Universidad Autónoma de Madrid  Facultad de Ciencias   Dpto. de Biología                Caracterización clínica y molecular de distrofias de  retina (Enfermedad de Norrie) y formas maculares  (Retinosquisis y Enfermedad de Stargardt).                  TESIS DOCTORAL  Rosa Riveiro Álvarez  Madrid, 2006 

La Doctora Carmen Ayuso García, Jefa Asociada del Departamento de Genética de la Fundación Jiménez Díaz,

CERTIFICA:

Que la presente Memoria titulada: Caracterización clínica y molecular de distrofias de retina (Enfermedad de Norrie) y formas maculares (Retinosquisis y Enfermedad de Stargardt), que presenta Dña. Rosa Riveiro Álvarez para obtener el Grado de Doctor, ha sido realizada bajo mi dirección, autorizándola para su presentación al Tribunal Calificador.

Madrid, a 20 de Julio de 2006.

VB

Fdo. Dra. Carmen Ayuso García Directora de la Tesis Doctoral

Fdo. Prof. Dr. José Fernández Piqueras Tutor de la Tesis Doctoral

AGRADECIMIENTOS 

Después de casi ocho meses escribiendo, creo que ha llegado el momento en el que, por fin, os puedo dedicar unas palabras. Quiero transmitiros que, sin vosotros, la realización de este trabajo hubiese sido imposible para mí y por ello quiero daros las gracias a todos y cada uno de vosotros.

En primer lugar, quiero agradecer a las Doctoras Carmen Ayuso y Carmen Ramos que me acogiesen en el laboratorio, hace algo más de cuatro años. No sólo tengo que darles las gracias por todo lo que he aprendido, sino por su cercanía, su amabilidad y su apoyo.

De manera especial, quiero agradecer a la Doctora Carmen Ayuso la dirección incansable de este trabajo, pero sobre todo, la paciencia y la capacidad de persuasión que ha tenido con su becaria incesante.

Quiero dar las gracias a la Doctora Isabel Valverde, por haberme orientado tan bien y porque gracias a ella he tenido esta oportunidad. No me puedo olvidar de su preocupación y cariño todas las veces que hemos intercambiado unas palabras en el pasillo.

Agradezco a todos mis compañeros de la red EsRetNet su apoyo a lo largo de estos años y que hayan estado tan cerca siempre que les he necesitado.

De forma especial, quiero dar las gracias a los pacientes, ya que sin ellos no se hubiese podido realizar este trabajo. Agradezco su paciencia y su colaboración, tanto en la recogida de muestras como en la realización de los diversos estudios oftalmológicos.

Sobre todo, quiero dar las gracias a mis compañeros del Servicio de Genética de la FJD, ya que vosotros habéis sido los auténticos compañeros de diario a lo largo de estos años y por eso, quiero daros las gracias una y mil veces:

- a mi queridísima Aco, por haber compartido conmigo tu enorme conocimiento, por tu cariño y tu apoyo constante. Porque siempre que he necesitado algo, has dado lo mejor de ti misma y con creces; - a Chonny, no sólo por todo lo que me has enseñado desde el principio, sino por tu cariño, tu comprensión y por esas largas horas de terapia, que tan bien nos han venido; - a Elena, por estar siempre ahí detrás, espalda con espalda. Gracias por todo lo que hablas y aconsejas, pero también por todo lo que escuchas y comprendes, por echarme siempre una mano y conseguir que no fibrile; - a Diego y a Fer, no sólo por vuestra inestimable ayuda a la hora de corregir textos varios en inglés y solucionar problemas informáticos, respectivamente, sino por vuestra paciencia y confianza. - a Anita y a Dan, por compartir vuestros conocimientos y vuestras bromas, por todos los buenos momentos dentro y fuera del laboratorio;

- a Jesús, por enseñarme a hacer Southern y a conocer otros estilos musicales, pero sobre todo, por echarme un cable a diario y por tu gran sentido del humor; - a María G.H., por todo lo que me has enseñado, por transmitirme tu inquietud intelectual y tu tesón; - a Jana, por ser una becaria pequeña estupenda y por confiar en mí, tanto en temas moleculares como en otros más cotidianos; - a Cristina y a Míguel, por vuestro trabajo y vuestro sentido del humor y, sobre todo, por conseguir que la música no deje de sonar en el laboratorio; - a María F., por ser una fuente inagotable de conocimiento, por tu cariño y tu preocupación, por haberme echado una mano cuando te he necesitado; - a Isa, por tus inteligentes preguntas y tus brillantes comentarios, por tu ayuda inestimable y por tu constante preocupación de madre; - a Marta, por tu cariño y por no dudar en ayudar cuando se pide un favor, por el ímpetu con el que transmites tus conocimientos, sean sobre temas científicos o sobre cualquier otro; - a Aurora y a Tere, por tantas horas de charlas y risas, por conseguir que esos pequeños descansos nos desestresen a todos un poco; - a Toñi, por ser tan cariñosa conmigo, dentro y fuera de la consulta; - a nuestros últimos y estupendos fichajes, Carol, Nuria y Almu, por vuestro entusiasmo con cada cosa que aprendéis, por vuestro enorme sentido del humor y por vuestro cariño;

También quiero dar las gracias a mis compañeros del Instituto Cajal, especialmente a la Doctora Paola Bovolenta por haberme acogido durante cuatro meses en su laboratorio, y a Pilar, Jazz, Cristina e Ivan, por todo lo que me han enseñado, por su enorme paciencia y sentido del humor.

Gracias a todos mis amigos, a los de Vigo y a los de Madrid, por ser como sois, especiales. Porque aunque no nos veamos a diario, nada cambia entre nosotros y siempre estáis cerca cuando se os necesita. Mil gracias por vuestra preocupación y apoyo a lo largo de estos últimos meses.

A mis padres, por su cariño, bondad y generosidad infinitos. Por su apoyarme en mis decisiones, por comprenderme y ayudarme a diario. Porque gracias a vosotros cualquier cosa es posible.

De manera especial, quiero dar las gracias a Gonzalo, no sólo por ser un marido excepcional, sino por ser un gran amigo y compañero. Por tus inteligentes consejos, por ser mi apoyo a diario y por no dejar nunca de sorprenderme. Por contagiarte con mi alegría y, lo que es mejor, compartirla con los demás. Por ayudarme a no preocuparme cuando las cosas no tienen solución, o cuando la tienen. Mil gracias por estar siempre a mi lado.

If you wanna kiss the sky, better learn how to kneel. Misterious Ways U2

A mis padres, a mis amigos, a Gonzalo. A vosotros os dedico esta Tesis.

Índice Páginas

Prólogo

1

I‐ Introducción 1‐ El ojo humano

3

1.1- Anatomía del globo ocular

3

1.2- La retina

3

1.2.1- Desarrollo embrionario del globo ocular y de la retina

4

1.2.2- Histología de la retina

5

1.2.3- Fisiología: El proceso de fototransducción

10

2‐ Retinopatías hereditarias 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

12 

2.1- Introducción

12

2.2- Diagnóstico oftalmológico

12

2.2.1- Antecedentes personales y familiares

12

2.2.2- Exploración oftalmológica

13

2.3- Características de las retinopatías hereditarias

14

2.3.1- Heterogeneidad en el patrón de herencia

14

2.3.2- Heterogeneidad genética

15

2.3.3- Heterogeneidad clínica

16

3‐ Enfermedades congénitas de la retina 

 

 

 

 

 

 

 

16 

4‐ Enfermedad de Norrie (ND) / Vitreorretinopatía Exudativa Familiar (VREF) 

 

 

17

4.1- Rasgos clínicos

17

4.2- El gen: NDP

18

4.3- La proteína: Norrina

18

5‐ Retinopatías hereditarias centrales: Distrofias maculares 

 

 

 

 

 

19

5.1- Aspectos clínicos

19

5.2- Aspectos genéticos

20

6‐ Retinosquisis Juvenil Ligada al Cromosoma X (XLRS)

20

6.1- Rasgos clínicos

20

6.2- El gen: RS1

21

6.3- La proteína: Retinosquisina

21

Índice Páginas

7‐ Enfermedad de Stargardt (STGD) / Fundus Flavimaculatus (FFM)   

 

 

 

24 

7.1- Rasgos clínicos

24

7.2- El gen: ABCA4

25

7.3- Variantes alélicas de ABCA4

25

7.3.1- Variantes alélicas

25

7.3.2- Fenotipos asociados a defectos en ABCA4

26

7.4- La proteína: ABCA4/RmP

8‐ Perspectivas de futuro: tratamientos  

27

 

 

 

 

 

 

 

29 

8.1- Remodelación de la retina en el proceso degenerativo

29

8.2- Terapia génica

30

8.3- Retinas artificiales

31

8.4- Células madre

31

II‐ Justificación, Hipótesis de Trabajo y Objetivos

32

III‐ Pacientes y Métodos

34

1‐ Pacientes y familias estudiadas

35

1.1- Procedencia de los pacientes

35

1.2- Consulta y cuestionario inicial

35

1.3- Clasificación de las familias estudiadas

35

2‐ Metodología 

 

2.1- Obtención de ADN genómico 2.1.1- Extracción de ADN genómico

 

51  51 51

2.1.1.1- Extracción de ADN por método salino

51

2.1.1.2- Extracción automática de ADN

52

2.1.2- Espectrofotometría de ADN: lectura de la concentración

52

2.1.3- Purificación de ADN genómico

53

2.2- Estudio genético directo 2.2.1- Reacción en Cadena de la Polimerasa: PCR

54 55

2.2.1.1- Condiciones de la PCR

55

2.2.1.2- Cebadores

55

2.2.1.3- Detección del producto de PCR mediante electroforesis

57

2.2.2- Cribado de mutaciones mediante microarray de genotipado

58

Índice Páginas

2.2.3- Secuenciación automática

59

2.2.3.1- Purificación del producto de PCR

59

2.2.3.2- Reacción de secuenciación

60

2.2.3.3- Purificación del producto secuenciado

61

2.2.4- Análisis con enzimas de restricción

62

2.2.5- MLPA (Multiplex Ligation Probe Assay)

63

2.2.6- dHPLC (denaturing High-Performance Liquid Chromatography)

64

2.3- Estudio genético indirecto 2.3.1- Reacción en Cadena de la Polimerasa: PCR

65 65

2.3.1.1- Condiciones de la PCR

65

2.3.1.2- Cebadores

65

2.3.2- Análisis de haplotipos

68

2.3.3- Diseño de árboles genealógicos

68

2.4- Estudios de expresión

69

2.4.1- Vectores de expresión

69

2.4.2- Cultivos celulares y transfección

69

2.4.3- Inmunocitoquímica

72

2.4.4- Western Blot

72

IV‐ Resultados

76 

1‐ Gen NDP

77

1.1- Estudio genético directo

77

1.1.1- Familias estudiadas

77

1.1.2- Caracterización de mutaciones

77

1.1.3- Caracterización de polimorfismos

78

1.2- Estudio genético indirecto

79

1.2.1- Familias estudiadas

79

1.2.2- Análisis de haplotipos

79

1.2.3- Haplotipos prevalentes

79

1.3- Correlación genotipo-fenotipo

81

1.4- Origen geográfico de las mutaciones

82

2‐ Gen RS1

84

2.1- Estudio genético directo

84

2.1.1- Familias estudiadas

84

2.1.2- Caracterización de mutaciones

84

Índice 2.1.3- Caracterización de polimorfismos 2.2- Estudio genético indirecto

86 86

2.2.1- Familias estudiadas

86

2.2.2- Análisis de haplotipos

86

2.2.3- Haplotipos prevalentes

87

2.3- Correlación genotipo-fenotipo

88

2.4- Origen geográfico de las mutaciones

91

2.5- Estudios de expresión

92

2.5.1- Localización subcelular de la Retinosquisina

92

2.5.2- Detección de la Retinosquisina mediante Western Blot

92

3‐ Gen ABCA4

94

3.1- Estudio genético directo

94

3.1.1- Familias estudiadas

94

3.1.2- Caracterización de mutaciones

94

3.1.3- Caracterización de polimorfismos

111

3.2- Estudio genético indirecto

113

3.2.1- Familias estudiadas

113

3.2.2- Análisis de haplotipos

113

3.3.2- Haplotipos prevalentes

120

3.3- Correlación genotipo-fenotipo

123

3.4- Origen geográfico de las mutaciones

126

3.5- Frecuencia de alelos mutantes de ABCA4 entre la población general

128

V‐ Discusión

130

1‐ Discusión general

131

2‐ Epidemiología de las distrofias de retina estudiadas

132

3‐ Gen NDP

133

3.1- Estudio genético directo

133

3.2- Estudio genético indirecto

134

3.3- Correlación genotipo-fenotipo

135

4‐ Gen RS1

136

4.1- Estudio genético directo

136

4.2- Estudio genético indirecto

137

4.3- Correlación genotipo-fenotipo

138

Índice 5‐ Gen ABCA4

138

5.1- Implicación en la Enfermedad de Stargardt

138

5.1.1- Estudio genético directo

138

5.1.2- Estudio genético indirecto

142

5.2- Implicación en la Distrofia de Conos y Bastones Autosómica Recesiva

144

5.2.1- Estudio genético directo

144

5.2.2- Estudio genético indirecto

145

5.3- Implicación en la Retinosis Pigmentaria Autosómica Recesiva

145

5.3.1- Estudio genético directo

145

5.3.2- Estudio genético indirecto

145

5.4- Implicación en otras distrofias de retina

146

5.4.1- Implicación en la Distrofia Macular Autosómica Dominante

146

5.4.2- Implicación en familias con fenotipo diverso

146

5.5- Implicación en reorganizaciones cromosómicas

147

5.6- Correlación genotipo-fenotipo

150

5.7- Epidemiología de los alelos mutantes en ABCA4

153

  6‐ Distribución geográfica de las mutaciones en los pacientes estudiados.

153

7‐ Estrategias de estudio genético en retinopatías de herencia ligada al cromosoma X

155

8‐ Estrategias de estudio genético en retinopatías de herencia autosómica recesiva

155

VI‐ Conclusiones

157

VII‐ Bibliografía

160

VIII‐ Bases de datos

174

IV‐ Publicaciones

176

PRÓLOGO

El ojo es un órgano complejo que nos permite apreciar el mundo que nos rodea, adquirir nuevos conocimientos y comunicarnos con los demás. Todas las partes del globo ocular son importantes para percibir correctamente una imagen, pero sin duda, la capa fundamental en el proceso de la visión es la retina. Conocer la organización de la retina ha sido una meta para muchos científicos durante los últimos cien años. Las descripciones anatómicas de Santiago Ramón y Cajal (1892) de los distintos tipos celulares que constituyen la retina de los vertebrados, el temprano conocimiento de los procesos fotoquímicos que tienen lugar en ellos y los estudios de adaptación a la visión en color, hicieron posible que en los años sesenta se tuviese un rudimentario conocimiento de cómo debía estar organizada la retina y cuál era su funcionamiento.

En el campo de la Genética, también se han producido importantes avances a lo largo de estos años. Sin duda, se han producido tres acontecimientos relevantes. El primero de ellos, ocurrido ya en el siglo pasado, fue el descubrimiento de la estructura de la doble hélice del ácido desoxirribonucleico (ADN) por James Watson y Francis Crick (1953), basado en los estudios previos de Rosalind Franklin, Maurice Wilkins y Erwin Chargaff. De esta manera, se identificaba la molécula portadora de toda la información genética de un organismo. Posteriormente, el científico español Severo Ochoa y el norteamericano Arthur Kornberg volvían a revolucionar al mundo científico al conseguir descifrar el código genético, hecho que permitía traducir la secuencia de bases del ADN en aminoácidos, los componentes esenciales de las proteínas que constituyen nuestro organismo. Han pasado cincuenta años desde el modelo de la doble hélice e incluso ha comenzado un nuevo siglo, hasta que se ha podido obtener la secuencia completa del ADN a través del Proyecto Genoma Humano (PGH; Abril 2003).

Hoy en día, la comunidad científica trata de aunar todos los conocimientos que nos han legado los investigadores que nos han precedido, con el fin de comprender mejor cuáles son los mecanismos moleculares subyacentes a cualquier proceso biológico. Asimismo, es preciso determinar qué sistema no funciona correctamente en un determinado proceso de enfermedad, así como encontrar un tratamiento eficaz, ya sea a través de fármacos, implantes o terapia génica.

A todos ellos que, con su gran esfuerzo, su valioso trabajo y su excepcional inteligencia, nos han permitido tomar el relevo en este arduo camino, cada vez más avanzado,

Gracias.

1

Esquema de la retina de vertebrados mostrando los principales tipos celulares. Dibujo original de Cajal, alrededor de 1890.

I- Introducción 2

I- Introducción I- INTRODUCCIÓN

1- EL OJO HUMANO

1.1- ANATOMÍA DEL GLOBO OCULAR En el ojo, se diferencian varias estructuras externas: - una apertura negra, la pupila, que permite que la luz entre en el ojo; - el iris, que es un músculo coloreado circular, responsable del color de los ojos. La contracción y relajación del iris regula el tamaño de la pupila, permitiendo la entrada de mayor o menor cantidad de luz; - una superficie externa transparente, la córnea, que recubre la pupila y el iris. Ésta es la primera lente y la más potente del sistema óptico que, junto con el cristalino, permite la producción de una imagen definida a nivel de los fotorreceptores; - la esclera, que forma parte de la pared que sustenta el globo ocular. La esclera es contigua a la córnea.

En una sección sagital del ojo, se diferencian tres capas distintas: 1- La capa externa, formada por la esclera y la córnea. 2- La capa intermedia, dividida en dos partes: - anterior: contiene el iris y el cuerpo ciliar; - posterior: contiene la coroides o capa vascular. 3- La capa interna o parte sensorial del ojo, la retina.

Existen tres cámaras rellenas de fluídos: - cámara anterior: entre la córnea y el iris; - cámara posterior: entre el iris, los ligamentos que sostienen al cristalino y el propio cristalino; ambas cámaras están rellenas de humor acuoso. - cámara vítrea: situada entre el cristalino y la retina; rellena de humor vítreo. El cristalino, situado detrás del iris, está suspendido por unos ligamentos unidos a la porción anterior del cuerpo ciliar. La contracción y relajación de estos ligamentos como consecuencia de las acciones del cuerpo ciliar, producen cambios en la forma del cristalino en un proceso denominado acomodación, que permite formar una imagen definida en la retina. Además, el ojo es rotado por los músculos oculares. (Figura I.1)

1.2- LA RETINA La retina es la más interna de las tres túnicas de las que se componen los ojos de los vertebrados: esclera, coroides y retina (Weisz & Keogh, 1987). Se diferencian dos regiones: - retina anterior o ciega: reviste la cara posterior del cuerpo ciliar, los procesos ciliares y el iris; - retina posterior o sensible: es la porción del ojo sensible a la luz, que desarrolla una función receptora e integradora de las imágenes que recibe. En ella se observan dos elementos: 3

I- Introducción - la papila del nervio óptico: corresponde al punto ciego de la retina por el que los axones de las células ganglionares abandonan la retina para formar el nervio óptico; - la mácula: es una región de la retina de aproximadamente 5 milímetros (mm) de diámetro. Es la región encargada de la visión de mayor nitidez y definición.

Figura I.1: Anatomía externa e interna del globo ocular (www.eyedesignbook.com).

1.2.1- DESARROLLO EMBRINARIO DEL GLOBO OCULAR Y DE LA RETINA

Durante la gastrulación (proceso que sufre el embrión y que conduce a la formación de las tres capas germinales: ectodermo, mesodermo y ectodermo), el ojo embrionario consiste en un surco óptico localizado en el centro del encéfalo anterior (Figura I.2A). Este surco óptico se separa en dos vesículas ópticas laterales, en torno al vigésimo octavo día de gestación en humanos (Figura I.2B). A medida que se desarrollan estas vesículas, sus extremos distales se expanden y se constriñen, formando los tallos ópticos. A continuación, se produce un evento crucial en el desarrollo ocular, que es interacción de la vesícula óptica con la placa del cristalino. Como resultado, la placa del cristalino se invagina y se convierte en la fóvea del cristalino (Figura I.2C). En este momento, en los tallos ópticos se desarrollan unos surcos denominados fisura óptica, de cuyo mesénquima se forman los vasos sanguíneos hialoideos. A medida que se acercan y se fusionan los bordes de la fisura, los vasos hialoideos quedan encerrados dentro del nervio óptico y darán lugar a la arteria y a la vena central de la retina.

4

I- Introducción Entre el trigésimo primer y el trigésimo quinto día de gestación, la fóvea del cristalino se cierra formando las vesículas del cristalino. A su vez, estas vesículas se invaginan, dando lugar a la cúpula óptica, de doble capa (Figura I.2D).

La capa externa de la cúpula óptica originará el epitelio pigmentario de la retina (EPR) (sexta semana de gestación) y la capa interna dará lugar a la retina neural (entre la cuarta y la quinta semana de gestación) (Figura I.2E). Los primeros conos y bastones aparecen en embriones humanos entre la semana diez y la semana quince, mientras que las capas de células horizontales, bipolares y ganglionares aparecen a la mitad del desarrollo embrionario.

Figura I.2: Desarrollo embrionario del globo ocular y de la retina (Graw J, 2003).

1.2.2- HISTOLOGÍA DE LA RETINA

La sección vertical de la retina humana muestra una estructura estratificada compleja que incluye el epitelio pigmentario de la retina, las capas neuronales y las membranas limitantes externa e interna, en las que se producen las conexiones sinápticas. Las células implicadas en las distrofias de retina (DR) son los fotorreceptores y las células del epitelio pigmentario de la retina (Haw AW, 1970; Krstic RV, 1997).

Las primeras neuronas de la vía visual son los fotorreceptores, que se sitúan en la capa de conos y bastones o capa nuclear externa. Los fotorreceptores traducen la señal luminosa y establecen sinapsis en la capa plexiforme externa con la siguiente neurona: la célula bipolar, situada en la capa nuclear interna. Esta neurona emite su axón a la capa plexiforme interna y conecta con la célula ganglionar, en la capa de las células ganglionares.

5

I- Introducción Por último, los axones de las células ganglionares se dirigen hacia la papila del nervio óptico, formando la capa de fibras del nervio óptico.

Figura I.3: Estructura de la retina.

EPITELIO PIGMENTARIO DE LA RETINA (EPR)

Es la capa más externa de la retina. Está unida a la membrana de Bruch, que la separa de la coroides o capa vascular. El EPR está formado por células columnares cargadas de melanina, contienen microvellosidades en su polo apical y vainas cilíndricas en su membrana plasmática que envuelven los segmentos externos de conos y bastones (Junqueira LC & Carneiro J, 1987). Sus funciones, vitales para el proceso visual, son las siguientes:

1- Reciclaje de fotorreceptores: fagocitosis y digestión lisosómica de los discos del segmento externo de conos y bastones. 2- Interviene en el ciclo de la vitamina A. 3- Síntesis de melanina: absorbe la luz no capturada por los fotorreceptores, impidiendo que se refleje dentro del ojo. 4- Aporte de nutrientes para los fotorreceptores. 5- Síntesis de glicosaminoglicanos (componentes de la matriz extracelular de los fotorreceptores). 6- Barrera entre la circulación coloidal y las capas externas de la retina. Transporte iónico y de agua desde el espacio subretinal.

6

I- Introducción FOTORRECEPTORES

Los fotorreceptores son células alargadas sobre las que incide la luz siguiendo un eje longitudinal. Su morfología está constituída por dos regiones diferenciadas: el segmento interno y el segmento externo. En la región basal del segmento interno, se encuentran el núcleo y la región axónica. Esta región celular también contiene abundantes mitocondrias, el retículo endoplasmático rugoso y el aparato de Golgi. El segmento externo, unido al segmento interno por un estrecho cilio, posee un gran desarrollo de membranas fotosensibles.

Figura I.4: Estructura del fotorreceptor.

Además de presentar diferencias morfológicas, los conos y los bastones difieren entre sí en su función y distribución. Los conos son los responsables de la visión a elevados niveles de luz (fotópica), por lo que perciben el color y una visión diurna muy rica en detalles. Contienen unos pigmentos visuales denominados opsinas y, en función del fotopigmento que portan, los conos se subdividen en rojos, verdes y azules. Existen unos seis millones de conos, la mayor densidad de ellos se encuentran en la mácula, la región central de la retina. En el centro de la mácula se sitúa la fóvea, que es la región de mayor agudeza visual. Los bastones poseen un umbral de excitación más bajo y son los responsables de la visión nocturna (escotópica) y en blanco y negro. En la retina humana hay alrededor de unos ciento cincuenta millones de bastones, dispuestos de forma periférica. Por tanto, a medida que nos alejamos de la fóvea, aumenta la densidad de bastones y disminuye la densidad de conos, disminuyendo la agudeza visual.

Segmento externo

Es el polo sensorial de la célula y está en íntimo contacto con el EPR. Es una prolongación celular que diferencia morfológicamente a los conos (cortos y gruesos) de los bastones (largos), en la que tiene lugar el proceso de fototransducción. Ultraestructuralmente, está constituido por microvesículas formando unos mil discos apilados (Rawn JD, 1989). Éstos se encuentran rodeados por membrana plasmática, formada a partir de invaginaciones de la membrana celular, que se separan de ésta en el caso de los bastones y que permanecen como tales invaginaciones en el caso de los conos. 7

I- Introducción Estas estructuras no son estáticas, sino que están sometidas a un proceso de reciclaje continuo:

- en los bastones, los discos migran hacia la porción apical del fotorreceptor progresivamente y son fagocitados por el EPR. El proceso de migración dura entre nueve y doce días y el EPR fagocita alrededor del 10% del segmento externo diariamente. Simultáneamente, se va añadiendo membrana nueva en el lugar de la unión segmento externo-interno (Zinn KM & Marmor MF, 1979; Travis GH, 1997). - En los conos, no se da la renovación de los discos ya que éstos son plegamientos de la propia membrana.

Se piensa que la estructura del disco se mantiene gracias a proteínas específicas del segmento externo de conos y bastones, como la proteína RDS/periferina y la proteína ROM1, que contribuyen al mantenimiento de la curvatura de los discos y de su anclaje al citoesqueleto del fotorreceptor (Connell GJ & Molday RS, 1990). Desde el punto de vista bioquímico, la membrana del segmento externo se caracteriza por una elevada fluidez, debido a una composición baja en colesterol y extremadamente alta en ácidos grasos esenciales (Deamen FJM, 1973). Otro componente que aparece en una composición inusualmente alta es la vitamina E (α-tocoferol), que contribuye a la eliminación del producto generado por la fotooxidación de los ácidos grasos del segmento externo.

Segmento interno

El segmento interno está separado del externo mediante una constricción denominada cilio de conexión, que interviene en el metabolismo celular sintetizando macromoléculas que liberan energía para la fototransducción. Esta porción del fotorreceptor presenta apilamiento de mitocondrias, contiene los orgánulos celulares y acumula gran cantidad de glucógeno. El núcleo se localiza al comienzo del axón, el cual realiza sinapsis con las células bipolares, lo que supone el primer relevo de la vía visual.

Opsinas o pigmentos visuales

Los segmentos externos de conos y bastones contienen sólo un tipo de pigmento visual por tipo celular. El 11-cis-retinaldehído es el cromóforo para los cuatro pigmentos visuales. Se dispone paralelamente al plano de la bicapa y perpendicularmente a las α-hélices, posición que le permite el aumento en la captura de fotones. Las opsinas son proteínas que participan en la fotorrecepción: absorben luz a distintas longitudes de onda, transformándola en impulsos nerviosos. La rodopsina, opsina que se expresa en los bastones, se excita en condiciones de baja intensidad lumínica y su máximo de absorción es de 493 nanómetros (nm) (Merbs SL & Nathans, 1992). Existen otros tres pigmentos visuales que se localizan en los conos y absorben a distintas longitudes de onda (Stockman A et al., 2000). El pigmento azul absorbe a 426 nm y su gen se encuentra localizado en 7q31. Las dos últimas opsinas se encuentran en el cromosoma Xq28: el pigmento verde que absorbe a 530 nm y el

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I- Introducción pigmento rojo que absorbe a 552 o 557 nm, dependiendo de la presencia de un polimorfismo en el codon 180 que puede ser alanina o serina.

Figura I.5: Espectros de absorción de los pigmentos de los fotorreceptores.

OTROS TIPOS CELULARES

Células bipolares

Son las segundas neuronas del proceso visual. Establecen sinapsis mediante sus dendritas con el fotorreceptor en la capa plexiforme externa y emiten su axón a la capa plexiforme interna, donde ocurre el tercer relevo sináptico con las células amacrinas o las células ganglionares (Boycott BB et al., 1987). Su función es crucial para detectar contrastes débiles o cambios en la intensidad de luz. Células horizontales

Este tipo celular está ubicado entre la capa nuclear interna, donde se observan sus somas y en la capa plexiforme externa, donde extiende sus dendritas y sus axones. Sus terminaciones dendríticas forman sinapsis tripartitas o tríadas con los conos y las células bipolares de los conos. Las terminaciones derivadas de sus axones inervan lateralmente las esférulas, que es como se denomina a las conexiones que se establecen entre los bastones y la célula bipolar del bastón. Se considera que desempeñan un papel esencial en el circuito de contraste simultáneo y la adaptación neural a la luz. Células amacrinas

Este término quiere decir “sin axón”. Establecen sinapsis con las células bipolares, con las células ganglionares y con otras células amacrinas en la capa plexiforme interna. Células ganglionares

Son las mediadoras del último relevo sináptico de la retina. Sus dendritas conectan con las células amacrinas y bipolares en la capa plexiforme interna y sus cuerpos se localizan en la capa de células ganglionares. Sus axones se organizan en la capa de axones del nervio óptico, que abandona la retina por el punto ciego. Su función consiste en distinguir y seleccionar la información visual que se transmite al cerebro (Lennie P et al., 1990).

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I- Introducción La glía. La célula de Müller

Las células gliales son un componente esencial de la retina. Histológicamente, se diferencian células tanto del tipo astroglía como microgliales pero, sobre todo, destaca la célula de Müller. La célula de Müller está dispuesta verticalmente a todas las capas de la retina, abarcando todas ellas: desde el soma, en la capa nuclear interna, irradian prolongaciones hacia las capas más internas de la retina, rodeando vasos sanguíneos y en contacto con el humor vítreo. También emiten prolongaciones hacia las capas de los fotorreceptores, rodeando a estas células. A su paso por las distintas capas, cubren los cuerpos neuronales y las dendritas de los distintos tipos celulares. Desempeñan funciones esenciales para la supervivencia de la retina: constituyen un tejido de sostén para los diversos tipos celulares, intervienen en la nutrición retiniana mediante el acúmulo de glucógeno y ejercen una función defensiva mediante fagocitosis.

1.2.3- FISIOLOGÍA: EL PROCESO DE FOTOTRANSDUCCIÓN

El proceso de fototransducción tiene lugar en los discos del segmento externo de los fotorreceptores. El fotorreceptor es sensible a la luz y responde al estímulo luminoso variando su potencial de membrana y, como consecuencia, varía su emisión del neurotransmisor glutamato al espacio sináptico en la capa plexiforme externa. En el bastón, adaptado a la oscuridad, el potencial de membrana está en torno a unos -40 milivoltios (mV). Este potencial se mantiene en ausencia de luz debido a la existencia de una “corriente oscura” catiónica: esta corriente se produce en reposo en el segmento externo del bastón por la actividad de un transportador catiónico Na+/Ca2+ dependiente de GMP cíclico (GMPc) que, en oscuridad, permanece abierto. Por tanto, se produce una liberación tónica de glutamato al espacio sináptico en ausencia de estímulos visuales. La molécula fotosensible de los discos de los bastones es la rodopsina, que consta de una parte proteica, la opsina y un grupo prostético unido covalentemente, el 11-cis-retinal.

Fase luminosa

La cascada visual comienza con la captación de un fotón de luz, que provoca la activación de la rodopsina por la isomerización del 11-cis-retinal a todo-trans-retinal, provocando un desplegamiento de la proteína. Entonces, la rodopsina pasa en milisegundos por distintos estados energéticos derivados de los cambios conformacionales y alcanza su forma activa y más estable: metarrodopsina II. La rodopsina activada, a su vez, interactúa con la siguiente proteína de la cascada: la transducina, que es una proteína heterotrimérica que consta de tres subunidades (α,β,γ). La rodopsina estimula la subunidad α de la transducina, que se disocia y cataliza la conversión de GDP a GTP. La transducina activada provoca un cambio conformacional en el complejo de la fosfodiesterasa (PDE), una proteína G heterotetramérica: consta de dos tipos de subunidades activadoras (α,β) y dos subunidades inhibitorias (γ). La disociación de estas dos últimas hace que la PDE hidrolice el GMPc a GMP. 10

I- Introducción Esta situación provoca el cierre de los canales catiónicos de la membrana plasmática del bastón, produciendo un aumento de polaridad en la membrana. Esta hiperpolarización genera el potencial receptor, constituyendo la primera señal eléctrica de transmisión de información neuronal (Yau KW, 1994).

Figura I.6: Esquema de las proteínas de la cascada visual.

Fase oscura

La finalización de la fotoexcitación se produce por inactivación de la metarrodopsina II por la fosforilación de resíduos de serina y treonina de su extremo carboxilo terminal, mediante la enzima rodopsina quinasa. Posteriormente, la rodopsina fosforilada se une a la arrestina: la actuación de ambas enzimas evita la unión de la rodopsina a la transducina, permitiendo que se paralice el proceso (Wilden U et al., 1996). También es necesaria la inactivación de la transducina y la PDE, proceso en el que parecen estar involucradas la concentración de Ca2+ intracelular y la recoverina: el descenso de las concentraciones de Ca2+ provoca la activación de la recoverina, enzima que a su vez activa la guanilato ciclasa, que reconstituye los niveles de GMPc. De esta forma, se reanuda la apertura de los canales dependientes de GMPc. El aumento del Ca2+ inhibe a su vez la actividad de la recoverina. La transducina GTPasa se encarga de catalizar la separación de la transducina y la PDE, permitiendo su inactivación al unirse de nuevo a sus subunidades inhibitorias. Mientras, el todo-trans-retinal (el cromóforo) es reducido rápidamente a todo-trans-retinol, por la enzima retinol deshidrogenasa y mediado por el paso de NADPH a NADP. Para que se produzca este último paso, es necesario que el todo-trans-retinal sea transportado desde la membrana intradiscal al citoplasma del fotorreceptor por la proteína RmP (Sun H et al., 2000), como se verá más adelante.

El proceso de fototransducción que se ha descrito en los bastones, ocurre de forma similar en los conos. La diferencia radica en la longitud de onda a la que absorben las opsinas de los distintos conos. De esta manera, cada tipo de cono se excita de forma espectralmente independiente, para un determinado color.

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I- Introducción 2- RETINOPATÍAS HEREDITARIAS

2.1- INTRODUCCIÓN Las distrofias hereditarias de la retina son un conjunto de enfermedades degenerativas y generalmente progresivas, causadas por la afectación primaria de los fotorreceptores, que ocurren en una de cada 3000 personas. Se caracterizan por ser transtornos hereditarios, por la evolución progresiva y por no tener, por el momento, un tratamiento ni paliativo ni curativo, lo que conlleva a la pérdida total o parcial de la visión (Rivolta C et al., 2002). Histológicamente, la pérdida de los fotorreceptores es seguida generalmente por alteraciones en el epitelio pigmentario y en la glía de la retina. Finalmente, los cambios degenerativos también afectan a las neuronas de la retina profunda, a los vasos y a la cabeza del nervio óptico (Milam et al., 1998). Las distrofias de retina (DR) se pueden clasificar, de manera general, en: - formas periféricas, en las que los bastones son las células de la retina que se ven afectados inicialmente; incluyen las formas típicas de Retinosis Pigmentaria (RP), - formas centrales, con degeneración de los conos en su inicio, pudiendo afectarse de forma secundaria o no los bastones; incluyen las distrofias maculares (DM), las distrofias de conos, las distrofias de conos y bastones (DCB), etc.

2.2- DIAGNÓSTICO OFTALMOLÓGICO

2.2.1- ANTECEDENTES PERSONALES Y FAMILIARES

El diagnóstico temprano de las DR requiere una historia clínica completa, en la que se resaltan tres aspectos fundamentales (www.retinosis.org): a) Sintomatología y edad de comienzo: Generalmente el paciente se queja de pérdida de la agudeza visual, reducción del campo visual, mala adaptación a la oscuridad (hemeralopia/ceguera nocturna) o intolerancia a la luz (fotofobia), etc. El comienzo de los síntomas es muy variable, existiendo formas muy tempranas (incluso congénitas), formas juveniles (entre la primera y la segunda década de vida) y formas adultas. b) Árbol genealógico: Dado el carácter hereditario de esta patología, es necesario reconstruir al menos tres generaciones del enfermo. También es importante tener en cuenta la posible existencia de consanguinidad en la familia, especialmente en aquellos casos que puedan presentar herencia recesiva de la enfermedad. c) Antecedentes personales: Resultan fundamentales, tanto en relación al proceso ocular (diagnóstico diferencial de formas secundarias), como a cualquier alteración sistémica (diagnóstico diferencial e identificación sindrómica).

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I- Introducción

2.2.2- EXPLORACIÓN OFTALMOLÓGICA

La exploración oftalmológica incluye, entre otras, las siguientes pruebas (García-Sandoval B, 2001):

- Agudeza visual: Se utiliza, entre otras, el test de visión de los colores 100-HUE Farnsworth-Munsell, que consiste en cuatro conjuntos de fichas de color removibles con un total de 85 fichas de referencia de color a lo largo del espectro visible. Las anomalías en la visión de color son detectadas cuando el paciente es incapaz de colocar las fichas en el orden correcto (Figura I.7a).

- Biomicroscopía del segmento anterior: Permite detectar cataratas subcapsulares posteriores, unos de los hallazgos más frecuentes en los pacientes con RP.

- Campimetría: La técnica más empleada para valorar el campo visual es el campímetro de Goldman, que proporciona información sobre la densidad del escotoma (zona sin visión) en valor absoluto y la representa en escala de grises (Figura I.7b).

- Funduscopia: Examen del fondo de ojo utilizando un microscopio de rendija y unas lentes corneales de contacto o simplemente una lente manual de 90 dioptrías (Figura I.7c).

- Electrooculograma (EOG): Es un examen que consiste en colocar pequeños electrodos cerca de los músculos de los ojos para medir el movimiento de éstos.

- Electrorretinograma (ERG): Esta prueba consiste en el registro -mediante un electrodo encajado en una lente de contacto- de los cambios del potencial eléctrico obtenido en la retina tras un estímulo luminoso. Sirve para evaluar la integridad funcional de la retina y, más específicamente, de los bastones (ERG escotópico), de los conos (ERG fotópico) o de ambos sistemas fotorreceptores (ERG mixto) (Figura I.7d).

- Angiofluoresceingrafía (AFG): Permite observar un efecto pantalla por los depósitos de pigmento que impiden ver la fluorescencia coroidea (Figura I.7e).

- Tomografía de coherencia óptica (TCO): Representa los estratos de la retina en forma de una imagen de sección transversal de alta resolución. Los colores calientes -rojo y blanco-, corresponden a zonas de alta reflectividad. Los colores fríos -azul y negro-, cuentan con una reflectividad más débil y caracterizan células ganglionares, fotorreceptores y la coroides (Figura I.7f).

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I- Introducción

Figura I.7: a) Test de los colores 100-HUE Farnsworth-Munsell. b) Campimetría: las zonas oscuras representan las regiones en las que se produce el escotoma. c) Fondo de ojo de un individuo sano. d) ERG con patrón bifásico típico de un individuo normal. e) Imagen obtenida por AFG de un individuo sano, en el que se observa la fluorescencia de los vasos sanguíneos de la coroides. f) Imagen obtenida por TCO, en la que se observan las distintas capas celulares.

2.3- CARACTERÍSTICAS DE LAS RETINOPATÍAS HEREDITARIAS Unas de las características típicas de las DR es su elevada heterogeneidad, tanto a nivel genético como a nivel clínico. De hecho, las manifestaciones de cada una de las diversas formas de DR varían en función del patrón de herencia con el que se transmiten a las siguientes generaciones (Valverde D, 2001).

2.3.1- HETEROGENEIDAD EN EL PATRÓN DE HERENCIA

Herencia autosómica dominante (AD)

Se caracteriza porque en cada generación aparece al menos un afecto (transmisión vertical). Varones y hembras se encuentran afectados por igual, ya que el gen alterado está situado en alguno de los veintidós autosomas y presenta dos alelos, uno normal y otro mutado. El riesgo de transmisión es del 50% en cada hijo de un afecto. La transmisión de varón a varón permite el diagnóstico diferencial respecto a la herencia ligada al X. Herencia autosómica recesiva (AR)

En este modelo de herencia aparecen varios miembros afectos dentro de una misma generación (transmisión horizontal). Los progenitores son portadores sanos (presentan un alelo sano y otro mutado) y la enfermedad se manifiesta cuando alguno de los hijos (varón o hembra) hereda ambos alelos mutados: uno del padre y otro de la madre. Por tanto, la enfermedad se hereda por ambas ramas familiares y la consanguinidad o la endogamia entre las mismas suele ser un hecho frecuente. El riesgo de aparición de la enfermedad es de un 25% para cada hijo. Todos los hijos de un afecto serán portadores. 14

I- Introducción

Herencia ligada al cromosoma X (XL)

En este tipo de patrón de herencia, las mujeres portadoras transmiten la enfermedad a sus descendientes sin padecerla, con la probabilidad de un 50% de tener hijos varones afectos y un 50% de tener hijas portadoras. No existe transmisión entre varones, puesto que el padre afecto únicamente aporta el cromosoma Y a su hijo varón. Sin embargo, todas sus hijas serán portadoras del defecto genético. Algunas portadoras pueden presentar síntomas de la enfermedad, debido a la inactivación al azar del cromosoma X (MacDonald IM, 1997). En cualquier caso, las manifestaciones clínicas suelen ser más leves y muy variables e incluso pueden existir asimetrías en la afectación de ambos ojos. Herencia digénica y trialelismo

Es una condición génica causada por la interacción de dos mutaciones en dos genes diferentes no ligados, donde sus productos proteicos están funcionalmente conectados. En algunos casos, genes recesivos pueden verse afectados por un tercer alelo mutante que ejerce un efecto modificador, suavizando o agravando el fenotipo. Un ejemplo de trialelismo se produce en la Amaurosis Congénita de Leber y en el Síndrome de Bardet-Bield. Herencia mitocondrial

Existen genes involucrados en patologías oftalmológicas que se encuentran en el genoma mitocondrial. Son enfermedades de herencia materna, ya que las mitocondrias se transmiten a la siguiente generación a través de los óvulos. Algunos ejemplos son la neuropatía óptica hereditaria de Leber (NOHL), el síndrome de Kearns-Seyre (KSS) y la neuropatía, ataxia y retinosis pigmentaria (NARP).

No hay evidencia de que las DR se manifiesten más tempranamente en las generaciones sucesivas, es decir, no se produce el fenómeno de anticipación genética producido por mutaciones dinámicas (alelos expandidos), excepto en el caso de la DR causada por mutaciones en el gen ATXN7 (antes SCA7, ataxia espinocerebelosa 7).

2.3.2- HETEROGENEIDAD GENÉTICA

Heterogeneidad alélica

Se produce cuando diferentes mutaciones a lo largo de la secuencia de un mismo gen desencadenan el mismo proceso degenerativo. Heterogeneidad no alélica

Se produce cuando distintos genes o loci son responsables de la misma enfermedad. Prácticamente, en todos los cromosomas se encuentran genes involucrados en alguna patología retiniana. Hasta el momento se han localizado un total de 163 loci, de los cuales 114 ya han sido clonados (www.sph.uth.tmc.edu/Retnet).

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I- Introducción 2.3.3- HETEROGENEIDAD CLÍNICA

Formas no sindrómicas

Son aquellas DR en las que únicamente se manifiesta la patología ocular. Se presentan asociadas a los modelos de herencia conocidos mendelianos. Formas sindrómicas

Son aquellas DR que aparecen acompañadas de un cuadro clínico complejo, con manifestaciones extraoculares. Suponen un 13-18% de todas las retinopatías hereditarias, se han descrito del orden de 77 síndromes distintos (www.retina-internacional.org). Pueden deberse a una herencia mitocondrial, herencia dominante, herencia recesiva, trialelismo o reordenamientos cromosómicos. Dentro de las formas sindrómicas, los más frecuentes son el Síndrome de Usher (recesivo) y el Síndrome de Bardet-Bield (recesivo y trialélico). Por lo tanto, a la hora de diagnosticar a un paciente, es importante determinar si se trata de una degeneración exclusivamente ocular o bien si forma parte de un trastorno sistémico ya que algunas retinopatías son un síntoma frecuente de distintos errores metabólicos congénitos, especialmente en alteraciones del sistema peroxisomal, errores del metabolismo de los ácidos grasos y defectos de la cadena respiratoria mitocondrial.

3- ENFERMEDADES CONGÉNITAS DE LA RETINA Las enfermedades congénitas de la retina son relativamente frecuentes en la población: en todo el mundo, entorno a 1,4 millones de niños menores de dieciséis años son ciegos (Johnson GJ et al., 2003). Entre otros defectos oculares que se producen de forma temprana o incluso congénita, destacan los siguientes: - microftalmia: disminución del tamaño normal del globo ocular; - anoftalmia: ausencia de los globos oculares, en cuyo caso pueden estar presentes los esbozos ópticos; - persistencia de vítreo primitivo: se localiza centralmente como una masa retrolental que emite procesos ciliares hacia la cápsula posterior del cristalino; - retinopatía del prematuro / de la prematuridad: retinopatía bilateral del recién nacido que ocurre en prematuros de bajo peso que han sido sometidos a concentraciones altas de oxígeno, lo que provoca alteraciones vasculares en la retina e isquemia de la misma con posterior neovascularización, proliferación vitreorretiniana y desprendimiento traccional de la retina. - desprendimiento de retina: separación que se produce entre la retina y el EPR, acumulándose líquido en el espacio virtual existente entre los dos. - coloboma: se produce por un déficit en el cierre o soldadura de la fisura óptica y que puede afectar, mayoritariamente, al desarrollo del iris o de la retina. Algunos de estos defectos oculares hereditarios pueden deberse, entre otras causas, a alteraciones en los genes NDP y RS1, como se verá a continuación 16

I- Introducción 4- ENFERMEDAD DE NORRIE (ND)/ VÍTREORRETINOPATÍA EXUDATIVA FAMILIAR (VREF)

4.1- RASGOS CLÍNICOS La Enfermedad de Norrie (ND; MIM +310600) es un trastorno recesivo ligado al X caracterizado por una serie de cambios fibrosos y vasculares en la retina desde el nacimiento, que progresan durante la infancia y la adolescencia causando pérdida de la agudeza visual de diferentes grados en varones. Los cambios retinianos más severos son masas fibrovasculares de color amarillo-grisáceo, llamados también “pseudogliomas” por su parecido a los tumores, que aparecen en los primeros meses de vida y producen ceguera legal (agudeza visual < 20/200). Estas masas producen un aumento de la reacción fibrótica en la retina, así como cambios vasculares, que habitualmente producen hemorragia del vítreo. Desde el tercer mes de vida hasta los 8-10 años, se producen cambios progresivos en la retina: opacidad del cristalino (cataratas), atrofia del iris con adhesión entre cristalino-iris (posterior synechiae) o adhesión entre iris-córnea (anterior synechiae) y aumento de la presión intraocular, que puede resultar dolorosa. En los estadios más avanzados de la enfermedad, los globos oculares se ven disminuidos y las córneas presentan un aspecto blanquecino, de forma que los ojos parecen hundidos en las órbitas (microftalmia). El 50% de los varones afectos presentan sordera neurosensorial que comienza en la infancia temprana debido a defectos en la cóclea, así como retraso mental de diferentes grados (Warburg M, 1961; Warburg M, 1975).

Un fenotipo más suave supone la aparición de una masa blanca desde el disco óptico hasta el cristalino -persistencia de vítreo primitivo hiperplásico (PHPV)- y anomalías vasculares periféricas, con o sin cambios fibrosos -vitreorretinopatía exudativa familiar (FEVR; MIM #305390)-. Los varones afectos no presentan sordera neurosensorial ni retraso mental (Fullwood P, 1993).

Figura I.8: A) Fondo de ojo de un paciente con vitreorretinopatía exudativa. Debido a cambios proliferativos en la retina, se observan alteraciones en los vasos sanguíneos que aparecen alargados. Los exudados amarillos aparecen cerca de la fóvea, debido a filtraciones de los vasos periféricos. B) La AFG (angiofluoresceingrafía) muestra hiperfluorescencia de la región temporal del disco óptico y distorsión de los vasos sanguíneos a nivel macular.

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I- Introducción

También se han identificado algunos casos de Enfermedad de Coats (MIM #300216) y retinopatía de prematuridad (ROP; MIM #305390; descrita anteriormente) debido a mutaciones en el gen NDP (Black GCM, 1999; Shastry BS, 1997). La Enfermedad de Coats o teleangiectasia retiniana se caracteriza por un defecto en el desarrollo de la vascularización de la retina que resulta en extravasación retiniana con exudados subretinianos y desprendimiento de retina. Mediante AGF, se observan áreas con ausencia de perfusión, dilataciones y aneurismas capilares. Al inicio, cuando sólo está afectado un sector de la retina, la visión está conservada. Posteriormente, el desprendimiento de retina conduce a la pérdida de la visión.

4.2- EL GEN: NDP El gen responsable de la Enfermedad de Norrie de denomina NDP (Norrie Disease Protein gene), se localiza en Xp11.4 y consta de tres exones, pero sólo los exones 2 y 3 se traducen: el exón 1 está situado dentro de la región 5´UTR (untranslated, no traducida) y se especula que desempeña una función reguladora en la región promotora del gen, el exón 2 contiene los primeros 58 codones mientras que el exón 3 es el de mayor tamaño y contiene los residuos 59-133 de la pauta abierta de lectura así como 917 pares de bases (pb) de la región 3´UTR. Hasta el momento, se han identificado más de setenta mutaciones en el gen NDP (www.hgdm.org), la mayoría provocan cambio de aminoácido (en inglés missense) y se producen en los exones 2 y 3.

4.3- LA PROTEÍNA: NORRINA El gen NDP codifica una proteína secretable de 133 aminoácidos llamada “Norrina” cuyos residuos de cisteína forman puentes disulfuro que sugieren un papel fundamental en la estructura y función de la retina. La Norrina es un miembro de la familia de los factores de crecimiento tipo “cysteine-knot” y se especula que interviene en la interacción neuroectodérmica célula-célula, que resulta crítica para el desarrollo normal de la retina, del Sistema Nervioso Central (SNC) y de la cóclea. Las alteraciones que ocurren en esta proteína, producen una vascularización incompleta de la retina, tanto en pacientes con Enfermedad de Norrie como con vítreorretinopatía exudativa familiar. Sin embargo, existe una forma de FEVR causada por defectos en el gen frizzled-4 (FZD4; MIM *604579) que codifica un receptor de la vía Wnt. La vía de señalización de Wnt, que está conservada evolutivamente en todos los organismos, regula un conjunto de procesos centrales para el desarrollo y las funciones celulares. Estos procesos incluyen la proliferación celular, la diferenciación de células en tejidos especializados y el establecimiento de regiones distintas dentro de la célula. Los cambios en la vía Wnt se han relacionado con distintas enfermedades humanas, como el cáncer y la enfermedad de Alzheimer, entre otras. Recientemente, se ha determinado que la Norrina y FZD4 funcionan como un par ligando-receptor respectivamente, basándose en la similitud de los fenotipos vasculares causados por mutaciones en Norrina y FZD4 tanto en humanos como en ratones: se ha observado que la Norrina se une con elevada

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I- Introducción especificidad al receptor FZD4, aunque requiere la presencia del co-receptor LRP5 (MIM *107770), para provocar la activación de la vía Wnt (Xu et al., 2004). Por tanto, estos datos consideran que el sistema Norrina-FZD4 desempeña un papel esencial en el desarrollo vascular del ojo y del oído.

Figura I.9: Secciones histológicas de retinas de ratón silvestre y de ratón mutante fz4-/-, a nivel de la capa de fibras nerviosas, plexiforme interna y plexiforme externa. En la retina fz4-/-, se desarrollan expansiones concretas a partir de los vasos primarios, pero los vasos secundarios y terciarios están ausentes (Xu et al., 2004).

5- RETINOPATÍAS HEREDITARIAS CENTRALES: DISTROFIAS MACULARES

5.1- ASPECTOS CLÍNICOS La degeneración macular se caracteriza por alteraciones de la pigmentación, estrechamiento arteriolar, cierto grado de atrofia óptica y deterioro progresivo de la función visual. La dispersión y acumulación del pigmento retiniano da lugar a alteraciones visibles en el examen oftalmológico, que van desde el aspecto moteado del pigmento hasta las acumulaciones típicas en forma de espículas óseas. Estas maculopatías comparten unas características comunes: el material acumulado es de tipo lipofucsina, se deposita en el epitelio pigmentario y las alteraciones afectan más severamente a la zona de la mácula. La enfermedad comienza a manifestarse en la infancia con una disminución bilateral gradual y progresiva de la visión central, aunque puede permanecer estacionaria durante muchos años. Este tipo de afectación retiniana es más frecuente en individuos de raza blanca que en los de raza negra (Wright AF & Jay B, 1994).

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I- Introducción

5.2- ASPECTOS GENÉTICOS Las distrofias maculares suelen presentarse como casos esporádicos, autosómicos dominantes, recesivos o ligados al cromosoma X. Dentro de las formas dominantes hay muchos tipos, que se distinguen por sus manifestaciones clínicas, como la Enfermedad de Best, las distrofias en patrón, la distrofia macular de Sorby y las drusas de herencia dominante. Entre las formas recesivas, destaca la Enfermedad de Stargardt, que se considera la distrofia macular juvenil más común. En las formas ligadas al cromosoma X, destaca la Retinosquisis juvenil. En general, las formas más frecuentes son las seniles, como la Distrofia Macular Asociada a la Edad (DMAE).

6- RETINOSQUISIS JUVENIL LIGADA AL CROMOSOMA X (XLRS)

6.1- RASGOS CLÍNICOS La Retinosquisis juvenil ligada al cromosoma X (XLRS; MIM +312700) es una de las causas más comunes de degeneración macular juvenil en varones, con una prevalencia que oscila entre 1:5000 a 1:25000 (Mooy CM et al., 2002). La manifestación clínica más común es la pérdida de visión en la primera década de vida, en algunos casos a los tres meses de edad, ocasionando una pérdida precoz de la agudeza visual (20/60-20/120). El deterioro de la visión es leve hasta la quinta o sexta década de vida, a partir de la cual la degeneración visual es progresiva y puede producirse ceguera legal en torno a los 70 años de edad. El fondo de ojo se caracteriza por una degeneración macular microquística, que presenta una distribución radial típica desde la fóvea hasta la periferia (patrón en “rueda de carro”). También se produce degeneración vitreorretiniana y rotura de la capa de fibras nerviosas, que genera grandes hendiduras (“schisis”). Estos desdoblamientos de las capas retinianas reciben el nombre de “velos vítreos” (Tantri A et al., 2004). Este desgarro de las capas superficiales de la retina ocasiona degeneración de los fotorreceptores, disminución de la capa ganglionar y alteraciones en el EPR. Posteriormente, surgen lesiones en la retina periférica, alteraciones en el vítreo y reducción de la onda b en el ERG.

Figura I.10: A) Fondo de ojo de un paciente con RS; se observa atrofia macular y velos vítreos. B) Imagen obtenida por TCO (Tomografía de Coherencia Óptica) que muestra las cavidades microquísticas en la fóvea.

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I- Introducción

En estadios más tardíos, la hemorragia del vítreo constituye la fundamental complicación, ya que agrava el déficit visual. En ocasiones se manifiesta por estrabismo (desviación de uno de los ojos de su dirección normal, por lo que los ejes visuales no pueden dirigirse en un mismo tiempo al mismo punto), o por nistagmus (espasmos de los músculos del ojo que produce movimientos oculares rápidos e involuntarios) En un 40% de los casos, se produce desprendimiento de retina.

6.2- EL GEN: RS1 El gen asociado a esta enfermedad se denomina RS1 y fue identificado por clonación posicional. Está situado en el brazo corto del cromosoma X (Xp22.2-p22.1), consta de 6 exones y codifica una proteína de 224 aminoácidos denominada Retinosquisina (Sauer GC et al., 1997). Este gen contiene una región altamente conservada en los exones 4-6, conocida como dominio discodín, como se verá más adelante. RS1 se expresa principalmente en los fotorreceptores, en las células bipolares y en los axones más distales de las células de Müller (Wu WW et al., 2005). Hasta el momento se han identificado más de ciento treinta mutaciones en este gen (www.hgmd.org; www.dmd.nl/rs), la mayoría de ellas en los exones 4-6 que codifican el dominio discoidín, mientras que la mayor parte de las mutaciones que ocurren en la región de los exones 1-3 producen una terminación prematura de la transcripción, originando una proteína truncada o ausencia de la proteína.

Figura I.11: Diagrama del gen RS1 y sus seis exones. Los exones 4-6 (sombreados) comprenden el dominio discoidín. Las barras grises (encima) indican la frecuencia relativa de mutaciones dentro de cada exón (Tantri et al., 2004)

6.3- LA PROTEÍNA: RETINOSQUISINA La Retinosquisina se expresa y se secreta a nivel de los fotorreceptores, en las células bipolares y en los procesos distales de las células de Müller, en forma de un complejo proteico formado por varias subunidades. La proteína secretada se asocia, por un lado, con la superficie de conos y bastones a nivel del segmento interno, de la capa nuclear externa y de la capa plexiforme externa y, por otro lado, se une a la superficie de las células bipolares dentro de la capa nuclear interna y de la capa plexiforme interna de la retina (Reid SN et al., 2003).

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I- Introducción La característica estructural más destacada de la proteína es el dominio discoidín, formado por 157 aminoácidos (exones 4-6 de RS1), que suponen el 75% de la cadena polipeptídica procesada (Sauer GC et al., 1997). Los dominios discoidín están presentes en una gran variedad de proteínas de membrana y extracelulares, que intervienen en procesos de señalización y de adhesión celular (Factor V y Factor VIII involucrados en la coagulación sanguínea; Neuropilinas 1 y 2, que intervienen en la regeneración y degeneración del sistema nervioso, etc) (Baumgartner S et al., 1998; Vogel, 1999). Las proteínas que contienen esta estructura contienen resíduos de cisteína al principio (Cys63) y al final (Cys 219) del dominio. Ambos aminoácidos se sitúan próximos entre sí y son necesarios para el correcto plegamiento de la proteína, ya que forman un puente disulfuro intramolecular (Wu WW & Molday RS, 2003). Además, este dominio tiene tres resíduos de cisteína adicionales: - Cys110 y Cys 142, que se supone que forman otro enlace disulfuro, estabilizando estas regiones de la proteína para su inserción en la bicapa lipídica; - Cys83: no aparece en el dominio discoidín de otras proteínas y aparece muy enterrado dentro de la Retinosquisina, por lo que se especula que alteraciones en esta posición deben tener un bajo efecto en el plegamiento, en la secreción o en el ensamblaje de la proteína.

Recientemente, se ha analizado la estructura oligomérica de la Retinosquisina para comprender las funciones de esta proteína extracelular en la adhesión de las células retinianas y cómo las mutaciones en RS1 producen Retinosquisis (Wu W et al., 2005). Este estudio ha permitido determinar que la estructura de esta proteína es un octámero constituído por ocho subunidades idénticas, formado por la unión de cuatro dímeros. Todas las uniones se establecen mediante puentes disulfuro, de la siguiente manera: - puentes intermoleculares entre los resíduos Cys 59∼Cys223: mantienen la formación del octámero; - puentes intermoleculares entre resíduos Cys40∼Cys40: forman dímeros entre dos subunidades adyacentes o entre dos subunidades opuestas. (Figura I.12).

Figura I.12: A) Representación esquemática de la Retinosquisina procesada (sin el péptido señal de 23 aminoácidos). La región RS1 (círculo) comprende los primeros 39 resíduos de la proteína y 5 resíduos del extremo C-terminal. El dominio discoidín se representa en la elipse, las cisteínas involucradas en enlaces disulfuro intramoleculares (azules) e intermoleculares (negras o grises) también se muestran. B) Estructura del octámero: representados en gris, los enlaces disulfuro Cys40 forman dímeros entre subunidades adyacentes (en este modelo, no se descarta que se puedan establecer entre subunidades opuestas); los enlaces Cys59∼Cys223 que mantienen la formación del octámero se muestran en negro. (Wu et al., 2005).

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I- Introducción

Asimismo, se ha especulado que el proceso de secreción de la Retinosquisina debe ser el siguiente: la secuencia líder inicia la inserción y traslocación de la cadena peptídica naciente a través de la membrana del retículo endoplasmático (RE). Una señal peptidasa en el lumen del RE corta la secuencia líder en la Ser23, dando lugar al polipéptido procesado. El plegamiento del dominio discoidín ocurre con la formación de los enlaces intramoleculares Cys63∼Cys219 y Cys110∼Cys142, mediante puentes disulfuro. A continuación, se establecen los puentes disulfuro intermoleculares Cys40∼Cys40 y Cys59∼Cys223 entre los segmentos 5´y 3´ flanqueantes al dominio discoidín, para formar el octámero (Figura I.12).

Figura I.13: Secreción de la Retinosquisina. En este esquema se representa la inserción de la proteína en el retículo endoplasmático (RE), el ensamblaje de los monómeros mediante puentes disulfuro y su secreción (Wu et al., 2005).

También se han realizado estudios con modelos estructurales del dominio discodín, con el fin de predecir cuál es el efecto de las mutaciones en el gen RS1 (Wang T et al., 2006). En este caso, los autores concluyeron que existen tres mecanismos moleculares diferentes que producen XLRS: mutaciones que interfieren en la secreción, mutaciones que interfieren en la oligomerización y mutaciones que permiten la secreción y oligomerización, pero que interfieren en la función de la proteína. En conclusión, se produce retención intracelular de la mayoría de las proteínas mutantes, lo que explicaría porqué la severidad de la enfermedad no es específica de la mutación responsable, es decir, no existe correlación entre el genotipo y el fenotipo, como ya se había descrito con anterioridad (Wang T et al., 2002).

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I- Introducción 7- ENFERMEDAD DE STARGARDT (STGD) / FUNDUS FLAVIMACULATUS (FFM) La Enfermedad de Stargardt (STGD; MIM #248200) es una forma de degeneración macular juvenil, con un patrón de herencia autosómico recesivo, descrita por primera vez por Karl Stargardt en 1909. Se calcula que la prevalencia de la Enfermedad de Stargardt es de 1 entre 10.000, por lo que está considerada como la distrofia macular hereditaria más común. De hecho, la frecuencia de portadores en la población se ha estimado en torno a un 2% (Blacharski PA, 1988).

7.1- RASGOS CLÍNICOS Esta distrofia macular se presenta entre la primera y la segunda década de vida, produciendo una severa disminución de la agudeza visual central mientras que la visión periférica es normal. En la mayor parte de los casos, los pacientes presentan una agudeza visual normal durante su infancia (Zhang K et al., 1995; Allikmets R et al., 1997; Allikmets R, 1997b). Desde un punto de vista histopatológico, el rasgo más característico es la aparición de acúmulos de lipofucsina que se depositan en forma de motas amarillentas hacia el polo posterior del EPR. En los estadíos más avanzados, se observa una gran zona atrófica en la mácula. Otros hallazgos oftalmológicos muestran, mediante AFG, un fenómeno conocido como coroides oscura o silente: la circulación retiniana destaca considerablemente sobre una coroides oscura, debido a que la fluorescencia de los capilares se ve enmascarada por los acúmulos de pigmento que contienen las células del EPR. El electrorretinograma (ERG) y el electroculograma (EOG) pueden ser normales en estadíos tempranos, pero se muestran moderadamente alterados en las formas más avanzadas de la enfermedad (Aaberg TM, 1986). Una variante de la STGD es el fundus flavimaculatus (FFM). Este término se utilizó por primera vez para describir un fondo de ojo con motas blanco-amarillentas de forma irregular, que aparecían dispersas por todas partes (Franceschetti A & Francois J, 1965). Por lo general, se considera que el paciente padece STGD cuando los acúmulos de lipofucsina se disponen hacia el polo posterior del EPR y la pérdida de visión comienza en primera o segunda década de vida. Sin embargo, el término FFM se emplea cuando estos acúmulos están dispersos por todo el fondo de ojo, la enfermedad tiene un comienzo más tardío y existe cierta preservación de la agudeza visual.

Figura I.14: A) Fondo de ojo de un paciente con Enfermedad de Stargardt (STGD); mácula atrófica y con acúmulos amarillos de pigmento a su alrededor. B) AFG (angiofluoresceingrafía) que muestra la coroides oscura del paciente y la fluorescencia de los acúmulos de lipofucsina; también se aprecia el patrón típico en “ojo de buey“.

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I- Introducción

7.2- EL GEN: ABCA4 El primer locus genético para la Enfermedad de Stargardt se localizó en el brazo corto del cromosoma 1 (1p21-p13) (Kaplan J et al.; 1993). Cuatro años más tarde se identificó el gen responsable de enfermedad, ABCR (retina-specific ABC transporter), y alternativamente se denominó ABCA4 (ATP binding cassette [ABC] transporter; Allikmets R et al., 1997a). Este gen consta de 50 exones que se traducen en su totalidad. Tiene una pauta abierta de lectura de 6.819 pares de bases que generan un polipéptido de 2.273 aminoácidos, denominado RmP (Rim protein; “proteína periférica”). También se han descrito formas dominantes de la enfermedad (Stargardt-like disease), cuyos genes responsables se encuentran en el cromosoma 6 (STGD3, ELOVL4; Elongation of Very Long Chain Fatty Acids-like 4; Stone EM et al., 1994), en el cromosoma 13 (STGD2; Zhang K et al., 1994) y en el cromosoma 4 (STGD4; Kniazeva M et al., 1999).

7.3- VARIANTES ALÉLICAS DE ABCA4

7.3.1- VARIANTES ALÉLICAS

Las mutaciones en ABCA4 se han visto asociadas a diferentes distrofias de retina, que incluyen: - Enfermedad de Stargardt autosómica recesiva (arSTGD) / Fundus flavimaculatus (FFM) (Allikmets R et al., 1997a) - Retinosis Pigmentaria autosómica recesiva (arRP) (Martinez-Mir A et al., 1998) - Distrofia de conos y bastones autosómica recesiva (arDCB) (Cremers FP et al., 1998) - Degeneración macular asociada a la edad (DMAE) (Allikmets R et al., 1997).

Con el fin de explicar este espectro de fenotipos oftalmológicos, los investigadores propusieron un modelo que explicaba la severidad de las enfermedades producidas por ABCA4 basándose en la actividad residual de la proteína que generaban las mutaciones en este gen (Maugeri et al., 1999). Así, se clasificaron los alelos mutantes de ABCA4 en “suaves”, “moderados” o “severos” y se estableció una correlación entre diferentes combinaciones de alelos y diferentes fenotipos: -

Los pacientes con dos alelos “moderados” o la combinación de un alelo “suave” y otro “severo”, conservan cierta actividad residual de la proteína y desarrollan STGD.

-

Las DCB o la RP, son el resultado de un genotipo con dos alelos “severos” o la combinación de un alelo “severo” y otro “moderado”. En estos fenotipos, la actividad de la proteína se ve muy reducida o es inexistente.

-

Por último, aquellos pacientes portadores de un solo alelo mutante y un alelo sano tienen un elevado riesgo de desarrollar DMAE.

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I- Introducción

Actividad residual de ABC A4

Fenotipo

Norm al

alelo 1

Norm al

DMAE

STG

STG

moderada

severa

moderada moderada

alelo 2

arDCB

RPAR

severa

severa

severa

suave

moderada

severa

Figura I.15: En este gráfico se representa la relación inversamente proporcional que existe entre la severidad de la mutación y la actividad residual de la proteína RmP (Maugeri et al., 1999).

Los estudios mutacionales de ABCA4 sugieren que quizá se trate del gen más polimórfico, hasta el momento, implicado en distrofias de retina (Lewis RA et al., 1999; Rivera A et al., 2000). De hecho, en ABCA4 se han identificado más de cuatrocientas alteraciones, desde mutaciones puntuales a deleciones de varios exones (www.hgmd.org). La mayoría de los cambios reportados son mutaciones que provocan cambio de aminoácido (Briggs CE et al., 2001; Gerth C et al., 2002; Yatsenko AN et al., 2001). Los alelos causantes de enfermedad suponen entre el 66% y el 80% de los cromosomas asociados a Stargardt estudiados (Yatsenko AN et al., 2001; Shroyer NF et al., 2001). Algunas de estas mutaciones se han encontrado en elevada frecuencia en determinadas poblaciones de Europa y Estados Unidos, sugiriendo un efecto fundador (Maugeri et al., 1999).

7.3.2- FENOTIPOS ASOCIADOS A DEFECTOS EN ABCA4

Distrofia de conos y bastones (DCB)

El diagnóstico de las DCB se realiza cuando el paciente presenta visión central disminuída o borrosa, sin presentar ceguera nocturna. El fondo de ojo se caracteriza por presentar una mácula en “ojo de buey” o con alteraciones granulares en el EPR, pudiendo existir o no cierta afectación de la retina periférica. El campo visual presenta escotoma central, mientras que el campo periférico es normal o muestra una constricción moderada. El trazado del ERG puede mostrar una respuesta de conos reducida o abolida, en comparación con la respuesta menos alterada de los bastones, o puede reflejar una alteración por igual en ambos sistemas de fotorreceptores. Retinosis Pigmentaria (RP)

Aunque las características clínicas de la RP varían de unos pacientes a otros e incluso entre los miembros afectados de una misma familia, la tríada clínica clásica consiste en afectación binocular con ceguera nocturna (hemeralopia), reducción concéntrica del campo visual (“visión en túnel”, “visión en cañón de escopeta”), pigmentación periférica del fondo del ojo con aspecto en espículas óseas u osteoclastos (Birch DG et al., 1999; Klevering et al., 2004). 26

I- Introducción

Distrofia macular asociada a la edad (DMAE)

Es la primera causa de pérdida severa de visión entre la población de edad avanzada en el mundo occidental (Allikmets et al., 1997). Es una enfermedad multifactorial, en la que interviene un componente ambiental (tabaco, dieta, nivel de colesterol) y un componente genético (un alelo mutante en gen ABCA4, polimorfismos en el gen del factor H del complemento; ambos en el cromosoma 1). Por lo general, afecta a personas mayores de cincuenta años, aunque la incidencia aumenta considerablemente a partir de los setenta años de edad. Se estima que un 30% de la población de esta franja de edad padece alguna forma previa de la enfermedad, denominada MAE (Maculopatía asociada a la edad), que produce alteraciones -percepción de manchas por la mañana, cuando el ojo se ha acostumbrado a la oscuridad del sueño-, debido a la acumulación de drusas en la retina. Puede que el proceso se detenga en esta fase o que evolucione hacia una de las dos formas de DMAE: - forma húmeda: se produce de manera repentina, por la formación de neovasos; - forma seca: se produce una evolución más lenta y progresiva, en la que las drusas se van fundiendo y forman zonas de atrofia.

Figura I.16: Fondos de ojo correspondientes a los distintos fenotipos producidos por mutaciones en ABCA4, además de la STGD: A) Distrofia de conos y bastones; B) Retinosis Pigmentaria; C) Distrofia Macular Asociada a la Edad.

7.4- LA PROTEÍNA: ABCA4/RmP La proteína codificada por el gen ABCA4 también recibe el nombre de Rim Protein (RmP) porque aparece en los bordes (en inglés rims) de los discos del segmento externo de los fotorreceptores. ABCA4 es un miembro de la superfamilia de los transportadores de tipo ABC (adenosin triphosphate-binding cassette). Muchas de estas proteínas utilizan ATP para transportar sustratos -péptidos, lípidos o sustancias hidrofóbicas- a través de las membranas celulares (Azarian Sm & Travis GH, 1997). Otro miembro bien conocido de esta familia, es la proteína codificada por el gen de la fibrosis quística, CFTR.

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I- Introducción

Los típicos transportadores ABC consisten en un polipéptido que contiene dos dominios transmembrana y dos dominios de unión a nucleótidos (NBDs; Nucleotide-binding domains). Los NBDs son hidrofílicos, constan de unos noventa-ciento diez aminoácidos y están altamente conservados, compartiendo un 30-50% de homología entre los distintos transportadores. Cada NBD contiene dos motivos, el motivo “Walker A” y el motivo “Walker B”, que son comunes dentro de la categoría de proteínas de unión a nucleótidos. El rasgo distintivo entre los transportadores ABC es el motivo, que contiene la secuencia consenso “LeuSerGlyGlyGln” (Stefkova J et al., 2004).

Figura I.17: Transportador ABC completo, con 2 dominios transmembranales y 2 NBDs (Stefkova J et al., 2004).

ABCA4 es un transportador de tipo flipasa (transmembranal), localizado en la membrana intradiscal del segmento externo de los fotorreceptores. En condiciones normales, la proteína RmP transporta un compuesto denominado todo-trans-retinal o N-RPE (N-retinilideno-fosfatidiletanolamina), desde la membrana intradiscal al citoplasma del fotorreceptor, mediante la hidrólisis del enlace existente entre el todo-trans-retinal y la fosfatidiletanolamina (Sun H et al., 2000). En el citosol, el todo-trans-retinal se reduce a todo-trans-retinol, que atraviesa la membrana plasmática del segmento externo y es capturado por las células del EPR, donde se reconvierte en 11-cis-retinal (cromóforo común a los cuatro tipos de fotopigmentos). Por tanto, esta proteína transporta derivados de la vitamina A en los segmentos externos de los fotorreceptores después de su exposición a la luz. En ausencia de la proteína RmP, su sustrato comienza a acumularse en el espacio intradiscal y al unirse una segunda molécula de N-RPE, se genera el compuesto A2PE (N-retinilideno-N-retinilfosfatidiletanolamina). Por último el A2PE se hidroliza, originando un fluoróforo de lipofucsina denominado A2E (Nretinilideno-N-retinil-etanolamina), cuya acumulación es tóxica para las células del EPR, que son las encargadas de digerir los discos del segmento externo de los fotorreceptores (Eldred GE & Lasky MR, 1993). De forma secundaria al fallo de estas células, se produciría la muerte de los fotorreceptores.

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I- Introducción

Figura I.18: Ciclo de los retinoides. Para el correcto funcionamiento de la vía visual, la molécula de todo-trans-retinal debe salir del segmento externo del fotorreceptor transportada por la proteína RmP, codificada por el gen ABCA4.

8- PERSPECTIVAS DE FUTURO: TRATAMIENTOS

8.1- REMODELACIÓN DE LA RETINA EN EL PROCESO DEGENERATIVO Estudios recientes en ratas con mutaciones en genes que se expresan tanto en fotorreceptores (FR) como en células del epitelio pigmentario (EPR), han permitido observar que cuando comienza la degeneración y muerte de los FR, el resto de las neuronas involucradas en la vía visual tratan de establecer nuevas conexiones sinápticas con las células que no están dañadas (Cuenca N et al., 2004; Cuenca N et al., 2005). Este hecho provoca una remodelación de la estructura de la retina, que es importante conocer para poder aplicar los futuros tratamientos de forma eficaz. El proceso degenerativo estudiado se produce en tres fases: - Fase 1: los FR sufren un período de estrés, en el que se produce la desorganización de sus contactos sinápticos; - Fase 2: se produce la muerte gradual de los FR y puede iniciarse la muerte de alguna neurona retiniana; - Fase 3: las células neuronales se mueren progresivamente, incluyendo las células ganglionares, y las células de Müller rellenan los espacios dejados por éstas. A su vez, las células del EPR migran e invaden las retina. La red vascular aparece totalmente modificada. Según la fase de la enfermedad, se deberán utilizar estrategias terapéuticas distintas. Si la enfermedad se encuentra en la fase 1 y 2, se podrán emplear estrategias para ralentizar la degeneración, como son la inyección de factores neurotróficos, células encapsuladas o estrategias para curar la 29

I- Introducción enfermedad, como son los transplantes retinianos y la terapia génica. Si la degeneración se encuentra en fase 3, se podrán utilizar transplantes retinianos, incluyendo células y visión artificial.

8.2- TERAPIA GÉNICA La terapia génica es una nueva forma de tratamiento de las enfermedades, que consiste en la introducción en las células de material genético -genes completos y otro tipo de ácidos nucleicos- para corregir un problema biológico. La base de la terapia génica es que se puede corregir la enfermedad proporcionando a las células la información genética necesaria para que por sí mismas sinteticen la proteína adecuada, en lugar de administrarla directamente, como sucede con los fármacos convencionales. Esto permitiría en numerosos casos atacar la causa de la enfermedad, en lugar de limitarse a tratar sus síntomas. Las posibles aplicaciones de la terapia génica en el futuro tratamiento de las distrofias de retina (DR), son las siguientes:

- deficiencias enzimáticas: en estos casos, el objetivo consistiría en implantar una copia normal del gen defectuoso en un grupo pequeño de células retinianas, de tal forma que su producto proteico fuese secretado por estas células a los fotorreceptores adyacentes.

- sustitución génica: en algunas DR, la terapia génica consistiría en reemplazar el gen defectuoso directamente en los fotorreceptores. La transferencia del gen normal se realizaría por medio de un vector, que reconociese de forma altamente específica al fotorreceptor, como célula huésped. Hasta el momento, los vectores más eficaces son los de tipo viral. Para construir un vector viral de terapia génica, se deben eliminar los genes del virus (fundamentales para que pueda multiplicarse) y sustituirlos por el gen terapéutico. De esta forma, se aprovecha la eficacia del virus para entrar en las células y se evitan los riesgos de su diseminación.

- factores neurotróficos: protegen a las neuronas de la muerte celular, aportando nutrientes e inhibiendo el proceso de apoptosis que se origina en la retina. El problema que se plantea es que es necesaria una administración continuada de estos factores, lo que puede ocasionar efectos secundarios adversos. Además, resulta difícil atravesar la barrera sanguínea retinal. Con terapia génica, los factores neurotróficos se podrían aplicar en dosis fisiológicas y se podrían evitar los efectos secundarios.

Hoy en día, se está experimentando con terapia de células encapsuladas, que consiste en implantar en la retina bolitas de material sintético poroso que contienen células del epitelio pigmentario transformadas genéticamente para producir cantidades masivas del factor neurotrófico.

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I- Introducción

8.3- RETINAS ARTIFICIALES Los investigadores Alan y Vincent Chow han inventado la llamada Retina Artificial de Silicio (ASRTM), un microchip que mide menos de una décima de pulgada y que es menos grueso que un cabello humano. El ASRTM contiene tres mil quinientas células solares microscópicas que convierten la luz en impulsos eléctricos. El propósito de este chip es reemplazar los fotorreceptores dañados de la retina, ya que intentan sustituir la estimulación que realizan los fotorreceptores sobre sus células diana, como son las células horizontales y las bipolares. La cirugía consiste en una minúscula incisión en la córnea, que permite situar el implante tras la retina. Los primeros implantes de retinas artificiales, en pacientes con diversos grados de ceguera, ya se han completado. De momento, únicamente se están evaluando la seguridad y la efectividad del chip, colocando una versión reducida de éste en un lateral de la retina. Si los implantes son tolerados por el ojo, se realizarán nuevas operaciones a mayor escala, que podrían devolver la visión incluso a pacientes en estadíos muy avanzados de la enfermedad.

8.4- CÉLULAS MADRE Son aquellas células dotadas simultáneamente de la capacidad de autorrenovación (es decir, producir más células madre) y pluripotencia o totipotencia, es decir, de originar células hijas comprometidas en determinadas rutas de desarrollo, que finalmente se diferenciarán en tipos celulares especializados. En el contexto de la actual investigación, se pretende obtener células madre que se mantengan como tales en cultivo en el laboratorio y que, bajo determinados estímulos, puedan conducir a poblaciones de células diferenciadas. Las células madre embrionarias de ratón (y quizá las humanas), son excelentes para manipulación genética, y pueden realizar recombinación homóloga, por lo que se podría ensayar incluso terapia génica sustitutiva, reemplazando genes anómalos por versiones correctas. Esta técnica consistiría en transferir un núcleo somático a un óvulo y desarrollar el blastocisto artificial, a partir del cual se aislarían las células madre y se manipularían por ingeniería genética para corregir el defecto. También se puede intentar la manipulación genética de células madre no embrionarias: se ha visto que células madre neuronales de fetos humanos fueron manipuladas genéticamente y demostraron su capacidad de secretar productos terapéuticos, por lo que muestran un potencial para corregir defectos metabólicos en neuronas y glía. En este sentido, se ha destacado la utilidad de las células madre de retina, así como la aparición de una nueva metodología para emplear vectores no víricos en terapia génica a través de los denominados inmunoliposomas.

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  Cristalografía de Rayos X del esqueleto azúcar-fosfato del ADN.  Rosalind Franklin, 1952.                   

II‐ Justificación, Hipótesis de Trabajo y Objetivos   

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II- Justificación, Hipótesis de Trabajo y Objetivos

II‐ JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS DE TRABAJO Y OBJETIVOS

Las distrofias hereditarias de retina son un grupo muy heterogéneo, tanto genética como clínicamente, de enfermedades oftalmológicas degenerativas. Hasta el momento, el tratamiento de estas retinopatías aún no es posible. El estudio molecular de los genes responsables resulta fundamental, ya que permitirá: - establecer la confirmación molecular del diagnóstico clínico previamente establecido; - determinar el patrón de herencia con el que se transmite la patología y ofrecer una prevención eficaz a través de un asesoramiento genético adecuado y - conocer el defecto genético causante de enfermedad, para poder aplicar el tratamiento preciso en el futuro.

Los objetivos planteados en este trabajo han sido los siguientes:

1- Caracterizar, desde el punto de vista genético y molecular, a los pacientes clínicamente diagnosticados de Enfermedad de Norrie, Retinosquisis, Enfermedad de Stargardt y formas asociadas. 2- Validar la técnica de genotipado empleada en el estudio del gen ABCA4 (microarray). 3- Determinar el origen parental de las mutaciones mediante el estudio genético familiar. 4- Establecer una correlación genotipo-fenotipo. 5- Facilitar al paciente un asesoramiento genético adecuado. 6- Contribuir a los estudios epidemiológicos de las distrofias de retina estudiadas.

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“El Hombre de Vitruvio” Leonardo da Vinci, alrededor de 1490.

III- Pacientes y Métodos

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III- Pacientes y Métodos

III- PACIENTES Y MÉTODOS 1- PACIENTES Y FAMILIAS ESTUDIADAS 1.1- PROCEDENCIA DE LOS PACIENTES El reclutamiento de pacientes y familiares que han participado en este estudio se realizó a través de la Red Española de Investigación en Distrofias de Retina (EsRetNet) -constituida por seis grupos multidisciplinares de investigación: Fundación Jiménez Díaz (Madrid), Hospital San Pablo (Barcelona), Hospital de Tarrasa (Tarrasa), Hospital La Fe (Valencia), Hospital Virgen del Rocío (Sevilla) y Universidad de Vigo (Vigo)- y de otros hospitales externos. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes que participaron en el estudio, de acuerdo con los principios establecidos en la Declaración de Helsinki (www.wma.net).

1.2- CONSULTA Y CUESTIONARIO INICIAL El diagnóstico de los pacientes fue llevado a cabo por genetistas y oftalmólogos experimentados. Habitualmente y con el fin de obtener la mayor cantidad de información posible, se entrega al paciente un cuestionario que debe cumplimentar. En él se recogen los datos personales y familiares del afecto, así como el registro de cuándo comenzó a padecer los primeros síntomas. La información recogida en el cuestionario y en la consulta, así como los datos clínicos obtenidos en el examen oftalmológico, serán de gran utilidad para elaborar una historia clínica completa y orientar el estudio del gen responsable de su enfermedad.

1.3- CLASIFICACIÓN DE LAS FAMILIAS ESTUDIADAS El estudio clínico y molecular se ha realizado en un total de 169 familias, que fueron clasificadas de acuerdo con los siguientes criterios clínicos: - Los pacientes con Enfermedad de Norrie o con vitreorretinopatía exudativa se diagnosticaron según los criterios oftalmológicos establecidos por Warburg (Warburg M, 1975), la presencia o no de síntomas sistémicos y su evolución. El diagnóstico diferencial incluye el “pseudoglioma” que puede ser debido a diversas causas como inflamación, hemorragia, trauma, neoplasia u otra malformación congénita. - El diagnóstico de pacientes afectos de Retinosquisis se fundamenta en signos oftalmoscópicos que incluyen microquistes perifoveolares radiales (patrón en “rueda de carro”), opacidad de vasos retinianos, lesiones en la retina periférica y alteraciones en el cuerpo vítreo (“velos vítreos”). El ERG muestra disminución de la onda “b”. El diagnóstico diferencial incluye la RP típica y la enfermedad de GoldmannFavre (presencia de cuerpo vítreo licuificado con presencia de velos vítreos, edema macular, degeneración pigmentaria de la retina con hemeralopia y ERG extinguido), los traumatismos y el desprendimiento de retina antiguo.

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III- Pacientes y Métodos - Los pacientes con Enfermedad de Stargardt se seleccionan según los siguientes criterios oftalmológicos: pérdida de la visión central, reducción de la agudeza visual a una edad temprana, pérdida del reflejo foveal, apariencia granular de fóvea, estrías alrededor de la lesión macular, atrofia coroidal en el centro de la retina y esclerosis de vasos coroidales, cambios en el epitelio pigmentario de la retina. Cuando los acúmulos de pigmento se localizan hacia el polo posterior de la retina, se denomina Fundus flavimaculatus.

- El diagnóstico de la distrofia de conos y bastones se basa en los siguientes criterios: pérdida de la visión central con historia de ceguera nocturna, severa reducción de la agudeza visual (20/100 que empeora con la edad) y alteración de la visión de los colores. Los hallazgos funduscópicos muestran degeneración macular, alteraciones en la retina periférica que incluyen acúmulos de pigmento o afinamiento del epitelio pigmentario. La disminución de la respuesta del ERG se produce primero en los conos y posteriormente en los bastones. - La Retinosis Pigmentaria se diagnostica en pacientes que desarrollan ceguera nocturna a una edad temprana con reducción progresiva y concéntrica del campo visual. El fondo de ojo presenta vasos retinianos disminuidos, despigmentación del EPR, pigmento en forma de osteoclastos (espículas óseas) y palidez papilar. La respuesta del ERG disminuye en los bastones y posteriormente en los conos, llegando a estar abolida en la etapa final de la enfermedad. (Birch DG et al., 1999; Klevering BJ et al., 2004). - Los pacientes con distrofia macular autosómica dominante presentan una herencia autosómica dominante (a diferencia de la STGD, DCB y RP, que son autosómicas recesivas) y las siguientes características oftalmológicas: pérdida de la agudeza visual central y anomalías maculares simétricas. La edad de comienzo es variable, aunque generalmente se produce durantes las dos primeras décadas de vida.

Las familias presentadas en este trabajo, los genes implicados y los fenotipos asociados se muestran en la siguiente tabla:

Gen estudiado

Nº familias

NDP

11

RS1

29

ABCA4

Total

Nº familias vs. fenotipo

Diagnóstico clínico

2

Enfermedad de Norrie

9

Vitreorretinopatía exudativa

29

Retinosquisis

74

Enfermedad de Stargardt

28

Distrofia de conos y bastones

17

Retinosis Pigmentaria Autosómica Recesiva

3

Fenotipo diverso

7

Distrofia macular autosómica dominante

129

169 Tabla III.1: Clasificación de las familias estudiadas en este trabajo.

36

III- Pacientes y Métodos a) Gen NDP (Retinopatías ligadas al cromosoma X): - Enfermedad de Norrie (ND): ANF-7, ANF-8. - Vitreorretinopatía exudativa familiar (VREF): XLDM-46, ND-1, ND-2, ND-4, ND-5, ND-6, ND-10, ND-12, ND-14. b) Gen RS1 (Distrofia Macular ligada al cromosoma X): - Retinosquisis juvenil: XLRS-29, XLRS-30, XLRS-43, XLRS-44, XLRS-45, XLRS-53, XLRS-55, XLRS-56, XLRS-70, ONCE-62, XLRS-93, XLRS-95, XLRS-97, XLRS-101, XLRS-102, XLRS-103, XLRS-104, XLRS107, XLRS-108, XLRS-112, XLRS-114, RP-130bis, RP-162bis, XLRS-124, XLRS-143, XLRS-144, XLRS145, XLRS-161, XLRS-185. c) Gen ABCA4: (Distrofias Maculares Autosómicas Recesivas -STGD, DCB-, Retinosis Pigmentaria Autosómica Recesiva y Distrofia Macular Autosómica Dominante): - Enfermedad de Stargardt (STGD): ARDM-12, ARDM-14, ARDM-15, ARDM-16, ARDM-17, ARDM-22, ARDM-31, ARDM-38, ARDM-39, ARDM-40, ARDM-47, ARDM-52, ARDM-57, ARDM-58, ARDM-60, ARDM61, ARDM-62, ARDM-63, ARDM-64, ARDM-65, ARDM-66, ARDM-67, ARDM-68, ARDM-69, ARDM-71, ARDM-72, ARDM-75, ARDM-76, ARDM-77, ARDM-78, ARDM-81, ARDM-82, ARDM-83, ARDM-84, ARDM88, ARDM-90, ARDM-91, ARDM-96, ARDM-100, ARDM-110, ARDM-111, ARDM-116, ARDM-117, ARDM118, ARDM-119, ARDM-122, ARDM-123, ARDM-125, ARDM-128, ARDM-129, ARDM-130, ARDM-131, ARDM-135, ARDM-137, ARDM-138, ARDM-139, ARDM-140, ARDM-142, ARDM-146, ARDM-148, ARDM151, ARDM-153, ARDM-155, ARDM-156, ARDM-158, ARDM-160, ARDM-162, ARDM-163, ARDM-164, ARDM-165, ARDM-167, ARDM-168, ARDM-170, SRP-773. - Distrofia de conos y bastones (DCB): ARDM-49, ARDM-79, ARDM-85, ARDM-86, ARDM-99, ARDM-126, ARDM-133, ARDM-134, ARDM-159, ARDM-169, ARDM-174, ARDM-176, ARDM-192, ARDM-195, RP-55, RP-267, RP-577, RP-586, RP-657, RP-719, RP-763, RP-827, RP-828, RP-959, RP-964, RP-965, RP-971, RP-973. - Retinosis Pigmentaria Autosómica Recesiva (RPAR): ARDM-54, ARDM-89, RP-82, RP-417, RP-578, RP586, RP-700, RP-716, RP-766, RP-775, RP-813, RP-818, RP-834, RP-854, RP-857, RP-927, RP-937. - Fenotipo diverso (en la misma familia, existen casos de STGD, DCB o RPAR): RP-280, RP-315, RP-532. - Distrofia macular autosómica dominante: ADDM-59, ADDM-74, ADDM-80, ADDM-92, ADDM-94, ADDM105, ADDM-106.

Los árboles genealógicos se muestran a continuación:

37

III- Pacientes y Métodos

Gen NDP: Familias con Retinopatías ligadas al cromosoma X -ND, VERF-

ANF-8

ANF-7

I:1

I:1

I:2 01/746

II:1

II:1 01/745

II:2 SG-2651 V89fs

XLDM-46

I:2

II:2 SG-2658

I:1 01/701

II:3

II:1 01/700

II:1 01/752

II:2

II:1

IV:1 03/134

V:1

IV:2

V:2

IV:3

II:3 01/534

II:4

II:5 01/699

III:2 01/695

III:3 01/696

I:2 01/754

II:3 01/751

ND-2 I:1

III:1

II:2

III:1 01/535

ND-1

I:1 01/753

I:2 01/702

II:2

II:3

II:4

III:2 03/130

IV:4 03/139

V:3 V:4 03/140 03/141

I:2

III:3

IV:5

IV:6 03/131

V:5 03/132

V:6 03/133

IV:7 03/599

IV:8 03/600

III:4

IV:9

V:7

38

IV:10 03/598

V:8

III:5

IV:11

III:6

II:5

III:7

IV:12

III:8

IV:13

V:9

IV:14

V:10

IV:15

V:11

III- Pacientes y Métodos

ND-4 ND-6 I:1

I:2 03/181

II:1 03/180

I:1

II:2 03/182

II:1

ND-5

III:1

III:2

III:3

III:4

III:5

III:6

III:7

2763

2764

2765

2767

2766

2769

2768

I:2

II:2

II:3

2762

2761

III:8

III:2 01/1222

III:10

III:11

III:12

III:13

2770

2772

2771

2774

2773

IV:2

IV:3

IV:4

IV:5

IV:6

IV:7

IV:8

IV:9

IV:10

IV:11

IV:12

IV:13

2775

2776

2777

2778

2779

2780

2781

2782

2783

2784

2785

2786

2787

I:1

III:1 01/1220

III:9

IV:1

ND-10

II:2 01/1221

04/33

I:1

II:1

II:1

I:2

II:3 01/1223

ND-12 I:2

II:4

III:3

II:5 03/553

III:4

II:6

II:1

ND-14

I:1

I:2

05/820

05/848

II:2

II:3

05/821

05/817

III:1

III:2

II:1

05/849

III:1 05/930

39

I:1

I:2

II:2

II:3

II:4

05/1148

05/1149

III:2

II:5 05/1146

III:3

III:4

05/1151

05/1150

III- Pacientes y Métodos

Gen RS1: Familias con Distrofia Macular ligada al cromosoma X -Retinosquisis-

XLRS-29

I:1

II:1

III:1 96/548

IV:1 96/549

III:2 96/765

IV:2 96/550

IV:3 96/417

III:3 97/61

IV:4 97/60

II:2

III:4

IV:5 97/59

IV:6 97/81

I:2

II:3

III:5 96/558

IV:7 97/82

IV:8 96/523

III:6 96/526

IV:9 96/528

IV:10 96/551

III:7

III:8 96/524

IV:11 96/527

IV:12 96/525

III:9 96/552

II:4

III:10

IV:13 96/709

III:11

IV:14 96/708

IV:15 96/554

III:12 96/553

IV:16 96/555

IV:17 96/556

XLRS-30

I:1 99/685

II:1 99/687

III:1

I:2

II:2 99/686

III:2 99/684

II:3

III:3 99/688

II:4

III:4

XLRS-43

XLRS-44

I:1

I:1 02/596

I:2

I:2 02/595

? II:1

III:1 01/508

II:1

II:2 02/46

III:2 02/47

III:1

III:2

II:2

III:3

III:4

II:3

III:5

III:6 01/22

40

II:4

III:7

III:8

II:5

III:9

III:10

II:6

III:11

III:12

II:7

III:13

III:14

III:15

III- Pacientes y Métodos

XLRS-53

XLRS-45

I:1

II:1

III:1 00/719

I:1

I:2 01/674

II:2 00/718

III:2 00/720

II:1

III:3

II:2 01/1221

III:1 01/1220

I:2

II:3 01/1223

III:2 01/1222

II:4

II:5 03/553

III:3

III:4

II:6

XLRS-70 I:1

XLRS-56

XLRS-55 I:1 01/169

II:1 00/584

II:2 00/585

I:1 01/1247

I:2 01/170

II:3 00/586

I:2

II:4 00/587

II:1 01/1248

II:5 00/588

II:2 01/1251

I:2 01/1249

II:3 01/1250

II:1

II:4 01/1252

III:1

II:2

III:2 04/657

II:3

II:4

III:3 04/708

III:4 04/707

IV:1

ONCE-62

I:1 01/753

II:1 01/752

I:2 01/754

II:2

I:1 03/544

II:3 01/751

II:1 03/532

XLRS-97 I:1 03/817

I:1

I:2 03/545

II:2 03/533

II:3 03/546

II:1 03/986

I:1 03/943

I:2 03/942

II:2 03/974

II:3 03/941

II:1 03/745

I:1

II:4 03/940

41

I:2

II:1 03/894

I:2 03/746

II:2 03/748

XLRS-102

XLRS-101 I:2 03/818

II:1 03/816

XLRS-95

XLRS-93

II:3 03/747

XLRS-103

I:1

I:2

II:1 03/895

III- Pacientes y Métodos

XLRS-104 I:1

II:1 04/1281

II:2

II:3 04/1280

III:1 04/1278

II:4

III:2 03/986

III:3 04/1277

XLRS-107 I:1 03/961

II:2 03/962

III:1 03/964

III:2 03/965

RP-130bis I:1 2042

II:1 2044

II:6

III:4 04/803

III:5

I:1 03/971

I:2 03/972

II:1 03/970

II:2 03/969

I:1 03/632

II:3 2046

II:1 99/267

I:1

I:1

I:2

II:1

II:3 04/1631

II:2 04/704

I:1

I:1

II:4 04/1633

I:1 05/1219

I:2 05/1220

? II:1 04/805

II:1 04/1522

II:1 04/806

42

II:2 06/203

I:2

II:1 04/804

XLRS-185

I:2

II:3 04/705

XLRS-143

III:2 04/1632

XLRS-161

I:2

I:2 04/706

II:1 04/56

I:2

II:2 04/315

XLRS-145 I:1

I:1

XLRS-124

III:1 02/1050

XLRS-144

XLRS-114

I:2

I:1

II:3 03/631

III:6 04/1276

II:1 03/148

I:2 99/266

II:2 99/268

II:7 04/1275

XLRS-112

RP-162bis

I:2 2043

II:2 2045

II:5 04/1279

XLRS-108 I:2

II:1 03/963

I:2

II:1 05/1221

III- Pacientes y Métodos

Gen ABCA4: Familias con Distrofia Macular Autosómica Recesiva -Enfermedad de Stargardt-

ARDM-12

I:1 98/308

II:1 1886

I:2 98/307

II:2 98/309

I:1 98/333

I:2 98/334

II:1 04/1308

II:3 98/331

II:2 98/335

I:1 99/1012

I:2 02/281

I:1 04/701

I:1

II:2 04/703

I:2 02/814

I:1 02/145

I:2 02/146

II:1 02/813

II:2 00/573

II:1 02/147

II:2 00/1000

I:1

II:1 II:1 02/439

II:2 02/416

I:1

I:2 02/484

II:1 03/857

II:3 02/440

II:2 02/320

II:3 00/947

II:2 01/573

ARDM-52 I:3

I:1

II:1 01/1170

II:3 02/485

ARDM-60 I:1 02/533

I:2

II:2

II:1 02/319

II:3 03/676

I:2 02/268

III:2

ARDM-58

I:2 02/431

II:2 98/283

ARDM-47

I:1 02/815

I:1 02/438

II:1 CG-1728

I:1 02/267

II:2

ARDM-40

ARDM-57

I:2 98/282

ARDM-38

I:2 03/677

II:1 99/964

III:1

ARDM-39

II:2 99/1014

I:1 98/284

ARDM-31

I:2 04/702

II:1 98/900

II:1 97/451

ARDM-16

I:2 99/1013

II:1 CG-1673

II:3 98/336

ARDM-22

ARDM-17

I:1 02/282

ARDM-15

ARDM-14

II:1 02/531

II:3 02/535

II:2

II:3

ARDM-61 I:1 02/724

I:2 02/530

I:2 02/726

II:2 02/532 II:1 02/721

II:2

III:1 02/534 III:1 02/723

43

I:2

II:3 02/722

II:4 02/725

III- Pacientes y Métodos

ARDM-62 I:1

I:2 02/759

I:1 04/3

II:1 II:1

II:2 02/756

II:3 02/599

II:4

III:1

II:5

II:3 04/1

II:1 02/622

II:4 02/662

ARDM-67

ARDM-66

I:2 02/1150

I:1

I:1 02/644

I:2

II:1 02/645

II:1 02/429

I:1 02/764

I:2 02/763

II:2 02/766

II:3 02/765

I:2 02/833

I:1 02/1090

II:1 03/126

II:2 02/834

II:2 03/169

I:1

II:2 02/642

II:4 02/354

I:2

II:1 02/853

II:5 02/806

I:1

I:2

II:1 02/793

II:1 02/766

I:1

II:4 02/807

ARDM-69

I:2

ARDM-75

I:2 02/1089

II:3 03/127

ARDM-68

I:2 02/643

ARDM-72

ARDM-71

II:1 02/799

II:2 03/899

II:6

II:1 02/800

I:1 02/835

I:2 04/2

III:2

ARDM-65

I:1 02/1149

ARDM-64

ARDM-63

ARDM-76

I:1

I:2

ARDM-77

I:1

I:2

II:1 02/857

II:1 02/855

? III:1 05/50

ARDM-78

II:1 02/887

I:1

I:2 02/890

II:2 02/888

II:3 02/889

ARDM-81 I:1 05/1366

II:4 02/891

ARDM-83

ARDM-82

I:2 05/1367

II:1 02/915

44

I:1 03/187

I:2 03/188

II:1 03/183

II:2 03/189

I:1 03/338

I:2

II:1 03/337

II:2 03/339

III- Pacientes y Métodos

ARDM-84

I:1 03/344

I:1

I:2 03/341

II:1 03/340

II:2 03/342

I:1 04/817

II:2 03/749

ARDM-117

I:1

I:1

I:2

II:1 04/264

I:1 04/561

II:1 04/559

ARDM-123

II:1 04/87

II:2 04/816

II:2 04/616

I:1 03/771

II:1 03/770

I:1 05/1368

II:4 04/183

II:1 05/1370

ARDM-128

I:1

II:1 05/88

II:2 04/387

I:2 05/87

II:3 05/86

45

II:2 05/392

II:3 05/395

ARDM-116

I:1 04/577

I:1

I:2 04/578

II:2

II:3 03/1158

I:1 05/1256

I:2 05/1255

II:1 04/1414

II:3 04/184

ARDM-129

ARDM-130

I:1

I:1

I:2

II:1 04/399

II:2 04/143

II:3

ARDM-122

I:2 05/1369

II:2 05/1371

I:2

II:1 04/142

ARDM-119

II:3 04/558

I:2 03/772

II:1 03/425

II:3 03/773

I:2 05/394

ARDM-111

II:1 04/624

I:2 04/560

ARDM-125

I:1 05/593

II:2 03/564

I:2 04/903

ARDM-118

I:2

II:1 04/144

I:1 04/871

ARDM-91

I:2 03/775

II:1 03/848

ARDM-110

I:2

II:1 04/754

I:1 03/774

II:2 03/378

ARDM-100

I:2 04/609

II:1 04/608

I:2

II:1 03/910

II:3 03/343

ARDM-96 I:1

ARDM-90

ARDM-88

I:2

II:1 04/509

I:3 04/1590

I:4 04/1520

II:2 04/233

II:3 04/1521

ARDM-131

I:1 04/491

II:1 04/458

I:2 04/492

II:2 04/493

III- Pacientes y Métodos

ARDM-135

I:1

ARDM-138

ARDM-137

I:2

I:1 04/840

I:2 04/841

I:1 03/1094

ARDM-140

I:2 05/29

I:1 04/734

I:1 04/769

I:2 04/733

I:2 04/770

? II:1 04/542

II:1 05/30

II:1 04/839

II:1 04/735

II:2 04/674

II:1 04/771

II:2 04/772

II:3 04/768

ARDM-142

I:1 04/492

II:1

II:2

II:4

I:1

I:2 04/849

ARDM-156

II:1 04/1394

I:2 04/1396

II:2 04/1397

II:3 04/1398

II:6

II:7

II:8

II:9 04/920

ARDM-151

I:2

I:1

II:1 04/985

II:1 04/847

I:1 04/1395

II:5

ARDM-148

ARDM-146

I:1 04/848

II:3

I:2 04/943

I:1 04/1331

II:1

II:1 04/1209

ARDM-160

I:1

I:1 04/1512

I:2

II:1 04/1510

II:1 04/1473

II:11

II:12 04/940

ARDM-153

I:2

ARDM-158

II:10 04/941

ARDM-155

I:2 04/1332

II:2 04/1242

II:13

II:3 04/1333

I:1 04/1361

I:2 04/1362

II:1 04/1364

II:2 04/1364

I:2 04/1511

II:2 04/1509

ARDM-162

II:1 05/123

II:2 05/16

II:3 04/1578

II:4 05/17

II:5 05/18

46

I:1 05/15

I:2 05/24

II:6 05/19

II:7 05/20

II:8 05/21

II:9 05/22

II:10 05/23

II:11 04/1610

II:12 04/1609

III- Pacientes y Métodos

ARDM-163

II:1 04/1558

II:2 04/1559

I:1 04/1557

I:2

II:3 04/1560

II:4 04/1561

II:1

I:2 05/189

II:2 05/196

ARDM-165

ARDM-167

I:1

I:1

I:1

II:3 05/279

I:2

II:6 05/77

I:1 05/406

I:2 05/398

II:1 05/397

II:2 05/396

I:2

II:1 05/2

ARDM-139

ARDM-169 I:1

II:5 04/1562

ARDM-164

II:1 05/3

ARDM-168 I:1 05/175

I:2

I:2 05/174

II:1 05/176

II:1 05/108

II:2 05/177

SRP-773 I:1

I:2

II:1 03/207

Gen ABCA4: Familias con Distrofia Macular Autosómica Recesiva -Distrofia de conos y bastonesARDM-49

ARDM-85

ARDM-79

I:1 02/285

I:2 02/287

II:1 02/286

II:2 01/896

II:1 02/978

II:2 04/1388

I:1 04/1385

I:2 04/1384

II:3 04/1386

II:4 04/1387

I:1

II:5 04/1389

ARDM-126

I:1 04/411

II:1 04/357

II:2 04/744

I:1

I:2

I:1 04-469

II:4 04/518

II:5 04/431

II:1 04/645

II:2 04/633

I:2 04/644

II:4 04/632

?

?

III:1 06/73

III:2 06/74

47

I:1

I:4

II:1 04/536

I:1

I:2

II:1 03/864

ARDM-159

I:1

I:2 04/568

II:2 04/537

ARDM-99

II:2 04/1336

ARDM-134

I:3

II:3 04/631

I:2 04/1337

II:1 03/372

II:1 03/373

ARDM-133

I:2 04/412

II:3 04/460

II:6 04/1390

ARDM-86

II:3 04/538

I:2 04/1515

II:1 04/1504

III- Pacientes y Métodos

ARDM-169

ARDM-174

I:1

I:1

II:1

I:2 05/189

II:2 05/196

II:1 05/486

II:3 05/279

I:2

I:1 05/1328

II:1 05/1363

II:1 05/1299

RP-586

I:1

II:3 01/213

I:1

II:3 05/1327

RP-657

I:1

I:2

II:1 99/1217

II:1 01/922

RP-959

I:2 04/1229

II:1 04/1226

II:2 04/1230

II:3 04/1227

III:1 04/1231

III:2 04/1232

II:5 05/489

II:6 05/573

I:2

II:1 05/695

II:1 1053

I:2 05/734

I:1 03/671

I:2 03/673

II:1 05/736

II:2 05/735

II:1 03/672

II:2 03/98

I:1

I:2

II:2 05/535

II:3 06/130

II:4 05/537

I:2 05/694

II:2 05/698

II:3 05/697

II:1 05/515

I:2

II:1 05/612

II:4 04/1228

48

I:1

I:1

II:1 99/631

RP-828

I:2

I:1

II:1 03/1123

I:1

I:2

II:1 03/1127

RP-973 I:2

II:1 05/548

I:2

II:4 05/696

RP-827

RP-971

RP-965 I:1

RP-577

I:1 05/693

RP-763

I:1 05/751

RP-964

II:1 05/538

II:7 05/504

I:2 05/536

RP-267

RP-719

I:2

I:1

I:1 05/534

RP-55

I:2 05/1326

II:2 05/1325

I:2 05/490

II:4 05/488

ARDM-195

ARDM-192

I:1

II:2 05/487

ARDM-176

I:1

I:2

II:1 05/753

III- Pacientes y Métodos

Gen ABCA4: Familias con Retinosis Pigmentaria Autosómica Recesiva

ARDM-54

I:1 01/1239

ARDM-89

I:2 01/1237

II:1 01/1238

II:2 01/1265

I:2 03/251

II:1 03/231

II:3 01/1199

I:1

II:2 03/232

I:2

I:1

I:1 01/1242

II:1 01/1246

II:1 99/1217

RP-766

I:1

I:1

II:1 03/235

I:2

II:1 04/1505

I:1

I:2

II:1 97/884

RP-716

I:1

I:2

II:3 01/1243

II:4 01/1240

II:5 01/1200

I:1

I:2

I:2 04/1298

II:1 04/368

II:2 04/1626

I:1

I:2

RP-927 I:1 04/1553

II:1 04/1552

49

RP-834

RP-937

I:2 04/1554

II:2 04/1555

I:2

II:1 04/469

II:1 03/908

RP-857

I:2

II:1 02/464

II:6 01/1241

RP-818

II:1 03/944

I:1 04/1299

I:1

I:2 01/1244

RP-813

II:1 03/385

RP-854 I:1

II:2 01/1245

RP-775

I:2

I:2

RP-700

I:2

II:1 99/703

RP-417

II:1 1799

RP-586

RP-578

I:1

I:1 03/252

RP-82

II:3 04/1556

I:1

I:2

II:1 05/225

III- Pacientes y Métodos

Gen ABCA4: Familias con Fenotipo diverso -STGD, DCB, RPAR-

RP-280

II:1 95/93

RP-315

I:1 95/91

I:2 95/92

II:2 95/94

II:3 95/95

II:4 95/96

I:1

I:2 95/397

II:1 95/398

II:2 95/399

RP-532

I:1 99/117

II:1 99/114

I:2 99/116

II:2 99/115

II:3 99/146

Gen ABCA4: Familias con Distrofia Macular Autosómica Dominante

ADDM-59

ADDM-74

ADDM-80

I:1

I:1

I:1

II:1 02/479

I:2 02/468

I:2

II:1 02/920

II:1 02/837

II:2 03/871

I:2

ADDM-92

ADDM-94 I:1 I:1

II:1

II:2 03/446

I:2

II:3

II:1 03/640

III:1

IV:1

III:2 03/398

IV:2 03/397

III:3

III:4 03/458

III:5 03/690

III:6 03/631

IV:3 03/456

V:1 06/183

ADDM-105

ADDM-106

I:1

I:1

I:2 03/1192

II:1 03/1169

50

I:2

II:1 03/591

III- Pacientes y Métodos

2- METODOLOGÍA 2.1- OBTENCIÓN DE ADN GENÓMICO El material de partida empleado en los estudios moleculares ha sido el ácido desoxirribonucleico o ADN, obtenido a partir de muestras de 15 centímetros cúbicos (cc) de sangre periférica con el anticoagulante EDTA (ácido etilendiaminotetraacético). 2.1.1- EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO

La extracción de ADN se ha realizado utilizando dos métodos distintos:

2.1.1.1- EXTRACCIÓN DE ADN POR EL MÉTODO SALINO

En un principio, el ADN se obtuvo por precipitación salina, que consiste en tratar la muestra con una serie de disoluciones tampón (tampones) que rompen las membranas celulares de los eritrocitos y de los leucocitos. Los leucocitos o glóbulos blancos son las células nucleadas de la sangre a partir de las cuales se obtiene el ADN. El protocolo empleado fue el siguiente:

1-

Trasvasar las muestras de sangre a tubos Falcon 50 (50 ml) y enrasar con suero fisiológico (NaCl 0,09%). Centrifugar a 3000 rpm, 15 min, 4ºC.

2-

Decantar el sobrenadante. Enrasar con TLE, agitar y mantener 30 min en hielo. Centrifugar a 3000 rpm, 15 min, 4ºC.

3-

Decantar el sobrenadante. Enrasar con TLE, agitar y mantener 10 min en hielo. Centrifugar a 3000 rpm, 15 min, 4ºC.

4-

Decantar el sobrenadante. Enrasar con TLE y agitar. Centrifugar a 3000 rpm, 15 min, 4ºC.

5-

Decantar el sobrenadante. Añadir 3 ml de TLL, 200 μl SDS (dodecil sulfato de sodio) 10% y 500 μl solución proteinasa-k. Dar un vórtex e incubar a 37ºC toda la noche.

6-

Añadir 1ml NaCl 6M. Dar un vórtex. Centrifugar a 3000 rpm, 30 min, a tpa.amb.

7-

Decantar el sobrenadante en un tubo Falcon 15 (15 ml). Centrifugar a 3000 rpm, 30 min, tpa.amb.

8-

Decantar el sobrenadante en un tubo y centrifugar a 3000 rpm, 30 min, tpa.amb.

9-

Decantar el sobrenadante en un tubo y enrasar con etanol absoluto (100%). Agitar; se observa la precipitación del ADN.

10- Lavar el ADN dos veces en etanol 70% a -20ºC. 11- Pasar el ADN a tubo limpio y centrifugar en vacío 15 min para eliminar los restos de etanol. 12- Pasar el ADN a un criovial y resuspender en 700 μl TRIS-EDTA 1mM / 0´1mM.

Cuadro III.1A: Protocolo de extracción de ADN por el método salino.

51

III- Pacientes y Métodos Los reactivos utilizados se detallan a continuación: Reactivos: TLE (tampón de lisis de eritrocitos): 5 ml TRIS 2M pH 8 + 2´5 ml MgCl2 1M + enrasar con H2Od hasta 500 ml. TLL (tampón de lisis de leucocitos): 5 ml TRIS 2M pH 8 + 40 ml NaCl 5M + 4 ml EDTA 0´25M + enrasar con H2Od hasta 500 ml. Solución proteinasa-k: 10 ml proteinasa-k (10 mg/ml) + 5 ml SDS 10% + 400 μl EDTA 0´25M pH 8 + enrasar con H2Od hasta 50 ml. TRIS/EDTA 1mM/0´1mM pH8: 50 μl TRIS 2M pH 8 + 40 μl EDTA 0´25M pH 8 + enrasar con H2Od hasta 100 ml.

Cuadro III.1B: Reactivos utilizados en la extracción de ADN por el método salino. Leyenda: ml, mililitros; rpm, revoluciones por minuto; min, minutos; μl, microlitros; M, molar (moles/litro); tpa.amb., temperatura ambiente; mM, milimolar = milimoles/litro; H2Od, agua destilada.

2.1.1.2- EXTRACCIÓN AUTOMÁTICA DEL ADN

La extracción automática del ADN se realizó mediante el BioRobot EZ1 (QIAGEN, Hilden, Germany), siguiendo las instrucciones del fabricante. El aparato permite la extracción de 1-6 muestras simultáneamente, a partir de 350 μl de sangre periférica del paciente. El ADN eluido se obtiene a una concentración óptima de aproximadamente 50 nanogramos por microlitro (ng/μl).

2.1.2- ESPECTROFOTOMETRÍA DE ADN: LECTURA DE LA CONCENTRACIÓN

Esta técnica se realizó únicamente con las muestras extraídas por precipitación salina, ya que la concentración del ADN obtenido no era conocida, con el objetivo de preparar alícuotas del ADN original a una concentración óptima de 50 ng/μl. 1-

Se cuantificaron las muestras de ADN en un espectrofotómetro Gene Quant pro (Amersham), siguiendo las instrucciones del fabricante.

2-

Registrar las medidas de las ABS obtenidas: ABS 260nm: indica la concentración de ADN; ABS 280nm: indica la concentración de proteínas; ABS 230nm: indica la concentración de sales; Coeficiente ABS 260/ABS 280: indica la pureza: - valores ∼1´6: indican contaminación por proteínas - valores ∼2: indican contaminación por RNA

3-

Una vez obtenida la concentración del ADN original, preparar alícuotas a una concentración de 50 ng/μl.

Cuadro III.2: Lectura de concentración del ADN en el espectrofotómetro.

52

III- Pacientes y Métodos 2.1.3- PURIFICACIÓN DE ADN GENÓMICO

Este proceso se realiza cuando las muestras de ADN -extraídas por precipitación salina- no presentan los valores óptimos de pureza. 1-

Añadir 5 μl RNAasa A (25mg) por cada 500 μl ADN. Incubar a 37ºC, 1h.

2-

Añadir 75 μl SDS 10% por cada 1 ml ADN. Agitar.

3-

Añadir 20 μl proteinasa-k por cada 1 ml ADN. Agitar. Incubar a 56ºC, 1h.

4-

Efectuar un pase en un volumen de fenol-cloroformo. Dar un vórtex y centrifugar a 13000 rpm, 2 min. Si la muestra no está limpia, dar 2 pases. Recoger el sobrenadante.

5-

Efectuar un pase en un volumen de cloroformo-isoamílico. Dar un vórtex y centrifugar a 13000 rpm, 2 min. Recoger la fase acuosa.

6-

Añadir 80 μl NaCl 5M por cada 1 ml ADN.

7-

Añadir 2 volúmenes de etanol absoluto, para precipitar el ADN.

8-

Conservar el ADN purificado en TRIS-EDTA 1mM/0´1mM pH8.

Cuadro III.3: Purificación del ADN genómico.

53

III- Pacientes y Métodos 2.2- ESTUDIO GENÉTICO DIRECTO El protocolo para abordar el estudio directo de los tres genes de interés se realizó de la siguiente manera: a) Genes NDP y RS1:

1-

Extracción de ADN a partir de sangre periférica, del afecto y de sus familiares.

2-

Amplificación mediante PCR de los exones de cada gen estudiado, en el afecto.

3-

Secuenciación automática de los exones de cada gen.

4-

Ampliación del estudio directo a los familiares del afecto, mediante secuenciación del fragmento concreto en el que encuentra la mutación.

5-

Confirmación, mediante ensayo de restricción, de mutaciones nuevas en población control.

b) Gen ABCA4:

1-

Extracción de ADN a partir de sangre periférica, del afecto y de sus familiares.

2-

Cribado de mutaciones y polimorfismos mediante un microarray de genotipado, en el afecto.

3-

Validación de resultados mediante secuenciación automática de los exones en los que se han identificado las mutaciones responsables.

4-

Ampliación del estudio directo a los familiares del afecto, mediante secuenciación de los fragmentos concretos en los que se encuentran las mutaciones.

5-

En pacientes con un único alelo mutante identificado, cribado de la región exónica completa mediante secuenciación automática.

6-

En pacientes con un único alelo mutante identificado, cribado de la región exónica completa mediante MLPA (Multiplex Ligation Probe Assay).

7-

Confirmación, mediante ensayo de restricción, de mutaciones nuevas en población control.

8- Cribado de una mutación prevalente en población control mediante dHPLC (denaturing High Performance Liquid Chromatography)

54

III- Pacientes y Métodos 2.2.1- REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA: PCR

2.2.1.1- CONDICIONES DE LA PCR

A continuación, se muestran las condiciones que fueron utilizadas para amplificar las distintas regiones exónicas. Las secuencias de los cebadores y las temperaturas de hibridación (Th) empleadas en la amplificación de los diversos fragmentos se verán más adelante.

Reactivos y Concentraciones Reactivo ADN Tampón (Roche)

Ciclos (n=30)

Concentración

Temperatura

Tiempo

50 ng/μl

95ºC

5 min

95ºC

20 s

1´5 mM MgCl2

Nucleótidos (Invitrogen)

1´25 mM (de cada uno)

Cebadores (Pacisa+Giralt)

10 μM (de cada uno)

Th

DMSO -aditivo opcional- (Merck)

10% del volumen final

72ºC

40 s

GC-rich -aditivo opcional- (Roche)

20% del volumen final 2´5 unidades

72ºC

10 min

csp 50 μl

4ºC

∞

Taq polimerasa (Roche) Agua estéril (Braun)

30x

20 s 30x

Tabla III.2: Condiciones utilizadas para amplificar los diferentes exones de los genes NDP, RS1 y ABCA4. Leyendas: DMSO, dimetilsulfóxido; csp, cantidad suficiente para; s, segundos.

El volumen final de la reacción fueron 50 μl. La reacción de PCR se realizó en un termociclador GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems).

2.2.1.2- CEBADORES

A continuación, se muestran las secuencias de los cebadores (sentido -S- y antisentido -AS-) empleados para amplificar las regiones exónicas de los genes NDP, RS1 y ABCA4, las temperaturas de hibridación específicas y el tamaño de cada fragmento (pb). También se detalla la utilización o no de GCrich, que es un aditivo necesario: - en la amplificación de regiones ricas en guaninas y/o citosinas, más difíciles de desnaturalizar; - cuando la amplificación del fragmento no es específica. Tabla III.3: Gen NDP; los cebadores utilizados fueron descritos por Berger W et al., 1992. Exón

Cebadores

Tpa.

Tam.

(ºC)

(pb)

GC-rich

ND1

S⇒ 5´ TCCCCGATAACGAGCGCCT 3´

AS⇒ 5´ CCTAGGCAAGCCGGCAGC 3´

60

364

-

ND2a

S⇒ 5´ GTTCCATTAGTGGTTCTGGG 3´

AS⇒ 5´ TTATCACCAGCAGGGAGAGC 3´

58

322

+

ND2b

S⇒ 5´ CCGATCCTGCCCTTTCCTT 3´

AS⇒ 5´ CTTGCCTGTTTCTGAGGGAA 3´

58

337

-

ND3

S⇒ 5´ CCTGGCTAAGGTTGTGGCAT 3´

AS⇒ 5´ CCTGGGAGTAGCTTGTCCTT 3´

58

349

-

55

III- Pacientes y Métodos Tabla III.4: Gen RS1; los cebadores utilizados fueron descritos por Sauer GC et al. 1997. Exón

Cebadores

Tpa. (ºC)

Tam. (pb)

RS1

S⇒ 5´ CTCAGCCAAAGACCTAAGAAC 3´

AS⇒ 5´ GTATGCAATGAATGTCAATGG 3´

54

216

RS2

S⇒ 5´ GTGATGCTGTTGGATTTCTC 3´

AS⇒ 5´ CAAGTGATAGTCCTCTATG 3´

56

176

RS3

S⇒ 5´ CTGCCCTGCCTCTCTGGTTG 3´

AS⇒ 5´ GGTGTTCCCAATGACTGTTCC 3´

60

178

RS4

S⇒ 5´ GGTGCTTGTTGAGTATTGAG 3´

AS⇒ 5´ AAAATCCCCGGGCCCTGC 3´

54

219

RS5

S⇒ 5´ GAGAGCCAGCACCTGCGG 3´

AS⇒ 5´ GGGTGCGAGCTGAAGTTGG 3´

65

311

RS6

S⇒ 5´ CCCGATGTGATGGTGACAGG 3´

AS⇒ 5´ CTTTGTTCTGACTTTCTCTGGC 3´

62

414

Tabla III.5: Gen ABCA4; los cebadores utilizados fueron descritos por Rivera A et al. 2000. Exón

Cebadores

Tpa. (ºC)

Tam. (pb)

STG1

S⇒ 5´ AATCTGGTCTTCGTGTGGTC 3´

AS⇒ 5´ GTTTATTTGCTCCACACCTC 3´

58

141

STG2

S⇒ 5´ AATCTCTTAGCACCACTGAAC 3´

AS⇒ 5´ AGGCCCAGACCAAAGTCTC 3´

58

197

STG3

S⇒ 5´ CCTGCTTGGTCTCCATGAC 3´

AS⇒ 5´ ACGTGAAGGGGTGTGCAAC 3´

57

249

STG4

S⇒ 5´ CCTTATTAATGAGGCTTTGTC 3´

AS⇒ 5´ ATAGGTGAGGGAAATGATGC 3´

57

213

STG5

S⇒ 5´ CCATTTCCCCTTCAACACCC 3´

AS⇒ 5´ GTGCTTCCCTCCCCTCCAG 3´

58

220

STG6

S⇒ 5´ CTACCACAGGGCAGTTTCTA 3´

AS⇒ 5´ CAGGAATCACCTTGCAATTG 3´

58

285

STG7

S⇒ 5´GATCAGACTGTGCCTATGTG 3´

AS⇒ 5´ATAAGTGGGGTAAATGGTGG 3´

57

229

STG8

S⇒ 5´GAGCATTGGCCTCACAGCAG 3´

AS⇒ 5´CCCCAGGTTTGGTTTCACC 3´

54

400

STG9

S⇒ 5´AGGTTACAAGCAATGGGGAG 3´

AS⇒ 5´TCTGGGAGGTCCAGGGTAC 3´

58

239

STG10

S⇒ 5´ATCTTTGTCTGGTTTTAGGC 3´

AS⇒ 5´CCCCCCTTACTCTGATCAT 3´

50

145

STG11

S⇒ 5´GAATTTCTAAGCAGAGCAGTG 3´

AS⇒ 5´AGCTCTGGCCCCACTCATG 3´

54

303

STG12

S⇒ 5´AGTTGAGTGTTTGCAGTTGG 3´

AS⇒ 5´CTGACTTTGGAGAAATGCAG 3´

58

307

STG13

S⇒ 5´TCGGGAGGTGTGAGTGAGC 3´

AS⇒ 5´TTAGCGTGTCATGGAGGAGG 3´

58

277

STG14

S⇒ 5´TTAGCGTGTCATGGAGGAGG 3´

AS⇒ 5´AATCCAGGCACATGAACAGG 3´

57

362

STG15

S⇒ 5´AGGCTGGTGGGAGAGAGC 3´

AS⇒ 5´GGACTGCTACGGACCATTC 3´

56

373

STG16

S⇒ 5´CTGTTGCATTGGATAAAAGGC 3´

AS⇒ 5´GATGAATGGAGAGGGCTGG 3´

56

330

STG17

S⇒ 5´ CTGCGGTAAGGTAGGATAGGG 3´

AS⇒ 5´ CACACCGTTTACATAGAGGGC 3´

58

231

STG18

S⇒ 5´CTCTCCCCTCCTTTCCTG 3´

AS⇒ 5´GCCTTTTCCTCGCCTCTG 3´

56

209

STG19

S⇒ 5´TGGGGCCATGTAATTAGGC 3´

AS⇒ 5´TGGGAAAGAGTAGACAGCCG 3´

57

320

STG20

S⇒ 5´GCCCTCCTAAGGCATGTTG 3´

AS⇒ 5´TATCTCTGCCTGTGCCCAG 3´

57

294

STG21

S⇒ 5´GTAAGATCAGCTGCTGGAAG 3´

AS⇒ 5´GAAGCTCTCCTGCTCCAAGC 3´

58

305

STG22

S⇒ 5´AGGTACCCCCACAATGCC 3´

AS⇒ 5´AGCCCAGCCCAGGAGACT 3´

56

260

STG23

S⇒ 5´TTTTTGCAACTATATAGCCAGG 3´

AS⇒ 5´AGCCTGTGTGAGTAGCCATG 3´

58

382

STG24

S⇒ 5´GCATCAGGGAGAGGCTGTC 3´

AS⇒ 5´CCAGACGGAACCCAAGTATG 3´

59

187

STG25

S⇒ 5´GGTAACCTCACAGTCTTCC 3´

AS⇒ 5´GGGAACGATGGCTTTTTGC 3´

56

379

STG26

S⇒ 5´TCCCATTATGAAGCAATACC 3´

AS⇒ 5´CCTTAGACTTTCGAGATGG 3´

48

220

STG27

S⇒ 5´GAGATCCAGACCTTATAGGC 3´

AS⇒ 5´GTTATAACCCATGCCTGAAG 3´

54

415

STG28

S⇒ 5´ACGTGTGACATCTCCATGCC 3´

AS⇒ 5´CCCTTCTAAGCAGCATGTGA 3´

58

250

56

III- Pacientes y Métodos

Exón

Cebadores

Tpa. (ºC)

Tam. (pb)

STG29

S⇒ 5´AGGCTCTGAGTTGCATGATG 3´

AS⇒ 5´CTGCCATCTTGAACCCACC 3´

59

234

STG30

S⇒ 5´ACTTTGAGGCTGATTATGGAA 3´

AS⇒ 5´CCCCGTTGTTTGGAGGTC 3´

54

253

STG31

S⇒ 5´TATAAGTCCTCAAGTTCCAAG 3´

AS⇒ 5´AATATCTTCTACAGGGAGCC 3´

56

198

STG32

S⇒ 5´TAACGGCACTGCTGTACTTG 3´

AS⇒ 5´TCATGGCTGTGAGGTGTGC 3´

58

180

STG33

S⇒ 5´TTCATGTTTCCCTACAAAACCC 3´

AS⇒ 5´AAAATCCTACTCAAATCTCCAG 3´

58

228

STG34

S⇒ 5´GCTTAACTACCATGAATGAG 3´

AS⇒ 5´TCAGCAGGAGGAGGGATG 3´

56

269

STG35

S⇒ 5´TAACTAGCTGTTAATGCAGCG 3´

AS⇒ 5´AAGAGTGGAGAAGGTGACAA 3´

58

270

STG36

S⇒ 5´GTATCTTCTCCTCCTTCTGC 3´

AS⇒ 5´CACACAAGCTCCACCTTGG 3´

58

303

STG37

S⇒ 5´CAGGTCTGAGAGGTTAAGTG 3´

AS⇒ 5´CCACCAGGCTTCTCTTCAG 3´

58

211

STG38

S⇒ 5´GGAATGGAATGTGGAACTCC 3´

AS⇒ 5´ACACATACTCTACTATCCTAC 3´

54

253

STG39

S⇒ 5´GGTTTGCCCCGTTTCCAAC 3´

AS⇒ 5´TCCCAGCTTTGGACCCAG 3´

56

211

STG40

S⇒ 5´AGGTCTGTGGGGTGAGCTG 3´

AS⇒ 5´TCTGGATGCCCTGAGCTGC 3´

58

236

STG41

S⇒ 5´GAAAGGACAGTGCCAAGGAC 3´

AS⇒ 5´TCTAACCAGCACCTCCAAAC 3´

58

221

STG42

S⇒ 5´CCGTCTCAGTTCTCAGTCC 3´

AS⇒ 5´AGAGCTGATGTTCGGAAGCC 3´

57

149

STG43

S⇒ 5´CTTACCCTGGGGCCTGAC 3´

AS⇒ 5´TCAGAGCCACCCTACTATAG 3´

56

276

STG44

S⇒ 5´GAAGCTTCTCCAGCCCTAGC 3´

AS⇒ 5´TGCACTCTCATGAAACAGGC 3´

54

287

STG45

S⇒ 5´CTTGTCTTCTCCAAATGGCA 3´

AS⇒ 5´TTTAAGCCCTTGGTGCGGC 3´

51

208

STG46

S⇒ 5´GAAGCAGTAATCAGAAGGGC 3´

AS⇒ 5´CCTCACATTCTTCCATGCTG 3´

57

256

STG47

S⇒ 5´CACATCCCACAGGCAAGAG 3´

AS⇒ 5´ATCCACAGAAGGCAAGC 3´

57

219

STG48

S⇒ 5´AGGCCCAACCACTAACAGAG 3´

AS⇒ 5´ACACTGGGTGTTCTGGACC 3´

57

357

STG49

S⇒ 5´GTGTAGGGTGCTGTTTTCC 3´

AS⇒ 5´CAAGCTGTGGACTGCATAAG 3´

54

178

STG50

S⇒ 5´AAACCAAGATGACGCGAGTC 3´

AS⇒ 5´GGAACGAGCGGTGTGAAAG 3´

57

66

2.2.1.3- DETECCIÓN DEL PRODUCTO DE PCR MEDIANTE ELECROFORESIS Los exones amplificados por PCR se resolvieron mediante electroforesis en gel de agarosa a una concentración del 3%, que permite separar fragmentos de ADN en un rango de 125-600 pb. Para determinar el tamaño, se empleó un marcador de peso molecular de un rango de una kilobase (kb). 1-

Preparar un gel a una concentración del 3% de agarosa (Serva) en tampón TBE 1x. (Tris-Borato-EDTA). Tapar y calentar en microondas hasta disolver la agarosa por completo. Una vez disuelta, añadir un 18 % de bromuro de etidio (Roche).

2-

Verter en una carcasa con peines y dejar gelificar.

3-

Cargar las muestras, mezcladas con azul de bromofenol, en la siguiente proporción: - muestras⇒ 20 μl producto de PCR + 2 μl azul de bromofenol 6x (10% del volumen de muestra) - marcador de peso molecular 1 kb (Roche)⇒ 1μl marcador + 9 μl azul de bromofenol 1x.

4-

En cubeta de electroforesis (Bio-Rad), introducir el gel en el tampón (TBE 1x). Correr a 90 V, 30 min.

5-

Visualizar el gel bajo luz UV (Gelprinter SuperII).

®

Cuadro III.4A- Protocolo de elaboración de geles de agarosa. Leyenda: g, gramo; TBE, Tris-Borato-EDTA; V, voltio.

57

III- Pacientes y Métodos Los reactivos utilizados en la preparación de los geles se detallan a continuación: Reactivos: Tampón TBE 1x: partir del tampón comercial TBE 10x (Pronadisa) y llevar a una concentración 1x con H2Od. Azul de bromofenol 6x: 0´25 g azul de bromofenol + 40 g sacarosa + enrasar con H2Od hasta 100 ml. Azul de bromofenol 1x: Añadir 5 volúmenes de TBE 1x por volumen de azul de bromofenol 6x.

Cuadro III.4B: Reactivos utilizados en la electroforesis de fragmentos de ADN.

2.2.2- CRIBADO DE MUTACIONES MEDIANTE MICROARRAY DE GENOTIPADO

El microarray de genotipado se ha utilizado con el fin de realizar un análisis mutacional previo en ABCA4, ya que presenta mayor sensibilidad de detección frente a las técnicas convencionales de cribado (SSCP, Single Strand Conformation Polymorphism, Polimorfismo Conformacional de Cadena Sencilla; DGGE, Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, Electroforesis en Gel de Gradiente Desnaturalizante) y permite la identificación de 438 variantes genéticas del gen ABCA4 en una sola reacción, que representa la detección del 75% de las alteraciones descritas en este gen, incluyendo mutaciones y polimorfismos de un único nucleótido (SNPs, Single Nucleotide Polymorphisms) (Jaakson J et al., 2003). El análisis previo del gen ABCA4 fue realizado por la empresa AsperBio Ltd., que ha desarrollado diversos microarrays de genotipado utilizando la tecnología APEX (Arrayed Primer Extensión) (www.asperbio.com). El material de partida fueron 50 μl ADN extraído a partir de sangre periférica del paciente.

1

2

3

4

Figura III.1: Método APEX. 1) Los 438 oligos sintéticos se inmovilizan por su extremo 5´ sobre una superficie de cristal (“chip de ADN”). 2) Los fragmentos de la muestra amplificados por PCR se hibridan con los oligos. 3) La polimerasa realiza la extensión incorporando nucleótidos. Los 4 terminadores están marcados con 4 fluorocromos distintos. 4) Los fragmentos de ADN y los nucleótidos no incorporados se eliminan por lavado. Se produce la detección de la señal emitida.

58

III- Pacientes y Métodos 2.2.3- SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA

2.2.3.1- PURIFICACIÓN DEL PRODUCTO DE PCR

Este proceso se utilizó para extraer y purificar fragmentos de ADN de geles de agarosa, de un tamaño comprendido entre 100 pb y 10 kb, que resulta imprescindible antes de secuenciar las muestras. Después de la electroforesis del producto de PCR, se coloca el gel en un transiluminador, se extrae el fragmento de ADN del gel con una cuchilla limpia y se introduce en un tubo eppendorf de 1´5 ml. El protocolo de purificación, realizado mediante un kit comercial (QIA-quick Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden, Germany), fue el siguiente:

1-

Pesar el gel cortado y añadir 3 volúmenes de buffer QG (μl) por volumen de gel (mg). Incubar a 50ºC, 10 min o hasta que el gel se haya disuelto completamente. Para que el gel se disuelva mejor, dar un vórtex al tubo cada 2-3 min durante la incubación.

2-

Tras la completa disolución del gel, comprobar que el color de la mezcla es amarillo. El buffer QG contiene un indicador de pH (amarillo si el pH < 7´5; naranja o violeta si pH > 7´5), ya que la adsorción del ADN a la membrana QIAquick es eficaz sólo a pH < 7´5. Si el color de la mezcla fuese naranja o violeta, añadir 10 μl de acetato de sodio 3 M pH 5´0 y agitar.

3-

Añadir un volumen de isopropanol y mezclar con la pipeta.

4-

Colocar la columna QIAquick en uno de los tubos de 2 ml proporcionados.

5-

Para la adsorción del ADN, aplicar la muestra en la columna y centrifugar a 13000 rpm, 1 min, tpa.amb.

6-

Tirar el filtrado y volver a colocar la columna en el mismo tubo.

7-

Para lavar, añadir 750 μl tampón de lavado (buffer PE) a la columna, dejar en reposo 2-5 min y centrifugar a 13000 rpm, 1 min, tpa.amb.

8-

Tirar el filtrado y centrifugar 1 min adicional.

9-

Colocar la columna en un tubo eppendorf limpio de 1´5 ml.

10- Añadir 30 μl de tampón de elución (buffer EB) al centro de la columna, dejar reposar 1 min y centrifugar a 13000 rpm, 1 min, tpa.amb.

Cuadro III.5- Protocolo para la purificación del producto de PCR a partir de geles de agarosa.

Cuando el fragmento amplificado está constituído por una única banda, es decir, no aparecen bandas inespecíficas en el gel de agarosa, el producto de PCR se puede purificar directamente. Para ello, se empleó un kit comercial (E.Z.N.A.® Cycle-Pure Kit, OMEGA) que utiliza como material de partida el producto de PCR, sin necesidad de separar previamente el fragmento amplificado por electroforesis.

59

III- Pacientes y Métodos El protocolo utilizado fue el siguiente:

1-

Determinar el volumen de partida del producto de PCR: añadir 4 volúmenes de tampón CP (μl) por volumen de PCR.

2-

Aplicar la solución a la columna HiBind® colocada en un tubo colector de 2 ml.

3-

Centrifugar a 13000 rpm, 1 min, tpa.amb. Tirar el líquido sobrante.

4-

Lavar la columna 2 veces: añadir 750 μl de tampón de lavado (Wash Buffer) y centrifugar a 13000 rpm, 1 min, tpa.amb. Tirar el líquido sobrante.

5-

Centrifugar la columna vacía a 13000 rpm, 1 min, tpa.amb., para secarla.

6-

Colocar la columna en tubo eppendorf de 1´5 ml. Para eluir el ADN, añadir 30-50 μl H2O estéril (Braun) o TRIS/EDTA 1mM/0´1mM pH8 y centrifugar a 13000 rpm, 1 min, tpa.amb. Cuadro III.6- Protocolo de purificación a partir de producto de PCR.

2.2.3.2- REACCIÓN DE SECUENCIACIÓN

Una vez purificado el producto de PCR, se realiza la reacción de secuenciación. En la reacción se empleó un premix (dRhodamine DNA Sequencing Kit, Applied Biosystems) que incorpora los siguientes reactivos: tampón de la reacción, dNTPs (90%), ddNTPs (10%) y la enzima ADN polimerasa. Las condiciones utilizadas fueron las siguientes:

Reactivos Reactivo

CICLOS (n=25) Volumen

Temperatura

Tiempo

ADN

6 μl

94ºC

3 min

Premix (Applied Biosystems)

4 μl

96ºC

10 s

Cebador [10mM] (Pacisa+Giralt)

1 μl

50ºC

DMSO (Merck)

1 μl

60ºC

4 min

csp 20 μl

4ºC

∞

Agua estéril (Braun)

25x

5s

25x

Tabla III.6: Condiciones de la reacción de secuenciación.

El volumen final de la reacción fueron 20 μl y la temperatura de hibridación (Th) fueron 50ºC. La reacción de PCR se realizó en un termociclador GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems). El producto de esta reacción se resuelve mediante electroforesis capilar en un secuenciador automático (ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer, Applied Biosystems) y la información obtenida se analiza mediante el programa informático Sequencing Analysis Software v 5.1.1.

60

III- Pacientes y Métodos 2.2.3.3- PURIFICACIÓN DEL PRODUCTO SECUENCIADO

Los productos de la reacción de secuenciación se purifican mediante unas columnas que contienen un polímero denominado Sephadex G-501 (Princetown Separations), que permite eluir las moléculas de mayor tamaño, mientras que las moléculas pequeñas quedan retenidas en el interior de cada una de las bolitas que conforman esta matriz. De esta forma, al centrifugar la columna se recoge el ADN (producto secuenciado), mientras que los reactivos sobrantes (dNTPs, ddNTPs, enzima, etc.) quedan retenidos en la columna.

1-

Resuspender la columna de Sephadex con 800 μl H2O estéril (Braun). Dar un vórtex y rehidratar durante 2-3 h.

2-

Centrifugar la columna 2 veces a 4000 rpm, 2 min, tpa.amb. Tirar el líquido sobrante.

3-

Colocar la columna en tubo eppendorf de 1´5 ml y añadir 20 μl reacción de secuenciación. Centrifugar, una vez, a 4000 rpm, 2 min, tpa.amb. Recoger el ADN eluído y reservar.

4-

Lavar la columna con 750 μl H2Od y rehidratar durante 2-3 h.

5-

Centrifugar 2 veces a 4000 rpm, 2 min, tpa.amb. Tirar el líquido sobrante y conservar a 4ºC. Cuadro III.7- Protocolo de purificación de la reacción de secuenciación.

Una vez que se ha purificado el producto secuenciado, hay que evaporar el líquido sobrante y resuspender el botón (pellet) con un agente desnaturalizante, antes de cargar las muestras en el secuenciador:

1-

Colocar los tubos eppendorf de 1´5 ml -con la reacción de secuenciación purificada- en un concentrador de ADN / centrífuga de vacío (Concentrator 5301, eppendorf). Centrifugar a tpa.amb. hasta evaporar el líquido por completo.

2-

Resuspender el pellet con 25 μl formamida, dejar actuar 15 min como mínimo.

3-

Dar vórtex y pulsada. Desnaturalizar a 95ºC, 2 min. Mantener los tubos en hielo para evitar la renaturalización.

4-

Cargar las muestras en el secuenciador automático (ABI PRISM

®

3100 Genetic Analyzer, Applied

Biosystems). Cuadro III.8- Desnaturalización de la reacción de secuenciación.

61

III- Pacientes y Métodos 2.2.4- ANÁLISIS CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Los ensayos de restricción se utilizaron para confirmar la presencia o ausencia de una mutación. Una vez que se ha identificado el cambio, se introduce la secuencia en el programa informático Vector Nti Suite v9. Este programa busca una endonucleasa de restricción (ER) que reconozca el cambio en la secuencia, bien porque la mutación genere una nueva diana de restricción o bien porque destruya una diana que existía previamente. Las ER utilizadas (New England BioLabs) y las condiciones de digestión de los productos de PCR se recogen en las siguientes tablas:

Digestión

Enzimas y dianas Enzima

Diana

Temperatura

Tiempo

Aci I

5’…C↓CGC…3’

37ºC

3 horas

Alu I

5’…AG↓CT…3’

37ºC

3 horas

Eco NI

5’…CCTNN↓NNNAGG…3’

37ºC

3 horas

Msp I

5’…C↓CGG…3’

37ºC

3 horas

Taq I

5’…T↓CGA…3’

37ºC

3 horas

Tabla III.7: Enzimas de restricción utilizadas, dianas que reconocen y condiciones de la digestión.

Reactivos Reactivos

Volúmenes

ADN (producto de PCR)

10 μl

Tampón

2 μl

Enzima de restricción (10 unidades/μl)

3 μl csp 20 μl

Agua

Tabla III.8: Reactivos de la digestión. El volumen final de la reacción fueron 20 μl.

El protocolo para realizar el ensayo de restricción fue el siguiente: 1-

Amplificar por PCR el fragmento de interés.

2-

Incubar el producto de PCR con la enzima de restricción a 37ºC, 3h (Ver condiones Tabla III.7).

3-

Resolver mediante electroforesis en gel de agarosa al 3% (Ver Cuadro III.4).

Cuadro III.9- Ensayo de restricción.

62

III- Pacientes y Métodos 2.2.5- MLPA (Multiplex Ligation Probe Assay)

Esta técnica fue utilizada con la finalidad de detectar pérdidas (deleciones) o ganancias (inserciones) de material genético. El análisis de las muestras se realizó mediante dos kits comerciales (MRC-Holland B.V.: SALSA MLPA KIT P151 y 152 ABCA4), siguiendo el siguiente protocolo: a) Desnaturalización del ADN: · Partir de 5 μl ADN: desnaturalizar a 95ºC, 5 min. Enfriar a 25ºC.

b) Hibridación de las sondas: · Añadir 1´5 μl SALSA Probe-Mix y 1´5 μl MLPA buffer. Mezclar con cuidado. Incubar a 95ºC, 1 min. A continuación, incubar a 60ºC, 16h.

c) Reacción de ligación · Reducir la tpa. a 54ºC, añadir 32 μl de Mix Ligase y mezclar. La solución Mix Ligase está formada por: 3 μl Ligase 65-A + 3 μl Ligase 65-B + 1 μl Ligase 65 + 25 μl H2O. Incubar a 54ºC, 15 min. · Calentar a 98ºC, 5 min para inactivar la ligasa. Antes de la PCR, mantener el termociclador a 60ºC.

d) PCR: se realizó en un termociclador GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems). Reactivos

CICLOS (n=35)

Reactivo

Volumen

Temperatura

Tiempo (pre-PCR)

Reacción de ligación (ADN molde)

10 μl

60ºC

SALSA PCR buffer 10x (tampón reacción)

4 μl

95ºC

2 μl

60ºC

SALSA Enzyme dilution buffer (tampón enzima) 2 μl

72ºC

60 s

72ºC

20 min

4ºC

∞

SALSA PCR primers (cebadores)

SALSA Polymerase (enzima)

0´5 μl

Agua estéril (Braun)

csp 50 μl

30 s 35x

30 s

35x

e) Electroforesis capilar · El producto de PCR obtenido se resuelve por electroforesis capilar (ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer, Applied Biosystems) mediante el programa informático GeneMapper Software v3.5. Cargar las muestras en el secuenciador de la siguiente manera: 1 μl producto de PCR + 0´5 μl marcador de peso molecular (GS-500 Liz; Applied Biosystems) + 8´5 μl formamida (Merck). Cuadro III.10- Protocolo del MLPA para el gen ABCA4.

63

III- Pacientes y Métodos 2.2.6- dHPLC (denaturing High-Performance Liquid Chromatography)

La Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento -en condiciones desnaturalizantes- permitió realizar un cribado previo de las muestras, con el fin de identificar una mutación prevalente entre los pacientes de STGD, como se verá más adelante. A continuación, se secuenciaron sólo aquellas muestras que presentaron un patrón alterado o de heterodúplex, que se establece cuando está presente una mutación. La detección de mutaciones se realizó en el cromatógrafo WaveTM DNA Fragment Analysis System 4500 (Transgenomic), siguiendo el siguiente protocolo: 1-

Mezclar los productos de PCR (muestra control + muestra problema) en proporción 1:1, ya que el dHPLC no puede diferenciar entre una muestra homozigota normal y homozigota mutante.

2-

Desnaturalizar los productos de PCR a 95ºC, 5 min en un termociclador (GeneAmp PCR System

2700; Applied Biosystems). Mantener a 54ºC, 1h para favorecer la formación de los heterodúplex. 3-

TM

Cargar 5 μl del producto de PCR mezclado en la columna (DnaSep

column; Transgenomic).

4- Analizar los heterodúplex y los homodúplex en un gradiente de acetonitrilo, formado por la combinación TM

de las soluciones A y B (WAVE Optimized 5-

; Transgenomic).

Determinar los gradientes óptimos para eluir los amplificados mediante el programa NavigatorTM Software, bajo la aplicación Mutation Detection: - Flujo del gradiente: 0´9 ml/min - Detección del ADN: luz UV (260nm) - Duración de la carrera: 8 min, incluyendo lavado y equilibrado de la columna. Cuadro III.11- Protocolo de análisis de muestras en el dHPLC.

La temperatura óptima de análisis de cada fragmento depende de la composición de bases a lo largo del mismo y, por tanto, es variable. Por ello, se realizó un análisis a la temperatura óptima para detectar dicho alelo mutante. La temperatura óptima, obtenida por simulación en el aparato, fueron 63´2ºC.

64

III- Pacientes y Métodos 2.3- ESTUDIO GENÉTICO INDIRECTO 2.3.1- REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA: PCR 2.3.1.1- CONDICIONES DE LA PCR

En la siguiente tabla se muestran las condiciones que fueron utilizadas para amplificar las distintas regiones microsatélites. Las secuencias de los cebadores empleados en la amplificación de los diversos marcadores se verán más adelante.

Reactivos y Concentraciones Reactivo

Concentración

Temperatura

Tiempo

50 ng/μl

95ºC

12 min

1´5 mM MgCl2

95ºC

15 s

55ºC 10x

15 s 10x

72ºC

30 s

89ºC

15 s

55ºC 20x

15 s 20x

72ºC

30 s

2´5 unidades

72ºC

30 min

csp 15 μl

4ºC

∞

ADN Tampón (Roche) Nucleótidos (Invitrogen)

2´5 mM (de cada uno)

Cebador sentido marcado con

5 μM

fluorocromo (Applied Biosystems) Cebador antisentido sin marcar

5 μM

(Pacisa+Giralt) Taq polimerasa (enzima) Agua estéril (Braun)

CICLOS (n=30)

Tabla III.9: Condiciones utilizadas para amplificar los diferentes marcadores microsatélites flanqueantes a los genes NDP, RS1 y ABCA4.

Estas regiones se amplificaron mediante PCR múltiple (multiplex PCR), que permite la amplificación simultánea de tres o cuatro marcadores microsatélites. El volumen final de la reacción fueron 15 μl y la temperatura de hibridación (Th) fueron 55ºC. La reacción de PCR se realizó en un termociclador GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems). Los productos de PCR correspondientes a los marcadores microsatélites se resolvieron mediante electroforesis capilar, como se verá más adelante.

2.3.1.2- CEBADORES

A continuación, se muestran las secuencias de los cebadores empleados para amplificar los marcadores microsatélites flanqueantes a los genes NDP, RS1 y ABCA4, así como la localización en los respectivos cromosomas. Como se indica en la tabla anterior, el cebador sentido está marcado con un fluorocromo que permitirá su posterior detección mediante electroforesis capilar.

65

III- Pacientes y Métodos Los datos para seleccionar los distintos marcadores se obtuvieron a partir de dos bases de datos electrónicas: - (1) The GDB Human Genome Database (www.gdb.org); - (2, 3)

National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview).

Tabla III.10: Marcadores microsatélites flanqueantes al gen NDP. Leyenda: Mb: megabase. (1)

Distancia (Mb)(2) Locus(3)

Marcadores

Fluorocromo

Cebadores

DXS8090

NED

S⇒ 5´GGGTGAAATTCCATCACAAA3´ AS⇒ 5´ACAAATGCAGATGTACAAAAAATA3´

41,08

Xp

DXS1068

PET

S⇒ 5´CCTCTAAAGCATAGGGTCCA3´ AS⇒ 5´CCCATCTGAGAACACGCTG3´

43,05

Xp

DXS8012

HEX

S⇒ 5´AGCTTAGCAAGCCCAAGTAA3´ AS⇒ 5´GGACATAAACATTCAGACCATAAC3´

45,5

Xp

DXS7

6-FAM

S⇒ 5´CCACCTCACTCCAGCCTGAG3´ AS⇒ 5´ACTTTGACCTTATCAAACAGGTG3´

47,6

Xp

MAOB

NED

-

Xp

S⇒ 5´GAAGCATCGAAGTTAGGAGT3´ AS⇒ 5´ATTTGGCCTCATAGAGTTAG3´ NDP

DXS8080

HEX

S⇒ 5´GGCCAACAAGAGCAAAACT3´ AS⇒ 5´TCCTTAGACCCAAACTTCC3´

48,4

Xp

DXS1003

NED

S⇒ 5´TTCACCCATAGAAGCCGT3´ AS⇒ 5´CCATTCCTCACTGGCAAG3´

50,7

Xp

Tabla III.11: Marcadores microsatélites flanqueantes al gen RS1. Cebadores(1)

Distancia (Mb)(2) Locus(3)

Marcadores

Fluorocromo

DXS8022

NED

S⇒ 5´CTGTCACAGAAGTCCCATTTTA3´ AS⇒ 5´GGAAACTAATGCAGCATGTC3´

18,05

Xp

DXS1053

PET

S⇒ 5´TTAAGGAAGTATGAGGCTCCA3´ AS⇒ 5´TTGGTGCAAAAGTAATCACG3´

19,68

Xp

DXS8019

6-FAM

S⇒ 5´TTCATTAAAAGCCGTCTTTG3´ AS⇒ 5´TGTTGAGTTTCCTCACAGC3´

21,86

Xp

DXS9911

HEX

-

Xp

S⇒ 5´CCCGATTTCCTCTAAAACAGT3´ AS⇒ 5´GCTATATATCTGCTATGCAGTGG3´ RS1

DXS999

HEX

S⇒ 5´GCTAACAACCTAGACTTCAACC3´ AS⇒ 5´CAGTTTCACAATCTCTGCC3´

22,95

Xp

DXS1226

6-FAM

S⇒ 5´ CTAAACCCATCTGNCCTC3´ AS⇒ 5´TTTCCAGCAACTACCTTTCAT3´

27,69

Xp

DXS989

6-FAM

S⇒5´AGAAGATAGATATACCCACTCACC3´ AS⇒ 5´ACATAAGAAATAAAATGGCTGC3´

27,30

Xp

66

III- Pacientes y Métodos Tabla III.12: Marcadores microsatélites flanqueantes al gen ABCA4. Distancia (Mb)(2)

Locus(3)

S⇒ 5´GCCTAAATTTCTTACACATCCTAAC3´ AS⇒ 5´GTTTTAAACACCACAAATAAATGT3´

73,98

1p

6-FAM

S⇒ 5´TAAATTCTCCTTGTTGGGTC3´ AS⇒ 5´TGAGTCATCTGCGTTTAAGA3´

88,51

1p

D1S435

HEX

S⇒ 5´GGCCACATGGGAATTTTCT3´ AS⇒ 5´AGCAGTTCAAGGCCACAGT3´

89,81

1p

D1S2804

NED

S⇒ 5´AAAGGATATTTTGGCCCTG3´ AS⇒ 5´CAACGAGTATATTAGCATGACCC3´

91,13

1p

D1S2868

PET

S⇒ 5´AGGTATAATCTGCAATAAAAAACTT3´ AS⇒ 5´AAAGTAAAACAATATGAAGCCAC3´

91,59

1p

Marcadores

Fluorocromo

D1S464

NED

D1S167

Cebadores(1)

ABCA4 D1S236

6-FAM

S⇒ 5´AAACCACCTACCAATGTCTGTC3´ AS⇒ 5´GAAGCTGTCGTTATGGGGT3´

93,06

1p

D1S2664

6-FAM

S⇒ 5´CAGCCCACAGAATAACACTG3´ AS⇒ 5´TTCATGCTATGATTTTCCGC3´

94,20

1p

D1S2793

VIC

S⇒ 5´GCCCTTCAGTTCCCAGA3´ AS⇒ 5´TGTATTAGTCAAGTTTCACCAGAGA3´

95,35

1p

Además de los marcadores flanqueantes al gen ABCA4, se amplificaron veintinueve marcadores microsatélites adicionales, distribuidos a lo largo del cromosoma 1. Estos marcadores se seleccionaron de un kit comercial: Linkage Mapping Sets v2.5 (Applied Biosystems). Tabla III.13: Marcadores microsatélites distribuidos a lo largo del cromosoma 1. Leyenda: cM: centimorgan. Marcadores

Distancia (cM)(1)

Locus(2)

Marcadores

Distancia (cM)(1)

Locus(2)

D1S450

16,61

1p

D1S196

169,4

1q

D1S2667

19,88

1p

D1S218

176,3

1q

D1S234

44,49

1p

D1S238

188,55

1q

D1S255

58,6

1p

D1S408

192,5

1q

D1S2797

68,9

1p

D1S2757

193,41

1q

D1S2890

80,9

1p

D1S413

194,98

1q

D1S2829

94,99

1p

D1S1660

194,98

1q

D1S2803

96,23

1p

D1S249

207,07

1q

D1S207

107,16

1p

D1S425

215,07

1q

D1S229

222,29

1q

ABCA4 D1S206

122,64

1p

D1S213

228,26

1q

D1S2726

132,11

1p

D1S2800

245,24

1q

D1S498

144,94

1q

D1S2785

257,46

1q

D1S484

157,51

1q

D1S2842

261,86

1q

D1S2878

165,78

1q

D1S2836

271,84

1q

67

III- Pacientes y Métodos 2.3.2- ANÁLISIS DE HAPLOTIPOS

Los productos de PCR obtenidos se resuelven por electroforesis capilar (ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer, Applied Biosystems) y se analizan mediante el programa informático GeneMapper Software v3.5.

1 μl de la dilución 1:10 del producto de PCR + 0´5 μl marcador de peso molecular (GS-500 Liz; Applied Biosystems) + 12 μl formamida (Merck).

Cuadro III.12- Preparación de las muestras para su análisis en el ABI PRISM® 3100.

2.3.3- DISEÑO DE ÁRBOLES GENEALÓGICOS

La construcción de los haplotipos en los correspondientes árboles genealógicos se realizó mediante el programa informático Cyrillic v2.1.

68

III- Pacientes y Métodos 2.4- ESTUDIOS DE EXPRESIÓN A continuación se describen las técnicas empleadas en los estudios de expresión “in vitro” de la proteína Retinosquisina, codificada por el gen RS1. Se utilizó esta proteína por dos motivos: - es una proteína de bajo peso molecular: 25 kilodalton (kDa) - es una proteína secretable por las células, que puede ser detectada en los medios de cultivo. La puesta a punto de esta metodología se realizó en el Laboratorio de Neurobiología del Desarrollo del Instituto Cajal (CSIC, Madrid), por cortesía de la Dra. Paola Bovolenta.

2.4.1- VECTORES DE EXPRESIÓN

Como vector de expresión, se utilizó un plásmido comercial que contiene la pauta abierta de lectura del gen RS1, marcado con los antígenos Myc-His en posición carboxilo terminal (OmicsLink ORF Expression Clone, EX-Q0232-M10; RZPD; www.rzpd.de). En la siguiente figura se describe la construcción utilizada:

Características del vector

MC1

CMV

T7

Promotor

CMV (Citomegalovirus)

Célula hospedadora

Mamíferos

Antibiótico de selección bacteriana

Ampicilina

Etiqueta (marcaje)

C-Myc C-His

MC2

ORF

C-Myc

C-His

PoliA

Figura III.2: Estructura y características del vector de expresión utilizado.

2.4.2- CULTIVOS CELULARES Y TRANSFECCIÓN

Se utilizaron dos líneas celulares, MDCK (procedentes de riñón canino) y HEK 293 (procedentes de riñón embrionario humano). Las condiciones de cultivo fueron las siguientes:

1-

Trabajar en campana de flujo laminar vertical (Cultek).

2-

Atemperar el medio de cultivo en baño termostatizado a 37ºC.

3-

En placas Petri de 10 cm de diámetro (Falcon), añadir 10 ml medio D-MEM GlutaMAX™ (Dulbecco´s modified Eagle´s medium; GIBCO) + 10% suero bovino fetal (Sigma-Aldrich) + gentamicina 1:1000 (GIBCO).

4-

Incubar en incubador a 37ºC, 5% CO2 (Heraeus, Hera Cell).

Cuadro III.13- Condiciones de cultivo de las líneas celulares MDCK y HEK 293.

69

III- Pacientes y Métodos Las líneas celulares se transfectan cuando se encuentran en crecimiento exponencial. Normalmente, este crecimiento se produce cuando las células tienen una confluencia del 50-70%, obtenida en cultivo 24 horas después de haberles dado un pase. La transfección se realizó con el reactivo FuGENE (Roche), como se indica a continuación:

1-

Atemperar el reactivo de lipotransfección FuGENE (Roche) a tpa. amb., 5 min. Trabajar en campana.

2-

Añadir 100 μl medio D-MEM GlutaMAX™, sin suero bovino fetal, en tubos de vidrio.

3-

Añadir 12 μl FuGENE directamente sobre el medio, sin tocar las paredes del tubo.

4-

Añadir 4 μl ADN plasmídico⇒ [ADN plasmídico]= 1 μg/μl. Incubar 45 min.

5-

Añadir la solución anterior, gota a gota, sobre la placa de cultivo.

6-

Incubar en incubador a 37ºC, 5% CO2, 72 h.

Cuadro III.14- Protocolo de transfección del reactivo FuGENE.

Se generaron líneas estables con ambos tipos celulares, es decir, que todas las células que crecen en la placa han incorporado el plásmido en su genoma y, por tanto, expresarán la proteína en mayor o menor medida. Cada tipo celular se transfectó con tres plásmidos diferentes: - RS1-Myc-His: proteína que se quiere estudiar - Flg-SFRP-Myc: proteína secretable; control positivo - pcDNA: es un vector vacío; control negativo.

A las 72 horas de la transfección, se comenzó la selección de las células transfectadas con G418 (análogo sintético de la neomicina; GIBCO), que permite mantener y seleccionar líneas celulares eucariotas estables que han sido transfectadas con vectores que contienen un gen de resistencia frente a la neomicina.

1-

Trabajar en campana de flujo laminar vertical.

2-

Atemperar el medio de cultivo en baño termostatizado a 37ºC.

3-

En placas Petri de 10 cm de diámetro, añadir 10 ml medio D-MEM GlutaMAX™ + 10% suero bovino fetal + gentamicina 1:1000 + G418 500 μg/μl (GIBCO).

4-

Incubar en incubador a 37ºC, 5% CO2.

Cuadro III.15- Selección de líneas celulares estables con G418.

70

III- Pacientes y Métodos Una vez comenzada la selección, las células que no han incorporado el plásmido comienzan a morir y únicamente sobreviven aquellas que han sido transfectadas. Al cabo de dos semanas, se aíslan varios clones de cada una de las lineas celulares transfectadas con los diferentes plásmidos.

1-

Bajo el microscopio, marcar los clones por debajo de la placa de cultivo.

2-

Trabajar en campana de flujo laminar vertical.

3-

Absorber el medio de cultivo de la placa con pipeta Pasteur de vidrio.

4-

Rodear los clones previamente marcados con un cilindro de plástico (punta amarilla cortada y autoclavada), impregnado en vaselina. Anadir 3 ml PBS 1x a la placa, para preservar la viabilidad celular.

5-

Introducir en cada cilindro 100 μl tripsina-EDTA 1x, para despegar las células. Incubar 2-5 min, en funcion del tipo celular.

6-

Pasar las células a una placa multiwell-24 (Falcon) con medio D-MEM GlutaMAX™ + 10% suero bovino fetal + gentamicina 1:1000 + G418 500 μg/μl. Incubar en incubador a 37ºC, 5% CO2.

7-

Una vez pasados los clones, retirar los cilindros de plástico con unas pinzas y absorber el PBS 1x con pipeta Pasteur de vidrio.

8-

Añadir a la placa 10 ml medio D-MEM GlutaMAX™ + 10% suero bovino fetal + gentamicina 1:1000 + G418 500 μg/μl. Incubar en incubador a 37ºC, 5% CO2.

Cuadro III.16- Selección de clones a partir de líneas celulares estables.

Los reactivos utilizados se detallan a continuación:

Soluciones: PBS 1x (Phosphate Buffered Saline): Disolver en 800 ml H2Od: 80 g NaCl + 2 g KCl + 26´8 g Na2HPO4 + 2´4 g H2PO4 + ajustar el pH a 7´4 con HCl 1M + enrasar con H2Od hasta 1L. Tripsina-EDTA 1x: partir de la solución comercial de Tripsina-EDTA 10x y llevar a una concentración 1x con PBS 1x.

71

III- Pacientes y Métodos Cada uno de los clones se siembra por duplicado en la placa multiwell-24 y en uno de ellos se coloca un cristal tratado con polilisina (1 μg/μl). Una vez crecidos los clones, se aislarán: - por un lado, los cristales tratados con polilisina, para realizar la técnica de inmunocitoquímica y comprobar la eficiencia de transfección; - por otro lado, los extractos celulares y los medios condicionados, para detectar la proteína por Western Blot.

2.4.3- INMUNOCITOQUÍMICA

El marcaje inmunofluorescente de las células se realizo sigiendo el protocolo que se describe a continuación:

1-

Fijar las células con paraformaldehído 4% (diluido en PBS 1x), 15 min.

2-

Lavar con PBS-T 1x, 5 min. Repetir 2 veces.

3-

Bloquear con solución de bloqueo: PBS-T 1x + 5% suero bovino fetal + 1% seroalbúmina bovina, 1h.

4-

io Añadir el anticuerpo 1 diluido 1:2000 (en sol. bloqueo), incubar 1 ½ hora (monoclonal α-c-myc; Sigma).

5-

Lavar con PBS-T 1x, 5 min. Repetir 2 veces.

6-

io Añadir el anticuerpo 2 diluido 1:2000, incubar 45 min (Alexa 488; Molecular Probes).

7-

Lavar con PBS-T 1x, 5 min. Repetir 2 veces.

8-

Incubar con Hoechst 1:1000 (diluido en PBS 1x), 5 min⇒ Tiñe núcleos celulares.

9-

Lavar con H2O y secar. Montar con Mowiol (medio de montaje) sobre un portaobjetos.

10- Las células marcadas se detectaron mediante microscopía de fluorescencia (Leica).

Cuadro III.17a- Protocolo de inmunocitoquímica.

Solución: PBS-T 1x (Phosphate Buffered Saline Tween): Añadir Tween 20 diluido 1:1000 en PBS 1x. Cuadro III.17b- Preparación de la solución PBS-T 1x.

2.4.4- WESTERN BLOT

La Retinosquisina se detectó mediante SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrilamide gel electrophoresis) y Western Blot, en extractos celulares y medios condicionados.

72

III- Pacientes y Métodos Los geles de SDS-poliacrilamida se prepararon bajo las siguientes condiciones: 1-

Región separadora del gel: -

5 ml H2O

-

6 ml acrilamida/bis-acrilamida (30% acrilamide/bis-acrilamide solution, 29’2:0’8; Biorad) ⇒ 12% poliacrilamida

2-

-

3’8 ml Tris 1’5M pH 8’8

-

0’15 ml SDS 10%

-

0’15 ml APS 10%

-

6 μl TEMED

Una vez solidificada, se prepara la región concentradora del gel (stack): -

2’1 ml H2O

-

0’5 ml acrilamida/bis-acrilamida

-

0’38 ml Tris 1’5M pH 6’8

-

30 μl SDS 10%

-

30 μl APS 10% Cuadro III.18- Protocolo de elaboración de geles de SDS-poliacrilamida.

Leyenda: SDS, dodecil sulfato sódico; APS, persulfato sódico; TEMED, N, N, N’, N’ tetrametiletilendiamina.

Los medios y las células se aislaron de la siguiente manera: 1-

Medios condicionados: - Recoger el medio y pasar a un tubo eppendorf 1´5 ml, centrifugar a 1000 rpm, 5 min. - Recoger el sobrenadante y mantenerlo en hielo⇒ este paso elimina posibles restos celulares.

2-

Extractos celulares: - Una vez recogido el medio, añadir solución de lisis de proteínas e inhibidores de proteasas. - Mantener en hielo 20 min, dando un vórtex cada 5 min. - Centrifugar a 13000 rpm, 5 min, 4ºC. - Recoger el sobrenadante y mantenerlo en hielo ⇒ este paso elimina los componentes celulares que no han sido lisados. Cuadro III.19a- Preparación previa de las muestras para SDS-PAGE.

Solución de lisis de proteínas: 1´5 ml NaCl 5M + 5 ml Nonidet P40 10x + 2´5 ml Tris pH8 + enrasar con PBS 1x hasta 50 ml. Inhibidores de proteasas: A partir de la solución comercial 20x (“Complete” Protease Inhibitor Cocktail Tablets, Roche), llevar a 1x con la solución de lisis de proteínas. Cuadro III.19b- Reactivos empleados en el aislamiento previo de las muestras para SDS-PAGE.

73

III- Pacientes y Métodos Una vez aislados los medios condicionados y los extractos celulares, las muestras se desnaturalizaron de la siguiente manera:

1-

En tubo eppendorf 1´5 ml, cargar 15 μl muestra + 15 μl Laemmly buffer 2x con β-mercaptoetanol (agente reductor).

2-

Hervir las muestras en termobloque a 100ºC, 5 min.

3-

Centrifugar a 13000 rpm, 10 seg. Mantener en hielo mientras se carga el gel. Cuadro III.20a- Desnaturalización y reducción previa de las muestras para SDS-PAGE.

Reactivo: Laemmly buffer 2x con β-mercaptoetanol: Tris-HCl 0´0125M + 2% SDS + 5% β-mercaptoetanol + 20% glicerol + 0´001% azul de bromofenol; pH 6´8. Cuadro III.20b- Preparación del tampón de Laemmly.

La electroforesis se llevó a cabo bajo las siguientes condiciones: 1-

Cargar en el gel las muestras y 7 μl marcador de peso molecular (Precision Plus Protein dual color; BioRad).

2-

Realizar la electroforesis a 180 V, aproximadamente 1 hora o hasta que se hayan resuelto todas las bandas del marcador. El tampón de electroforesis utilizado fue Running Buffer 1x. Cuadro III.21a- Condiciones de la SDS-PAGE.

Soluciones tampón: Running Buffer 10x (Laemmli electrolyte buffer): 144g glicina + 36´3g Tris + 10g SDS + enrasar hasta 1L con H2Od. Running Buffer 1x: A partir del Running Buffer 10x, llevar a 1x con H2Od.

Cuadro III.21b- Tampones de la SDS-PAGE.

Una vez finalizada la electroforesis de proteínas, se sumerge el gel en tampón de transferencia (transfer buffer), para eliminar el exceso de SDS. Antes de montar la transferencia, los papeles de filtro Whatmann y la membrana de nitrocelulosa (Hybond-ECL, Amersham Biosciences) deben ser previamente humedecidos en este tampón.

74

III- Pacientes y Métodos La transferencia de las proteínas desde el gel a la membrana de nitrocelulosa se realizó bajo las siguientes condiciones:

1-

En un cassette (Bio-Rad), montar la transferencia en el siguiente orden: cátodo→ esponja→ 2 papeles Whatmann→ gel→ membrana de nitrocelulosa→ 2 papeles Whatmann→ esponja→ ánodo.

2-

Transferir a 300 mA, 45 min. La electroforesis se realizó en Transfer Buffer 1x.

Cuadro III.22a- Protocolo de transferencia. Leyenda: mA, miliamperio.

Soluciones: Transffer Buffer: Running Buffer 1x+ metanol 20x. TBS 1x (Tris Buffered Saline): Disolver en 800 ml H2Od: 6´05 g Tris+ 8´76 g NaCl + ajustar el pH a 7´5 con HCl 1M + enrasar con H2Od hasta 1L. TBS-T 1x (Tris Buffered Saline Tween): Añadir Tween 20 diluido 1:1000 en PBS 1x.

Cuadro III.22b- Tampones empleados en la transferencia y en los lavados posteriores.

A continuación, se realizó el Western blot, bajo las siguientes condiciones:

1-

En un Falcon 50, bloquear la membrana con solución de bloqueo: TBS-T 1x + 5% leche desnatada en polvo. Incubar a tpa.amb., 1h, en agitación orbital.

2-

Añadir el anticuerpo 1io diluido 1:5000 (en sol. bloqueo), incubar 1 ½ hora (monoclonal α-c-myc; Sigma).

3-

Lavar con TBS-T 1x, cada 10 min., durante 1 hora.

4-

Añadir el anticuerpo 2io diluido 1:100000, incubar 45 min (PO conjugated AffinityPure goat α-mouse IgG; Jackson Inmunoresearch Laboratories).

5-

Lavar con TBS-T 1x, cada 10 min., durante 1 hora. Realizar un último lavado con PBS 1x.

6-

Lavar la membrana con H2O y secar.

7-

Revelar con ECL (Enhanced Chemiluminiscence) Advance Western Blotting Detection Kit (Amersham); incubar 5 min en oscuridad. Secar la membrana.

Cuadro III.23- Protocolo de Western Blot utilizado. Leyenda: HRP, horse radish peroxidase (peroxidasa de rábano); enzima que cataliza la oxidación del luminol en presencia de peróxido de hidrógeno.

75

Córtex visual primario Tracto óptico Cuerpo geniculado lateral Radiaciones ópticas

Esquema de la vía visual.

IV- Resultados

76

IV-Resultados

IV- RESULTADOS

1- GEN NDP

1.1- ESTUDIO GENÉTICO DIRECTO 1.1.1- FAMILIAS ESTUDIADAS

El estudio molecular directo del gen NDP fue realizado en un total de once familias (ver pág.36).

1.1.2- CARACTERIZACIÓN DE MUTACIONES

Se identificó la mutación responsable en siete de las once familias estudiadas (7/11):

-

cuatro mutaciones en las que se produce un cambio de aminoácido en la proteína (4/7): p.Arg38Cys (identificada en dos familias distintas), p.Arg121Gln y p.Lys104Asn;

-

una mutación que produce un codon de parada prematuro (1/7), originando una proteína de menor tamaño de lo normal: p.Tyr120X;

-

una deleción “de novo” de cinco nucleótidos, que altera la pauta de lectura y genera un codon de parada prematuro, dando lugar a una proteína truncada (1/7): p.Val89fsX101;

-

una mutación que afecta al sitio donador del procesamiento (mecanismo de corte y empalme de los intrones) del intrón 1 del gen NDP (1/7): IVS1+1 G>A.

Familia

Cambio de nucleótido

Cambio de aminoácido

Localización

ANF-7

c.654_658delTGTCG

p.Val89fsX101

Exón 3

ANF-8

c.776C>A

p.Tyr120X

Exón 3

XLDM-46

c.778G>A

p.Arg121Gln

Exón 3

ND-2

c.529C>T

p.Arg38Cys

Exón 2

ND-5

c.529C>T

p.Arg38Cys

Exón 2

ND-12

IVS1+1G>A

ND-14

c.728G>T

Intrón 1 p.Lys104Asn

Tabla IV.1: Mutaciones identificadas en el gen NDP.

77

Exón 3

IV-Resultados

De las mutaciones identificadas en nuestros pacientes, tres son mutaciones nuevas, es decir, no descritas previamente: p.V89fsX101, p.Tyr120X y p.Lys104Asn.

A

B

C Asn

Lys

Figura IV.1: Mutaciones nuevas identificadas en el gen NDP. A) p.Val89fsX101; B) p.Tyr120X; C) p.Lys104Asn.

El cambio p.Tyr120X se confirmó mediante un ensayo de restricción, ya que esta mutación elimina una diana reconocida por la endonucleasa de restricción Msp I.

1.1.3- CARACTERIZACIÓN DE POLIMORFISMOS

En las familias estudiadas, no se identificaron polimorfismos.

78

IV-Resultados

1.2- ESTUDIO GENÉTICO INDIRECTO

1.2.1- FAMILIAS ESTUDIADAS

El análisis de haplotipos se realizó en nueve de las once familias (9/11), debido a que en dos familias (2/11) únicamente se estudió el caso índice (ver págs. 38-39). En uno de estos dos varones se identificó la mutación responsable de enfermedad.

1.2.2- ANÁLISIS DE HAPLOTIPOS

Este análisis realizado en las nueve familias permitió descartar el gen NDP como causante de enfermedad en una de ellas (1/9), ya que los haplotipos no cosegregaban con la patología ocular. En las ocho familias restantes (8/9), los haplotipos obtenidos del análisis de los marcadores microsatélites sí mostraron cosegregación con la enfermedad. En dos de estas familias (2/8) no se han identificado mutaciones en NDP, mientras que en las seis restantes (6/8) fue posible encontrar el defecto genético.

· Cosegregan: 8

· Mutación identificada: 6⇒ ANF-7, XLDM-46, ND-2, ND-5, ND-12, ND-14. (Ver Tabla IV.1) · Sin mutación identificada: 2 ⇒ ND-1, ND-10.

· Con estudio familiar: 9

· No cosegregan: 1 ⇒ ND-4. 11 Familias · Mutación identificada: 1⇒ ANF-8. (Ver Tabla IV.1) · Sin estudio familiar: 2 · Sin mutación identificada: 1 ⇒ ND-6.

Figura IV.2: Esquema del análisis de haplotipos realizado en las familias con Enfermedad de Norrie o Vitreorretinopatía exudativa familiar.

1.2.3- HAPLOTIPOS PREVALENTES

En dos de las familias estudiadas (ND-2 y ND-5) se observó que compartían la misma mutación [p.Arg38Cys (c.529C>T)] y que además compartían el mismo haplotipo, lo que hizo sospechar que en ambas familias existiese identidad por descendencia. Para confirmar esta situación, se amplificaron un total de siete marcadores microsatélite flanqueantes al locus NDP. Este estudio molecular mostró que la región de ADN común en las dos familias comprendía 5,35 Mb y estaba situada entre los marcadores DXS1068 y DXS8080 (Figura IV.3).

79

IV-Resultados

ND-2

Figura IV.3:

II:1

II:2

III:1 DXS8090 DXS1068 DXS8012 DXS7 MAOB DXS8080 DXS1003

IV:1 DXS8090 DXS1068 DXS8012 DXS7 MAOB DXS8080 DXS1003

164 255 178 154 183 175 182

162 255 178 154 187 173 182

III:3 160 253 176 152 183 175 180

166 259 182 158 187 173 186

IV:5 162 255 178 154 183 175 182

V:2

166 259 182 158 187 173 186

IV:6

? ? ? ? ? ? ?

166 259 182 158 187 173 186

V:3

166 259 182 158 187 173 186

IV:7 162 255 178 154 183 175 182

II:4

III:4

? ? ? ? ? ? ?

IV:4

? ? ? ? ? ? ?

V:1 DXS8090 DXS1068 DXS8012 DXS7 MAOB DXS8080 DXS1003

III:2

? ? ? ? ? ? ?

IV:3

II:3

? ? ? ? ? ? ?

? ? ? ? ? ? ?

IV:8

162 255 178 154 183 175 182

IV:10

162 255 178 154 183 175 182

? ? ? ? ? ? ?

IV:11 ? ? ? ? ? ? ?

162 255 178 154 183 175 184

V:4

162 255 178 154 183 175 182

162 255 178 154 183 175 182

ND-5

II:1

DXS8090 DXS1068 DXS8012 DXS7 MAOB DXS8080 DXS1003

III:1 2763 162 255 178 154 183 175 168

II:2 2762 168 249 170 156 191 175 164

DXS8090 DXS1068 DXS8012 DXS7 MAOB DXS8080 DXS1003

III:3 2765 162 255 178 154 183 175 168

DXS8090 DXS1068 DXS8012 DXS7 MAOB DXS8080 DXS1003

160 253 176 152 174 171 171 175 166 166

II:3 2761 162 255 178 154 183 175 168

162 255 178 154 174 183 183 175 168 168

III:8 ? ? ? ? ? ? ?

IV:6 2780 168 249 170 156 191 175 164

III:9 2770 168 249 170 156 191 175 164

III:12 2774 164 253 180 152 187 173 166

162 255 178 154 183 175 168

IV:7 2781 168 249 170 156 191 175 164

IV:9 2783 168 249 170 156 191 175 164

80

III:13 2773 168 249 170 156 191 175 164

IV:10 2784 164 253 180 152 187 173 166

162 255 178 154 183 175 168

IV:11 2785 162 255 178 154 183 175 168

164 253 180 152 187 173 166

IV:12 2786 162 255 178 154 183 175 168

164 253 180 152 187 173 166

168 249 170 156 191 175 164

IV:13 2787 162 255 178 154 183 175 168

IV-Resultados

Figura IV.3: Árboles genealógicos simplificados de las familias ND-2 y ND-5, respectivamente. El análisis de haplotipos realizado con siete marcadores microsatélites (Cen-DXS1003-DXS8080-NDP-MAOB-DXS7-DXS8012-DXS1068DXS8090-Tel) confirmó que ambas familias compartían el mismo haplotipo (barra negra). Existen marcadores en las familias que se desvían de la segregación (Familia ND-2, individuo IV:1, marcador DXS8090; Familias ND-2 y ND-5, marcador DXS1003). En este análisis se muestra la región común del cromosoma X que comparten (haplotipo negro) y que los marcadores distales y proximales no están ligados.

1.3- CORRELACIÓN GENOTIPO-FENOTIPO En los pacientes estudiados, las mutaciones identificadas en el gen NDP se asociaron a tres fenotipos distintos: - Enfermedad de Norrie (ND) que produce ceguera desde el nacimiento y, en algunos varones, sordera neurosensorial y retraso mental; - Vitreorretinopatía exudativa familiar (VREF) que cursa con vascularización incompleta de la retina, pero sin alteraciones sistémicas; - Persistencia de vítreo primitivo hiperplásico (PHPV), que consiste en la aparición de una masa blanca entre el disco óptico y el cristalino.

Familia

Mutación

Características retinianas

Manisfestaciones extraoculares

Fenotipo

ANF-7

p.V89fsX101

Microftalmia unilateral, cataratas.

Sordera neurosensorial, retraso mental.

ND

ANF-8

p.Tyr120X

Microftalmia, cataratas, phthisis bulbi, opacidad corneal.

Sordera, bajo coeficiente intelectual.

ND

XLDM-46

p.Arg121Gln

Ceguera congénita, phthisis bulbi.

No

VREF

IV:1⇒ Afectación oftalmológica.

No

VREF

V:3⇒ Ceguera desde los 5 años.

No

PHPV

No

VREF

No

VREF

ND-2

p.Arg38Cys

V:4⇒ Ceguera desde los 2 años, buena visión en su ojo derecho. Afectación oftalmológica; existe un varón asintomático con mutación (III:1).

ND-5

p.Arg38Cys

ND-12

IVS1+1G>A

Afectación oftalmológica.

Retraso mental.

ND

ND-14

p.Lys104Asn

Afectación oftalmológica.

No

VREF

Tabla IV.2: Familias con mutación identificada en el gen NDP y fenotipos asociados. En la familia ND-2, se destacan tres varones con la misma mutación y fenotipos diferentes.

81

IV-Resultados

En la tabla anterior se observa que las distintas mutaciones se asocian a fenotipos diversos e incluso existe variabilidad intrafamiliar, como se observa en la familia ND-2. El caso más representativo de heterogeneidad clínica aparece en la familia ND-5, en la que se identificó un varón de 60 años con la mutación p.Arg38Cys y que no había desarrollado ningún síntoma (Figura IV.3, Familia ND-5, individuo III.1) Para confirmar esta situación, se extrajo una segunda muestra de sangre del sujeto y se obtuvo el mismo resultado.

pseudogliomas

A

exudados

C

B

D

Figura IV.4: Imágenes del fondo de ojo de un paciente con Enfermedad de Norrie (ANF-7). En ellas se aprecian pseudogliomas (A, B) y alteraciones en los vasos sanguíneos, que originan exudados cerca de la fóvea (C, D).

1.4- ORIGEN GEOGRÁFICO DE LAS MUTACIONES Los datos familiares recogidos en la consulta y en el cuestionario (ver pág. 35) permiten conocer la procedencia geográfica del linaje materno de los pacientes, por lo que se puede representar el origen geográfico de las mutaciones identificadas.

Familia

ANF-7

ANF-8

XLDM-46

ND-2

ND-5

ND-12

ND-14

Procedencia

Ciudad Real

Cuenca

Barcelona

Madrid

Guadalajara

Barcelona

Arteixo (La Coruña)

82

IV-Resultados

p.Lys104Asn

p.Arg121Gln IVS1+1G>A p.Arg38Cys p.Arg38Cys p.Tyr120X

p.V89fsX101

Figura IV.5: Mapa de España en el que se representa el origen geográfico de las mutaciones identificadas en el gen NDP. La mayor parte proceden del centro de la península, mientras que dos surgen en Barcelona y una en Galicia.

83

IV-Resultados

2- GEN RS1

2.1- ESTUDIO GENÉTICO DIRECTO

2.1.1- FAMILIAS ESTUDIADAS

El estudio molecular directo del gen RS1 fue realizado en un total de veintinueve familias (ver pág.36).

2.1.2- CARACTERIZACIÓN DE MUTACIONES

En este estudio molecular se identificaron mutaciones en el gen RS1 en veinte familias (20/29), de las cuales diecinueve son españolas y una es portuguesa: -

dieciocho mutaciones en las que se produce un cambio de aminoácido en la proteína (18/20): p.Glu72Lys (identificada en tres familias españolas -en una de ellas se produce “de novo”- y en una portuguesa), p.Tyr89Cys, p.Leu137Pro, p.Arg141Cys, p.Gln154Arg (identificada en cinco familias distintas), p.Arg197Cys, p.Arg209His, p.Arg213Gln, p.Glu215Gln, p.Glu215Val y p.Leu216Pro.

-

una mutación “de novo” que produce un codon de parada prematuro (1/13): p.Gln80X.

-

una inserción de un nucleótido (1/13), que altera la pauta de lectura y genera una proteína anómala de sesenta y nueve aminoácidos más larga de lo normal: p.His194fsX263.

Familia

Cambio de nucleótido

Cambio de aminoácido

Localización

XLRS-43*, 93, 104, 185

c.214G>A

p.Glu72Lys

Exón 4

XLRS-108*

c.238C>T

p.Gln80X

Exón 4

XLRS-44

c.266A>G

p.Tyr89Cys

Exón 4

XLRS-102

c.410T>C

p.Leu137Pro

Exón 5

XLRS-95

c.421C>T

p.Arg141Cys

Exón 5

XLRS-30, 70, 97, 143, 161

c.461A>G

p.Gln154Arg

Exón 5

XLRS-124

c.579_580insC

p.His194fsX263

Exón 6

XLRS-145

c.589C>T

p.Arg197Cys

Exón 6

XLRS-112

c.626G>A

p.Arg209His

Exón 6

XLRS-45

c.638G>A

p.Arg213Gln

Exón 6

XLRS-29

c.643G>C

p.Glu215Gln

Exón 6

XLRS-101

c.644A>T

p.Glu215Val

Exón 6

XLRS-107

c.647T>C

p.Leu216Pro

Exón 6

Tabla IV.3: Mutaciones identificadas en el gen RS1. Se identificaron un total de trece cambios diferentes en hemizigosis en la región codificante del gen. *: Indica que la mutación se produce “de novo”.

84

IV-Resultados

De las mutaciones identificadas en nuestros pacientes, cuatro son mutaciones nuevas: p.Gln80X, p.Leu137Pro, p.Gln154Arg y p.Glu215Val. A

B

C

D

Q154R (A461G)

Figura IV.6: Mutaciones nuevas identificadas en el gen RS1. A) p.Gln80X; B) p.Leu137Pro; C) p.Gln154Arg; D) p.Glu215Val.

La alteración más frecuente en nuestras familias fue el cambio p.Gln154Arg, que se identificó en cinco de ellas (5/20). (Figura IV.5C). Para determinar que se trataba de un cambio patogénico y no de un polimorfismo, se estudiaron setenta y seis cromosomas en individuos control mediante ensayo de restricción, ya que la mutación genera una diana de restricción para la enzima Aci I. El análisis mostró que la mutación no aparecía en ninguno de los controles. Asimismo, el análisis de haplotipos demostró que la mutación segregaba en todos los individuos afectos pertenecientes a estas cinco familias, como se verá más adelante.

Mediante el estudio directo, se identificaron otras dos mutaciones nuevas que provocan cambio de aminoácido, p.Leu137Pro y p.Glu215Val, localizadas en los exones 5 y 6 del gen RS1 respectivamente (Figuras IV.5 B y D). Estas nuevas variantes alélicas no se encontraron en setenta y seis cromosomas control analizados, ya que ambas alteraciones eliminan las dianas de restricción para las endonucleasas Eco NI y Alu I, respectivamente. El cambio p.Glu215Val se identificó en un varón afecto y también en su madre, por lo que se descarta que este evento mutacional se haya producido “de novo” (Familia XLRS-101, ver pág. 41). Sin embargo, no se pudo establecer el origen de la mutación p.Leu137Pro, ya que únicamente se estudió el caso índice (Familia XLRS-102, ver pág. 41).

Por último, se identificó una mutación nueva que produce un codon de parada prematuro, originando una proteína truncada: p.Gln80X (Figura IV.5A). Este cambio aparece en el varón pero no en su madre, lo que sugiere que la alteración se haya producido “de novo”. (Familia XLRS-108, ver pág. 42).

85

IV-Resultados

2.1.3- CARACTERIZACIÓN DE POLIMORFISMOS

En las familias estudiadas, no se identificaron polimorfismos.

2.2- ESTUDIO GENÉTICO INDIRECTO

2.2.1- FAMILIAS ESTUDIADAS

El estudio familiar se realizó en diecinueve de las veintinueve familias (19/29), debido a que en diez familias (10/29) únicamente se contaba con el caso índice (ver págs. 40, 41, 42). En seis de estos varones estudiados (6/10) se identificó la mutación en RS1.

2.2.2- ANÁLISIS DE HAPLOTIPOS En las diecinueve familias en las que se realizó el estudio familiar, fue posible descartar el gen RS1 como responsable en dos de ellas (2/19) en las que se observó que los haplotipos no cosegregaban con la enfermedad. En las diecisiete familias restantes que mostraban cosegregación, se identificó el defecto genético en catorce de ellas (14/17).

· Mutación identificada: 14⇒ XLRS-29, XLRS-30, XLRS-43, XLRS45, XLRS-70, XLRS-93, XLRS-95, XLRS-97, XLRS-101, XLRS-104, · Cosegregan: 17 XLRS-107, XLRS-108, XLRS-124, XLRS-185. (Ver Tabla IV.3) · Con estudio familiar: 19

· Sin mutación identificada: 3 ⇒ ONCE-62, RP-130bis, RP-162bis. · No cosegregan: 2 ⇒ XLRS-56, XLRS-114.

29 Familias

· Sin estudio familiar: 10

· Mutación identificada: 6⇒ XLRS-44, XLRS-102, XLRS-112, XLRS-143, XLRS-145, XLRS-161. (Ver Tabla IV.3) · Sin mutación identificada: 4 ⇒ XLRS-53, XLRS-55, XLRS-103, XLRS-144.

Figura IV.7: Esquema del análisis de haplotipos realizado en las familias con Retinosquisis juvenil.

86

IV-Resultados

2.2.3- HAPLOTIPOS PREVALENTES

En este estudio molecular, se han identificado dos mutaciones prevalentes: p.Gln154Arg y p.Glu72Lys. El cambio más frecuente fue la nueva mutación p.Gln154Arg, que se identificó en cinco familias (ver Tabla IV.3). Una vez realizado el estudio familiar, se observó que los pacientes pertenecientes a estas familias compartían un haplotipo idéntico, sugiriendo identidad por descendencia. Para confirmar esta situación, se amplificaron un total de siete marcadores microsatélites a lo largo del cromosoma X, flanqueantes al gen RS1. Este análisis permitió determinar que los pacientes compartían un fragmento común de ADN de 3,27 Mb, localizado entre los marcadores DXS1053 y DXS999.

XLRS-30

I:1

I:2

II:1

99/684

TEL

XLRS-97

XLRS-70

I:2 04/657

I:1

I:1

174 202 155 176

172 202 155 178

RS1

RS1

265 290 176

265 298 192

XLRS-143

I:2

II:1 03/816

II 1

I:1

I:2

II:1

04/804

XLRS-161

I:1

I:2

II:1

04/1522

DXS8022 DXS1053 DXS8019 DXS9911

164 202 155 176

172 202 155 176

174 202 155 176

170 202 155 176

RS1

RS1

RS1

RS1

RS1

DXS999 DXS1226 DXS989

265 294 176

265 294 176

265 292 176

265 298 178

CEN

Figura IV.8: Árboles genealógicos simplificados de las familias XLRS-30, XLRS-70, XLRS-97, XLRS-143 Y XLRS-161, portadoras de la mutación p.Gln154Arg (c.461A>G) y análisis de haplotipos realizado con 7 marcadores microsatélites (Tel-DXS8022-DXS1053-DXS8019-DXS9911-RS1-DXS999-DXS1226-DXS989-Cen). El estudio molecular confirmó que los individuos portadores de la mutación p.Gln154Arg compartían una región común en el cromosoma X, localizada entre los marcadores DXS1053 y DXS999.

La segunda mutación más frecuente fue el cambio p.Glu72Lys, que se identificó en cuatro familias (ver Tabla IV.3). Sin embargo, estas familias no parecen estar relacionadas entre si, ya que presentaban haplotipos diferentes (Figura IV.8).

87

IV-Resultados

XLRS-43 I:1 02/596 ?

II:1 ? ? ?

I:2 02/595 ? ?

XLRS-93

II:2 02/46 178 272 180

I:1 03/544 176 272 176

178 274 182

III:1 01/508 178 274 182

I:2 03/545 176 178 256 264 178 176

II:1 II:2 03/532 03/533 176 178 176 176 272 264 272 256 176 176 176 178

III:2 02/47 178 274 182

II:3 03/546 176 256 178

XLRS-104 I:1

I:2 ? ? ?

? ? ?

? ? ?

XLRS-185

II:1 04/1281 182 178 256 272 186 176

II:2 ? ? ?

III:1 04/1278 178 178 272 272 168 176

II:3 04/1280 182 178 256 272 186 176

III:2 03/986 182 256 186

II:4 ? ? ?

III:3 04/1277 176 178 264 272 176 176

II:5 04/1279 182 178 256 272 186 176

III:4 04/803 182 256 186

II:6

II:7 04/1275 182 178 256 272 186 176

? ? ?

III:5 ? ? ?

I:1 05/1219 176 259 186

III:6 04/1276 178 182 256 256 192 186

I:2 05/1220 182 180 273 273 176 184

II:1 05/1221 182 273 176

Figura IV.9: Árboles genealógicos simplificados de las familias portadoras de la mutación p.Glu72Lys, construidos con 3 marcadores microsatélites (Tel- DXS9911-RS1-DXS999- DXS989-Cen). En este caso, se descarta un posible efecto fundador, ya que los varones afectos presentan haplotipos distintos entre si.

2.3- CORRELACIÓN GENOTIPO-FENOTIPO En los pacientes estudiados, se observaron manifestaciones clínicas similares, independientemente del tipo de mutación identificada en el gen RS1. En general, presentan pérdida de la agudeza visual central, amplitud reducida de la onda b en el ERG y fondo de ojo en el que se observan desgarros (en inglés schisis) maculares y presencia de velos vítreos. Los pacientes de mayor edad (XLRS-44, XLRS-95) presentan afectación macular más severa y atrofia del EPR (George ND et al., 1996). Los datos oftalmológicos obtenidos de cada paciente, así como las mutaciones identificadas, se recogen en la siguiente tabla (Tabla IV.4):

88

Mutación

Familia

Edad de inicio

Edad actual

Fondo de ojo

Apariencia del vítreo

ERG

Complicaciones

p.Glu72Lys

XLRS-43

4 meses

8 años

Desprendimiento de retina, microquistes periféricos.

Normal

Reducido

Estrabismo congénito, leves anomalías vasculares.

p.Glu72Lys

XLRS-93

12 años

34 años

Microquistes maculares, squisis periférica.

Velos vítreos

p.Glu72Lys

XLRS-104

8 años

17 años

Squisis macular y periférica, quistes maculares.

Velos vítreos

↓ amplitud onda b

AV: 10-20/100

p.Gln80X

XLRS-108

7 años

No disponible.

p.Tyr89Cys

XLRS-44

10 años

52 años

Atrofia macular del EPR, papilas pálidas.

Velos vítreos

Onda b no registrable

Cataratas, AV: 10/100, escotomas absolutos.

p.Leu137Pro

XLRS-102

6 años

22 años

Squisis macular y periférica, quistes maculares.

Normal

Onda b no registrable

Hemorragias del vítreo, AV: 20-32/100.

p.Arg141Cys

XLRS-95

4-5 años

40 años

Atrofia macular del EPR, atrofia coriorretiniana.

Degeneración vitreorretiniana tipo Goldmann-Favre

Sin respuesta

Catarata incipiente, no perfusión de los capilares), AV: 10/100.

p.Gln154Arg

XLRS-30

18 meses

22 años

Desprendimiento de retina, mácula con grandes agujeros.

Normal

1 año

3 años

Desdoblamiento de las capas retinianas, degeneración macular microquística.

Velos vítreos

↓ amplitud onda b

Endotropía e hipermetropía.

p.Gln154Arg

XLRS-70

Estrabismo y ambliopía, AV: 20/100.

Hemorragia del vítreo

p.Gln154Arg

XLRS-97

6 meses

4 años

Desprendimiento de retina, squisis macular.

Normal

↓ amplitud onda b

Hemorragia vitreorretiniana, estrabismo.

p.Gln154Arg

XLRS-143

2 años

7 años

Squisis macular y periférica.

Normal

↓ amplitud onda b

AV: 20-30/100

p.Gln154Arg

XLRS-161

1 año

3 años

Squisis macular

Normal

↓ amplitud onda b

p.His194fsX263

XLRS-124

7-8 años

15 años

Squisis macular

Normal

Alterado

Pérdida de visión, fotofobia y discromatopsia.

p.Arg197Cys

XLRS-145

3 años

25 años

Squisis macular.

Normal

↓ amplitud onda b

AV: 40-50/100

p.Arg209His

XLRS-112

Congénito

34 años

RS desde la infancia.

Persistencia de vítreo primitivo.

p.Arg213Gln

XLRS-45

7 años

18 años

Squisis macular y periférica.

Normal

↓ amplitud onda b

Nictalopia, AV: 10/100.

p.Glu215Gln

XLRS-29

5 años

21 años

Microquistes en máculas.

Normal

Onda b no registrable

Nictalopia, fotofobia, escotomas relativos, hemorragia del vítreo, AV: 10-20/100.

p.Glu215Val

XLRS-101

2 años

23 años

Lesión macular bilateral.

Normal

Abolido

Estrabismo nictalopia, fotofobia, ambliopía, AV: 30-40/100.

p.Leu216Pro

XLRS-107

13 años

26 años

Squisis macular.

Velos vítreos

↓ amplitud onda b

AV: 20-30/100.

89

Cataratas congénitas, AV: 2-5/100.

IV-Resultados

En la tabla anterior, se observa que los pacientes presentan alteraciones semejantes en el fondo de ojo, con complicaciones clínicas que difieren entre si. La edad de comienzo de la enfermedad es variable, aunque suele producirse en la infancia temprana o incluso ser congénita.

A

B

D

C

Figura IV.10: A) Fondo de ojo de paciente con RS (XLRS-45), de 17 años, en la que se observan grandes velos vítreos (flechas negras). B) TCO del paciente de la familia XLRS-104, de 16 años, en la que se aprecian quistes a nivel macular (flechas blancas). C) Fondo de ojo y D) AGF del paciente de la familia XLRS-95, de 40 años de edad. En estadíos más avanzados de enfermedad, se produce atrofia del EPR (flecha negra) y acúmulo de gran cantidad de pigmento (flecha blanca).

Como caso particular, en la familia XLRS-29 se identificó una mujer afecta, portadora de la mutación p.Glu215Gln: presentaba ERG abolido, tanto el escotópico como el fotópico, y escotoma absoluto. Otras dos mujeres de la misma familia mostraban el ERG reducido, pero eran asintomáticas.

I:1

I:2 ? ? ?

II:1

IV:1 96/549 179 179 273 273 179 169

III:2 96/765 177 179 275 273 173 169

IV:2 96/550 179 177 273 275 179 173

IV:3 96/417 179 273 169

III:3 97/61 177 275 173

IV:4 97/60 177 275 173

III:4 179 258 179

? ? ?

II:2 ? ? ?

III:1 96/548 179 273 179

? ? ?

(177) (262) (179)

IV:5 IV:6 IV:7 97/59 97/81 97/82 177 179 177 179 275 258 262 258 173 179 179 179

? ? ?

II:3 ? ? ?

III:5 96/558 181 258 193

II:4 ? ? ?

III:6 96/526 177 179 275 273 173 179

IV:8 IV:9 96/523 96/528 181 179 181 179 258 273 258 273 193 179 193 179

IV:10 96/551 177 275 173

III:7 ? ? ?

IV:11 96/527 177 275 173

III:8 96/524 177 179 275 273 173 179

IV:12 96/525 177 275 173

III:9 96/552 179 273 169

IV:13 96/709 179 177 273 258 169 177

III:10 ? ? ?

IV:14 96/708 ? ? ?

? ? ?

? ? ?

III:11

? ? ?

? ? ?

IV:15 96/554 179 258 179

III:12 96/553 179 181 258 272 179 181

IV:16 96/555 179 258 179

IV:17 96/556 181 272 181

Figura IV.11: Árbol genealógico de la familia XLRS-29. La flecha roja muestra a la mujer portadora de la mutación p.Glu215Gln, que es afecta. Las mujeres señaladas con flechas azules, también portadoras de mutación, presentan alterado el ERG pero mantienen una buena visión.

90

IV-Resultados

2.4- ORIGEN GEOGRÁFICO DE LAS MUTACIONES En la siguiente tabla se muestra la procedencia geográfica de las madres de los pacientes, por lo que se puede representar el origen geográfico de las mutaciones identificadas. Familia

XLRS-29

XLRS-30

XLRS-43

XLRS-44

XLRS-45

XLRS-70

XLRS-93

Procedencia

Toledo

Oviedo

Madrid

Málaga

Córdoba

Ayamonte (Huelva)

Madrid

Familia

XLRS-95

XLRS-97

XLRS-101

XLRS-102

XLRS-104

XLRS-107

XLRS-108

Procedencia

Valencia

Bilbao

Murcia

Barcelona

Segades (Valladolid)

Zaragoza

Barcelona

Familia

XLRS-112

XLRS-124

XLRS-143

XLRS-145

XLRS-161

XLRS-185

Procedencia

Cuenca

Madrid

Sta. Cruz Tenerife

Sta. Cruz Tenerife

Sevilla

Lisboa (Portugal)

p.Gln154Arg

p.Gln154Arg

p.Glu72Lys

p.Leu137Pro p.Gln80X

p.Leu216Pro

p.His194fsX263 p.Glu72Lys (2) p.Glu215Gln

p.Arg209His p.Arg141Cys

p.Glu72Lys

p.Arg213Gln p.Gln154Arg p.Gln154Arg

p.Glu215Val

p.Gln154Arg

p.Tyr89Cys

p.Arg197Cys

Figura IV.12: Mapa de la Península Ibérica en el que se representa el origen geográfico de las alteraciones identificadas en el gen RS1. La distribución de las mutaciones es homogénea, con cierta agregación en el centro y en el sur de España, así como en el archipiélago canario.

91

IV-Resultados

2.5- ESTUDIOS DE EXPRESIÓN

2.5.1- LOCALIZACIÓN SUBCELULAR DE LA RETINOSQUISINA

Una vez realizada la técnica de inmunocitoquímica, la proteína se detectó en las células mediante microscopía de fluorescencia confocal:

A

B

C

Figura IV.13: Imágenes obtenidas mediante microscopía confocal, en células HEK 293 transfectadas con el plásmido RS1-c-Myc-c-His. A) Imagen de una región de la preparación a 60x. B) Imagen de dos células de la preparación anterior, obtenida con el objetivo 60x y ampliada con zoom. C) Imagen de otra región de la preparación en la que se muestran los núcleos contrateñidos con Hoechst (azules).

Las imágenes anteriores muestran que la Retinosquisina se localiza en el citoplasma celular. Sin embargo, no se detecta en el medio de la preparación, cuando se trata de una proteína secretable. Este hecho sugiere que la proteína se secreta en muy baja proporción y mediante una transfección transitoria (se realiza la técnica de inmunohistoquímica a las 72 horas de la transfección) no se detecta. Por ello, se seleccionaron líneas celulares estables que expresan esta proteína en mayor proporción (ver pág.70).

2.5.2- DETECCIÓN DE LA RETINOSQUISINA MEDIANTE WESTERN BLOT

A continuación se muestran las imágenes obtenidas por autorradiografía de los geles SDS-PAGE, tanto en transfecciones transitorias como en líneas celulares estables:

92

IV-Resultados

Figura IV.14: Western Blot de extractos celulares (EC) y medios condicionados (MC) de RS1 (Retinosquisina), SFRP (control positivo de secreción) y pcDNA (control negativo). La línea celular utilizada fue HEK 293. Leyenda: M, marcador de peso molecular.

En la autorradografía del gel, se observa que la Retinosquisina aparece en los extractos celulares, al igual que en la inmunocitoquímica, pero no se secreta al medio cuando se obtiene mediante transfección transitoria. Sin embargo, la proteína secretable codificada por el gen SFRP se detectó en los medios condicionados (Figura IV.14; carril MC SFRP, tamaño 37 kDa). Al seleccionar líneas estables, fue posible detectar la proteína codifica por RS1 (tamaño 25 kDa), tanto en los EC como en los MC. Se observan diferencias en la secreción entre los distintos clones:

Figura IV.15: Western Blot de extractos celulares (EC) y medios condicionados (MC) de RS1 (Retinosquisina), SFRP (control positivo de secreción) y pcDNA (control negativo) líneas MDCK estables.

93

IV-Resultados

3- GEN ABCA4

3.1- ESTUDIO GENÉTICO DIRECTO

3.1.1- FAMILIAS ESTUDIADAS

El estudio molecular directo del gen ABCA4 fue realizado en un total de ciento veintinueve familias (ver pág.36).

3.1.2- CARACTERIZACIÓN DE MUTACIONES

El estudio molecular del gen ABCA4 realizado con el microarray de genotipado, permitió identificar pacientes con dos alelos mutantes, con un alelo mutante y sin alelos mutantes. Debido al elevado número de familias estudiadas, los resultados se presentan por fenotipos.

a) Enfermedad de Stargardt (STGD) Se estudiaron un total de setenta y cuatro familias con STGD, entre las cuales se identificaron: - veintinueve familias con dos alelos mutantes, - veintitrés familias con un alelo mutante, - veintidós familias en las que no se identificaron mutaciones.

Familias con Enfermedad de Stargardt 30 25 20 15

Nº familias

10 5 0 2 alelos mutantes

1 alelo mutante

0 alelos mutantes

Figura IV.16: Familias STGD clasificadas en función de los alelos mutantes identificados.

Los alelos mutantes de ABCA4 identificados en las distintas familias se recogen en las siguientes tablas:

94

IV-Resultados

Familias con dos alelos mutantes Alelo 1 Familia

1

ARDM-14

ARDM-151

Alelo 2

Exón

Cambio de nucleótido

Cambio de aminoácido

5

c.455G>A

22

Exón

Cambio de nucleótido

Cambio de aminoácido

p.Arg152Gln

5

c.455G>A

p.Arg152Gln

c.3322C>T

p.Arg1108Cys

22

c.3322C>T

p.Arg1108Cys

46

c.6320G>A

p.Arg2107His

46

c.6320G>A

p.Arg2107His

17

c.2588G>C

p.Gly863Ala

21

c.3163C>T

p.Arg1055Trp

19

c.2888 del G

p.Gly963fs

46

c.6320G>C

p.Arg2107Pro p.Leu2060Arg

5

c.455G>A

p.Arg152Gln

22

c.3322C>T

p.Arg1108Cys

46

c.6320G>A

p.Arg2107His

ARDM-22

19

c.2888 del G

p.Gly963fs

45

c.6179T>G

ARDM-31

23

c.3386G>T

p.Arg1129Leu

35

c.4926C>G

p.Ser1642Arg

ARDM-47

23

c.3386G>T

p.Arg1129Leu

23

c.3386G>T

p.Arg1129Leu

ARDM-57

23

c.3386G>T

p.Arg1129Leu

42

c.5882G>A

p.Gly1961Glu

ARDM-60

13

c.1804C>T

p.Arg602Trp

42

c.5882G>A

p.Gly1961Glu

ARDM-61

23

c.3386G>T

p.Arg1129Leu

23

c.3386G>T

p.Arg1129Leu

ARDM-62

23

c.3386G>T

p.Arg1129Leu

43

c.5929G>A

p.Gly1977Ser

ARDM-17

ARDM-64

6

c.634C>T

p.Arg212Cys

43

c.5929G>A

p.Gly1977Ser

ARDM-66

23

c.3386G>T

p.Arg1129Leu

41

c.5819T>C

p.Leu1940Pro

ARDM-72

5

c.466A>G

13

c.1804C>T

p.Arg602Trp

ARDM-76

6

c.768G>T

23

c.3386G>T

p.Arg1129Leu

ARDM-82

23

c.3386G>T

p.Ile156Val p.= o altera el procesamiento (*) p.Arg1129Leu

23

c.3364G>A

p.Glu1122Lys

ARDM-88

28

c.4139C>T

p.Pro1380Leu

ARDM-96

IVS40+5 G>A c.4222T>C

p.Trp1408Arg

35

c.4918C>T

p.Arg1640Trp

42

c.5882G>A

p.Gly1961Glu

23

c.3386G>T

p.Arg1129Leu

30

c.4469G>A

p.Cys1490Tyr

c.3386G>T

p.Arg1129Leu

22

c.3322C>T

p.Arg1108Cys

46

c.6320G>A

p.Arg2107His

23

c.3386G>T

p.Arg1129Leu

22

c.3322C>T

p.Arg1108Cys

46

c.6320G>A

p.Arg2107His

ARDM-119

23

c.3386G>T

p.Arg1129Leu

23

c.3386G>T

p.Arg1129Leu

ARDM-128

23

c.3386G>T

p.Arg1129Leu

23

c.3386G>T

p.Arg1129Leu

5

c.455G>A

p.Arg152Gln

22

c.3322C>T

p.Arg1108Cys

-

IVS40+5 G>A

46

c.6320G>A

p.Arg2107His

17

c.2588G>C

p.Gly863Ala

19

c.2828G>A

p.Arg943Gln

30

c.4537insC

p.Gln1513fs

23

c.3386G>T

p.Arg1129Leu

ARDM-110 ARDM-111 ARDM-116

ARDM-137

ARDM-138

ARDM-139

23

28

5

c.455G>A

p.Arg152Gln

22

c.3322C>T

p.Arg1108Cys

46

c.6320G>A

p.Arg2107His

95

IV-Resultados

Alelo 1 Familia Exón

Cambio de nucleótido

ARDM-153

22

ARDM-155

23

ARDM-168 ARDM-170

Alelo 2 Cambio de aminoácido

Exón

Cambio de nucleótido

Cambio de aminoácido

c.3211ins GT

p.Ser1071fs

42

c.5881G>A

p.Gly1961Arg

c.3386G>T

p.Arg1129Leu

13

c.1804C>T

p.Arg602Trp

42

c.5882G>A

p.Gly1961Glu

45

c.6179T>G

p.Leu2060Arg

9

c.122C>T

p.Arg408X

30

c.4457C>T

p.Pro1486Leu

Tabla IV.5: Familias STGD en las que se han identificado ambos alelos mutantes en ABCA4. 1

: Indica que estas familias se analizaron previamente en la Universidad de Barcelona (Paloma E et al., 2001). Leyenda: p.=, indica que no cambia el aminoácido (antes: p.= (*) p.Val256Val).

Familias con un alelo mutante Alelo 1 Familia

Cambio de nucleótido

Cambio de aminoácido

25

c.3758C>T

p.Thr1253Met

42

c.5882G>A

p.Gly1961Glu

Exón ARDM-121

Alelo 2

1

ARDM-16

38

c.5395A>G

p.Asn1799Asp

ARDM-38

13

c.1804C>T

p.Arg602Trp

ARDM-39

-

IVS40+5 G>A

ARDM-40

21

c.3056C>T

ARDM-63

18

c.2690C>T

p.Thr897Ile

ARDM-65

42

c.5882G>A

p.Gly1961Glu

ARDM-75

48

c.6721C>G

p.Leu2241Val

ARDM-78

23

c.3386G>T

p.Arg1129Leu

ARDM-81

42

c.5882G>A

p.Gly1961Glu

ARDM-90

43

c.5929G>A

p.Gly1977Ser

Exón

Cambio de nucleótido

Cambio de aminoácido

p.Thr1019Met

ARDM-91

19

c.2791G>A

p.Val931Met

ARDM-125

22

c.3211ins GT

p.Ser1071fs

ARDM-131

18

c.2701A>G

p.Thr901Ala

ARDM-135

42

c.5882G>A

p.Gly1961Glu

ARDM-146

21

c.3056C>T

p.Thr1019Met

ARDM-158

22

c.3211ins GT

p.Ser1071fs

ARDM-162

23

c.3386G>T

p.Arg1129Leu

ARDM-163

30

c.4457C>T

p.Pro1486Leu

ARDM-164

23

c.3386G>T

p.Arg1129Leu

ARDM-165

22

c.3211ins GT

p.Ser1071fs

ARDM-167

22

c.3211ins GT

p.Ser1071fs

SRP-773

23

c.3386G>T

p.Arg1129Leu

Tabla IV.6: Familias STGD en las que únicamente se ha identificado un alelo mutante en ABCA4. 1

: Indica que esta familia se analizó previamente en la Universidad de Barcelona (Paloma E et al., 2001).

96

IV-Resultados

Todas las mutaciones identificadas por el microarray se comprobaron mediante secuenciación automática. Únicamente se identificaron dos posibles fallos de detección:

- un falso positivo en la familia ARDM-153, debido a que el cambio de nucleótido se producía en la posición c.5881 G>A (p.Gly1961Arg) en lugar de la posición c.5882 G>A (p.Gly1961Glu) detectada por el chip, es decir, el el nucleótido anterior (ver Tabla IV.5).

A

B

C

B

Figura IV.17: Secuencias del exón 42 del gen ABCA4. A) Secuencia silvestre; B) Secuencia con la mutación p.Gly1961Arg; C) Secuencia con la mutación p.Gly1961Glu.

- un falso negativo en la familia ARDM-81, en la que no se detectó la mutación c.4297G>A (p.Val1433Ile), como se verá más adelante.

A partir de los resultados obtenidos de nuestras familias, calculamos la frecuencia de detección del microarray en nuestros pacientes STGD, para compararla con los porcentajes de detección obtenidos habitualmente en otras poblaciones europeas y americanas:

(29 familias x 2 alelos mutantes) + (23 familias x 1 alelo mutante) x 100 = 54,7%. 148 alelos totales

97

IV-Resultados

Con el fin de testar la eficiencia del microarray en nuestros pacientes STGD, se seleccionaron nueve pacientes en los que sólo se había identificado uno de los alelos mutantes y se secuenciaron los cincuenta exones del gen ABCA4. Se identificó el segundo alelo mutante en seis de ellos y se identificaron cinco mutaciones nuevas: -

una mutación “de novo” en la que se produce un cambio de aminoácido en la proteína: p.Val1433Ile; esta mutación está descrita y se encuentra incluida entre las cuatrocientas treinta y ocho variantes alélicas detectadas por el microarray. El hecho de que no se hubiese detectado puede deberse a un falso negativo del chip.

-

tres mutaciones en las que se produce un codon de parada prematuro: p.Gln1315X (identificada en dos familias, en una de ellas se produce “de novo”): p.Gln2187X.

-

una inserción de un nucleótido, que altera la pauta de lectura, genera un codon de parada prematuro y, en consecuencia, una proteína truncada: c.4739 del T.

-

una mutación que afecta al sitio aceptor del procesamiento (mecanismo de corte y empalme de los intrones) del intrón 22 del gen ABCA4: IVS22-2 A>T.

Alelo 1 Familia Exón

Alelo 2

Cambio de nucleótido

Cambio de aminoácido

ARDM-121

25

c.3758C>T

p.Thr1253Met

42

c.5882G>A

p.Gly1961Glu

ARDM-38

13

c.1804C>T

p.Arg602Trp

ARDM-39

-

IVS40+5 G>A

Exón

Cambio de nucleótido

Cambio de aminoácido

27

c.3943C>T

p.Gln1315X

33

c.4739 del T

Leu1580fs

No detectado

ARDM-40

21

c.3056C>T

p.Thr1019Met

ARDM-63

18

c.2690C>T

p.Thr897Ile

27

c.3943C>T No detectado

p.Gln1315X *

ARDM-65

42

c.5882G>A

p.Gly1961Glu

No detectado

ARDM-78

23

c.3386G>T

p.Arg1129Leu

48

c.6559C>T

p.Gln2187X

ARDM-81

42

c.5882G>A

p.Gly1961Glu

29

c.4297G>A

p.Val1433Ile *

ARDM-90

43

c.5929G>A

p.Gly1977Ser

-

IVS22 -2A>T

Tabla IV.7: Mutaciones identificadas en el gen ABCA4 por secuenciación automática. *: Indica que la mutación se produce “de novo”. 1

: Indica que esta familia se analizó previamente en la Universidad de Barcelona (Paloma E et al., 2001).

98

IV-Resultados

A

B

C

D Exón 23

Figura IV.18: Mutaciones nuevas detectadas en el gen ABCA4. A) p.Gln1315X (c.3943C>T); B) Leu1580fs (4739 del T); C) Q2187X (c.6559C>T); D) IVS22-2 A>T.

Los tres pacientes anteriores en los que no se identificó el segundo alelo responsable de enfermedad, se analizaron con la técnica MLPA, para detectar posibles pérdidas o ganancias de material genético que incluyesen regiones exónicas completas, en las que pudiesen existir mutaciones que no serían detectadas por secuenciación automática. Mediante este estudio, se observó que los pacientes no presentaban deleciones ni inserciones de ninguna de las cuarenta y ocho sondas que hibridan específicamente con cuarenta y ocho exones del gen ABCA4.

Por tanto, la tasa de detección total (microarray+secuenciación+MLPA) de alelos mutantes es la siguiente:

(35 familias x 2 alelos mutantes) + (17 familias x 1 alelo mutante) x 100 = 58,8%. 148 alelos totales

Asimismo, se amplió el estudio mutacional a los familiares del paciente mediante secuenciación de las regiones del gen ABCA4 en las que previamente se han identificado mutaciones mediante el microarray de genotipado.

99

IV-Resultados

En la familia ARDM-61 (ver pág. 43), se identificó en la paciente la mutación p.Arg1129Leu en homozigosis (ver Tabla IV.5). No se identificaron otras alteraciones patogénicas, a excepción de dos polimorfismos en homozigosis (p.His423Arg, IVS33+48 C>T). Al ampliar el estudio familiar, se observó que únicamente su padre era portador de un alelo mutante mientras que su madre presentaba alelos silvestres en ambas copias del gen (Figura IV.19 A, B). Con el fin de determinar si esta segregación se había producido por disomía uniparental paterna o por microdeleción del cromosoma 1 materno, se realizó la técnica MLPA que permite detectar pérdidas (o ganancias) de material genético. El resultado de este análisis molecular permitió establecer que la paciente presentaba ambas copias del gen ABCA4, descartando una posible deleción del alelo materno (Figura IV.19 C). Estudios posteriores demostraron que esta segregación era debida a una isodisomía parcial paterna, como se verá más adelante.

A I:1 02/724

II:1 02/721

II:2

I:2 02/726

II:3 02/722

B

Leu Gly Asp Arg Ile Ala Ile ↓ Leu

Leu Gly Asp Arg Ile Ala Ile ↓ Leu

Leu Gly Asp Arg Ile Ala Ile

C T T G G G G AC CG C A T T G C CA T C ↓ T

C T T G G G G AC CG C A T T G C CA T C ↓ T

C T T G G G G AC CG C A T T G C CA T C

II:4 02/725

02/725 III:1 02/723

02/724

02/726

C

02/725

Control

Figura IV.19: A) Árbol genealógico de la familia ARDM-61. B) Secuencias de la paciente (mutación p.Arg1129Leu en homozigosis), de su padre (portador del cambio p.Arg1129Leu) y de su madre (no portadora), respectivamente. C) Electroferogramas del MLPA realizado en la paciente y en un control sano (los picos sombreados representan las sondas que hibridan con los exones de ABCA4, los picos normales son sondas sintéticas). Cada sonda presenta un patrón de amplificación normal, que sugiere que existe una dosis normal en ambas copias del gen ABCA4. Por tanto, se descarta la posibilidad de microdeleción materna.

100

IV-Resultados

b) Distrofia de conos y bastones (DCB) Se estudiaron un total de veintiocho familias con DCB, entre las cuales se identificaron: - seis familias con dos alelos mutantes, - cuatro familias con un alelo mutante, - dieciocho familias en las que no se identificaron mutaciones.

Familias con Distrofia de Conos y Bastones

30 25 20 15

Nº familias

10 5 0 2 alelos mutantes

1 alelo mutante

0 alelos mutantes

Figura IV.20: Familias DCB clasificadas en función de los alelos mutantes identificados.

Los alelos mutantes de ABCA4 identificados en las distintas familias se recogen en las siguientes tablas:

Familias con dos alelos mutantes Alelo 1 Familia

Alelo 2

Exón

Cambio de nucleótido

Cambio de aminoácido

Exón

Cambio de nucleótido

Cambio de aminoácido

ARDM-79

19

c.2888delG

p.Gly963fs

19

c.2888delG

p.Gly963fs

ARDM-86

19

c.2888delG

p.Gly963fs

19

c.2888delG

p.Gly963fs

ARDM-126

43

c.5929G>A

p.Gly1977Ser

43

c.5929G>A

p.Gly1977Ser

ARDM-133

1

c.32T>C

p.Leu11Pro

19

c.2888 del G

p.Gly963fs

ARDM-176

19

c.2888delG

p.Gly963fs

45

c.6179T>G

p.Leu2060Arg

RP-267

36

p.Val1681_Cys1685del

36

c.5041_5055del

c.5041_5055del

p.Val1681_Cys1685del

Tabla IV.8: Familias DCB en las que se han identificado ambos alelos mutantes en ABCA4.

101

IV-Resultados

Familias con un alelo mutante Alelo 1 Familia

Alelo 2

Exón

Cambio de nucleótido

Cambio de aminoácido

ARDM-99

29

c.4297G>A

p.Val1433Ile

ARDM-174

35

c.4918C>T

p.Arg1640Trp

RP-577

9

c.1140T>A

p.Asn380Lys

RP-959

5

c.466A>G

p.Ile156Val

Exón

Cambio de nucleótido

Cambio de aminoácido

Tabla IV.9: Familias DCB en las que únicamente se ha identificado un alelo mutante en ABCA4.

El cambio c.2888delG fue el alelo mutante más frecuente entre los pacientes DCB. Se identificaron dos pacientes con esta alteración en homozigosis (ARDM-79 y ARDM-86) y otros dos pacientes en los que la mutación forma un heterozigoto compuesto (ver Tabla IV.8). En la paciente de la familia ARDM-79, el diagnóstico clínico cambió de STGD (a los 10 años de edad) a DCB (a los 26 años), durante la realización de este estudio. Esta mujer presentó inicialmente hallazgos oftalmológicos compatibles con STGD (palidez papilar, maculopatía inespecífica con puntos de pigmento que confieren un aspecto grisáceo, campo visual con escotoma paracentral, vasos retinianos ligeramente atenuados y discromatopsia). En una segunda exploración realizada a los veintiséis años de edad, la paciente mostró ERG abolido (fotópico y escotópico), reducción del campo visual periférico (prácticamente escotoma absoluto), afinamiento de los vasos retinianos y pigmento en forma de espículas óseas, consistente con un diagnóstico de DCB.

Las mutaciones identificadas por el microarray se confirmaron mediante secuenciación automática, siendo correctas en todos los casos. Asimismo, en el paciente perteneciente a la familia ARDM-99, en el que únicamente se había identificado un alelo responsable de enfermedad, se analizaron los cincuenta exones del gen ABCA4 mediante secuenciación. En este caso, no se detectó el segundo alelo mutante. Este paciente también se analizó mediante MLPA, sin que se identificasen alteraciones en las sondas que pudiesen sugerir pérdidas o ganancias de material genético.

102

IV-Resultados

c) Retinosis Pigmentaria Autosómica Recesiva (RPAR) Se estudiaron un total de diecisiete familias con RPAR, entre las cuales se identificaron: - cuatro familias con un alelo mutante, - trece familias en las que no se identificaron mutaciones, - no se identificó ninguna familia que fuese portadora de mutaciones en ambos alelos de ABCA4. Familias con Retinosis Pigmentaria Autosómica Recesiva

30 25 20 15

Nº familias

10 5 0 2 alelos mutantes

1 alelo mutante

0 alelos mutantes

Figura IV.21: Familias RPAR clasificadas en función de los alelos mutantes identificados.

Los alelos mutantes de ABCA4 identificados en las distintas familias se recogen en la siguiente tabla:

Alelo 1 Familia

Alelo 2

Exón

Cambio de nucleótido

Cambio de aminoácido

ARRP-700

42

c.5843CA>TG

p.Pro1948Leu

SRP-766

15

c.2300T>A

p.Val767Asp

SRP-775

5

c.466A>G

p.Ile156Val

SRP-834

-

IVS40+5 G>A

Exón

Cambio de nucleótido

Cambio de aminoácido

Tabla IV.10: Familias RPAR en las que únicamente se ha identificado un alelo mutante en ABCA4.

Las mutaciones identificadas en estas familias se comprobaron por secuenciación, coincidiendo con los resultados obtenidos por el microarray de genotipado.

103

IV-Resultados

d) Fenotipo diverso Se estudiaron un total de tres familias en las que aparecen afectos con distintas distrofias de retina, entre las cuales se identificaron: - una familia en la que se identificó un afecto de STGD con dos alelos mutantes, - dos familias en las que se identificaron sendos afectos con un único alelo mutante.

Familias con fenotipo diverso

30 25 20 15

Nº familias

10 5 0 2 alelos mutantes

1 alelo mutante

0 alelos mutantes

Figura IV.22: Familias con afectos que presentan distintos fenotipos clasificadas en función de los alelos mutantes identificados.

Los alelos mutantes de ABCA4 identificados en las distintas familias, así como el fenotipo exhibido, se recogen en las siguientes tablas:

Familias con dos alelos mutantes Familia ⇒ Nº ADN

Alelo 1 Exón

Cambio de nucleótido

Alelo 2 Cambio de aminoácido

Exón

Cambio de nucleótido

Cambio de aminoácido

Fenotipo

RP-2801 ⇒ 38 c.5413A>G p.Asn1805Asp 38 c.5413A>G p.Asn1805Asp STGD 95/93 RP-280 ⇒ 38 c.5413A>G p.Asn1805Asp RP precoz 95/96 Tabla IV.11: Familia con miembros que presentan distintos fenotipos retinianos en las que se han identificado ambos alelos mutantes en ABCA4. 1

: Indica que esta familia se analizó previamente en la Universidad de Barcelona (Paloma E et al., 2001).

104

IV-Resultados

I:1 95/91

I:2 95/92

P,Asn1805Asp

p.Asn1805Asp

S T GD

RP precoz

II:1 95/93

p.Asn1805Asp

II:2 95/94

II:3 95/95

II:4 95/96

p.Asn1805Asp

p.Asn1805Asp p.Asn1805Asp

Figura IV.23: Árbol genealógico de la familia RP-280 en la que muestra la segregación de los alelos mutantes en ABCA4 y los respectivos fenotipos.

En una mujer afecta de esta familia (II:4), portadora de un único alelo mutante en ABCA4, se identificó un alelo mutante en el gen CRB1 (Human Crumbs Homologue 1), implicado en la Amaurosis Congénita de Leber (LCA) y RP precoz (E.Vallespin et al., 2005). Esta mujer presenta un fondo de ojo típico de RP con preservación del epitelio paraarteriolar, mientras que su hermano afecto, portador de la mutación p.Asn1805Asp en homozigosis, manifiesta un fenotipo típico de Enfermedad de Stargardt. Como se observa en la Figura IV.20, los alelos mutantes identificados en ABCA4 cosegregan con la enfermedad en el probandus (II:1), pero no en su hermana. El análisis de haplotipos confirmó esta segregación, como se verá más adelante.

Familias con un alelo mutante Familia ⇒ Nº ADN

Alelo 1 Exón

Cambio de nucleótido

Alelo 2 Cambio de aminoácido

Exón

Cambio de nucleótido

Cambio de aminoácido

Fenotipo

RP-315 ⇒ 42 c.5882G>A p.Gly1961Glu DCB 95/397 RP-315 ⇒ DM Best 95/398 RP-315 ⇒ 42 c.5882G>A p.Gly1961Glu FFM 95/399 RP-532 ⇒ 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu STGD 99/115 RP-532 ⇒ 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu DCB 99/114 RP-532 ⇒ 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu DCB 99/146 Tabla IV.12: Familias con miembros que presentan distintos fenotipos retinianos en los que se ha identificado un alelo mutante en ABCA4. Leyenda: DM: Distrofia macular de Best; FFM: Fundus flavimaculatus.

105

IV-Resultados

B

A

DCB

I:1

I:1 99/117

I:2 95/397

FFM

II:1 95/398

S T GD

p.Arg1129Leu

p.Gly1961Glu

DM Be s t

I:2 99/116

DCB

DCB

II:1 99/114

II:2 95/399

p.Gly1961Glu

II:2 99/115

p.Arg1129Leu

II:3 99/146

p.Arg1129Leu

P,Arg1129Leu

Figura IV.24: A) Familia RP-315. B) Familia RP-532. En ambos árboles genealógicos se muestra la segregación de los alelos mutantes en ABCA4 y los respectivos fenotipos.

En la familia RP-315, se observa que la madre afecta (I:2) presenta un fenotipo de DCB, mientras que su hijo afecto (II:2) muestra un fenotipo FFM (ver pág. 24), que es una manifestación menos severa que la STGD. Como caso peculiar, la hija (II:1) presenta un fondo de ojo que concuerda con distrofia macular de Best (distrofia macular juvenil, autosómica dominante, provocada por mutaciones en el gen VMD2 -Vitelliform Macula Dystrophy Gene 2-). En la familia RP-532, los tres hermanos afectos presentan la misma segregación del alelo p.Arg1129Leu. Sin embargo, ambas hermanas (II:1, II:3) presentan un fenotipo DCB mientras que el hermano (II:2) muestra un fenotipo STGD.

Las mutaciones identificadas en estas familias se comprobaron por secuenciación, coincidiendo con los resultados obtenidos por el microarray de genotipado.

106

IV-Resultados

e) Distrofia Macular Autosómica Dominante (ADDM) Se estudiaron un total de siete familias con ADDM, entre las cuales se identificaron: - dos familias con un alelo mutante; en una de ellas (ADDM-92) se identificó una paciente afecta de distrofia macular, compatible con STGD, en la que se detectaron ambos alelos mutantes en ABCA4. - cinco familias en las que no se identificaron mutaciones,

Familias con Distrofia Macular Autosómica Dominante

30 25 20 15

Nº familias

10 5 0 2 alelos mutantes

1 alelo mutante

0 alelos mutantes

Figura IV.25: Familias ADDM clasificadas en función de los alelos mutantes identificados.

Los alelos mutantes de ABCA4 identificados en las distintas familias se recogen en la siguiente tabla: Familias con un alelo mutante Familia ⇒ Nº ADN ADDM-59⇒ 02/468 ADDM-92 ⇒ 03/397 ADDM-92 ⇒ 03/456 ADDM-92 ⇒ 03/691

Alelo 1

Alelo 2

Exón

Cambio de nucleótido

Cambio de aminoácido

42

c.5582G>A

p.Gly1961Glu

5

c.466A>G

p.Ile156Val

5

c.514G>A

p.Gly172Ser

18

c.2690C>T

p.Thr897Ile

Exón

Cambio de nucleótido

Cambio de aminoácido

Fenotipo

DM DM 45

c.6148G>T

p.Val2050Leu

Tabla IV.13: Familias ADDM en las que se han identificado alelos mutantes en ABCA4. Leyenda: DM: Distrofia macular.

107

STGD

IV-Resultados

En la familia ADDM-92 se realizó un estudio con el microarray en individuos afectos (III:5, IV:2, IV:3) y en algunos miembros sanos (II:2, III:4, III:6), mediante el cual se identificaron diversos alelos mutantes en ABCA4, como se indica en la Figura IV:23 (en la Tabla IV.13 únicamente se recogen los familiares que presentan diferentes alelos entre sí). La ampliación del estudio familiar permitió identificar a una prima afecta (IV:3) con mutaciones en ambos alelos del gen. El fondo de ojo de esta paciente es compatible con STGD.

I:1

II:1

II:2 03/446

II:3

p.Ile156Val

III:1

III:2 03/398

III:3

p.Ile156Val

DM

DM

III:4 03/455

III:5 03/690

p.Val2050Leu

III:6 03/691

p.Thr897Ile

S T GD IV:1

IV:2 03/397

IV:3 03/456

p.Ile156Val

p.Gly172Ser

p.Val2050Leu

V:1 06/183

p.Ile156Val

Figura IV.26: Árbol genealógico de la familia ADDM-92 en la que se muestra la segregación de los alelos mutantes en ABCA4 y los respectivos fenotipos.

Las mutaciones identificadas en estas familias se comprobaron por secuenciación, coincidiendo con los resultados obtenidos por el microarray de genotipado.

108

IV-Resultados

En la siguiente gráfica se comparan los alelos mutantes identificados en los distintos fenotipos, en la que se aprecia que la patología en la que se detecta un mayor número de alelos mutantes es en la STGD. En las restantes retinopatías, el mayor porcentaje lo representa la no detección de mutaciones.

40 35 30 25

2 alelos mutantes

20

1 alelo mutante

15

0 alelos mutantes

10 5 0 STGD

DCB

RPAR

Otros

Figura IV.27: Histograma en el que se representan los distintos fenotipos asociados a mutaciones en el gen ABCA4 y porcentaje de alelos mutantes identificados en cada uno de ellos. Leyenda: En la columna Otros se incluyen las familias RP-315, RP-532, ADDM-59 y ADDM-92. La familia RP-280 se clasifica como STGD con dos alelos mutantes.

En la muestra que conforman nuestros ciento veintinueve pacientes, se identificaron un total de cuarenta y cinco alelos mutantes diferentes: -

treinta y nueve alelos sencillos (39/45),

-

cinco alelos dobles mutantes (5/45),

-

un alelo triple mutante (1/45).

En referencia al tipo de mutaciones, se observó que: -

la mayor parte de las mutaciones producen un cambio de aminoácido en la proteína (35/45),

-

cinco producen cambios en la pauta de lectura (5/45),

-

tres generan un codon de parada prematuro y, por tanto, una proteína truncada (3/45),

-

dos alteran los sitios donadores/aceptores del procesamiento de los intrones (2/45).

109

R1 52 Q + 10 7H +

28 88 de lG

E

9L

61

12

19

15

10

R1 1 G 0 8C 1 3 2 97 7 S 11 in s GT R6 IV 02 S4 W 0 +5 G> A I1 56 V L2 06 0R Q 13 15 T1 X 01 9M R1 V1 10 43 8C 3I + R2 10 P1 7 H 50 48 41 6L de lV VA I T1 N1 C 25 80 3M 5D G 86 + G 3A 19 61 + R1 E 05 5 N1 W 79 9 R2 D 01 7 S1 P 64 2 47 39 R de lT T8 97 I R2 12 C L1 94 0P V2 L 22 56 41 V o V al t. p ro c Q . 21 87 E1 X 12 2 P1 K IV 38 S2 0L 2 -2 A W > 14 V9 T 80 31 R M + R1 64 C 1 0W 49 0Y G T9 86 01 3A A + R 45 9 43 37 Q ins G C 19 61 R R4 08 X L1 1P R1 64 0W N3 80 K P1 94 8L V7 67 D

R2

G

R1

25

22´43%

20

8´41 % 1% 7´47% 4´67% 3´74% 2´80%

5

1´87% 0´93%

0

Figura IV.28: En esta gráfica se representan el total de alelos mutantes diferentes (45) identificados en el gen ABCA4, así como sus respectivas frecuencias.

110

IV-Resultados

3.1.3- CARACTERIZACIÓN DE POLIMORFISMOS

El microarray de genotipado ha permitido detectar mutaciones (cambios a nivel de ADN que resultan patológicos para el individuo) y polimorfismos (cambios a nivel de ADN o a nivel de proteína no patológicos para el individuo) en el gen ABCA4. En este gen se ha identificado dos tipos de polimorfismos: -

cambios en la secuencia de ADN que no alteran la secuencia de aminoácidos de la proteína: mutaciones sinónimas o polimorfismos;

-

cambios de nucleótido que producen un cambio de aminoácido en la proteína, pero que se han identificado en homozigosis en población control sin que produzcan afectación retiniana en el individuo: polimorfismos proteicos.

En la siguiente tabla se indican las frecuencias de los cambios identificados:

Polimorfismo Exón

Cambio de nucleótido

Cambio de aminoácido

6

c.635G>A

p.Arg212His

10

c.1268A>G

p.His423Arg

10

c.1269C>T

p.= (1)

-

IVS10+5 del G

19

c.2828G>A

p.Arg943Gln

28

c.4203C>A

p.= (2)

-

IVS33+48 C>T

40

c.5603A>T

N1868I

40

c.5682G>C

p.= (3)

41

c.5814A>G

p.= (4)

42

c.5843CA>TG

P1948L

42

c.5844A>G

p.= (5)

44

c.6069C>T

p.= (6)

45

c.6249C>T

p.= (7)

46

c.6285T>C

p.= (8)

-

IVS48+21 C>T

49

c.6764G>T

p.Ser2255Ile

Frecuencia

3´3% 28´3% 3´3% 21´7% 6´1% 2´9% 57´0% 10´2% 27´4% 16´8% 3´3% 12´7% 9´0% 8´2% 16´4% 2´4% 6´5%

Tabla IV.14: Polimorfismos, proteicos y no proteicos, identificados en ABCA4. Leyenda: p.=, indica que no cambia el aminoácido (antes: p.= (1) p.His423His; p.= (2) p.Pro1401Pro; p.= (3) p.Leu1894Leu; p.=

(4)

p.Leu1938Leu; p.= (5) p.Pro1948Pro; p.= (6) p.Ile2023Ile; p.= (7) p.Ile2083Ile; p.= (8) p.Asp2095Asp.

111

IV-Resultados

Se identificaron un total de diecisiete polimorfismos diferentes, de los cuales: -

ocho son mutaciones sinónimas (8/17),

-

seis son variantes que provocan un cambio de aminoácido en la proteína (6/17),

-

tres cambios se producen en zona intrónica (3/17).

R

21 2 H H 42 3R IV S H4 10 23 +5 H de l R G 94 3 IV P Q S 14 33 0 +4 1P 8 C N >T 18 6 L1 8I 89 L1 4L 93 P1 8L 94 P1 8L 94 8 I2 P 02 3 I2 I 08 IV D2 3 I S 48 095 +2 D 1 C S2 >T 25 5I

57´0% 160 60 140 120 45 100 28´3% 27´4% 80 21´7% 30 16´4% 16´8% 60 12´7% 10´2% 6´5% 9´0% 8´2% 40 3´3% 3´3% 6´1% 2´ 15 2´9% 3´3% 2´4% 20 0

Figura IV.29: Polimorfismos identificados en el gen ABCA4 y sus respectivas frecuencias.

112

IV-Resultados

3.2- ESTUDIO GENÉTICO INDIRECTO

3.2.1- FAMILIAS ESTUDIADAS

El estudio familiar se realizó en setenta y nueve de las ciento veintinueve familias (79/129), como se verá a continuación.

3.2.2- ANÁLISIS DE HAPLOTIPOS

Debido al elevado número de familias estudiadas, los resultados se presentan por fenotipos.

a) Enfermedad de Stargardt (STGD) El análisis de haplotipos se realizó en cincuenta y tres de las setenta y cuatro familias con STGD (53/74), ya que en veintiuna de las familias (21/74) únicamente se contaba con el caso índice (ver págs. 4347). En las familias estudiadas, fue posible descartar el gen ABCA4 como responsable en cuatro de ellas (4/53) en las que se observó que los haplotipos no cosegregaban con la enfermedad. En las cuarenta y nueve familias restantes que mostraban cosegregación, se identificaron alelos mutantes en cuarenta y dos de ellas (42/49).

· Cosegregan: 49

· Con estudio familiar: 53

· Con alelos mutantes: 42⇒ ARDM-12, ARDM-14, ARDM-15, ARDM-16, ARDM-17, ARDM-22, ARDM-31, ARDM-38, ARDM-39, ARDM-40, ARDM-47, ARDM-57, ARDM-60, ARDM-61, ARDM-62, ARDM-63, ARDM-64, ARDM-65, ARDM-72, ARDM-78, ARDM-81, ARDM-82, ARDM-90, ARDM-91, ARDM-96, ARDM-110, ARDM-111, ARDM-116, ARDM-119, ARDM-125, ARDM-128, ARDM-131, ARDM-137, ARDM-138, ARDM-139, ARDM-146, ARDM-153, ARDM-155, ARDM-162, ARDM-163, ARDM-168, ARDM-170. (Ver Tablas IV.5 y IV.6) · Sin alelos mutantes: 7⇒ ARDM-67, ARDM-83, ARDM-122, ARDM-84, ARDM-100, ARDM-142, ARDM-160.

74 Familias STGD

· No cosegregan: 4⇒ ARDM-71, ARDM-118, ARDM-140, ARDM-156.

· Sin estudio familiar: 21

· Con alelos mutantes: 10⇒ ARDM-66, ARDM-75, ARDM-76, ARDM-88, ARDM-135, ARDM-158, ARDM-164, ARDM-165, ARDM-167, SRP-773. (Ver Tablas IV.5 y IV.6) · Sin alelos mutantes: 11⇒ ARDM-52, ARDM-58, ARDM-68, ARDM-69, ARDM-77, ARDM-117, ARDM-123, ARDM-129, ARDM-130, ARDM-148, ARDM-151.

Figura IV.30: Esquema del análisis de haplotipos realizado en las familias con Enfermedad de Stargardt.

113

IV-Resultados

Como se ha visto anteriormente (ver pág. 100), en la familia ARDM-61 se identificó que la paciente presentaba la mutación p.Arg1129Leu en homozigosis debido a una isodisomía parcial paterna, ya que únicamente su padre era portador del alelo mutante. La posibilidad de que esta segregación fuese debida a una una microdeleción del alelo materno se descartó mediante el análisis de cinco marcadores microsatélites flanqueantes al gen: D1S435-D1S2804-D1S2868-ABCA4-D1S236-D1S2664. En esta región del brazo corto del cromosoma 1, se observó que la paciente era homozigota para todos los marcadores y que éstos eran idénticos a uno de los dos alelos paternos (Figura IV.31, barra negra). La región homozigota (isodisómica) comprendía una distancia física de 4´4 Mb, incluyendo el locus de ABCA4.

D1S450 D1S2667

02/724

D1S234 D1S255 D1S2797 D1S2890 D1S2829 D1S2803 D1S464 D1S207 D1S167 D1S435 D1S2804 D1S2868 D1S236 D1S2664 D1S2793 D1S206

ABCA4

D1S2726 D1S498 D1S484 D1S2878 D1S196 D1S218 D1S238 D1S408 D1S2757 D1S413 D1S1660 D1S249 D1S425 D1S229 D1S213 D1S2800 D1S2785 D1S2842

2 3 1 1 1 1 2 1 2 2 1 1 2 2 +? 2 2 2 1 3 3 1 2 1 3 2 2 2 1 2 2 1 1 1 2 2 1 2

02/725

02/726 3 2 1 1 2 1 1 3 2 4 2 3 1 1 ?1 3 2 2 2 2 1 1 2 2 2 2 3 2 1 3 2 3 2 1 1 2 1

1 1 2 1 2 1 3 2 1 1 2 2 2 1 -? 1 1 2 1 2 3 2 2 2 1 1 1 1 1 3 1 1 2 3 3 3 1 1

3 2 1 1 3 2 2 1 2 3 2 3 1 3 ? 3 3 1 2 1 1 1 2 1 3 2 2 2 1 2 2 1 1 1 2 2 2 1

2 3 1 1 1 1 2 1 2 2 1 1 2 2 +? 2 2 2 1 3 3 1 2 1 3 2 2 2 1 2 2 1 1 1 2 2 1 2

1 1 2 1 2 1 3 2 1 1 2 1 2 2 +? 2 2 2 1 2 3 2 2 2 1 1 1 1 1 3 1 1 2 3 3 3 1 1

D1S2836

Figura IV.31: Árbol genealógico de la familia ARDM-61 en el que se muestran treinta y dos marcadores genéticos distribuidos a lo largo del cromosoma 1, en la paciente y en sus padres.

114

IV-Resultados

Como se muestra en la figura anterior, se analizaron veintisiete microsatélites adicionales, localizados a lo largo del cromosoma 1. Se observó que la paciente presentaba marcadores heterozigotos biparentales cerca del centrómero (D1S2726), así como en la región distal del brazo corto (D1S450, D1S2667) y del brazo largo (D1S2842). En los restantes marcadores, se observaron regiones no informativas en las cuales no se puede diferenciar entre una segregación biparental normal o heterodisomía uniparental maternal. El análisis de haplotipos permitió determinar que esta segregación era producida por una isodisomía parcial paterna, con los puntos de rotura localizados entre 1p22.3 (D1S167-D1S435) y 1p22.1 (D1S2664D1S2793). Los marcadores D1S2793 y D1S206 (brazo corto) también podrían estar involucrados en la isodisomía, pero no son informativos. Asimismo, la paternidad se confirmó mediante el análisis de marcadores microsatélites localizados en los cromosomas 13, 18, 21, X e Y (datos no presentados en este trabajo).

b) Distrofia de conos y bastones (DCB) El análisis de haplotipos se realizó en catorce de las veintiocho familias con DCB (14/28), ya que en catorce de las familias (14/28) únicamente se contaba con el caso índice (ver págs. 47, 48). En las familias estudiadas, fue posible descartar el gen ABCA4 como responsable en dos de ellas (2/14) en las que se observó que los haplotipos no cosegregaban con la enfermedad. En las doce familias restantes que mostraban cosegregación, se identificaron alelos mutantes en ocho de ellas (8/12).

· Cosegregan: 12 · Con estudio familiar: 14

· Con alelos mutantes: 8⇒ ARDM-79, ARDM-86, ARDM-126, ARDM-133, ARDM-174, ARDM-176, RP-267, RP-959. (Ver Tablas IV.8 y IV.9) · Sin alelos mutantes: 4⇒ ARDM-49, ARDM-169, SRP-763, ARDM-195.

· No cosegregan: 2⇒ ARDM-134, ARRP-719. 28 Familias DCB · Con alelos mutantes: 2⇒ ARDM-99, RP-577. (Ver Tablas IV.8 y IV.9) · Sin estudio familiar: 14 · Sin alelos mutantes: 12⇒ ARDM-85, ARDM-159, ARDM-192, ARRP-55, RP-586, RP-657, SRP-827, SRP-828, SRP-964, RP-965, RP-971, RP-973.

Figura IV.32: Esquema del análisis de haplotipos realizado en las familias con distrofia de conos y bastones.

115

IV-Resultados

c) Retinosis Pigmentaria Autosómica Recesiva (RPAR) El análisis de haplotipos se realizó en cinco de las diecisiete familias con RPAR (5/17), (ver pág. 49). En dos de estas familias se pudo descartar el gen ABCA4 como responsable de enfermedad (2/5) y en una de ellas se identificó un alelo mutante (1/2). En las tres familias que mostraban cosegregación, no se identificaron alelos mutantes.

· Cosegregan: 3

· Sin alelos mutantes: 3⇒ ARDM-89, SRP-857, RP-927.

· Con estudio familiar: 5 · Con alelos mutantes: 1⇒ ARRP-700 (Ver Tabla IV.10). · No cosegregan: 2 17 Familias RPAR

· Sin alelos mutantes: 1⇒ ARDM-54.

· Con alelos mutantes: 3⇒ SRP-766, SRP-775, SRP-834 (Ver Tabla IV.10). · Sin estudio familiar: 12

· Sin alelos mutantes: 9 ⇒ ARRP-82, RP-417, RP-578, RP-586, SRP-716, SRP-813, SRP-818, RP-854, RP-937.

Figura IV.33: Esquema del análisis de haplotipos realizado en las familias con RPAR.

En la familia ARRP-700, el análisis de haplotipos permitió descartar el gen ABCA4 como responsable de enfermedad, ya que ambos hermanos afectos (II:1, II:5) mostraban haplotipos diferentes. En el hermano afecto (II:1) se identificó un alelo mutante, como se indica en la siguiente figura:

I:1 I:2 01/1242 01/1244 158 154 154 170 191 183 p.Pro1948Leu 177 179 188 188 188 184

II:1 01/1246 158 154 191 177 188 188

II:2 01/1245 154 154 183 177 188 188

p.Pro1948Leu

II:3 01/1243 154 170 183 179 188 184

II:4 01/1240 154 154 183 177 188 188

II:5 01/1200 158 170 191 179 188 184

II:6 01/1241 154 154 183 177 188 188

Figura IV.34: Árbol genealógico de la familia ARRP-700, en el que se muestra los haplotipos y la segregación del alelo mutante p.Pro1489Leu.

116

IV-Resultados

d) Fenotipo diverso El análisis de haplotipos se realizó en las tres familias que presentaron distintos fenotipos asociados a mutaciones en el gen ABCA4. En las tres familias, los haplotipos cosegregaban con la enfermedad y se identificaron alelos mutantes.

3 Familias Fenotipo diverso

· Con estudio familiar: 3

· Cosegregan: 3

· Con alelos mutantes: 3⇒ RP-280, RP-315, RP-532. (Ver Tablas IV.11 y IV.12)

Figura IV.35: Esquema del análisis de haplotipos realizado en las familias con fenotipo diverso.

Como se ha mostrado anteriormente (ver pág. 104), en la familia RP-280 se identificó la mutación p.Asn1805Asp en homozigosis en el probandus con STGD (II:1), mientras que su hermana (II:4) es heterozigota para dicho cambio y presenta un fenotipo compatible con RP precoz. La segregación de los haplotipos confirmó la distribución de los alelos mutantes.

I:1 95/91 p.Asn1805Asp

154 177 189

I:2 95/92 158 177 185

154 p.Asn1805Asp177 189

154 185 207

ST DG

RP precoz

II:1 95/93 154 p.Asn1805Asp177 189

II:2 95/94 154 154 177p.Asn1805Asp 177 189 189 p.Asn1805Asp

II:3 95/95 154 185 207

158 177 185

II:4 95/96 154 185 207

158 177 185

154 177p.Asn1805Asp 189

Figura IV.36: Árbol genealógico de la familia RP-280, en el que se muestran los haplotipos y la segregación del alelo mutante p.Asn1805Asp.

117

IV-Resultados

En la familia RP-315 el alelo mutante p.Gly1961Glu aparece en la madre y en el hijo, como se ha visto anteriormente (ver pág. 106). El análisis de haplotipos mostró que ambos hermanos comparten uno de los dos cromosomas paternos (rojo), pero cada uno ha heredado un cromosoma materno diferente.

DCB

I:1 ? ? ?

I:2 95/397 170 158 183 191 206 188

? ? ?

p.Gly1961Glu

DM Be s t

II:1 95/398 154 158 179 191 206 188

FFM

II:2 95/399 154 170 179 183 p.Gly1961Glu 206 206

Figura IV.37: Árbol genealógico de la familia RP-315, en el que se muestran los haplotipos y la segregación del alelo mutante p.Gly1961Glu.

En la familia RP-532, los haplotipos cosegregan con la enfermedad. Los tres hermanos comparten los mismos haplotipos y el alelo mutante p.Arg1129Leu.

I:1 99/117 170 154 185 183 206 206

DCB

I:2 99/116 158 168 183 191 206 188 p.Arg1129Leu

S T GD

DCB

II:1 II:2 II:3 99/114 99/115 99/146 170 168 170 158 170 158 185 183 185 183 185 183 p.Arg1129Leu 206 206 206 206 206 206 p.Arg1129Leu p.Arg1129Leu

Figura IV.38: Árbol genealógico de la familia RP-532, en el que se muestran los haplotipos y la segregación del alelo mutante p.Arg1129Leu.

118

IV-Resultados

e) Distrofia Macular Autosómica Dominante (ADDM) El análisis de haplotipos se realizó en dos de las siete familias con ADDM (2/7), (ver pág. 50). En una de estas familias se pudo descartar el gen ABCA4 como responsable de enfermedad (1/2), aunque se identificó un alelo mutante. En la familia que mostró cosegregación (1/2), también se identificó un alelo mutante. En las familias restantes, no se detectaron mutaciones. · Cosegregan: 1

· Con alelos mutantes: 1⇒ ADDM-92 (Ver Tabla IV.13).

· Con estudio familiar: 2 · No cosegregan: 1

7 Familias ADDM · Sin estudio familiar: 5

· Con alelos mutantes: 1⇒ ADDM-59 (Ver Tabla IV.13).

· Sin alelos mutantes: 5 ⇒ ADDM-74, ADDM-80, ADDM-94, ADDM-105, ADDM-106.

Figura IV.39: Esquema del análisis de haplotipos realizado en las familias con ADDM.

En la familia ADDM-92 se identificaron diversos alelos mutantes en ABCA4, como se ha visto anteriormente (ver pág. 107). El análisis de haplotipos que se muestra en la siguiente figura no puede descartar el gen ABCA4 como responsable de enfermedad. I:1 ? ? ? II:1 ? ? ?

II:2 03/446 154 168 183 p.Ile156Val 185 208 188

? ? ?

II:3 ? ? ?

? ? ?

DM

III:1 ? ? ?

? ? ?

III:2 03/398 154 154 189 185p.Ile156Val 206 208

III:3 ? ? ?

? ? ?

III:4 03/455 154 168 177 183 206 188

III:5 03/690 154 168 191 183 188 188

p.Val2050Leu

DM

S T GD

IV:1 ? ? ?

? ? ?

IV:2 03/397 154 154 183 185 208 208

p.Ile156V

p.Gly172Ser

IV:3 03/456 154 154 189 177 184 206

III:6 03/691 168 168 179 183 204 188

p.Thr897Ile

p.Val2050Leu

V:1 06/183 158 154 177 185 p.Ile156Val 208 208

Figura IV.40: Árbol genealógico de la familia ADDM-92; haplotipos y segregación de los alelos mutantes.

119

? ? ?

IV-Resultados

3.3.2- HAPLOTIPOS PREVALENTES

Mediante el estudio genético directo realizado en nuestras familias, se ha identificado un alelo mutante prevalente (ver pág. 110, Figura IV.28). En el gráfico anterior se puede observar que la mutación más frecuente en nuestra población es el cambio p.Arg1129Leu, que aparece en dieciocho pacientes y en cinco de ellos se produce en homozigosis. El análisis de haplotipos realizado con marcadores extragénicos (microsatélites) e intragénicos (SNPs o polimorfismos de único nucleótido, detectados mediante el microarray) permitió identificar que algunos de los pacientes portadores de dicha mutación comparten un haplotipo similar, como se muestra en la siguiente tabla:

Familias Marcadores

ARDM-31

ARDM-47

ARDM-57

ARDM-61

D1S435

154

168/154

158

DIS2804

182

182/182

D1S2868

146

p.His423Arg (c.1268A>G) p.Arg1129Leu (c.3386G>T) IVS33 + 48C>T D1S236

1

ARDM-62

ARDM-78

ARDM-82

154/154

154

164

168

182

182/182

182

192

182

146/146

146

146/146

144

146

146

A//G

A//G

A//G

G

A//G

A

G

T

T/T

T

T

T

T

T

T

T/T

T

T

C//T

T

T

188

202/206

206

206/206

206

210

206

Familias Marcadores

ARDM-96

ARDM-111

ARDM-119

ARDM-128

ARDM-139

ARDM-155

ARDM-162

D1S435

168

154/154

168/154

168/168

154

154

170

DIS2804

190

188/182

172/182

172/172

182

182

182

D1S2868

142

142/146

146/146

146/146

146

146

146

A//G

G

G

G

A//G

A//G

A//G

T

T

T

T

T

T

T

T

T

T

T

T

T

T

206

206/184

206/206

206/206

206

206

188

p.His423Arg (c.1268A>G) p.Arg1129Leu (c.3386G>T) IVS33 + 48C>T D1S236

Tabla IV.15: marcadores extragénicos e intragénicos al gen ABCA4, identificados en familias con la mutación p.Arg1129Leu. En los marcadores intragénicos, los alelos salvajes se muestran en azul y los mutantes en rojo. El símbolo”//” indica que no se ha podido establecer la fase del alelo. Las familias subrayadas indican que el cambio p.Arg1129Leu se produce en homozigosis; por tanto, se muestran ambos alelos, paterno y materno, respectivamente. 1

: En esta paciente la homozigosidad se ha producido por isodisomía parcial (ver pág. 100).

120

IV-Resultados

En la tabla anterior no se incluyen las familias ARDM-66, ARDM-76, ARDM-164 y SRP-773, ya que en ellas únicamente se ha estudiado el caso índice y no se puede establecer la fase de los marcadores microsatélites y polimorfismos.

Según los resultados anteriores, se observa que el cambio IVS33+48C>T está presente siempre que aparece la mutación p.Arg1129Leu, aunque en la familia ARDM-62 no se ha podido establecer la fase. En las familias en las p.Arg1129Leu se produce en homozigosis, el cambio p.His423Arg aparece asociado a dicha mutación en todas excepto en la familia ARDM-47, en la que no se pudo determinar la fase del polimorfismo aunque éste aparece en heterozigosis. En la familia ARDM-78, el cambio p.His423Arg no se produce, mientras que IVS33+48C>T aparece asociado a la mutación p.Arg1129Leu.

El análisis de los marcadores microsatélites identificó un haplotipo compartido por las familias ARDM-47 (alelo materno), ARDM-61 (en ambos alelos, debido a la isodisomía parcial), ARDM-119 (alelo materno), ARDM-139 y ARDM-155. Si no se considera el marcador D1S435 (el más distal de ABCA4, ver pág. 67), se observa que las familias ARDM-57 y ARDM-82 comparten un haplotipo similar con las cuatro anteriores (Figura IV.41A). El segundo haplotipo más prevalente lo comparten las familias ARDM-119 (alelo paterno) y ARDM-128 (ambos alelos) (Figura IV.41B). Por último, las familias ARDM-31 y ARDM-162 comparten un haplotipo idéntico, que únicamente difiere en el marcador distal D1S435 (Figura IV.41C).

A ARDM-47, ARDM-61, ARDM-119, ARDM-139, ARDM-155 154 182 146 A//G T T 206

154 182 146 G T T 206

154 182 146 G T T 206

ARDM-57, ARDM-82

154 182 146 A//G T T 206

154 182 146 A//G T T 206

B

158 182 146 A//G T T 206

C ARDM-119, ARDM-128 168 172 146 G T T 188

ARDM-31, ARDM-162 15 154 182 146 A//G T T 188

168 172 146 G T T 188

170 182 146 A//G T T 188

Figura IV.41: Haplotipos compartidos por las diferentes familias con la mutación R1129L.

121

168 182 146 G T T 206

IV-Resultados

El segundo alelo más frecuente en la muestra de pacientes STGD fue el cambio p.Gly1961Glu (ver pág. 110, Figura IV.28). El haplotipo establecido con las mutaciones detectadas por el microarray mostró que p.Gly1961Glu siempre aparece asociado a cuatro polimorfismos de único nucleótido. Sin embargo, el haplotipo formado con los marcadores microsatélites extragénicos difiere entre los distintos pacientes.

ARDM-57

ARDM-12 158 188 c.5682G>C c.5814A>G c.5843CA>TG c.5844A>G c.5882G>A 80 0 1 18

ARDM-60

154 191 c.5682G>C c.5814A>G c.5843CA>TG c.5844A>G c.5882G>A 208

ARDM-65

15 154 183 c.5682G>C c.5814A>G c.5843CA>TG c.5844A>G c.5882G>A 18 189

ARDM-81

15 158 177 c.5682G>C c.5814A>G c.5843CA>TG c.5844A>G c.5882G>A 18 185

ARDM-168 15 154 185 c.5682G>C c.5814A>G c.5843CA>TG c.5844A>G c.5882G>A 18 183

16 168 187 c.5682G>C c.5814A>G c.5843CA>TG c.5844A>G c.5882G>A 21 214

Figura IV.42: Haplotipos de las familias con la mutación p.Gly1961Glu; los marcadores utilizados fueron los siguientes: TEL- D1S435- DIS2804- c.5682G>C (p.Leu1864Leu) - c.5814A>G (p.Leu1938Leu) - c.5843CA>TG (p.Pro1948Leu) – c.5844A>G (p.Pro1948Pro) - c.5882G>A (p-Gly1961Glu) - D1S236-CEN. En azul se representan los polimorfismos proteicos y en rojo la mutación.

Otra

mutación

frecuente

en

nuestros

pacientes

es

el

alelo

complejo

[p.Arg152Gln+p.Arg1108Cys+p.Arg2107His], que aparece en cuatro familias, en una de ellas se produce en homozigosis (ARDM-14). En otras dos familias (ARDM-110 y ARDM-116), se detectó el alelo doble mutante [p.Arg1108Cys+p.Arg2107His], que difiere del anterior en la mutación p.Arg152Gln (ver pág. 95). Los haplotipos construidos con los marcadores microsatélites son similares entre los diferentes pacientes. El análisis de haplotipos se muestra en la siguiente figura:

ARDM-17

ARDM-14 154 182 148 c.455G>A c.3322C>T c.6320G>A 206

154 190 144 c.455G>A c.3322C>T c.6320G>A 188

ARDM-137

154 190 144 c.455G>A c.3322C>T c.6320G>A 188

ARDM-139

154 190 144 c.455G>A c.3322C>T c.6320G>A 188

ARDM-110

154 190 144 c.455G>A c.3322C>T c.6320G>A 206

ARDM-116

154 190 144 c.3322C>T c.6320G>A 188

158 198 144 c.3322C>T c.6320G>A 188

Figura IV.43: Haplotipos de las familias con los alelos complejos [p.Arg152Gln+p.Arg1108Cys+p.Arg2107His] y [p.Arg1108Cys+p.Arg2107His], respectivamente. Los marcadores utilizados fueron los siguientes: TEL- D1S435DIS2804-D1S2868- c.455G>A (p.Arg152Gln) - c.3322C>T (p.Arg1108Cys) - c.6320G>A (p.Arg2107His) -D1S236-CEN. Las mutaciones se representan en rojo.

122

IV-Resultados

3.3- CORRELACIÓN GENOTIPO-FENOTIPO Con el fin de determinar la severidad de las mutaciones identificadas en el gen ABCA4, se han agrupado los pacientes en función de la combinación de alelos mutantes que presentan, el fenotipo exhibido y en la edad de comienzo de la enfermedad. Los datos utilizados en el análisis se recogen en las siguientes tablas:

1- En primer lugar, se clasifican los pacientes con el alelo prevalente p.Arg1129Leu en homozigosis. Los síntomas comienzan en la segunda década de vida y el fenotipo resultante es STGD: presentan escotoma central, discromatopsia (no percepción de los colores), fotosensibilidad y agudeza visual disminuida (entre 0´1-0´5). Algunos casos presentan estrabismo y alteración de la onda b en el ERG.

Familia

Alelo 1

Alelo 2

Edad de inicio (años)

Fenotipo

ARDM-61

p.Arg1129Leu

p.Arg1129Leu

12

STGD

ARDM-111

p.Arg1129Leu

p.Arg1129Leu

18

STGD

ARDM-119

p.Arg1129Leu

p.Arg1129Leu

19

STGD

ARDM-128

p.Arg1129Leu

p.Arg1129Leu

19

STGD

ARDM-47

p.Arg1129Leu

p.Arg1129Leu

21

STGD

N= 5; Media de edades ⇒ x = 17´8 años; Desviación estándar ⇒ σ = 3´42

2- A continuación, se muestran los pacientes heterozigotos compuestos con el alelo p.Arg1129Leu. Asimismo, el fenotipo asociado a esta combinación de alelos es siempre STDG y la edad de comienzo oscila desde la primera década de vida hasta la cuarta.

Familia

Alelo 1

ARDM-76

p.Arg1129Leu

ARDM-78

p.Arg1129Leu

ARDM-155 ARDM-57

Alelo 2

Edad de inicio (años)

Fenotipo

p.= o altera el procesamiento p.Gln2187X

9

STGD

10

STGD

p.Arg1129Leu

p.Arg602Trp

11

STGD

p.Arg1129Leu

p.Gly1961Glu

15

STGD

ARDM-82

p.Arg1129Leu

p.Glu1122Lys

15

STGD

ARDM-66

p.Arg1129Leu

17

STGD

ARDM-96

p.Arg1129Leu

p.Leu1940Pro p.Trp1408Arg p.Arg1640Trp

17

STGD

ARDM-139

p.Arg152Gln p.Arg1108Cys p.Arg2107His

p.Arg1129Leu

20

STGD

ARDM-62

p.Arg1129Leu

p.Gly1977Ser

39

STGD

ARDM-31

p.Arg1129Leu

p.Ser1642Arg

40

STGD

N= 10; Media de edades⇒ x = 19´3 años; Desviación estándar= σ = 10´6

123

IV-Resultados

3- En la siguiente tabla se recogen los pacientes con STGD que portan, al menos, un alelo complejo. Al igual que en el grupo anterior, la edad de comienzo es muy variable.

Familia ARDM-14

ARDM-17 ARDM-110 ARDM-15 ARDM-116 ARDM-137 ARDM-138 ARDM-12

Alelo 1

Alelo 2

Edad de inicio (años)

Fenotipo

p.Arg152Gln p.Arg1108Cys p.Arg2107His p.Arg152Gln p.Arg1108Cys p.Arg2107His p.Arg1108Cys p.Arg2107His p.Gly863Ala p.Arg1055Trp p.Arg1108Cys p.Arg2107His p.Arg152Gln p.Arg1108Cys p.Arg2107His p.Gly863Ala p.Arg943Glu p.Thr1253Met p.Gly1961Glu

p.Arg152Gln p.Arg1108Cys p.Arg2107His

5

STGD

p.Arg2107Pro

8

STGD

p.Gly1961Glu

8

STGD

c.2888delG

11

STGD

p.Cys1490Tyr

11

STGD

IVS40+5 G>A

13

STGD

c.4537ins C

19

STGD

p.Gln1315X

38

STGD

N= 8; Media de edades= 14´1 años; Desviación estándar= σ = 9´8

4- A continuación se recogen los pacientes que portan alelos sencillos, a excepción del alelo mutante p.Arg1129Leu. Presentan STGD y la edad de comienzo se sitúa entre la primera y la segunda década de vida.

Familia

Alelo 1

Alelo 2

Edad de inicio (años)

Fenotipo

ARDM-38

p.Arg602Trp

c.4739 del T

8

STGD

ARDM-40

p.Thr1019Met

p.Gln1315X

8

STGD

ARDM-90

p.Gly1977Ser

IVS22 -2A>T

8

STGD

ARDM-72

p.Ile156Val

p.Arg602Trp

12

STGD

ARDM-22

c.2888delG

p.Leu2060Arg

12

STGD

ARDM-170

p.Arg408X

p.Pro1486Leu

14

STGD

ARDM-64

p.Arg212Cys

p.Gly1977Ser

15

STGD

ARDM-168

p.Gly1961Glu

p.Leu2060Arg

15

STGD

ARDM-88

p.Pro1380Leu

IVS40+5 G>A

16

STGD

ARDM-60

p.Arg602Trp

p.Gly1961Glu

17

STGD

ARDM-81

p.Gly1961Glu

p.Val1433Ile

18

STGD

ARDM-153

c.3211insGT

p.Gly1961Arg

24

STGD

N= 12; Media de edades= 13´9 años; Desviación estándar= σ = 4´5

124

IV-Resultados

5- Por último, se muestran las familias que presentan un fenotipo DCB, caracterizado por pérdida de la visión central, ceguera nocturna y alteraciones en el ERG que se manifiestan primero en conos y posteriormente en bastones. El comienzo de la enfermedad es muy temprano, ya que se produce en la primera década de vida.

Familia

Alelo 1

Alelo 2

Edad de inicio (años)

Fenotipo

RP-267

p.Val1681_Cys1685del

p.Val1681_Cys1685del

6

DCB

ARDM-79

c.2888delG

c.2888delG

8

DCB

ARDM-86

c.2888delG

c.2888delG

8

DCB

ARDM-133

p.Leu11Pro

c.2888delG

8

DCB

ARDM-176

c.2888delG

p.Leu2060Arg

10

DCB

ARDM-126

p.Gly1977Ser

p.Gly1977Ser

10

DCB

N= 6; Media de edades= 8´3 años; Desviación estándar= σ = 1´4

125

IV-Resultados

3.4- ORIGEN GEOGRÁFICO DE LAS MUTACIONES En la siguiente tabla se muestra la procedencia geográfica de los padres de los pacientes, por lo que se puede representar el origen geográfico de las mutaciones identificadas.

Procedencia Familia

Alelo paterno

ARDM-12

Procedencia

Alelo materno

Familia

Peñaflor (Sevilla)

Segovia Guadalajara Cidamón Burgos (La Rioja) Puerto Llano Madrid (Ciudad Real) Barrika (Vizcaya) Castro Caldelas (Orense) San Sebastián Echarri Aranaz (Guipúzcoa) (Navarra) Galdako Horga (Vizcaya) (Vizcaya) Yunclillos Ines (Toledo) (Soria) Fuentes de León Ciudad Real (Badajoz) Lucerna (Suíza) Ginebra (Suíza) Prádanos de Madrid Bureba (Burgos) Oviedo Alora Osuna (Málaga) (Sevilla) Vélez-Rubio (Almería)

Madrid

Ciudad Real

ARDM-91

ARDM-15

Ciudad Real

Guadalajara

ARDM-96

ARDM-16

Toledo

ARDM-110

ARDM-17

Madrid

ARDM-111

ARDM-22

Toledo

ARDM-116

ARDM-31

Salamanca

ARDM-119

ARDM-38

Cáceres

ARDM-125 Valladolid

ARDM-128

ARDM-40

Segovia

ARDM-131*

ARDM-47

Madrid

ARDM-135

ARDM-57

Madrid

ARDM-137

ARDM-60

Huelva

ARDM-138 (1)

Ciudad Real

ARDM-61

Burgos

ARDM-139

ARDM-62

Almadén (Ciudad Real)

ARDM-146

ARDM-63

Toledo

ARDM-153

ARDM-64

Madrid

Zaragoza

Alelo materno

ARDM-90

ARDM-14

ARDM-39

Alelo paterno

ARDM-155

ARDM-65

Madrid

ARDM-158*

ARDM-66

Nuñomoral (Cáceres)

ARDM-162

ARDM-72

Pontevedra

ARDM-163

Ingenio (Las Palmas)

ARDM-75

Cuenca

ARDM-164

ARDM-76

Barcelona

ARDM-165

ARDM-78

Ciudad Real

ARDM-167* ARDM-168

San Sebastián (Guipúzcoa) Monforte de Puebla de Lemos (Lugo) Brollón (Lugo) Torre de Juan Úbeda Abad (C. Real) (Jaén) Oviedo

ARDM-170

Madrid

SRP-773

Madrid

ARDM-81 ARDM-82 ARDM-88

Madrid Ávila

Madrid Tenerife

Las Palmas

Cuenca

Papatrigo (Ávila)

Tabla IV.16: Procedencia de los alelos mutantes en ABCA4 en familias STGD.

126

IV-Resultados

Procedencia Familia

Alelo paterno

Procedencia

Alelo materno

Familia

ARDM-79

Toledo

ARRP-700

ARDM-86

Asturias

SRP-766

ARDM-99

Mula (Murcia)

SRP-775

ARDM-126

Toledo

SRP-834*

ARDM-133 ARDM-174 ARDM-176 RP-267

Aldea Rodrigo Navalmoral de la (Salamanca) Mata (Cáceres) La Codosera (Badajoz) Sta. Mª del Páramo S. Martín del (León) Camino (León) San Ginés (Orense)

RP-959

Alelo paterno

Alelo materno Madrid

La Almunia (Zaragoza) Avileses (Murcia) Cantalpino Valladolid (Salamanca)

RP-280

-

RP-315

Cáceres

RP-532

León

Sevilla

ADDM-59

Madrid

ADDM-92

Castrillo de la Reina (Burgos)

Tabla IV.17: Procedencia de los alelos mutantes en ABCA4 en familias DCB, RPAR, fenotipo diverso y ADDM. (1)

: El paciente procede de Suiza, no se representan los alelos en el mapa. *: Indica que no se puede establecer la fase.

T1019M G1961E L2060R 2888 delG (2) 3211insG I156V R1108C+R2107H R602W C1409Y 5041 del15pb (2)

2888 delG L2060R I156V

R1129L (4) R1129L (2) R1129L R1129L (3)

IVS40+5G>A G1977S T1019M V767D Q1315X G1977S R1129L IVS22-2A>T S1642R V931M E1122K L11P G863A+R1055W R1129L R602W N1799D 4739 delT L2241V 2888 delG (3) R1129L L2060R L1940P T897I 2888 delG G1977S (2) G1961E

V256V R1129L

IVS40+5G>A R1640W

T1253M+G1961E Q1315X R602W 3211insGT R1 R1129L G1961R

V1433I I156V R602W R1129L P1380L IVS40+5G>A P1486

Ciudad Real: Real: R152Q+R1108C+R2107H (2) // R1129L (2) R1108C+R2107H // 2888 delG G1961E // G1977S Q2187X

Madrid: Madrid: R1129L (5) // G1961E (5) R152Q+R1108C+R2107H (3) R2107P // R212C V1433I // R408X P1486L // P1948L

Figura IV.44: Origen geográfico de las alteraciones identificadas en el gen ABCA4.

127

IV-Resultados

3.5- FRECUENCIA DE ALELOS MUTANTES DE ABCA4 ENTRE LA POBLACIÓN GENERAL Con el fin de determinar la frecuencia de portadores (sanos) de alelos mutantes en ABCA4, se estudió la mutación p.Arg1129Leu, ya que es el alelo prevalente entre los pacientes analizados (frecuencia=24/107= 22´4%), en un total de cuatrocientos cromosomas: -

cien cromosomas se analizaron mediante ensayo de restricción, con la ER Aci I, ya que la mutación destruye la diana de restricción de esta endonucleasa.

-

trescientos cromosomas se analizaron mediante dHPLC.

Mediante ensayo de restricción, no se identificaron portadores de la mutación p.Arg1129Leu. Sin embargo, el análisis posterior realizado por cromatografía líquida de alto rendimiento en los restantes cromosomas, permitió detectar un patrón alterado o en heterodúplex en dos individuos control (Figura IV.41). A continuación, se secuenciaron las dos muestras que presentaron un patrón alterado y se identificó en ambas el alelo p.Arg1129Leu.

Mutante Control sano Blanco

Figura IV.41: Patrón cromatográfico de un individuo control y de un individuo portador del alelo p.Arg1129Leu.

Los cálculos realizados se indican a continuación:

-

El alelo p.Arg1129Leu representa el 22´4% de los alelos mutantes identificados en ABCA4 (ver pág. 101) y la tasa de detección del microarray es del 54´7% en pacientes STGD (ver pág. 88):

Por tanto:

p.Arg1129Leu ⇒ 0´224 x 0´547 = 0´122⇒ 12´2% de los alelos posibles mutantes en

STGD, es decir, el 12´2% de la frecuencia alélica mutante (q) para ABCA4.

128

IV-Resultados

-

La frecuencia del alelo p.Arg1129Leu en la población general es 2/400 = 0´005, por tanto:

Frecuencia alelo R1129L Frecuencia absoluta mutante

=

12´2

⇒

q =

0´005 x 100

100

= 0´041

12´2

q

- Para calcular las frecuencias genotípicas a partir de las frecuencias alélicas, se utilizó la fórmula del equilibrio de Hardy-Weinberg: Equilibrio de Hardy-Weinberg⇒ p2 + 2pq + q2 = 1

Homozigotos sanos= p2 = 0´9197 Heterozigotos sanos = 2pq = 0´0786 Homozigotos mutantes= q2 = 0´0017

A partir de la ecuación anterior, se obtiene que la frecuencia (estimada) de portadores de alelos mutantes en ABCA4 en nuestra población sea del 7´87% y la prevalencia (estimada) de la enfermedad de 1:588.

129

Representación de la retina realizada por Ramón y Cajal (1852-1934).

    V‐ Discusión 

130

V- Discusión

V‐ DISCUSIÓN    1‐ DISCUSIÓN GENERAL  “Durante el año 1896 […] ataqué con nuevos bríos la retina, el más antiguo y pertinaz de mis amores de Laboratorio…”, eran las palabras de Santiago Ramón y Cajal recogidas en su obra Historia de mi labor científica. Sus descripciones anatómicas y fisiológicas de los diversos tipos celulares revolucionaron las investigaciones neurológicas de la época, más aún, cuando los medios ópticos de los que disponía para observar las retinas de los diferentes vertebrados eran, cuando menos, rudimentarios. Hoy en día, la estructura de la retina se conoce en profundidad y su análisis ha permitido determinar que la mayoría de las conexiones neuronales establecidas por Cajal eran correctas.

El avance de la Ciencia ha permitido que la Biología Molecular llegue a “ver” incluso dentro de los fotorreceptores. De hecho, se han identificado un total de ciento sesenta y seis loci (localizaciones genéticas), de los cuales se han clonado un total de ciento dieciséis (www.sph.uth.tmc.edu/Retnet). Las proteínas codificadas por estos genes intervienen en el desarrollo celular de la retina, en la integridad estructural, en el transporte de metabolitos, en la cascada de fototransducción, en el control y el mantenimiento de la cascada, etc., y consiguen que esta estructura, elegantemente organizada, confiera uno de los sentidos más importantes: la visión. El conocimiento de la secuencia de estos genes, de las mutaciones que se producen y de la repercusión fenotípica que puedan tener en el paciente resulta imprescindible para comprender las interacciones que se generan entre las diferentes proteínas existentes en las células retinianas.

Como se ha observado a lo largo de este trabajo, es necesario un enfoque multidisciplinar, en el que la correcta clasificación clínica de la patología y el abordaje molecular preciso resultan esenciales. El resultado de esta investigación conjunta permite, por un lado, conocer la prevalencia y la distribución geográfica de las distrofias de retina estudiadas y, por otro lado, facilitar al paciente un asesoramiento genético adecuado. En un futuro cada vez más próximo, el conocimiento de la causa genética de la enfermedad permitirá aplicar al paciente el tratamiento adecuado, sustituyendo el gen dañado (terapia génica).

La caracterización genotípica y fenotípica resultan esenciales para el diagnóstico de estas enfermedades, no obstante, es necesaria una aproximación funcional que permita determinar cuál es el papel de cada una de las proteínas codificadas por estos genes, así como las interacciones que puedan existir entre ellas y la interacción que existe entre los genes y el ambiente. Conocer los productos proteicos permitirá identificar posibles dianas terapéuticas con herramientas genómicas, que harán más efectivos dichos tratamientos.

131

V- Discusión

Identificación del gen responsable

Informe y consejo genético Tratamiento: terapia génica

Estudio genético No identificación del gen responsable

Conocidos Búsqueda de otros genes Desconocidos

Búsqueda genómica Paciente

Estudio genómico

Identificación de nuevos genes Identificación de SNPs

Determinación de la función de la proteína Estudio funcional

prognosis del paciente Tratamiento

Identificación de dianas terapéuticas Figura V.1- Esquema de los diferentes estudios moleculares aplicables a las distrofias de retina hereditarias.

2‐ EPIDEMIOLOGÍA DE LAS DISTROFIAS DE RETINA ESTUDIADAS El estudio epidemiológico sobre distrofias de retina realizado en pacientes españoles ha permitido conocer la prevalencia de estas enfermedades en España. Hasta el momento, se han estudiado un total de tres mil novecientos treinta y seis casos (3936) correspondientes dos mil ciento sesenta y seis familias no emparentadas (2166) (Ayuso C et al., Memoria Red EsRetNet 2005; comunicación personal). En el siguiente gráfico se muestran las frecuencias de los fenotipos observados: la ND y la XLRS presentan una frecuencia muy baja (0´5% y 1´2%, respectivamente). La STGD es algo más frecuente (3´8%), siendo la RPAR uno de los fenotipos más prevalentes en población española. Sin embargo, mientras que la mayoría de los casos de STGD están asociados a mutaciones en ABCA4, únicamente una pequeña fracción de casos con RPAR (0´43%) y algo más con DCB (0´71%) están causados por mutaciones en este gen, existiendo una gran heterogeneidad genética.

132

 

V- Discusión

DR⇒10% 0´ 5% 16%

1´ 2% 3´ 8% 0´ 71%

Otras DR ND XLRS STGD DCB RPAR

37%

37% 0´ 43%

RPAR-ABCA4 Otras RP (RPAD, XLRP) Otros

RP⇒74%

Figura V.2- Porcentajes de las distrofias de retina presentadas en este trabajo con respecto al total de casos españoles estudiados hasta el momento (3936 casos; Ayuso C et al., Memoria final EsRetNet 2005).

  3‐ GEN NDP 

3.1- ESTUDIO GENÉTICO DIRECTO En las familias presentadas en este trabajo, se identificaron seis mutaciones diferentes en el gen NDP asociadas a dos fenotipos diferentes, Enfermedad de Norrie (ND) y vitreorretinopatía exudativa familiar (VREF). La Enfermedad de Norrie es una displasia retiniana congénita que, en la mayoría de los casos, produce ceguera desde el nacimiento. La vitreorretinopatía exudativa familiar ligada al cromosoma X es un defecto del desarrollo caracterizado por vascularización incompleta de la retina periférica. Las formas de VREF ligadas al cromosoma X se asocian a mutaciones en el gen NDP, aunque también se han descrito formas autosómicas recesivas y autosómicas dominantes (Clevers H, 2004). De hecho, en el cromosoma 11q13-23 se han identificado dos loci implicados en FEVR autosómica dominante, que corresponden a los genes Fzd4 (frizzled-4 gene) y LRP5 (Robitaille J et al., 2002; Toomes C et al., 2004). Recientemente se ha observado que las proteínas Norrina y FZD4 funcionan como un par ligando-receptor: la Norrina se une con elevada especificidad al receptor FZD4, aunque requiere la presencia del co-receptor LRP5, para provocar la activación de la vía Wnt. Este sistema de señalización desempeña un papel esencial en el desarrollo vascular del ojo, del oído interno y del cerebelo (Xu Q et al., 2004).

Mediante el estudio molecular realizado en el gen NDP se identificaron dos nuevas mutaciones que producen un codon de parada prematuro: p.Val89fsX101 que se produce “de novo” y p.Tyr120X (ver pág. 77). La consecuencia de estas alteraciones es una proteína truncada, que se asocia con un fenotipo más severo de la enfermedad, en el que, además de problemas visuales, se presentan sordera neurosensorial y

133

V- Discusión

retraso mental de diferentes grados. De hecho, este tipo de mutaciones siempre se asocian a un fenotipo ND (Wong F et al., 1993; Chynn E et al., 1996). Sin embargo, existen diversos ejemplos de alteraciones que generan un cambio de aminoácido en la proteína y que también producen ND (www.hgmd.org).

En una de nuestras familias (ND-12) se identificó una mutación que afecta al sitio donador del procesamiento (mecanismo de corte y empalme de los intrones) del intrón 1 del gen NDP: IVS1+1G>A. Este cambio se había descrito con anterioridad (Fuchs S et al., 1996), asociado a ND. Asimismo, nuestro paciente presenta pérdida severa de visión y retraso mental.

Las mutaciones identificadas que provocan un cambio de aminoácido, únicamente causan pérdida de visión en nuestros pacientes y se asocian con una forma menos severa de la enfermedad. Existen algunos ejemplos de VREF ligada al cromosoma X debido a mutaciones en el gen NDP y, en todos los casos, se deben a cambios que no generan una proteína truncada (Chen ZY et al., 1993; Fuchs S et al., 1996; Johnson K et al., 1996; Torrente I et al., 1997; Shastry BS et al., 1997).

La mutación p.Arg121Gln identificada en la familia XLDM-46 se había descrito previamente, incluso en otra familia española (Fuentes JJ et al., 1993). Ambas comparten haplotipos, lo que sugiere que nuestros pacientes probablemente pertenezcan a otra rama de esta familia. El cambio p.Lys104Asn, identificado en una familia gallega (ND-14), únicamente se ha descrito en este trabajo y está asociado a VERF. La alteración p.Arg38Cys, detectada en dos de nuestras familias (ND-2, ND-5), se había reportado previamente (Royer et al., 2003).

3.2- ESTUDIO GENÉTICO INDIRECTO En las dos familias portadoras de la mutación p.Arg38Cys, el análisis de los marcadores microsatélites flanqueantes al gen NDP permitió identificar que compartían el mismo haplotipo, por lo que se puede sospechar identidad por descendencia. En la figura IV.3 (ver pág. 80), se observa que el individuo IV.1 perteneciente a la familia ND-2 difiere en el marcador DXS8090 (164) con respecto a los restantes varones afectos y las mujeres portadoras de ambas familias (162). Observando el haplotipo de su madre para ese marcador (III:2; 162 pb), se aprecia que se producido una repetición más del dinucleótido CA (164 pb), mostrando la inestabilidad de estas regiones genómicas (Jones MH & Nakamura Y, 1992).

Este cambio (p.Arg38Cys), descrito por primera vez por Royer G et al., se identificó en un varón afecto de una familia francesa, pero no se encontró en el análisis realizado en población control en un total de setenta y cinco cromosomas. La detección de esta mutación en una familia francesa y en nuestras dos familias españolas sugiere la posibilidad de un efecto fundador en población del sur de Europa.

134

V- Discusión

3.3- CORRELACIÓN GENOTIPO-FENOTIPO Las mutaciones identificadas en nuestros pacientes, a excepción del cambio IVS1+1G>A localizado en el intrón 1, se producen en el dominio “cysteine-knot”, localizado entre los aminoácidos 32 y 133. Se considera que esta región de la proteína desempeña un papel fundamental en las interacciones neurológicas.

Cambio de aminoácido Codon de parada prematuro

Exones 1 y 2 no traducidos

Dominio “cysteine-knot”

Altera la pauta de lectura

Figura V.3- Representación esquemática de la estructura del gen NDP y de las mutaciones identificadas en nuestros pacientes.

La mayor parte de las alteraciones descritas en el gen NDP se producen en este dominio, como las mutaciones en el codon 121 [p.Arg121Trp (777C>T)] y [p.Arg121Gly (777C>G)], asociadas a VREF y ND, respectivamente (Fuchs S et al., 1996; Zhu D & Maumanee H, 1994). Se han reportado diversas mutaciones en este aminoácido, por lo que se puede asumir que debe desarrollar una función importante en esta estructura de la proteína. La severidad de los fenotipos asociados a mutaciones en el codon 121 puede depender del tipo de alteración que se produzca.

Asimismo, se produce expresividad variable entre los pacientes de las familias en las que se identificó el cambio p.Arg38Cys. En la familia ND-2, uno de los varones afectos presenta persistencia de vítreo primitivo hiperplásico y se quedó ciego a los cinco años, mientras que su hermano padece vitreorretinopatía exudativa y conserva buena visión en su ojo derecho. Este es un ejemplo de que una mutación puede producir dos fenotipos diferentes, incluso dentro de la misma familia. La variabilidad intrafamiliar se ha descrito en diversas enfermedades hereditarias, incluyendo retinopatías (Weleber RG et al., 1993; Kondo H et al., 2003; Dharmaraj N et al., 2003). De hecho, esta mutación produce un fenotipo ND en la familia francesa en la que se describió esta alteración por primera vez (Royer et al., 2003). Sin embargo, este cambio se identificó en un varón asintomático de la familia ND-5. En este paciente, se podría sospechar una situación de penetrancia incompleta, no descrita con anterioridad en la literatura.

La variabilidad de expresión en varones afectos, en relación con las funciones cognitiva y auditiva, así como en la edad de comienzo de los síntomas, sugieren que genes modificadores u otros factores relacionados deben desempeñar un papel esencial, no bien definido todavía, en la modulación del fenotipo de la enfermedad (Fuentes JJ et al., 1993).

135

V- Discusión

Una vez que se conoce que el binomio Norrina-Fzd4 interviene en la vía Wnt del desarrollo, podemos sospechar que existen mutaciones más agresivas (como las que producen un codon de parada prematuro) que alteran considerablemente la estructura de la proteína, especialmente si se producen en el dominio “cysteine-knot”. En consecuencia, la unión ligando-receptor desaparece y la vía Wnt se interrumpe, produciendo un defecto más severo en la vascularización retiniana.

4‐ GEN RS1 

4.1- ESTUDIO GENÉTICO DIRECTO El estudio molecular del gen RS1, realizado en veintinueve familias, permitió identificar el defecto genético responsable de enfermedad en veinte de ellas. Se detectaron un total de trece mutaciones diferentes, cuatro de las cuales no se habían reportado previamente (p.Gln80X, p.Leu137Pro, p.Gln154Arg y p.Glu215Val). La caracterización molecular de RS1 permitió determinar que las alteraciones no se producen al azar, si no que se localizan en los exones 4, 5 y 6 del gen que codifican el dominio discoidín de la proteína.

Cambio de aminoácido Codon de parada prematuro Altera la pauta de lectura

Péptido señal

Dominio discoidín

Dinucleótidos CG

Figura V.4- Representación esquemática de la estructura del gen RS1 y de las mutaciones identificadas en nuestros pacientes.

Entre los trece cambios identificados, se ha observado que ocho de ellos (8/13; 61´5%) se producen en dinucleótidos CG, que son secuencias consideradas como puntos calientes de mutación en el genoma (Lutsenko E & Bhagwat AS, 1999). En RS1 existen veintiséis dinucleótidos CG, que representan aproximadamente un 7´7% de la secuencia codificante del gen. Se analizaron todas las alteraciones puntuales identificadas hasta ahora en RS1 (www.hgmd.org) y se observó que el 18´5% de ellas se producen en estos dinucleótidos.

136

V- Discusión

El cambio p.Gln80X (XLRS-108), ocurre en un dinucleótido CG y se produce “de novo”, generando una proteína truncada que carece de dominio discoidín. Asimismo, la mutación p.Glu72Lys se produce “de novo” en la familia XLRS-43. De hecho, esta alteración se ha descrito en repetidas ocasiones en poblaciones diferentes. Otro punto caliente de la secuencia codificante se sitúa en un tracto de seis citosinas (posiciones nucleotídicas 574_579), en el que se produce la inserción de una citosina que desplaza la pauta de lectura y genera una proteína anómala de sesenta y nueve aminoácidos más larga de lo normal (p.His194fsX263). Esta inserción se ha descrito previamente en tres familias no relacionadas de Austria, Reino Unido y Estados Unidos (The Retinoschisis Consortium, 1998).

Las mutaciones identificadas en nuestras familias, así como las alteraciones descritas en pacientes procedentes de otras poblaciones, indican que existe una tasa considerable de mutaciones “de novo” en el gen RS1, debida en parte a la elevada prevalencia de dinucleótidos CG en su secuencia. Esta situación pone de manifiesto que se producen múltiples orígenes de la XLRS.

La sustitución más frecuente en nuestros pacientes con Retinosquisis, p.Gln154Arg, se identificó en cinco familias no relacionadas entre sí (ver pág. 87). Esta mutación se describe por primera vez en este trabajo y, a diferencia de los cambios anteriores, no se produce en un dinucleótido CG.

4.2- ESTUDIO GENÉTICO INDIRECTO El análisis de los marcadores microsatélites realizado en las familias portadoras de la mutación p.Gln154Arg permitió identificar que comparten un haplotipo común, por lo que se puede sospechar identidad por descendencia. Teniendo en cuenta que únicamente se ha descrito otro cambio en este codon (p.Gln154X; The Retinoschisis Consortium, 1998) y que esta alteración no se produce en un dinucleótido CG, se puede sospechar que esta mutación se ha transmitido a partir de un ancestro común.

El cambio p.Glu72Lys se identificó en tres familias españolas y en una familia portuguesa. Esta mutación tiene un efecto fundador en población finlandesa, en la que uno de cada tres pacientes con XLRS presenta esta alteración (Huopaniemi L et al., 1999). Sin embargo, en nuestras familias se trata de una mutación recurrente, quizá porque se produce en un dinucleótido CG, pero no fundadora, ya que los pacientes presentan haplotipos diferentes entre sí. De hecho, en la familia XLRS-43 esta mutación se produce “de novo” en una mujer portadora que tiene dos gemelos afectos (ver pág. 88).

137

V- Discusión

4.3- CORRELACIÓN GENOTIPO-FENOTIPO Independientemente de la heterogeneidad de las mutaciones, los pacientes presentan manifestaciones clínicas similares, con cierta variabilidad intrafamiliar en la edad de comienzo y en la progresión. Como caso particular, en la familia XLRS-29 se identificó una mujer con síntomas clínicos (ver pág. 90). Aunque se trata de situaciones excepcionales, en la literatura se han descrito casos de mujeres con Retinosquisis producida por consanguinidad (Forsius H et al., 1973; Francois P et al., 1989; MendozaLondono R et al., 1999). En el estudio molecular de RS1 realizado por Mendoza-Londono R et al., se describe una mutación en homozigosis en las mujeres afectas como causa de la enfermedad. En nuestra familia, los padres de la paciente no están emparentados entre sí, por lo que su fenotipo se podría explicar por una inactivación sesgada del cromosoma X o por una alteración en otro gen responsable.

El estudio molecular del gen RS1 permite establecer que el espectro de mutaciones es amplio y las manifestaciones oftalmológicas son variables. Se ha observado la agudeza visual de los pacientes disminuye con la edad y que la maculopatía empeora a partir de los treinta años, pero no existe correlación entre el tipo de mutación y la severidad de la enfermedad. De hecho, se aprecia variación en las manifestaciones clínicas entre varones afectos de la misma familia. Estudios recientes con modelos estructurales del dominio discodín, permitieron determinar que las mutaciones en RS1 pueden inhibir la secreción de la proteína, alterar su oligomerización o interferir en su función (Wang T et al., 2006). Los autores concluyeron que se produce retención intracelular de la mayoría de las proteínas mutantes, lo que explicaría porqué la severidad de la enfermedad no es específica de la mutación responsable, es decir, no existe correlación entre el genotipo y el fenotipo.

Por tanto, la identificación de la mutación responsable en varones con XLRS confirma el diagnóstico clínico y facilita un asesoramiento genético adecuado para los familiares, pero no permite predecir la evolución (prognosis) del paciente.       5‐ GEN ABCA4 

5.1- IMPLICACIÓN EN LA ENFERMEDAD DE STARGARDT

5.1.1- ESTUDIO GENÉTICO DIRECTO

Las diversas mutaciones en el gen ABCA4 se han asociado con diferentes distrofias de retina, aunque en la etiología de la STGD es donde desarrollan un papel decisivo. ABCA4 consta de cincuenta exones, con una pauta abierta de lectura de 6.819 pares de bases, por lo que la detección de mutaciones en este gen supone un reto. Para el cribado mutacional previo de nuestros pacientes, se utilizó el microarray de genotipado ABCR400 diseñado por Asperbio (Jaakson K et al., 2003) y las mutaciones detectadas se confirmaron mediante secuenciación automática.

138

V- Discusión

Para evaluar la eficiencia del microarray, se estudiaron un total de setenta y cuatro familias diagnosticadas de STGD. En nuestra muestra, se identificaron ochenta y un alelos potencialmente asociados a enfermedad, lo que supone una tasa de detección de 54´7% (ver pág. 97). Se identificaron ambos alelos mutantes en el 39´2% (29/74) de los pacientes, un alelo mutante en el 31´1% (23/74) y no se identificaron mutaciones en 29´7% (22/74) restante de los casos.

Estos porcentajes son simililares a los identificados por Jaakson K et al., ya que en sus series de pacientes el microarray detecta entre el 54-56% de los alelos asociados a enfermedad, en pacientes con Stargardt elegidos al azar y que no han sido analizados previamente, dependiendo de la composición étnica de la muestra y del grado de caracterización clínica y molecular de la misma. En su estudio incluyen pacientes europeos procedentes de Italia (Nápoles), Países Bajos (Nijmegen) y Eslovenia (Ljubljana) y pacientes norteamericanos reclutados en dos centros (Harkness Eye Institute, Universidad de Columbia, Nueva York; National Eye Institute, NIH, Bethesda, MD). La distribución de los alelos mutantes en estas poblaciones, así como en población española, se muestra en la siguiente tabla:

Pacientes STGD

Cromosomas analizados

Alelos asociados a enfermedad (%)

Alelos complejos

Alelos más frecuentes

Distribución de los alelos

Valores medios

2- 38´3% 1- 36´7% 2- 41´6% 0- 25´0% 1- 33´4% 2-45´0% 0- 25´0% IVS38-10T>C 14´3% NEI/NIH 40 24 (60%) 5 1- 30´0% p.Gly1961Glu 7´1% 0- 25´0% 2- 32´2% p.Gly1961Glu 12´9% Italia (Nápoles) 62 34 (54´8%) 0 1- 45´2% IVS35+2T>C 9´7% 0- 22´6% 2- 33´3% p.Gly1961Glu 11% 2- 38´9% Países Bajos 1- 42´8% 36 20 (55´6%) 4 p.Gly863Ala 8´3% 1- 33´3% (Nijmegen) 0- 23´9% p.Val256Val 8´3% 0- 27´8% p.Gly1961Glu 21´4% 2- 28´6% Eslovenia 28 15 (53´6%) 0 p.Arg681X 7´1% 1- 50´0% (Ljubljana) p.Gln1412X 7´1% 0- 21´4% p.Arg1129Leu 22´4% 2- 39´2% 2- 39´2% España 148 81 (54´7%) 6 p.Gly1961Glu 8´4% 1- 31´1% 1- 31´1% c.2888delG 7´4% 0- 29´7% 0- 29´7% Tabla V.1: Eficiencia de detección de mutaciones del microarray ABCR400 en población europea y norteamericana

Univ. Columbia Nueva York

120

68 (56´7%)

10

p.Gly1961Glu 10% p.Gly863Ala 4´2% IVS38-10T>C 4´2%

(Jaakson K et al., 2003) y en población española.

Según estos datos, se detectaron ambos alelos mutantes en un porcentaje más elevado de pacientes españoles que en la media de pacientes europeos reportados por Jaakson K et al. Sin embargo, el porcentaje de pacientes en los que no se han identificado alelos mutantes también fue más elevado (29´7% en España frente al 23´9% europeo y el 25´0% norteamericano), indicando la inclusión de fenocopias que no se pueden evitar por completo debido a los medios de selección, ya que los pacientes son remitidos por diversos oftalmólogos entre los cuales no se establece un protocolo común de diagnóstico para STGD. Se ha observado que en aquellos pacientes que se han caracterizado clínicamente en detalle, se identifican ambos alelos mutantes.

139

V- Discusión

Además de la eficiencia obtenida, el microarray es altamente sensible y específico, ya que en un total de doscientos cincuenta y ocho alelos analizados (=129 pacientes ABCA4) únicamente se identificaron un

falso

positivo

(no

específico)

y

un

falso

negativo

(no

sensible),

que

determinan

una

especificidad/sensibilidad del 99´6% (ver pág. 97).

La secuenciación automática del gen ABCA4 realizada en nueve pacientes STGD en los que se había detectado previamente un alelo mutante, permitió identificación del segundo alelo asociado a enfermedad en seis de ellos (6/9), que supone una tasa de detección total (microarray+secuenciación) de 58´8% (ver pág. 99). En consecuencia, la distribución de los alelos es la siguiente:

Pacientes STGD

Cromosomas analizados

Alelos asociados a enfermedad (%)

Distribución de los alelos ABCR400

Distribución de los alelos ABCR400 + secuenciación

2- 39´2% 2- 47´3% 1- 31´1% 1- 23´0% 0- 29´7% 0- 29´7% Tabla V.2: Eficiencia de detección de mutaciones mediante el microarray ABCR400 y mediante la combinación de España

148

81 (54´7%)

métodos ABCR400+secuenciación automática, en población española.

El análisis realizado con MLPA en los tres pacientes STGD restantes, no detectó ninguna alteración que implicase deleción o duplicación de material genético que pudiese representar el segundo alelo responsable de enfermedad. Por tanto, únicamente la secuenciación automática de todas las posiciones nucleotídicas del gen ABCA4 permite una mayor tasa de detección de mutaciones frente al microarray de genotipado.

Además de la diferencia en la tasa de detección de mutaciones entre las poblaciones estudiadas, las frecuencias de los alelos mutantes también son distintas. La mutación más frecuente en población europea es el cambio p.Gly1961Glu. En los pacientes españoles aparece con una frecuencia del 8´41%, que la sitúa en el rango observado en otras poblaciones europeas, a excepción de Eslovenia, en la que este cambio aparece con mayor frecuencia (21´4%). Fumagalli A et al. analizaron los polimorfismos del exón 42 de ABCA4 y definieron un haplotipo común, en el que p.Gly1961Glu se asocia con tres polimorfismos de único nucleótido (c.5836-43A>C, c.5836-11A>G y c.5844A>G), sugiriendo un origen común a partir de un mismo cromosoma ancestral. En nuestros pacientes STGD, el alelo p.Gly1961Glu E siempre aparece asociado al haplotipo c.5682G>C, c.5814A>G, c.5843CA>TG y c.5844A>G, que así mismo puede sugerir la hipótesis de un origen ancestral común.

140

V- Discusión

Sin embargo, el alelo mutante más frecuente en nuestra muestra de pacientes STGD es el cambio p.Arg1129Leu, que representa el 22´4% de los alelos asociados a enfermedad. La prevalencia de esta mutación en pacientes norteamericanos es del 1% (Webster AR et al., 2001). Este alelo siempre aparece asociado a un polimorfismo localizado en el intrón 33 del gen (IVS33+48C>T), por lo que se puede sospechar un origen común en población española. En un 35´7% de las familias, esta mutación también aparece asociada al polimorfismo p.His423Arg (c.1268A>G), aunque en un 57´1% no se ha podido establecer la fase. Considerando que p.Arg1129Leu y IVS33+48C>T aparecen en desequilibrio de ligamiento y pueden indicar un posible origen común, el cambio p.His423Arg ha debido producirse posteriormente como un evento mutacional recurrente, ya que en las familias en las que la que la mutación p.Arg1129Leu se produce en homozigosis, el polimorfismo IVS33+48C>T también aparece en homozigosis, pero el cambio p.His423Arg se identifica en heterozigosis. El hecho de que en la familia ARDM-78 el cambio p.His423Arg no aparece, pero si el alelo complejo p.Arg1129Leu + IVS33+48C>T, refuerza esta hipótesis (ver pág. 120).

Alelo mutante

p.Gly1961Glu

p.Gly863Ala

p.Arg1129Leu

Población STGD

Frecuencia alélica

Referencia

Eslovenia

21´4%

Jaakson K et al., 2003

Italia

12´9%

Jaakson K et al., 2003

Italia

10%

Fumagalli A et al., 2001

Alemania

12%

Rivera A et al., 2000

Países Bajos

11%

Jaakson K et al., 2003

España

8´4%

Este trabajo

Países Bajos / Alemania

15%

Maugeri A et al., 1999

Reino Unido

3´6%

Papaioannou M et al., 2000

Francia

2´8%

Maugeri A et al., 2002

España

1´87%*

Este trabajo

España

3%

Paloma E et al., 2001

Italia

0%

Simonelli F et al., 2000

España

22´4%

Este trabajo

Tabla V.3: Frecuencia alélicas de las mutaciones más prevalentes en ABCA4 en pacientes STGD europeos. *: Este cambio forma dos alelos dobles mutantes, [p.Gly863Ala +p.Arg1055Trp] y [p.Gly863Ala + p.Arg 943GlnQ]; cada uno de ellos aparece con una frecuencia del 0´93%.

En el gen ABCA4 se producen dos o más alteraciones en cis, denominadas “alelos complejos”, reportadas por primera vez por Shroyer NF et al., 2000. En nuestros pacientes, se identificaron seis alelos complejos, cinco dobles mutantes y uno triple mutante (ver pág. 109). Cabe destacar que las mutaciones p.Arg1108Cys y p.Arg2107His únicamente aparecen combinadas como un alelo doble mutante en dos familias (ver pág. 95). En otras cuatro familias, estas alteraciones se asocian a un tercer cambio (R152Q) y en una de ellas este alelo triple mutante se produce en homozigosis (ver pág. 95).

141

V- Discusión

El alelo [p.Arg152Gln+p.Arg1108Cys+p.Arg2107His] puede haber evolucionado a partir del alelo [p.Arg1108Cys+p.Arg2107His], por evento mutacional recurrente. De hecho, son los dos alelos complejos más prevalentes entre nuestros pacientes. El análisis de los marcadores microsatélites muestra que los pacientes comparten un haplotipo similar, incluso el paciente de la familia ARDM-110 (doble mutante) tiene un haplotipo idéntico al que muestran las familias ARDM-14 (alelo materno), ARDM-17 y ARDM-137 (triples mutantes). Este hecho sugiere que la mutación p.Arg152Gln se ha producido recientemente, ya que los cambios/polimorfismos de único nucleótido tienen una tasa de mutación mucho menor que los microsatélites, que son más inestables (Morral N et al., 1994).

La mayoría de las mutaciones que se producen en el gen ABCA4 son puntuales, cambia un nucleótido determinado que origina diversos tipos de cambios a nivel de la proteína. El cambio más frecuente son las mutaciones que provocan cambio de aminoácido, seguidas de los cambios que alteran la pauta de lectura. Esto puede ser debido a que al copiar un gen de tamaño considerable como ABCA4, se produzca deslizamiento (en inglés, slippage) de la polimerasa y se introduzcan nucleótidos de más o de menos. Las alteraciones menos frecuentes son las que provocan un codon de parada prematuro y las que alteran el procesamiento de los intrones, que no dejan de ser mutaciones puntuales que generan un codon específico (de parada) o que ocurren en un lugar concreto (sitios aceptores/donadores de procesamiento), respectivamente. Sólo dos mutaciones se producen “de novo” (ARDM-40, ARDM-81), a excepción de la isodisomía parcial de la familia ARDM-61, que sugiere un elevado número de portadores sanos en nuestra población.

5.1.2- ESTUDIO GENÉTICO INDIRECTO

El estudio familiar realizado en cuarenta y nueve familias STGD en las que se identificó al menos un alelo mutante, permitió determinar que los haplotipos siempre cosegregan con la enfermedad (ver pág. 113). En aquellas familias en las que se pudo excluir ABCA4 como gen responsable, no se identificaron pacientes que fuesen portadores de mutaciones por azar. Este hecho sugiere que en aquellas familias con un alelo mutante identificado y que cosegregan, debe existir un segundo alelo mutante. Por tanto, sería recomendable utilizar un segundo método de cribado que permita detectar nuevas mutaciones, como el dHPLC, de mayor sensibilidad que métodos anteriores como SSCP y DGGE (Stenirri S et al., 2004).

El análisis de los marcadores microsatélites llevado a cabo en las familias con el alelo p.Arg1129Leu puede sugerir que esta mutación tenga un origen común. Los microsatélites o repeticiones cortas en tándem (STR, Short Tandem Repeats) resultan útiles para observar los cromosomas que portan la mutación p.Arg1129Leu, ya que la variabilidad de los alelos en estos loci se produce principalmente por adiciones o deleciones de repeticiones de nucleótidos, debido al deslizamiento de la polimerasa (Weber JL, 1990).

142

V- Discusión

En las familias p.Arg1129Leu, se observó que un 50% tienen el haplotipo [182-146- p.Arg1129Leu 206] (ver pág. 121). Por lo general, en los análisis de parsimonia (no realizados en este trabajo), se considera que el alelo más antiguo en: 1) el más frecuente, 2) el que da lugar a un mayor número de alelos diferentes, 3) el que tiene un mayor número haplotipos asociados. Asumiendo estas premisas, lo esperable es que a partir del haplotipo [182-146- p.Arg1129Leu -206], se haya generado el haplotipo [182-146P.Arg1129Leu-188] y, finalmente, el haplotipo [172-146-P.Arg1129Leu-188], como se muestra en la figura anterior. El deslizamiento (en inglés, slippage) en un alelo de uno de los tres loci (microsatélites) es el mecanismo que genera más haplotipos diferentes (Morral N et al., 1994).

182 146 c.3386G>T 206

182 146 c.3386G>T 206 182 182 182 146 146 146 c.3386G>T c.3386G>T c.3386G>T 206 206 206 182 146 182 c.3386G>T 146 206 c.3386G>T 206

182 146 c.3386G>T 188

172 146 c.3386G>T 188

182 146 c.3386G>T 188

172 146 c.3386G>T 188

Figura V.5: Posible evolución de los haplotipos asociados al alelo mutante p.Arg1129Leu (c.3386G>T).

El número de cromosomas presentados en este trabajo es muy limitado, por lo que no se puede realizar un estudio sobre el origen, evolución y dispersión de la mutación p.Arg1129Leu. Sin embargo, su elevada prevalencia entre los alelos asociados a STGD en población española y la similitud de los haplotipos puede sugerir un origen común.

143

V- Discusión

5.2- IMPLICACIÓN EN LA DISTROFIA DE CONOS Y BASTONES AUTOSÓMICA RECESIVA 5.2.1- ESTUDIO GENÉTICO DIRECTO

En nuestra muestra de pacientes DCB, se han identificado ambos alelos mutantes en ABCA4 en seis pacientes (6/28; 21´4%), un alelo mutante en cuatro pacientes (4/28; 14´3%) y no se identificaron mutaciones en los restantes dieciocho pacientes (18/28; 64´3%). Por tanto, se ha detectado al menos un alelo mutante en diez de las veintiocho familias, que representa un 35´7% de los casos. Este porcentaje de detección es superior que el 33% descrito por Klevering BJ et al., 2004. Sin embargo, las diferencias entre ambas poblaciones no fueron significativas (test Chi-cuadrado, α=0´05). De las seis familias en las se identificaron ambos alelos mutantes, en cuatro de ellas las mutaciones se producen en homozigosis (ARDM-79, ARDM-86, ARDM-126 y RP-267), dos de ellas son consanguíneas (ARDM-86, ARDM-126).

El alelo asociado a enfermedad más prevalente fue el cambio c.2888delG (6/16), representando el 37´5% de todos los alelos mutantes identificados. Este cambio es el tercer alelo patológico más frecuente de la muestra de pacientes estudiados (ver pág. 110).

En este trabajo, el estudio clínico evolutivo en la familia ARDM-79 permitió modificar el diagnóstico de la probandus de STGD a DCB. El hecho de que en nuestros pacientes la mutación c.2888delG está asociada a un DCB, tanto en homozigosis como en heterozigosis, sugiere que este cambio debe ser considerado un alelo severo asociado a enfermedad. El alelo c.2888delG aparece en heterozigosis, constituyendo un alelo doble mutante en las familias ARDM-133 y ARDM-176, que portan las mutaciones [c.2888delG +p.Leu11Pro] y [c.2888delG + p.Leu2060Arg], respectivamente. Esto es importante ya que los pacientes que portan este cambio pueden diagnosticarse como STGD en etapas tempranas de la enfermedad y posteriormente evolucionar a un fenotipo DCB. De hecho, debe tenerse en cuenta especialmente en las familias ARDM-15 y ARDM-22 (que porta el mismo genotipo que la familia ARDM176), actualmente clasificadas como STGD (ver pág. 95). La edad de comienzo de la enfermedad en estos pacientes se produce entre los ocho-doce años y padecen ceguera nocturna en torno a los dieciocho años (ver págs. 124-125).

En las restantes familias DCB, únicamente se detectó un alelo patológico que en todos los casos produce un cambio de aminoácido en la proteína (ver pág. 102). En la familia ARDM-99, en la que previamente se había identificado un alelo mutante, no se identificó el segundo alelo responsable de enfermedad tras las secuenciación de la región exónica completa y análisis con MLPA. Estos resultados sugieren que el paciente sea portador de mutación en ABCA4 por azar, ya que no se pudo realizar el estudio familiar, o que puedan existir mutaciones en zonas no codificantes del gen que no han sido analizadas, como el promotor o los intrones.

144

V- Discusión

5.2.2- ESTUDIO GENÉTICO INDIRECTO

El análisis de haplotipos realizado en aquellas familias en las que se identificó al menos uno de los alelos mutantes mostró cosegregación con la enfermedad. En dos familias este estudio permitió excluir el gen ABCA4 (ver pág. 115), sugiriendo la existencia de otro gen responsable. En estas familias excluidas no se identificaron alelos mutantes, lo que descarta que alteraciones en este gen puedan ejercer algún efecto modulador o regulador sobre el fenotipo del paciente.

5.3- IMPLICACIÓN EN LA RETINOSIS PIGMENTARIA AUTOSÓMICA RECESIVA

5.3.1- ESTUDIO GENÉTICO DIRECTO En las diecisiete familias RPAR estudiadas, se identificaron cuatro con un alelo mutante, de las cuales una fue excluida como ligada a ABCA4 por el análisis familiar (3/17; 17´6%). Este porcentaje de detección es más elevado que el 5% descrito por Klevering BJ et al., 2004 y que el 16% descrito por Wiszniewski W et al., 2005. Sin embargo, las diferencias entre nuestra serie de pacientes y las series reportadas por ambos autores son fueron significativas (test Chi-cuadrado, α=0´05).

En la literatura, se describe que los pacientes con ambos alelos mutantes identificados en ABCA4 presentan pérdida severa de la función visual, atrofia extensa y respuestas abolidas en el ERG. No obstante, al no haberse identificado los dos alelos mutantes en ABCA4 en la mayoría de las familias estudiadas, no es posible establecer en nuestra serie un fenotipo RPAR asociado específicamente a este gen, ni conocer cuáles son las mutaciones causantes de dicho fenotipo.

5.3.2- ESTUDIO GENÉTICO INDIRECTO En una de las cuatro familias con un alelo mutante en ABCA4, el análisis de haplotipos permitió descartar su implicación en la patología, sugiriendo que en este paciente la causa primaria de la enfermedad no es la mutación identificada en este gen (ARRP-700, ver pág. 116).

En RPAR la heterogeneidad genética es enorme. En 4/17 familias, la causa genética aparentemente es detectada en ABCA4, pudiendo tener mutación(es) en cualquiera de los genes candidatos conocidos u otros. Incluso en los casos con aparente cosegregación (3/17), pueden existir otras causas genéticas. Recientemente, se ha localizado un locus en 1p13.3-p21.2 situado a 4´9 cM (7´1 Mb) de ABCA4, en una familia pakistaní (Zhang Q et al., 2005). La identificación y el estudio de este gen podrían ayudar a dilucidar la diversidad fenotípica de la RPAR localizada en esta región, ya que quizá las alteraciones en este nuevo gen podrían ser responsables de este fenotipo más agresivo en nuestros pacientes.

145

V- Discusión

5.4- IMPLICACIÓN EN OTRAS DISTROFIAS DE RETINA

5.4.1- IMPLICACIÓN EN LA DISTROFIA MACULAR AUTOSÓMICA DOMINANTE

Las familias con herencia autosómica dominante se incluyeron en este trabajo, porque no se puede descartar que progenitor e hijos puedan tener mutaciones en ambas copias del gen ABCA4 y que compartan un alelo mutante común.

En estas familias con ADDM, se identificaron dos pacientes con un alelo mutante (ver pág. 107). En la familia ADDM-59, los haplotipos excluyeron el gen ABCA4 como responsable de la patología. En la familia ADDM-92, se identificó el cambio p.Ile156Val (reportado como asociado a un fenotipo STGD por Papaioannou M et al., 2000), que no mostró cosegregación con los haplotipos. El análisis mutacional realizado reveló un total de seis haplotipos diferentes identificados en las tres mujeres afectas (III:5, IV:2, IV:3), descartando las mutaciones en ABCA4 como causa común a los fenotipos DR observados en esta familia: - en la paciente con STGD (IV:3) se identificaron ambos alelos mutantes, que son muy probablemente la causa de su enfermedad; - en una paciente con DM (IV:2) se identificó un alelo mutante distinto, que posiblemente se trate de una asociación fortuita; - en la tercera paciente con DM (III:5), no se identificaron alelos mutantes en ABCA4, por lo que la causa genética de su enfermedad es desconocida; - por último, se identificó un alelo mutante -diferente a los anteriores- en una mujer sana (III:6). Por tanto, en esta familia se puede concluir que no existe una causa genética común a las distintas DR presentes en las tres afectas, existiendo un caso típico de STGD con ambas mutaciones identificadas en ABCA4 y dos pacientes con distrofia macular de otra causa genética. No obstante, no se puede descartar que el cambio p.Ile156Val desarrolle un posible efecto modulador sobre el fenotipo DM de la probandus (IV:2).

5.4.2- IMPLICACIÓN EN FAMILIAS CON FENOTIPO DIVERSO

Entre el total de familias en las que se realizó el estudio mutacional del gen ABCA4, se identificaron tres que resultaron peculiares debido a que los diferentes afectos manifestaban distintos fenotipos, atribuibles a mutaciones en este gen.

En la familia RP-280 se pudieron confirmar dos diagnósticos clínicos; en el hermano con STGD se identificó la mutación p.Asn1805Asp en homozigosis en el gen ABCA4, mientras que en la hermana diagnosticada de RP con preservación del epitelio paraarteriolar se detectó una mutación en el gen CRB1. Las mutaciones en este gen se transmiten con un patrón autosómico recesivo, por lo que es muy probable que exista un segundo alelo mutante en CRB1 (no detectado hasta el momento) que justifique su enfermedad. Esta familia en la que existen distintos fenotipos compatibles con alteraciones en ABCA4, pone de manifiesto que, independientemente de las combinaciones de alelos que se produzcan

146

V- Discusión

(moderado+severo, severo+severo, etc.), puede existir más de un gen relacionado con las distrofias retinianas implicado en las patologías familiares (en este caso, CRB1). En trabajos previos en los que se identificaron disomías uniparentales completas para el cromosoma 1, se estableció, por un lado, que no deben existir genes improntados y, por otro lado, que el número total de mutaciones recesivas por cromosoma en un individuo concreto debe ser bajo. Esta afirmación se realizó en base a que el paciente no presentaba anomalías adicionales a la enfermedad en cuestión causada por una mutación en homozigosis en un gen determinado (Thompson DA et al., 2002). Sin embargo, en nuestra familia se han producido dos enfermedades oftalmológicas recesivas, con mutaciones en sendos genes localizados en el cromosoma 1.

En la familia RP-315 se observa una herencia autosómica dominante, ya que la madre y sus dos hijos presentan problemas visuales aunque exhiben fenotipos distintos. El análisis de haplotipos mostró que ambos hermanos comparten uno de los cromosomas 1 paternos, pero cada uno ha heredado un cromosoma 1 materno diferente (ver pág. 118). Por tanto, el único alelo mutante detectado (p.Gly1961Glu materno) no es el causante de la enfermedad, al menos en la hija, que además presenta Distrofia Macular de Best, normalmente asociada a mutaciones en el gen VMD2. Si éste fuese el gen responsable de la retinopatía en la hija y teniendo en cuenta que el padre era sano, podría haberse producido una mutación “de novo” que explicase la patología. Por tanto, los haplotipos podrían cosegregar con ABCA4 únicamente en la madre y en el hijo y sus diferentes manifestaciones clínicas se podrían explicar en función de sus respectivos alelos mutantes no identificados (Figura IV.34, barras azul y roja). Al igual que ocurre en la familia ADDM-92 con el alelo mutante p.Ile156Val, es probable que el alelo p.Gly1961Glu se produzca por asociación fortuita y que la patología se deba a otro gen responsable.

Por último, en la familia RP-532 se observó que el alelo p.Arg1129Leu y los haplotipos cosegregaban con la enfermedad. Este alelo únicamente se ha visto asociado a STDG en los pacientes presentados en este trabajo (ver págs. 95-96). Los tres hermanos comparten los mismos haplotipos, sin embargo, las dos hermanas presentan un fenotipo más agresivo de DCB. Por tanto, es posible que la patogénesis se deba a un alelo severo aún no identificado y que en principio la enfermedad se manifieste como STGD y posteriormente evolucione a DCB, como ocurre con el alelo c.2888delG en las familias ARDM-79 y ARDM-86, comentadas anteriormente (ver pág. 144).

5.5- IMPLICACIÓN EN REORGANIZACIONES CROMOSÓMICAS A lo largo del estudio mutacional del gen ABCA4 realizado en ciento veintinueve familias, se identificó una paciente perteneciente a la familia ARDM-61 con la mutación p.Arg1129Leu en homozigosis. Sin embargo, el patrón de herencia no fue autosómico recesivo, ya que el alelo en heterozigosis únicamente se detectó en su padre. La paternidad se confirmó mediante marcadores microsatélites, por tanto, la paciente podía presentar isodisomía parcial paterna en el cromosoma 1 o un cariotipo anómalo debido a una microdeleción materna en la región 1p, causando hemizigosidad para el locus ABCA4.

147

V- Discusión

Se realizaron cariotipos convencionales y de alta resolución que no mostraron anomalías cromosómicas estructurales. El análisis de dosis realizado con MLPA confirmó la presencia de dos copias del gen ABCA4, sugiriendo isodisomía parcial paterna. La evolución y severidad de la enfermedad fueron similares a los mostrados por otros pacientes con el alelo p.Arg1129Leu en homozigosis, confirmando que este alelo mutante produce un efecto moderado en la patogénesis de la STGD.

Los hallazgos moleculares indicaron que la paciente ha heredado dos copias del cromosoma 1, una de cada progenitor, a excepción de la región isodisómica identificada en el brazo corto del homólogo materno. Por tanto, la recombinación ha sido postzigótica (mitótica). Este mecanismo se puede deber a una recombinación producida en una célula trisómica, seguida de un rescate de la trisomía. También puede ocurrir por pérdida del cromosoma 1p materno seguida de duplicación del cromosoma 1p paterno.

Cromosomas homólogos paternos

Profase (Meiosis I)

1ª división meiótica (Meiosis I)

2ª división meiótica (Meiosis II)

Homólogo materno

Homólogo materno

+

+

Gametogénesis normal

No disyunción en Meiosis II⇒ Isodisomía

X

X

Pérdida del 1p materno y duplicación del 1p paterno

Isodisomía parcial

Recombinación (mitótica) en célula ⇒ trisómica y rescate de trisomía

Isodisomía parcial

Figura V.6: Posibles mecanismos que producen isodisomía parcial o segmentaria.

148

V- Discusión

La recombinación postzigótica en una célula diploide puede provocar mosaicismo con isodisomía parcial. No obstante, no se pudo determinar este mecanismo en la paciente ya que únicamente se analizó el ADN extraído a partir de linfocitos de sangre periférica. Es menos frecuente que se produzca un rescate de trisomía, ya que las trisomías del cromosoma 1 son extremadamente infrecuentes y los fetos portadores de estas aneuploidías mueren antes de implantarse (Field LL et al., 1998). Si éste hubiese sido el mecanismo, ha debido producirse prácticamente durante la primera división celular del zigoto, produciendo la pérdida completa de las células trisómicas.

También se ha identificado una región en 1q en la que no se puede distinguir entre una segregación normal (biparental) o heterodisomía materna (ver pág. 114, Figura IV.31). No obstante, que se produzca este reordenamiento es bastante improbable y quizá esta segregación se deba a que ambos padres comparten uno de los dos alelos de estos marcadores. Aunque los marcadores microsatélites utilizados presentan elevada heterozigosidad, es posible que presenten un alelo muy prevalente entre la población española, que explique que ambos progenitores compartan uno de los dos alelos en un total de catorce marcadores (D1S2878-D1S2785).

Otros ejemplos de disomía uniparental en el cromosoma 1 se han reportado previamente, tanto de origen paterno como materno (Pulkkinen L et al., 1997; Gelb BD et al., 1998; Takizawa Y et al., 1998; Dufourcq-Lagelouse R et al., 1999; Takizawa Y et al., 2000; Rivolta C et al., 2002; Thompson DA et al., 2002). Entre ellos, existen dos casos con degeneración retiniana; por un lado, un paciente con isodisomía uniparental completa que produce homozigosidad para una mutación en el gen RPE65 (Thompson DA et al., 2002), por otro lado, un paciente con heterodisomía uniparental e isodisomía parcial, en el que se identifica una mutación en homozigosis en el gen USH2A (Rivolta C et al., 2002). En relación con enfermedades oftalmológicas, también se han descrito casos de isodisomía uniparental en otros cromosomas (Thompson DA et al., 2002, Pentao L et al., 1992).

Una de las consecuencias de este tipo de reordenamientos es la alteración de la impronta genómica (Engel E, 1980). Al igual que ha ocurrido en nuestro caso, los pacientes que presentan ambos cromosomas 1 derivados de un solo progenitor se identificaron por la evolución de sus respectivas enfermedades recesivas, sin mostrar anomalías genéticas adicionales. Del estudio de estos casos, se ha descrito que no deben existir genes improntados en el cromosoma 1 que generen alteraciones en el fenotipo (Thompson DA et al., 2002). No obstante, se debe tener en cuenta que estos reordenamientos aumentan el riesgo de padecer enfermedades con herencia autosómica recesiva. Por tanto, familias con retinopatías recesivas pueden tener descendencia afecta, con una mutación en homozigosis, incluso cuando uno de los progenitores es portador sano de un alelo mutante y el otro progenitor presenta alelos silvestres.

149

V- Discusión

Un patrón de herencia no mendeliano para el gen ABCA4 se ha descrito previamente, en un paciente que presentaba retinosis pigmentaria severa causada por una mutación en homozigosis que alteraba el procesamiento (1938-1 G>A). Los autores especularon que esta alteración se debía a una deleción del locus materno, sin embargo, no se pudo comprobar (Rozet JM et al., 1999). Es posible que la segregación de este alelo se haya producido por disomía uniparental como en nuestra paciente. En este caso, el análisis con la técnica de MLPA podría determinar el número de copias del locus ABCA4 en el probandus.

Hasta el momento, la isodisomía parcial del cromosoma 1p, como se muestra en nuestro caso, no se ha descrito previamente. Este hallazgo tiene una consecuencia importante en lo que se refiere al consejo genético de la paciente; como el riesgo de recurrencia de disomía uniparental parcial es muy bajo, el riesgo de que sus hermanos y su futura descendencia padezcan STGD es prácticamente inapreciable.

Este estudio, que forma parte del análisis mutacional realizado en setenta y cuatro familias STGD indica que las alteraciones genómicas únicamente representan una pequeña fracción de todos los alelos mutantes asociados a ABCA4. Hasta ahora, supone el reordenamiento estructural de mayor tamaño en el que se ha visto involucrado este gen (www.hgmd.org). En los casos en los que se identifican mutaciones en homozigosis, es recomendable realizar un análisis de haplotipos para descartar una posible disomía uniparental. Además de la detección de la mutación p.Arg1129Leu en homozigosis, la información de homozigosidad de dos polimorfismos intragénicos obtenida mediante el microarray contribuyó a la sospecha de una no segregación del alelo materno.

5.6- CORRELACIÓN GENOTIPO-FENOTIPO El análisis molecular del gen ABCA4 realizado en pacientes con diferentes distrofias de retina ha permitido establecer que las alteraciones en este gen son responsables del fenotipo STGD y DCB. Sin embargo, su implicación en otras retinopatías como la RPAR o la ADDM no es tan evidente, de hecho, en algunas de estas familias se ha observado que la presencia de alelos mutantes en ABCA4 no cosegrega con la enfermedad o se produce por asociación fortuita. Este hecho se puede deber a la prevalencia de alelos mutantes que existe en población control.

Los pacientes con STGD y DCB en los que se han identificado ambos alelos mutantes se han agrupado en función de la combinación de alelos que exhiben y de la edad de comienzo de la enfermedad (ver págs. 123-125). De esta manera, se ha observado que el alelo p.Arg1129Leu siempre aparece asociado a un fenotipo STGD y tiene un efecto moderado en la patogénesis, ya que el comienzo de los síntomas se produce en torno a la segunda década de vida. Cuando esta variante aparece combinada con otro alelo en trans (doble heterozigoto), se observa que el comienzo de los síntomas no es tan homogéneo y varía mucho de unos pacientes a otros, por lo que el desarrollo de la enfermedad debe estar determinado por la patogenidad del otro alelo. Este hecho podría explicar que los pacientes que presentan en trans

150

V- Discusión

alteraciones más severas (alteran el procesamiento de los intrones -ARDM-76- o que generan un codon de parada prematuro -ARDM-78-) presenten disminución de la agudeza visual en la primera década de vida.

En los pacientes que presentan alelos complejos, dobles y triples mutantes, también se observa un desarrollo temprano de la enfermedad (pág. 124). Las excepciones se producen en las familias ARDM-138 y ARDM-12. En la ARDM-138, un comienzo más tardío se podría explicar porque el alelo complejo p.Gly863Ala+p.Arg943Gln se ha descrito como una mutación de efecto patológico limitado (Sun H et al., 2000). En el caso del paciente perteneciente a la familia ARDM-12, la enfermedad comienza de forma tardía, en torno a la cuarta década de vida (38 años). Se conoce que el cambio p.Gly1961Glu se considera un alelo de efecto moderado, pero se desconoce cuál puede ser el efecto del alelo complejo p.Gly1961Glu +Thr1253Met. El segundo alelo causante de su enfermedad genera una proteína truncada, que sugeriría un efecto patológico considerable. Cabe destacar que este paciente es de edad avanzada (76 años) y es posible que no recuerde con exactitud el comienzo de su enfermedad, o bien, que describa el inicio de los síntomas cuando la disminución de la agudeza visual sea ya crítica. Es posible que alguna de estas situaciones pudiese explicar que una combinación de alelos severos produzca un aparente, pero no real, desarrollo tardío de la STGD. No obstante, no se puede descartar que existan otros factores que modulen la patogenicidad de dichos alelos.

En los pacientes que presentan alelos simples, la enfermedad comienza entre la primera y la segunda década de vida. Se observan pacientes que manifiestan síntomas a partir de los ocho años de edad (ARDM-38, ARDM-40, ARDM-90; ver pág. 124), que portan un alelo que altera considerablemente la proteína (4739 del T, Q1315X y IVS22 -2A>T, respectivamente).

En el fenotipo DCB, se ha identificado un alelo prevalente (c.2888delG) que aparece en homozigosis y en heterozigosis en cuatro de los seis pacientes (ver pág. 125). Los dos pacientes restantes son homozigotos para los cambios c.5041_5055del y p.Gly1977Ser, respectivamente. En todos ellos la enfermedad comienza en la primera década de vida (6-10 años de edad). Los cambios c.2888delG y p.Gly1977Ser aparecen como dobles heterozigotos en cuatro pacientes diagnosticados como STGD en la actualidad (ver págs. 123-124). De hecho, la paciente de la familia ARDM-22 (diagnosticada como STGD) presenta el mismo genotipo que la paciente perteneciente a la familia ARDM-176 (diagnosticada como DCB). En la paciente de la familia ARDM-22 sería recomendable realizar un seguimiento oftalmológico de su enfermedad a largo plazo, considerando que porta un alelo asociado a DCB. Los restantes datos de correlación genotipo-fenotipo en nuestra serie con la mutación c.2888delG pudieran demostrar una evolución hacia afectación también periférica en el transcurso del tiempo.

151

V- Discusión

En la siguiente figura se muestran las mutaciones identificadas en ABCA4, situadas en los correspondientes dominios de la proteína codificada por este gen:

4537insC I156V R152Q

G172S R212C

4739delT R1640W N380K

V256V

S1642R

C1490Y

R408X

Q1315X R602W V767D P1380L

IVS40+5G>A

delVVAIC1681

P1486L

membrana

L11P

N

R943Q 2888 del G

G863A T897I T901A

NBD-1

V931M

NBD-2

G1977S

T1019M

V2050L P.ARG1

R1055W R1108C 3211insGT

N1805D P1948L N1799D L1940P G1961E W1408R V1433I G1961R T1253M

E1122K

L2060R

C

L2241V Q2187X R2107H R2107P

IVS22-2A>T

Figura V.7: Localización de las mutaciones identificadas en ABCA4 en la proteína Rim. Las mutaciones puntuales están indicadas con flechas negras, mientras que las mutaciones que alteran la pauta de lectura o el procesamiento se muestran con flechas rojas. El modelo de la proteína es de Sun H et al., 2000.

Según el modelo de Sun H et al., las mutaciones en el dominio NBD-1 (Nucleotide Binding Domain 1) eliminarían la actividad ATPasa de la proteína tanto a nivel basal como cuando es estimulada por el retinal. En cambio, las mutaciones en el NBD-2 (Nucleotide Binding Domain 2) no alteran la actividad ATPasa basal pero tienden a inhibir la hidrólisis del ATP dependiente de retinal por parte del NBD1. Aunque estas observaciones muestran cómo se ve alterada la funcionalidad de la proteína, no permiten establecer una correlación genotipo-fenotipo en nuestros pacientes. En el caso de la familia ARDM-126 (alelo p.Gly1977Ser en homozigosis), presenta ambas mutaciones en el NBD-2 y muestran un fenotipo DCB, aunque es posible que la actividad ATPasa basal se siga manteniendo. Además, el cambio en homozigosis que presenta es una mutación puntual que cambia el aminoácido, sin alterar los residuos restantes de la proteína.

Para determinar la severidad de los alelos mutantes que se producen en ABCA4, es necesario realizar un estudio funcional que permita establecer qué pérdida de funcionalidad genera cada variante alélica. Es preciso tener en cuenta que generalmente, se producen más de una mutación en cada alelo (alelos complejos) y que es posible que cada uno conlleve un efecto patológico asociado, por mínimo que sea. Por otro lado, sería recomendable realizar un estudio para determinar posibles interacciones de ABCA4 con otras proteínas retinianas.

152

V- Discusión

5.7- EPIDEMIOLOGÍA DE LOS ALELOS MUTANTES EN ABCA4 El estudio del gen ABCA4 realizado en individuos control ha permitido estimar la frecuencia de portadores sanos entre nuestra población en 7´87%. El hecho de que entre 5-10% de la población general (este trabajo; Jaakson K et al., 2003; Yatsenko AN et al., 2001) sea portadora de alelos asociados a enfermedad tiene considerables implicaciones en la proporción de patologías retinianas atribuibles a ABCA4 y sugiere que la prevalencia actual de la enfermedad (1:10000) debe ser revisada. La frecuencia de portadores observada en este estudio muestra una frecuencia estimada considerablemente mayor de retinopatías debido a mutaciones en este gen, aproximadamente 1/600.

La prevalencia precisa de retinopatías asociadas a ABCA4 aún no se ha determinado, pero la frecuencia de portadores hallada en nuestra población así como en otros estudios previos puede haberse sobreestimado por dos razones: por un lado, que el número de controles analizados sea relativamente pequeño y, por tanto, se trate de una estimación sesgada; por otro lado, que existan combinaciones de alelos (mutantes) que no produzcan alteraciones (tempranas) en el fenotipo. Este sería el caso de los denominados polimorfismos proteicos, que se han identificado en homozigosis en individuos sin alteraciones retinianas.

6‐ DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA DE LAS MUTACIONES EN LOS PACIENTES ESTUDIADOS. Las mutaciones identificadas en los distintos genes analizados se distribuyen homogéneamente por toda la geografía española. En la ND, la mutación p.Arg38Cys se identificó en dos familias que compartían haplotipos procedentes de Madrid y Guadalajara, y en una familia francesa (Royer et al., 2003). El número de pacientes estudiados es muy limitado y, a excepción del cambio p.Arg38Cys, cada paciente presenta una mutación distinta, por lo que no se observa agregación asociada a una región geográfica concreta (ver pág. 83).

En RS1, aparecen dos mutaciones prevalentes. Por un lado, el cambio p.Gln154Arg que sugiere la existencia de un ancestro común en todos los pacientes (ver pág. 87) y, por otro lado, el cambio p.Glu72Lys, que se ha originado independientemente (ver pág. 88). Sin embargo, esta mutación muestra un efecto fundador en población europea, concretamente en población finlandesa, en la que uno de cada tres pacientes con XLRS presenta esta alteración (Huopaniemi L et al., 1999). El cambio p.Gln154Arg se localiza en Asturias, País Vasco, Andalucía y en el archipiélago canario. Pese a que la distribución geográfica es dispersa, se especula que esta mutación ha debido producirse a lo largo de un periodo de tiempo relativamente corto ya que los pacientes comparten un haplotipo idéntico para cuatro marcadores microsatélites y éstos son hipermutables (Jones MH & Nakamura Y, 1992).

En ABCA4, el espectro de variantes alélicas se encuentra ampliamente distribuido a lo largo de todas las regiones geográficas. Cabe destacar que se identifican un número muy considerable de alelos mutantes en Madrid y Castilla La Mancha (ver pág. 127), aunque quizá esté producido por el sesgo en la

153

V- Discusión

recogida de datos. En el alelo p.ArgG1129Leu, se observó cierta agregación en el País Vasco, Navarra, Burgos y Madrid (15/22 alelos p.ArgG1129Leu), estando ausente en ambos archipiélagos y noroeste peninsular. Si se asumiese que este alelo ha tenido un origen común, es posible que esta variante haya surgido hace bastante tiempo, ya que se ha producido cierta divergencia entre los marcadores microsatélites y se han originado haplotipos ligeramente diferentes, aunque similares. No obstante, sería necesario realizar un estudio de haplotipos en población control para poder determinar qué haplotipos pueden estar asociados al mutante ancestral y estimar en qué momento se ha producido esta alteración.

Comparando los alelos prevalentes de estas retinopatías en otras poblaciones europeas (alelo p.Glu72Lys en Finlandia (RS1); alelo p.Gly1961Glu en Alemania, Países Bajos, Eslovenia e Italia (ABCA4) con las frecuencias de estas mutaciones en población española, se observan diferencias genéticas con nuestros vecinos europeos. Estas diferencias se pueden deber, en gran parte, al elevado número de migraciones e invasiones que ha sufrido la Península Ibérica a lo largo de su historia. Estos desplazamientos de población pueden diseminar un alelo (mutante) en concreto. Por el contrario, si la población se asienta, puede originar un efecto fundador. La evolución y la selección natural son procesos estocásticos que ocurren sobre las poblaciones, alterando las frecuencias alélicas y las características de sus individuos (deriva genética). Por lo general, estos cambios conllevan la pérdida de los alelos menos frecuentes, disminuyendo la diversidad genotípica de la población. Es posible que, a lo largo del tiempo, estos procesos hayan generado frecuencias alélicas diferentes entre las poblaciones del norte y del sur de Europa, estableciendo un gradiente (clina) de mutaciones desde los países nórdicos y centro europeos hasta la cuenca mediterránea.

p.Arg1129Leu p.Gly1961Glu p.Gly863Ala

p.Gln154Arg p.Glu72Lys

Figura V.8: Distribución geográfica y frecuencia relativa de diferentes mutaciones identificadas en RS1 y ABCA4 en diversos países europeos (The Retinoschisis Consortium, 1998; Jaakson K et al., 2003; este trabajo).

154

V- Discusión

7‐ ESTRATEGIAS DE ESTUDIO GENÉTICO EN RETINOPATÍAS DE HERENCIA LIGADA AL CROMOSOMA X 

A continuación, se muestra el algoritmo diagnóstico propuesto para el estudio genético de la Enfermedad de Norrie/Vitreorretinopatía exudativa familiar y de la Retinosquisis juvenil: Con mutación

Informe

Sin mutación

Informe

Fin

Secuenciación automática: NDP, RS1

Pa Paciente

ADN Cosegrega

Informe

Búsqueda de otros genes implicados

Fin

An Análisis de haplotipos No cosegrega

In Informe

Figura V.9: Algoritmo diagnóstico para la ND/VREF y la XLRS.

8‐ ESTRATEGIAS DE ESTUDIO GENÉTICO EN RETINOPATÍAS DE HERENCIA AUTOSÓMICA RECESIVA

A continuación, se muestra el algoritmo diagnóstico propuesto para el estudio genético de la Enfermedad de Stargardt y otras formas asociadas a mutaciones en el gen ABCA4, compatibles con una herencia autosómica recesiva:

2 alelos mutantes

Microarray ABCR400

Confirmación: secuenciación automática

Informe

Fin

1 alelo mutante Cribado mutacional 50 exones ABCA4 Sin mutaciones

Paciente

ADN

Con mutación

Informe

Sin mutación

Informe

Fin

dHPLC

Búsqueda de otros genes implicados Cosegrega

Informe

Fin

Análisis de haplotipos No cosegrega

Informe

Figura V.10: Algoritmo diagnóstico para la STGD, DCB, RPAR y formas asociadas a mutaciones en ABCA4.

155

VI- Conclusiones

157

VI- Conclusiones VI- CONCLUSIONES

1- En el gen NDP, se ha observado que las mutaciones más agresivas (asociadas a proteína truncada) producen un fenotipo más severo (ND), con afectación oftalmológica, auditiva y retraso mental.

2- En el gen RS1, las mutaciones identificadas en nuestras familias, así como las alteraciones descritas en pacientes procedentes de otras poblaciones, indican que existe una tasa considerable de mutaciones “de novo”, debida en parte a la elevada prevalencia de dinucleótidos CG en su secuencia. Esta situación se asocia a una ausencia de efecto fundador y origen múltiple de la XLRS.

3- La identificación de la mutación responsable en varones con XLRS confirma el diagnóstico clínico y facilita un asesoramiento genético adecuado para los familiares, pero no permite predecir la evolución (prognosis) del paciente.

4- La detección de alelos mutantes en ABCA4, utilizando como método previo de cribado el microarray ABCR400, sólo puede ser implementada mediante un método posterior de análisis mutacional (secuenciación+dHPLC) y a través de una caracterización clínica precisa en pacientes con STGD. En el fenotipo DCB, la baja tasa de detección de mutaciones puede deberse a la existencia de otros genes responsables (heterogeneidad genética).

5- En aquellos pacientes en los que los haplotipos cosegregan con la patología y se ha identificado un alelo mutante en ABCA4 o no se han detectado mutaciones, la utilización de un método de cribado adicional al microarray de genotipado (secuenciación o dHPLC) aumenta la tasa de detección (6/10 familias).

6- La implicación de ABCA4 en la STGD y en DCB es patente. No obstante, su etiopatogenia en los otros fenotipos (RPAR y ADDM) no es tan evidente y la presencia de mutaciones puede deberse a una asociación fortuita.

7- Los grandes reordenamientos genómicos únicamente representan una pequeña fracción de todos los alelos mutantes asociados a ABCA4.

8- Algunos alelos mutantes de ABCA4 se asocian de forma clara a un fenotipo retiniano: - p.Arg1129Leu a STGD de inicio tardío - c.2888delG a DCB.

9- En este tipo de retinopatías tan heterogéneas (genética, alélica y clínicamente), se debe tener en cuenta que los distintos fenotipos exhibidos en una misma familia pueden deberse: - a la variación fenotípica por un alelo mutante - o a la coexistencia de diferentes genes implicados, que pueden ser conocidos o no.

158

VI- Conclusiones 10- La mutación p.Arg1129Leu es la más prevalente en población española. Pese al número limitado de cromosomas estudiados, su elevada prevalencia entre los alelos asociados a STGD y la similitud de los haplotipos pueden sugerir un origen ancestral común.

11- La prevalencia de alelos mutantes en ABCA4 en población general española, analizada mediante la medida de la frecuencia del alelo p.Arg1129Leu en población control, se podría estimar en el 7´87%. Si bien, estos datos deberían ser confirmados con un estudio más exhaustivo mediante el microarray de genotipado en un número elevado de sujetos control.

159

Biblioteca Barroca (Klementinum), Praga. K.I. Dienzenhoffer, principios del siglo XVIII.

VII- Bibliografía 160

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VIII- Bases de datos

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VIII- Bases de datos VIII- BASES DE DATOS

Las bases de datos de Internet utilizadas han sido las siguientes: - Retinal Information Network: www.sph.uth.tmc.edu/Retnet - Retina International: www.retina-international.org - The GDB Human Genome Database: www.gdb.org - The Human Genome Mutation Database: www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php - The National Center for Biotechnology Information: www.ncbi.nih.gov

Además de las bases de datos anteriores, se han consultado las siguientes páginas Web: - Asper Biotech: www.asperbio.com - Eye Design Book by Curt Deckert, PhD: www.eyedesignbook.com - Retinosis Pigmentaria: www.retinosis.org - The World Medical Association: www.wma.net - German Resource Center for Genome Research: www.rzpd.de

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IX‐ Publicaciones        176

IX- Publicaciones IX- PUBLICACIONES

A) Enfermedad de Norrie / Vitreorretinopatía exudativa · Genotype-phenotype variations in five Spanish families with Norrie disease or X-linked FEVR. R.Riveiro-Alvarez, M.J. Trujillo-Tiebas, A.Gimenez-Pardo, M.Garcia-Hoyos, D.Cantalapiedra, I.LordaSanchez, M.Rodriguez de Alba, C.Ramos, C.Ayuso. Molecular Vision 2005: 11: 705-12.

· Submission of Mutation Data. NDP. Human Genetics (2005) 118, 534. Temporary accession number: M20051121/14.00.56. R Riveiro-Alvarez, Trujillo MJ, Gimenez A, Cantalapiedra D, Vallespin E, Villaverde C, Ayuso C.

B) Retinosquisis juvenil ligada al cromosoma X

· Submission of Mutation Data. RS1. Human Genetics (2005) 118, 534. Accession number: Hi0503. R Riveiro-Alvarez, MJ Trujillo-Tiebas, A Gimenez, M Garcia-Hoyos, D Cantalapiedra, E Vallespin, A Queipo, C Ramos, C Ayuso.

· Submission of Mutation Data. RS1. Human Genetics (2005) 118, 535. Accession number: Hm0512b. R Riveiro-Alvarez, MJ Trujillo-Tiebas, A Gimenez, M Garcia-Hoyos, D Cantalapiedra, E Vallespin, A Queipo, C Ramos, C Ayuso.

· Submission of Mutation Data. RS1. Human Genetics (2005) 118, 535. Accession number: Hm0513b. R Riveiro-Alvarez, MJ Trujillo-Tiebas, A Gimenez, M Garcia-Hoyos, D Cantalapiedra, E Vallespin, A Queipo, C Ramos, C Ayuso.

· Submission of Mutation Data. RS1. Human Genetics (2005) 118, 536. Accession number: Hm0514b. R Riveiro-Alvarez, MJ Trujillo-Tiebas, A Gimenez, M Garcia-Hoyos, D Cantalapiedra, E Vallespin, A Queipo, C Ramos, C Ayuso.

· Submission of Mutation Data. RS1. Human Genetics (2005) 118, 536. Accession number: Hm0515b. R Riveiro-Alvarez, MJ Trujillo-Tiebas, A Gimenez, M Garcia-Hoyos, D Cantalapiedra, E Vallespin, A Queipo, C Ramos, C Ayuso.

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IX- Publicaciones C) Enfermedad de Stargardt

· Microarray-based mutation analysis of the ABCA4 gene in Spanish patients with Stargardt disease: evidence of a prevalent mutated allele. Valverde D, Riveiro-Alvarez R, Bernal S, Jaakson K, Baiget M, Navarro R, Ayuso C. Revista: Molecular Vision (en prensa).

· Spectrum of the ABCA4 gene mutations implicated in severe retinopathies from Spanish patients. D Valverde, R Riveiro-Alvarez, M Baiget, M Carballo, G Antiñolo, JM Millan, B Garcia-Sandoval, C Ayuso. Revista: IOVS (en prensa).

- Partial paternal uniparental disomy (UPD) of chromosome 1 in a patient with Stargardt disease. R Riveiro-Alvarez, D Valverde, I Lorda-Sanchez, MJ Trujillo-Tiebas, D Cantalapiedra, E Vallespin, J AguirreLamban, C Ramos, C Ayuso. Revista: Molecular Vision (en prensa).

· Submission of Mutation Data. ABCA4. Human Genetics (2006) 118, 774-785. Accession number: Hm0536. R Riveiro-Alvarez, MJ Trujillo, D Cantalapiedra, E Vallespin, C Villaverde, D Valverde, C Ayuso.

· Submission of Mutation Data. ABCA4. Human Genetics (2006) 118, 774-785. Accession number: Hm0537. R Riveiro-Alvarez, MJ Trujillo, D Cantalapiedra, E Vallespin, C Villaverde, D Valverde, C Ayuso.

· Submission of Mutation Data. ABCA4. Human Genetics (2006) 118, 774-785. Accession number: Hm0538. R Riveiro-Alvarez, J Aguirre, MJ Trujillo, D Cantalapiedra, E Vallespin, C Villaverde, D Valverde, C Ayuso.

· Submission of Mutation Data. ABCA4. Human Genetics (2006) 118, 774-785. Accession number: Hs0512. R Riveiro-Alvarez, MJ Trujillo, D Cantalapiedra, E Vallespin, C Villaverde, D Valverde, C Ayuso.

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