TÉCNICAS CITO-HISTOLÓGICAS Las células y tejidos son examinados por transparencia con casi todos los tipos de microscopio, lo cual obliga a estudiar células o tejidos aplanados lo suficientemente delgados como para que puedan ser atravesados por la radiación luminosa. Ello implica una serie de procedimientos que culminan con la obtención de un corte transparente de tejido. Las técnicas cito-histológicas son todos los procedimientos desde la obtención de la muestra hasta su transformación en una preparación adecuada para su estudio microscópico. Los métodos convencionales para prepara muestras para el microscopio óptico común son similares a las del microscopio electrónico de transmisión, diferenciándose solo en el uso de reactivos y aparatos diferentes para realizar los cortes. La técnica histológica para obtener preparaciones más común es la siguiente: Obtención de la muestra Para las muestras obtenidas a partir de un animal, este debe estar preferentemente vivo y anestesiado. Los fragmentos de muestra deben ser pequeños, no mayores a 5 mm de espesor. Se deben cortar con un instrumento muy afilado, como bisturí o navaja, para evitar el desgarro de los tejidos. Luego de extraída, la muestra debe ser sumergida inmediatamente en fijador. Fijación La fijación es un método que permite conservar la morfología y composición química de las células y los tejidos. Consiste en matar a las células para que mantengan la misma estructura que poseían en vida y permitan analizarlas mediante microscopio. La fijación se debe realizar inmediatamente después de extraer las células o tejidos del organismo, para evitar el deterioro del material. Los fragmentos de tejido deben ser lo más pequeño posible, para que el fijador penetre rápidamente. Debido a ello, una características que debe reunir un buen fijados es la velocidad de penetración en las estructuras. La fijación tiene además la finalidad de endurecer los tejidos, volviéndolos más resistentes para las etapas siguientes de la técnica histológica. Los fijadores químicos producen enlaces cruzados o desnaturalización de las proteínas, al substituir el agua con la cual están relacionados. La mayor parte de los fijadores además inactivan las enzimas celulares. Cualidades que debe tener un fijador: 1. Actuar con rapidez, matando y fijando a las células antes de que aparezcan los fenómenos de post-mortem (autólisis, desintegración, etc.). 2. Poseer alto poder de penetración para asegurar la fijación correcta hasta en las capas profundas de la pieza a fijar. 3. Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban in vivo. 4. Permitir o favorecer el empleo de los procedimientos necesarios para su observación ulterior (cortes, coloración, etc.). 5. Impedir la desaparición de los elementos solubles durante la fijación o después de ella. 1

6. No provocar o impedir la producción de estructuras artificiales. 7. No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos quebradizos. Mecanismo de acción de los fijadores Varía con la composición o naturaleza de los mismos: 1. coagulando las proteínas sin combinarse con ellas (alcohol, ácido pícrico, yodo, calor). 2. formando combinaciones químicas con las sustancias orgánicas (ácido crómico y sus sales) 3. reduciéndose en contacto con las mismas y originando en su seno un precipitado sumamente fino (ácido ósmico, bicloruro de mercurio, cloruro de oro). Tipos de Fijadores El fijador a utilizar depende del material que se desea analizar y las estructuras o células que se quieren estudiar. Sin embargo, a los fijadores se los puede agrupar en dos grandes categorías. Fijadores químicos: son los más utilizados. Existen dos tipos de fijadores químicos, los simples y los compuestos. Simples: son los que están constituidos por una sola sustancia química. a) Formol al 10%: es el más usado. Su empleo es aconsejable en todos los casos en que no se disponga de un fijador especial, principalmente cuando se trata de fijar órganos o tejidos para estudios histológicos o patológicos. b) Alcohol etílico absoluto o de 96%: se usa generalmente en microquímica. c) Alcohol metílico: se lo emplea con frecuencia para fijar frotis desecados (sangre, médula ósea, ganglio, bazo, líquidos de punción, etc.). d) Ácido ósmico al 1 ó 2%, es poco penetrante pero enérgico, conserva muy bien estructuras celulares. e) Bicromato de potasio al 3-5%. Compuestos: se encuentran formados por un número variable de fijadores simples, que se eligen con la intención de complementar la acción de cada uno de ellos o atenuar sus defectos. a) Líquido de Fleming, mezcla cromo-osmio-acética. b) Líquido de Zenker, mezcla bicromato-sublimado-acética. c) Líquido de Helly, mezcla Zenker-formol. d) Líquido de Bouin, mezcla picro-formos-acética. e) Liquido de Duboscq-Brasil, o Bouin alcohólico. Fijadores Físicos 1. 2. 3. 4. 5.

Desecación. Calor seco. Calor húmedo. Frío. Congelación y desecación. 2

Para el diagnóstico histopatologico, lo más utilizado es el formol. Para la observación de cromosomas o núcleos celulares, generalmente se utiliza una mezcla de alcohol y ácido acético (3:1). En el estudio de enzimas se pueden emplear la acetona, el glutaraldehido o el formaldehído que se caracterizan por producir muy pocas modificaciones a los sistemas enzimáticos. Para microscopía electrónica la fijación se realiza casi siempre con glutaraldehido, cualquiera sea la célula o estructura que se quiera analizar, seguido por una refijación con tetróxido de osmio. Deshidratación Las piezas al ser retiradas del fijador, o después de haberlas lavado, están embebidas en agua; impidiendo que sean penetradas por la parafina. Por lo tanto, en primer lugar, se deben deshidratar los tejidos sumergiéndolos en líquidos sin agua. Para evitar alteraciones provocadas por una deshidratación brusca, se utiliza una serie creciente de alcohol etílico. Inclusión Para poder obtener cortes finos de tejido es necesario que el tejido haya sido previamente endurecido, porque cuanto más firme, más delgado será el corte histológico. La técnica mas empleada es la inclusión en parafina, que es una sustancia hidrófoba, sólida a temperatura ambiente. Dado que el alcohol no es miscible en parafina, antes de incluir los tejidos es necesario tratarlos con benceno o tolueno. Para la inclusión en parafina se emplean moldes de papel o de metal. En los moldes se coloca la muestra de tejido y luego se vierte la parafina a 60ºC. A los 1530 minutos la parafina se solidifica completamente. Se recortan los bloques en forma de pirámide cuadrangular, se adhieren los bloques a un taquito de madera mediante una espátula calentada con la llama de un mechero y luego ya se pueden realizar los cortes. Para las preparaciones de microscopio electrónico se utiliza siempre resinas de epoxi, que poseen una gran dureza, por lo cual deben ser cortados mediante las cuchillas de diamante o vidrio del ultramicrótomo. Cortes histológicos Para poder observar los tejidos en el MO, se deben obtener láminas delgadas para que la luz atraviese el material. En casi todos los casos el elemento utilizado para hacer los cortes es el micrótomo. Los micrótomos son instrumentos de gran precisión que nos proporcionan cortes delgados parejos y de espesor graduable. Los cortes más corrientes son los de 4-6 micrones. Los cortes de parafina se extienden en agua tibia, dentro de la cual se introduce el portaobjetos cubierto con una capa de adhesivo. Con la ayuda de una aguja histológica, se colocan los cortes sobre el portaobjetos y a continuación se lo levanta. En algunas ocasiones se realiza el congelamiento del material (sin fijación ni inclusión) y se realizan los cortes en un micrótomo de congelación. En este caso se emplean micrótomos refrigerados con CO2 líquido y se realizan cortes de no muy 3

buena calidad. Sin embargo son empleados en la realización de biopsias para obtener un rápido diagnóstico. Coloración La coloración se realiza para dos propósitos diferentes. El primero para obtener contraste en el MO y poder realizar observaciones morfológicas o estructurales. En el otro caso se utilizan colorantes para identificar sustancias o moléculas específicas. En este caso se habla de técnicas citoquímicas o histoquímicas. Según su origen se clasifican en: Colorantes Naturales - Animales (carmín) - Vegetales (hematoxilina, orceína, azafrán) Colorantes Artificiales o Sintéticos - Ácidos: sales cuya base es incolora y su ácido es coloreado (eosina o eosinato de sodio). Son colorantes citoplasmáticos. - Básicos: sales cuya base es coloreada y el ácido es incoloro (azul de metileno o clorhidrato de azul de metileno). Son colorantes nucleares. - Neutros: sales en las que tanto el ácido como la base son coloreados. Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro. - Indiferentes: no forman sales. Tiñen aquellas sustancias que tienen un poder disolvente superior al del líquido que ha servido para preparar la solución colorante (Sudán lll, rojo escarlata). Montaje Luego de la coloración, se deshidrata el corte y se procede a la aclaración y montaje definitivo. La deshidratación se realiza con alcoholes de graduaciones crecientes. La aclaración se realiza con xilol o con alcohol, dependiendo del tipo de medio de montaje que se utilice. Lo más común es efectuar la aclaración con xilol y luego montar la preparación en Bálsamo de Canadá. También es frecuente la aclaración en alcohol absoluto y el montaje en Euparal. Los medios de montaje permiten conservar las estructuras durante muchos años y presentan un índice de refracción semejante al del vidrio.

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