Conceptos de sensibilidad y resistencia. Cuantificación de la actividad inhibitoria y bactericida de los antimicrobianos.

CIM=“Gold Standard” Marcelo Galas Dto. Bacteriología INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbran” Buenos Aires, Argentina

Definición de sensibilidad WHO - 1961

Una bacteria es considerada sensible a un antimicrobiano si la concentración que se alcanza in vivo excede la concentración necesaria para inhibir el desarrollo de la bacteria in vitro”

Definición de sensibilidad CLSI - 2006

Una bacteria es considerada sensible a un antimicrobiano si es inhibida por las CC de droga usualmente alcanzadas con la dosificación recomendada para el sitio de infección”

Concepto de Sensibilidad

Concepto de Sensibilidad y Resistencia Cantidad minima de ATB necesaria para inhibir a la bacteria

Sitio Blanco + [ATB] CIM

Blanco-ATB Inhibicion o muerte bacteriana

Que pasa cuando la bacteria adquiere un mecanismo de resistencia???

Sitio Blanco +[ATB] [ATB] [ATB] ↓↓de afinidad

↓↓CC:

↑↑CIM Hidrólisis Modificación Impermeabilidad Eflujo

Blanco-ATB Blanco-ATB

Resistencia bacteriana

1

Aumento de CIM

Fundamento de las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos por dilució dilución Bacteria problema

2 1 µg/ml

4 2 µg/ml

4 8 µg/ml

16 µg/ml 8 µg/ml

32 16 µg/ml

32 64 µg/ml µg/ml

128 µg/ml 64 µg/ml

256 128 µg/ml

512 256 µg/ml µg/ml

1024 512 µg/ml µg/ml

Concentraciones crecientes de antimicrobiano

Fundamento de las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos por dilució dilución

Fundamento de las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos por dilució dilución

CIM 1 µg/ml

2 µg/ml

4 µg/ml

8 µg/ml

16 µg/ml

32 µg/ml

64 µg/ml

128 µg/ml

256 µg/ml

512 µg/ml

CIM 1 µg/ml

2 µg/ml

4 µg/ml

8 µg/ml

16 µg/ml

32 µg/ml

64 µg/ml

128 µg/ml

256 µg/ml

512 µg/ml

CINETICA DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA CONCEPTO DE CIM Y CBM UFC/ml 1 x 109

//

Control ATB 0.5 µg/ml

1 x 108

//

ATB 1µg/ml

1 x 107

CIM

ATB 2 µg/ml

1 x 106

//

1 x 105

//

ATB 4 µg/ml

//

ATB 8 µg/ml

1 x 104 1 x 103 1 x 102

//

CBM

ATB 16 µg/ml

1 x 101 0

2

4

8

OBJETIVOS DE LAS PRUEBAS DE SENSIBILIDAD • Proveer al cuerpo médico de la información necesaria para la adecuada elección del tratamiento antimicrobiano • Vigilancia local de resistencia ⇨ Políticas de uso de antibióticos

24 Tiempo

2

• Facilidad de realización

• Difusión en agar

• Costo

• Dilución en caldo y en agar

Metodología • Automatización

Elección del • Desempeño del método para droga/ATB (Estandarización) • Necesidad del médico de un método resultado de sensibilidad específico para la elección del tratamiento

• Método epsilométrico (E-test)

Antibiograma por difusió difusión CC ATB

CC ATB

icaa ló lóggic ioló robbio icro Mic M

Disco con ATB

less imaale anim loss an Mooddeelo M

Aga MH

étiicca nét a cinné coci maaco arm FFar

Desarrollo bacteriano

ia mia inaam coddin maaco arm FFar

CIM de la Bacteria

E. coli cepa Salvaje

Informació Información utilizada

ió iónn ació rmac form info la in tegg ddee la Inte In

E. coli productor de BLEE

Puntos de corte

Adaptar x sitio de infecció infección

Relación entre el “gold standard” (CIM) y el Antibiograma por difusión

Cl ón Clínica Correlaci Clíínica Correlació Correlación

Punto de corte = valor de cc que discrimina entre cepas que van a resultar en éxito o falla de tratamiento.

Log CIM

2048

CRITERIOS PARA FIJAR PUNTOS DE CORTE: 1) Farmacocinética (droga/paciente) 2) Poblacional (droga/Bacteria) 3) Clínico (droga/bacteria/paciente)

512

GOLD ESTÁNDAR

128 32 8 2 0.5

Puntos de corte

0.128 0.032 0.008 6

7

8

9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Ø

3

Criterio Farmacológico (PK)

Criterio Poblacional Distribució Distribución unimodal

32

32

Sensibilidad de una población bacteriana a la Droga X

Farmacociné Farmacocinética A 16

16

8

8

4

4

Punto de corte PK Nº de aislamientos

CIM

Distribució Distribución bimodal

Punto de corte PK ➟ S ➟R

CC ATB

Farmacocinética de la Droga X

EN SUERO

Nº de aislamientos

CC ATB

Sensible

R

S

CIM (cc)

Punto de corte PK ➟ ?

16 (D3)

24 (D4)

32 (D5)

40 (D6)

tiempo

48 (D7)

100

1000

10000

Nº de aislamientos

8 (D2)

Punto de corte PK

Nº de aislamientos

Resistente

Farmacociné Farmacocinética B 0 (D1)

CIM (cc)

Distribució Distribución bimodal superpuesta

Distribució Distribución unimodal

Nº de bacterias

S

R CIM (cc)

CIM (cc)

Relación entre el “gold standard” (CIM) y el Antibiograma por difusión

Criterio clínico . . .. ... ... .. . ... ... ..... . . .. .. .. .. .. . .. .. .. .. .. .. .. .

Log CIM

Punto de corte?

. . .. ... ... .. . . ... ... ..... . . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .

Nro. de casos

Nro. de casos

Punto de corte Exito Fracaso

Exito

R

Fracaso

CIM

CIM

LIMITACIONES Y CONTROVERSIAS 1) Razones éticas: •

•

Una bacteria en particular

2) Dificultades de diseño:

•

Una relación infección huésped particular

•

•

Un dosaje y vía de administración particular

Necesidad de contar con alto nro. de cepas con CIMs cercanas al punto de corte.

CRITERIOS PARA FIJAR PUNTOS DE CORTE Falso Sensible 1) Farmacocinética (droga/paciente) 8 µg/ml (error very major) 2) Poblacional (droga/Bacteria) 8 µg/ml 3) Clínico (droga/bacteria/paciente) 4 µg/ml

512

< 1%

128 32

I

8 2

4) Generalizaciones a partir de:

Exclusión de pacientes con cepas resistentes.

Ej.: VANCOMICINA vs Enterococcus spp.

2048

S

0.5 Falso resistente (error major)

0.128

< 5%

0.032 0.008

3) Limitaciones presupuestarias: •

6

Diferenciar cepas causantes de falla terapeutica

7

8

9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Ø

R

de reinfecciones es muy costoso.

Qué es un Punto de Corte???

• CC de ATB que separa poblaciones de microorganismos

Propósito • Proveer al médico información para la elección de la terapia antimicrobiana

Tipos • Microbiológico Valor epidemiológico

≠

• Clínico Valor terapéutico

I

S

CA PC clínicos: Provee al médico información NI

Í para la elección del tto. CL N Ó la dosis • S= el aislam es inh x cc del ATB alcanzables con CI IOS recomendada en el sitio de infección. A TU UD • R= el aislam es inh x cc de ATB alcanzables SI STen el sitio de A resultados E infección con D recomendada y/o L dan en rangos Nla eficacia S O clínica. donde mec de R hacen dudar de Ú O G T SEalacanzables DA • I= CIMs cercanas a lasECC en sangre y tejidos para S S los cuales la eficaciaRpuede Oser menor que para las cepas S. V A E donde la droga concentra y es un buffer Implica eficacia R sitios Eenfactores NU técnicos no controlables den Tque para prevenir L R A en discrepancias POla interpretación, especialmente para drogras N margen E con escaso de farmacotoxicidad. O D E U P

4

Interrogantes sobre los PC

PC epidemiológicos: Provee al

• Son útiles en ≠ localizaciones de la infección?

médico información para la elección del tto.

• Salvaje o wild type:

Muy ≠ CC de ATB en LCR - Orina – Pulmó Pulmón, etc

– No tiene resistencia adquirida o mutacional. – Se categoriza como Salvaje aplicando valores de corte apropiado para un determinado método – El PC NO puede alterarse en ninguna circunstancia – Un germen salvaje puede o no responder clínicamente al tto

• Predicen siempre el resultado clínico? MLSB , BLEE, Met R en Staph, Staph, FQ en SAL, etc

• Por que difieren en ≠ partes del mundo? ≠ Metodologí Metodologías para PS, ≠ utilizació utilización del ATB, ≠ Mec de R, etc

• No Salvaje: – Tiene resistencia adquirida o mutacional. – Se categoriza como no Salvaje aplicando valores de corte apropiado para un determinado método – El PC NO puede alterarse en ninguna circunstancia – Un germen NO salvaje puede o no responder al tto

• Son estables en el tiempo? Aparició Aparición de nuevos mec de R, Nuevas formulaciones farmacé farmacéuticas, nuevos datos clí clínicos, cambios metodoló metodológicos, etc.

Concepto de sensibilidad

Concepto de sensibilidad

µg/ml µg/ml

CIM 1

Sensible CIM 2 Resistente

Conc. sérica

Conc. sérica

CIM 2 Resistente

Sensible

Tiempo Tiempo

PK/PD

Doripenem 500 mg IV, 1 hs

Farmacocinética de Doripenem Dosis 1 g/8hs

T > CIM 18% 

Doripenem 500 mg IV, 1 hs

T > CIM 30% 

Doripenem 500 mg IV, 1 hs

T > CIM 45% 

Concentracion (μg/mL)

25

Doripenem 500 mg IV, 4 hs 500 mg IV, 4 hs

T > CIM 0% 

20

Doripenem 500 mg IV, 4 hs 500 mg IV, 4 hs

CIM

T > CIM 56% 

15

CIM

Doripenem 500 mg IV, 4 hs 500 mg IV, 4 hs

T > CIM 75% 

10

CIM=8µg/ml

T>CIM=56%

T>CIM=28%

CIM CIM

T>CIM=44% T>CIM=50% T>CIM=63% T>CIM=75%

T>CIM=65%

Nueva dosis

T>CIM=75% T>CIM=88% T>CIM=98%

CIM=4µg/ml CIM=2µg/ml

5

0 0

1

2

3

4

5

6

7

8

Tiempo (hr) Antimicrob Agents Chemother 2005; 49:3944-7.

5

CASOS EN QUE SE JUSTIFICA REALIZAR UNA PRUEBA CUANTITATIVA (CIM)

• SITUACIONES CLÍNICAS ESPECIALES (EJ. ENDOCARDITIS) • FALTA DE ESTAND. (EJ. NEUMO vs ß-LACT, MENINGO, ETC) • CALCULO DE PARÁMETROS PK/PD PARA TTO • FALLA INESPERADA DE TRATAMIENTO • INFECCIONES SEVERAS (cc sérica/CIM baja) • PERFILES INUSUALES (CONFIRMACION) • PARA VIGILANCIA CUANTITATIVA DE LA RESIST. A LOS ATBs • PRUEBAS BACTERICIDAS

METODOS PARA LA DETERMINACION CUANTITATIVA DE LA SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS

METODOS PARA LA DETERMINACION CUANTITATIVA DE LA SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS kMacrodilución en caldo Control de esterilidad del medio Concentraciones crecientes de

Control de inóculo

kDilución en agar

Concentraciones crecientes del ATB

Control de inóculos

METODOS PARA LA DETERMINACION CUANTITATIVA DE LA SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS kMacrodilución en caldo

kMicrodilución en caldo Control de esterilidad del medio

Concentraciones crecientes de

RESULTADO DE LA CIM EN MEDIO SOLIDO

ATB

ATB

Control de inóculo

ATB 1 ATB 2 ATB 3 ATB 4 ATB 5 ATB 6 ATB 7 ATB 8

Concentraciones crecientes de

Control de inóculo Control de esterilidad del medio

ATB

kDilución en agar

Concentracions crecientes del ATB

Control de inóculos

kConc. “Break-points”

METODOS PARA LA DETERMINACION CUANTITATIVA DE LA SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS

METODOS PARA LA DETERMINACION CUANTITATIVA DE LA SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS kMacrodilución en caldo Control de esterilidad del medio Concentraciones crecientes de

RESULTADO DE LA CIM POR MICRODILUCION EN CALDO

kMicrodilución en caldo

ATB

Control de inóculo

Concentraciones crecientes de

kDilución en agar

Concentracions crecientes del ATB

ATB 1 ATB 2 ATB 3 ATB 4 ATB 5 ATB 6 ATB 7 ATB 8

Control de inóculo Control de esterilidad del medio

ATB

kE-test

Control de inóculos

kConc. “Break-points”

6

METODOS PARA LA DETERMINACION CUANTITATIVA DE LA SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS

METODOS PARA LA DETERMINACION CUANTITATIVA DE LA SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS

kMacrodilución en caldo

kMacrodilución en caldo

kMicrodilución en caldo ATB 1 ATB 2 ATB 3 ATB 4 ATB 5 ATB 6 ATB 7 ATB 8

Control de esterilidad del medio Concentraciones crecientes de

ATB

Control de inóculo

Concentraciones crecientes de

kDilución en agar

Concentraciones crecientes del ATB

Control de inóculo Control de esterilidad del medio

ATB

kE-test

Control de inóculos

kConc. “Break-points”

kMicrodilución en caldo Control de esterilidad del medio

Concentraciones crecientes de

ATB

Control de inóculo

Concentraciones crecientes de

kDilución en agar

Concentraciones crecientes del ATB

Control de inóculo Control de esterilidad del medio

ATB 1 ATB 2 ATB 3 ATB 4 ATB 5 ATB 6 ATB 7 ATB 8

ATB

kE-test

Control de inóculos

kConc. “Break-points” kAutomatizados Se basan, al menos en parte, en los conceptos aplicados para los métodos de referencia

METODOS AUTOMATIZADOS

Ø VITEK1 Y VITEK2 Ø MICROSCAN CON PANELES RAPIDOS Y CONVENCIONALES Ø PHOENIX Ø SENSITITRE

Métodos Automatizados: Ventajas • Alto nú número de ATB ensayados para cubrir la mayor cantidad de posibilidades en cuanto a gérmenes y foco. • Posibilidad de restringir el informe de ATB en forma personalizada.

Métodos Automatizados: Ventajas • >Rapidez en la disponibilidad de resultados: • - 3-10 hs. hs. vs 1616-24hs. • - Valor significativo en ciertas situaciones clí clínicas y ciertas instituciones: inicio o cambio precoz del tto y reducció reducción de costos. • - Acelera el “Flujo de Trabajo” Trabajo” dentro del Laboratorio. • - Gran nú número de pruebas bqcas para ID

Métodos Automatizados: Desventajas • > Costo test a test • Tamañ Tamaño de los equipos • Necesidad de un mé método backup • Desperfectos mecá mecánicos o de software

• Aná Análisis estadí estadísticos para estudios epidemioló epidemiológicos – Optimizar terapé terapéutica empí empírica.

• Confirmació Confirmación de ciertos mecanismos y/o resultados

7

Métodos Automatizados: Desventajas • Esquema y concentraciones fijas de antibió antibióticos. • Necesidad de difusió difusión para definir – Antibiograma directo del frasco de hemocultivo, gram positivos

METODOS PARA LA DETERMINACION CUANTITATIVA DE LA SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS LIMITACIONES • No evalúa los factores del paciente • Inmunidad humoral • Inmunidad celular • Unión a proteínas • Se trabaja a conc. constantes • No existen puntos de corte para todos los microorganismos • Puntos de corte definidos para concentraciones en suero u orina • Representatividad del inóculo utilizado • No tiene en cuenta la fase de crecimiento del microorganismo • Log (p. ej. bacteriemia) • No log (p.ej. endocarditis, biofilm, etc.) • No evalúa la cinética de muerte

FACTORES QUE AFECTAN LOS RESULTADOS DE LAS PRUEBAS DE SENSIBILIDAD POR DILUCION

FACTORES QUE AFECTAN LOS RESULTADOS DE LAS

• Esquema de dilución

• Inóculo

• Seriadas al medio

• Fase de crecimiento

• Aritmética

• Tamaño

• Composición del medio de cultivo

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD POR DILUCION

• pH

• Incubación • Tiempo

• Cationes

• Temperatura

• Osmolaridad

• Atmósfera

• Suplementos

• Técnica utilizada

• Volumen de medio utilizado

CONCEPTOS DE CIM50, CIM90 Y RANGO

CONCEPTOS DE CIM50, CIM90 Y RANGO

Utilidad clí clínica

Como se calculan????

Da idea de la distribución poblacional de la resistencia

Es muy útil para:

Sensibilidad de una población bacteriana CIM (µg/ml)

Sensibilidad de una población bacteriana CIM (µg/ml)

Cepa 1

0,5

Cepa 8

0,125

Cepa 2

0,25

Cepa 9

0,125

Cepa 3

1

Cepa 2

0,25

Cepa 4

4

Cepa 5

0,5

• Evaluar cambios de sensibilidad de un determinado germen en el tiempo

Cepa 5

0,5

Cepa 8

0,5

CIM50 = 0,5 µg/ml

Cepa 6

1

Cepa 10

0,5

CIM90 = 2 µg/ml

Cepa 7

2

Cepa 3

1

• Comparar sensibilidad de ≠ poblaciones bacterianas a un antibiótico

Cepa 8

0,125

Cepa 6

1

Cepa 9

0,125

Cepa 7

2

Cepa 10

0,5

Cepa 4

4

• Comparar actividad de ATBs de la misma o ≠ familias

Ordenar CIMs de menor a mayor

Rango = 0,125-4 µg/ml

8

CONCEPTOS DE CIM50, CIM90 Y RANGO

CONCEPTOS DE CIM50, CIM90 Y RANGO Ejemplo de utilidad

Ejemplo de utilidad Sensibilidad de una población bacteriana CIM (µg/ml) Año 1990

Sensibilidad de la población bacteriana CIM (µg/ml) Año 2004

Sensibilidad de la población bacteriana CIM (µg/ml) Año 2004

Cepa 8

0,125

Cepa 9

0,125

Cepa 9

0,125

Cepa 5

0,5

Cepa 2

0,25

Cepa 1

0,5

Cepa 1

0,5

Cepa 2

1

Cepa 5

0,5 CIM50 = 0,5 µg/ml 0,5 CIM90 = 2 µg/ml 1

Cepa 3

2

Cepa 6

2

Cepa 1

0,5

Cepa 1

0,5

Cepa 2

0,25

Cepa 2

1

Cepa 3

1

Cepa 3

2

Cepa 4

4

Cepa 4

4

Cepa 5

0,5

Cepa 5

0,5

Cepa 10

Cepa 6

1

Cepa 6

2

Cepa 3

Cepa 7

2

Cepa 7

4

Cepa 6

Cepa 8

0,125

Cepa 8

4

Cepa 7

Cepa 9

0,125

Cepa 9

0,125

Cepa 4

Cepa 10

0,5

Cepa 10

2

CLA

ROX

AZY

TEL

ESPIRA

VAN

TEI

PEN

CIP

0,06

0,03

0,007

0,007

< 0,0007

0,12

2048

512

64

64

16

CEPA 2

0,125

0,03

0,06

0,06

0,007

0,125

>4096

2048

2

8

4

CEPA 3

256

128

128

128

0,015

16

>4096

>4096

>128

64

8

0,03

0,0015

0,007

0,0015

0,125

4

2

32

16

CEPA 5

0,06

0,015

0,06

0,06

0,0035

0,25

>4096

>4096

0,25

16

8

CEPA 6

0,125

0,03

0,125

0,125

0,015

0,5

2048

1024

16

8

2

CEPA 7

0,03

0,0015

0,007

0,0035

0,0015

0,06

4096

2048

0,5

32

4

CEPA 8

0,03

0,0015

0,015

0,007

< 0,0007

0,125

2048

1024

1

0,5

0,125

CEPA 9

0,125

0,03

0,125

0,125

0,015

0,5

>4096

4096

64

8

2

CEPA 10

0,03

0,0015

0,007

0,03

0,0035

0,06

4

2

0,5

32

8

CEPA 11

0,007

8

0,06

0,015

0,06

0,015

0,007

>4096

2048

32

0,5

0,125

CEPA 12

0,03

0,0015

0,015

0,007

0,0035

0,06

2048

2048

>128

1

0,5

CEPA 13

0,06

0,003

0,06

0,06

0,007

0,25

>4096

4096

0,25

2

0,5

CEPA 14

0,03

0,0015

0,007

0,0035

0,0015

0,125

8

4

1

16

8

CEPA 15

0.125

0,03

0,06

0,06

0,015

0,5

>4096

4096

0,5

1

0,25

CEPA 16

0,06

0,0015

0,015

0,125

0,007

0,25

>4096

2048

32

32

8

0,03

0,0015

0,007

0,007

< 0,0007

0,06

>4096

>4096

CEPA 17

0,25

CIM90 = 4 µg/ml

4 Rango = 0,125-4 µg/ml 4 4

LEV

CEPA 1

CEPA 4

2

CONCEPTOS DE CIM50, CIM90 Y RANGO Ejemplo de utilidad

0,25

32

4

CEPA 18

0,125

0,03

0,06

0,125

0,015

0,5

2048

2048

1

0,5

0,125

CEPA 19

0,125

0,03

0,06

0,125

0,015

0,5

4096

2048

2

4

2

CEPA 20

0,125

0,03

0,125

0,06

0,015

0,5

>4096

4096

0,5

4

1

CEPA 21

0,03

0,0015

0,015

0,0035

0,0015

0,06

2048

1024

0,25

8

4

CEPA 22

128

64

128

128

0,015

8

>4096

>4096

>128

32

16

CEPA 23

0,125

0,03

0,06

0,125

0,015

0,5

>4096

2048

4

32

8

CEPA 24

0,06

0,003

0,06

0,03

0,007

0,25

>4096

2048

2

1

0,5

Lactobacillus spp. N=24

ERY

Cepa 10 1 Rango = 0,125-4 µg/ml Cepa 4 2 Cepa 7 4 Cepa 8

CIM50 = 2 µg/ml

Conclusió Conclusión: la població población se esta haciendo cada vez mas resistente

CONCEPTOS DE CIM50, CIM90 Y RANGO Ejemplo de utilidad

Lactobacillus spp. N=24

Sensibilidad de una población bacteriana CIM (µg/ml) Año 1990

ANTIBIOTICO Eritromicina Claritromicina

CIM (µg/ml) RANGO 0,03 - 256 0,0015 - 128

CIM50

CIM90

0,06

0,125

0,015

0,03

Roxitromicina

0,0007 - 128

0,06

0,125

Azitromicina

0,0035 - 128

0,06

0,125

Telitromicina

4096

>4096

>4096

2 - >4096

2048

>4096

Penicilina

0,25 - >128

2

>128

Ciprofloxacina

0,25 - 64

8

32

Levofloxacina

0,125 - 16

4

8

Teicoplanina

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