Conservación de Cepas de Colección
Bioq. María de los Angeles Sosa Instituto de Medicina Regional – UNNE Instituto de Medicina Regional Resistencia ‐ Chaco
¿Qué es una Colección de cultivos microbianos? Son entidades en donde se realizan una serie de actividades cuyo objetivo principal es preservar , mantener y distribuir cepas con sus características originales. •Colecciones de investigación CEREMIC, IMR IMR--M, Malbrán •Colecciones industriales Colección Instituto Finlay (Cuba) •Colecciones de servicio ATCC, CBS
y Cultivos puros, evitar las contaminaciones Cultivos puros evitar las contaminaciones y Sobrevida del 70 al 80% del inoculo y Genéticamente estables
Conservación de cepas Conservación de cepas Métodos de conservación a largo plazo: • Liofilización • Criopreservación (N2 líquido, ‐30, ‐80º C) Métodos de conservación alternativos Métodos de conservación alternativos • Transferencia periódica. ‐ Bajo capa de aceite mineral • Conservación en agua destilada . Método de Castellani Conservación en agua destilada Método de Castellani Métodos de conservación restringidos • Desecación en papel de filtro p p • Desecación en suelo, arena, silica gel • Secado Liquido o L‐Drying
Métodos de conservación a largo plazo
Criopreservación • La congelación disminuye la actividad metabólica de una célula por l di i ió d la disminución de agua disponible. di ibl • Se guardan en ampollas selladas ( vidrio o plástico: crioviales) con un agente crioprotector un agente crioprotector • Es el mejor método de conservación a largo plazo. • Requiere aparatos especiales, es honeroso • Suministro constante de energía o NL. S i i d í NL • No apto para el envío de las cepas.
Factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de las cepas bld dd l • Temperatura de almacenamiento: Temperatura de almacenamiento: 9 Nitrógeno líquido a –195ºC, o bien en su fase gaseosa a –140ºC gaseosa a 140 C. 9Ultrafreezer de hasta –96ºC. 9Congelador –20ºC –40ºC no son aconsejables 9Congelador –20ºC , –40ºC, no son aconsejables para algunos grupos .
• Alta densidad celular: Alta densidad celular: Usar entre 107 ‐ 104 células/ml: Lisis de parte del inóculo.
Edad de las de las células • Que mo. se va a conservar, gran variabilidad. ,g Velocidad de crecimiento promedio (18 hs, 1 semana, 20 días) • Deben estar maduras, lo ideal es preservarla en fase log tardía o al inicio de su fase fase log tardía o al inicio de su fase estacionaria.mayor resistencia a la congelacion y descongelacion. • Si es una cepa que tiene un estado de esporulación hacerlo en ese momento esporulación, hacerlo en ese momento.
Nucleación cristalina • Una Velocidad de Congelación de 1 a 10 º C/min g / minimiza el efecto de la concentración de los solutos durante la nucleación.
• Congelación paulatina evita la Ruptura celular!!!
Crioprotector: • Son compuestos químicos no tóxicos con facilidad
para atravesar la membrana celular y acumularse intracelularmente. • reducen al mínimo los efectos perjudiciales del aumento de la concentración de solutos y la formación de cristales de hielo. • Examinar sus propiedades tóxicas (DMSO>glicerol) • Los penetrantes mejores que los no penetrantes
Los mas usados: Glicerol 10% Sacarosa 7% + inositol 7% Leche descremada 10% (vol/vol) DMSO 5% (vol/vol)
Período
de equilibrio: se inocula en el medio liquido, se incuba hasta la fase estacionaria centrifugar se retira el la fase estacionaria, centrifugar, se retira el pellet y se resuspende en 2‐5ml caldo, añadir el crioprotector el crioprotector. • Tiempo: 30 minutos a Tº ambiente. El agente crioprotector puede ser tóxico para las células si el tiempo de equilibrio es demasiado largo.
• Fraccionamiento en viales
“Lote de reserva”
“Lotes de trabajo”
Freezer -80ºC IMR UNNE RCIA CHACO
Freezer -80ºC LABORATORIO CENTRAL DE CORRIENTES CORRIENTES
Suministro especial de energía eléctrica Espacio sp c o físico s co refrigerado Estabilizador, elevador de tensión Grupo electrógeno
Reconstitución (deshielo) Reconstitución (deshielo) • Velocidad y temperatura de descongelado: Velocidad y temperatura de descongelado: • Descongelación rápida: Baño María a 37ºC. D l ió á id B ñ M í 37ºC • Crioviales: – Criotolerancia, tapa a rosca y o‐ring. Máxima capacidad de almacenamiento y facilidad de manejo.
– No llenar, colocar entre 0,5 a 1,0 ml N ll l 05 10 l de la suspensión de célular.
CRIOPERLAS Perlas de cerámica que se impregnan con la solución celular a congelar y al reconstituir b t basta con emplear una o varias bolitas sin necesidad de descongelar el resto. l i b lit i id d d d l l t
Recuperación post congelado post congelado • STREESS!! STREESS!! Una vez recuperadas nunca utilizar estos Una vez recuperadas nunca utilizar estos microorganismos inmediatamente en pruebas fisiológicas realizar 1 o 2 pasajes previos fisiológicas, realizar 1 o 2 pasajes previos. • Transferir a medios adecuados (caldos o medios agarizados) i d ) • Tiempo de incubación: puede disminuir la velocidad de crecimiento.
Criopreservación Ventajas j : ¾ ¾ ¾ ¾
Viabilidad 7 a 10 años No se detectaron cambios genéticos Apto para una gran variedad de mo. Simple, pre‐tratamiento mínimo.
Desventajas: ¾ ¾ ¾ ¾
Equipamiento y mantenimiento $$$. Equipamiento y mantenimiento $$$ Criotubos, racks para criotubos, etc. Monitoreo de la Tº. Suministro constante de energía eléctrica, grupo electrógeno. d í lé l ó
Liofilización •Combina una congelación (‐60°C) y luego secado al vacío. (Secado por sublimación) •Para Para bacterias, levaduras, bacterias levaduras esporulados y virus. •Mayor sobrevida para bacterias gram (+) que Gram (‐). •Viabilidad hasta 30 años. •Espacio reducido los liófilos •Espacio reducido, los liófilos pueden almacenarse a temperatura ambiente (18ºC), con lo cual su envío es muy cómodo.
Lioprotectores • No utilizar glicerol, genera liófilos muy viscosos. g ,g y • No DMSO porque es algo tóxico, y al concentrarse por la evaporación del agua puede dañar a las células. células • Si: 9Inositol 5% la mayoría de las bacterias 5% la mayoría de las bacterias 9Proteosa peptona‐glicerol para bacterias, 9leche descremada 10‐20 % para hongos y actinomicetos ti i t 9glutámico‐glutamato para las bacterias lácticas 9Sacarosa Sacarosa 7% 7% + peptona 7% peptona 7%
Consideraciones • Tipo de microorganismo • Inoculo: 108‐109 células/ml bacterias, 105‐107 hongos • Tº durante la sublimación: lo más baja posible, sin subir por encima de –50ºC. • Grado de deshidratación alcanzado: humedad menor al 1% • Atmósfera de oxígeno en el tubo: cerrados al vacío para evitar la presencia de oxígeno (rehidratación, oxidación) i d í ( hid ió id ió ) • Condiciones de almacenamiento: En oscuridad y la Tº debe ser constante 18ºC o refrigerar constante, 18ºC o refrigerar.
Reconstitución del liófilo Reconstitución del liófilo Pasos: 9Se toman los viales de la parte superior, cubren con ggaza p para evitar explosión p al ingreso g de aire. 9Se inyectan 0.1‐0.4 ml de medio enriquecido con pipeta Pasteur o jeringa. 9Se agita y se disuelve, luego transferir a el medio de cultivo adecuado.
Mayor sobrevida, al mantener elevada la Presion osmótica durante la rehidratación!!
Liofilización Ventajas: ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾
Viabilidad y longevidad elevada Promedio 20 años No se detectaron cambios genéticos Apto para una gran variedad de mo. Fácil manipuleo y transporte de los liófilos Protección total ante posibles contaminantes Protección total ante posibles contaminantes Producción a gran escala
D Desventajas t j : ¾ ¾ ¾ ¾ ¾
Equipamiento inicial y mantenimiento $$$. Muchos mo. no resisten Existen algunos daños genéticos y/o selección Laborioso Requiere personal especializado
Métodos de conservación é d d ó alternativos
Métodos de conservación
Transferencia periódica f i iódi • Método común de conservacion que consiste en la q resiembra periódica del cultivo en un medio fresco. • El intervalo de transferencia varia con el mo, debiendo considerarse el medio de cultivo adecuado onsiderarse el medio de lti o ade ado • Mantener a T amb o 4º C durante 15 días a 2 meses. • Bajo capa de aceite mineral o vaselina estéril Bajo capa de aceite mineral o vaselina estéril ( Evita la ( Evita la desecación y ↓ metabolismo) Refrigerado, mantiene hasta 3 años.
Neisseria N i i sp. (1 año) (1 ñ ) Salmonella sp (35 años)
Consideraciones Retardar el envejecimiento alargando los eta da e e ejec e to a a ga do os periodos entre dos resiembras: 9↓Inóculo 9↓nutrientes del medio (Agar min, agar cepa) 9 inocular en profundidad y no en estría, los anaerobios facultativos crecen más rápido en presencia de O2 facultativos crecen más rápido en presencia de O2 (productos tóxicos) 9Almacenar a 4ºC‐8ºC.
• Los mo. muy aerobios no se pueden guardar en tubos completamente cerrados.
Métodos de conservación
T Transferencia periódica f i iódi Ventajas: ¾ Viabilidad: 2 ó 3 años. ¾ No requiere equipamiento especializado. ¾ No “estress” ¾ Rehabilitación + rápida. Desventajas: ¾ Variaciones genéticas!!! Variaciones genéticas!!! ¾ Deshidratación. ¾ Contaminación. ¾ Supervisión técnica constante. ¾ Espacio físico de almacenamiento.
Métodos de conservación
Método de Castellani Método de Castellani • Es un método muy utilizado con altos porcentajes de viabilidad (hongos filamentosos, levaduras y algunas bacterias) • Suspensión de bacterias, levaduras, esporas o bloques p , , p q de agar en agua destilada estéril o agua de mar. • Inoculo menor a 104‐105 células/ml para bacterias y levaduras. levaduras. • Tº amb y a 4ºC.
Ej: Candida sp y Dermatofitos. Ej: Candida y Dermatofitos
Métodos de conservación
Método de Castellani Método de Castellani Ventajas: ¾ Viabilidad 5 años o más. ¾ Almacenamiento : mesada o heladera. ¾ No contaminación con ácaros. No contaminación con ácaros. ¾ Alto % de recuperación. ¾ Bajo % variaciones genéticas. Desventajas: Desventajas ¾ Estabilidad de los caracteres es buena (?? Virulencia, poder fermentativo) ¾ Personal entrenado. P l d ¾ Tubos con o‐ring (deshidratación). ¾ Solo cepas con buena esporulación.
Métodos de conservación Restringidos
Secado líquido o
Leche descremada 5%
•Bacterias Bacterias y levaduras y levaduras •TRANSPORTE •Viabilidad 2 o 3 años
Desecación en Silica gel Desecación en Silica Muy bueno para hongos y bacterias!!! M b h b i !!! Pasos: • Preparación del inoculo 10 Preparación del inoculo 109 – 1010 cél/ml •Distribución de la suspensión a disecar sobre la silica gel esterilizada a 160º C 3 horas (cambio de color) horas (cambio de color) •Colocar e en disecador 12 horas a 4ºC •Distribución de los gránulos en tubos de polipropileno. •Congelado. Reconstitución (sacar 1 granulo) (sacar 1 granulo) •Reconstitución
Micoteca i d l Dpto. Micología del l í Instituto de Medicina Regional IMR-M
Directores: Gustavo Giusiano – Magdalena Mangiaterra Curadores: María de los Angeles Sosa Mariana Fernández P Personal l Técnico: Té i Liliana Lili Alegre Al
Departamento de Micología Instituto de Medicina Regional
Repique en Medio Dixon o LN (Purificación)
Pruebas de identificación presuntiva
Fraccionamiento y archivo Etiquetado
Registro computarizado
Controles periódicos de viabilidad
Control de inventario
Pruebas de identificación definitiva
Registro manual
Paso 1: Repique en Medio Dixon o LN ((Purificación))
La incubación se realiza en atmosfera húmeda a Tº promedio 32ºC, 5 a 7 días. Considerar la velocidad de crecimiento:
Rápida ( < 3 días)
Media (5-7 días)
M pachydermatis M furfur, M.pachydermatis furfur M sympodialis M. slooffiae
Lenta > 7 dias M. globosa, M globosa M M. restricta, restricta M. M obtusa, obtusa M japonica, M. dermatis, M. nana M. yamatoensis, M. equina, M. caprae M. cuniculi (LN > 7dias y mDA ( 14 días)
Paso 2: Pruebas de identificación presuntiva
Paso 3: Identificación definitiva EXTRACCION
Cepa aislada
-Shock Shock térmico
Amplificación 26s ARN ribosomal
RFLP Enzimas Cfo f I y MboI
PCR RFLP 1 (CfoI)
Corrida electroforética
PCR screening
Paso 4: Registro manual
A) Nombre (identificatorio del cultivo) B) Nombre y dirección del depositante. C) Fuente, sustrato o huésped de donde se aisló o derivó y fecha de aislamiento. D) Origen geográfico (lugar de origen.) E) Número del material según el depositante depositante, o número de otras colecciones si fue depositado en otra parte. F) Medio y condiciones de crecimiento, condiciones de almacenamiento. almacenamiento G) Hoja de seguridad (Información de riesgos)
Base de datos Base de datos
Paso 5: Registro computarizado
Fraccionamiento y archivo
“Lote de reserva”
“Lotes de trabajo”
Freezer -80ºC IMR UNNE RCIA CHACO
Freezer -80ºC LABORATORIO CENTRAL DE CORRIENTES CORRIENTES
Suministro especial de energía eléctrica Espacio sp c o físico s co refrigerado
Fraccionamiento y archivo
Estabilizador, elevador de tensión Grupo electrógeno
CONTROLES DE CALIDAD CONTROLES DE CALIDAD: Realizarlo ANTES Y DESPUÉS DE LA PRESERVACIÓN. DE VIABILIDAD Y PUREZA DE ESTABILIDAD DE CARACTERES RELEVANTES. REQUERIMIENTOS PARA EL CRECIMIENTO. REQUERIMIENTOS PARA EL CRECIMIENTO. MÉTODOS DE PRESERVACIÓN. FRECUENCIA DE CONTROLES DE MANTENIMIENTO (1 control al año)
Control de viabilidad
MEDIO Leeming g Notman ((14 días a 32ºC como.max)) % de recuperación de viables = Colonias /INOCULO (104) = %
Control de inventario
Información mínima requerida: requerida: Metodología de preservación Localización e identificación del material almacenado (en que lugar q g físico)) Fecha de conservación Numero de pasajes
Acrecentar el número de cepas de la colección. Acrecentar el número de cepas de la colección Aplicar un 2do método de conservación: Liofilizar las cepas que
puedan soportar esta metodología.
Completar la caracterización de las existentes. Incrementar el personal técnico Certificar las cepas Promover la sustentabilidad Fomentar cambios de política en las Instituciones (Universidad, SeCyT) Trabajar en red (FELACC).
RESUMEN RESUMEN Bacterias Transferencias simples: algunos meses Transferencias simples: algunos meses Almacenamiento con aceite mineral: 1‐2 años C Congelación a ‐20°C: 1‐3 años l ió 20°C 1 3 ñ Secado y freezado en silica gel: 6 años Congelación a ‐70°C: 1‐10 años N liq y liofilización: hasta 30 años
Bibliografía • • • • • • • • • • • •
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Agradecimientos D t de Micología Dpto d Mi l í IMR
Dr. Gustavo Giusiano Lic. Magdalena Mangiaterra Bioq. Florencia Rojas Bioq. Mariana Fernandez Bioq Maria Emilia Cattana Bioq. Maria Emilia Cattana Bioq. Sergio Toma Vanacore Tec. Liliana Alegre
