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Avances Biotecnológicos en Girasol y Soja Ruth Heinz 1, 3, Norma Paniego1, Eduardo Guillin2, Marisa Lopez Bilbao, Paula Fernandez1, Luis Fernandez1, Paola Talia, Verónica Nishimakamasu 1, Maximo Rivarola, 1, Betiana Parodi 1, Javier Gilli2, Mariana Rocco1, Lidia Poggio 3 , H. Esteban Hopp1,3 Instituto de Biotecnología, CNIA INTA Castelar, Buenos Aires, 2 EEA INTA Marcos Juárez 3 Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA 1

La biotecnología juega un rol preponderante en la exploración de nuevas estrategias para el mejoramiento de los cultivos. Entre otras se destacan el mayor rendimiento, la modificación de la estructura de la planta, la mejora de la resistencia a las condiciones adversas bióticas y abióticas, la adaptación a nuevos medios y la precocidad

Una de las principales características del sector oleaginoso es su dinamismo y alta competitividad reflejada principalmente en la evolución del cultivo respecto del área sembrada, la producción y los rendimientos alcanzados durante la última década. Este crecimiento ha sido el resultado de la incorporación de una combinación de nuevas tecnologías (particularmente la sinergia producida entre siembra directa, transgénicas en el caso de la soja y una mayor eficiencia del mejoramiento de variedades por la utilización de marcadores moleculares) que han permitido la expansión del área de cultivo a través de la disponibilidad de nuevas variedades altamente productivas y mejor adaptadas a ambientes adversos. El complejo industrial también acompañó este crecimiento con inversiones y tecnología, ubicando a la Argentina como primer exportador mundial de aceite de soja y girasol, así como de subproductos derivados. En los cultivos oleaginosos hay objetivos adicionales relativos a la modificación de su composición de ácidos grasos y proteínas, con el fin de adaptarlos a aplicaciones específicas para el consumo humano o el uso industrial. Los cultivos oleaginosos son también una fuente posible de combustible renovables y de materias primas para la industria química-farmacéutica. El progreso de las ciencias genómicas en el estudio de especies modelo, en conjunción con las tecnologías disponibles para el análisis estructural y funcional de genomas complejos, las metodologías de transformación genética y los programas de mejoramiento asistido con marcadores moleculares prometen

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un progreso aún más promisorio para la próxima década. MARCADORES MOLECULARES EN GIRASOL El grado de avance de los conocimientos públicos sobre el genoma de girasol es muy limitado cuando se lo compara con otros cultivos como el arroz, el maíz, la soja, el tomate, el trigo, la papa, la cebada e inclusive dentro de la familia taxonómica de las compuestas, la lechuga. Sin embargo, están en desarrollo distintos proyectos a nivel nacional e internacional orientados al análisis genómico de girasol con lo cual se espera un progreso significativo en la disponibilidad de secuencias genómicas y de ADNc para los próximos cinco años, que sin duda impactarán positivamente en el avance de las investigaciones y el conocimiento sobre esta especie. Por su parte, el Instituto de Biotecnología del INTA Castelar cuenta con un importante conjunto de herramientas que incluyen marcadores moleculares como son los microsatélites y otros marcadores asociados a características funcionales, regulatorias o metabólicas para avanzar en el análisis genómico de girasol. Los microsatélites o secuencias simples repetidas (SSR) se encuentran abundantemente representados en el genoma y reflejan la diversidad dentro de las especies, basándose en el número de repeticiones de un motivo simple de di, tri o tetranuceótidos. Se trata del mismo tipo de marcadores que se utiliza en medicina forense humana o para la identificación mediante la llamada "prueba del ADN". Sus ventajas principales son la practicidad, bajo costo de análisis, alta reproducibili-

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dad y capacidad para detectar diferencias entre individuos genéticamente muy relacionados. Estas ventajas son críticas para implementar el uso extensivo de estos marcadores tanto en la identificación de variedades como en programas de mejoramiento genético. Actualmente, se dispone de una base de datos de 550 microsatélites altamente informativos, caracterizados sobre la base de su comportamiento en la diferenciación de 16 líneas endocriadas de girasol representativas del germoplasma de esta especie que fueron desarrollados en el marco de un convenio de cooperación de índole pre-competitivo entre INTA y un consorcio de compañías semilleras. Este número provee de una cobertura importante para la saturación del genoma de girasol con marcadores útiles para el mejoramiento y la identificación de regiones cromosómicas de interés, tal es así que se los emplea activa y exitosamente en programas de mejoramiento tanto en las semilleras nacionales como en las filiales extranjeras de las empresas que invirtieron en el convenio con el INTA. Para la identificación de marcadores específicamente relacionados a caracteres agronómicos, se desarrolló, por otro lado, una colección de secuencias genéticas clonadas de girasol obtenidos a partir de distintos tejidos y estados fisiológicos en el marco de un proyecto subsidiado por la ANPCyT. Estas secuencias genéticas son copia de los transcriptos de los tejidos; es decir, que cuando un gen se expre-

sa, guía la síntesis (trascripción) de un ácido nucleico mensajero (ARN) que lleva a la información codificada en el gen correspondiente a los ribosomas, que son las organelas encargadas de traducir esta información en proteínas, que son las moléculas ejecutoras de las funciones celulares. Para la caracterización de estas secuencias relacionadas con la actividad funcional del genoma, también conocidas como ESTs (expressed sequence tags), se aislaron y secuenciaron aproximadamente 920 secuencias génicas de entre 300-600 pb. La ventaja de obtener esta trabajosa y onerosa información radica en que las secuencias nucleotídicas obtenidas pueden ser asociadas rápidamente a una función bioquímica tentativa a partir de la búsqueda en distintas bases de datos y la identificación de similitud a secuencias de genes conocidos (o motivos funcionales descriptos) para la misma u otras especies, particularmente con especies de plantas modelo como Arabidopsis thaliana cuyo genoma se encuentra totalmente secuenciado. Este análisis comparativo de la funcionalidad de las secuencias aisladas permite identificar clones de la colección que representan genes potencialmente importantes en la determinación de distintos caracteres agronómicamente deseables. Un grupo interesante por su potencial de aplicación al mejoramiento lo constituyen las secuencias relacionadas con respuesta a estreses de distinto tipo (Figura 1). Figura 1

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soja y girasol Tejido in vitro regenerando una plántula transgénica después detransformación genética. El tejido transgénico puede identificarse porque se colora de azul en presencia de un sustrato adecuado.

Etapas en el proceso de regeneración de plantas transgénicas "in vitro" por organogénesis.

recombinantes endocriadas provenientes del cruzamiento de 2 líneas provenientes del proyecto Cartisol europeo, observándose en una primera instancia una distribución homogénea de los marcadores entre los distintos grupos de ligamientos obtenidos.

Dentro de este grupo funcional se detectaron secuencias relacionadas con defensa a patógenos (glucanasas, inhibidores de proteasas, inhibidores de poligalacturonasas, oxidasas) y respuesta a estrés abiótico (osmotinas dehidrinas, enzimas del metabolismo de fructanos). La identificación de secuencias de girasol que son claves en la determinación de caracteres deseables abre un espectro de nuevas estrategias a desarrollar en la selección de germoplasma agronómicamente deseable: el aislamiento de las secuencias genómicas completas para la evaluación de la expresión de dichos genes en plantas transgénicas de girasol y su localización en un mapa genético de referencia para contribuir al conocimiento de la organización del genoma del girasol cultivado. El mapeo de los marcadores disponibles en INTA se integra en un mapa genético de girasol de referencia internacional, contribuyendo a incrementar la representación y cobertura del genoma del girasol cultivado. La disponibilidad de mapas genéticos saturados con marcadores moleculares constituye una herramienta valiosa para el clonado molecular de genes de interés, la selección asistida basada en marcadores moleculares y el análisis comparativo de genomas de especies relacionadas. En una etapa inicial se ha evaluado la cobertura genómica de un grupo de 40 marcadores informativos en una población de líneas

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La aplicación de técnicas de hibridación "in situ" con sondas fluorescentes de ADN específico (FISH) y o ADN geonómico (GISH) que esta siendo desarrollada, en el marco de un proyecto conjunto, por el Instituto de Biotecnología y la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA, permite determinar la localización cromosómica de secuencias de interés, contribuyendo a la elaboración de un mapa físico de girasol. AVANCES EN LA TRANSFORMACIÓN DE GIRASOL No existen aún en el mercado internacional plantas transgénicas de girasol. Si se tiene en cuenta el fuerte impacto que produjo la aparición de la soja transgénica en nuestro país, hay que considerar como sumamente importante el desarrollo de esta tecnología para el cultivo de girasol. El Instituto de Biotecnología tiene una amplia experiencia en cultivo de tejido y transformación genética de girasol (Helianthus annuus). Esta situación quedó reflejada en los convenios de Vinculación Tecnológica que el INTA firmó con las empresas Dekalb (septiembre 1997-agosto 1999) y Syngenta (marzo 2000octubre 2001) para la obtención de plantas de girasol transgénicas, modificadas genéticamente para ser resistentes a herbicidas, lepidópteros y hongos. Una característica con la que deben contar todas las plantas transgénicas es la de haber incorporado un gen de selección, de forma tal que se puedan seleccionar las plantas transformadas de aquellas

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que no lo están. Como genes de selección se utilizan habitualmente genes que confieren resistencia a antibióticos como la kanamicina (nptII) o a herbicidas como el glifosato (cry) o el glufosinato (bar). Este tipo de selección se denomina negativa ya que aquellas células no transformadas mueren en presencia del agente selectivo. Actualmente existen métodos de selección donde se favorece el crecimiento de las células y tejidos transformados sobre aquellos que no lo están y se denomina selección positiva. Un ejemplo de esta selección es la utilización del gen de la fosfomanosa isomerasa que permite la utilización de manosa como fuente de carbono. Este marcador fue utilizado durante el convenio con la empresa Syngenta, que posee la patente sobre dicho método. Después de haber logrado exitosamente la obtención de plantas de girasol transgénicas, los objetivos inmediatos del grupo de transformación de girasol son dos: 1) optimizar el método de selección en kanamicina, ya utilizado en el convenio con Dekalb, mejorando y modificando la respuesta del cultivo de girasol in vitro y 2) poner a punto la utilización de un nuevo marcador de selección, como el glufosinato de amonio. El glufosinato de amonio es un herbicida de contacto de amplio espectro que se usa para controlar las malezas. Muchas de las plantas transgénicas autorizadas, cultivadas y comercializadas a nivel mundial llevan la resistencia a este herbicida. Así, AgrEvo formuló un glufosinato para ser utilizado en los cultivos resistentes denominado Liberty. En Canadá, la canola Liberty Link está a la venta desde 1995 y en USA la soja y el maíz Liberty Link fueron aprobados en 1997. En nuestro país la CONABIA ha aprobado a nivel de ensayo de campo, cultivares de soja, arroz y maíz resistentes al glufosinato de amonio. Para chequear la puesta a punto de los métodos de transformación se utilizan genes "reporteros" que permiten identificar las células y tejidos transformados de aquellos que no lo están. En nuestro caso usamos el gen uidA, que codifica para la enzima glucuronidasa (GUS) y se puede visualizar por tinción histoquímica, quedando teñidas de azul aquellas células que llevan el transgen. La optimización de la transformación genéti-

ca de girasol, permitirá la introducción de distintos genes de interés, especialmente aquellas secuencias que se obtengan en nuestro laboratorio a través del análisis de los ESTs y que se revelen como atractivas para: - conferir resistencia a enfermedades como las causadas por hongos como la podredumbre basal del tallo. - conferir resistencia a estreses abióticos como la sequía o el frío. - modificar la calidad de los aceites. MARCADORES MOLECULARES EN SOJA Fitopatólogos, genetistas, mejoradores, biólogos moleculares (de la Estación Experimental Marcos Juárez del INTA e Instituto de Biotecnología, INTA Castelar), extensionistas y productores rurales, de modo más indirecto, confluyen para la formación de un grupo interdisciplinario para abordar la implementación de técnicas de avanzada en tres grandes áreas de trabajo: - Desarrollo de marcadores moleculares aptos para el mejoramiento asistido. - Caracterización del germoplasma comercial argentino. - Mejoramiento asistido por marcadores moleculares. Desarrollo de marcadores moleculares aptos para el mejoramiento asistido El equipo de trabajo en mejoramiento molecular ha diseñado dos SCAR (Regiones Amplificadas de Secuencias Conocidas). Ambos son marcadores de PCR y, como su nombre lo indica, están basados en la información de secuencias nucleotídicas que han sido estudiadas por otros grupos de trabajo y que pueden ser obtenidas de sitios públicos en la Internet. Los marcadores moleculares pueden ser utilizados como herramientas de diagnóstico cuando se encuentran ligados al gen bajo estudio. El primer SCAR desarrollado permite la identificación de una variante en un gen (alelo) que confiere resistencia contra una enfermedad de gran importancia en el cultivo de la soja, la podredumbre húmeda de raíz y tallo, cuyo agente causal es el hongo Phytophtora sojae. Las plantas de soja que poseen este alelo (Rps1k) son resistentes a casi todas las razas del hongo que se han

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detectado hasta el momento, este gen está en la actualidad siendo introducido en todos los programas de producción de variedades comerciales de soja. El segundo marcador permite distinguir un alelo no codificante para el inhibidor de tripsina de Kunitz. Este alelo (ti) contiene una mutación que impide que se produzca esta proteína, principal factor antinutricional de la soja. En la Argentina es una práctica corriente entre los productores de aves y porcinos alimentar a sus animales con formulaciones que contienen harinas crudas en su composición. Debido a la presencia del inhibidor de tripsina, la harina de soja debe ser "desactivada" sometiéndola a altas temperaturas, lo que encarece el proceso productivo significativamente. La disponibilidad de un marcador que permita diferenciar el alelo ti nos pone en condiciones de producir rápida y eficientemente variedades de soja de alto rendimiento y libres del inhibidor de tripsina. Los productores podrán así incluso cultivar en sus campos soja especialmente apta para la alimentación animal y disminuir los costos de producción. Caracterización del germoplasma comercial argentino El cultivo de la soja es relativamente nuevo en nuestro país. Cobró importancia recién hacia finales de la década del ´70. Debido a esto, las enfermedades han sido relativamente poco importantes como factor limitante para la producción. Así, el desarrollo de variedades ha tenido tradicionalmente un objetivo preponderante: la mejora del rendimiento. Sin embargo, el advenimiento de la siembra directa y en particular de la soja tolerante al herbicida glifosato (sojas RoundUp Ready™) ha producido una verdadera explosión en el área cultivada. Esto incrementó también las enfermedades que provocan mermas considerables en el potencial productivo. Se ha hecho necesario entonces no sólo producir nuevas variedades con una sanidad superior, sino también conocer con precisión cuáles genes de resistencia se encuentran presente en el germoplasma comercial que está actualmente siendo utilizado en las diferentes áreas sojeras de nuestro país. Se ha encarado una doble caracterización de variedades comerciales que incluye la res-

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puesta general (fenotípica) frente a diferentes patógenos por un lado y la caracterización molecular (genotípica) utilizando marcadores moleculares, por el otro. Para caracterizar la respuesta fenotípica se recurre a evaluaciones a campo y bajo invernáculo de aquellos cultivares para los cuales se dispone de información previa que permite inferir que son resistentes a un determinado patógeno. La caracterización genotípica se realiza con marcadores moleculares (principalmente microsatélites y SCARs) que nos permiten inferir de modo indirecto cual de los alelos de resistencia está presente en una variedad determinada. Una vez que esta información haya sido recopilada se confeccionará una base de datos que permitirá una mejor elección del cultivar, de acuerdo con la historia sanitaria de cada lote de producción. Esta base de datos (que será de libre disponibilidad) permitirá también a los mejoradores en instituciones públicas y privadas seleccionar con más precisión los progenitores para las futuras variedades que serán lanzadas al mercado. Mejoramiento asistido por marcadores moleculares La utilización de marcadores moleculares en el mejoramiento permite un desarrollo más eficiente de nuevas variedades. El mejoramiento asistido (MA) evita la interacción ambiental, ya que selecciona el genotipo (no el fenotipo), lo que incrementa la heredabilidad del rasgo. El MA permite también analizar de modo no destructivo líneas y poblaciones en estadios vegetativos y generaciones muy tempranos, sin necesidad de la presencia del agente selectivo. En particular, el MA hace posible el "apilamiento" de alelos de resistencia para producir materiales multi-resistentes que anticipen las necesidades del productor o bien puedan ser utilizados como progenitores en futuros trabajos de mejoramiento. Se ha iniciado recientemente un programa de trabajo que utiliza aquellos marcadores que se han desarrollado en el INTA, y también otros que se obtuvieron de la literatura científica u otros grupos de trabajo en el exterior, y que se encuentran muy cercanamente ligados a distintos genes de interés. En este programa se intenta acumular genes de resistencia a algunas de las enfermedades y plagas de la soja que provocan mayor pérdida en el rendi-

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miento. Entre ellas cabe mencionar la podredumbre de raíz y hoja, la mancha ojo de rana (agente causal, Cercospora sojina) y el nematodo del quiste de la soja (Heterodera glycines). También se prevé en un futuro no muy lejano, iniciar un programa similar a fin de obtener genotipos de soja con resistencia a enfermedades de fin de ciclo, que perjudican la calidad de la semilla. Entre esas enfermedades cabe mencionar el tizón del tallo y de la vaina (agente causal Phomopsis sojae) y el "mosaico", causado por el virus del mosaico de la soja (SMV).

Cromosomas mitóticos de Helianthus annuus, cultivar Charata INTA (con introgresion de H. petiolaris).A-B: Tensión con fluorescente DAPI mostrando los 17 pares de cromosomas de girasol; C-D: FISH utilizando como sonda de ADN codificante de unidades ribosomales. Los puntos rojos corresponden a la localización de ADN ribosomal. E-F: Foto con doble exposición DAPI y FISH.

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