HOLOTYPE HLA™ 96/7 CONFIGURACIÓN A Y CE Y CONFIGURACIÓN B Y CE (REF: H32 Y REF: H34) INSTRUCCIONES DE USO VERSIÓN 10 02/05/2018 Omixon Biocomputing Limited

0086

Preparación de ADN para el análisis de secuenciación en Illumina MiSeq





Contenido INFORMACIÓN DEL FABRICANTE .......................................................................................................................... 8 SIGNIFICADO DE LOS SÍMBOLOS ........................................................................................................................... 8 CONTENIDO DEL KIT HOLOTYPE HLA-96/7 CONFIGURACIÓN A Y CE (REF:H32) O CONFIGURACIÓN B Y CE (REF:H34) ............................................................................................................................................................. 9 CAJA DE COMPONENTES DEL CEBADOR .............................................................................................................................. 9 CAJA DE COMPONENTES DE REACTIVOS DE PREPARACIÓN DE LA BIBLIOTECA .............................................................................. 9 PLACA DE ADAPTADORES DE 96 POCILLOS ........................................................................................................................ 10 LIBRO DE EXCEL .......................................................................................................................................................... 10 SOFTWARE – OMIXON HLA TWIN ................................................................................................................................. 10 ENVÍOS Y ALMACENAMIENTO ............................................................................................................................ 10 ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES ....................................................................................................................... 11 LIMITACIONES CONOCIDAS DEL PRODUCTO ...................................................................................................................... 11 INFORMACIÓN DE SEGURIDAD ........................................................................................................................... 11 PARÁMETROS DE RENDIMIENTO ........................................................................................................................ 12 ASISTENCIA TÉCNICA .......................................................................................................................................... 12 Soporte telefónico: ........................................................................................................................................... 12 EQUIPOS, REACTIVOS Y SUMINISTROS ............................................................................................................... 13 RECOMENDACIONES TÉCNICAS Y DEL EQUIPO .................................................................................................................... 13 RECOMENDACIONES DEL REACTIVO ASOCIADO .................................................................................................................. 13 Capacidad del kit reactivo de MiSeq ................................................................................................................ 14 SUMINISTROS RECOMENDADOS ..................................................................................................................................... 14 AVISO LEGAL ...................................................................................................................................................... 15 USO PREVISTO .................................................................................................................................................... 15 NOTA IMPORTANTE ANTES DE COMENZAR ........................................................................................................ 16 AISLAMIENTO DE ADN GENÓMICO RECOMENDADO ........................................................................................................... 16 PRINCIPIO DEL MÉTODO ..................................................................................................................................... 17 RESUMEN DE PASOS ........................................................................................................................................... 18 GLOSARIO/DEFINICIONES ................................................................................................................................... 19 PASO 1 – PREPARACIÓN DE LA MEZCLA MAESTRA DE AMPLIFICACIÓN DE HLA ................................................... 20 LISTA DE REACTIVOS .................................................................................................................................................... 20 PROTOCOLO .............................................................................................................................................................. 20 Mezcla maestra: HLA-A, B, C, DRB1, DPB1 y DQA1 .......................................................................................... 21 Mezcla maestra: Grupo 3 de HLA-DQB1 .......................................................................................................... 21 PASO 2: AMPLIFICACIÓN HLA DE CLASE I Y II ...................................................................................................... 22 LISTA DE REACTIVOS .................................................................................................................................................... 22 PROTOCOLO .............................................................................................................................................................. 22 Mezcla maestra cargada de polimerasa taq: HLA-A, B, C, DRB1, DPB1 y DQA1 .............................................. 22 Mezcla maestra cargada de polimerasa taq: Grupo 3 de HLA-DQB1 .............................................................. 23 Amplificación de clase I (HLA-A, B y C) ............................................................................................................. 23 Omixon Holotype 96/7 CONFIGURACIÓN | Configuración A y CE, y Configuración B y CE | Instrucciones de uso v10. 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Amplificación de clase II (HLA-DRB1, DPB1, DQA1 y DQB1) ............................................................................. 23 Tamaños esperados de los amplicones ............................................................................................................ 24 PASO 3: CUANTIFICACIÓN Y NORMALIZACIÓN DE AMPLICONES (MEDIANTE EL USO DE FLUORÍMETRO DE PLACAS) ............................................................................................................................................................. 25 LISTA DE REACTIVOS .................................................................................................................................................... 25 PROTOCOLO .............................................................................................................................................................. 26 Agrupación de amplicones ............................................................................................................................... 27 ExoSAP-IT Purificación de RCP Expresa ............................................................................................................ 27 PASO 4: PREPARACIÓN DE LA BIBLIOTECA .......................................................................................................... 28 LISTA DE REACTIVOS .................................................................................................................................................... 28 PROTOCOLO .............................................................................................................................................................. 28 Mezcla maestra de fragmentación .................................................................................................................. 29 Programa de fragmentación ............................................................................................................................ 29 Mezcla maestra de reparación de extremos .................................................................................................... 30 Programa de reparación de extremos .............................................................................................................. 30 Mezcla maestra de ligación ............................................................................................................................. 31 Programa de ligación ....................................................................................................................................... 31 Agrupamiento y purificación de biblioteca ...................................................................................................... 32 PASO 5: SELECCIÓN DEL TAMAÑO DE LA BIBLIOTECA ......................................................................................... 34 LISTA DE REACTIVOS .................................................................................................................................................... 34 PROTOCOLO .............................................................................................................................................................. 34 PASO 6: CUANTIFICACIÓN DE BIBLIOTECA CON UN INSTRUMENTO DE RCPC ...................................................... 35 LISTA DE REACTIVOS .................................................................................................................................................... 35 PROTOCOLO .............................................................................................................................................................. 35 Mezcla del cebador RCPc ................................................................................................................................. 35 Mezcla maestra de RCPc .................................................................................................................................. 36 PASO 7: SECUENCIAMIENTO EN EL ILLUMINA MISEQ .......................................................................................... 38 LISTA DE REACTIVOS .................................................................................................................................................... 38 Capacidad del kit reactivo de MiSeq ................................................................................................................ 38 PROTOCOLO .............................................................................................................................................................. 38 PASO 8 – ANÁLISIS DE DATOS DEL SECUENCIAMIENTO HLA ................................................................................ 40 PROTOCOLO AUTOMATIZADO ........................................................................................................................................ 40 Establecimiento y configuración de TI .............................................................................................................. 40 Protocolo por análisis ....................................................................................................................................... 40 PROTOCOLO MANUAL DEL SERVIDOR .............................................................................................................................. 40 Establecimiento y configuración de TI .............................................................................................................. 40 Protocolo por análisis ....................................................................................................................................... 40 PROTOCOLO MANUAL DE ESCRITORIO ............................................................................................................................. 41 Establecimiento y configuración de TI .............................................................................................................. 41 Protocolo por análisis ....................................................................................................................................... 41 FIGURAS COMPLEMENTARIAS ............................................................................................................................ 42 EJEMPLO DE PLACA PARA PLACA DE AMPLICONES, PLACA DE AMPLIFICACIÓN, PLACA DE DILUCIÓN, PLACA DE CUANTIFICACIÓN DE AMPLICONES (PARA UN LOCUS INDIVIDUAL) Y PLACA DE REACCIÓN ....................................................................................... 42 EJEMPLO DE PLACA PARA PLACA DE CUANTIFICACIÓN DE ESTÁNDARES ................................................................................... 42 EJEMPLO DE PLACA DE RCPC PARA CUANTIFICACIÓN DE BIBLIOTECA KAPA ............................................................................ 43 Omixon Holotype 96/7 CONFIGURACIÓN | Configuración A y CE, y Configuración B y CE | Instrucciones de uso v10. 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APÉNDICE 1: PIPPIN PREP ................................................................................................................................... 44 PROGRAMACIÓN DEL PIPPIN PREP ................................................................................................................................. 44 EJECUCIÓN DEL PIPPIN PREP ......................................................................................................................................... 44 APÉNDICE 2: CUANTIFICACIÓN DE AMPLICONES CON UN INSTRUMENTO DE RCPC ............................................. 47 LISTA DE REACTIVOS .................................................................................................................................................... 47 PROTOCOLO .............................................................................................................................................................. 47 APÉNDICE 3: CUANTIFICACIÓN DE BIBLIOTECA CON UN TINTE FLUORESCENTE INTERCALADO DE ADNBC ........... 49 LISTA DE REACTIVOS .................................................................................................................................................... 49 PROTOCOLO .............................................................................................................................................................. 49



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Antecedentes del documento: notas y actualizaciones importantes Versión Fecha V1 V2 V3

V4 V5 V6

V7 V8

V9

Autor

05/12/2015 Robert Pollock 18/01/2016 Robert Pollock 10/02/2016 Robert Pollock

26/02/2016 Robert Pollock 05/04/2016 Robert Pollock 09/04/2016 Efi Melista 23/04/2016 Efi Melista 30/05/2016 Gergely Tölgyesi

21/08/2017 Gergely Tölgyesi

Resumen de cambios

Autorizado por Primera versión, borrador Gergely Tölgyesi Segundo borrador, correcciones menores Gergely Tölgyesi Tercer borrador, se actualizó la explicación de Gergely los símbolos, se actualizó la recomendación del Tölgyesi ciclo de congelamiento/descongelamiento, se actualizó el uso previsto Cuarto borrador, actualización de la sección Gergely de información de seguridad Tölgyesi Quinta versión, recomendación alternativa Efi Melista de la cuantificación de amplicones Cambio menor de palabras de “enzima LRGergely RCP” a “Polimerasa taq”, en función del Tölgyesi cambio de documentación de Qiagen. Actualización de declaraciones del grupo 1 y Gergely grupo 2 de DQB1 Tölgyesi Actualización de la métrica de rendimiento. Efi Melista Actualización de volúmenes de reactivos en la preparación de la biblioteca actualizada. Actualización de la configuraciones del producto para las placas de adaptadores indexadas de A2/A3/A4 96/7 Configuración B, configuración de placa Efi Melista de adaptadores indexada agregada

Fecha de emisión 05/12/2015 18/01/2016 10/02/2016

26/02/2016 05/04/2016 09/04/2016

23/04/2016 30/05/2016

21/08/2017

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V10

14/12/2017 Tünde Vágó

La eliminación de “DQB” de los potenciadores Efi Melista 02/05/2018 de DQB, la verificación del gel después de LRRCP se volvió opcional, simplificación de la cuantificación de amplicones, según el cambio de volumen de la agrupación de la muestra en kits de 11 locus, reemplazo de ExoSAP-IT por ExoSAP-IT Express, uso de Qubit para la cuantificación de la biblioteca, grupo 1 y grupo 2 de la mezcla del cebador DQB1 reemplazada por el grupo 3 de DQB1, reducción del tiempo de reacción de reparación final, actualización del método de cuantificación de biblioteca sobre la reducción del tiempo de reacción de ligadura, se eliminó la hoja de muestra de los Apéndices.

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Exención de responsabilidad Omixon ha hecho todo lo posible por garantizar que las Instrucciones de Uso (IFU, por sus siglas en inglés) sean precisas. Omixon no se responsabiliza por errores ni omisiones que pudieran haber ocurrido. La información de estas IFU está sujeta a cambios sin previo aviso. Omixon no se responsabilidad por ninguna imprecisión que pudieran contener estas IFU. Omixon se reserva el derecho a mejorar estas IFU y/o los productos que se describen en estas IFU en cualquier momento sin aviso. Si encuentra información incorrecta, errónea o incompleta en este manual, valoraremos sus comentarios y sugerencias. Envíelos a [email protected].

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Información del fabricante Nombre de la compañía: Omixon Biocomputing Ltd Dirección de visita: Fehérvári út 50-52/6 Ciudad: Budapest Código postal: H-1117 País: Hungría

Significado de los símbolos Número de partida/lote Número de referencia/catálogo Consulte las instrucciones de uso Contiene reactivo para número de prueba N Fabricante legal. Los datos que contienen este símbolo hacen referencia a la fecha de fabricación Temperatura de almacenamiento recomendada

Fecha de vencimiento

Dispositivo médico para diagnóstico in vitro

Componente de reemplazo

Contiene componente de reemplazo

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Contenido del kit Holotype HLA-96/7 Configuración A y CE (REF:H32) o Configuración B y CE (REF:H34) Caja de componentes del cebador La caja de componentes del cebador proporciona soluciones específicas del cebador lista para usar para amplificación de RCP de largo alcance (Long Range PCR) de genes HLA A, B, C, DPB1, DQA1, DQB1 y DRB1. Además, contiene dos tipos de aditivos RCP (Potenciador 1 y Potenciador 2).

HLA-A

N.º de referencia P012

HLA-B

P022

96

220 µL

1

Rojo

HLA-C

P032

96

220 µL

1

Anaranjado

HLA-DRB1

P042

96

220 µL

1

Verde

HLA-DQB1 (grupo 3)

P122

96

220 µL

1

Azul

HLA-DQA1

P072

96

220 µL

1

Marrón

HLA-DPB1

P082

96

220 µL

1

Púrpura

Potenciador 1

E01

96

1100 µL

1

Transparente

Potenciador 2

E02

96

300 µL

1

Transparente

Mezcla del cebador

96

Volumen/ tubo 220 µL

Cantidad de tubos 1

Código de color Amarillo

Rxns

Caja de componentes de reactivos de preparación de la biblioteca La caja de componentes de preparación de la biblioteca contiene los reactivos para la preparación de la biblioteca (fragmentación, producir los extremos romos y adenilar los extremos de los amplicones y ligar las secuencias de adaptadores indexados) a partir de los amplicones de HLA. Reactivo Enzima de fragmentación (A)

N.º de referencia R11

96

Volumen/ tubo 278 µL

Cantidad de tubos 1

Código de color Amarillo

Rxns

Solución amortiguadora de fragmentación (B) Enzima reparadora de extremos (C) Solución amortiguadora reparadora de extremos (D) Enzima de ligación (E)

R21

96

278 µL

1

Rojo

R31

96

162 µL

1

Verde

R41

96

324 µL

1

Anaranjado

R51

96

324 µL

1

Azul

Solución amortiguadora de ligación (F)

R61

96

1800 µL

2

Negro

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Placa de adaptadores de 96 pocillos El componente de placa de adaptadores indexada de 96 pocillos contiene adaptadores NGS indexados listos para usar (oligonucleótidos de ADN bicatenario) en 5 µL de solución para la generación de bibliotecas individuales de NGS. La placa de adaptadores indexada de 96 pocillos contiene un tipo suficiente de adaptadores indexados para generar 96 bibliotecas NGS individuales y para identificar muestras en los procesos posteriores. Versión del kit

Reactivo

H32

Placa de adaptadores A (i1-96)

H34

Placa de adaptadores B (i97-192)

N.º de referencia N1 N2

Rxns

Vol/pocillo

96

5 µL

N.º de placas 1

96

5 µL

1

Libro de Excel Se proporciona un libro de Excel para respaldar el protocolo de Holotype HLA 96/7 con los cálculos, los diseños de placas, el mantenimiento de registros, la generación de hojas de muestra de MiSeq y mucho más. Si no tiene una copia, póngase en contacto con [email protected].

Software – Omixon HLA Twin Póngase con contacto con [email protected] para obtener los créditos de Omixon HLA Twin necesarios para la compra del kit Holotype HLA 96/7.

Aviso importante: Use los tres componentes del kit Omixon Holotype HLA 96/7 y el software Omixon HLA Twin en el mismo flujo de trabajo para constituir un flujo de trabajo para el uso de diagnóstico in vitro. Para conocer las limitaciones, consulte la Sección Advertencias y precauciones de uso del producto. Los componentes de reemplazo están disponible a pedido especial del usuario. Recuerde que Omixon proporciona el reemplazo de cajas de componentes, no de los viales individuales. Para obtener más información, consulte [email protected].

Envíos y almacenamiento Enviado en paquetes de hielo seco en cajas de envío de poliestireno extruido; debe almacenarse a -20 °C al momento de la llegada. Valide el control de temperatura y el proceso de monitoreo de sus congeladores y manténgalos a una temperatura regular. Los kits sin abrir son estables hasta la fecha de vencimiento del kit (que se indica en la etiqueta del kit) cuando se los almacena a -20 °C. Después de abrir el producto, se recomienda someter al producto a cuatro (4) ciclos de congelamiento/descongelamiento para garantizar la estabilidad del producto. Los kits abiertos serán estables hasta 3 meses cuando se los almacena a -20 °C.

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Advertencias y precauciones Limitaciones de uso del producto Para asegurar el mejor rendimiento posible, utilice el flujo de trabajo del kit Holotype HLA 96/7 y el software Omixon HLA Twin para la tipificación de HLA mediante NGS con los materiales, los reactivos y los equipos recomendados en la sección “Equipos y reactivos”. El usuario debe verificar y validar el uso de los materiales diferentes a aquellos identificados en la Sección “Equipos y reactivos”. No reconstituya ni diluya los reactivos en volúmenes diferentes a aquellos que se describen en estas IFU. No utilice un volumen inferior al de los reactivos, diferente al especificado en estas IFU. Estas actividades pueden conducir a errores de rendimiento. Omixon no puede brindar soporte en caso de problemas derivados por la falta de seguimiento de los pasos del protocolo que se describen en estas IFU. No utilice el producto si detecta daños en los componentes (viales rotos, placa, tapones faltantes, etc.).

Limitaciones conocidas del producto Consulte el documento “Guía de limitaciones conocidas del producto” para determinar las ambigüedades conocidas y las limitaciones conocidas del software respecto del producto Holotype HLA. Esta guía se entrega con las IFU, pero también la podrá encontrar en el sitio web de Omixon en Instrucciones de uso de MyHolotype/Support and Services/HLA Twin o podrá solicitarla a [email protected].

Información de seguridad Lea las secciones “Información de seguridad” y “Notas importantes” de los reactivos o los kits especificados en la Sección “Equipos, reactivos y suministros” antes de comenzar. Cuando trabaja con sustancias químicas, use siempre un ambo de laboratorio adecuado, guantes descartables y gafas protectoras. Para obtener más información, consulte las hojas de datos de seguridad (SDS) apropiadas disponibles en el proveedor de productos especificado. Para acceder a las generalidades de los componentes químicos de los reactivos del producto, consulte las SDS del kit Holotype HLA 96/7, disponible a pedido. Deseche los componentes del producto como desecho médico general.

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Parámetros de rendimiento Parámetros principales de rendimiento establecidos según la validación del producto.

HLA-A

HLA-B

HLA-DRB1

HLA-C

HLA-DPB1

HLA-DQA1

HLA-DQB1

Sensibilidad

99,054%

99,171%

98,335%

96,310%

98,818%

98,927%

95,724%

Especificidad

99,966%

99,982%

99,956%

99,863%

99,946%

99,881%

99,775%

Precisión

99,054%

99,171%

98,335%

96,310%

98,818%

98,927%

95,724%

Exactitud

99,935%

99,965%

99,915%

99,736%

99,897%

99,785%

99,572%

Reproducibilidad 100,00%

100,00%

99,28%

100,00%

99,28%

100,00%

99,28%

Repetitividad

100,00%

100,00%

100,00%

100,00%

100,00%

100,00%

100,00%

Asistencia técnica Para recibir asistencia general con este protocolo, póngase en contacto con [email protected]

Soporte telefónico: Estados Unidos | +1 (617) 500-0790 Europa | +36 70 574 8001 Resto del mundo | +1 (617) 500-0790

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Equipos, reactivos y suministros Recomendaciones técnicas y del equipo § Ciclador térmico con formato de 96 pocillos. § Fluorímetro de placas (o cualquier instrumento capaz de detectar fluorescencia en un formato de placa de 96 pocillos, para uso con el sistema de ADN bicatenario [ADNbc*] Promega QuantiFluor). § Pippin Prep (Cat n.º PIP0001) o Blue Pippin (Cat n.º BLU0001) de SAGE Science. § Instrumento de RCPc con formato de placa de 96 o 384 pocillos. § Fluorímetro Qubit (Cat n.º Q33216, Thermo Fisher Scientific) (opcional). § Illumina MiSeq (Cat n.º SY-410-1003) § Computadora de 64 bits con 4 núcleos y 16 GB de memoria RAM como mínimo. § Almacenamiento de datos a largo plazo (aproximadamente 2 TB de datos por MiSeq por año).

Recomendaciones del reactivo asociado § Kits de RCP de largo alcance de Qiagen (Cat n.º 206401, 206402 o 206403). § Cada muestra requiere 3,2 µL de Polimerasa taq. § El kit de RCP de largo alcance Cat n.º 206401 (20) contiene 8 µL de Polimerasa taq. § El kit de RCP de largo alcance Cat n.º 206402 (100) contiene 40 µL de Polimerasa taq. § El kit de RCP de largo alcance Cat n.º 206403 (250) contiene 100 µL de Polimerasa taq. § ExoSAP-IT de Affymetrix (Cat n.º 75001-200, 75001-1ML, 75001-4X-1ML o 75001-10ML). § Cada muestra agrupada necesita 4 µL de enzima ExoSAP-IT. § La Cat n.º 75001-200 contiene 200 µL de enzima ExoSAP-IT Express. § La Cat n.º 75001-1-ML contiene 1 mL de enzima ExoSAP-IT Express. § La Cat n.º 75001-4X-1ML contiene 4 mL de enzima ExoSAP-IT Express. § La Cat n.º 75001-10ML contiene 10 mL de enzima ExoSAP-IT Express. § Kit de cuantificación de biblioteca: Illumina/Universal de KAPA Biosystems (Cat. n.º KK4824). § Kit de ensayo Qubit dsDNA BR (Cat n.º Q32850 o Q32853) (opcional). § La Cat n.º Q32850 contiene 100 ensayos. § La Cat n.º Q32853 contiene 500 ensayos. § Sistema de ADNbc QuantiFluor de Promega (Cat n.º E2670). § Cuentas Agencourt AMPure XP de Beckman Coulter (Cat n.º A63880, A63881 o A63882). § Cada ciclo de Holotype HLA necesita como máximo 900 µL de cuentas AMPure XP. § La Cat n.º A63880 contiene 5 mL de cuentas AMPure XP. § La Cat n.º A63881 contiene 60 mL de cuentas AMPure XP. § La Cat n.º A63882 contiene 450 mL de cuentas AMPure XP. § Casete de gel, 1.5% agarosa, libre de tinción con estándar interno (Marcador K/R2), para Pippin Prep/Blue Pippin (Cat. n.º CDF1510 para Pippin Prep y BDF1510 para Blue Pippin). § Etanol de grado molecular (alcohol anhidro). § Agua de grado molecular (libre de desoxirribonucleasa y ribonucleasa). § Hidróxido de sodio. Omixon Holotype 96/7 CONFIGURACIÓN | Configuración A y CE, y Configuración B y CE | Instrucciones de uso v10. Para uso de diagnóstico in vitro Copyright© 2017, Omixon Biocomputing Ltd. Confidencial y propietario Página 13 │ 50



§ 1× solución amortiguadora TE (pH 8,0). § Kit reactivo de MiSeq de Illumina.

Capacidad del kit reactivo de MiSeq Kit reactivo de MiSeq de Illumina Ciclo estándar 500 (MS-102-2003)

Ciclo estándar 300 (MS-102-2002)

Ciclo micro 300 (MS-103-1002)

Ciclo nano 500 (MS-103-1003)

Ciclo nano 300 (MS-103-1001)

Tiempo Horas

Muestras 96/7

~39

96

~24

96

~19

28

~28

12

~17

6

Suministros recomendados § Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. § Tubos de microcentrífuga de baja retención de 1,5 mL. § Tubos de microcentrífuga de baja retención de 2,0 mL (se recomiendan los tubos Eppendorf DNA LoBind Cat n.º 022431048). § Tubos de pared delgada de 0,5 mL para instrumento Qbit (se recomiendan los tubos de ensayo Qubit Cat n.º Q32856). § Pipetas de volumen ajustable (capacidad de 1,0 a 1000 µL). § Pipetas de volumen ajustable de 8 canales (capacidad de 1,0 a 100 µL). § Placas de 96 pocillos compatibles con el ciclador térmico. § Placas óptimas de 96 pocillos compatibles con el fluorímetro de placas. § Placas de 96 pocillos compatibles con el instrumento de RCPc. § Sellos de placa para uso general. § Sellos de placa compatibles con los cicladores térmicos (probados para RCP de largo alcance). § Sellos de placas ópticas compatibles con el instrumento RCPc (opcionales). § Pie magnético compatible con los tubos de microcentrífuga de 2 mL. § Bastidores enfriadores de 96 pocillos (2 unidades). § Tubos cónicos de 50 mL. § Depósitos de 50 mL.

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Uso previsto El producto Holotype HLA 96/7 – Configuración A y CE, y Configuración B y CE (denominado “Holotype HLA”) es una combinación de reactivos de ensayo de diagnóstico in vitro y software de análisis de datos (Omixon HLA Twin™) y tiene como finalidad la identificación y definición de antígenos leucocitarios humanos de Clase I y Clase II (HLA) para uso en tipificación de HLA, mediante el uso de la plataforma Illumina® MiSeq Next Generation Sequencing. Holotype HLA proporciona información de histocompatibilidad humana de la Clase I del locus de HLA (A, B y C) y la Clase II (DPB1, DQA1, DQB1 y DRB1), mediante ADN genómico humano. Omixon Holotype 96/7 CONFIGURACIÓN | Configuración A y CE, y Configuración B y CE | Instrucciones de uso v10. Para uso de diagnóstico in vitro Copyright© 2017, Omixon Biocomputing Ltd. Confidencial y propietario Página 15 │ 50



El software Omixon HLA Twin™ incluido en el producto Holotype HLA tiene como finalidad interpretar y emparejar los datos de secuenciación generados en el sistema Illumina® MiSeq, que deriva en tipificación de HLA a nivel alélico de un paso, altamente precisos, con muy baja tasa de ambigüedad en el nivel 2 de campo. El producto Holotype HLA ha sido diseñado para uso diagnóstico in vitro por parte del personal de la atención médica profesional, tales como técnicos y médicos de laboratorio, entrenados en tipificación de HLA en laboratorios de diagnóstico acreditados por EFI o ASHI o que pueden trabajar según las especificaciones EFI y ASHI.

Nota importante antes de comenzar Aislamiento de ADN genómico recomendado El ADN genómico humano se debe preparar mediante kits de preparación de ADN comercialmente disponibles y que generen buenas pruebas para garantizar la uniformidad de la preparación. Independientemente del enfoque, se debe determinar exactamente la concentración y la pureza para obtener un rendimiento robusto del ensayo. El ADN debe estar libre de sustancias contaminantes que puedan afectar la posterior amplificación, preparación de la biblioteca y pasos de secuenciación (por ejemplo, alcohol, sales, detergentes, formaldehído y heparina). La sangre no se debe recolectar en tubos heparinizados y no se deben utilizar las muestras de sangre de los pacientes en tratamiento con heparina, ni las muestras lipémicas o hemolizadas. El ADN genómico preparado se puede usar de inmediato si se prepara en agua libre de nucleasa o se almacena durante períodos prolongados a -20 °C o menos. Recomendamos utilizar agua para la preparación de ADNg ya que el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) en la solución amortiguadora de TE puede inhibir las reacciones de reacción de cadena polimerasa (RCP) de largo alcance. Se deben evitar congelar y descongelar el producto reiteradamente para reducir la degradación. Se recomienda utilizar una concentración de 20-30 ng/µL de ADN para proporcionar 100-150 ng de ADN genómico por amplificación de RCP. Recomendamos especialmente utilizar un método de cuantificación basado en la fluorescencia para determinar el ADNg. Se recomienda especialmente utilizar un índice de absorbancia con valores de 260 nm/280 nm y 260 nm/230 nm de 1,7–2. Para la amplificación de HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DPB1, HLA-DQA1 y HLA-DQB1, se necesitan 0,8-1,2 µg de ADNg.

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Principio del método Durante muchos años, la comunidad de HLA ha estado trabajando en un método que permita identificar con claridad el amplio polimorfismo de los genes de HLA y sus productos genéticos. El evento de RCP, en combinación con otras tecnologías (secuenciación de Sanger, SSOP, SSP, Luminex) proporcionaron una fórmula para manejar de manera significativa la detección de polimorfismos de HLA; no obstante, se observaron diversas limitaciones que continúan inhibiendo nuestra capacidad para caracterizar los genes HLA de manera integral. Las tecnologías que se desarrollaron durante los últimos años de manera acumulativa mediante la denominada Next Generation Sequencing (NGS), han brindado nuevas oportunidades para permitir la completa caracterización de los genes HLA de manera haploide. La NGS tiene dos características distintivas: 1) secuenciación clonal de fragmentos de ADN y 2) rendimiento extremadamente elevado. La NGS proporciona la capacidad para dividir en fases los polimorfismos y, por lo tanto, eliminar todas las ambigüedades y proporciona la tipificación de HLA a nivel de campo tres o cuatro sin análisis reflexivo, que permite introducir una solución potencialmente total al problema de tipificación de HLA. El protocolo que aquí se describe aprovecha esta tecnología y combina una amplificación de RCP de largo alcance de los genes HLA con secuenciación en la plataforma Illumina MiSeq. Más específicamente, los genes A, B, C, DQA1 y DQB1 de HLA se amplifican en toda la longitud de la codificación, e incluye los elementos de las regiones no traducidas de los extremos 5’ y 3’, mientras que DRB1 se amplifica desde intron 1 a intron 4 y DPB1 se amplifica de intron 1 a 3’ en la región no traducida. Posteriormente, los amplicones se procesan mediante una serie de pasos que: 1. Fragmentan los amplicones a un tamaño apropiado para la secuenciación en la plataforma de Illumina, 2. extremos romos y los extremos de los amplicones fragmentados. 3. Ligar las secuencias de adaptadores que se utilizan en todo el proceso de MiSeq para capturar, amplificar y secuenciar el ADN. Los adaptadores incluyen además un índice que es una secuencia breve, única en cada adaptador, que identifica los orígenes de la biblioteca (muestra/locus). Después de agrupar las bibliotecas indexadas y después de realizar la selección y cuantificación, la muestra se carga en MiSeq para la secuenciación. El proceso toma entre 3 y 5 días, según la selección de la celda de flujo en la plataforma de Illumina. A continuación se muestra el resumen de los pasos del protocolo:

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Resumen de pasos

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Glosario/Definiciones § Placa de amplicones: nombre alternativo a placa de amplificación. § Placa de cuantificación de amplicones: placa de 96 pocillos compatible con el fluorímetro de placas donde se cuantifican los amplicones diluidos. § Placa de amplificación: placa de RCP de 96 pocillos utilizada para amplificar los locus de HLA. § Biblioteca final: biblioteca que contiene todas las bibliotecas de muestra lista para secuenciación en un único proceso de MiSeq. § Placa de reacción: placa donde se llevan a cabo las reacciones secuenciales que fragmentan, reparan los extremos y ligan los adaptadores indexados en las bibliotecas de muestra. § Placa de reactivos: placa utilizada para fijar una alícuota de los reactivos varios utilizados para preparar las bibliotecas. § Biblioteca de muestras: biblioteca preparada mediante la combinación (agrupación) de todos los locus de HLA para una muestra dada. § Placa de amplicones agrupados: placa que contiene una biblioteca de muestras (todos los locus combinados) antes de colocarla en los pocillos. § Placa de cuantificación de estándares: placa de 96 pocillos compatible con el fluorímetro de placas donde los estándares de ADN se colocan para permitir la cuantificación de amplicones.

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Paso 1 – Preparación de la mezcla maestra de amplificación de HLA Duración: ~1 hora y 45 minutos Este paso tiene como finalidad preparar mezclas maestras específicamente dellocus para amplificar cada locus de HLA objetivo de manera individual. Los locus amplificados por este protocolo son HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DPB1, HLA-DQA1 y HLA-DQB1. Nota: las mezclas maestras preparadas en este paso contienen todos los reactivos para amplificación, excepto la Polimerasa taq.

Lista de reactivos Elemento Mezcla del cebador HLA-A Mezcla del cebador HLA-B Mezcla del cebador HLA-C Mezcla del cebador HLA-DRB1 Mezcla del cebador HLA-DPB1 Mezcla del cebador HLA-DQA1 Mezcla del cebador HLA-DQB1 (grupo 3) Potenciador 1 Potenciador 2 Solución amortiguadora de RCP de largo alcance (10×) dNTPs (10 mM cada uno) H2O de grado molecular

Almacenamiento -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C

Suministrado por Omixon Omixon Omixon Omixon Omixon Omixon Omixon Omixon Omixon Qiagen Qiagen Qiagen

Protocolo 1.1 – Quitar del almacenamiento todas las mezclas del cebador, el Potenciador 1 y 2, los dNTPs en la solución amortiguadora de RCP de largo alcance (10×) y descongelar a temperatura ambiente. 1.2 – Preparar el potenciador combinado: agregar 132 µL de Potenciador 2 en el tubo del Potenciador 1. Cambiar el nombre del tubo del Potenciador 1 a Potenciador Combinado. 1.3 – Preparar la mezcla maestra para cada mezcla del cebador según las tablas a continuación:

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Mezcla maestra: HLA-A, B, C, DRB1, DPB1 y DQA1 Reactivo Mezcla del cebador Solución amortiguadora de RCP de largo alcance (10×) Mezcla de dNTP (10 mM cada uno) H2O de grado molecular Volumen Total

Volumen/muestra/locus 2 µL 2,5 µL

Volumen/96 muestras/locus 204 µL 255 µL

1,25 µL 13,85 µL 19,6 µL

127,5 µL 1412,7 µL 1999,2 µL

Volumen/muestra/locus 2 µL 2,5 µL

Volumen/96 muestras/locus 204 µL 255 µL

1,25 µL 5,6 µL 7,85 µL 19,2 µL

127,5 µL 571,2 µL 800,7 µL 1958,4 µL

Mezcla maestra: Grupo 3 de HLA-DQB1 Reactivo Mezcla del cebador Solución amortiguadora de RCP de largo alcance (10×) Mezcla de dNTP (10 mM cada uno) Potenciador combinado H2O de grado molecular Volumen Total

1.1 – Coloque cada mezcla maestra en el vortex y agite durante 1 segundo. Coloque las mezclas maestras sobre hielo. 1.2 – Diluya todos los ADNg a una concentración de 30 ng/µL (el volumen mínimo es 45 µL).



Nota: Holotype HLA incluye suficientes reactivos para 96 reacciones más un volumen adicional para compensar la pérdida por pipeta y los errores de amplificación.

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Paso 2: amplificación HLA de clase I y II Duración: ~7 horas y 50 minutos El Paso 2 tiene como finalidad ampliar los locus HLA. Se han optimizado las amplificaciones de HLA Clase I y Clase II mediante dos juegos separados de condiciones de RCP. Después de completar las reacciones de RCP, la amplificación se verifica mediante electroforesis en gel de agarosa (opcional).



Consejo rápido: la electroforesis del gel de agarosa (paso 2.5), si bien es recomendado, no es requerido para completar el protocolo de Holotype HLA de forma exitosa. Cuando los amplicones están cuantificados (Paso 3), cualquier concentración por encima de 50 ng/µL se considera una amplificación correcta. La electroforesis en gel de agarosa es un paso de control de calidad importante y no se debe omitir sin experiencia suficiente con el protocolo completo de Holotype HLA.

Lista de reactivos Elemento Mezcla maestra de HLA-A Mezcla maestra de HLA-B Mezcla maestra de HLA-C Mezcla maestra de HLA-DRB1 Mezcla maestra de HLA-DPB1 Mezcla maestra de HLA-DQA1 Mezcla maestra HLA-DQB1 (grupo 3) Polimerasa Taq ADNg H2O de grado molecular

Almacenamiento -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C 4 °C 20 °C

Suministrado por Paso 1 Paso 1 Paso 1 Paso 1 Paso 1 Paso 1 Paso 1 Qiagen Usuario Usuario

Protocolo 2.1 – Retirar la polimerasa taq del almacenamiento, agitarla y agregarla a cada mezcla maestra según las tablas a continuación; para ello, enjuague bien las puntas de las pipetas y tome con una pipeta:

Mezcla maestra cargada de polimerasa taq: HLA-A, B, C, DRB1, DPB1 y DQA1 Reactivo Mezcla maestra del Paso 1 Polimerasa Taq Total

Volumen/muestra/locus 19,6 µL 0,4 µL 20 µL

Volumen/96 muestras/locus 1999,2 µL 40,8 µL 2040 µL

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Mezcla maestra cargada de polimerasa taq: Grupo 3 de HLA-DQB1 Reactivo Mezcla maestra del Paso 1 Polimerasa Taq Total

Volumen/muestra/locus 19,2 µL 0,8 µL 20 µL

Volumen/96 muestras/locus 1958,4 µL 81,6 µL 2040 µL

2.2 – Coloque brevemente en un vortex y agite toda la polimerasa taq cargada en las mezclas maestras. Determine la alícuota de 20 µL de cada mezcla maestra cargada con polimerasa taq en pocillos separados de 96 placas de RCP.



Nota: La amplificación de Clase I y Clase II se optimizan mediante dos condiciones de RCP diferentes; por lo tanto, las mezclas maestras de la Clase I y la Clase II no necesitan estar en la misma placa.

2.3 – Agregue 5 µL de cada ADNg diluido en el pocillo apropiado de las placas preparadas en el paso anterior. Mezcle dentro de la pipeta. Luego selle con un sello térmico e inspeccione visualmente cada pocillo. Agite todas las placas de amplificación en una centrífuga. 2.4 – Coloque las placas de amplificación en cicladores térmicos y ejecute los programas de la amplificación de Clase I y Clase II según las tablas a continuación:

Amplificación de clase I (HLA-A, B y C) Cantidad de ciclos 1 35 1 1



Temperatura 95 °C 95 °C 65 °C 68 °C 68 °C 4 °C

Tiempo 3 minutos 15 segundos 30 segundos 5 minutos 10 minutos ∞

Amplificación de clase II (HLA-DRB1, DPB1, DQA1 y DQB1) Cantidad de ciclos 1 35 1 1

Temperatura 95 °C 93 °C 60 °C 68 °C 68 °C 4 °C

Tiempo 3 minutos 15 segundos 30 segundos 9 minutos 10 minutos ∞



Nota: Para verificar el éxito de la amplificación, procese 2 µL de cada amplicón en gel de agarosa 2% estándar a 250 durante 30 minutos. (Opcional)

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Tamaños esperados de los amplicones Locus de HLA HLA-A, B y C HLA-DRB1 HLA-DPB1 HLA-DQA1 HLA-DQB (grupo 3)

Tamaño esperado de los amplicones (kb) ~3 ~4,3 ~6,7 ~6 ~6,6



Punto de parada seguro. Los amplicones se pueden almacenar a 4 °C durante toda la noche o a -20 °C durante más tiempo.

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Paso 3: cuantificación y normalización de amplicones (mediante el uso de fluorímetro de placas) Duración: ~1 hora y 50 minutos Se recomienda llevar a cabo la cuantificación y normalización de amplicones para garantizar aportes precisos al paso de preparación de la biblioteca (opcional). La concentración de amplicón se mide mediante el sistema de ADNbc QuantiFluor que contiene una tinta fluorescente de unión al ADN estándar para llevar a cabo una cuantificación sensible de pequeñas cantidades de ADN bicatenario (ADNbc). Para obtener instrucciones acerca de cómo realizar la cuantificación de amplicón con un equipo RCPq, consulte el Apéndice 2.



Consejo: si se recomienda la cuantificación de amplicones, no es necesario completar correctamente el protocolo de Holotype HLA. Para normalizar los amplicones, no es necesario efectuar una medición precisa de la concentración de amplicones. En cambio, se puede usar un cálculo estimado de las concentraciones de amplicones en función de la experiencia o la electroforesis de gel de agarosa. No se debe omitir la cuantificación de amplicones sin tener experiencia uniforme en el protocolo completo de Holotype HLA.

Lista de reactivos Elemento Placa de amplificación de clase I Placa de amplificación de clase II ADN Lambda estándar (100 ng/µL) Tinta de ADNbc QuantiFluor (200×) 20× solución amortiguadora TE (pH 7,5) H2O de grado molecular ExoSAP-iT Express

Almacenamiento 4 °C 4 °C 4 °C 4 °C 4 °C 20 °C a 25 °C -20 °C

Suministrado por Paso 2 Paso 2 Promega Promega Promega Usuario Affymetrix

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Protocolo 3.1 – Preparar los estándares del ADN mediante dilución seriada del ADN Lambda estándar (100 ng/µL) que se proporciona en el kit de QuantiFluor según la tabla de dilución a continuación. Etiqueta en el tubo Estándar 1 Estándar 2 Estándar 3 Estándar 4 Estándar 5 Estándar 6 En blanco

ADN de entrada ADN Lambda Estándar 1 Estándar 2 Estándar 3 Estándar 4 Estándar 5 En blanco

Volumen de ADN (µL) 7,5 µL 250 µL 250 µL 250 µL 250 µL 250 µL 0 µL

Volumen 1x TE (µL) 492,5 µL 250 µL 250 µL 250 µL 250 µL 250 µL 250 µL

Concentración final (ng/µL) 1,5 ng/µL 0,75 ng/µL 0,38 ng/µL 0,19 ng/µL 0,09 ng/µL 0,05 ng/µL 0 ng/µL

3.2 – Prepare las placas de cuantificación de amplicones (vea las figuras complementarias). Divida en alícuotas 99 µL de solución amortiguadora TE 1x en los pocillos de una placa óptica de 96 pocillos para el número total de amplicones que debe cuantificarse. 3.3 – Agregue 1 µL de amplicones desde los pocillos correspondiente de las placas de amplicones a los pocillos individuales de las placas de cuantificación de amplicones. Mezcle dentro de la pipeta. 3.4 – Prepare una solución de trabajo de tinte QuantiFluor 1× con la siguiente fórmula: 0,5 µL de tinte QuantiFluor (200X) + 99,5 µL de solución amortiguadora TE 1×. Prepare suficiente solución de trabajo de tinte QuantiFluor 1× de tal forma que cada muestra (total de muestras en las placas de amplicones) y el estándar (14 en total) reciban una alícuota de 100 µL. 3.5 – Prepare una placa de cuantificación de estándares y placas de cuantificación de amplicones. Divida en alícuotas 100 µL de la solución de trabajo de tinte QuantiFluor 1× a los pocillos de la placa óptica de 96 pocillos que será la placa de cuantificación de estándares y a las placas de cuantificación de amplicones del Paso 3.2. 3.6 – Con los estándares preparados arriba, agregue 100 µL de cada estándar, por duplicado, en los pocillos individuales de la placa de cuantificación de estándares (14 pocillos en total). Mezcle dentro de la pipeta. 3.7 – Agite bien en vórtice para mezclar y centrifugue. 3.8 – Procese la placa de cuantificación de estándares en el fluorímetro de placa seguido de las placas de cuantificación de amplicones. 3.9 – Calcule la concentración de ADN en las placas de cuantificación de amplicones con datos RFU generados por el fluorímetro de placa. Consulte la pestaña Dilution (Dilución) en el libro de ejercicios suministrado para obtener asistencia con los cálculos. 3.10 – Diluya ADN en las placas de amplicones con H2O de grado molecular para que la concentración final de ADN sea de aproximadamente 67 ng/µL. § Si la concentración de ADN es de 150 ng/µL o mayor: agregue 25 µL de H2O Omixon Holotype 96/7 CONFIGURACIÓN | Configuración A y CE, y Configuración B y CE | Instrucciones de uso v10. Para uso de diagnóstico in vitro Copyright© 2017, Omixon Biocomputing Ltd. Confidencial y propietario Página 26 │ 50



§ Si la concentración de ADN es de 100 a 150 ng/µL: agregue 10 µL de H2O § Si la concentración de ADN es de menos de 100 ng/µL: no agregue H2O

Agrupación de amplicones 3.11 – Agrupe todos los locus de cada muestra en una sola placa de agrupación de amplicones. Combine los volúmenes indicados para cada locus como se indica en la siguiente tabla para obtener un volumen final de 35 µL: Locus de HLA A B C DRB1 DPB1 DQA1 DQB1 grupo 3

Volumen agrupado 5 µL 5 µL 5 µL 5 µL 5 µL 5 µL 5 µL

3.12 – Agregue 4 µL de ExoSAP-iT Express en cada biblioteca de muestras. Enjuague las puntas de las pipetas por medio de pipeteado. Selle la placa con un sello térmico y centrifugue. 3.13 – Coloque la placa de amplicones agrupados en un ciclador térmico y ejecute el siguiente programa:

ExoSAP-IT Purificación de RCP Expresa Cantidad de ciclos 1 1 1

Temperatura 37 °C 80 °C 4 °C

Tiempo 4 minutos 1 minuto ∞



Punto de parada seguro. Los amplicones se pueden almacenar a 4 °C durante toda la noche o a -20 °C durante más tiempo.

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Paso 4: Preparación de la biblioteca Duración: ~3 horas Durante este paso, los amplicones agrupados se preparan para secuenciarlos en el Illumina MiSeq. Los amplicones se fragmentan enzimáticamente, los extremos se reparan y se adenilan, y los adaptadores indexados se ligan a los extremos. Las bibliotecas luego se agrupan seguidas de un solo paso de limpieza y concentración que se realiza con esferas AMPure XP.



Nota: Omixon recomienda volúmenes mayores que lo necesario para 96 muestras, porque muchas de las enzimas y soluciones amortiguadoras son viscosas, lo que genera un exceso de pipeteado.

Lista de reactivos Elemento Placa de amplicones agrupados Enzima de fragmentación (A) Solución amortiguadora de fragmentación (B) Enzima reparadora de extremos (C) Solución amortiguadora reparadora de extremos (D) Enzima de ligación (E) Solución amortiguadora de ligación (F) Placa de adaptadores Esferas AMPure XP 80% Etanol (preparado fresco) H2O de grado molecular

Almacenamiento 4 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C 4 °C 20 °C a 25 °C 20 °C a 25 °C

Suministrado por Paso 3 Omixon Omixon Omixon Omixon Omixon Omixon Omixon Beckman Coulter Usuario Usuario

Protocolo 4.1 – Encienda el ciclador térmico. Verifique que la tapa calefaccionada tome temperatura.



Nota: Asegúrese de agitar en vórtice la enzima de fragmentación (A) por completo antes de usarla.

4.2 – Prepare la mezcla maestra de fragmentación de acuerdo con la siguiente tabla:

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Mezcla maestra de fragmentación Reactivo Enzima de fragmentación (A) Solución amortiguadora de fragmentación (B) Volumen Total

Volumen por biblioteca (µL) 2 µL 2 µL

Volúmenes recomendados para 96 bibliotecas (µL) 220,8 µL 220,8 µL

Código de color Amarillo Rojo

4 µL

441,6 µL



4.3 – Prepare una placa de reactivos: coloque una nueva placa de 96 pocillos de RCP en un estante enfriador de RCP y divida en alícuotas una cantidad igual de la mezcla maestra de fragmentación en cada pocillo de una sola columna.



Nota: La reacción de fragmentación se ha diseñado para brindar ADN de un tamaño ideal para secuenciarlo en el Illumina MiSeq. Es importante mantener los reactivos fríos hasta que la reacción comience en el ciclador térmico para evitar la fragmentación excesiva. Se recomienda usar pipetas de varias puntas para minimizar las oportunidades de fragmentación excesiva.

4.4 – Centrifugue la placa de amplicones combinados por 10 segundos, y colóquela sobre hielo o un bloque frío. 4.5 – Prepare una placa de reacción: coloque una placa fresca de 96 pocillos de RCP en un bloque frío de RCP. 4.6 – Agregue 4 µL de mezcla maestra de fragmentación de la placa de reactivos en los pocillos de la placa de reacción en forma correspondiente con las muestras de la placa de amplicones combinados. Se recomienda usar una pipeta de varias puntas. 4.7 – Transfiera 16 µL de amplicón desde la placa de amplicones agrupados al pocillo correspondiente de la placa de reacción con una pipeta de varias puntas. Mezcle dentro de la pipeta. 4.8 – Cubra la placa de reacción con un sello térmico y centrifugue durante 10 segundos. 4.9 – Incube la placa de reacción en un ciclador térmico con el siguiente programa:

Programa de fragmentación Cantidad de ciclos 1 1 1

Temperatura 37 °C 70 °C 4 °C

Tiempo 10 minutos 15 minutos ∞



Punto de parada seguro. Las bibliotecas pueden almacenarse a 4 °C durante la noche o a -20 °C por más tiempo.

4.10 – Prepare la mezcla maestra de reparación de extremos de acuerdo con la siguiente tabla: Omixon Holotype 96/7 CONFIGURACIÓN | Configuración A y CE, y Configuración B y CE | Instrucciones de uso v10. Para uso de diagnóstico in vitro Copyright© 2017, Omixon Biocomputing Ltd. Confidencial y propietario Página 29 │ 50



Mezcla maestra de reparación de extremos Reactivo H2O de grado molecular Enzima reparadora de extremos (C) Solución amortiguadora reparadora de extremos (D) Volumen Total

Volumen por biblioteca (µL) 1,25 µL 1,25 µL 2,5 µL 5 µL

Volúmenes recomendados Código de para 96 bibliotecas (µL) color 139,2 µL 139,2 µL Verde 278,4 µL Anaranjado µL



4.11 – Divida en alícuotas una cantidad igual de mezcla maestra de reparación de extremos en una sola columna sin usar de la placa de reactivos. 4.12 – Centrifugue la placa de reacción (que contiene las muestras fragmentadas) durante 10 segundos. Agregue 5 µL de mezcla maestra de reparación de extremos desde la placa de reactivos en cada pocillo de la placa de reacción. Se recomienda usar una pipeta de varias puntas. Mezcle dentro de la pipeta. 4.13 – Cubra la placa de reacción con un sello térmico y centrifugue durante 10 segundos. 4.14 – Incube la placa de reacción en un ciclador térmico con el siguiente programa:

Programa de reparación de extremos Cantidad de ciclos 1 1 1

Temperatura 20 °C 70 °C 4 °C

Tiempo 30 minutos 5 minutos ∞



Punto de parada seguro. Las bibliotecas pueden almacenarse a 4 °C durante la noche o a -20 °C por más tiempo.

4.15 – Retire la placa de adaptadores indexados del almacenamiento y descongele a temperatura ambiente después de que el programa de reparación de extremos comience en el ciclador térmico. Cuando la placa de adaptadores llegue a la temperatura ambiente, centrifugue durante 3 minutos a 3000 rpm. 4.16 – Quite con cuidado el sello de la placa de adaptadores. No sacuda la placa de adaptadores una vez que se retiró el sello para evitar la contaminación cruzada. 4.17 – Transfiera todo el volumen de cada pocillo desde la placa de reacción (25 µL) al pocillo correspondiente de la placa de adaptadores.

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Nota: Si NO se va a usar toda la placa de adaptadores, puede usarse solamente el número de adaptadores necesarios. Corte el sello de la placa entre los pocillos que se van a usar y los pocillos que se conservarán. Quite con cuidado el sello de la placa de adaptadores, dejando el sello colocado sobre las placas que se conservarán. a. Transfiera 25 µL desde cada muestra de reparación de extremos de la placa de reacción a un pocillo de la placa de adaptadores, mezclando bien con una pipeta. b. Transfiera la muestra completa desde la placa de adaptadores al pocillo original de la placa de reacción.



c. Vuelva a sellar la placa de adaptadores y vuelva a ponerla en -20 °C. Use la placa de reacción en lugar de la placa de adaptadores para los pasos restantes del manual. 4.18 – Prepare la mezcla maestra de ligación. Prepare suficiente mezcla maestra de ligación para cada muestra.

Mezcla maestra de ligación Reactivo Enzima de ligación (E) Solución amortiguadora de ligación (F) Volumen Total

Volumen (µL) 2,5 µL 30 µL 32,5

Volúmenes recomendados para 96 bibliotecas (µL) 252,5 µL 3030 µL 3282,5 µL

Código de color Azul Negro

4.19 – Divida en alícuotas la mezcla maestra de ligación en 3 columnas sin usar de la placa de reactivos. Se recomienda usar una pipeta de varias puntas. 4.20 – Agregue 32,5 µL de mezcla maestra de ligación en cada pocillo de la placa de reacción. Se recomienda usar una pipeta de varias puntas. Mezcle dentro de la pipeta. 4.21 – Cubra la placa de reacción con un sello térmico y centrifugue durante 10 segundos. 4.22 – Incube la placa de reacción en el ciclador térmico con el siguiente programa:

Programa de ligación Cantidad de ciclos 1 1 1

Temperatura 25 °C 70 °C 4 °C

Tiempo 10 minutos 10 minutos ∞



Punto de parada seguro. Las bibliotecas pueden almacenarse a 4 °C durante la noche o a -20 °C por más tiempo.

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Agrupamiento y purificación de biblioteca 4.23 – Permita que las esferas AMPure XP lleguen a temperatura ambiente. Asegúrese de que sean homogéneas (sin grumos ni gránulos). Prepare 5 mL de 80% etanol (4 mL EtOH + 1 mL H2O) recién hecho. 4.24 – Para crear la Biblioteca, combine una alícuota de cada amplicón agrupado, ahora una Biblioteca de muestras específica, en un único tubo de microcentrífuga de baja retención de 2,0 mL. I.

Para 16 muestras o más: calcule la cantidad de cada Biblioteca de muestras para agruparlas como una única Biblioteca con un volumen total de 900 µL. Divida 900 µL entre el número de bibliotecas de muestras. Este el volumen de alícuota que debe tomarse de cada biblioteca de muestras y pipetearse en la Biblioteca. Para menos de 16 muestras: transfiera 60 µL de cada biblioteca de muestras a una Biblioteca.

II.

4.25 – Agregue 900 µL de esferas AMPure XP al tubo de la Biblioteca. Agite bien con el vórtice y centrifugue brevemente. No permita que las esferas se separen. Incube la biblioteca por 10 minutos a temperatura ambiente.



Nota: Si hay menos de 900 µL de biblioteca en la agrupación final, agregue una cantidad equivalente de esferas AMPure XP. Debe haber una relación 1:1 de agrupación final y de esferas AMPure XP.

4.26 – Coloque el tubo de biblioteca en un soporte magnético e incube durante 10 minutos. 4.27 – Con el tubo en el soporte magnético, retire y descarte con cuidado el sobrenadante del tubo de la biblioteca, sin tocar las esferas. 4.28 – Con el tubo en el soporte magnético, agregue aproximadamente de 1,5 a 2 mL de etanol 80% preparado fresco al tubo de la biblioteca. El volumen agregado de etanol debe ser suficiente para que cubra las esferas. Nota: Aplique el etanol al costado del tubo sin esferas. 4.29 – Incube el tubo de la biblioteca a temperatura ambiente durante 30 segundos; después, retire y descarte con cuidado el sobrenadante. 4.30 – Repita los pasos 4.28 y 4.29. 4.31 – Centrifugue rápidamente el tubo de la biblioteca y vuelva a colocarlo en el soporte magnético con la tapa abierta. Retire el etano residual con una pipeta. No toque las esferas.

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Nota: Asegúrese de que el gránulo de la esfera no contiene alcohol residual. Esto puede requerir que se gire el tubo en el soporte magnético para quitar el etanol sin perturbar el gránulo de la esfera.

4.32 – Permita que las esferas se sequen con el aire durante 5 a 8 minutos en el soporte magnético hasta el que gránulo de la esfera quede seco. 4.33 – Quite el tubo de la biblioteca del soporte magnético y eluya la biblioteca con 31 µL de agua de grado molecular. No deje que la punta de la pipeta toque las esferas, porque quedarán pegadas a ella. 4.34 – Agite en vórtice la biblioteca para volver a poner las esferas completamente en suspensión. Centrifugue brevemente si quedan algunas gotitas en las paredes laterales. Asegúrese de que las esferas queden en suspensión. 4.35 – Incube la biblioteca a temperatura ambiente durante 2 minutos. 4.36 – Coloque el tubo de la biblioteca sobre el soporte magnético durante 2 minutos. 4.37 – Recolecte la biblioteca: manteniendo el tubo final de la Biblioteca en el soporte magnético, recolecte 31 µL del sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga de baja retención de 1,5 mL.



Punto de parada seguro. Las bibliotecas pueden almacenarse a -20 °C por períodos extensos de tiempo.

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Paso 5: Selección del tamaño de la biblioteca Duración: ~1 hora El paso 5 hace que la biblioteca avance desde el paso 4 y realiza la selección del tamaño con el Pippin Prep. El Pippin Prep puede seleccionar automáticamente un rango de tamaños de fragmentos de ADN y eluirlos en una cámara de recolección. Nota: puede usarse Blue Pippin en lugar de Pippin Prep. Consulte el Apéndice 1 para ver las Instrucciones de uso del Pippin Prep.

Lista de reactivos Elemento Casette con gel de agarosa 1,5%, sin tinte Solución de carga de Pippin/mezcla marcadora (etiquetada K) Biblioteca agrupada

Almacenamiento 20 °C a 25 °C 4 °C 4 °C

Suministrado por Sage Science Sage Science Paso 4

Nota: Se usa el Marcador K con el Pippin Prep. El Blue Pippin usa el Marcador R2.

Protocolo 5.1 – Haga que la solución de carga de Marcador k llegue a la temperatura ambiente. 5.2 – Combine 31 µL del grupo con 10 µL de la solución de carga de Marcador k. 5.3 – Mezcle agitando el vortex y centrifugue. 5.4 – Configure el Pippin Prep para que recoja fragmentos de ADN de entre 650 y 1300 bps. Cargue la muestra de 40 µL en el puerto de muestras y procese. El tiempo de procesamiento dura de 45 a 50 minutos. 5.5 – Recolecte todo el contenido (aproximadamente 40 µL) del puerto de elución del Pippin Prep y transfiéralo a un nuevo tubo de microcentrífuga de baja retención de 1,5 mL. Esta es la biblioteca de tamaño seleccionado.



Punto de parada seguro. Las bibliotecas pueden almacenarse a -20 °C por períodos extensos de tiempo.

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Paso 6: Cuantificación de biblioteca con un instrumento de RCPc Duración: ~1 hora y 15 minutos Es necesario cuantificar la biblioteca seleccionada por tamaño a fin de usar en forma óptima el resultado del secuenciador Illumina MiSeq. La concentración de la biblioteca seleccionada por tamaño puede medirse con precisión por medio de RCPc. De manera opcional, usted puede usar el kit Qubit dsDNA BR y una máquina Qubit para medir la concentración de la biblioteca. Para este protocolo, consulte el Apéndice 3.

Lista de reactivos Elemento 10 x Premezcla del cebador Illumina 2x Mezcla maestra KAPA SYBR FAST de RCPc Est. 1 (20,00 pM) Est. 2 (2,00 pM) Est. 3 (0,20 pM) Est. 4 (0,02 pM) Estándares de ADN de Illumina H2O de grado molecular 1× solución amortiguadora TE (pH 8,0). Biblioteca de tamaño seleccionado

Almacenamiento -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C 20 °C a 25 °C 20 °C a 25 °C 4 °C

Suministrado por KAPA Biosystems KAPA Biosystems KAPA Biosystems KAPA Biosystems KAPA Biosystems KAPA Biosystems KAPA Biosystems Usuario Usuario Paso 5

Protocolo 1

– Prepare la mezcla del cebador de RCPc con la premezcla del cebador 10× Illumina y las 2× mezclas maestras KAPA SYBR FAST de RCPc:



Nota: Los reactivos del kit KAPA SYBR FAST de RCPc (mezcla maestra de RCPc, premezcla del cebador y soluciones ROX) se combinan durante el primer uso del kit. Esta solución combinada es estable por al menos 30 ciclos de congelamiento/ descongelamiento. Siga la documentación de KAPA para determinar si se recomienda ROX para su instrumento de RCPc.

Mezcla del cebador RCPc Reactivo 10 x Premezcla del cebador Illumina 2x Mezcla maestra KAPA SYBR FAST de RCPc Volumen Total

Volumen (mL) 1 mL 5 mL 6 mL

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2

– Prepare la mezcla maestra de RCPc.

Mezcla maestra de RCPc Reactivo Mezcla del cebador RCPc H2O de grado molecular Volumen Total

3

Volumen (µL) 228 µL 76 µL 304 µL

– Prepare una dilución seriada de la biblioteca de tamaño seleccionado. a.

Prepare una dilución 1:1000 agregando 1 µL de biblioteca de tamaño seleccionado a 999 µL de solución amortiguadora TE 1× (pH 8,0), y enjuague muy bien la punta de la pipeta. Agite con el vortex y centrifugue. Prepare una dilución 1:2000 agregando 100 µL de la dilución 1:1000 a 100 µL de solución amortiguadora TE 1× (pH 8,0). Agite con el vortex y centrifugue.

b. 4

– Prepare una placa de cuantificación de RCPc en una placa RCP fresca compatible con su sistema de RCPc.

5

– Divida en alícuotas 16 µL de la mezcla maestra de RCPc por triplicado para los estándares 1 a 4, la dilución 1:1000 y la dilución 1:2000 (vea las figuras complementarias).

6

– Divida en alícuotas 4 µL de los estándares 1 a 4, la dilución 1:1000 y la dilución 1:2000 entre los pocillos correspondientes.

7

– Selle la placa de cuantificación de RCPc y centrifúguela durante 10 segundos.

8

Nota: Evite generar burbujas en los pocillos de la placa de cuantificación de RCPc. Centrifugue según sea necesario para eliminar las burbujas.

– Configure los triplicados 1:1000 y 1:2000 como muestras objetivo, y defina los estándares (puntos: 4, concentración de inicio: 20 pM, dilución: 1:10). Ejecute el siguiente programa en la máquina de RCPc para determinar la concentración de ADN de la Biblioteca de tamaño seleccionado: Cantidad de ciclos 1 25 (sin curva de fusión)

Temperatura 95 °C 95 °C 60 °C

Tiempo 5 minutos 30 segundos 90 segundos (adquisición de datos)

9

– Para convertir el resultado de RCPc de una concentración pM a una nM, ingrese los resultados “media de cantidad” de los replicados de las dos bibliotecas en la pestaña del libro de ejercicios de Omixon llamada “Cuantificación de biblioteca”.

10

– Con los volúmenes que figuran en el libro de ejercicios, diluya 10 µL de la biblioteca de tamaño seleccionado a una concentración de 2 nM con H2O estéril en un nuevo tubo de microcentrífuga de baja retención de 1,5 mL. Almacene la biblioteca de tamaño seleccionado restante a -20 °C.

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Punto de parada seguro. Las bibliotecas pueden almacenarse a -20 °C por períodos extensos de tiempo. En el caso de un almacenamiento a largo plazo, se recomienda enfáticamente recuantificar la biblioteca antes de procesarla en el MiSeq.

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Paso 7: Secuenciamiento en el Illumina MiSeq Duración: ~24 a 40 horas El Illumina MiSeq es un instrumento NGS automatizado que puede secuenciar la biblioteca de tamaño seleccionado que se preparó en los pasos anteriores. El desmultiplexado de las muestras indizadas se realiza en forma automática luego de haber finalizado el proceso de secuenciamiento.



Consejo rápido: puede usar un pico de PhiX del 1% como un control adicional para monitorear la reacción del secuenciamiento. Consulte la documentación de Illumina sobre el control de PhiX para obtener más información.

Lista de reactivos Elemento Cartucho de reactivo HT1 PR2 Célula flujo MiSeq Biblioteca en 2 nM NaOH 1 N o 2 N H2O de grado molecular

Almacenamiento -20 °C -20 °C 4 °C 4 °C 4 °C 20 °C a 25 °C 20 °C a 25 °C

Suministrado por Illumina Illumina Illumina Illumina Paso 6 Usuario Usuario

Capacidad del kit reactivo de MiSeq Kit reactivo de MiSeq de Illumina Ciclo estándar 500 (MS-102-2003)

Ciclo estándar 300 (MS-102-2002)

Ciclo micro 300 (MS-103-1002)

Ciclo nano 500 (MS-103-1003)

Ciclo nano 300 (MS-103-1001)

Tiempo Horas

Muestras 96/7

~39

96

~24

96

~19

28

~28

12

~17

6

Protocolo 7.1 – Prepare el MiSeq de acuerdo con los protocolos estándares de Illumina.

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7.2 – Prepare una Biblioteca desnaturalizada de 1 nM: Combine 10 µL de 0,2 N NaOH recién preparado y 10 µL de la biblioteca seleccionada de tamaño diluido de 2 nM en un nuevo tubo de microcentrífuga de baja retención de 1,5 mL. Agite con el vortex y centrifugue. Incube esta biblioteca desnaturalizada de 1 nM a temperatura ambiente durante 5 minutos. 7.3 – Prepare una Biblioteca desnaturalizada de 20 pM: Agregue 980 µL de HT1 enfriado a los 20 µL de la biblioteca desnaturalizada de 1 nM. Agite con el vortex y centrifugue. 7.4 – Prepare una Biblioteca desnaturalizada de 9 pM: Agregue 550 µL de HT1 enfriado y 450 µL de la biblioteca desnaturalizada de 20 pM a un nuevo tubo de microcentrífuga de baja retención de 1,5 mL. Agite con el vortex y centrifugue. 7.5 – Transfiera 600 µL de la biblioteca desnaturalizada de 9 pM en el depósito de muestras de carga de cartucho de reactivo MiSeq.

Consejo rápido: es recomendable usar el libro de ejercicios suministrado para crear la Hoja de muestra que requiere el MiSeq.

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Paso 8 – Análisis de datos del secuenciamiento HLA El Illumina MiSeq procesará la biblioteca agrupada de 9 pM y generará datos de secuenciamiento como archivos fastq. Consulte el manual HLA Twin para obtener asistencia con la instalación correcta del HLA Twin y conseguir información sobre cómo interpretar el análisis de genotipificación de sus datos de secuenciamiento. Para implementar el Protocolo automatizado y por problemas relacionados con la instalación o el análisis de los datos, comuníquese con [email protected].

Protocolo automatizado Establecimiento y configuración de TI 1.

Instale HLA Twin Server en el servidor.

§

Instale HLA Twin Client en una computadora cliente; pueden conectarse varios HLA Twin Clients al servidor. Comuníquese con Soporte de Omixon ([email protected]) para instalaciones de instalación personalizadas para la Automatización.

§

Protocolo por análisis 1.

Abra HLA Twin Client e inicie sesión.

2.

Los datos ya se han procesado o se están procesando. Revise los resultados con el sistema Traffic Light del HLA Twin.

3.

Exporte los resultados de la genotipificación y/o las secuencias de consenso según sea requerido.

Protocolo manual del servidor Establecimiento y configuración de TI § §

Instale HLA Twin Server en el servidor. Instale HLA Twin Client en una computadora cliente.

Protocolo por análisis § § § §

Abra HLA Twin Client e inicie sesión. Seleccione los datos de MiSeq en formato fastq o fastq.gz e iniciela ejecución de la tipificación de Holotype HLA. Una vez que la tipificación de Holotype HLA está terminada, revise los resultados con el sistema Traffic Light de HLA Twin. Exporte los resultados de la genotipificación y/o las secuencias de consenso según sea requerido.

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Protocolo manual de escritorio Establecimiento y configuración de TI §

Instale HLA Twin Desktop.

Protocolo por análisis 6

Abra HLA Twin e inicie sesión.

7

Seleccione los datos de MiSeq en formato fastq o fastq.gz e iniciela ejecución de la tipificación de Holotype HLA.

8

Una vez que la tipificación de Holotype HLA está terminada, revise los resultados con el sistema Traffic Light de HLA Twin.

9

Exporte los resultados de la genotipificación y/o las secuencias de consenso según sea requerido.

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Figuras complementarias Ejemplo de placa para Placa de amplicones, Placa de amplificación, Placa de dilución, Placa de cuantificación de amplicones (para un locus individual) y Placa de reacción



Ejemplo de placa para Placa de cuantificación de estándares



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Ejemplo de placa de RCPc para Cuantificación de biblioteca KAPA



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Apéndice 1: Pippin Prep Programación del Pippin Prep 1.

Haga clic en la pestaña Protocol Editor (Editor de protocolo) y haga clic en el botón “New” (Nuevo).

2.

Haga clic en el icono de la carpeta al lado del campo Cassette y seleccione “1.5%DF Marker K” (Marcador K 1,5 % DF) para Pippin Prep o “1.5%DF Marker R2” (Marcador R2 1,5 % DF) para Blue Pippin.

3.

En la vía que usted está programando: a. b. c. d.

Resalte el campo “Range” (Rango). Configure la “Ref Lane” (Vía de referencia) para que coincida con el número de vía en el cual está trabajando. Configure el campo “Start*” (Inicio*) en 650. Configure el campo “End*” (Fin*) en 1300.

4.

En el campo Reference Lane (Vía de referencia), seleccione la vía en la cual está trabajando.

5.

Haga clic en el botón “Save As” (Guardar como) y póngale un nombre a su programa.

Ejecución del Pippin Prep 1.

Encienda el Pippin Prep presionando el botón de encendido que está en la parte trasera del aparato.

2.

Inspeccione visualmente el Pippin Prep. Asegúrese de que las 5 luces LED están encendidas y que el interior del aparato está limpio y seco.

3.

Haga clic en el logotipo de Sage Science que está en la parte inferior derecha de la pantalla. Esto le permitirá ingresar una contraseña. La contraseña predeterminada de fábrica es “pips”.

4.

Haga clic en la pestaña Factory Setup (Configuración de fábrica) y asegúrese de que el valor de base a umbral está puesto en 0,02.

5.

Coloque el dispositivo de calibración dentro del Pippin Prep y asegúrese de que la banda oscura está boca abajo y encima de las luces LED.

6.

En la pestaña Main (Principal), haga clic en el botón “Calibration” (Calibración).

7.

En la ventana “Calibration” (Calibración), asegúrese de que el campo “Target I pH mA” (Objetivo I pH mA) está puesto en 0,80 (0,60 para Blue Pippin) y luego apriete el botón “Calibration” (Calibración).

8.

Vaya a la pestaña Protocols (Protocolos). Haga clic en el botón “Load” (Carga) y seleccione el programa para Holotype HLA y la vía específica que usará usted. Asegúrese de lo siguiente: a. b.

La vía correcta está encendida. El indicador de selección de espectro ancho está activo.

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c. 9.

La vía de referencia es la misma línea que se procesará.

Vaya a la pestaña Main (Principal). Asegúrese de lo siguiente: a. b.

El programa que cargó es el que está seleccionado. La vía de referencia apropiada está seleccionada y es también la vía en la que se procesará la muestra.

10. Inspeccione el casete. Antes de sacar la cinta que sella los pocillos, revise para ver si hay burbujas detrás del puerto de elución. Si hay alguna burbuja detrás del puerto de elución, golpee y haga girar el casete con suavidad entre sus manos para sacarlas. 11. Coloque el casete, con la cinta todavía puesta sobre los pocillos, dentro del Pippin Prep. 12. Despegue la cinta con cuidado y asegúrese de sacarla desde la parte limpia del casete (vía 5) hacia la parte usada del casete (vía 1). Tenga cuidado de no salpicar líquido cuando se retira la cinta, para prevenir la contaminación. 13. Quite todo el volumen de la solución amortiguadora del puerto de elución de la vía que usará y agregue 40 µL de solución amortiguadora de electroforesis fresca en ese puerto de elución. 14. Coloque una tira delgada de cinta sobre los puertos de elución. 15. Cualquier depósito que esté menos de 3/4 lleno debe completarse con solución amortiguadora de electroforesis. ¡No llene los pocillos en exceso! El borde de la solución amortiguadora debe llegar justo al plástico, y no más alto, para impedir que se arrastre cuando se desliza la tapa. Aplique solución amortiguadora desde los pocillos limpios (Vía 5) a los pocillos usados (Vía 1). 16. Asegúrese de que cada uno de los pocillos de carga (pocillos con agarosa) están llenos con la solución amortiguadora de electroforesis. La solución amortiguadora debe estar justo encima de la agarosa, y verse completamente plana. 17. Cierre despacio el Pippin Prep y tenga cuidado de que nada de la solución amortiguadora toque la tapa mientras cierra el dispositivo. 18. Lleve a cabo la prueba de continuidad. Cuando los sensores se secan ligeramente, es común que la prueba de continuidad falle una vez. Si la prueba de continuidad falla, haga la prueba una vez más. Una vez que se complete la prueba de continuidad, abra lentamente el Pippin. Asegúrese de que la tapa del Pippin Prep no arrastre líquido por el casete. 19. Agite con el vortex la solución de carga de Marcador K brevemente y centrifugue. Agregue 10 µL de solución de carga de Marcador K a sus aproximadamente 30 µL de biblioteca. 20. Agite con el vortex su biblioteca brevemente y centrifugue. 21. Extraiga 40 µL de solución amortiguadora del pocillo de muestra que estará usando. 22. Agregue aproximadamente 40 µL de su biblioteca cargada con Marcador K al pocillo de muestra que estará usando. 23. Marque la vía que está usando con las iniciales del técnico y la fecha. Omixon Holotype 96/7 CONFIGURACIÓN | Configuración A y CE, y Configuración B y CE | Instrucciones de uso v10. Para uso de diagnóstico in vitro Copyright© 2017, Omixon Biocomputing Ltd. Confidencial y propietario Página 45 │ 50



24. Cierre el Pippin Prep y haga clic en el botón “Start” (Inicio). Asegúrese de que la vía apropiada está encendida. La muestra debe procesarse por unos 45 minutos. 25. Una vez que se completó el procesamiento, abra el Pippin Prep con cuidado. Espere para ver si la tapa arrastra algo de líquido por el casete. 26. Quite la tapa que está sobre los puertos de elución, con cuidado de no tocar nada de líquido. 27. Transfiera todo el volumen desde el puerto de elución a un nuevo tubo de baja retención de 1,5 mL. 28. Cubra todos los pocillos abiertos con dos piezas de cinta selladora de placas. Recuerde dejar una pestaña en el lado limpio. Esto hará que sea más fácil quitar la cinta desde la parte limpia a la usada. 29. Coloque el casete sellado en su bolsa y póngalo a un lado. 30. Tome el casete de lavado y llénelo con agua MiliQ. Cierre con suavidad la tapa del Pippin Prep, con cuidado de no derramar nada del líquido por el casete de lavado. 32. Deje el Pippin Prep cerrado por unos cuantos segundos. 33. Abra el Pippin Prep, con cuidado de no llevar nada de líquido por el casete de lavado. 34. Quite el casete de lavado, vacíelo de agua y deje que se seque. 35. Limpie toda el agua que tenga el Pippin Prep y ciérrelo suavemente. 36. Seleccione el botón “Shut Down” (Apagar) del menú del Pippin Prep.

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Apéndice 2: Cuantificación de amplicones con un instrumento de RCPc Duración: 1 hora y 50 minutos

Lista de reactivos Elemento 20× solución amortiguadora TE (pH 7,5) ADN Lambda estándar (100 ng/µL) Tinte 200× QuantiFluor de ADNbc H2O estéril Placa(s) de amplificación de clase I Placa(s) de amplificación de clase II

Almacenamiento 4 °C 4 °C 4 °C 20 °C a 25 °C 4 °C 4 °C

Suministrado por Promega Promega Promega Usuario Paso 2 Paso 2

Protocolo 1.

Cree una dilución serial con tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y el estándar de ADN QuantiFluor Lambda (100 ng/µL). Siga la siguiente tabla de diluciones: Etiqueta en el tubo

Estándar 1 Estándar 2 Estándar 3 Estándar 4 Estándar 5 Estándar 6 Estándar 7, en blanco

ADN de entrada ADN Lambda Estándar 1 Estándar 2 Estándar 3 Estándar 4 Estándar 5 En blanco

Volumen de ADN (µL) 7,5 µL 250 µL 250 µL 250 µL 250 µL 250 µL 0 µL

Volumen 1x TE (µL) 492,5 µL 250 µL 250 µL 250 µL 250 µL 250 µL 250 µL

Concentración final (ng/µL) 1,5 ng/µL 0,75 ng/µL 0,38 ng/µL 0,19 ng/µL 0,09 ng/µL 0,05 ng/µL 0 ng/µL

2.

Prepare las placas de cuantificación de amplicones (vea las figuras complementarias). Divida en alícuotas 49,5 µL de solución amortiguadora TE 1x en los pocillos de una placa óptica de 96 pocillos para el número total de amplicones que debe cuantificarse.

3.

Agregue 0,5 µL de amplicones desde los pocillos correspondientes de las placas de amplicones a pocillos individuales de las placas de cuantificación de amplicones. Mezcle dentro de la pipeta.

4.

Prepare una solución de trabajo de tinte 1× QuantiFluor con la siguiente fórmula: 0,25 µL tinte QuantiFluor (200X) + 49,75 µL solución amortiguadora TE 1×. Prepare suficiente solución de trabajo de tinte QuantiFluor 1× de forma que cada muestra (total de muestras en las placas de amplicones) y el estándar (14 en total) reciban una alícuota de 50 µL.

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5.

Prepare una placa de cuantificación de estándares y placas de cuantificación de amplicones. Divida en alícuotas 50 µL de solución de trabajo de tinte QuantiFluor 1× en los pocillos de las placas ópticas de 96 pocillos con el formato de la placa de cuantificación de estándares y las placas de cuantificación de amplicones (consulte las figuras complementarias).

6.

Con los estándares preparados arriba, agregue 50 µL de cada estándar, por duplicado, a los pocillos individuales de la placa de cuantificación de estándares (14 pocillos en total).

7.

Agite en vórtice para mezclar bien y centrifugue.

8.

Coloque cada placa de cuantificación en la máquina de RCPc, una a la vez, y ejecute el siguiente programa: Cantidad de ciclos 1 2

9.

Temperatura 25 °C 25 °C 25 °C

Tiempo 10 segundos 15 segundos 30 segundos (adquisición de datos)

Calcule la concentración de ADN de las placas de cuantificación de amplicones con los datos RFU en bruto generados por el instrumento de RCPc.

10. Diluya el ADN de las placas de amplicones con H2O estéril para que la concentración final de ADN sea de aproximadamente 67 ng/µL. § Si la concentración de ADN es de 150 ng/µL o mayor: agregue 25 µL de H2O § Si la concentración de ADN es de 100 a 150 ng/µL: agregue 10 µL de H2O § Si la concentración de ADN es menor que 100 ng/µL, agregue 0 µL de H2O.

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Apéndice 3: Cuantificación de biblioteca con un tinte fluorescente intercalado de ADNbc Duración: ~15 minutos La concentración de la biblioteca de tamaño seleccionado puede medirse en forma precisa con un tinte fluorescente ADNbc intercalado, como SYBR verde o un equivalente. Los kits y los instrumentos comercialmente disponibles para este fin incluyen pero no se limitan al lector Qubit de Thermo Fisher (usa el kit de ensayo de ADNbc Qubit de amplio rango), el lector Quantus de Promega (usa el tinte fluorescente de ADNbc Quantifluor) y otros. Aquí se describe el método Qubit, ya que es el instrumento de uso más común. Si se usan otro instrumento y otro kit, siga las instrucciones estándar del fabricante.



Nota: Este método fluorimétrico para el ADNbc constituye una manera rápida pero precisa de determinar la concentración de la biblioteca de tamaño seleccionado final. Mide todo el ADNbc presente en la biblioteca.

Lista de reactivos Elemento Kit de ensayo Qubit dsDNA BR Estándares Qubit dsDNA BR Biblioteca de tamaño seleccionado

Almacenamiento temperatura ambiente 4 °C 4 °C

Suministrado por Thermo Fisher Thermo Fisher Paso 5

Protocolo 6.1 – Haga que los estándares de Qubit lleguen a la temperatura ambiente. Prepare tubos de ensayo de Qubit (500 µL, paredes finas) para su biblioteca por duplicado, y los dos estándares. Agite en vórtice y centrifugue los estándares y la biblioteca. 6.2 – Agregue 995 µL de solución amortiguadora y 5 µL de tinte a un tubo de centrífuga de 1,5 mL. Agite con el vortex y centrifugue. 6.3 – Transfiera 190 µL desde la mezcla de reactivos a los tubos de Qubit para los dos estándares. Transfiera 198 µL desde la mezcla de reactivos a los dos tubos de Qubit para los duplicados de la biblioteca. 6.4 – Agregue 10 µL desde el estándar 1 al tubo de Qubit correspondiente y agite en vórtice durante 2 segundos. Repita para el estándar 2. 6.5 – Agregue 2 µL desde la biblioteca a los dos tubos de Qubit correspondientes y agite en vórtice durante 2 segundos. 6.6 – Incube los tubos de Qubit a temperatura ambiente durante 2 minutos. 6.7 – Encienda la máquina de Qubit y elija BR protocol (Protocolo BR). Omixon Holotype 96/7 CONFIGURACIÓN | Configuración A y CE, y Configuración B y CE | Instrucciones de uso v10. Para uso de diagnóstico in vitro Copyright© 2017, Omixon Biocomputing Ltd. Confidencial y propietario Página 49 │ 50



6.8 – Ponga el tubo de Qubit estándar 1 y presione GO (Empezar). Repita para el estándar 2. 6.9 – Ponga el tubo de biblioteca en Qubit y presione GO (Empezar). Repita para el replicado. 6.10 – Para convertir el resultado de Qubit de ng/µL a una concentración nM, ingrese la concentración media de los dos replicados de la biblioteca en la pestaña del libro de ejercicios de Omixon llamada “Library Quantitation” (Cuantificación de biblioteca). 6.11 – Con los resultados de la medición del Qubit, diluya 10 µL de la Biblioteca de tamaño seleccionado a una concentración de 2 nM con H2O estéril en un nuevo tubo de microcentrífuga de baja retención de 1,5 mL. Almacene la biblioteca de tamaño seleccionado restante a -20 °C.



Punto de parada seguro. Las bibliotecas pueden almacenarse a -20 °C por períodos extensos de tiempo. En el caso de un almacenamiento a largo plazo, se recomienda enfáticamente recuantificar la biblioteca antes de procesarla en el MiSeq.



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