“MARCADORES MOLECULARES COMO HERRAMIENTA PARA EL MEJORAMIENTO GENÉTICO EN ANIMALES DE INTERÉS PECUARIO”

Cátedra Zootecnia General I Ing. Zoot. Andrea Longo

 Que son los marcadores moleculares?  Aplicaciones de Marcadores Moleculares en Mejoramiento genético animal  Diferentes tipos de Marcadores Moleculares y técnicas por las cuales se los evalua  Ejemplos de uso en animales de interés pecuario

Mejoramiento Genético Tradicional  Programas de Selección y Cruzamientos: han incrementado notablemente los niveles productivos de la mayoría de las especies de interés pecuario.  Esta basado principalmente en la selección fenotípica de individuos superiores.

 Muchos logros en importantes características.  Considerables dificultades en algunos casos debido principalmente a las interacciones genotipo-ambiente.

Hasta hace poco tiempo, todo lo que sabíamos acerca del potencial genético de un animal joven era el promedio de sus padres. No teníamos más alternativa a esperar 2 años para medir su desempeño, en el caso de las hembras, o esperar 5 años para poder medir el desempeño de su progenie, en el caso de los machos.

Mejoramiento Genético Mejoramiento Genético VS. Marcadores Moleculares Tradicional

Selección por caracteres Fenotípicos

Selección con Marcadores moleculares

 Influencia del ambiente  Bajo número  Caracteres de madurez  Entrenamiento y subjetividad

Sin influencia ambiental  Cantidad ilimitada  Análisis en edades tempranas  Sencillos, rápidos y objetivos

¿Cómo transmite la información genética?

Todos los seres vivos tienen su información hereditaria codificada en la molécula de ADN.

El juego completo de ADN de un ser vivo es el GENOMA

GENÓMICA: Disciplina dentro de la biología molecular que caracteriza y estudia genomas completos de diferentes especies.

MOLÉCULA ADN (ácido desoxirribonucleico)  Función: transmitir la información genética.  Compuesto por miles de nucleótidos (adenina, guanina, citosina y timina) que se agrupan en una cadena.  Clave de la transmición genética: “COMPLEMENTARIEDAD DE BASES”, donde adenina y timina forman un par químico estable y citosina y guanina forman otro par.  La molécula de ADN esta compuesta por 2 cadenas de ADN, complementarias una con la otra.

COMO PODEMOS APROVECHAR ESTA INFORMACIÓN?????

ADN COMO FUENTE DE INFORMACIÓN Es a partir de la segunda mitad del siglo XX que se desarrollan técnicas que permiten analizar y manipular el ADN.

Esto es actualmente una importante herramienta que puede ser utilizada con el fin de mejorar genéticamente los rodeos de animales de interés pecuario. “La era genómica” aprovecha la información codificada en los genomas de los seres vivos.

COMO ES LA REPLICACIÓN DEL ADN EN LAS CÉLULAS?

El ADN es duplicado mediante enzimas celulares especializadas: ADN polimerasas, que realizan el correcto apareamiento de bases y síntesis de la nuevas cadenas de ADN El desarrollo de tecnologías ha permitido llevar a cabo la replicación IN VITRO de fragmentos de ADN específicos.

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

 Desarrollada por Kary Mullis en la década de los 80`

 Lleva a cabo una síntesis enzimática IN VITRO de millones de copias de un segmento específico de ADN en presencia de una ADN polimerasa.  Permite estudiar los genomas de las especies e

identificar marcadores moleculares en estos.

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Esta síntesis IN VITRO de fragmentos de ADN consta de 3 etapas:  Desnaturalización de la doble hebra de ADN, llevada a cabo a una temperatura de 94º C que rompe los puentes H.

 Hibridación de Primers con el ADN molde (donde encuentran complementariedad de bases flanqueando la región de ADN de interés). (Primers: pequeñas moléculas de ADN de hebra simple sintetizadas artificialmente, de una longitud de 20 pares de bases que delimitan la secuencia de ADN de interés)

 Síntesis de la nueva cadena de ADN, llevada a cabo a 72º C por la enzima ADN polimerasa. Acá se produce la incorporación de los nuevos nucleótidos, utilizando como molde la secuencia de ADN original.

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)  Estas 3 etapas se repiten 25 a 40 veces.  En cada ciclo se generan nuevos fragmentos de ADN y estos sirven como molde para el siguiente ciclo, después de 25 ciclos se producen más de 1 millón de copias de el fragmento de ADN comprendido entre ambos primers (reacción con crecimiento exponencial).  Podemos iniciar la reacción con cantidades mínimas de ADN (del orden de nanogramos y picogramos) y terminar con grandes cantidades de ADN de una secuencia específica.

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Qué es necesario para amplificar ADN IN VITRO?  ADN polimerasa: Taq polimerasa recombinante  Buffer de enzima: contiene MgCl2,  dNTPs: dinucleotidos fosfatos: adenina, timina, guanina, citosina  Primers:  ADN molde: obtenido de diferentes tipos celulares  Agua estéril libre de ADNsas  Volumen de reacción: 15 a 25 ul  Termociclador

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

 Desarrollada por Kary Mullis en la década de los 80`

 Lleva a cabo una síntesis enzimática IN VITRO de millones de copias de un segmento específico de ADN en presencia de una ADN polimerasa.  Nos permite estudiar los genomas de las especies e

identificar marcadores moleculares en estos.

¿QUE SON LOS MARCADORES MOLECULARES? Posición específica en un genoma o sitio de referencia en el ADN de una especie que es posible identificar en el laboratorio y que nos permite caracterizarlos genéticamente.

Herencia Mendeliana

MEJORAMIENTO GENÉTICO CON MARCADORES MOLECULARES

 Genética Molecular  Genética Cuantitativa  Genética de Poblaciones  Bioinformática

Localizar e identificar variantes genéticas responsables de la VARIANZA GENOTÍPICA de los CARACTERES de INTERÉS ECONÓMICO

CARACTERES DE IMPORTANCIA ECONÓMICA CON BENEFICIOS POTENCIALES:  Baja Heredabilidad del carácter de interés  Difíciles de medir  La medida de esa variable está limitada a un solo sexo  Medidos luego de dejar descendencia  Expresión tardía en la vida del animal  Medidos en estado Posmortem

TIPOS DE MARCADORES MOLECULARES

 RFLP  RAPD  MICROSATÉLITES  SNPs  QTLs

Diferentes características y métodos de detección y análisis.

¿PARA QUE SIRVEN LOS MARCADORES MOLECULARES EN EL MEJORAMIENTO ANIMAL?  Análisis de Parentescos e Identificación Individual  Identificación de Razas  Identificación de portadores de enfermedades genéticas  Identificación de genes Favorables o No favorables en los animales  Trazabilidad de Productos Selección Asistida por Marcadores Moleculares (SAM), incluida la Selección genómica

ADN EN LA IDENTIFICACIÓN INDIVIDUAL Y DE RAZAS Y LA DETERMINACIÓN DE PARENTESCO  Huellas de ADN o DNA Fingerprinting (1985 en adelante)  Individuos de una misma especie comparten más del 98% de su genoma. La fracción restante los hace únicos  Una huella digital de ADN es un conjunto de marcadores moleculares cuya combinación resulta ser única e irrepetible entre individuos de una población

ADN EN LA IDENTIFICACIÓN INDIVIDUAL Y DE RAZAS Y LA DETERMINACIÓN DE PARENTESCO Actualmente se analizan paneles de marcadores microsatélites para:  confirmación de parentesco, identificación de razas y detección de mezclas,  implementación de protocolos de trazabilidad  incluso la resolución de problemas legales como el abigeato.

ADN EN LA IDENTIFICACIÓN INDIVIDUAL Y DE RAZAS Y LA DETERMINACIÓN DE PARENTESCO

A partir de 2005 incorpora Análisis de ADN: • verificación de identidad • chequeo de parentesco en las especies inscriptas • identificación de enfermedades genéticas

ADN EN LA IDENTIFICACIÓN INDIVIDUAL Y DE RAZAS Y LA DETERMINACIÓN DE PARENTESCO

SERVICIOS OFRECIDOS: Bovinos/Equinos/Camélidos/Ovinos • Control de Genealogía en animales inscriptos. • Identificación de crías de transplante embrionario, tatuaje o identificación dudosa, cambios de crías, etc • Determinación de posible padre/madre de crías cuestionadas en su ascendencia. • Verificación de aptitud de trabajo de toros en servicio colectivo, determinando las crías producidas por cada uno de los toros utilizados.

HUELLAS DE ADN POR PCR MICROSATÉLITES  Secuencias cortas (de 1 a 6 bases nucleotídicas)

repetidas en tándem un alto número de veces  Utiliza poca cantidad de ADN  Son de un tamaño amplificable por PCR (100-350 pb)  Especie-específicos Muy polimórficos, ideales para identificación de individuos

ESTRUCTURA MICROSATÉLITE

La región microsatélite se encuentra flanqueada por secuencias conservadas, a partir de las cuales se diseñan cebadores específicos los que son utilizados durante la PCR.

OBTENCIÓN DE ADN A partir de distintos tipos celulares

PROCEDIMIENTO  OBTENCIÓN ADN

AMPLIFICACIÓN MICROSATÉLITES POR PCR ADN

GENOTIPIFICACIÓN ALELOS

Secuenciador Automático

Geles de Secuenciación

Cebadores Buffer

dNTPs

Taq ADN Polimerasa

• Objetivo: Asignación de paternidad en Charolais • Se analizaron muestras de sangre o semen de 108 vacas, 68 terneros y 7 toros. • Se analizaron 9 marcadores microsatelites bovinos • Análisis estadístico de los datos obtenidos • Los toros presentaron paternidad múltiple; sin embargo uno de ellos mostró mayor éxito reproductivo (mayor Nº de crías) • El panel de microsatélites fue capaz de asignar paternidad con 95 % de confianza en más del 75% de los animales analizados

TRAZABILIDAD POR MARCADORES MOLECULARES La trazabilidad de la carne es de gran importancia para la seguridad alimentaria, ya que garantiza su identidad y rastreabilidad desde el origen hasta la comercialización. Para esto es necesario IDENTIFICAR a los animales para asegurar el seguimiento del producto en toda la cadena productiva, incluso luego de la faena. La Sociedad Internacional de Genética Animal (ISAG, por sus siglas en ingles) recomienda ciertos marcadores microsatélites que sirven como marcadores estándares para la comparación entre distintas razas bovinas

TRAZABILIDAD POR MARCADORES MOLECULARES Cada vez que un animal es faenado, se colecta una muestra biológica del animal antes de que se pierda la identidad del mismo.

Se guarda con la identificación completa como muestra de referencia. En caso de que sea necesario establecer el origen del producto en cualquier punto de la cadena, se toma la muestra (problema) para obtener la huella genética del ADN, y este perfil se compara con la muestra de referencia, y se determina si ambas huellas genéticas son idénticas o no.

IDENTIFICACIÓN DE ENFERMEDADES GENÉTICAS

Identificación de portadores de ALELOS INDESEABLES que predisponen a DEFECTOS y ENFERMEDADES.

Existe una Base de Datos que reúne información de defectos y enfermedades que tengan un origen genético en más de 135 especies. Mediante un test genético es posible identificar animales portadores. El carácter de portador de un reproductor puede ser asentado junto con el resto de la información del mismo.

EJEMPLO DE IDENTIFICACIÓN DE ENFERMEDADES GENÉTICAS CITRULINEMIA (deficiencia de la enzima argininosuccinato sintetasa):

• Enfermedad recesiva letal metabólica en la cual la falta de esta enzima en doble dosis (Homocigota recesivo) produce la muerte de los terneros (durante la primer semana de vida), involucra un error en el metabolismo de la urea. • Dicha patología se genera por la presencia de una mutación puntual permitiendo diseñar un diagnostico molecular directo por marcadores moleculares PCR-RFLP. • Uno de los toros portadores y diseminadores en la raza Holstein es Linmack Kriss King, con amplia utilización como semental.

TÉCNICA EMPLEADA: MARCADORES RFLP PROCEDIMIENTO: • Se amplifica por PCR un fragmento específico • Este fragmento es cortado con una la enzima de restricción

EJEMPLO DE IDENTIFICACIÓN DE ENFERMEDADES GENÉTICAS CITRULINEMIA

PROCEDIMIENTO: • Se amplifica por PCR un fragmento específico de 176 pb del gen de la enzima argininasuccinato sintetasa. • Este fragmento es cortado con la enzima de restricción AvaII (RFLP)

Animal Portador Animal Sano

EJEMPLO DE IDENTIFICACIÓN DE ENFERMEDADES GENÉTICAS CITRULINEMIA Una mutación en el codón 86 modifica el aminoácido y también el lugar de reconocimiento de la enzima de restricción AvaII. Animales sanos: se observan 2 fragmentos Animales portadores: se observa un fragmento, ya que se pierde un sitio de reconocimiento de la enzima

SELECCIÓN ASISTIDA POR MARCADORES MOLECULARES (SAM) y SELECCIÓN GENÓMICA Utiliza información aportada por el ADN de un animal candidato a ser seleccionado, juntamente con sus registros productivos y los de individuos emparentados. Utiliza esta información como un dato adicional para predecir sus valores genéticos y basándose en esos valores genéticos “mejorados” tomar las decisiones de selección.  La gran ventaja es que la información sobre el ADN se puede tener al nacimiento del animal, a partir de una muestra de sangre.  Se identifican marcadores moleculares y se los correlaciona con una característica productiva

SELECCIÓN ASISTIDA POR MARCADORES MOLECULARES (SAM) y SELECCIÓN GENÓMICA En 2004 se obtuvo la secuencia de nucleótidos completa del genoma bovino

A partir de esta información, en 2007 comenzó la comercialización de un chip de ADN que permite conocer la información sobre un animal a partir del análisis de 54.000 marcadores SNP

MARCADORES SNP (Polimorfismos de un solo nucleótido) Variación en el ADN debido a una Mutación de una base nucleotídica por otra en una posición específica de un genoma  Di-alélicos  Abundantes y dispersos en el genoma  Muchos SNP están próximos a regiones del ADN responsables de caracteres de interés, es decir, estarán asociados a genes

SELECCIÓN ASISTIDA POR MARCADORES MOLECULARES (SAM) y SELECCIÓN GENÓMICA

El manejo del ganado lechero (hembras en control lechero, uso de la inseminación artificial, uso de toros con evaluación genética) ha permitido una rápida implementación de la tecnología genómica.

En bovinos de carne el progreso es más lento, dado que hay diferencias entre las diferentes razas y no hay información fenotípica tan precisa.

SELECCIÓN ASISTIDA POR MARCADORES MOLECULARES (SAM) y SELECCIÓN GENÓMICA EVALUACIONES GENÓMICAS A partir de la información sobre los miles de SNP de un animal, se predice el Mérito genético del mismo para diferentes caracteres productivos, aplicando “fórmulas” o “ecuaciones de predicción”. Estas evaluaciones genómicas se incorporan luego en las evaluaciones genéticas tradicionales aumentando su fiabilidad. Varios países han empezado a incorporar la información del ADN en las evaluaciones genéticas oficiales del vacuno de leche Holstein (EEUU, España).

SELECCIÓN ASISTIDA POR MARCADORES MOLECULARES (SAM) y SELECCIÓN GENÓMICA SELECCIÓN GENÓMICA EN GANADO LECHERO Investigaciones realizadas muestran que, para un toro joven y una vaquillona Holstein, podemos combinar el Promedio de los Padres (PA) del animal con la información genómica para tener un “PTA Genómico” con una confianza del 60 al 70% (mucho mejor que la confianza de su PA por si sólo, que es sólo del 30 al 40%).

Ternera: la confianza de su PTA genómico es equivalente al que se tendría al medir datos de varias lactancias del animal y de sus hijas.

Ternero: la confianza de su PTA genómico es equivalente al que se tendría al medir datos de varias lactancias de sus hijas.

SELECCIÓN ASISTIDA POR MARCADORES MOLECULARES (SAM) y SELECCIÓN GENÓMICA SELECCIÓN GENÓMICA EN GANADO LECHERO Actualmente casi todos los toros jóvenes que entran a un centro de I.A. de América del Norte son analizados genómicamente, y muchas madres potenciales son analizadas también. Los centros de I.A. han comenzado a comercializar semen de toros genómicos jóvenes que tienen PTA genómicos, pero no hijas propias. Es necesario desarrollar sistemas de evaluaciones genómicas de menor costo para que puedan ser utilizados en gran cantidad de animales.

EJEMPLOS DE MARCADORES MOLECULARES ASOCIADOS A CARACTERÍSITCAS DE INTERÉS PRODUCTIVO

• Realizaron estudios en el genoma bovino en los genes de la Calpastatina (CAST) y de la Calpaína (CAPN1), dos enzimas que intervienen en los procesos de tiernizado post mortem de la carne. • Se identificaron marcadores SNP en dichos genes: 1 SNP en gen Calpastatina y 2 SNP en gen de Calpaína. • Se identificó una variante alélica favorable y otra no favorable para la terneza de la carne en la población de Angus, Hereford y Limousin. • Un reproductor puede ser evaluado con "tres marcadores moleculares" asociados a terneza, identificando en cada uno la presencia o ausencia de la variante más favorable, siendo una herramienta para seleccionar reproductores a una edad temprana.

"La genómica ofrece información adicional para integrarla a un programa de mejoramiento genético, pero la genómica no va a reemplazar a la prueba de progenie".