplitud de las corrientes observadas no puede relacionarse a una actividad de cotransporte. Las corrientes observadas deben corresponder a una actividad tipo canal que es inducida por la presencia del yodo oxidado. En las condiciones experimentales utilizadas en Patch-Clamp en estos experimentos, estas corrientes de entrada deben corresponder a corrientes de entrada de sodio. 85

Para verificar que la fusión al extremo C-terminal de una proteína EGFP no estuviese modificando las propiedades funcionales de SLC5A8, un nuevo conjunto de experimentos fue realizado utilizando células HEK transfectadas con un plásmido recombinante que codifica las dos proteínas de forma separada (plásmido derivado de un pIRES-EGFP). Los resultados obtenidos fueron comparados con los obtenidos con la proteína de fusión SLC5A8-EGFP. Como se ilustra en la Figura 10C, las corrientes inducidas por los monocarboxilatos y por el yodo fueron similares bajo las dos condiciones.

Al igual que otros grupos, no se observaron corrientes inducidas por el yodo (50 µM o 1 mM) en ovocitos de X. laevis inyectados con el ARNc de SLC5A8. Tampoco se observaron corrientes significativas con soluciones a baja concentración de yodo oxidado. Las corrientes inducidas por los monocarboxilatos fueron observadas y registradas. Finalmente, para verificar que las corrientes inducidas por el yodo no son específicas de las células HEK-293 que expresan la SLC5A8, se realizaron experimentos en células de la línea HeLa. Las corrientes asociadas al a presencia de SLC5A8 fueron más pequeñas en esta línea celular, pero se observaron tanto las corrientes asociadas a monocarboxilatos como las corrientes asociadas al yodo oxidado. Reuniendo los resultados obtenidos, indican que SLC5A8 sería activado en presencia de especies oxidadas de yodo, especialmente HOI, induciendo una corriente de entrada de sodio. Este tipo de actividad sería consecuente con una función de sensor de formas oxidadas de yodo para SLC5A8. Recientemente, el ácido hipoyodoso (HOI) ha sido postulado como la molécula encargada de la organificación del yodo en la tiroglobulina, para la posterior formación de las hormonas tiroides (Kessler et al., 2008). Una función sensor, que permita controlar las concentraciones de esta molécula sería coherente para ejercer una regulación de la producción de hormonas en la glándula. 86

b. Las corrientes relativas inducidas por los diferentes monocarboxilatos varían según el tipo de célula que exprese SLC5A8

Cómo la expresión de SLC5A8 en células de mamífero tiene un efecto antiproliferativo, los experimentos de Patch-clamp fueron realizados en células transfectadas de forma transitoria con SLC5A8. En estas condiciones experimentales, las amplitudes de las corrientes observadas puede variar según el tamaño de las células y el nivel de expresión de la proteína. Como se menciona arriba, en células que expresan la LSC5A8, de una célula a otra la amplitud de las corrientes inducidas por el yodo puede llegar a ser muy diferentes. Esto puede estar relacionado con la inestabilidad del sustrato, yodo oxidado (Kessler y Hooge, 2007); y la expresión de SLC5A8. La corriente inducida por el yodo fue igualmente observada en otras líneas celulares transfectadas de forma transitoria con el ADNc de SLC5A8, como la HeLa, pero no en ovocitos de X. laevis inyectados con el ARNc de SLC5A8. La aparición de las corrientes inducidas por los monocarboxilatos fue siempre utilizada como control positivo de la expresión de SLC5A8 en la membrana de la célula. Así, tanto en las células que presentaron una corriente inducida por el yodo como en las que no, existió siempre una corriente inducida por monocarboxilatos. Esto puede sugerir que SLC5A8 no cataliza por sí misma la corriente inducida por el yodo, o que requiere asociarse a otra proteína para hacerlo. Se ha propuesto que SLC5A8 cataliza por sí mismo el transporte electrogénico de diferentes monocarboxilatos (Ganapathy et al., 2005). Teniendo en cuenta la hipótesis de que SLC5A8 no cataliza por sí mismo las corrientes inducidas por el yodo, se buscó determinar si esta proteína cataliza por sí misma las corrientes inducidas por los monocarboxilatos. Si es el caso, la amplitud relativa de las corrientes inducidas por los diferentes monocarboxilatos a una misma concentración debería ser independiente del tipo celular donde se exprese. Así, para cada célula la intensidad de la corriente inducida por adición a la solución de perfusión de butirato, propionato, piruvato, nicotinato y lactato (a una concentración final de 100 µM cada uno) fue medida. Como se ilustra en la 11A, en células HEK (ver también la Figura 10A) y 87

HeLa que expresan la SLC5A8, se encontraron corrientes de amplitud muy diferente. El mismo tipo de experimento fue realizado en ovocitos de X. laevis que expresan SLC5A8. En la 11B, todas las corrientes inducidas por los monocarboxilatos fueron normalizadas para cada

célula con respecto a la amplitud de la corriente inducida por el butirato (fijada como 100%). Se observaron varias diferencias: 1) la corriente inducida por el propionato fue mayor que la inducida por el butirato en células HEK-293 (117 ± 16 %, n = 9), y menor en células HeLa (73 ± 3.5 %, n = 5) o en ovocitos de X. laevis (76 ± 3, n = 11); 2) la corriente inducida por el piruvato fue ligeramente menor que la inducida por el butirato en ovocitos de X. laevis (69 ± 3 %), y mucho menor en células HEK-293 (25 ± 4.9 %) y HeLa (23 ± 9 %); 3) la corriente inducida por el nicotinato fue ligeramente mayor a la inducida por el butirato en células HEK-293 (114 ± 9 %), y menor en células HeLa (59 ± 19 %) y ovocitos de X. laevis (64.5 ± 3.5 %). De igual forma, el mismo experimento fue realizado en células HEK-293 que expresan la SLC5A8 48 y 72 horas después de la transfección. Al comparar la amplitud de las corrientes inducidas por los monocarboxilatos, se observó una disminución en la amplitud de las corrientes inducidas por el butirato, propionato y lactato; y corrientes de una amplitud similar o superior para el piruvato y superior para el nicotinato (Figura C). Al normalizar los experimentos para cada célula con respecto a la amplitud de la corriente inducida por el butirato, las variaciones en el tiempo de las corrientes inducidas por el piruvato y el nicotinato, comparadas con las de butirato, propionato y lactato, se observan fácilmente (Figura D).

88

Figura 11: Variabilidad de la amplitud de las corrientes inducidas por monocarboxilatos en diferentes tipos celulares que expresan la SLC5A8. Células HEK-293 y HeLa, y ovocitos de X. laevis que expresan la SLC5A8 fueron perfundidos con soluciones 0.1 mM de butirato, propionato, piruvato, nicotinato y lactato. La amplitud de las corrientes inducidas fue registrada por Patch-clamp (HEK-293 y HeLa) o Voltage-Clamp (ovocitos), dos días después de la transfección o inyección inyección.. En la figura se muestran registros representativos (A) y la comparación de las corrientes (B) inducidas por los monocarboxilatos en células HEK-293, HeLa y ovocitos de X. laevis; y registros representativos (C) y comparación de las corrientes inducidas (D) en células HEK-293, 2 y 3 días después de la transfección. Todas las corrientes inducidas por los mono monocarboxilatos carboxilatos fueron normalizadas para cada célula con respecto a la amplitud de la corriente inducida por el butirato (fijada como 100%).

Los resultados obtenidos al comparar la amplitud de las corrientes inducidas por los monocarboxilatos en diferentes tipos celulares (células HEK-293, HeLa y ovocitos de X.

laevis), indican un efecto del tipo celular sobre el comportamiento de la proteína SLC5A8. Ya ha sido descrito para SLC5A8 una alta variabilidad en la estequiometria del transporte

acoplado al sodio, que cambia dependiendo del monocarboxilato transportado (Gopal et al., 2004). Esta variabilidad explica la diferencia en la amplitud de la corriente inducida por cada monocarboxilato en un mismo tipo celular. El cam cambio bio de la amplitud relativa de la corriente inducida por un monocarboxilato al cambiar el tipo celular donde la SLC5A8 es expresada

(Figura B), indicaría un cambio en la selectividad o la estequiometria del transporte realizado 89

por SLC5A8 para ese monocarboxilato en particular. Esto mostraría una regulación de la función de SLC5A8 por proteínas endógenas en cada tipo celular, por interacción directa o indirecta con SLC5A8. La presencia de un dominio PDZ ha sido reportado para SLC5A8 (Anzai et al., 2007), aunque no se observa en la estructura putativa de la proteína, sugiriendo la capacidad de esta proteína para interactuar, regular y/o ser regulada por otras proteínas. Finalmente, no puede descartarse la posibilidad de que esta variabilidad en las características funcionales de SLC5A8 dependiendo del tipo celular, esté relacionada con el cambio en el microambiente lipídico con el que interactúa la proteína en la membrana. Este tipo de comportamientos ya ha sido observado para otras proteínas de membrana (Locke y Harris, 2009). El cambio en las características funcionales de SLC5A8 dependiendo del tipo celular en donde es expresada podría explicar la no aparición de la corriente inducida por el yodo oxidado en los ovocitos de X. laevis.

c. Ratón invalidado para SLC5A8 presenta niveles de hormonas normales, pero no responde a excesos de yodo como el ratón silvestre.

En los ratones invalidados para SLC5A8 la función de la tiroides fue aparentemente normal, como ya había sido observado en otro ratón deficiente para SLC5A8 (Frank et al., 2008). Sin embargo, los resultados obtenidos en Patch-Clamp indicarían una función putativa para SLC5A8 como sensor de especies oxidadas de yodo en la membrana apical de los tirocitos. De acuerdo a dicha hipótesis, es de esperarse que esta proteína juegue un rol en la regulación de la tiroides por el yodo. Una alta administración de yodo induce una inhibición en la tiroides conocida como el efecto Wolff-Chaikoff (Wolff y Chaikoff, 1948). Este efecto se caracteriza por una disminución de la capacidad de captación de yodo y una disminución transitoria de la secreción de hormonas (Eng et al., 1999). Para verificar si SLC5A8 está implicado en la regulación de la tiroides por el yodo, se compararon las concentraciones de hormonas tiroides en el plasma, después de la administración de una alta dosis de yodo, 90

entre los ratones invalidados para SLC5A8 y los ratones silvestres. Como se ilustra en la

Figura 11, uno y seis días después de la aadministración dministración del yodo los ratones invalidados para SLC5A8 (KO) no presentaron una disminución en la concentración de hormonas tiroides en el plasma, como sí la presentaron los ratones silvestres (WT). Estos resultados indican que SLC5A8 puede ser un senso sensorr de especies oxidadas de yodo implicado en la fase inicial del

efecto Wolff-Chaikoff.

Figura 11: Medida de la concentración de las hormonas tiroideas T3 y T4 en ratones invalidados para el gen que codifica la proteína SLC5A8 (KO (KO)) y ratones silvestres (WT). La concentración de las hormonas T3 y T4 fue medida por RIA en el plasma de los ratones KO y WT inmediatamente, 1 día y 6 días después de la administración de una alta dosis de yodo.

d. El efecto antiproliferativo de SLC5A8 es inhibido en presencia de antioxidantes Para determinar si el efecto antiproliferativo de la expresión de SLC5A8 está relacionado con la entrada de sodio activada por moléculas oxidadas, se midió el efecto de la incubación con antioxidantes en el medio de cultivo sobre la proliferación de células de mamífero que

expresan la SLC5A8. Células de la línea HEK-293, transfectadas de forma transitoria con el 91

ADNc que codifica una proteína de fusión SLC5A8/EGFP, fueron cultivadas en medio DMEM

suplementado con 10% de SFB y: 1) 110 mg/mL de piruvato (condición control), 2) en ausencia de piruvato (condición sin piruvato) y 3) 110 mg/mL de piruvato y 0.1 mM de ácido

D-ascórbico (condición con Vitamina C). La proliferación celular fue evaluada por conteo del número de células que expresaron SLC5A8 (imagen de fluorescencia) y el número total de células, 24, 48 y 72 horas después de realizada la transfección. Para cada condición de cultivo, y para cada día, el número de células fue normalizado respecto al número de células presentes en la condición control a las 24 horas (que se tomó como el 100%).

Figura 12: Estudio del efecto antiproliferativo de la expresión de SLC5A8. Células de la línea HEK-293 que expresan la proteína de fusión SLC5A8/EGFP SLC5A8/EGFP,, fueron cultivadas en medio DMEM suplementado con 10% de SFB y: sin ácido D-ascórbico (DMEM), y 0.1 mM de ácido D-ascórbico (DMEM + Vit C). En la figura se muestran las imágenes obtenidas a las 24 y 72 horas posteriores a la transfección, por contraste de fases (panel superior) y fluorescencia (panel inferior). 92

Según lo reportado por Ganapathy y colaboradores (2008), el efecto antiproliferativo de la expresión de SLC5A8 estaría relacionado con la presencia de monocarboxilatos en el medio de cultivo. Para verificar esta hipótesis, las células HEK-293 que expresan la SLC5A8 fueron incubadas en un medio desprovisto de piruvato (monocarboxilato presente en la mayoría de medios de cultivo). A las 24 horas después de la transfección, el número de células fluorescentes al microscopio en la condición control indicaron un rendimiento de transfección de aproximadamente 30% (ver primer panel de la Figura 12A). Aunque el número de células que expresaron SLC5A8 fue ligeramente mayor en la condición sin piruvato a las 24 horas que en el control, no se observaron diferencias estadísticamente significativas entre estas dos condiciones (Figura 13A). De igual forma, no hubo diferencias significativas en el número de células que expresaron SLC5A8 a las 48 y 72 horas entre estas dos condiciones, aunque se observó una ligera diferencia en el número de células, siendo menor para la condición sin piruvato (Figura 13A). Aunque no se observaron diferencias significativas, esta disminución del número de células en la condición sin piruvato con respecto a la condición control también se observó en las células HEK-293 que no expresan SLC5A8 (Figura 13B), indicando un ligero efecto de la ausencia de piruvato en la proliferación celular. Este efecto, sin embargo, sería independiente de la expresión de SLC5A8. En los resultados obtenidos no se observa la relación de la presencia de monocarboxilatos en el medio con el efecto antiproliferativo de SLC5A8 propuesta por el equipo de Ganapathy.

De igual modo, aunque el número de células que expresaron SLC5A8 fue ligeramente mayor en la condición con vitamina C a las 24 horas que en el control, tampoco se observaron diferencias estadísticamente significativas entre estas dos condiciones (Figura 13A). Sin embargo, a las 48 y 72 horas después de la transfección, el número de células que expresan SLC5A8 es significativamente mayor en la condición con vitamina C, al compararla con la condición control (Figura 12 y Figura 13A). Aunque el número de células que no expresan SLC5A8 es ligeramente mayor en la condición con vitamina C, en comparación con la 93

condición control, a las 48 y 72 horas, esta diferencia no es estadísticamente significativa, ni es tan apreciable como la observada en células que sí expresan SLC5A8. Juntos, estos

resultados indicarían una inhibición del efecto antiproliferativo de SLC5A8 en presencia de la vitamina C. Teniendo en cuenta el efecto antioxidante de la vitamin vitaminaa C (Duarte y Lunec

2005), los resultados obtenidos apoyan la hipótesis de que el efecto antiproliferativo de la expresión de SLC5A8 está rel relacionado acionado con la corriente inducida por moléculas oxidadas en presencia de esta proteína. La desaparición de estas moléculas por interacción con la

vitamina C impediría la activación de la SLC5A8 y, por ende, la aparición de su efecto antiproliferativo.

élulas de la línea HEK-293 que Figura 13: Estudio del efecto antiproliferativo de la expresión de SLC5A8. CCélulas

expresan la proteína de fusión SLC5A8/EGFP, fueron cultivadas en medio DMEM suplementado con 10% de SFB y: 1) 110 mg/mL de piruvato (control), 2) en ausencia de piruvato (sin piruvato) y 3) 110 mg/mL de piruvato y 0.1 mM de ácido D-ascórbico (con Vitamina C). La proliferación celular fue evaluada por conteo del número de células que expresaron SLC5A8 (A) y el número de células que no expresan SLC5A8 (B), 24, 48 y 72 horas después de realizada la transfección. El número de células fue normalizado respecto al número de células presentes en la condición control a las 24 horas (que se tomó como el 100%).

94

VI. CONCLUSIONES

1. De las diez moléculas estudiadas, cuatro moléculas inhibidoras de NIS fueron

identificadas como inhibidores rápidos y específicos de la actividad de NIS. Estas moléculas representan una herramienta eficaz para el estudio funcional de NIS; adicionalmente, puede tener aplicaciones médicas en el diagnóstico y tratamiento de patologías tiroideas.

2. La proteína NIS no está sobre expresada en cáncer de tiroides y seno. En consecuencia, para aumentar la efectividad del uso de yodo radioactivo en tratamientos de cáncer de tiroides y en el diagnóstico y tratamiento de cáncer de seno, mejorar el direccionamiento a la membrana de NIS no es suficiente. Aumentar la expresión de NIS debe ser el objetivo principal en este campo.

3. Una regulación de la proteína NIS por la TSH y altas concentraciones de yodo fue observada en folículos tiroideos en cultivo. Dicha regulación es coherente con la observada en otros sistemas de cultivo. Sin embargo, un estudio más detallado debe ser realizado.

4. La proteína SLC5A8 induce una corriente de sodio en activada por formas oxidadas de yoduro. En la glándula tiroides, esta proteína podría tener una actividad sensor de especies oxidadas de yoduro (principalmente HOI), y participaría en la regulación de la etapa inicial del efecto Wolff-Chaikoff.

95

VII. AGRADECIMIENTOS

Al programa ECOS-Nord/Colciencias/Icetex, a la División de Investigación (DIB) de la Universidad Nacional de Colombia, al Comisariado de Energía Atómica (CEA), al Centro Internacional de Física (CIF) y a la Facultad de Ciencias de la Universidad de Niza por su participación en la financiación de este trabajo.

A Isabelle Peyrottes y demás miembros Departamento de Patología del Centro Antoine Lacassagne, y a Nathalie Lecat-Guillet y demás miembros del Departamento de Química Bioorgánica y Marcaje Isotópico del CEA, por su colaboración en la obtención de los resultados de este trabajo.

A mis directores, Clara Spinel y Thierry Pourcher, por su constante apoyo, sus enseñanzas, su paciencia y su sincera amistad.

A Sabine LIndenthal, Robert Marsault, George Roumey, Fanny Graslin, Julien Gugliemi, Anne Vejux, Christophe LeSaint, Collette Ricoh y, en general, a todos los miembros de la Unidad TIRO por su calurosa recepción y su desinteresado apoyo.

A Marcela Camacho, por su constante apoyo, y por sus siempre oportunos y pertinentes aportes y comentarios.

A Eleonora Bernal, Margarita Victoria, Magnolia Herrera, Cristina Zapata, Jhon Rivera y, en general, a todos los miembros del Laboratorio de Biofísica del CIF por su apoyo y amistad.

A María Cristina Plazas y Didier Paul, porque el largo camino que llevó a la realización de este trabajo se inició gracias a su iniciativa y desinteresado apoyo.

A mi familia y amigos, porque siempre están a mi lado, en todo momento y a pesar de todo. 96

VIII. BIBLIOGRAFÍA

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