TRABAJO PRÁCTICO Nº 7 MECANISMOS ENDÓCRINOS QUE REGULAN LA CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA EN PLASMA 1. OBJETIVOS A partir de los conocimientos teóricos: 1.a. OBJETIVOS GENERALES - Conocer los mecanismos que regulan la concentración plasmática de glucosa. 1.b. OBJETIVOS ESPECÍFICOS - Realizar una Prueba de Sobrecarga Oral con Glucosa. - Interpretar los resultados obtenidos y elaborar conclusiones. - Evaluar el efecto inhibidor del fluoruro en la vía glucolítica. 2. CONOCIMIENTOS NECESARIOS - Mecanismos de acción de las hormonas que intervienen en el mantenimiento y regulación de la glucosa. - Insulina: Estructura. Acción. Secreción. Regulación de su secreción. - Mecanismos de ingreso de la glucosa a las distintas células del organismo.

3. PRUEBA DE TOLERANCIA ORAL A LA GLUCOSA 3.a. Fundamento La concentración de glucosa plasmática (Glucemia) se mantiene dentro de un rango estrecho de 70 –110 mg/dl (70 – 110 mg%). El aporte de glucosa a la circulación está dado por los siguientes mecanismos: 1 - Absorción intestinal: a través de la hidrólisis de hidratos de carbono que forman parte de la dieta, los cuales se absorben por un mecanismo de cotransporte con Na+ y pasan rápidamente al torrente sanguíneo. 2 - Glucogenólisis: degradación de glucógeno almacenado en el hígado. 3 - Gluconeogénesis: formación de glucosa a partir de sustratos no hidratos de carbono: piruvato, aminoácidos como alanina y menos frecuentemente glicerol. Las hormonas Pancreáticas Insulina y Glucagón son las principales hormonas reguladoras de la captación y producción hepática de la glucosa. Además otras como los Glucocorticoides, Hormonas del Crecimiento y Catecolaminas, forman parte de este sistema de regulación.

De éstas la única hipoglucemiante es la

Insulina; las demás tienden a aumentar la concentración de glucosa en sangre. La Insulina, esencial para la vida, además de ser hipoglucemiante, tiene acciones como antilipolítica y anabólica proteica.

Fisiología del páncreas endócrino

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Considerando los valores obtenidos de glucemia en ayunas, se pueden presentar los siguientes casos: Estado

Glucemia plasma en ayunas mg/dl

Normal

70 a 110

Glucemia en ayunas alterada (GAA)

110 a 126

Diabetes Mellitus (DM)

> 126 Fuente: Sociedad Americana de Diabetes (2011).

Si la glucemia en ayuna supera los 126 mg/dl en dos ocasiones diferentes con el ayuno respectivo, puede hacerse el diagnóstico de Diabetes Mellitus (DM), mientras que si se encuentra en el rango de 110 – 126 mg/dl puede decirse que la glucosa de ayuno se encuentra alterada. 3.b. Materiales 3.b.1. Extracción de sangre: Ver Trabajo Práctico Nº 1. Anticoagulante de elección: EDTA/ Fluoruro (Anticoagulante G de Wiener). 3.b.2. Determinación de glucosa: -

Centrífuga.

-

Micropipetas Automáticas de 10 μl.

-

Tubos de hemólisis.

-

Baños termostatizados a 37ºC.

-

Reactivos para determinación de Glucosa en líquidos corporales. Método GOD/POD.

-

Espectrofotómetro.

3.b.3. Limpieza (por comisión): Detergente – Rejilla – Alcohol gel – Cepillo para lavar tubos de hemólisis – Rollos de cocina. 3.c. Técnica -

Extracción de Sangre por venopunción. Ver Trabajo Práctico Nº 1.

-

Determinación de Glucosa en plasma:

o

Previamente dejar que el reactivo de trabajo tome temperatura ambiente

o

En tres tubos de hemólisis: B (blanco), E (estándar), D (desconocido) colocar:

o

B

E

D

Muestra

-

-

10 μl

Estándar

-

10 μl

Reactivo

1 ml

1 ml

1 ml

Mezclar. Incubar 15 minutos a 37 ºC

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2

o

Leer en espectrofotómetro a 505 nm llevando a cero con el blanco de reactivo.

o

Estabilidad del color 60 minutos.

o

Cálculo:

[Glucosa (g/l)] = Absorbancia Desconocido x Estándar (g/L) Absorbancia Estándar 3.c.3. Experiencia 

Preparar una solución acuosa de glucosa: En adultos 75g de glucosa anhidra en 375ml de agua (puede ser acidulada con jugo de limón natural), a temperatura ambiente. En menores de 12 años o peso < 30 Kg: solución al 20% con 1,75g de glucosa por Kg de peso.



Realizar una extracción de sangre por punción venosa en ayunas usando anticoagulante EDTA-G (EDTA con fluoruro). Separar el plasma dentro de los 15 minutos.



Administrar la solución de glucosa, controlando que el paciente beba toda la solución en un tiempo no mayor a 5 min. Registrar tiempo de inicio de la ingesta.



Realizar extracciones de sangre por punción venosa a los 30, 60 y 120 minutos de iniciada la ingestión de glucosa.



Realizar la determinación de Glucemia en cada una de las muestras.

3.d. Resultados Registrar los resultados obtenidos en la siguiente tabla y realizar un gráfico de la variación de la concentración de glucosa en plasma en el tiempo. Tiempo

Glucemia (mg/dl)

Basal 30 minutos 60 minutos 120 minutos 3.e. Conclusiones Relacionar los resultados hallados en el trabajo práctico con los mecanismos homeostáticos puestos en juego para la regulación de la glucemia.

4. EFECTO DEL FLUORURO COMO INHIBIDOR DE LA GLUCÓLISIS ANAERÓBICA 4.a. Fundamento La enolasa es la enzima que cataliza la transformación de 2-fosfoglicerato a fosfoenolpiruvato durante la glucólisis. La enzima forma un complejo con un catión divalente como el Mg2+ antes de unirse al sustrato. El ión F- inhibe la glucólisis por medio del bloqueo de la actividad de la enolasa. En presencia de fósforo inorgánico, el F- bloquea la unión del sustrato a la enolasa por medio de la formación de un complejo con Mg2+ (fluorfosfato de magnesio), el cual se une al sitio activo de la enzima. Fisiología del páncreas endócrino

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4.b. Materiales Anticoagulante EDTA-F Anticoagulante Heparina Tubos de hemólisis Centrífuga Baño a 37° C Micropipeta automática de 10 μl Pipetas de vidrio de 1 ml y propipetas Kit de reactivos para determinación de glucemia Reloj o timer Espectrofotómetro

4.c. Experiencia Las muestras de sangre se recogerán con anticoagulante heparina, EDTA-Fcomercial y sin anticoagulante. Esta se colocará en baño a 37° C hasta retracción del coágulo; luego se centrifugará 5 minutos a 1000 rpm, y por último se separará la mitad del suero en otro tubo, dejando el resto con el paquete globular. A. Tubo 1: Suero B. Tubo 2: Suero + Paquete globular. C. Tubo 3: Plasma con Heparina + Paquete globular. Proporción: 50 µl de Heparina para un máximo de 5 ml de sangre. D. Tubo 4: Plasma con EDTA-F+ Paquete globular. Proporción: 20 µl de EDTA-Fpara un máximo de 2,5 ml de sangre. 

Determinar la glucemia basal en todas las muestras utilizando el método GOD-POD.



Determinar la glucemia a la hora de realizada la extracción en todas las muestras.

4.d. Resultados Registrar los resultados obtenidos en la siguiente tabla. Basal (Hora Tubos

:

Glucemia

)

1 hora (Hora

:

)

Glucemia

1 2 3 4

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4

4.e. Conclusiones ¿Qué diferencias se observo en la concentración de glucosa en las muestras con y sin agregado de inhibidor? Por medio de que transportador ingresa la Glucosa a los glóbulos rojos. ¿En que otras células se presenta dicho transportador y cómo se encuentra regulado? Indique la diferencia entre el transporte de glucosa para entrar en las células intestinales y para entrar en las células musculares.

5. GUÍA DE ESTUDIO 1. ¿Cuáles son los órganos blancos de la insulina? ¿A qué tejidos se los denomina insulino-independinetes? 2. ¿Qué factores estimulan la liberación de insulina? ¿Cuáles inhiben? 3. ¿Cómo interviene la regulación nerviosa en la homeostasis de la glucosa? 4. ¿Cuál es la importancia de la acción de las incretinas? 5. ¿Por qué se denomina al hígado amortiguador del metabolismo de la glucosa? 6. ¿Cuál es el valor de referencia de la concentración de glucosa en plasma? 7. ¿Cuándo se recomienda la realización de una prueba de tolerancia oral a la glucosa? 8. ¿Qué se debe evaluar ANTES de realizar el estudio? 9. ¿Qué contrindicaciones presenta? 10. ¿Por qué la liberación de insulina al torrente sanguíneo es bifásica? 11. Para investigar: ¿Se sigue el mismo procedimiento en los niños?

6. ANEXO PTOG Considerando los valores de Glucemia Plasmática en ayunas:

A qué individuos debe realizarse PSOG y Para qué 

Personas que presentan riesgos de desarrollar DM aún cuando no presentan manifestaciones clínicas de DM (detección precoz). Para confirmar o descartar DM.



Personas que presentan signos y/o síntomas que sugieren DM. Para confirmar o descartar DM.



Personas con diagnóstico reciente de DM tipo 2, y se desea conocer el grado de Insulinoresistencia hepática y periférica. En cada muestra se hará el dosaje de Insulina y analizar su nivel respecto a la Glucemia de la misma muestra. Contraindicaciones para realizar la PSOG: no debe realizarse cuando:



Cuando el paciente tiene 2 Glucemias en ayunas > 126 mg/dl sin causas de hiperglucemia secundaria.

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

Pacientes que presentan hiperglucemia secundaria por inflamación del páncreas o pancreatectomía; enfermedades endocrinas (Acromegalia, Cushing), por fármacos.



Individuos que tengan factores que disminuyen la tolerancia a la glucosa oral:

-

Inactividad física durante los últimos 3 días.

-

Dieta hipocalórica de hasta una semana.

-

Fármacos (diuréticos, glucocorticoides) en los últimos 5 días.

-

Enfermedades intercurrentes (insuficiencia renal, cirrosis hepática).



Estrés severo hace menos de una semana (accidentes, traumatismos).



Estados malabsortivos (náuseas, vómitos, dolor abdominal).

Procedimiento correcto para la realización de PSOG 

Interrogar y registrar: motivo de consulta al médico, micción (aumento de frecuencia y volumen, aumento en la micción nocturna), aumento de sed, mayor apetito, aumento de peso, si posee familiares directos con D.M.



Investigar si el paciente

presenta alguna

contraindicación. En caso positivo avisar al médico solicitante la

imposibilidad de realizar la prueba hasta que se elimine la contraindicación. 

Investigar si está recibiendo medicación, en caso positivo, consultar lista de drogas interferentes a la PSOG. Avisar al médico solicitante la imposibilidad de realizar la PSOG hasta suspensión de la medicación interferente por 5 días.



Indicar dieta previa: Consumir panes, arroz, fideos, pastas, (en adultos se busca entre 150 y 400 g de carbohidratos/día), durante 3 días previos a la realización de la prueba. Un bajo aporte de carbohidratos puede dar resultados falsos positivos debido a que se puede producir un estado de inercia pancreática frente a la sobrecarga glucídica de la prueba, y la cantidad de insulina secretada será insuficiente para los requerimientos, aún en paciente normales.



Explicar al paciente que se debe concurrir al laboratorio, por la mañana con 8 a 12 horas de ayuno, el procedimiento a seguir, y la necesidad de permanecer en reposo por 2 hs, en el laboratorio; (se debe realizar la PSOG por la mañana para evitar las variaciones diurnas de la glucemia por el ritmo circadiano de secreción de insulina).

Al momento de realizar la PSOG en el laboratorio:  Verificar cumplimiento de dieta, y ausencia de contraindicaciones para realizar la PSOG.  Registrar todos los datos del paciente y del médico solicitante.  Preparar una solución acuosa de glucosa: En adultos 75g de glucosa anhidra en 375ml de agua (puede ser acidulada con jugo de limón natural), a temperatura ambiente. En menores de 12 años o peso < 30 Kg: solución al 20% con 1,75g de glucosa por Kg de peso.  Previo reposo del paciente por 5 minutos, realizar una extracción de sangre por punción venosa en ayunas (usar heparina o EDTA). Separar el plasma dentro de los 15 minutos. Fisiología del páncreas endócrino

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 Administrar la solución de glucosa, en un lugar del laboratorio libre de ruidos, controlar que el paciente beba toda la solución en 5 min. Registrar tiempo de inicio de la ingesta.  Indicar y controlar que el paciente permanezca sentado en el laboratorio, durante 2 hs, sin fumar, comer ni beber.  Realizar extracciones de sangre por punción venosa a los 30, 60 y 120 minutos de iniciada la ingestión de glucosa. 

Dosar glucemia por método de rutina calibrado y validado, utilizar controles interno y externos. Si el paciente en algún momento vomita después de la administración de glucosa la prueba queda suspendida y no se continúa.

7. BIBLIOGRAFÍA 

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