Carrera de Ingeniería Agronómica Cátedra de Microbiología Agrícola Año 2014

Serie Didáctica Control microbiano 1. Introducción El trabajo experimental con microorganismos tiene en cuenta una serie de factores físicos y químicos que:  modifican la velocidad de crecimiento;  condicionan la distribución de los microorganismos en sus ecosistemas y hábitats naturales;  permiten controlar el crecimiento microbiano, por medio de la fijación de parámetros para: la mutagénesis, la esterilización, desinfección y la quimioterapia. El control microbiano se efectúa por muerte de los organismos o por inhibición de su desarrollo. En general la muerte de todos los organismos se llama esterilización Esterilización es un término absoluto que implica la pérdida de la viabilidad o la eliminación de todos los microorganismos contenidos en un objeto o sustancia. Se entiende por pérdida de viabilidad la pérdida irreversible de la capacidad de reproducción sin que ello signifique, necesariamente, la destrucción o desaparición de la totalidad de las estructuras microbianas. Eliminación se refiere a separar las estructuras microbianas presentes en un fluido, por ej la utilización de filtros. Los principales tipos de factores que permiten controlar el crecimiento microbiano se muestran en la Tabla 1. Tabla 1. Principales factores físicos y químicos que permiten controlar el crecimiento microbiano Físicos Químicos Temperatura Desinfectantes y antisépticos Desecación Quimioterápicos de síntesis Presión Antibióticos Radiaciones Los efectos que un determinado factor puede ejercer sobre los microorganismos son:  impedir el crecimiento microbiano (ej. bacteriostático si se trata de bacterias);  destruir (matar) al microorganismo (ej. bactericidas si se trata de bacterias),  lisar la célula microbiana (ej. bacteriolítico si se trata de bacterias). 1.1. Régimen de mortalidad de los microorganismos Para entender en que se basa la esterilización por agentes letales, es necesario conocer el régimen de mortalidad de los microorganismos. Cuando las bacterias se exponen a un agente físico o químico, la muerte no se presenta en forma instantánea y simultánea en toda la población. La velocidad con que muere un organismo, en condiciones uniformes, sigue una 1 Cátedra de Microbiología Agrícola-FAyA-UNSE. 2014. Prof Titular Ing Msc Ada Albanesi; JTP Ing. Mag. Analia Anriquez; Ayud. Prof. Ing. Juan Silberman

Log Nº supervivientes/unidad

relación definida, es decir que el fenómeno de la muerte de una población tiene una interpretación estadística. La cinética de muerte es casi siempre exponencial. El número de supervivientes decae geométricamente con el tiempo. Si en un período de tiempo dado se destruye una determinada fracción de células, la misma fracción de las restantes células viables será aniquilada en el período subsiguiente de igual duración. Es decir, si en el primer minuto muere el 90% de la población inicial, en el segundo minuto se habrá destruido el 99%, después del tercer minuto el 99,9% y así sucesivamente. Si se representa el logaritmo del número de sobrevivientes en función del tiempo se obtiene una línea recta (Figura 1), la cual muestra la naturaleza exponencial de la muerte de una población bacteriana. La pendiente de esta recta representa la velocidad de muerte de la población. 10 8 6 4 2 0 tiempo de exposición

Figura 1: Logaritmo del número de supervivientes en función del tiempo de exposición En la aplicación de cualquier agente esterilizante hay que considerar tres factores:  velocidad de muerte de los microorganismos que se van a destruir. Este factor depende de la naturaleza e intensidad del agente letal.  tiempo de exposición al agente letal.  tamaño inicial de los microorganismos. 2. Acción de los agentes físicos 2.1. Temperatura La temperatura es uno de los parámetros ambientales más importantes que condicionan el crecimiento y la supervivencia de los microorganismos. Cada microorganismo muestra una curva característica de tasa de crecimiento en función de la temperatura, donde se distinguen:  temperatura óptima: permite la máxima tasa de crecimiento  temperatura mínima: por debajo de ella no hay crecimiento, debido al descenso de la fluidez de la membrana celular; aumento de la viscosidad del citoplasma y debilitamiento de los enlaces hidrófobos de las proteínas.  temperatura máxima: por encima de ella tampoco existe crecimiento, debido a la desnaturalización e inactivación de proteínas enzimáticas esenciales; colapsamiento de la membrana citoplásmica y lisis térmica del microorganismo. 2.1.2. Uso letal del calor La esterilización se puede lograr por calor húmedo o por calor seco, y se debe a la desnaturalización de proteínas y a la fusión de lípidos de membrana, debido a que se rompen muchos enlaces débiles. Estos enlaces se rompen más fácilmente por calor húmedo (en 2 Cátedra de Microbiología Agrícola-FAyA-UNSE. 2014. Prof Titular Ing Msc Ada Albanesi; JTP Ing. Mag. Analia Anriquez; Ayud. Prof. Ing. Juan Silberman

atmósfera saturada de vapor de agua), debido a que las moléculas de agua pueden desplazar a los puentes de hidrógeno. 2.1.2.1. Calor húmedo La inactivación por calor húmedo requiere menores temperaturas que la que se realiza en ausencia de agua. Los métodos principales de lograr esterilización de materiales por calor húmedo son: 2.1.2.1.1. Autoclave Ideado por Chamberland en 1884, es un aparato que permite calentar muestras por calor húmedo a temperaturas superiores a las de ebullición del agua (sin que ésta hierva), debido a que el tratamiento se efectúa en un compartimento estanco saturado con vapor de agua y a presiones superiores a la atmosférica. Cuando el vapor saturado encuentra un objeto frío, se condensa formando agua, libera el calor latente de condensación y aumenta la temperatura del objeto a esterilizar. La temperatura que alcanza el autoclave a diferentes presiones y el tiempo que se necesita para la esterilización se indican en la Tabla 2. Tabla 2. Relación entre las distintas temperaturas que alcanza el autoclave bajo determinadas presiones y el tiempo necesario para realizar la esterilización. Presión (kg cm-3) 1,1 1,45 2,2

Temperatura (ºC) 121 126 134

Tiempo (minutos) 15 10 3

Lo usual es esterilizar a 121ºC durante 15 min. Esta temperatura se alcanzará si en el interior de la cámara hay vapor puro y no vapor mezclado con aire. Por la ley de Dalton (presiones parciales), la presión total absoluta de la mezcla será igual a la suma de las presiones absolutas individuales. Por lo tanto, para una determinada presión total dada cuanto mayor sea la proporción de aire presente, menor será la presión parcial del vapor y menor la temperatura de la mezcla. Por esto es muy importante permitir que el vapor fluente desplace totalmente el aire de la cámara, antes que la presión aumente (purgado del autocave). El autoclave es un elemento esencial en un laboratorio de microbiología. Con éste se esterilizan, habitualmente, medios de cultivo, soluciones, cultivos bacterianos que se desechan y todo material termoresistente que no sea afectado por el vapor de agua. Productos no miscibles con el agua, no dejan penetrar vapor, como grasas, aceites, etc. y no se esterilizan en autoclave. 2.1.2.1.2. Tindalización Recibe este nombre en honor a John Tyndall quien ideó este método de esterilización fraccionada para materiales que se inactivan o estropean a más de 100oC (termolábiles) y consiste en someter el material a tres fases sucesivas: 1º fase: el material se calienta a una temperatura entre 50 y 100oC, durante 1 ó 2 horas donde mueren todas las células vegetativas de la muestra, pero permanecen viables las esporas, que quedan activadas para germinar; 2º fase: el material se incuba en una estufa, a 30-37oC durante 24 horas, donde se produce la germinación de las esporas activadas en la fase anterior. 3º fase: se procede igual que en la primera provocando la muerte de las células vegetativas procedentes de la germinación en la fase anterior. Este método es bastante engorroso y consumidor de tiempo por lo que para materiales o sustancias termolábiles se usa, habitualmente, la filtración. 3 Cátedra de Microbiología Agrícola-FAyA-UNSE. 2014. Prof Titular Ing Msc Ada Albanesi; JTP Ing. Mag. Analia Anriquez; Ayud. Prof. Ing. Juan Silberman

2.1.2.1.3. Uperización Es un tratamiento de calor húmedo donde se emplean temperaturas muy altas durante unos pocos segundos. Así se eliminan sólo los posibles microorganismos patógenos que pueden contaminarla, y que son más sensibles al calor que los saprófitos inofensivos. En la leche, con esta inactivación parcial de la población microbiana se logra que ésta se conserve durante unos días, sin alterar apenas sus cualidades organolépticas y nutricionales. Los procedimientos más habituales para lograrlo son: Pasteurización (en honor a Pasteur, que la introdujo en los años 1860) consiste en tratar la leche a 63oC durante 30 min, tras los cuales se enfría y envasa rápidamente. No se usa actualmente. Pasteurización instantánea (también conocida por sus siglas en inglés HTST, de high temperature-short time) se logra calentando a 72oC durante sólo 15 segundos, tras de lo cual la muestra se enfría rápidamente. Esta técnica es la más usada actualmente, ya que es rápida; eficiente; altera menos el sabor; actúa en flujos continuos (y permite procesar grandes volúmenes de leche). Tras la pasteurización, el número de bacterias viables desciende un 97-99%. Los potenciales patógenos que pueda llevar la leche (Brucella, Salmonella, bacilo tuberculoso, Streptococcus, etc) son eliminados fácilmente. Aplicaciones principales del calor húmedo:  En la práctica cotidiana del laboratorio de microbiología, en la esterilización de medios de cultivo y soluciones.  En la esterilización de material quirúrgico.  En la esterilización, en las industrias alimentarias (conservas, leche y derivados). 2.1.2.2. Calor seco La esterilización por calor seco necesita mayores temperaturas que la efectuada por el calor húmedo, ya que al no existir agua, la rotura de puentes de hidrógeno y la desnaturalización de proteínas, así como la fusión de membranas, se efectúan a mayores energías. Otros efectos del calor seco son los daños por oxidación y el provocar un aumento de la concentración de electrolitos. Aplicaciones del calor seco:  El horno de Pasteur, mediante calentamiento a 160oC durante 2 horas (o 180ºC durante 1 h) permite esterilizar materiales inertes de laboratorio resistentes al calor: material de vidrio y metálico, etc.  Flameado a la llama (hasta el rojo) de ansas metálicas de siembra, con las que se inoculan las bacterias.  Incineración de materiales de desecho. 2.1.3. Uso de las bajas temperaturas para el control microbiano Las bajas temperaturas (por debajo de la temperatura mínima) no son útiles para la esterilización ya que, aunque existen algunas bacterias que mueren por congelación, el efecto de este tratamiento es sobre todo microbiostático, sin contar aquellos organismos psicrófilos. Los efectos de someter una suspensión microbiana a temperaturas menores de 0oC dependen del medio donde están suspendidas y del modo en que se realice la congelación y una ulterior descongelación. Aplicaciones de la congelación:  Preservar muestras bacterianas durante largos periodos de tiempo. Una vez congeladas (en nieve carbónica; en nitrógeno líquido), las bacterias supervivientes conservan

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su viabilidad durante mucho tiempo. Por esto, este método es usado en el laboratorio para guardar cultivos durante largas temporadas. 2.2. Desecación La desecación al aire (sin vacío) mata a las células vegetativas microbianas, pero no a las endosporas bacterianas. La sensibilidad a la desecación varía de una especie a otra. Las causas de la muerte son, principalmente:  el aumento de concentración intracelular de sales, lo que conlleva efectos tóxicos y desnaturalizantes de proteínas;  daños por oxidación. La mayor eficacia de la desecación al aire se logra con 50% de humedad relativa. 2.3. Presión Alta presión: aplicada a soluciones líquidas se transfiere de un modo instantáneo y uniforme a través de muestra. Si la presión es suficientemente alta se alteran las estructuras moleculares de las proteínas e hidratos de carbono, lo que da como resultado la rápida inactivación de las formas vegetativas de las bacterias. Las endosporas son relativamente resistentes a la alta presión. Sin embargo pueden ser destruidas por otras técnias, como por ejemplo la combinación de alta presión con temperaturas elevadas o por ciclos de presión alternante, que produzcan la germinación de las esporas, seguidas de la muerte de las vegetativas causadas por la presión. Aplicaciones de la presión osmótica:  alimentos como por ejemplo jugos de fruta conservados mediante tratamientos con alta presión. Una ventaja es que estos tratamientos conservan los sabores, los colores y los valores nutritivos de los alimentos. Presión osmótica: la utilización de altas concentraciones de sales y azucares para conservar alimentos se basa en efecto de la presión osmótica. Las altas concentraciones de estas sustancias crean un ambiente hipertónico que determinan que el agua abandone la célula microbiana. Este método se parece a la desecación, ya que ambos métodos privan a la célula del agua necesaria para su desarrollo. Como regla general, los hongos filamentosos y las levaduras son mucho más capaces que las bacterias de crecer en ambientes con baja humedad y altas presiones osmóticas. Aplicaciones de la presión osmótica:  conservación de alimentos. Por ejemplo se utilizan concentraciones altas de sales para curar carnes y de azúcar para conservar frutas. 2.4. Liofilización Es la desecación al vacío de una muestra previamente congelada. Es uno de los métodos que mantiene por más tiempo la viabilidad de los microorganismos (varios años). La eliminación de toda el agua sobre la muestra congelada aumenta la viabilidad de ésta, que se guarda en ampollas cerradas de vidrio a temperatura ambiente. 2.5. Radiaciones Los principales tipos de radiaciones que pueden tener efectos sobre los seres vivos se muestran en la Tabla 3.

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Tabla 3: Radiaciones electromagnéticas con sus diferentes longitudes de onda. Radiación electromagnética  (longitudes de onda, en nm) Radiación infrarroja (IR) 800-106 Radiación visible 380-800 Ultravioleta (UV) 13,6-380 Rayos X 0,14-13,6 0,001-0,14 Rayos  Rayos cósmicos < 0,001 Las radiaciones, según provoquen o no ionizaciones en el material, serán radiaciones ionizantes o no ionizantes respectivamente. 2.5.1. Radiaciones ionizantes El principal efecto de la radiación ionizante es la ionización del agua que produce radicales hidroxilos (OH) altamente reactivos, que reaccionan principalmente con el ADN. Los efectos de las radiaciones ionizantes (rayo X y rayos ) son letales, tanto directos como indirectos, así como mutagénicos. Los efectos letales directos se logran a altas dosis de radiación, mientras que los letales indirectos y mutagénicos se consiguen a menores dosis. Aplicaciones de las radiaciones ionizantes:  esterilización de material farmacéutico;  esterilización de material médico-quirúrgico (guantes de cirujano, suturas de nylon, jeringas desechables, agujas, bisturíes, catéteres, prótesis, etc);  esterilización de alimentos envasados (aunque en algunos países aún sigue abierta la polémica por parte de ciertos grupos sobre la seguridad de este tratamiento). Debido al gran poder penetrante de las radiaciones hay que mantener normas y controles de seguridad muy estrictos en su manipulación: planchas protectoras de plomo y revisiones periódicas de los manipuladores. 2.5.2. Radiaciones no ionizantes La radiación UV tiene un efecto letal y mutagénico, que depende de su longitud de onda. Esto se debe a la absorción selectiva de longitudes de onda por parte de ciertas moléculas biológicas. Los rayos UV no tienen actividad ionizante, pero provocan cambios químicos en las moléculas absorbentes, de modo que aparecen moléculas alteradas denominadas genéricamente fotoproductos. Éstos originan la inactivación del ADN provocando efectos letales primarios y efectos mutagénicos secundarios. Los fotoproductos principales generados por la luz UV en el ADN derivan principalmente de alteraciones en las bases pirimidínicas (citosina, timina) y se denominan dímeros de pirimidina. El principal es el dímero de timina (T-T), aunque también se producen T-C y C-C. Se trata de uniones entre dos pirimidinas adyacentes en la misma hebra de ADN, mediante la creación de un anillo de ciclobutano. Su efecto principal es la distorsión local de la configuración de la doble hélice, que interfiere en el normal emparejamiento de bases complementarias; ello, a su vez, provoca una interferencia en los procesos de replicación y transcripción, y secundariamente en el crecimiento y la respiración. El ADN dispone de mecanismos para paliar o eliminar estas modificaciones potencialmente lesivas, reparando el daño por enzimas que actúan mediante dos mecanismos: la fotoreactivación y la reactivación oscura. Aplicaciones de la luz UV El uso práctico de la luz UV como agente esterilizante está limitado, ya que tiene poco poder penetrante: no entra en objetos sólidos, y además se ve apantallada por el cristal y 6 Cátedra de Microbiología Agrícola-FAyA-UNSE. 2014. Prof Titular Ing Msc Ada Albanesi; JTP Ing. Mag. Analia Anriquez; Ayud. Prof. Ing. Juan Silberman

penetra poco en los líquidos. Su aplicación concreta más frecuente es en el control de infecciones por vía aérea: lámparas de desinfección en salas de hospitales y de laboratorios de investigación. También se emplea como agente mutagénico en bacterias. 3. Acción de los agentes químicos A los agentes químicos se los clasifica en: Agentes desinfectantes (o germicidas) son agentes (sobre todo químicos) antimicrobianos capaces de matar los microorganismos patógenos (infecciosos) de un material. Pueden (y en muchos casos suelen) presentar efectos tóxicos sobre tejidos vivos, por lo que se suelen emplear sólo sobre materiales inertes. Ej. compuestos de cloro, compuestos fenólicos. El fenol y derivados fenólicos ejercen su actividad antimicrobiana al lesionar la membrana plasmática que contienen lípidos, lo que determina la pérdida del contenido celular. El cloro cuando se combina con agua forma el ácido hipocloroso que es un agente oxidante fuerte que impide el funcionamiento del sistema enzimático celular. El yodo altera la síntesis proteica y la membrana celular, al parecer por la formación de complejos con los aminoácidos y ácidos grasos insaturados. Agentes antisépticos son sustancias químicas antimicrobianas que se oponen a la sepsis o putrefacción de materiales vivos. Se trata de desinfectantes con baja actividad tóxica hacia los tejidos vivos donde se aplican. Ej alcohol, solución de yodo, espadol, agua oxigenada. El alcohol es eficaz para eliminar bacterias y hongos pero no las endosporas y virus sin envoltura. El mecanismo de acción suele ser la desnaturalización de proteínas pero también puede alterar la membrana y disolver lípidos, entre ellos el componente lipídico de virus envueltos. Dos de los alcoholes más utilizados son el etanol e isopropanol. La concentración óptima de etanol es 70%. El etanol puro es menos eficaz que las soluciones acuosas, ya que la desnaturalización requiere agua. Agentes quimioterápicos son compuestos químicos con actividad microbicida o microbiostática, con una toxicidad suficientemente baja como para permitir su administración a un organismo superior, en cuyos fluidos corporales y tejidos permanece estable un cierto tiempo a concentraciones tales que los hace eficaces como antimicrobianos dentro del organismo. Estos son quimioterápicos de síntesis y antibióticos. Desinfectantes y antisépticos Los factores que afectan la potencia de un desinfectante son:  Concentración del agente y tiempo de actuación  pH  Temperatura  Naturaleza del microorganismo y otros factores asociados a la población microbiana: especie; fase de cultivo; presencia de cápsulas o de esporas; número de microorganismos iniciales; presencia de materiales extraños. Los desinfectantes se suelen clasificar de acuerdo con su mecanismo de acción: a) Agentes que dañan la membrana: solventes orgánicos (compuestos fenoles, alcoholes) y los desinfectantes tensioactivos (detergentes). b) Agentes desnaturalizantes de proteinas: ácidos y bases fuertes y ácidos orgánicos no disociables. c) Agentes modificadores de grupos funcionales: metales pesados, agentes oxidantes, colorantes y agentes alquilantes.

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Aplicaciones de los desinfectantes y antisépticos  En la conservación de alimentos (ej. ácidos orgánicos como el ácido benzoico y el ácido sórbico). Ciertos ácidos, como el acético, láctico, propiónico aparecen en alimentos fermentados, actuando como conservantes naturales. Estos mismos, así como el cítrico se pueden añadir a otros tipos de alimentos, para prolongar el periodo de posible almacenamiento de los productos.  Se utilizan en medicina como antisépticos de la piel y heridas, en productos farmacéuticos, cosméticos y oftalmológicos.  En agricultura se usan compuestos de cobre para el control de hongos y algas.  En tratamientos de agua y en la desinfección de equipamientos y maquinarias de industrias alimentarias y lácteas (ej. cloro).  Desinfección de superficies inertes y equipos quirúrgicos (ej. agua oxigenada)  Esterilización de cámaras de cría de animales líbres de gérmenes (ej. ácido peracético en forma de vapor).  Antisépticos de lesiones dermatológicas, infecciones de la piel y pequeñas heridas (tinturas de colorantes básicos)  Descontaminación de habitaciones, en la preservación de tejidos, en líquidos de embalsamamiento, en la esterilización de instrumental quirúrgico (ej. agentes alquilantes). 4. Filtros esterilizantes Son métodos basados en la separación de los microorganismos. Consiste en hacer pasar una solución a través de una membrana o filtro de un tipo de material (normalmente nitrato de celulosa) que presenta poros de un tamaño inferior al de cualquier célula bacteriana (diámetro de poro = 0,22 m). Los microorganismos quedan retenidos por el pequeño tamaño de los poros del filtro y con algunos tipos de materiales filtrantes por adsorción sobre los mismos, además de la influencia del pH del líquido sobre las cargas de los microorganismos y el filtro. Comúnmente en el laboratorio se usan membranas de ésteres de celulosa con porosidades de 0,45 µm ó 0,2 µm, pero también suelen usarse en otros casos filtros de porcelana. Cuando se quiere eliminar microorganismos del aire se utilizan filtros de aire, como en las cámaras de flujo laminar estéril. 5.Controles de la eficiencia de la esterilización y de la esterilidad 5.1.Control de esterilización: es el que se realiza para comprobar si se cumplieron las condiciones del método empleado. Puede ser:  Biológico: mediante preparaciones estandarizadas de microorganismos específicos relativamente resistentes al proceso de esterilización empleado, son procesados junto con el material a esterilizar y luego son inoculados en medios de cultivo apropiados, incubándose por un período determinado de tiempo.  Físico-químico: - Termocupla --Sustancias químicas: de punto de fusión conocido y bien definido. Para tratamientos de 121ºC se puede usar anhídrido succínico (pF= 120ºC) ó ácido benzoico (pF = 121ºC). Estas sustancias se mezclan con un colorante y al fundir éste difunde libremente. Si tales compuestos son sellados en tubos capilares, solo indican la temperatura alcanzada. --Esterilómetro: tiras de papel marcadas con óxidos minerales, cambian de color al alcanzar determinadas temperaturas. Hay algunas que indican temperatura y tiempo. 5.2. Control de esterilidad: se realiza sobre muestras o alícuotas del material esterilizado con el objeto de comprobar la total ausencia de microorganismos en el mismo

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6. Bibliografía consultada Gerard J. Tortora, Berdell R. Funke, Christine L. Case. 2007. Introducción a la microbiología 9ª ed. Buenos Aires: Médica Panamericana. 988p.

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Serie Didáctica Medios de cultivo 1. Introducción Un medio de cultivo es una mezcla balanceada de nutrientes a concentraciones tales que permiten un buen crecimiento. Este debe contener todos los nutrientes necesarios para el desarrollo de los microorganismos para lo que fue diseñado, por lo que su elaboración debe estar basado en los principios de la nutrición. La nutrición es el proceso por el que los seres vivos toman del medio donde habitan las sustancias químicas que necesitan para crecer. Dichas sustancias se denominan nutrientes, y se requieren para dos objetivos:  fines energéticos (reacciones de mantenimiento);  fines biosintéticos (reacciones plásticas o anabolismo). Todos los microorganismos, sean autótrofos (utilizan una fuente inorgánica de carbono) o heterótrofos (utilizan una fuente de carbono orgánica), necesitan tomar del ambiente una serie de elementos químicos, que se pueden clasificar (según las cantidades en que son requeridos) como macronutrientes (C, H, O, N, P, S, K, Mg), y micronutrientes o elementos traza (Co, Cu, Zn, Mo). En la naturaleza, estos elementos se encuentran combinados, formando parte de sustancias orgánicas y/o inorgánicas. La aplicación práctica de la nutrición microbiana, se plasma sobre todo en el diseño de medios de cultivo para manipular a los microorganismos en el laboratorio. Normalmente los medios de cultivo se preparan diluyendo en agua sales minerales, una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y, eventualmente, factores de crecimiento. Los suplementos varían de acuerdo a las necesidades nutricionales de los organismos particulares a crecer. Además, es necesaria una concentración adecuada de iones hidrógeno, para las distintas actividades metabólicas.  Agua: los microorganismos necesitan grandes cantidades de agua ya que ésta es el principal constituyente del protoplasto microbiano; el medio universal donde ocurren las reacciones biológicas y un reactante en exceso (es decir, un producto resultante de algunas reacciones bioquímicas).  Sales minerales: son la fuente de aniones y de cationes para la célula y mantienen la concentración osmótica necesaria para que los microorganismos puedan desarrollar todas las funciones vitales.  Fuente de carbono: suministra la posibilidad de utilizar la energía química almacenada en la molécula  Fuente de nitrógeno: fines plásticos ya que el N forma parte de los aminoácidos (sillares de las proteínas) y de las bases nitrogenadas (que participan en los ácidos nucleicos y en algunas coenzimas). Aquellos procariotas que fijan N2 del aire en vida libre no requieren N en los medios de cultivo.

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 Factores de crecimiento: suelen ser coenzimas o sus precursores, vitaminas, que determinados microorganismos no pueden fabricar por sí mismos, al carecer de parte o de toda una ruta biosintética (ej. biotina, niacina, tiamina, ácido pantoténico). 2. Clasificación de los medios de cultivo Los medios de cultivo se pueden clasificar según: la naturaleza de sus constituyentes, la finalidad para la cual fueron formulados y el estado físico. 2.1. Naturaleza de sus constituyentes: 2.1.1. Medios complejos o indefinidos: su composición química exacta se desconoce, ya que son el producto de realizar infusiones y extractos de materiales naturales complejos (extracto de carne, de levadura, peptona de carne o de soja). Son un tipo de medio rico nutricionalmente, aunque indefinido químicamente, por lo que no se tiene un control nutricional preciso, al desconocerse la composición química y la proporción exacta de los distintos nutrientes. Contienen fuentes variadas de C y N orgánicos, sales minerales y micronutrientes Permite obtener un buen crecimiento bacteriano, su confección es fácil y rápida.  De origen animal: los más importantes son las soluciones de peptona que es un producto de degradación ácida o enzimática de proteínas, formado por polipéptidos de peso molecular tal que no son coagulables por el calor (por eso se los puede coagular). Otro producto usado es el hidrolizado de caseína, también producto de la hidrólisis ácida, usado para enriquecer los medios de cultivo. Ej: agua peptonada, caldo peptonado, medio extracto de carne  De origen vegetal: las sustancias nutritivas la constituyen los componentes naturales de los vegetales. En la papa se utiliza el almidón, débiles cantidades de sustancias nitrogenadas y sales. Ej: agar papa glucosado, agua de levadura, papa glicerada 2.1.2. Medios sintéticos o definidos: se utilizan cantidades concretas de distintas sustancias químicas puras, orgánicas y/o inorgánicas. La composición concreta de un medio sintético dependerá de la bacteria que se quiera cultivar: lógicamente, un medio definido para una bacteria con grandes capacidades biosintéticas será más sencillo que el medio definido de otra bacteria con menores posibilidades biosintéticas. 2.1.3. Medios semisintéticos: llevan algunas sustancias químicas cuya naturaleza y cantidad conocemos, junto con sustancias de naturaleza y composición indefinidas. 2.2. Finalidad para la cual fueron formulados: 2.2.1. Medios enriquecidos: se obtienen mediante el agregado de sustancias nutritivas, tales como azúcares o materias albuminosas, para obtener una cosecha microbiana abundante, crecimiento más rápido o para permitir el desarrollo de ciertos gérmenes, a los medios de cultivo comunes. Ej: agua de peptona glucosado, medios azucarados, medio agar hígado. 2.2.2. Medios selectivos: son aquellos que permiten seleccionar un tipo (o unos pocos tipos) de microorganismos. Contienen ciertas sustancias que inhiben el crecimiento de ciertas bacterias, pero permiten el crecimiento de otras. Ej: medio lactosado para el aislamiento de Enterobacterias, medios con antibióticos. 2.2.3. Medios diferenciales: son aquellos que permiten distinguir a simple vista dos o más tipos de bacterias en función de su distinto comportamiento respecto de algún nutriente del medio. Ese comportamiento diferencial se traduce normalmente en un viraje de color de una sustancia indicadora presente en el medio. Ej: medio de Endo. 2.3. Estado físico: cualquiera sea el medio de cultivo, los mismos pueden elaborarse como: medios líquidos (conocidos como caldos), sólidos o semisólidos. Para obtener éstos últimos se 11 Cátedra de Microbiología Agrícola-FAyA-UNSE. 2014. Prof Titular Ing Msc Ada Albanesi; JTP Ing. Mag. Analia Anriquez; Ayud. Prof. Ing. Juan Silberman

añade a la solución nutritiva un coloide en estado de gel (1,5-2% y 0,7% respectivamente), solidificándola.

2.3.1. Sustancias solidificantes  Gelatina: Se prepara descalcificando los huesos por ácidos fuertes, transformando la caseína en gelatina. Presenta muchos inconvenientes, ya que funde a 25oC (por encima de esta temperatura el medio se licúa), y además, muchas bacterias presentan gelatinasas que hidrolizan la gelatina.  Agar-agar: Polisacárido extraído de las algas marinas. Presenta la gran ventaja de que una vez solidificado, no funde hasta cerca de los 100oC, lo que permite su uso para la inmensa mayoría de bacterias, que son mesófilas. Una vez fundido queda líquido hasta que la temperatura descienda hasta 44ºC, haciendo posible su uso en la preparación de cajas de Petri. Es atacado por muy pocas bacterias y por ello la licuación del agar es muy rara.  Silicagel o gel de sílice: es un solidificante inorgánico que se usa para cultivar ciertas bacterias (sobre todo los quimioautótrofas). 4. Condiciones físico-químicas para el desarrollo de los microorganismos Para lograr un adecuado desarrollo de los microorganismos es necesario no sólo proveerles de un medio nutritivo sino también darle las condiciones ambientales adecuadas para su crecimiento. 4.1. Temperatura Según el rango de temperaturas al que pueden crecer los microorganismos, se pueden establecer tres tipos principales (Tabla 1): Tabla 1. Temperaturas en ºC para los distintos grupos de microorganismos Temperaturas en °C para microorganismos procarióticos Grupo mínima óptima Termófilos 40-45 55-75 Mesófilos 5-15 30-45 Psicrófiloss -5-+5 12-15

máxima 60-90 35-47 15-20

4.2. pH La mayoría de los microorganismos pueden crecer dentro de un margen de pH en su medio externo, manteniendo al mismo tiempo su pH interno óptimo prácticamente constante. Respecto del margen normal de pH a los que crecen los microorganismos, éstos se pueden clasificar en: Neutrófilos, si crecen de modo óptimo en torno a la neutralidad (entre pH 5,5 y 8). Acidófilos, si crecen normalmente a pH < 5. Alcalinófilos, si crecen a pH > 8,5 La mayoría de las bacterias son neutrófilas. Muchas bacterias neutrófilas modifican el pH del medio, y resisten ambientes relativamente ácidos o alcalinos. Por ejemplo, algunas bacterias fermentativas excretan ácidos, mientras otras alcalinizan el medio produciendo amonio a partir de la desaminación de aminoácidos. Aunque los microorganismos pueden crecer en un margen más o menos amplio de pH (alrededor de un óptimo), los cambios bruscos pueden ser lesivos, afectar a la membrana y al transporte de solutos e inhibir a las enzimas. 12 Cátedra de Microbiología Agrícola-FAyA-UNSE. 2014. Prof Titular Ing Msc Ada Albanesi; JTP Ing. Mag. Analia Anriquez; Ayud. Prof. Ing. Juan Silberman

Para la mayoría de las bacterias el pH óptimo para el crecimiento se encuentra entre 8,5 y 7,5; pocas especies son acidófilas (Thiobacillus), algunas son ácido-tolerantes (lactobacilos), pero muchas crecen en condiciones alcalinas (nitriificadores, rizobios, actinomicetos y bacterias ureolíticas). Por su parte, los hongos prefieren valores bajos de pH. Algunos organismos productores de ácidos no son ácido-tolerantes y si el medio no posee un regulador de pH (amortiguador o buffer) se autoenvenenan, por ejemplo ciertas enterobacterias. Para determinar el pH de los medios de cultivos, dos métodos son los más utilizados * Métodos colorimétricos: basados en el empleo de indicadores coloreados, sustancias que presentan la propiedad de poseer, en solución acuosa, colores diferentes según la acidez o la alcalinidad. Permiten explorar todas las escalas del pH. Pueden ser soluciones (disueltos en alcohol o en hidróxido de sodio) o bien papeles indicadores (papel embebido en soluciones indicadoras de pH) * Métodos potenciométricos: Si se sumergen en un líquido un electrodo de potencial fijo y un segundo electrodo de vidrio y se unen por medio de un galvanómetro, se establece una diferencia de potencial cuya intensidad depende de la concentración de H+ de la solución. Son de medición más exacta, de empleo más general que los colorantes y de manipulación mucho más rápida. 4.3. Concentración de oxígeno El metabolismo de los microorganismos está fuertemente influído por el oxígeno molecular. Los organismos que dependen de la respiración aeróbica, para los cuales el oxígeno molecular es el aceptor final de electrones, se conocen como aerobios estrictos. Por el contrario, los organismos anaerobios estrictos mueren con el oxígeno. Un grupo intermedio de organismos, los anaerobios aerotolerantes, pueden crecer en presencia o ausencia de oxígeno molecular, por ejemplo la levadura Saccharomyces cerevisiae que puede obtener su energía tanto de la fermentación como de la respiración. Además, están los organismos que únicamente toleran al oxígeno (aerotolerantes), como algunas bacterias lácticas que obtienen su energía exclusivamente de la fermentación sin ser dañadas por el mismo. Ciertas bacterias aeróbicas se cultivan mejor en ambientes donde la concentración de oxígeno es reducida y se las denomina microaerófilas. 4.4. Concentración de CO2 El suministro de CO2 es utilizado para el cultivo de autótrofos. Aunque la difusión del CO2 de la atmósfera en los medios de cultivo permite el desarrollo de los microorganismos, la concentración es muy baja (0,03% en el aire libre) y la proporción del crecimiento de los autótrofos está limitado por la disponibiliodad de CO2 en estas condiciones. La solución es pasar aire enriquecido en CO2 entre el 1% y el 5% de este gas (hay que tamponar el medio para evitar variaciones de pH). 4.5. Luz La luz visible es de baja energía, y no tiene efectos sobre el ADN. Sin embargo, la luz visible puede ejercer un efecto negativo indirecto, en el fenómeno de sensibilización fotodinámica. Esto es que la luz visible de fuerte intensidad (p. ej., exposición a pleno sol) es capaz de matar las bacterias, debido a que ciertas moléculas de éstas (riboflavinas, porfirinas, citocromos) absorben la energía de los cuantos y se excitan durante 10-6-10-8 seg, tras lo cual reemiten la energía a otras moléculas, originando fotooxidaciones de las proteínas y en las bases de los ácidos nucleicos. También se puede generar oxígeno singlete (1O2), que es un radical muy reactivo, oxidante, que puede destruir la célula con rapidez. Ciertas bacterias (entre ellas las fotosintéticas, y las que se propagan vía aérea) poseen abundantes pigmentos de tipo carotenoide que las protegen de estos efectos fotosensibilizadores. (Los carotenoides captan la energía del oxígeno singlete y la reenvían al estado basal, no excitado). 13 Cátedra de Microbiología Agrícola-FAyA-UNSE. 2014. Prof Titular Ing Msc Ada Albanesi; JTP Ing. Mag. Analia Anriquez; Ayud. Prof. Ing. Juan Silberman

En la práctica de laboratorio habitual, no es conveniente exponer los microorganismos en cultivo a la luz, sino que habrán de cultivarse en oscuridad, salvo el cultivo de fotótrofos (algas eucariotas, algas verdes azuladas, bacterias fotosintéticas) que toleran la iluminación continua y su crecimiento es favorecido por la luz artificial. 4.6. Efecto del potencial de óxido-reducción El potencial de óxido-reducción o el rH2, que se deduce por cálculo sirve para expresar la actividad reductora u oxidante de una solución. Cuando tenemos una atmósfera de H2, la presión de hidrógeno es 1 y su logaritmo respectivo es 0 o su rH2=0 Todo microorganismo que vive en un medio dado tiene un máximo de actividad para un valor dado de rH2 del medio y que es definido para cada especie. Este comportamiento de los microorganismos depende de su tipo respiratorio y, a su vez, está bajo la dependencia de su capacidad enzimática, y en particular de usar o no el oxígeno gaseoso como aceptor de hidrógeno al final de la cadena respiratoria. Así los aerobios estrictos desarrollan mejor cuando el rH2 > 14 mientras que los anaerobios estrictos lo hacen a partir de 7,4.

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Carrera de Ingeniería Agronómica Cátedra de Microbiología Agrícola Año 2014 Guía de Trabajo Práctico Nº 1: Control microbiano Objetivos Que el estudiante:  Aprenda técnicas microbiológicas para lograr el crecimiento de determinados microorganismos  Comprenda la importancia del control microbiano. Actividades 1. Acondicionar material para esterilizar (cajas, pipetas, tubos erlenmeyer) 2. Reconocimiento de los aparatos más comúnmente usados en el laboratorio de microbiología (estufas de esterilización, estufas de incubación, flujo laminar, microscopio, pHmetros, etc). 3. Reconocimiento de soluciones desinfectantes. 4. Reconocimiento de controles de esterilización. 5. Reconocimiento de la importancia de trabajar en esterilidad: comparar cajas de Petri con agar nutritivo luego de exponerlas a distintos ambientes e incubadas por 48 hs a 30ºC. Explicar los resultados observados. Caja Nº 1: exponer 10’ en una zona de mucha circulación; Caja Nº 2: exponer 10’ en el área del flujo laminar; Caja Nº 3: imprimir la huella del dedo pulgar sin desinfectar; Caja Nº 4 : imprimir la huella del dedo pulgar previamente desinfectado. 6. Para cada uno de los siguientes materiales: tubos de ensayo, pipetas, ansas, erlenmeyer, medios de cultivo, agua, solución de antibiótico, mesadas, cajas de Petri, flujo laminar. a) Cuál es el mejor método de esterilización. b) Cómo procedería a acondicionarlos para la correcta esterilización c) Cómo realizaría controles de esterilización 7. La tabla 1 muestra los resultados encontrados en un estudio para comparar la eficiencia de tres métodos de control microbiano del agua de mar. Los mismos fueron: i) microfiltración (dos sistemas de filtros en serie, de 1 y 0,5 µm, de polipropileno y cerámica respectivamente), ii) cuarentena (almacenada en envases plásticos opacos de polietileno de alta densidad, bien tapados y a temperatura ambiente durante cinco meses) y iii) exposición solar (en recipientes plásticos transparentes pintados de negro y sellados, expuestos al sol en piso de cemento 6 a 48 hs).

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Tabla 1. Evaluación microbiológica de agua de mar colectada en la orilla de la costa, al inicio y después de cada método de control (microfiltración, cuarentena y exposición solar). Muestra

Inicio

Micro Cuarentena filtración (cinco meses) UFC UFC mL-1 -1 mL

UFC mL-1

1 2 3

4 E. coli 0 3 E.coli, 2 Aeromonashidrophyla 3 E.coli, 1Aeromonashidrophyla 1 Vibrio alginolyticus 5 UFC E. coli

4

5

Exposición solar UFC mL-1

0 0 0

0 0 0

1 E. coli 0 0

0

1 Vibrio 0 alginolyticus

0

2 E.coli, 1 Citrobacter spp

Tiempo de exposición 6 horas 4 horas 12 horas

Temperatura máxima (ºC)

48 horas

60

1.Klebsiella 48 horas spp Oscuridad 1.Vibrio sp (testigo)

44 55 55

28

Explique:a) ¿cual es el fundamento de cada uno de los métodos empleados como control microbiano? b) ¿cual método fue más eficaz?. ¿Realizaría control de esterilización o de esterilidad? c) ¿los métodos evaluados garantizan un agua libre de enteropatógenos? d) que ventajas y desventajas podría mencionar en cada método Medios de cultivo Objetivos Que el estudiante:  Aprenda técnicas microbiológicas para lograr el crecimiento de determinados microorganismos Actividades Medios de cultivo 1. Preparar diferentes medios de cultivo (sólido, líquido, semisólido) 2. Fraccionar en tubos los medios preparados 3. En la Tabla 1 se muestra la composición química de diferentes medios de cultivo. Indicar: i) a que tipo de medio corresponden (según la naturaleza de los constituyentes, finalidad y estado físico), ii) cuál es la fuente de carbono, nitrógeno y energía, iii) qué tipos de microorganismos podrían crecer en los mismos. Medio A KH2PO4 0.5 g NaNO3 0.5 g MgSO 0,05g

Agar nutritivo Pepona 20g Extr. de lev.. 2g Extr. de carne 4g

Caldo nutritivo Pepona 20g Extr. de levadura 2 g Extr. de carne 4g

Rojo congo K2PO4 0.5 g MgSO4 7H2O 0.2 g NaCl 0.1 g

NFB Acido málico KH2PO4 MgSO4 7H2O

5g 0.5 g 0.2 g

CaCl2 NaCl FeCl3 Agua destilada pH

NaCl Agar-agar Agua destilada pH

NaCl Agua destilada pH

FeCl3 6H2O KOH Extr. de levadura Acido málico Rojo congo Agar-agar Agua destilada pH

NaCl CaCl2 2H2O FeCl3 6H2O KOH Soluc. Micronutr. Azul bromo timol Agar-agar Agua destilada pH

0.1 g 0.02 g 0.015g 4.5 g 2mL 2mL 1.8 g 1L 6.8

4

0.05g 0,05g 0,01g 1L 7,2

5g 15g 1L 7,4

5g 1L 7,4

0.015g 4.8 g 0.5 g 5g 15 mL 20 g 1L 7

4. Indique cómo prepararía un medio de cultivo y las condiciones de incubación para lograr el desarrollo de: i) hongos del suelo, ii) bacterias solubilizadoras de fosfatos, iii) bacterias oxidadoras de amonio. 16 Cátedra de Microbiología Agrícola-FAyA-UNSE. 2014. Prof Titular Ing Msc Ada Albanesi; JTP Ing. Mag. Analia Anriquez; Ayud. Prof. Ing. Juan Silberman