Carrera de Ingeniería Agronómica Cátedra de Microbiología Agrícola Año 2014

Serie Didáctica Interacciones plantas, bacterias y hongos micorrízicos. Inoculantes 1. Introducción La rizósfera es el volumen del suelo adyacente a las raíces de las plantas, el cual está influenciado por las mismas y representa una región de intensa actividad microbiana. El grupo de microorganismos y otros agentes que se encuentran en la rizósfera incluyen bacterias, hongos, nematodos, protozoos, algas y microartrópodos. En la rizósfera hay expresión de relaciones simbióticas mutualistas entre microorganismos y plantas, debido a la exudación de sustratos orgánicos útiles para el metabolismo microbiano. Los microorganismos, a la vez, participan en numerosos beneficios hacia las plantas, como: influencia en el crecimiento radical, regulación de la actividad metabólica de la raíz e influencia en las propiedades físicas y químicas del suelo, así como de los contaminantes. 2. Microorganismos promotores del crecimiento Entre estos microorganismos benéficos para las plantas se encuentran las rizobacterias promotoras del crecimiento de las plantas (PGPR) y muchas especies de hongos, particularmente los micorrízicos. Éstas favorecen el crecimiento de los vegetales a través de diferentes mecanismos Las PGPR además pueden suprimir enfermedades producidas por microorganismos fitopatógenos a través de la producción de sideróforos, síntesis de antibióticos, enzimas y/o compuestos fungicidas. También participan en procesos de bioremediación, degradando e incluso mineralizando los compuestos orgánicos en asociación con las plantas. 2.1. Mecanismos de acción El mecanismo de acción de las PGPR sobre las plantas puede ser: 2.1.1. Directo: las PGPR le proporcionan a la planta compuestos sintetizados por ellas mismas, produciendo una estimulación del crecimiento. Estos compuestos pueden ser nitrógeno, hierro o fósforo y hormonas de crecimiento. Los efectos directos de las PGPR son: la síntesis de fitohormonas, la producción de sideróforos, la solubilización de minerales y la fijación del nitrógeno atmosférico. Se ha observado además su influencia en la absorción de elementos minerales, debido a incrementos en los flujos iónicos de la superficie radicular en presencia de PGPR  Fijación de nitrógeno: de las bacterias que suministran nutrientes a las plantas (biofertilizantes) se destacan las bacterias fijadoras de N2, (Rhizobium y Bradyrhizobium) que establecen asociaciones simbióticas con formación de nódulos en las raíces de las plantas de leguminosas como soja, poroto, maní, y alfalfa entre otras. Por medio del manejo de los sistemas simbióticos fijadores de nitrógeno (Rhizobium-leguminosa, Frankia-casuarina, Anabaena-Azolla) es posible contribuir al enriquecimiento de la fertilidad del suelo. Existen otras PGPR de vida libre capaces de rducir el N2. Tal es el caso de Azospirillum, Azotobacter, Cátedra de Microbiología Agrícola-FAyA-UNSE. 2014. Prof Titular Ing Msc Ada Albanesi; JTP Ing. Mag. Analia Anriquez; Ayud. Prof. Ing. Juan Silberman

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Beijerinkia, entre otras. Todas ellas además, poseen otros mecanismos tan o más importantes con los cuales aumentan la productividad de los cultivos.  Producción de sustancias reguladoras del crecimiento: de las bacterias que producen fitohormonas como las auxinas, particularmente el ácido indol acético, citoquininas, giberelinas que promueven el crecimiento de las raíces y la proliferación de pelos radicales, mejorando la absorción de agua y minerales del suelo y con ello el mejor y mayor desarrollo de las plantas. Las bacterias pertenecientes a los géneros: Azotobacter sp, Azospirillum sp, Pseudomonas sp, Xantomonas sp, Enterobacter sp, Arthrobacter sp, Bacillus subtilis, se destacan por su potencial como biofertilizantes debido a que son capaces de producir sustancias promotoras de crecimiento. 2.1.2. Indirecto: se pueden observar en la interacción del microorganismo PGPR con un fitopatógeno, mediante la cual se reducen los efectos dañinos en el vegetal.  Competencia por el hierro y la producción de sideróforos: éstos son compuestos que las PGPR excretan al medio en condiciones de escasez de hierro, secuestrándolo, con lo cual se inhibe el crecimiento de patógenos en la rizósfera, ya que convierten al hierro en factor limitante. Ejemplos Pseudomonas y Burkholderia  Antibiosis: inhibición o destrucción de un microorgnismo por los productos metabólicos de otros, que incluyen antibióticos, enzimas líticas y enzimas detoxificadoras. Ej Pseudomonas  a las Pseudomonas se les atribuye la capacidad de producir enzimas fosfatasas, ácidos orgánicos (ác. Glucónico, cítrico) e inorgánicos (Ác. Sulfhídrico, nítrico, carbónico) que por medio de la rotura de enlaces y la acidificación del medio, incrementarían la recuperación del fósforo nativo del suelo y la adquisición del aporte por fertilización. Los hongos micorrízicos no son menos importantes que las PGPR, particularmente la asociación micorrízica vesícula-arbuscular (VA). Durante el establecimiento de esta asociación los hongos desarrollan un extenso micelio extrarradical que explora regiones del suelo inaccesibles a la raíz, incrementando así la captación de nutrientes como el fósforo y nitrógeno y favoreciendo el crecimiento de la planta. Además, la micorriza VA contribuye a reducir los daños a la planta ocasionados por el estrés biótico, incluidos los fitopatógenos, y el abiótico, incluyendo a los contaminantes del ambiente como los metales pesados. 3. Inoculantes Las PGPR se utilizan para producir Inoculantes, productos cuyo principio activo son microorganismos vivos, no patógenos de humanos, animales o plantas, ni patógenos oportunistas del hombre, que favorecen la nutrición y/o el desarrollo de las plantas. Excluye los denominados agentes de control biológico, biofungicidas, bionematicidas, bioinsecticidas y productos de similar actividad que favorecen la salud de las plantas. El uso de inoculantes biológicos, incorporados como tratamientos de semilla y/o sobre el suelo, con microorganismos promotores del crecimiento vegetal tales como Pseudomona sp. Azospirillum sp. Rhizobium y Micorrizas muestra un creciente interés no solo en estudios de investigación sino también en evaluaciones extensivas y usos comerciales en diferentes cultivos. 3.1. Inoculación La inoculación tiene como finalidad esparcir sobre las semillas o en la región próxima a la raíz un número suficiente de microorganismos seleccionados con características deseables, de manera de aumentar la posibilidad de que la planta sea colonizada por los mismos. Cátedra de Microbiología Agrícola-FAyA-UNSE. 2014. Prof Titular Ing Msc Ada Albanesi; JTP Ing. Mag. Analia Anriquez; Ayud. Prof. Ing. Juan Silberman

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Las características requeridas para emplear determinados microorganismos como inoculantes son: infectividad (capacidad de penetración y colonización de la raiz), efectividad (ej. capacidad de fijar N2 en los rhizobios y de absorber nutrientes en los hongos micorrícicos) y sobrevivencia en la rizósfera y en el suelo. Existe diversos métodos para comprobar la infectividad y efectividad, ya sea en cámaras de cultivos, invernáculos, o a campo. 3.1.1. Inoculación de leguminosas con rizobios Los requerimientos más importantes para el éxito de la inoculación son:  Proporcionar a la semilla un número suficiente de bacterias apropiado. El inoculante debe contener desde 106 a 109 UFC gr-1 de inoculante.  La bacteria debe ser aplicada en una forma y bajo condiciones tales que le den una buena posibilidad de sobrevivencia.  El medio donde se implante la semilla debe permitir una colonización de la rizósfera por el rizobio, la formación del nódulo y su funcionamiento. Al preparar un inóculo es esencial una regular y cuidadosa investigación de las cepas de Rhizobium con todas las leguminosas para las cuales se recomiendan. Para ello se hacen ensayos en solarios y/o invernáculos y también son necesarios los ensayos en una o más situaciones a campo. 3.1.1.1. Tipos de inoculantes En nuestro país se comercializan diferentes tipos de inoculantes, que son de procedencia extranjera y nacional. Estos son:  Inoculantes líquidos: Los microorganismos, están suspendidos en el medio de cultivo líquido. Según el registro de SENASA la mayor parte de los inoculantes comerciales son formulaciones líquidas. Algunas de ellas pueden venir con el curasemilla compatible con el microorganismo.  Inoculantes liofilizados: Estos son generalmente mezclados con talco, su uso ha sido desaconsejado por problemas de sobrevivencia sobre la semilla.  Inoculantes en seco: Es aquél en el cual se impregna un excipiente pulverulento con el cultivo del microrganismo, siendo la turba el soporte más empleado comercialmente. La producción en gran escala, se realiza mediante un proceso de dos etapas: el desarrollo del microorganismo en medio líquido y la impregnación con este líquido de la turba o de la mezcla suelo-turba. Su duración es de 3 o 4 meses y no presenta problema de contaminación. 3.1.1.2. Métodos para inocular semillas:  Inoculación simple: Consiste en agregar una suspensión del inoculante-agua azucarada sobre la semilla a tratar en proporciones calculadas experimentalmente y que varían de acuerdo al inoculante a usar. La semilla se extiende a la sombra y sobre una superficie no absorbente. Se mezcla con pala y se deja secar para luego sembrar. Se inocula la semilla que se sembrará en el día. Conviene inocular al atardecer y a la mañana siguiente recién sembrar o bien inocular al amanecer la semilla que se sembrará a la tarde.  Preinoculación: Consiste en revestir a las semillas con un adhesivo y el inoculante, formando una capa a su alrededor, donde las bacterias pueden sobrevivir más tiempo. Se emplea para evitar la inoculación sucesiva de lotes de semillas, con este método se inocula la cantidad total de semillas a sembrar. Puede guardarse una vez seca en lugar fresco y a la sombra durante 3 semanas sin que el inoculante pierda efectividad, conservando a una temperatura de 21oC.

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 Pelleteado: Consiste en revestir a al semilla con un adhesivo, el inoculante y finalmente con polvos impalpables como carbonato de calcio, hiperfosfato, harina de huesos, superfosfato, sangre desecada, etc. Las razones para su uso son las siguientes: - Protege a los rizobios de los rayos solares cuando se siembra al voleo y de las sequías al sembrar en líneas. - Proporciona mayor período de supervivencia de las bacterias sobre la semilla (hasta un mes). - Protege las bacterias en suelos ácidos y permiten aplicar fertilizantes ácidos junto con la semilla inoculada. - Al separar el inoculante del tegumento de las semillas, protege al rizobio de las sustancias dañinas que pueden contener éstos. 3.1.2. Inoculación con Azospirillum y Pseudomonas La producción de inoculantes a base de estas rizobacterias y sus formas de aplicación son similares a las realizadas para los inoculantes de rizobios. 3.1.3. Inoculación con hongos micorrícicos En general los hongos ectomicorrícicos se incorporan a los cultivos de árboles, en particular de pinos, abetos y otras coníferas, así como a plantas ornamentales, cuando estas se desarrolloan en medios artificiales como vermiculita, arena etc. en el vivero. La falta de micorrización puede acarrear problemas en el transplante de estos cultivos, salvo que el suelo contenga especies ectomicorrícicas. 3.1.3.1. Técnicas de inoculación:  Con suelo o mantillo o trozos de raíces colonizadas que se trasladan desde la zona de origen del cultivo, a los viveros. Esta técnica es poco específica y se corre el riesgo de llevar también microorganismos patógenos.  Con esporocarpos, esporas, esclerocios, frescos o secos que se agregan a las macetas regando con un licuado en agua.  Con cultivos puros: Los suelos o los soportes de plantas se fumigan frecuentemente para eliminar patógenos y la población nativa que puede competir con el inóculo. 3.2. Calidad de los inoculantes La calidad de los inoculantes dependerá de la concentración adecuada de microorganismos PGPR y la ausencia de contaminantes durante toda la vida útil del producto siendo éstas las características fundamentales para garantizar la calidad del mismo. La realización de recuentos de bacterias viables en el inoculante y estimaciones del número más probable de bacterias en el mismo, con capacidad de nodular (en el caso de rizobios) en condiciones controladas, permiten establecer durante el periodo entre la fabricación y el vencimiento del inoculante si la calidad de este se mantiene durante su vida útil en los niveles requeridos para ejercer su función. El control de calidad de los inoculantes está siendo estandarizado por la Red de Calidad de Inoculantes (REDCAI). 5. Bibliografía consultada Bach Álvarez T., M. Díaz. 2008. Las rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR) en la agricultura. Agricultura orgánica. Pp 35-38. Ferraris, G. 2010. Microorganismos con efecto promotor de crecimiento (PGPM) en cultivos extensivos. Impacto sobre los rendimientos, eficiencia de uso de los nutrientes y otros caracteres de interés agronómico. En: García de Salamone, I., Cassán, F (Eds).Taller Internacional sobre de Rizosfera, Biodiversidad y Agricultura Sustentable. Cátedra de Microbiología Agrícola-FAyA-UNSE. 2014. Prof Titular Ing Msc Ada Albanesi; JTP Ing. Mag. Analia Anriquez; Ayud. Prof. Ing. Juan Silberman

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Lara C., L. Oviedo, A. Alemán. 2011. Aislados nativos con potencial en la producción de ácido indol acético para mejorar la agricultura. Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial. Vol 9 No. 1 ( 17 -23). REDCAI 2006. Control de Calidad de Inoculantes en Leguminosas. Documento de Procedimientos Nº1. División de Microbiología Agrícola y Ambiental (DIMAYA) de la Asociación Argentina de Microbiología. AAM. Rives N., Y. Acebo, A. Hernández. 2007. Bacterias promotoras del crecimiento vegetal en el cultivo del arroz (Oryza sativa). Perspectivas de su uso en Cuba. Cultivos tropicales. Vol 28, N° 2, p 29-38. Sarabia Ochoa M., R. Madrigal Pedraza, M. Martinez Trujillo, Y. Carreón Abud. 2010. Plantas, hongos micorrízicos y bacterias: su compleja red de interacciones. Biológicas 12 (1) 65-75. Frioni, L. 2006. Microbiología: Básica, ambiental y agrícola. Facultad de Agronomía. Universidad Nacional de la República, Uruguay Caballero-Mellado J. 2006. Microbiología agrícola e interacciones microbianas con plantas. Rev. Latinoam. Microbiol. Vol. 48, No. 2 pp. 154 - 161

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Carrera de Ingeniería Agronómica Cátedra de Microbiología Agrícola Año 2014 Guía de Trabajo Práctico Nº 7 Interacciones plantas, bacterias y hongos formadores de micorrizas. Inoculantes Objetivos: Que el estudiante: - aprenda a realizar evaluaciones en laboratorio y a campo de la nodulación en la asociación rizobio-leguminosa. - aprenda a aislar e identificar rizobios a partir de leguminosas de importancia agronómica. - aprenda los métodos de inoculación y pelleteado de semillas de leguminosas. - reconozca esporas, vesículas y arbúsculos de hongos endomicorrícicos en raíces teñidas. - reconozca inóculos de hongos ectomicorrícicos Actividades: 1) Realizar observaciones de nodulación en ensayos a campo. a-Descripción de la nodulación - desenterrar una leguminosa, eliminar la tierra mediante un lavado enérgico y reconocer sobre raíces y raicillas la presencia de nódulos. - realizar la descripción de los nódulos, en cuanto a su forma, tamaño, ubicación y coloración interna. Es importante tener en cuenta que las características mencionadas antes, varían según las especies de leguminosas. Los nódulos eficientes son grandes, están en raíz principal o cuello y al corte son rojizos (por la leghemoglobina), mientras que los nódulos no eficientes son pequeños, ubicados en raíz secundaria, y coloración interna verdes o marrones. b- Observación de rizobios en el nódulo obtenidos mediante el siguiente procedimiento - cortar un nódulo y aplastarlo sobre dos portaobjetos. - realizar un extendido con el líquido que proviene del nódulo aplastado, secar y fijar. - hacer una coloración simple y examinar al microscopio. c- Observación de rizobios en el medio de cultivo - describir la forma, tamaño, color de las colonias. - realizar un frotis con los rizobios provenientes de un medio de cultivo sólido. - realizar una coloración de Gram o coloración simple y observar en el microscopio con objetivo de inmersión. d- Sembrar, para aislar de rizobios, a partir de nódulos de leguminosas mediante el siguiente procedimiento - elegir el mejor nódulo con el trocito de raíz. - lavar para eliminar la tierra superficial. - sumergir en alcohol 70º, 1 minuto y luego en una solución de NaClO al 3% (lavandina diluida) entre 1-3 min. - eliminar el NaClO lavando sucesivamente con agua ésteril. Cátedra de Microbiología Agrícola-FAyA-UNSE. 2014. Prof Titular Ing Msc Ada Albanesi; JTP Ing. Mag. Analia Anriquez; Ayud. Prof. Ing. Juan Silberman

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- colocar el nódulo sobre un portaobjeto previamente esterilizado por flameado y con otro porta estéril aplastarlo. - estriar con ansa el líquido proveniente del interior (que contiene la suspensión de bacterias), sobre una placa que contiene el medio de cultivo específico para Rhizobium (agar- extrato de levadura-manitol). - incubar a 28ºC. - observar las colonias que aparecen a los 2-3 días (crecimiento rápido) y a los 7 días (crecimiento lento). -estriar en el medio de cultivo colonias aisladas, con características típicas y repicar en el mismo medio a bisel. - identificar el aislamiento, sólo con una prueba de infección o serológica. 2) Inocular semillas de Medicago sativa con inoculantes comerciales mediante los siguientes procedimientos: a- Preinoculación: - Preparar la solución adherente: cellofax A (metil-etil-celulosa) al 5% ó goma arábiga al 40% - Mezclar la solución adherente con el inoculante - Agregar sobre las semillas de leguminosa b- Pelleteado: - Preparar la solución adherente: cellofax A (metil-etil-celulosa) al 5% ó goma arábiga al 40% - Mezclar la solución adherente con el inoculante - Agregar la mezcla sobre las semillas de leguminosa - Recubrir con el polvo de recubrimiento: carbonato de calcio al 30 %, talco al 35%, bentonita al 35 %, yeso, etc. 4) Analizar y discutir los resultados obtenidos (Tabla 1) en un estudio de evaluación a campo, de la respuesta de la soja (Glycine max) inoculada con dos cepas seleccionadas de rizobio. Tabla 1. Componentes de Rendimiento. Medias de rendimiento (kg ha-1), Indice (IC), peso de 100 semillas (g) y número de semillas por metro cuadrado (sem m2). 100 semillas -1 Tratamiento Rendimiento (kg ha )* IC (g) Testigo 1354 a 0,28 a 10,92 a Fertilizado 2035 b 0,32 a 11,60 a Cepa 1 1470 a 0,32 a 11,22 a Cepa 2 1513 ab 0,32 a 11,73 a Letras distintas indican diferencias significativas. *** p=0,06

de cosecha

Sem m2 1239 a 1785 a 1323 a 1279 a

5) Analizar y discutir los resultados obtenidos (Tabla 2), en un estudio de evaluación a campo, de la respuesta de alfalfa (Medicago sativa) coinoculada con Azospirillum brasilense y Rhizobium meliloti. Tabla 2. Medias de número de plantas de alfalfa (plantas m-2) y materia verde de alfalfa (g m-2) Tratamiento Número de plantas m-2 Materia verde (g m-2) Sin Azospirillum brasilense 128 97 Con Azospirillum brasilense 180 124

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6) Analizar y discutir los resultados obtenidos (Tabla 3), en un estudio de evaluación a campo, de la respuesta del maíz (Zea mays) coinoculado con Pseudomonas fluorescens y Azospirillum brasilense.

Tabla 3: Materia seca (MS), contenidos de fósforo (P) en órganos aéreos y radicales de plantas de maíz en V4 y rendimiento medio. Tratamiento MSaérea MSraíces MStotal P aéreo P P Rendimiento -1 -1 -1 -1 (kg ha ) (kg ha ) (kg ha ) (kg ha ) raíces total (kg ha-1) (kg ha- (kg 1 ) ha-1) Testigo 275,24 77,38 352,62 1,158 0,354 1,511 8691,1 Pseudomonas 255,71 83,57 339,29 1,271 0,415 1,687 9055,9 Pseudomonas+ 252,38 88,81 341,19 1,282 0,416 1,698 9286,3 Azospirillum

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