Trabajo Práctico N° 1 Reacción en Cadena de la Polimerasa Definició Definición e importancia. Usos y aplicaciones. Optimizació Optimización. Tipos de PCR. Electroforesis. Fundamentos. Asociado al Programa Teó Teórico: Tema 2. Replicació Replicación del ADN. ADN. Replicació Replicación in vitro: vitro: Reacció Reacción en Cadena de la Polimerasa. Polimerasa. Definició Definición, usos y aplicaciones en biologí biología molecular.
Objetivos Conocer y comprender:
El fundamento teórico que permitió el desarrollo de la técnica de PCR
La importancia de la técnica en el desarrollo de la tecnología del ADN recombinante
Las aplicaciones y usos de la técnica
La importancia del diseño de cebadores y de la optimización de las reacciones de PCR en el laboratorio
El fundamento de la separación de moléculas mediante electroforesis
El análisis de los resultados obtenidos en relación al objetivo del experimento planteado
PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa Polymerase Chain Reaction
PCR: origen
1983: diseñada por el Dr. Kary Banks Mullis Amplificación del gen de la β-hemoglobina humana y diagnostico prenatal de anemia falciforme. 1986: Mullis, K., Faloona, F., Scharf, S., Saiki, R., Horn, G. and Erlich, H., Specific Enzymatic Amplification of DNA In Vitro: The Polymerase Chain Reaction, Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology 51 : 263 1993: Ganó el premio Nobel de Química Nuevas perspectivas a la investigación y al diagnóstico médico
¿Qué es la Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)?
Amplificación cíclica de una secuencia de ADN in vitro A partir de 1 copia → Millones de copias de ADN en pocas horas
Fundamentos de la PCR
Replicación del ADN in vivo:
En la horquilla se encuentra enzimas y proteínas con funciones diferentes
Replicación del ADN in vitro:
La separació separación de las hebras se hace mediante temperatura
Primasa Cebador
Ligasa ADN polimerasa
ADN nativo: Doble hebra
Cadena
Temperatura
retrasada Fragmentos de Okasaki Cadena
ADN desnaturalizado:
líder
Topoisomerasa
Hebras simples
ADN polimerasa Helicasa Proteínas de unión a cadena simple
En la célula
En la PCR
Etapas de la PCR 1.
Desnaturalización del ADN molde
2.
Hibridación de cebadores con ADN molde
3.
Polimerización
El cambio entre pasos se da por cambios en la temperatura 1. Desnaturalización
1. Desnaturalización
Temperatura (ºC)
3. Polimerización
2. Hibridación de cebadores
1º ciclo
2º ciclo
Tiempo
El proceso físico químico que ocurre se determina sólo mediante una variación controlada de la temperatura
En la PCR hay una amplificación exponencial del ADN molde 4º ciclo
Secuencia blanco
3º ciclo 2º ciclo
35º ciclo
1º ciclo
ADN molde
21 = 2 copias
22 = 4 copias
8 copias
16 copias
235= 34.000 millones copias
Secuencia blanco
ADN molde
0 de 2
0 de 4
2 de 8
8 de 16
Regulación de la temperatura
La PCR se realiza en un Termociclador Es un aparato que modifica la temperatura de forma cíclica:
↑ ↓
y la T de la reacción en períodos cortos de tiempo
Componentes de la PCR
PCR: Componentes
ADN molde Enzima ADN polimerasa Cebadores Desoxinucleótidos trifosfatos (dNTPs) MgCl2 Buffer de reacción Adyuvantes
ADN Molde
Tipo de ADN: cadena sencilla o doble circulares o lineales
Cantidad:
Calidad: Libre de contaminantes Urea, SDS, Fenol, Agarosa ↓ actividad polimerasa
5 pg (1 o 2 copias) 100 ng (100.000 copias ) >> cantidad ↓ eficiencia
Tipos de ADN polimerasa
ADN polimerasa procedente de E. coli ADN polimerasas termoestables Taq (Thermus aquaticus) Tfl (Thermus flavus) Pfu (Pyrococcus furiosus)* VENT (Thermococcus litoralis)* DeepVENT (Pyrococcus sp. GB-D)*
.
Cebadores ► Secuencias
cortas ADN de 20 a 30 bases ► Concentración: 0,2-1,0 µM c/u ↑ [ ] ↓ rendimiento ► Relación
cebador/ADN molde: Inicial: 108 Final: 10
► Distancia
entre cebadores: < 3 kb
.
Cebadores ► Específicos
→ extremo 3´ ► Contenido G+C similar → T hibridación similar ► Evitar estructuras secundarias: Homodímeros Heterodímeros Horquillas ► Adición de sitios de restricción: extremo 5´
Desoxinucleótidos trifosfato
Bloques o ladrillos: Sustrato Concentración: equimolar 0,2 mM c/u > [ ] 4mM: inhiben la reacción Pueden estar modificados Manufactura: libres de pirofosfato
Mg2+
Cofactor de la ADN polimerasa Afecta
la actividad y fidelidad de la enzima la unión del cebador T de desnaturalización del molde la especificidad del producto
[ ]= 0,5 y 5,0 mM
PCR: Componentes
Buffer de reacción
Mantiene el pH 50 mM KCl y 10 mM Tris-HCl T° ambiente pH: 8,3- 8,8 72°C pH: 7,2
Adyuvantes
Mejoran la especificidad y e! rendimiento PEG, glicerol → estabilizan la enzima DMSO → evita la formación de estructuras secundarias en el molde BSA (10-100 µg/ml) → capta iones inhibidores de la Taq polimerasa
Optimización de la PCR ¿Cuá Cuánto queremos obtener?
Rendimiento
Es ci
lid ad
pe id
Fi de
fic ad
¿Qué secuencia queremos amplificar?
¿La copia debe ser igual al molde?
Optimización de la PCR Parámetro
Especificidad
Fidelidad
Rendimiento
[Mg2+]
↓
↓
↑
[dNTPs]
↓
↓
↑
[Polimerasa]
↓
↓
↑
Pfu; Vent
Taq (sin act. correctora)
Tipo de Polimerasa Duración de las etapas
↓
Nº de ciclos
↓
[Cebadores]
↓
↑
Cebadores degenerados
↓
↑
Temperatura de renaturalización
↑
Temperatura de desnaturalización
↑
pH
≠
Potenciadores
+
↑ ↓
+
Tipos de PCR
AFLP: Polimorfimos de longitud de fragmentos de amplificación PCR asimétrica PCR degenerada Hot-start PCR PCR inversa PCR in situ PCR-ELISA QC-PCR
►
► ► ► ► ► ►
PCR-RFLP: Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción RACE (Amplificación rápida de extremos de ADNc) Touchdown PCR RAPD PCR múltiple PCR mutagénica PCR-Expresión diferencial (DDPCR)
RT-PCR PCR anidada Real-Time PCR
RT-PCR
Molde: ARN ARNm Oligo dT RT: Transcriptasa reversa
ADNc
PCR anidada
2 pares de cebadores PCR sobre producto de PCR ↑ sensibilidad ↑ especificidad
ADN blanco P1
P2
1º par de cebadores 1º producto ≈ 20 ciclos P int 1
P int 2
2º par de cebadores
≈ 20 ciclos
Amplificación específica
Real Time PCR
PCR en tiempo real PCR cuantitativa PCR cinética
Medición de la formación de un producto de PCR en tiempo real
Requiere Fluorocrómo Sistema óptico de detección
Real Time PCR SYBR Green
Sondas
Fluorocromo Silenciador
Separación Emisión de Fluorescencia
Real Time PCR
Fluorescencia
•Ciclo umbral: •Nº de ciclos necesarios para detectar fluorescencia
Nº de ciclos
•Inversamente proporcional a [Molde] inicial
PCR: Ventajas
Amplificación ilimitada de secuencias de interés
Fotocopiadora molecular: de 1 copia a millones de copias
Rápida
Eficaz
Sensible
Específica
El producto se puede utilizar para clonar, secuenciar y analizar
Se puede amplificar ADN de cualquier organismo vivo o muerto: Muestras antiguas
PCR: Desventajas
Se debe conocer por lo menos una mínima secuencia de 20 – 40 pb
Cebadores específicos que sean complementarios al fragmento que se desea sintetizar
La polimerización puede introducir errores al sintetizar el ADN
Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del mismo investigador o de cualquier otro)
PCR: Aplicaciones
Todos los campos de la biología Medicina forense y legal Detección de patógenos Diagnóstico de patologías genéticas y adquiridas Taxonomía molecular Trazabilidad alimentaria
Importancia en Medicina
Herramienta fundamental para el mejoramiento de la salud y vida humana
Detección de enfermedades infecciosas, hereditarias y adquiridas
Detección de patógenos difíciles o imposibles de cultivar
HIV
Detección en plasma Determinación de la carga viral Sensibilidad: 200 copias/ ml Técnica: RT-PCR Objetivo: gen gag (proteínas estructurales)
HVC
Técnica: RT-PCR anidada Sensibilidad: 100 - 1 000 copias/ ml Objetivo: región no codificante 5′
Identificación de individuos
Herencia mendeliana Material:
ADN nuclear
Cebadores
VNRT STR Y
Cromosomas homólogos
ADN mitocondrial Secuencia blanco
STR-VNTR
Electroforesis
Electroforesis PCR Amplificación in vitro (ADN - ARN) Detección
Electroforesis
Separación de partículas con carga debido a la influencia de un campo eléctrico en un medio semisólido Los fragmentos de ADN pueden separarse por electroforesis
Cátodo (-)
Ánodo (+)
Movilidad de las moléculas cargadas
Factores extrínsecos
Soporte: tipo y [ ] Voltaje: Fuerza del campo eléctrico Fuerza iónica del medio: pH Buffer Temperatura Tiempo
Factores intrínsecos a la partícula
Tamaño Relación carga/masa Forma de la molécula
Factores extrínsecos
Soporte: tipos
PAPEL Celulosa Es poco restrictivo Separaciones defectuosas Moléculas pequeñas: péptidos y aminoácidos
ACETATO DE CELULOSA Gel de poro grande Poco restrictivo Inerte Características estructurales constantes y definidas Fácil manejo, costo bajo Proteínas séricas
ALMIDÓN Geles de almidón parcialmente hidrolizado Poro es menor que el de acetato de celulosa Menor difusión, mejor separación Dificultad para la obtención de resultados reproducibles
Soporte: tipos
AGAROSA
Componente del agar Polisacárido lineal Geles de poro grande Difusión elevada No tóxico Alto grado de separación Preparación sencilla Fragmentos de ADN de 200 a 50.000 pb Bajo poder de resolución
POLIACRILAMIDA
Gel inerte Tamiz molecular: tamaño de poro variable Estable en amplio intervalo de pH, fuerza iónica y temperatura Transparentes: facilidad para ser densitometrado Fácil de almacenar Alto poder de resolución O Fragmentos de ADN de 500 pb O C NH2 Mezclas de proteínas C Toxicidad de los monómeros CH CH 2 CH2 CH Acrilamida
O NH
CH2
NH
N,N`-Metilenbisacrilamida
C
CH
CH2
Soporte: [ ] Agarosa % 0,3 0,6 0,7 1,2 2,0 Acrilamida % 3,5 5 12 15 20
Intervalo de tamaños (bp) 5.000 - 60.000 1.000 - 20.000 800 - 10.000 400 - 6.000 100 - 2.000 Intervalo de tamaños (bp) 1000 - 2000 80 - 500 40 - 200 25 - 150 6 - 100
Voltaje
Fuente de poder V típico = 10 V / cm de gel geles de 10 – 15 cm → 100 V – 130 V >V → Fundición del gel Resolución (70 V) ↓↓ V → > Tiempo → Difusión
Buffer: Fuerza iónica y pH
> [iones] → < resolución Control de pH → Evita modificaciones en la carga y conformación de las moléculas Composición
TAE: Tris-acetato-EDTA TBE: Tris-borato-EDTA TPE: Tris-fosfato-EDTA
Tiempo
Depende del tamaño de los fragmentos a separar A > tiempo > resolución (longitud del gel)
Factores intrínsecos
Carga y tamaño
ADN → carga (-) Q/m= constante Migra desde el cátodo (-) al ánodo (+) > Tamaño < movilidad
Forma de la molécula ADN circular: 3 conformaciones posibles Circular abierto
Lineal
Circular covalentemente cerrado (superenrrollado) +
Etapas de la electroforesis en gel de agarosa 1. 2. 3. 4. 5.
Preparación del gel Siembra de las muestras Corrida Revelado Análisis
1. Preparación del gel
Agarosa + Buffer
Fundir del gel
Verter en el molde con el peine
Dejar gelificar
2. Siembra de las muestras
Muestra + Buffer de carga Composición del Buffer de Carga: Glicerol, ficol o sacarosa → ↑ densidad de la muestra Colorantes de corrida
Xylene Cyanol Azul de bromofenol Orange G
→ movilidad ~ 4000 pb → movilidad ~ 400 pb → movilidad ~ 40 pb
3. Corrida
Conectar los electrodos
Conectar la fuente de poder Seleccionar el voltaje
Observar el desplazamiento del frente de corrida
4. Revelado del gel
Autorradiografía → sondas marcadas Tinción con plata Agentes intercalantes:
Bromuro de etidio
Fluoresce con luz UV Detecta hasta 10 ng de ADN doble hebra Cancerígeno
SYBR
Fluoresce con luz visible Poca afinidad gel Detecta hasta 20 pg ADN doble hebra Seguro Caro
5. Análisis del gel
Cualitativo:
Presencia o ausencia de bandas Tamaño de las mismas
Cuantitativo:
Concentración del amplicón
Actividades prácticas A.
Búsqueda del gen pcoA en cepas de actinomycetes mediante PCR
B.
Preparación de un gel de agarosa
C.
Análisis de geles
A.
Materiales:
Buffer STR DNA polimerasa Primers: pcoA1- pcoA2 ADN Agua bidestilada estéril Micropipetas – Tips – Tubos de PCR – Termociclador Agarosa – Cuba de electroforesis – Marcador de PM 1kb SYBR® Safe- Analizador de imágenes
Metodología
Búsqueda del gen pcoA mediante PCR
Preparar la mezcla de reacción (volumen final 25 µl) Buffer STR 10X 2,5 µ l Primers F (pcoA1) 0,2 µ l R (pcoA2) 0,2 µ l DNA polimerasa 0,2 µ l ADN 1µl H2O bd esteril 20,9 µ l
Realizar la PCR usando las siguientes condiciones
Desnaturalización inicial → 95ºC Desnaturalización → 95ºC Hibridación → 57ºC Polimerización → 72ºC Polimerización final → 72ºC 7’ Conservación → 4ºC inf
5’ 90’’ 90’’ 2’
35 ciclos
B. Preparación de un gel de agarosa
Visualizar los productos de PCR en gel de agarosa al 0,8%. Usar el marcador de peso molecular 100 pb (Promega)
3. Análisis de geles Grupo 2
Grupo 1 PM (+) (-) A
B
PM (+) (-) A
Grupo 3 B
PM (+) (-) A
Grupo 4 B
PM (+) (-) A
B
pb 700 600 500 400 300 200 100
Grupo 5 (+) Control positivo (-) Control negativo A: A. tucumanensis B: Streptomyces AB2A
PM (+) (-) A
Grupo 7
Grupo 6 B
PM (+) (-) A
B
PM (+) (-) A
Grupo 8 B
PM (+) (-) A
B
Responder
¿La amplificación observada en el control positivo corresponde a la esperada? ¿Por qué?
¿Se debe seguir analizando el resultado? ¿Por qué?
¿Se observa amplificación en el control negativo? ¿Por qué?
¿Se debe seguir analizando el resultado? ¿Por qué?
¿Se observa amplificación para A. tucumanensis? ¿Se observa una única banda? ¿Es del tamaño esperado? ¿Por qué? ¿Se observa amplificación para Streptomyces AB2A? ¿Se observa una única banda? ¿Es del tamaño esperado? ¿Por qué?
¿Modificaría algún parámetro de la reacción? ¿Cuál? ¿Por qué?
Exponer el análisis al resto de los grupos
