TRABAJO PRÁCTICO N°11 ROL DE LAS PROTEÍNAS EN EL ORGANISMO PROTEINOGRAMA ELECTROFORETICO

1. OBJETIVOS 

Determinar en forma cualitativa las proteínas del plasma.

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Reconocer las proteínas de cada fracción en la corrida electroforética.

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Evaluar la importancia de una técnica económica y sencilla en la determinación de patologías por comparación con muestra de referencia.

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Reconocer las actividades de proteínas que integran las diferentes bandas y relacionarlas con su función fisiológica a modo de integración de los temas dictados.

2. CONOCIMIENTOS TEORICOS NECESARIOS Proteínas plasmáticas: Composición – Funciones – tamaños – peso molecular. Electroforesis.

3. DESARROLLO DEL TRABAJO PRÁCTICO FUNDAMENTOS Las proteínas son polímeros de aminoácidos, las cuales poseen grupos aminos con cargas + y grupos carboxilos con cargas -, del balance de estas resulta la carga neta. Dado que estas cargas dependen del pH de la solución, en este método, se trabaja a un pH constante en el cual la mayoría de las proteínas se cargan en forma negativa; esta estrategia permite que la separación de las distintas fracciones ocurra desde el cátodo (-) al ánodo (+). La albúmina es la que posee mayor movilidad, le siguen las fracciones alfa1, alfa2, beta1, beta2 y las gamma (esta última permanece en el punto de siembra). La concentración normal de proteínas plasmáticas es de 6,0-8,0 g/dl, las cuales podemos dividirlas en: Prealbúmina (0,1 – 0,3 g/dl) Albúmina (3,6–4,6 g/dl): pequeña y globular de 69.000 Daltons. Negativa a ph fisiológico. Fracción Alfa 1 globulinas (0,1–0,3 g/dl): α1 antitripsina, transcortina, globulina fijadora de tiroxina, αfetoproteina, α lipoproteína, α 1 glicoproteína acida.

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Fracción Alfa2 globulinas (0,5–0,7 g/dl): α2 macroglobulina, haptoglobina, ceruloplasmina, eritropoyetina. Fracción Beta globulinas (0,6-1,0 g/dl): transferrina, hemopexina, complemento, plasminogeno. Fracción Gamma globulinas (0,8-1,3 g/dl): inmunoglobulinas. La migración de partículas cargadas por influencia de una corriente eléctrica, se denomina ELECTROFORESIS. La velocidad de migración depende de la magnitud de la carga, el tamaño, la forma y la fuerza iónica del medio. Dentro de los factores a tener en cuenta: Potencial, temperatura y tiempo: a mayor potencial, mayor velocidad, por tanto, menor tiempo; pero a la vez existe aumento de temperatura lo cual puede desnaturalizar las proteínas. Fuerza iónica: a mayor fuerza iónica, mayor competencia entre los iones, lo cual lleva a migración más lenta, se observaran bandas menos separadas pero más nítidas. Soporte: existen diferentes soportes. en este trabajo práctico utilizaremos el de acetato de celulosa gelificado, el cual separa las proteínas en 6 fracciones.

MATERIALES Muestra: suero (libre de hemólisis), orina o LCR. No usar plasma porque el fibrinógeno interfiere. Soporte (tiras) de acetato de celulosa gelificado conservadas en metanol al 40 % a 4°C. No dejar secar las tiras Cuba electroforética y fuente de poder. Sembrador, tijera, pinza para cejas, papel de filtro, recipientes para decolorar. Pipetas de: 10ml, 2ml y 1ml. Buffer: Solución de Boro acetato. Dilución 1:10 en agua destilada. Solución colorante: Rojo Ponceau S: 0,5g en 100ml de acido tricloroacetico 5%. Amido Schwart: 0,5g en 45ml metanol + 45ml agua + 10ml acido acético. Soluciones decolorantes: Para Rojo Ponceau S: acido acético 5%. Para Amido Schwart: acido acético 5% y ac. acético+metanol (1+9). Deshidratante: metanol puro. Solución para Transparentizar: preparar en el momento de uso: 8,5ml metanol + 1,4 ml ac. acético + 0,1ml glicerol. Proteínas

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Cuba electroforética y fuente

TÉCNICA Colocar las tiras de acetato de celulosa (manipulándolas siempre con pinza para no contaminar) en el buffer durante 10 minutos previo a la utilización. Secar suavemente las tiras con papel absorbente para eliminar el exceso de buffer, evitando la eliminación de la superficie gelificada. Cortar las tiras por la mitad y realizar un chanfle en la parte inferior derecha, esto nos indicará la posición de la tira en la cual se realiza la siembra (lado más opaco). Proteínas

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Colocar las tiras en la cuba con la precaución de que la superficie más opaca (superficie activa para las proteínas) mire hacia arriba; apretar ambos extremos con papel absorbente embebido en buffer, este actúa como puente entre las tiras y el buffer y permite la rigidez de las tiras para una buena siembra. Colocar una gota de la muestra patrón y los desconocidos sobre portaobjetos y ensayar la siembra sobre papel con sembrador (semi micro). El sembrador se carga por capilaridad (no tocar el portaobjetos) y se descarga una sola vez. Realizar las siembras en el extremo catódico, rotular las tiras, tapar la cuba y conectarla a la fuente de poder. Regular el amperaje en 2,5 mA por tiras, a un voltaje constante de 150 – 200 V. Dejar correr 30 – 45 min en estas condiciones y controlando los mA. Desconectar la fuente y la cuba y retirar las tiras. Proceder a colorear durante 5 min y luego lavar levemente con agua de la canilla. La solución colorante se recupera. Realizar la decoloración pasando por las sucesivas soluciones de ac. acético (1,2 y 3) durante 5 min c/u. Recuperar las soluciones. Deshidratar con metanol puro 30 segundos. Transparentar sumergiendo las tiras 2 min en solución pertinente, recogerlas y acomodarlas sobre portaobjetos; llevar a estufa (el tiempo varia con la temperatura). INFORME Y RESULTADOS Reconocer por visualización directa las diferentes fracciones proteicas, relacionando la movilidad de cada una con tamaño, peso molecular y cargas. Indicar posibles causas de errores.

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CONCLUSIONES Relacionar los resultados hallados en el presente trabajo práctico con lo mencionado en la teoría. En base a los conocimientos adquiridos, indique como encontraría el proteinograma en las siguientes situaciones: Paciente deshidratado. Paciente edematizado. Enteropatía perdedora de proteínas. 4. GUÍA DE ESTUDIO a) investigue y elija una proteína de cada banda y relacione con una actividad fisiológica. b) De ser posible, enumere no menos de dos funciones que haya visto durante el dictado de la asignatura. c) ¿Porqué la imagen de un proteinograma en un recién nacido muestra

una

“hipogammaglobulinemia”? d) ¿Cómo se ve la imagen de un proteinograma de una mujer embarazada? e) Factores intrínsecos de las proteínas que intervienen en su movilidad electroforética. f)

Factores de la técnica que afectan la electroforesis.

g) ¿Cuál es la concentración normal de cada fracción proteica? 5. BIBLIOGRAFIA  Cingolani, H. E.; Houssay, A. B. y Col: Fisiología Humana de Houssay. 7ª Edición. Editorial El Ateneo. Buenos Aires. 2006.  Dvorkin, M. A.; Cardinali, D. P.; Iermoli, R. H.: Best & Taylor. Bases Fisiológicas de la Práctica Médica. 14ª Edición. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires. 2010.  Guyton, A. C.: Tratado de Fisiología Médica. 11ª Edición. Editorial Elsevier. Madrid. 2006.  Koeppen, B.M.; Stanton, B.A.: Berne & Levy. Fisiología. 6ª Edición. Editorial Elsevier Mosby. Madrid, 2009.  Silvernagl, S; Despopoulos, A.: Fisiología. Texto y Atlas. 7ª Edición. Editorial Médica Panamericana. Madrid, 2009.  Silverthorn, D. U.: Fisiología Humana. Un Enfoque Integrado; 4ª Edición. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires. 2007.

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 Henry, J.B.: El Laboratorio en el diagnóstico clínico: Homenaje a Todd-Stanford & Davidsohn. Tomos I y II. Editorial Marbán. 2005. 

Ióvine, E.; Atilio SeIva, A.: El Laboratorio en la Clínica. 3ª Edición. Editorial Médica Panamericana. 1985.

 Coppo, J. A.: “Guía de Trabajos Prácticos”. Cátedra de Fisiología – Facultad de Ciencia Veterinarias. U.N.N.E.

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