Cátedra Biología Molecular Facultad de Ciencias Naturales e IML -2014-
Programa de Trabajos Prácticos Prácticos Trabajo Práctico N° N° 1. Reacción en Cadena de la Polimerasa. Definición e importancia. Usos y aplicaciones. Optimización. Tipos de PCR. Electroforesis. Fundamentos. Trabajo Práctico N° N° 2. Vectores de clonado: Plásmidos. Características: Estructura, clasificación (criterios), funciones codificadas (fenotipos), número de copias. Grupos de incompatibilidad. Electroforesis de plásmidos. Trabajo Práctico N° N° 3. Bioinformática. Concepto e Importancia. Bases de datos en Internet: NCBI, EMBL. Software (DNAman, MEGA 4, Treeview) y Programas on line para análisis de secuencias: Workbench Biology, Eztaxon Server, Ribosome DataBase Project, NCBI. Algoritmos de comparación: BLAST. Construcción de Árboles Filogenéticos. Trabajo Práctico N° 4. Taxonomía molecular. Marcadores moleculares y técnicas más comúnmente usadas. Identificación de microorganismos mediante ARDRA. Digestión in silico con enzimas de restricción. Tipos de enzimas. Mapas de Restricción. Trabajo Práctico N° 5. Secuenciación y Genómica. Análisis de genomas con plataforma RAST. Cantidad y tipo de genes. División en subsistemas. Anotación de genes con programa ARTEMIS.
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N°°1 Trabajo Práctico N REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Dra. Marta A. Polti-Dr. Sergio A. Cuozzo 1- Objetivos • Que el alumno comprenda el fundamento teórico que permitió el desarrollo de la técnica de PCR. • Que el alumno comprenda la importancia de la técnica en el desarrollo de la tecnología del ADN recombinante. • Que el alumno conozca las aplicaciones y usos de la técnica. • Que el alumno sea capaz de diseñar y efectuar reacciones de PCR en el laboratorio. • Que el alumno pueda interpretar los resultados obtenidos en relación al objetivo del experimento planteado. 2- Introducción
Definición e importancia. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fue desarrollada por el grupo de Kary Mullis de Cetus-Perkin- Elmer en 1985. El primer experimento de Mullis y colaboradores, publicado en Science en 1985 fue planeado para desarrollar un método de diagnóstico que no insumiera más de 24 hs para la detección de la hemoglobinopatia de eritrocitos falciformes ("sickle cellanemia"). En esta anemia la cadena β de la globina está mutada a nivel de la segunda base del séptimo codón de lo que resulta un cambio de glutámico (cadena PA normal) por valina (cadena βs patológica). A nivel del gen esto hace desaparecer un sitio Dde pero no afecta a otro sitio Hinf contiguo. En el experimento amplificaron un fragmento de 110 pb portador o no de la mutación. Luego de la amplificación el producto desnaturalizado monocatenario se hibridizó con un oligonucleótido homólogo de 40 bp en cuyo extremo 5' están dos hemisitios de Hinf y Dde. El fragmento fue marcado con 32P en dicho extremo. El híbrido es entonces tratado primero con Dde a 56"C que de cortar, genera un producto de 8 nucleótidos. El segundo tratamiento es con Hinf que no actúa sobre e! producto de Dde pero si corta generando un fragmento de 3 nucleótidos si el sitio Dde no existe. En los últimos años, la PCR se ha convertido en una revolucionaria tecnología que facilita los estudios moleculares en el laboratorio y que abre nuevas perspectivas a la investigación y al diagnóstico médico. Esta nueva tecnología se basa en la ampliación de secuencias específicas del ADN y se conoce como reacción en cadena de la polimerasa o PCR (polymerase chain reaction). La revolución que la PCR ha originado en el campo de la investigación genética y molecular es comparable a la producida por el descubrimiento de las enzimas de restricción o de los polimorfismos del ADN. -2-
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Ventajas y usos. - Se dispone, en forma rápida y eficaz, de cantidades suficientes de una determinada secuencia de DNA para su posterior estudio molecular. - Diagnóstico de patologías genéticas o adquiridas, - Investigación sobre los defectos moleculares todavía no definidos. - Aplicación a la medicina forense y legal. - Detección de patógenos responsables de enfermedades infecciosas.
Fundamentos La PCR permite, mediante la utilización de una ADN polimerasa, la amplificación de regiones específicas de ADN de simple cadena, la que actúa como molde para la síntesis de una nueva cadena complementaria. Estos moldes de ADN se obtienen cuando se calienta el mismo a una temperatura cercana a un punto de ebullición (desnaturalización), produciéndose la separación de las cadenas de ADN. Para la iniciación de la síntesis de la cadena complementaria al molde se requiere además de la presencia de cebadores o primers, que son secuencias cortas de nucleótidos sintéticos (oligonucléotidos) o primers, hibridan de forma específica con las dos hebras complementarias de ADN. Los cebadores se diseñan de tal manera que hibriden en los extremos opuestos de cada hebra de la región de interés, así las nuevas cadenas de ADN sintetizadas que comienzan en cada primer se extiende hacia la posición del primer que se encuentra en la hebra opuesta. De esta forma se generan en cada cadena de ADN nuevamente sintetizada nuevos sitios de unión a los primers. La mezcla de racción se calienta nuevamente para separar la cadena original de la nueva, las cuales quedan disponibles para nuevos ciclos de hibridación del primer, síntesis de ADN, separación de las cadenas, y así sucesivamente. Es decir que básicamente, la amplificación de la secuencia de interés se consigue al realizar una serie de ciclos repetitivos que consisten en: Desnaturalización del ADN molde. Hibridación de los primers con el molde. Síntesis del ADN complementario mediante la acción de la enzima denominada ADN polimerasa, termoestable. El resultado de una reacción de PCR es que al final de n ciclos, la reacción contiene un máximo teórico de 2n moléculas de DNA de doble cadena que son copias de la secuencia de DNA comprendida entre los primers específicos. Si se realizan 20-30 ciclos del proceso de PCR señalado anteriormente, se pueden obtener varios millones de copias de la secuencia de interés, flanqueada por los primers utilizados en la amplificación.
Tema 4. Componentes de la reacción de PCR. La reacción típica de PCR consta de: Muestra de ADN que contiene la secuencia a amplificar. Enzima ADN polimerasa. Secuencias cebadoras o primers.
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Desoxinucleótidos trifosfatos (dNTPs) Mg Cl2 Buffer de reacción. Enhancers. Aceite mineral.
Muestra de ADN o templado. La muestra de ADN puede consistir en 100 ng de ADN genómico (aproximadamente 100.000 copias del ADN molde a amplificar); o ADN obtenido de una única célula, es decir solo una a dos copias del ADN (aproximadamente 5 pg de ADN). ADN polimerasa. Existen varios tipos de enzimas ADN polimerasa. En un principio se utilizó ADN polimerasa procedente de E. coli. Sin embargo, la actividad de esta enzima desciende considerablemente por encima de los 37º C, y la exposición a las altas temperaturas de desnaturalización, necesarias para separar las dos cadenas de ADN inactiva la enzima tras cada ciclo de amplificación. Por tal razón, en la reacción de PCR se utilizan ADN polimerasas termoestables; éstas se han aislado a partir de microorganismos que viven a temperaturas elevadas. La ADN polimerasa del microorganismo Thermus aquaticus ( Taq ADN polimerasa) permite la síntesis del ADN por encima de los 70º C, resistiendo temperaturas de hasta 94º C. Otras enzimas termoestables son las Tfl ADN polimerasa obtenida del Thermus flavus, la Pfu ADN polimerasa de Pyrococcus furiosus, VENT (nombre comercial de enzima de Thermococcus litoralis), DeepVENT (nombre comercial de enzima de Pyrococcus sp. GB-D), estas tres últimas presentan mayor termoestabilidad que la Taq polimerasa, presentando además una actividad exonucleasa 3′ a 5′ que le permite corregir los nucleótidos incorporados en forma errónea; es decir que los fragmentos de PCR generados con esta enzima tendrán menos errores de incorporación que los generados con la Taq polimerasa. La Tth polimerasa de Thermus termophilus, posee además actividad de RT en presencia de Mn2+. Cebadores. Cebadores Los primers o cebadores son secuencias cortas de ADN de 20 a 30 bases que se obtienen por síntesis; la secuencia de los mismos se diseña de acuerdo al fragmento de ADN que se desea amplificar. Se debe tener una concentración de 0.2-1.0 µM c/u, en muchísimo exceso molar respecto del templado (relación primer/target: inicial: 108 y final: 10 aproximadamente. En el diseño de los primers es necesario tener en cuenta algunas consideraciones: Deben ser específicos, especialmente en el extremo 3´. Las bases que lo componen deben tener una distribución homogénea a lo largo de la secuencia, evitando regiones ricas en polipurinas, polipirimidinas u otras secuencias poco comunes. Se debe tratar en lo posible que el contenido de CG sea similar al del fragmento a amplificar. Diseñar "primers" con el Tm más alto posible, 55° a 80° C y similares entre los primers. Los primers no deben estar distanciados por mas de 3 kbp. Se debería evitar la presencia de secuencias que permitan la formación de estructuras secundarias, particularmente en el extremo 3′ del primer .
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Es muy conveniente controlar que no existan regiones de complementariedad entre los primers (uno con otro) evitando que el par de cebadores posean extremos 3′ solapados, ya que podrían dar lugar a un artefacto de amplificación llamado dímero de primers. Estos dímeros aparecerán como producto de la reacción de PCR especialmente cuando se hacen muchos ciclos de amplificación sobre una muestra que tiene pocas copias iniciales del material a amplificar. Un dímero de este tipo es un fragmento de ADN cuya longitud es muy próxima a la suma de los dos primer y su formación ocurriría cuando un primer es “extendido” por la polimerasa sobre el otro primer. La concatenación resultante es un molde extremadamente eficiente que puede , si es que ocurre en un ciclo temprano, fácilmente volverse el producto predominante de la reacción. Existen programas de computación que facilitan el diseño de los primers.
dNTPs. Son necesarios para la formación del nuevo ADN amplificado. 0.2 mM c/u (0,8 mM en total), corresponden a aproximadamente a 1016 moléculas de dNTPs. Cuando se amplifican productos largos se aumenta también la concentración de dNTPs. También se puede reemplazar un dNTP por algún nucleótido modificado. Ej: ddNTP, bases modificadas, adición de biotina, fluorocromos, etc. Mg2+. Afecta la unión del primer, el Tm del templado, la especificidad del producto (que los primers se unan únicamente a la secuencia de interés), la actividad de la enzima y su fidelidad. Junto con la temperatura es uno de los parámetros a manipular. Usualmente se ensayan concentraciones, entre 0.5 y 5.0 mM. Buffer de reacción. reacción 50 mM KCl y 10 mM Tris-HCl (pH 8.3). Enhancers. En ciertas circunstancias el agregado de sustancias como DMSO (1-10%), PEG-6000 o glicerol (5-15%), detergente no iónicos, formamida {1-10%), BSA (10-100 µg/ml) pueden mejorar mucho la especificidad y e! rendimiento. Aceite mineral: para evitar la evaporación de la mezcla de reacción, 2 gotas
Diseño de una reacción de PCR. En una reacción de PCR se busca optimizar tres elementos fundamentales: Especificidad, Rendimiento y Fidelidad. La especificidad se refiere a la capacidad de obtener un producto de PCR único y deseado. La fidelidad busca por su parte que el producto de amplificación sea tan fiel a la secuencia original como sea posible, es decir, que se minimicen los errores en la adición de bases durante la replicación. Y el rendimiento implica la obtención de una gran cantidad de producto final después de toda la reacción. Debido a la amplia variedad de aplicaciones en las que se está utilizando la PCR, no existen condiciones estándares que garanticen el éxito en todas la situaciones. Sin -5-
Cátedra Biología Molecular Facultad de Ciencias Naturales e IML -2014embargo, algunos parámetros pueden ser tenidos en cuenta como referencia para el diseño de una reacción de PCR. Una reacción de PCR se realiza habitualmente en un volumen de 25 a 50µl, en un aparato automático programado (ciclador térmico) para conseguir las temperaturas y los ciclos deseados. Un ciclo típico consiste en realizar la desnaturalización a 94º C durante 20 seg., la hibridación de los primers con el ADN molde a 55º C durante 20 seg., y la síntesis a 72º C durante 30 seg. Los aparatos existentes en el mercado permiten llegar a las temperaturas deseadas a una velocidad de entre 0,3 y 1º C por segundo, por lo que un ciclo dura menos de 5 min., y el total del proceso de amplificación puede ser de menos de 3 horas de duración. En la mezcla de reacción, la concentración del ión Mg2+ puede tener un profundo efecto sobre la especificidad y el rendimiento en una amplificación. Generalmente una concentración de 1,5 mM de MgCl2 es óptima cuando se trabaja con concentraciones de 200 µM de cada desoxinucleótido trifosfato (dNTP) pero en algunas circunstancias pueden ser requeridas diferentes cantidades de Mg2+. En general, el exceso de Mg2+ producirá una acumulación de productos de amplificación no específicos, y una cantidad insuficiente del mismo reducirá el rendimiento en la amplificación del fragmento deseado. Los desoxinucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dTTP y dGTP) se utilizan normalmente en concentraciones equimolares y comprendidas entre 50 a 200 mM cada uno de ellos. Concentraciones más elevadas pueden dar lugar a incorporaciones erróneas por la ADN polimerasa (es decir, disminuye la fidelidad de la copia); a las concentraciones mencionadas hay suficiente cantidad de precursor para sintetizar aproximadamente 6,5 y 25 mg de ADN respectivamente. A concentraciones menores disminuye el rendimiento de la reacción, es decir, la cantidad de producto amplificado que obtengo. La Taq polimerasa se utiliza en una concentración de 2,5 unidades por 100 µl; al incrimentar la cantidad de enzima pueden aumentar la producción de productos no específicos de PCR, reduciendo así el rendimiento del fragmento de ADN deseado. La cantidad de cebador utilizada en una amplificación dependerá de varios factores, pero en general las concentraciones de los mismos están comprendidas entre 0,05 a 0,5 µl; de cada uno de los oligonucleótidos. El tiempo de incubación a 72º C (extensión) varía de acuerdo a la longitud de la secuencia a ser amplificada. La temperatura de hibridación o annealing depende de la longitud de los cebadores y de su contenido de CG. Si los primers tienen una complementariedad perfecta con el templado se usa 55° C para (C+G) < 50% o 60° C para (C+G) > 50%. Si no la tienen por ignorarse detalles de las secuencia del primer, hay que hacer pruebas variando la temperatura entre 35° y 65° C, hasta la obtención de un único producto con la longitud deseada. Este último caso es el de la mezcla de oligonucleótidos “degenerados” donde la referencia que se tiene del templado es sobre la secuencia de aminoácidos de la proteína y no de la secuencia de bases del gen o mRNA. En otros casos se introducen a propósito en los primers zonas sin homología; por ejemplo cuando se trata de introducir una mutación o bien un sitio de restricción. Cuando esto ocurre, la zona no homóloga debe estar en el lado 5´ del primer; caso contrario puede no haber extensión. Como vemos, son varios los parámetros a tener en cuenta en una reacción de PCR y muchas veces puede ocurrir que una región particular del ADN presente dificultad en ser -6-
Cátedra Biología Molecular Facultad de Ciencias Naturales e IML -2014amplificada por esta técnica. Este es el caso de aquellas regiones de ADN ricas en CG o aquellas que forman estructuras secundarias; en estos casos se puede incluir en la mezcla de reacción un aditivo que incremente el rendimiento y la especificidad. Los aditivos más usados son dimetilsulfóxido (DMSO), la N,N,N-trimetilglicina (betaína) y la formamida, también se utilizan el glicerol, detergentes no iónicos, polietilenglicol, albúmina sérica bovina.
Condiciones que favorecen una mayor especificidad
Tipos de PCR. 1. Reacción de PCR a partir de ARN (RT(RT-PCR). Esta técnica es una variante de la PCR que permite determinar la presencia de un transcripto, estimar los niveles de expresión del mismo y clonar productos de ADNc. El material de partida es ARN, pero como la PCR utiliza una ADN polimerasa, es necesario hacer previamente una copia del ARN a ADNc; esto se consigue haciendo en una primera etapa una transcripción reversa del ARN total o el ARNm a ADNc con una transcriptasa reversa; el ADNc obtenido es el sustrato en la reacción de PCR usando cebadores específicos. 2. PCR anidada o Nested PCR. Es un método para incrementar la sensibilidad y la especificidad de la amplificación. Luego de 20 ciclos de amplificación, se toma un 10% de la mezcla que se somete a una nueva amplificación por 20 ciclos pero ahora en presencia de otro par de primers que se ubican por dentro de la secuencia a amplificar respecto de los primers iniciales. 3. PCR anclada o Anchored PCR. Se la utiliza cuando solamente se tiene información para el diseño de un solo primer.
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Cátedra Biología Molecular Facultad de Ciencias Naturales e IML -20144. PCR con “random primers”. Está basado en la utilización de “primers” con secuencias seleccionadas al azar. Se usa para la detección de polimorfismos genéticos en ausencia de información sobre secuencias de bases. El esquema de fragmentos amplificados con esta técnica es trnsmitido mendelianamente de padres a hijos y sirve para caracterizar especies de indviduos y eventualmente para construir mapas genéticos. El método se denomina “Random Amplified Polymorphic DNA” y se realiza con primers de 10 nucleótidos y la renaturalización se debe efectuar a 36°C. 5. RNA display. El método fue descripto por el grupo de Pardee (1991). Se basa en la utilización de primers con secuencias seleccionadas al azar para detectar mRNAs específicos de un estadío celular mediante RT- PCR. La renaturalización se debe efectuar a 40°C. Un ejemplo de los primers que se utilizan es:
6. Real Time PCR. Es una metodologia que permite medir en tiempo real la formacion de un producto de PCR. Utiliza un fluorometro adosado a un equipo convencional de PCR y tubos de calidad optica. Se basa en el uso de un oligonucleotido que contiene un fluorocromo y un quencher. La proximidad de estos dos elementos bloquea la fluorscencia. Cuando estos dos elementos se separan en el transcurso de la amplificacion, aumenta la emision de fluorescencia. Las desventajas que presenta incluyen la necesidad de una optimizacion perfecta, no se puede asegurar la especificidad de la reaccion, complica el uso de controles internos, y elevado costo.
Cuando el fluorocromo se aleje o separe del quencher, se observara fluorescencia.
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Cátedra Biología Molecular Facultad de Ciencias Naturales e IML -2014Comparacion con electroforesis
Comparacion entre distintas concentraciones 7. RACE: rapid amplification of cDNA ends; Amplificación rápida de extremos de cDNA. La RACE –PCR es un método muy utilizado para obtener las secuencias completas de cDNA (Frohman et al., 1988). RACE-PCR es una modificación anclada de la RT-PCR. Está basada en la amplificación de la secuencia comprendida entre una sola región previamente caracterizada en el mRNA (cDNA) y una secuencia de anclaje apareada en el extremo 5’ o 3’. Se diseña un cebador a partir de una secuencia interna conocida y el segundo cebador tiene la secuencia de anclaje. Un paso previo a la RACE-PCR implica la introducción de una secuencia específica en o el extremo 3’ o 5’, por lo que efectivamente es una forma de mutagenesis A- 3’ RACE-PCR utiliza un primer antisense que empieza con una secuencia específica 5’, generalmente de más de 15 nucleótidos, que se incorpora en el transcripto de cDNA en el paso donde interviene la transcriptasa reversa. Un primer sense interno se utiliza para generar un segunda cadena corta que termina en una secuencia complementaria a la secuencia original de anclaje. Después, la PCR se inicia utilizando el primer sense interno y el primer de anclaje. B- 5’ RACE-PCR. Aquí un primer antisense interno se utiliza para preparar la síntesis del templado de una cadena parcial de cDNA. Una cola de poly(dA) se añade al extremo 3’del cDNA usando una transferasa terminal. La síntesis de la segunda cadena se prepara utilizando un primer sense con una secuencia de extensión específica (el ancla). Esta cadena se utiliza como templado para un paso adicional de la síntesis que utiliza el primer interno para producir una copia complementaria de la sucesión de anclaje. La PCR, entonces, se puede realizar utilizando los primers interno y de anclaje
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8. PCR PCR mutagénica La PCR también puede ser utilizada para introducir mutaciones en sitios específicos. Mutagénesis 5’: (A) Los primers son modificados en el extremo 5’, por lo que se pueden introducir, por ejemplo, secuencias marcadas, secuencias que contengan un sitio de restricción o un promotor que dirija la expresión. Mutagénesis específica de sitio: (B) En este caso, la mutación ocurre en una zona localizada en el centro del amplicón. Se llevan a cabo dos reacciones de PCR, A y B, que amplifican segmentos superpuestos que contienen la mutación introducida a propósito, al modificar los primers internos de la secuencia original. Luego los dos productos son combinados mediante otra PCR. Mutagénesis por unión incorrecta: En este caso el primer es solo parcialmente complementario a la secuencia original.
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Aplicaciones de la PCR. La PCR ha simplificado y magnificado las posibilidades diagnósticas del ADN en medicina. La nueva tecnología permite el diagnóstico preciso de la patología hereditaria, que incluye tanto los procesos en los que el defecto molecular es conocido en detalle, como aquellos para los que sólo ha sido posible la localización cromosómica del defecto en cuestión. En enfermedades genéticas adquiridas, como el cáncer y los procesos autoinmunes, la PCR permite detectar con precisión los defectos moleculares que han sido definidos, y facilita la exploración de su patología básica. El estudio de la hipervariabilidad en el genoma supone la posibilidad de su empleo en los estudios de susceptibilidad a ciertas enfermedades y la aplicación a la medicina forense y legal. En este campo, el poder discriminativo de la nueva tecnología es altamente superior al obtenido con la metodología clásica. La detección de patógenos infecciosos y la identificación de variabilidad genética asociada a enfermedad se ha visto también revolucionada con la utilización de la tecnología del ADN recombinante. La PCR en el campo de las enfermedades monogénicas tiene dos aplicaciones principales: El análisis indirecto de los procesos hereditarios mediante el estudio de polimorfismos asociados a los genes responsables de los distintos procesos. La detección directa de mutaciones, mediante hibridación, digestión con enzimas de restricción, secuenciación directa del ADN o simple visualización de fragmentos. Además de la posibilidad de análisis de procesos genéticos, cáncer y susceptibilidad a enfermedades, la nueva tecnología permite el análisis rápido de patógenos infecciosos. El
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Cátedra Biología Molecular Facultad de Ciencias Naturales e IML -2014análisis de la presencia de estos patógenos y de mutaciones en oncogenes en material médico de archivo, como bloques de tejidos de parafina, fijados en formol, permite importantes trabajos retrospectiv os. Detección de la presencia de HIV en plasma La técnica del PCR permite no solo determinar la presencia del virus en sangre sino también la carga viral. Puesto que la PCR solo puede amplificar ADN, el ARN del HIV-1 debe ser transcripto a ADNc mediante una transcriptasa reversa (RT-PCR). El ARN del HIV-1 se extrae del plasma usando agentes caotrópicos como el tiocianato de guanidina, que inactiva a las RNAsas , luego se precipita con isopropanol y se solubiliza el pellet en agua y se coloca en un tubo de micro centrífuga junto a los otros componentes de la reacción, para amplificar una secuencia de 142-bases del gen gag. Los primeros utilizados poseen 25 a 30 bases de longitud, hibridan por fuera de las regiones de la secuencia del gen gag a amplificar. En la mezcla de reacción se coloca además cantidades conocidas de un estándar interno que es una molécula de ARN sintético idéntico al ARN viral a amplificar con la diferencia que posee una delección (ARN competidor); la presencia de este estándar permite la cuantificación del virus en la muestra problema. Luego que los ciclos de PCR han terminado, los productos de amplificación se separan por electroforesis en un gel teñido con GelRed, GelGreen o SYBR Green. Se determina la intensidad de la banda de 142 pares de bases del ARN del HIV-1 y la intensidad de la banda del producto de amplificación del estándar interno (que tiene una talla menor). La relación de intensidades de ambos fragmento permite realizar un cálculo del número de copias del ARN del HIV-1 en la muestra original. Detección de genes de microorganismos en alimentos Las aplicaciones de la técnica de PCR en el control de alimentos son numerosas. Se pueden utilizar para identificar especies cárnicas y especies de pescado de interés alimenticio, detectar la presencia de agentes patógenos en los alimentos (Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157:H7) o detectar la presencia o ausencia de organismos genéticamente modificados (OGM) en los alimentos. Para ello se amplifican por PCR marcadores moleculares específicos y se detecta su presencia en un gel de agarosa. Aplicación de la la biología molecular en la identificación de individuos Desde 1990, se empezó a utilizar la técnica de PCR para la identificación molecular forense.. Este sistema posibilitó la obtención de información genética útil a partir de muestras provenientes de cadáveres antiguos, de tejidos descompuestos, de restos epiteliales de colillas de cigarrillos o bulbo piloso, etc. básicamente, se identifican secuencias de DNA hipervariables. Los patrones generados por este sistema presentan dos bandas (alelos) en un determinado individuo, cada una de ellas aportada por cada uno de sus progenitores: Condición de inclusión: inclusión el individuo comparte una banda con su padre y otra con su madre.
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Cátedra Biología Molecular Facultad de Ciencias Naturales e IML -2014Condición de exclusión: exclusión el individuo no comparte ninguna banda con su padre o su madre. Si nos encontramos ante una condición de exclusión, podemos afirmar que los supuestos progenitores y el individuo testeado no tienen ninguna relación. Si nos encontramos ante una condición de exclusión, no podemos confirmar con el análisis de un solo sistema que por ejemplo el padre alegado es el padre biológico; por eso debemos utilizar más de un sistema para alcanzar niveles de certeza compatibles con la paternidad. Existe cierto numero de regiones no codificantes de el gen de la mioglobina humana las cuales exhiben un alto grado de variabilidad entre individuos. Estas secuencias presentan un comportamiento de herencia “de padres a hijos” (herencia mendeliana) y se localizan en diferentes regiones del genoma. Estas secuencia se pueden utilizar como sondas o marcadores sobre DNA, llamando a esta técnica DNA fingerprinting (huellas digitales genéticas HDG) o sondas capaces de generar tales patrones se denominan sondas multilocus (MLP). Este tipo de secuencias fueron reemplazadas por otro tipo de secuencias variables pero localizadas en posición determinada del genoma de tal manera que el patrón producido por estas, al ser usadas como sondas, sólo presentaba dos bandas (en la condición heterocigota) o una banda (en la condición homocigota). Estas sondas fueron denominadas unilocus y reciben actualmente la mayor atención por su posibilidad de estandarización y de generación de bancos de datos poblacionales intercomparables. El análisis molecular de los fragmentos variables con sondas de locus múltiple múltiple (MLP) o con sondas de locus específico (SLP) permitieron demostrar que tal variación depende del número de veces que se encuentran presentes ciertos segmentos de ADN, los que constituyen unidades de repetición. Tal propiedad valió para que se las denominará Repeticiones en Tándem de Número Variable (VNTR).
Visualización de ADN ELECTROFORESIS FUNDAMENTOS El método electroforético aprovecha la propiedad de las partículas cargadas de migrar en un campo eléctrico, en donde la velocidad de migración depende de la carga de dichas partículas. Este método se puede usar tanto para proteínas como para ácidos nucleicos. Las proteínas poseen carga como resultado de la presencia de aminoácidos básicos (arginina y lisina) y ácidos (glutámico y aspártico) pero también poseen cargas adicionales debido a las modificaciones postraduccionales mediante glicosilación, sulfatación y fosforilación. En el caso del ADN, éste se carga negativamente cuando se encuentra en un buffer alcalino, debido a sus extremos fosfatos y de esta manera puede migrar al ánodo en un campo eléctrico. Otros factores influyen en la migración y la separación del ADN, además de la carga: tamaño del ADN, concentración de agarosa, concentración de ADN e intensidad del campo eléctrico. Los fragmentos del ADN lineal, por ejemplo, migran a través de la matriz del gel a una velocidad inversamente proporcional al log10 de sus pesos moleculares. Esta relación puede ser usada para estimar el tamaño de los fragmentos de ADN. - 13 -
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FORMA DE LLEVAR A CABO UNA ELECTROFORESIS Entre los soportes más comunes están: papel, acetato de celulosa, agarosa y poliacrilamida. Estos soportes afectan la movilidad de las moléculas cargadas de manera diferente, ya que pueden absorber moléculas al medio de soporte (tales como los grupos hidroxilos del papel de celulosa) o reducir el movimiento mediante un tamiz de poros moleculares como en el caso del PAGE. La migración de partículas cargadas en un gel, presenta un alto coeficiente de rozamiento. Este tipo de medio no sólo previene la convección y minimiza la difusión sino que participa activamente en la separación de las moléculas haciendo intervenir en forma importante el criterio de dimensión ya que ejercen un efecto de filtración molecular. Este efecto de tamiz es función de la dimensión de los poros del gel, lo que depende de la concentración del gel. Cualquier matriz que el operador elija es importante que sea eléctricamente neutra ya que la presencia de grupos cargados en dicho soporte produce un fenómeno de electroósmosis que disminuye el poder resolutivo de esta técnica. Los soportes más comunes para la electroforesis en gel son los de agarosa y poliacrilamida. Los primeros dan un tamaño de poros más grande y su utilización permite la separación de grandes moléculas mientras que con geles de poliacrilamida se logran poros de pequeño tamaño, haciendo posible la separación de pequeñas macromoléculas. ELECTROFORESIS EN GELES GELES DE AGAROSA Es un método estándar usado para analizar moléculas de ADN de más de 200 pares de base (pb). La electroforesis en gel de agarosa fue desarrollada primariamente en plataformas horizontales. Los geles horizontales se preparan colocando la agarosa fundida en un molde, cerca del extremo se coloca un peine para formar los pocillos. Una vez que la agarosa ha solidificado, el peine es removido. El método más común para la electroforesis del ADN es el método submarino en el cual el buffer cubre el gel. Se utilizan buffers neutros o alcalinos. Ej: TAE. Éste contiene EDTA que es un agente quelante de cationes divalentes, que son requeridos por las DNasas y así se previene la degradación de la muestra de gel. La agarosa actúa como tamiz molecular, por lo tanto la conformación del ADN afecta su migración y separación durante la electroforesis. El ADN posee tres conformaciones normales: superenrrollado, relajado (circular abierto) y lineal. Generalmente el ADN superenrrollado corre más rápido que el ADN lineal, y éste corre más rápido que el ADN relajado. Cuando el análisis del ADN es cuantitativo, es muy importante que las bandas puedan resolverse y verse claramente. La resolución depende de muchos factores: tamaño y forma del pocillo, tamaño de los fragmentos de ADN, concentración de agarosa y voltaje usado. La intensidad del campo también determina la velocidad de migración del ADN. Un gradiente de altos voltajes conduce a una pobre resolución debido a que los fragmentos tienden a atravesar el gel como una masa compacta. El uso de voltajes bajos puede producir la difusión del ADN de la banda, reduciendo así la resolución. PROTOCOLO CORRIDA ELECTROFORÉTICA EN GEL DE AGAROSA.
Visualizar el ADN extraído corriendo 5 µl de muestra en posillos dentro de en un gel de agarosa 0.8% en una cuba de electroforesis usando como buffer de electroforesis TAE 1X
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Cátedra Biología Molecular Facultad de Ciencias Naturales e IML -2014y como marcador de peso molecular, 1 Kb. Debe tenerse en cuenta siempre que el volumen de las muestras no debe sobrepasar el volumen de los pocillos del gel. Antes de sembrar la muestra se le agrega un volumen determinado de colorante (1 µl) de frente (azul de bromofenol) para visualizar la corrida. La electroforesis se lleva a cabo a 10 V cm-1 durante 1 h a temperatura ambiente; los geles luego se tiñen con GelRed, GelGreen o SYBR Green, los cuales se intercalan entre las bases del ADN y son fluorescentes cuando se iluminan con luz ultravioleta. Reactivos necesarios. 1. 1X TAE buffer ( 0,04 M Tris-acetato, 0,001 M EDTA, pH 8,0) 2. 0,8 % agarosa en 1X TAE buffer. 3. GelRed, GelGreen o SYBR Green. 4. Marcador de peso molecular: 1kb. 5. Buffer de corrida. Preparación del gel de agarosa. 12345-
Preparar la cuba de electroforesis con el peine correspondiente. Realizar el calculo necesario para preparar un gel de agarosa 0,8 %(25 ml). Pesar la agarosa. Diluir con TAE 1x hasta 25 ml y calentar hasta disolución. Dejar enfriar 10 minutos y verter solución de agarosa. Dejar solidificar y cubrir el gel con TAE 1x.
Esquema ilustrando el resultado de una corrida electroforética.
ELECTROFORESIS EN GELES GELES DE POLIACRILAMIDA POLIACRILAMIDA COMPOSICIÓN QUÍMICA. La matriz está compuesta de acrilamida copolimerizada con N, N· - metilenbis acrilamida. La polimerización ocurre cuando el persulfato de amonio se disuelve en agua,
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Cátedra Biología Molecular Facultad de Ciencias Naturales e IML -2014formándose radicales libres. Cuando estos radicales libres se ponen en contacto con la acrilamida, ésta se polimeriza en largas cadenas de poliacrilamida, que gelificarán debido a la presencia de la bisacrilamida que forma enlaces cruzados entre las cadenas. El TEMED, una amina cuaternaria N N N tetrametilen diamina actúa como catalizador, debido a su capacidad de existir en la forma de radical libre. Debido a que el oxigeno inhibe la polimerización, la mezcla se somete a vacío o se purga con gas inerte. El tamaño del poro de la acrilamida polimerizada depende de la cantidad de acrilamida usada por unidad de volumen en el medio de reacción, y el grado de entrecruzamiento. La relación acrilamida/bis acrilamida es también crítica para el tamaño de poro. Al aumentar la concentración de acrilamida disminuye el tamaño del poro. Para ajustar aún más el tamaño de poro puede variarse la concentración de bisacrilamida. Pudo establecerse que con un 5% de bisacrilamida con respecto a la cantidad total de acrilamida-bisacrilamida se logra el poro más fino. Por abajo o por arriba de ese porcentaje el tamaño del poro aumenta. Los geles pueden ser hechos en placas planas o en tubos cilíndricos. En ambos casos en el borde superior, el gel forma un menisco que posteriormente distorsiona el esquema de las bandas, para evitarlo se coloca una fina capa de agua antes de que polimerice. SISTEMAS DE ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA - Sistema continuo: La concentración del gel , el pH y la fuerza iónica quedan fijos . Se utiliza el mismo buffer en el gel y en las cubas. Utiliza un tipo de gel llamado gel de separación (o de resolución) y además un gel concentrador (o espaciador). - Sistema discontinuo: En este sistema los parámetros anteriores varían pero la resolución es superior. SISTEMAS DESNATURALIZANTES Y NO DESNATURALIZANTES Tanto en los sistemas continuos y discontinuos pueden seleccionarse a su vez un sistema que permita mantener las muestras en su estado nativo, o sea no desnaturalizante mediante el uso de tampones adecuados que no contengan detergentes, con pH y concentración predeterminada y reduciendo el calor al máximo. Por lo contrario cuando la resolución de las muestras proteicas es difícil de llevar a cabo, se incluye en el gel un agente desnaturalizante, siendo el más comúnmente utilizado el detergente dodecil sulfato de sodio (SDS) en concentraciones entre 1 y 2%. En este sistema disociador se logra la disociación de los agregados de macromoléculas en las subunidades polipeptídicas. Existen otros agentes disociantes como urea, ácido acético, ac. Acético más fenol, detergentes no iónicos, o cambios de pH. Con el SDS, la mezcla proteica se desnaturaliza calentando al 100º C durante 1 a 2 min en presencia de un exceso de SDS y beta mercaptoetanol (un agente reductor). La presencia de SDS en todo el sistema incluyendo la muestra negativiza las proteínas, las que migrarán hacia el ánodo de acuerdo solamente a su peso molecular. PROTOCOLO DE UNA CORRIDA ELECTROFORÉTICA DE GELES DE POLIACRILAMIDA
Reactivos y soluciones 1. 10X TBE buffer ( 0,04 M Tris-borato, 0,001 M EDTA, pH 8,0) 2. 40% acrilamida: bis {19:1) y TEMED o:Acryl-a-Mix Solution (6%) 3. 0,5 % ácido acético en 95% de etanol. 4. Azul de bromofenol: 1mg/ml en H20 bidestilada.
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Cátedra Biología Molecular Facultad de Ciencias Naturales e IML -20145. Solución de persulfato de amonio: persulfato de amonio 10% en H20 bidestilada. 6. TEMED Procedimiento Procedimiento - Se preparan los soportes planos. - Se preparan las soluciones del gel separador. Se cargan los soportes con la solución de acrilamida-bisacrilamida. - Se agrega agua en el borde superior, se deja gelificar. - Se preparan las soluciones del gel concentrador. Se agrega sobre el primer gel, previo secado del agua. Se deja gelificar. - Se preparan las muestras para la corrida, diluyendo en cantidad suficiente del buffer de preparación de muestras, se calienta a baño maría a 100º C durante un minuto y medio. - Se arma el aparato de electroforesis, se coloca el buffer de corrida en las cubas respectivas. - Se siembran 25µl de cada muestra. - Se corre en el gel de concentración a 17 mA durante aproximadamente ½ hora y a 25 mA en el gel de resolución. TEÑIDO CON PLATA Este protocolo describe el uso del DNA Silver Staining System de Promega. Un sistema contiene suficiente reactivo para teñir 10 medidas de gel e incluye: , . 500 µl de silano en pasta . 20µl de nitrato de plata (10 x 2g) . 60 ml de formaldehído, 37 % (20 x 3ml) . 10 ml de tiosulfato de sodio, 10 mg/ml (10 x 1 mi) . 600 g de carbonato de sodio (10 x 60 g) Reactivos no provistos: . Solución fix/stop, . Solución de manchado . Solución reveladora Procedimiento 1. Después de la electroforesis, vaciar la cámara de buffer y afloje con cuidado los sujetadores del gel. Retire los platos de vidrio del aparato. 2. Ubique el gel (platos de vidrio) en una superficie plana. Remueva el peine y los espaciadores del costado. Use una cuña de plástico para separar dcon cuidado los dos platos de vidrio. El gel debería estar fuertemente adherido al plato de vidrio corto. 3. Ubique el gel (adherido al plato corto) en una bandeja de plástico poco profunda (tina de lavado NALGENE®). NOTA. EL USO DE Silver Múltiple Holder permite simultáneamente el teñido de plata de dos o más geles usando aproximadamente la misma cantidad de tiempo - 17 -
Cátedra Biología Molecular Facultad de Ciencias Naturales e IML -2014uy reactivos. Si dos geles son teñidos, ubique el lado expuesto del gel de ambos platos hacia arriba mientras está la solución. Para el teñido de plato: Paso Solución Tiempo a. solución fix/stop 20 minutos b. agua desionizada 2 minutos c. repita paso b dos veces 2 x 2 minutos d. solución de teñido 30 minutos e. agua desionizada 10 segundos f. solución reveladora (4-10ºC) hasta 5 minutos g. solución fix/stop 5 minutos b. agua desionizada 2 minutos 4. Posicione el gel verticalmente y deje secar durante toda la noche. ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSADO La electroforesis de campo pulsado se basa en la reorientación periódica del campo eléctrico que permite la separación de moléculas de ADN del orden de las 2 megabases (Mb). Las moléculas de ADN de mayor tamaño se resuelven porque son selectivamente retardadas en el campo pulsado. Las alternancias en la polaridad de los electrodos producen cambios en la dirección de migración; la velocidad de reorientación de las moléculas de ADN varía en función del tamaño. Una explicación de ésto es que una molécula de ADN de elevado peso molecular utiliza una porción considerable de cada ciclo reorientándose con respecto al campo. Existen diferentes tipos de electroforesis de campo pulsado: FIG, RGE, TAFE y CHEF. Actualmente el más empleado es el CHEF (Contour-clamped homogeneous electric field) emplea un arreglo geométrico de los electrodos para producir un campo que es reorientado electrónicamente. Múltiples electrodos dispuestos alrededor de un círculo están sujetos a potenciales iguales en un campo uniforme. El grado de uniformidad del campo aumenta con el número de electrodos, en consecuencia los geles pueden correrse libres de cualquier distorsión significativa. El primer equipo de CHEF fue construido con los electrodos dispuestos en un cuadrado de tal manera que el campo estaba reorientado por 90º. Aunque la migración de las moléculas de ADN fue uniforme a lo largo del gel, la resolución fue pobre. Posteriormente se ensayó un diseño en donde los electrodos estaban dispuestos en forma hexagonal, originando un ángulo de reorientación de 120º, lo cual produjo una excelente resolución en moléculas de ADN por arriba de las 10 Mb.
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Cátedra Biología Molecular Facultad de Ciencias Naturales e IML -20143- Actividades prácticas A- Búsqueda del gen pcoA en cepas de actinomycetes mediante PCR Los genes pcoA y pcoR forman parte del operon pco (plamid-borne copper resistance) presente en el plasmido pRJ1004 detectado en una cepa de E. coli resistente a cobre. A su vez, dichos genes fueron detectados mediante PCR en aislamientos de suelo lo cual sugiere la posible transferencia de los genes pcoA y pcoR en cepas de actinomycetes tolerantes a cobre. Materiales: o o o o o o o o
Buffer STR DNA polimerasa Primers: pcoA1- pcoA2 ADN Agua bidestilada estéril Micropipetas – Tips – Tubos de PCR – Termociclador. Agarosa – Cuba de electroforesis – Marcador de PM 1kb GelRed, GelGreen o SYBR Green – Analizador de imagenes
Metodología 1. Preparar la mezcla de reaccion (volumen final 25 ul) Buffer STR 10X Primers F (pcoA1) R (pcoA2) DNA polimerasa ADN H2O bd esteril
2,5 ul 0,2 ul 0,2 ul 0,2 ul 1 ul 20,9 ul
2. Realizar la PCR usando las siguientes condiciones 95ºC 95ºC 57ºC 72ºC 72ºC 4ºC
5’ 90’’ 90’’ 2’ 7’ inf
35 ciclos
3. Visualizar los productos de PCR en gel de agarosa al 0,8%. Usar el marcador de peso molecular 1kb (Promega). 4. Una muestra de los resultados que se consiguen aparece en la gráfica siguiente:
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Primera banda: Amplificación de 300pb esperada Segunda banda: Dímero de cebadores Calle 1: marcador de 1 kpb ("ladder") Calle 2: control positivo Calle 3: control negativo Calles 4 a 10: resultado de la PCR de distintas colonias
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