Carrera de Ingeniería Agronómica Cátedra de Microbiología Agrícola Año 2014

Serie Didáctica Identificación microbiana 1. Introducción La identificación de una bacteria es su asignación a un taxón según una clasificación dada. Consiste en la determinación de las características fenotípicas y/o genotípicas y la comparación de estas características con los diferentes taxones de la clasificación considerada. Las características a determinar y su número depende principalmente del tipo de bacteria y del fin que se persigue en la identificación. Existen diferentes sistemas de clasificación de bacterias, pero el más comúnmente utilizado es el Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. La identidad de un microorganismo se determina mediante un conjunto de técnicas y procedimientos, los cuales se utilizan en diferentes áreas, por ejemplo: detección de bacterias patógenas en agua y alimentos; identificación de patógenos de animales y plantas; identificación de microorganismos de importancia como PGPR, identificación de microorganismos relacionados a un determinado grupo fisiológico. 2. Métodos Los métodos más utilizados para la identificación microbiana, los podemos clasificar en métodos basados en: criterios morfológicos, tinción diferencial, pruebas bioquímicas, tipificación con fagos, pruebas serológicas, procedimientos moleculares. En la mayoría de los casos la identificación no se realiza con base a un solo método, sino a la combinación de más de uno. Por ejemplo la identificación de bacterias se puede basar en criterios moleculares y bioquímicos. 2.1. Métodos basados en criterios morfológicos Los rasgos morfológicos (estructurales) han ayudado a los taxonomistas por muchos años a clasificar organismos. Los organismos superiores tienen rasgos anatómicos tan diferentes que pueden ser fácilmente utilizados en su clasificación, pero con respecto a los microorganismos, éstos lucen bajo el microcoscopio tan similares que se dificulta su clasificación. Es decir, que estos microorganismos que se ven tan parecidos bajo un microscopio, pueden diferir en propiedades bioquímicas, fisiológicas y/o serológicas. Sin embargo, aun cuando la morfología celular dice poco sobre las relaciones filogenéticas, sigue siendo útil para la identificación bacteriana. Por ejemplo: la presencia de endosporas y su localización resulta de mucha utilidad en la identificación de bacilos esporulados. Los microorganismos son demasiado pequeños para observarse a simple vista (Figura 1), es por ello que para realizar las observaciones es imprescindible la utilización del microscopio (instrumento que amplifica la imagen de un objeto pequeño). Se usa en los laboratorios que estudian los microorganismos, facilitando la observación de los mismos y de ciertas estructuras celulares, al tratarlos con colorantes o tintes, por lo que se deben conocer sus fundamentos.

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Figura 1. Tamaños relativos de las células y sus componentes 2.1.1. El microscopio El microscopio puede ser: * Simple: compuesto por un sistema de lentes. Da una imagen virtual, derecha y aumentada. Sirve para aumentos débiles (ej. lupas). * Compuesto: tiene dos lentes o sistemas de lentes; el objetivo, situado cerca del objeto a observar y el ocular que está colocado cerca del ojo humano. El aumento total de un microscopio compuesto es el producto del aumento de su objetivo por el de su ocular. Con un objetivo de 40x y un ocular 10x, el aumento total es de 400x. Además del aumento, una propiedad importante es su poder resolutivo que es la capacidad de mostrar distintos y separados dos puntos muy cercanos, por lo tanto cuanto mayor sea el poder resolutivo, mayor será la definición de un objeto. El poder resolutivo depende de la longitud de onda utilizada, y de una propiedad óptica de la lente conocida como apertura numérica, y que está marcada al lado de la lente objetivo. La apertura numérica también es afectada por el medio a través del cual pasa la luz. Para conseguir aperturas numéricas mayores que uno (1) el objetivo debe estar inmerso en un líquido de mayor índice de refracción que el aire. Para tal fin se utilizan aceites de varios tipos y las lentes preparadas para usarse con aceite se denominan lentes de inmersión. El sistema de iluminación de un microscopio óptico también es de considerable importancia. La luz que entra en el sistema debe enfocarse sobre el preparado y para esto se usa un sistema de lentes llamado condensador. 2.1.1.1. Microscopios ópticos Los microscopios de este tipo generalmente producen aumentos de hasta 1000 veces el tamaño original. 2.1.1.1.1. microscopio de campo claro Usa como fuente de luz directa una bombilla eléctrica o bien la luz solar. Ya que los microorganismos son transparentes es difícil distinguirlos con este tipo de microscopía y es por lo que se suelen teñir. 2.1.1.1.2. microscopio de campo oscuro Es un microscopio ordinario cuyo sistema condensador ha sido modificado para dirigir la luz a la preparación desde los lados, de tal modo que sólo la luz difractada por la

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preparación pasa al ocular y se hace visible. A causa de esta disposición, la muestra parece iluminada sobre un fondo oscuro. Este método se utiliza para visualizar microorganismos vivos sin teñir 2.1.1.1.3. microscopio de contraste de fases Es un microscopio óptico modificado que permite contrastar sustancias de diferente grosor o densidad. Retarda la luz mediante un anillo de contraste de fase situado entre el objetivo y el ocular, con el fin de exagerar la diferencia del índice de refracción entre las células y el medio. La fuente de luz es un cono hueco que pasa a través de un diafragma anular al condensador. De esta manera pueden observarse células sin teñir que no podrían ser percibidas sin tal intensificación del contraste. Con este método, el material denso aparece brillante, mientras que las partes de la célula que tienen una densidad cercana al H2O (citoplasma) aparecen oscuras. Se utiliza para visualizar estructuras celulares sin necesidad de usar colorantes o matar microorganismos. 2.1.1.1.4. microscopio con luz ultravioleta Utilizando luz ultravioleta se logra un ligero aumento resolutivo del microscopio óptico. Como el ojo humano no puede percibir los rayos UV, debe usarse una cámara fotográfica para registrar la imagen. El pequeño aumento en el poder resolutivo no compensa generalmente la mayor característica de este microscopio, por lo que es de poco uso. 2.1.1.1.5. microscopio de fluorescencia Es una modificación del microscopio UV. Utiliza la propiedad de algunas sustancias químicas de absorber la luz UV y emitirla como visible (fluorescencia). Esta técnica es útil para el examen de partículas fluorescentes o que pueden serlo mediante tinciones especiales. 2.1.1.2. Microscopios electrónicos Para estudiar la estructura interna de los procariotas es esencial el uso del microscopio electrónico. En este microscopio, se emiten electrones en lugar de rayos de luz y como lentes funcionan electroimanes. Cuando los electrones pasan a través de la preparación algunos son difractados creando, entonces, una imagen que se hace visible en una pantalla sensible a los electrones. El poder resolutivo de este instrumento hace que puedan verse objetos de 0.001 um. 2.11.2.1. microscopio electrónico de transmisión (MET) Es usado para el estudio de las estructuras internas de los procariotas. Las muestras, para su observación, requieren técnicas especiales de preparación (cortes ultrafinos) y para obtener contraste suficiente, se tratan las preparaciones con colorantes especiales como ácido ósmico, permanganato, uranio o plomo, que dispersan bien los electrones. 2.1.1.2.2 microscopio electrónico de exploración o de barrido (MEB) Es usado para observar las características externas de un organismo. Para aumentar el contraste de las células enteras se recurre generalmente al sombreado, esto implica recubrir la muestra con una fina capa de metal (paladio, oro o cromo), que se deposita sobre el objeto de manera que se crea una sombra; así éste aparece con espesor y forma. 2.1.2. Observaciones Las observaciones macro y microscópicas constituyen las primeras etapas del estudio de los microorganismos y también del diagnóstico microbiológico ya que permite conocer algunas características de los microorganismos. 2.1.2.1. Observaciones macroscópicas La morfología macroscópica, se basa en las características de crecimiento de las colonias en un medio de cultivo determinado. Así en medios sólidos se observarán

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características tales como tamaño, forma, consistencia, elevación, borde, superficie, color, transparencia, textura. En medios líquidos se observarán cantidad de crecimiento (ausente, escaso, abundante) y la distribución del crecimiento (presencia de velo, precipitado, etc.) 2.1.2.2. Observaciones microscópicas La morfología microscópica se basa en las características individuales como ser: forma, tamaño, disposición o agrupación, presencia o ausencia de estructuras (cápsulas, esporas, flagelos), movilidad, etc (Figura 2). La forma y la movilidad de los microorganismos se pueden conocer mediante observaciones al estado fresco o coloración vital, mientras que la presencia de estructuras, orgánulos, etc. requieren de tinciones, previa muerte microbiana.

Figura 2. Morfología y agrupaciones bacterianas. Algunos ejemplos. 2.1.2.2.1. Observaciones vitales Permiten apreciar la morfología de la célula microbiana y la movilidad o ausencia de la misma. Observación al estado fresco: permite observar el microorganismo al estado vivo y evita las deformaciones artificiales de su morfología que producen las técnicas de coloración. Su aplicación más importante se refiere al estudio de la movilidad de los microorganismos. Consiste en colocar en solución fisiológica (Cl Na 9 ‰)., o agua, una suspensión de los microorganismos en estudio, entre porta y cubreobjeto. Observación por coloración vital: Es semejante a la observación anterior con la diferencia que se utiliza un colorante en lugar de solución fisiológica. Muy pocos colorantes son usados para impregnar las bacterias sin matar y sin inmovilizarlas. Es por eso que es necesario utilizar soluciones acuosas diluidas de colorantes (ej. rojo neutro al 0,5%, azul de metileno al 0,5%) 2.2. Métodos basados en coloraciones y tinciones diferenciales El empleo de colorantes biológicos permite aumentar el contraste entre la célula y el medio ambiente y a través del empleo de técnicas especiales, es posible distinguir algunos de los constituyentes celulares más importantes. Cualquiera sea el procedimiento de tinción, éste

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produce la muerte de la célula y en cierto modo la alteración de la estructura física del microorganismo. Las tinciones se utilizan con más frecuencia en bacterias con el objeto de observarlas con mayor detalle y poner en evidencia sus estructuras ya que las tinciones prestan una gran utilidad en el estudio e identificación de las especies bacterianas. Todas las técnicas de coloración requieren dos operaciones previas a la aplicación del colorante: preparar el extendido y fijarlo, para lograr un frotis. Preparación del extendido: se procede a extender la muestra a observar sobre un portaobjeto con la ayuda de un ansa. Fijación del extendido: se realiza con el fin de coagular el protoplasma de los microorganismos antes de ser teñidos, así las estructuras citológicas se adhieren al portaobjeto. Se puede fijar por calor (pasando el portaobjeto por la llama del mechero 2-3 veces, con el extendido hacia arriba) o por sustancias químicas (como alcohol metílico, etílico, formaldehído). Una vez logrado el frotis, se realiza la tinción que consiste en dejar actuar colorantes de uso microbiológico. 2.2.1. Colorantes Son compuestos químicos que poseen un grupo cromóforo que otorga color a la molécula y un grupo auxocromo que otorga al colorante la capacidad de disociarse electrolíticamente y, por lo tanto, formar sales. El grupo auxocromo es el que facilita la unión del colorante a otras sustancias con carga eléctrica. Los colorantes usados en Microbiología son, en su mayoría, compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica con el protoplasma o determinadas estructuras celulares. Se los clasifica en: básicos: son moléculas orgánicas cargadas positivamente que se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, como por ejemplo los ácidos nucleicos. ácidos : moléculas cargadas negativamente que se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente. liposolubles: específicos para colorear grasas, tales como el ácido poli betahidroxibutirato. La fijación de colorantes a la célula bacteriana se facilita con el uso de mordientes, con los que forman compuestos insolubles (yodo, fenol, ácido tánico, oxalato de amonio, etc.). 2.2.2. Clasificación de las coloraciones Por el número de colorantes usados  Simple: Se usa un solo colorante. Las bacterias se tiñen en forma homogénea de la misma coloración. La utilidad de esta tinción es relativa, ya que sólo es factible observar forma y agrupación celular.  Compuesta: usa más de un colorante, con el fin de obtener un notable efecto de contraste, tales como la coloración de Gram o de esporas. Por alguna particularidad determinada:  Diferencial: distingue dos grupos o más, destinadas a ayudar a la clasificación de los microorganismos, como por ejemplo la coloración de Gram.  Especial: permiten poner de manifiesto alguna estructura especial de la célula bacteriana, ej. material nuclear, membrana citoplasmática, flagelos, cápsulas, esporas, etc.  Negativa: se tiñe el medio que rodea las células, pero no éstas. 2.2.3. Descripción de algunas coloraciones de mayor importancia taxonómica 2.2.3.1. Coloración de Gram

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Es una coloración doble y diferencial, de gran importancia por su valor taxonómico en bacterias, que ha permitido establecer dos grupos microbianos: Gram positivos, que son los que retienen el primer colorante (violeta de genciana o cristal violeta) luego de ser tratados con el decolorante (alcohol o acetona) y Gram negativos, son los que no retienen el primer colorante después de la acción del decolorante. Esta coloración además brinda información acerca de la pureza del cultivo y permite observar morfología, agrupamientos celulares, etc. Se demostró que existen diferencias fundamentales en la composición química de la pared celular de las bacterias Gram negativas y positivas. Estas diferencias químicas están relacionadas con la estructura de la pared celular. Las Gram negativas tienen una pared constituida por el peptidoglicano en pequeña proporción y la membrana LPS constituida por fosfolípidos, polisacáridos y proteínas, mientras que en la Gram positivas el peptidoglicano se encuentra en mayor proporción acompañado de ácidos teicoicos. En las Gram negativas, por su alto contenido de lípidos en pared, el alcohol (diferenciador de la coloración de Gram) produce solubilización de la capa lipídica, la porosidad aumenta y así el complejo yodo-cristal violeta es desalojado y se decolora. Con el segundo colorante o contra colorante (safranina o fucsina) se colorea nuevamente y así las Gram negativas toman una tonalidad rosada. En las Gram positivas, la acción del alcohol provoca la deshidratación de la pared, los poros disminuyen de tamaño y el complejo yodo-cristal violeta es fijado ya que el peptidoglicano actúa como barrera. Así, éstas quedan teñidas con el colorante cristal violeta o violeta de genciana (primer colorante). Al realizar la reacción de Gram se deben tener en cuenta lo siguiente:  Estado fisiológico del cultivo: deben ser células provenientes de un cultivo joven, de 24 hs. o menos porque ciertas bacterias pierden su condición de Gram positivas al ir envejeciendo ya que no retienen al complejo iodo-cristal violeta., y por ello se denominan Gram variables.  Desarrollo del cultivo en medio sólido: se debe trabajar con microorganismos desarrollados en medio agarizado, ya que si se encuentran en medio líquido se puede arrastar sustancias del mismo medio. 2.2.3.2. Coloración de flagelos y cilias Muchos microorganismos se desplazan por medio de orgánulos especiales, los flagelos y las cilias. Estas son estructuras filamentosas y la diferencia entre flagelo y cilia se basa en su longitud relativa. La cilia es un filamento más corto que un flagelo. Las cilias y los flagelos presentan un diámetro inferior al poder de resolución del microscopio óptico. Para ponerlos en evidencia hay que agrandarlos cargándolos de colorante, después de un mordentado enérgico o de depositar en su superficie plata reducida. Mediante el método de impregnación argéntica, uno de los métodos de tinción, las cilias son cargadas con un mordiente reductor y luego, por la acción de una sal de plata o de óxido de plata, se forma sobre este mordiente un depósito de plata. Los flagelos pueden disponerse en las células bacterianas en forma polar o perítrica. En las formas polares los flagelos están insertos exclusivamente en uno o en ambos extremos de la célula. Acorde con el número y distribución, pueden ser: monótricos (un flagelo en un polo), lofótricos (un grupo de flagelos en un extremo o anfítricos (un grupo de flagelos en ambos extremos. En la flagelación perítrica las células están completamente rodeadas de flagelos. Los flagelos tienen importancia en taxonomía bacteriana para identificar especies. 2.2.3.3. Coloración de cápsulas Muchas bacterias segregan polímeros orgánicos de solubilidad limitada en agua y que tienden a acumularse como capas sueltas y confluentes en la vecindad inmediata de las células, justamente alrededor de la pared. Se denominan cápsulas si el material está dispuesto

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de un modo compacto alrededor de la superficie celular. Si el material es laxo, de manera que sólo forma una capa difusa, se denominan capas mucosas o viscosas. Las cápsulas y las capas mucosas, normalmente están compuestas de polisacáridos, polipéptidos o complejos de polisacáridos y proteínas. Las características de producir cápsulas, es una propiedad hereditaria del organismo, pero estas estructuras no son componentes celulares absolutamente esenciales, ya que cepas mutantes sin cápsula, son capaces de crecer en cultivo puro. Para observarlas se realiza una coloración negativa en dónde las células quedan sin teñir pero se colorea el medio que las rodea. Los microorganismos quedan transparentes y delimitados por un fondo oscuro. Esta tinción sirve para revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas. Para este tipo de coloración se usan colorantes que no tienen afinidad por los constituyentes celulares, por ejemplo tinta china. 2.2.3.4. Coloración de endosporas Las endosporas son estructuras, que forman ciertas bacterias, resistentes a agentes físicos y químicos. Las forman, generalmente, especies de la familia Bacillaceae, tales como Bacillus y Clostridium. La característica más notable es su resistencia a altas temperaturas, por ello se deben extremar los cuidados al esterilizar un material que puede estar contaminado con microorganismos esporulados. La diferencia química más notable entre la espora y la célula vegetativa es la presencia de ácido dipicolínico. Constituye del 10-15 % del peso seco de la espora. Además, las esporas contienen muy poca cantidad de agua y este estado de deshidratación de sus componentes las hace más resistentes a la desnaturalización. Las células que la contienen se denominan esporangios. La deformación o no del esporangio, así como la ubicación de la espora, se utiliza como carácter taxonómico. 2.2.3.5. Coloración de gránulos metacromáticos Se puede utilizar en la coloración azul de metileno (0,3%). Los gránulos aparecen de color azul intenso. Las tinciones simples, diferenciales, especiales aún cuando se combinen con observación de las características de la colonia y cultivo de la misma, no son suficientes para la identificación de una bacteria aislada. Los resultados de las tinciones y de los cultivos deben combinarse con resultados de pruebas bioquímicas. 2.3. Métodos basados en pruebas bioquímicas Las pruebas bioquímicas evalúan las propiedades metabólicas de un microorganismo aislado, las cuales son únicas para cada especie. La combinación de pruebas bioquímicas puede utilizarse para determinar el patrón bioquímico del microorganismo aislado. Esto hace posible la identificación del mismo utilizando un esquema de identificación. Existen tres métodos de identificación: a) método convencional; b) sistemas multiprueba y c) métodos automatizados. Las pruebas bioquímicas han sido ampliamente utilizadas para diferenciar bacterias. Estas pruebas se fundamentan en demostrar si el microorganismo es capaz de fermentar azúcares, la presencia de enzimas, la degradación de compuestos, la producción de compuestos coloreados, etc. Aún bacterias fuertemente relacionadas pueden separarse en dos especies diferentes con base a pruebas bioquímicas. El método convencional diferencia entre: 1) pruebas que se utilizan en la identificación preliminar y con lectura inmediata como la catalasa y oxidasa 2) pruebas rápidas, con lecturas en menos de 6 hs (ej. Hidrólisis del hipurato, Bgalactosidasa (ONPG), aminopeptidasas, la ureasa y el indol. 3) pruebas lentas, con lecturas de 18 a 48 hs. Que incluirían la oxido-fermentación, reducción de nitratos, rojo de metilo, Voges-Proskauer, Agar hierro de Kligler, fermentación

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de azúcares, hidrólisis de la esculina, coagulasa, fenilanina-desaminasa, DNas, hidrólisis de la gelatina, decarboxilasas, lipasa, lecitinasa, utilización de citratos, utilización de malonato, y prueba de CAMP 4) pruebas basadas en caracteres de resistencia a ciertas sustancias como optoquina, bacitracina etc. Los sistemas multiprueba, permiten una mayor rapidez en la identificación de algunas bacterias. Estos sistemas pueden ser manuales o automatizados. Se trata de celdillas aisladas con sustrato liofilizado que se inoculan individualmente y que permiten realizar simultáneamente entre 10 y 50 pruebas bioquímicas. Los resultados de las pruebas se expresan de forma numérica. Cada especie está definida por un código numérico, resultado de la codificación de las reacciones a las pruebas que se hubieran utilizado. Estos son algunos de los sistemas disponibles en el mercado API (bioMérieux), Enterotube (BBL), Oxi/Ferm Tube (BD), RapID systems y MicroID (Remel), Biochemical ID systems MicroID (Remel), Biochemical ID systems para realizar una identificación más preci-(Microgen), etc. Los sistemas automatizados son galerías multiprebas, como las usadas en el sistema anterior, pero cuya inoculación, incubación y lectura se efectúan de modo automatizado. Existen distintos paneles para distintos grupos de microorganismos. La inoculación y lectura de estos paneles se suele hacer de forma automática, incorporándose los datos obtenidos en una pC, el cual proporciona con un alto índice de fiabilidad la identificación del microorganismo. Algunos de los paneles comerciales disponibles en el mercado son MicroScan, Vitek, ATB, Pasco, Wider, Phoenix, etc. 2.3. Métodos moleculares La identificación bacteriana mediante métodos moleculares es útil ante la dificultad en el aislamiento de los microorganismos a estudiar, el crecimiento lento, la baja actividad en las pruebas bioquímicas, ausencia o baja efectividad de técnicas serológicas, etc. Estas situaciones y la necesidad de obtener resultados reproducibles e intercambiables entre laboratorios confieren a las técnicas moleculares, y en especial al ARNr 16S, un gran protagonismo. Actualmente, las herramientas de la biología molecular permiten conocer las secuencias de ADN que son únicas para cada microorganismo. Una vez conocida las secuencias y, por comparación, con la base de datos, se logra identificar al microorganismo. Las técnicas de identificación molecular en bacterias mediante el análisis del ARNr 16S u otros genes se basa en la amplificación genómica y en la secuenciación de esos genes o sus fragmentos. El medio de cultivo o las condiciones de incubación no son factores determinantes, pero si son factores críticos la técnica de extracción del ADN genómico y la amplificación. A continuación se describen las etapas metodológicas a considerar en la identificación molecular. Extracción del ADN genómico. El ADN genómico se extrae a partir de las células totales mediante diferentes métodos estándar o sistemas comerciales con versatilidad sobre el tipo de muestra. Dependiendo del tipo de bacteria se pueden aplicar modificaciones que simplifiquen u optimicen la extracción cromosómica. Amplificación. En un termociclador, este ADN se utiliza como molde para la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de una secuencia del ARNr 16S con un rango de tamaño entre 500-1.500 pb (o de otro tamaño si se analizan otros genes). Con cebadores universales o de amplio espectro complementarios a las regiones conservadas, se amplifica teóricamente el gen del ARNr 16S en todas las bacterias. Ninguno de los cebadores utilizados en la actualidad se considera totalmente universal, por lo que no se puede realizar una recomendación específica de cebadores que garantice la amplificación de todos los procariotas. Las etapas de la amplificación por PCR son: 1) Se desnaturaliza la doble hélice, 2) los cebadores se unen a cada uno de los extremos de la cadena molde, 3) síntesis de la nueva

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cadena mediada por la ADN polimerasa; este ciclo se repite aproximadamente treinta veces de manera que las copias de ADN aumentan exponencialmente en cada ciclo. .La región que codifica para el ARN 16S (procariotas) y su homólogo 18S en eucariotas son las regiones de interés taxonómico porque: -Se trata de una molécula muy antigua, presente en todas las bacterias actuales. Constituye, por tanto, una diana universal para su identificación -Su estructura y función han permanecido constante durante un tiempo muy prolongado -Tiene regiones conservadas y otras hipervariables para diferenciar los organismos más próximos -Es relativamente fácil de secuenciar y existen amplias bases de datos en constante crecimiento Para confirmar una amplificación óptima, es imprescindible la electroforesis del producto de PCR en gel de agarosa. Debe observarse una sola banda (perteneciente a un único amplicón) con el tamaño adecuado. Los amplicones suelen purificarse con sistemas comerciales, ya sea el producto de PCR o la banda de electroforesis incluida en el gel. Aunque estos sistemas eliminan el exceso de cebadores y nucleótidos, debe someterse a una nueva electroforesis de confirmación. Secuenciación del amplicón. La secuenciación es un proceso análogo a la PCR, que utiliza el ADN como molde pero que los cebadores directo y reverso actúan en reacciones independientes. A diferencia de la PCR, no se genera un nuevo molde, sino que se reutiliza en los ciclos programados (25-35). Se añaden bases marcadas con fluorocromos o terminadores y bases no marcadas, que se irán incorporando aleatoriamente a la síntesis. Los terminadores finalizan la síntesis de la secuencia, por lo que al final se obtiene una mezcla de productos de ADN de diferentes tamaños. Cada base (adenina, timina, guanina y citosina) se marca con un fluorocromo diferente que absorbe a diferente longitud de onda detectándose posteriormente. Los terminadores no incorporados se eliminan mediante la purificación del producto y el tamaño de cada uno se determina mediante electroforesis capilar. Según se va conociendo el tamaño y el terminador de cada fragmento (separados en gel o por elución) se determina la secuencia de bases representadas cada una por un color diferente y se editan de forma manual o automática. Las cadenas de ADN se secuencian independientemente, generándose la secuencia directa y la reversa (complementaria). Según el modelo de secuenciador, el tipo de capilar utilizado, y las variables en la secuenciación, es posible simplificar el proceso, reducir el tiempo de ensayo y el coste y aumentar el tamaño de la secuencia a analizar (500- 900 bases). Análisis de secuencias La observación del electroferograma (secuencias de bases ofrecidas por los secuenciadores) constituye el primer paso del análisis de las secuencias La secuencia se introduce en bases de datos online de acceso público o privado, con el objetivo de identificar la cepa problema mediante la comparación con otras secuencias depositadas en estas bases. Actualmente, la base de datos que presenta mayor número de consultas por su mayor versatilidad en organismos, orígenes, genes, y tipo y número de secuencias depositadas es la base pública GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov) con programas como BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) para el alineamiento de secuencias. Además, GenBank contiene una sección de taxonomía (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy que incluye información y secuencias sobre más de 160.000 organismos. Otras bases de datos ampliamente utilizadas en el análisis de secuencias del ARNr 16S son: - BIBI Bioinformatic Bacterial Identification (http://pbil.univ-lyon1.fr/bibi/), programa que automatiza y simplifica las identificaciones bacterianas utilizando diferentes genes y diferentes niveles de exigencia en la identificación - Ribosomal Database Project European Molecular Biology Laboratory (http://www.ebi.ac.uk/embl/) - Smart Gene IDNS (http://www.smartgene.ch) - Ribosomal

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Differentiation of Medical Microorganisms (RIDOM) (http://www.ridom.com/) Ribosomal Data-base Project (RDP-II) (http://rdp.cme.msu.edu/html/). - Además existen bases de datos de acceso privado. Otras utilidades que ofrecen estas bases de datos son la construcción de árboles filogenéticos, el diseño de cebadores, el análisis de polimorfismos o SNPs (single nucleotide polymorphisms), etc. Gran parte de ellos están disponibles en la página http://evolution.genetics.washington.edu/phylip/softw are.html 2.4. Métodos basados en fagos La interacción entre un virus bacteriano (fago) y su célula bacteriana sensible es sumamente específica, ya que el proceso de interacción se encuentra mediado por receptores específicos tanto en el virus como en la célula bacteriana. A una placa con medio de cultivo sólido inoculado con un cultivo puro de una determinada bacteria, se le añade una alícuota de un fago específico; éste puede ocasionar la lisis de las bacterias, hecho que se evidencia en el cultivo como zonas claras definidas, denominadas placas, que indican que hubo infección y lisis celular. El uso de fagos específicos permite identificar y subclasificar bacterias dentro de una misma especie. 2.5. Métodos basados en ensayos serológicos Los métodos serológicos, implican la utilización de preparaciones de inmunoglobulinas específicas provenientes del suero o de un reactivo, y que pueden ser de gran utilidad en la identificación microbiana en muestras puras o en muestras biológicas. Cada uno de los métodos tiene su fundamento particular, pero en líneas generales, todos se basan en la reacción de un antígeno presente en el agente microbiano con su anticuerpo correspondiente. La solución que contiene los anticuerpos se denomina antisuero. 3. Bibliografía consultada Brock T. D., Madigan, M. T.1991. Microbiología. Editorial Prentice Hall Hispanoamericana S.A. Sexta edición Fernández Olmos A., C. García de la Fuente, J. A. Saéz Nieto, S. Valdezate Ramos.2010. Procedimientos en Microbiología Clínica. Recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. Editores: Cercenado E., R. Cantón. ISBN-978-84-614-7932-0 http://edicion-micro.usal.es/web/educativo/micro2/tema02.html http://www.biologia.edu.ar/bacterias/micro1.htm#forma Santana Contreras L. E., M.Z. Poncio Acosta 2011. Manual de prácticas de microbiología ambiental. Revisado por: Academia de Biología 2011 Ciudad Juárez, Chihuahua Universidad Autónoma de Ciudad Juárez p. 45. Verna L. C. 1945. Técnicas Generales y experimentación Bacteriológica. Editorial El Ateneo.

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Carrera de Ingeniería Agronómica Cátedra de Microbiología Agrícola Año 2014 Guía de Trabajo Práctico Nº 3: Identificación de microorganismos Objetivos Que el estudiante:  Aprenda técnicas para la determinación de características microbiológicas de microorganismos Actividades 1. Reconocimiento de características microbiológicas (macroscópicas y microscópicas) de cultivos puros. a- Caracteres culturales:  en medio sólido: elevación, margen, color, consistencia de las colonias  en medio líquido: desarrollo superficial, enturbiamiento, sedimento b- Caracteres morfológicos y tintoriales de las bacterias  morfología mediante coloraciones vitales, coloraciones simples y coloración de Gram  movilidad mediante observación al estado fresco Procedimientos para la realización de las observaciones con microscopio Toda acción debe realizarse en condiciones de asepsia Observación al estado fresco: 1) sobre portaobjeto limpio colocar una gota de solución fisiológica. 2) extraer con ansa una pequeña porción del cultivo y depositar sobre la gota mediante movimientos circulares. 3) colocar un cubreobjeto y observar al microscopio Coloración vital: 1) sobre portaobjeto limpio colocar una gota de azul de metileno al 5‰ o rojo neutro al 5‰. 2) extraer con ansa una pequeña porción del cultivo y depositar sobre la gota mediante movimientos circulares. 3) colocar un cubreobjeto y observar al microscopio Preparación del frotis: 1) Preparación del extendido: se procede a extender la muestra a observar sobre un portaobjeto con la ayuda de un ansa. 2) Fijación del extendido: fijar por calor (pasando el portaobjeto por la llama del mechero 2-3 veces, con el extendido hacia arriba). Coloración simple: 1) Aplicar el colorante sobre el frotis y dejar actuar un minuto 2) Lavar con agua corriente y dejar secar al aire 3) Observar con microscopio Coloración Gram: 1) Aplicar, sobre el frotis, el primer colorante (cristal violeta o violeta de genciana) durante un minuto. 2) Lavar con agua corriente

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3) Aplicar el mordiente (lugol) durante un minuto. 4) Lavar con alcohol puro hasta que éste no arrastre más colorante. 5) Aplicar el colorante de contraste (safranina o fucsina), durante un minuto 6) Lavar con agua y secar al aire 7) Observar con microscopio 2. Con el objetivo de desarrollar un biofertilizante para la agricultura de la región chaqueña, Ud. considera que tiene cultivos puros de Azospirillum, Rizhobium y Pseudomonas. ¿de que manera comprueba que son cultivos puros? 3. Con la información de la Tabla 1 determinar el género al que pertenece una cepa bacteriana aislada, la cual presenta las siguientes características: bastones, Gram +, catalasa negativa, fermentación de glucosa con formación de ácido y gas, no presentan esporas, sin movilidad, crecimiento en aerobiosis y anaerobiosis. Tabla 1. Pruebas primarias para identificación de bacterias heterótrofas (modificada de Cowan´s & Steel) tinción gram (cultivo fresco) forma agrupación Crecimiento aerobio Crecimiento anaerobio esporas movilidad

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coco racimos

coco racimos

coco cadenas

coco tetradas

bastón

bastón

bastón

bastón

bastón

bastón

bastón

bastón

coco pares

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catalasa oxidasa fermentación de glucosa a ácido ó a acido+gas O/F Micrococcus Staphylococcus Streptococcus Lactococcus Enterococcus Leuconostoc Pediococcus Aerococcus Lactobacillus Clostridium Bacillus Alcaligenes Pseudomonas Enterobacterias Aeromonas Chromobacterium Neisseria

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