Universidad Nacional del Nordeste Facultad de Medicina

Maestría en Micología Médica

Director:

Dr. Ricardo Negroni

Coordinadores:

Dra. Alicia Arechavala Dr. Gustavo E. Giusiano

Unidad Temática II

Preparación de antígenos para reacciones serológicas y pruebas cutáneas Técnicas de ejecución de pruebas serológicas Interpretación de resultados

Cohorte 2012 -2013

Maestría en Micología Médica

Preparación de antígenos – Dr. Ricardo Negroni

En esta parte del Módulo II se informará a los cursantes la forma de preparación de los antígenos más frecuentemente usados para pruebas serológicas y cutáneas, de acuerdo a los procedimientos usados en el Centro de Micología, del Departamento de Microbiología y Parasitología, de la Facultad de Medicina, de la Universidad de Buenos Aires.

Antígenos para pruebas serológicas Paracoccidiodina (antígeno metabólico) Cepa utilizada Paracoccidiodes brasiliensis V9 (colección de Gioconda de San Blas), en su fase levaduriforme, mantenida por subcultivos semanales en BHI-agar a 37ºC. Medio de cultivo: dextrosa 2%, neopeptona (DIFCO) 1% en agua destilada, envasado en frascos de Erlenmayer de 250 ml, con 125 ml de medio de cultivo cada uno. Se esterilizan a 120º C durante 15 minutos en autoclave. Siembra e incubación: se siembra masivamente cada frasco de Erlenmayer, con el desarrollo completo de un tubo de ensayo de la forma levaduriforme de P.brasiliensis incubado durante 5 días a 37º C. La incubación de los frascos se lleva a cabo en agitador mecánico rotatorio New Brunswick, a razón de 90 rpm., a 37º C y durante 7 días. Desactivación del cultivo, de le agrega a cada frasco 1,50 ml de una solución de mertiolato al 1% con borato de sodio al 1,4% en agua destilada. Seguidamente, para evitar la destrucción de los antígenos por las proteasas de P. brasiliensis, se le adiciona 1ml de fenilmetilsulfonilfluoruro al 2% en alcohol absoluto y se dejan los frascos a temperatura ambiente durante 48 hs. Separación de las células fúngicas: se lleva a cabo por centrifugación a 2.000 rpm. durante 15 minutos. El líquido sobrenadante es concentrado 10 veces por evaporación en un desecador de ácido sulfúrico a 37º C. La evaluación de la capacidad antigénica del lote se realiza mediante pruebas de inmunodifusión frente a sueros conocidos como reactores positivos fuertes y débiles y utilizando como antígeno patrón lotes anteriores de potencia antigénica conocida. Se recomienda que cada nuevo lote sea probado sin diluir y en las diluciones 1/2 y 1/4. Las posibles reacciones cruzadas son detectadas mediante la misma técnica, haciendo reaccionar la dilución óptima del antígeno obtenido frente a sueros de pacientes con aspergilosis, histoplasmosis, coccidiodomicosis y tuberculosis.

2

Maestría en Micología Médica

Preparación de antígenos – Dr. Ricardo Negroni

Aspergilina (antígeno metabólico) Cepa utilizada: Aspergillus fumigatus, CM. Rearte, incubada en lactrimel a 37º C durante 5 días. Medio de cultivo: idéntico al empleado para la paracoccidiodina. Siembra e incubación: se siembra una suspensión de esporos muy densa, se incuba en agitador como el especificado en el antígeno anterior, a 37º C, pero durante 4 semanas. Desactivación del cultivo: igual a la paracoccidiodina, no se agrega el inhibidor de proteasas por no ser indispensable. Separación del micelio: se lleva a cabo por filtración con papel de filtro. El líquido remanente se concentra 10 veces por evaporación como en la paracoccidiodina. La evaluación de la potencia de cada lote se realiza mediante pruebas de inmunodifusión frente a un panel de sueros positivos y se lo compara con lotes anteriores. Se prueba el antígeno sin diluir y en las diluciones 1/2 y 1/4. El control de las reacciones cruzadas se lleva a cabo como en el antígeno anterior. De la misma manera se preparan antígenos de Aspergillus flavus y Aspergillus niger.

Coccidiodina (antígeno metabólico) Cepa utilizada: Coccidioides posadasii, CM.Besso, incubado en agar-glucosado de Sabouraud a 37º C durante 10 días. Medio de cultivo: extracto de levadura 1% y glucosa 2% en agua destilada, de distribuye en frascos de Erlenmayer y esterilizan como en el caso de la paracoccidiodina. Siembra e incubación: se siembra una suspensión densa de artroconidias y se incuba en agitador mecánico, a 37º C durante 4 semanas. Desactivación del cultivo: como en la aspergilina sólo se adiciona la solución de mertiolato-borato de sodio y se deja a temperatura ambiente durante 48hs. Separación del micelio: se lleva a cabo por filtración con papel de filtro. El líquido remanente se concentra por evaporación 10 veces, en desecador de ácido sulfúrico a 37ºC. Cada lote se prueba por medio de reacciones de inmunodifusión en gel de agar frente a un panel de sueros positivos con el antígeno sin diluir y diluido 1/2 y 1/4. Se lo compara

3

Maestría en Micología Médica

Preparación de antígenos – Dr. Ricardo Negroni

con lotes anteriores con potencia antigénica conocida. Las reacciones cruzadas se detectan como en le caso de la paracoccidiodina.

Histoplasmina (exo-antígeno de la forma de levadura) Cepa utilizada: Histoplasma capsulatum, 188.404, mantenida por subcultivos semanales a 37º C en BHI-agar. Medio de cultivos: BHI-agar líquido, distribuido en frascos de Erlenmayer y esterilizado como en la paracoccidiodina. Siembra e incubación: se siembra una suspensión densa de levaduras y se incuba en agitador mecánico a 37ºC durante 7 días. Desactivación del cultivo: se efectúa con el agregado de la solución de mertiolatoborato de sodio hasta la concentración final de 1/10.000, aproximadamente 1,5 ml de la dilución 1/100 por cada frasco. Separación de las células fúngicas se hace por centrifugación a 2.000 rpm. durante 15 minutos, el sobrenadante se elimina y las células son lavadas por centrifugación 3 veces con agua destilada, luego las células de cada frasco son suspendidas en 25 ml de agua destilada conteniendo mertiolato-borato de sodio 1/10.000 y solución alcohólica de fenilmetilsulfonilfluoruro 1/5.000. Esta suspensión se deja a temperatura ambiente durante 7 días para la extracción del antígeno. Las células fúngicas son nuevamente separadas por centrifugación y el sobrenadante es colocado en recipientes aptos para la liofilización. El polvo obtenido después del liofilizado en cada recipiente es diluido en 1 ml de agua destilada estéril, de esta forma se concentra 25 veces el sobrenadante inicial y se usa como antígeno para las pruebas serológicas. Se dosan proteínas totales por el método de Folin-Ciocalteu de acuerdo a Chase y los polisacáridos mediante la técnica de fenol de Morris y Ribbons. Los controles de capacidad antigénica de efectuaron como en los antígenos anteriores.

Candidina (antígeno citoplasmático) Cepa utilizada: Candida albicans, C.M. Sabban, mantenido en agar-glucosado de Sabouraud incubado a 37º C durante 72 hs. Siembra e incubación: se siembra con una suspensión densa de levaduras en medio con dextrosa al 2% y neopeptona al 1% en agua destilada, la incubación se hace a 37º C, en agitador mecánico rotatorio a razón de 90 rpm., durante 72 hs.

4

Maestría en Micología Médica

Preparación de antígenos – Dr. Ricardo Negroni

Desactivación del cultivo, se lleva a cabo con la solución de mertiolato-borato de sodio 1/100, hasta alcanzar la concentración final de 1/10.000, se deja a temperatura ambiente durante 48 hs. Separación de las células fúngicas por centrifugación, se descarta el sobrenadante y las células son lavadas 3 veces por centrifugación con agua destilada. Ruptura de las células fúngicas: las células fúngicas son suspendidas en una solución buffer de fosfatos de pH 7,2 en un volumen 10 veces inferior al que originalmente estaban en el medio de cultivo. Las células se rompen por agitación, en un aparato Braun para romper células, a 4.000 rpm. durante 10 minutos, en frascos con perlas de vidrio de 0,11mm. y bajo una corriente refrigerante de CO2. Se efectúa seguidamente el control de ruptura de las células por examen microscópico, en preparaciones montadas con líquido de Gueguen y si el 80% de las células están rotas, se procede a separar las paredes celulares por centrifugación refrigerada a 10.000 rpm. durante 30 minutos y a 4º C. Se determina la concentración de las proteínas totales y los polisacáridos como en el antígeno anterior y se controla la capacidad antigénica por pruebas de inmunodifusión en gel de agar frente a un panel de sueros positivos y negativos.

Antígenos para pruebas cutáneas

Coccidioidina e Histoplasmina Cepas utilizadas: Histoplasma capsulatum, CM. 922.5 y 922.8, mantenidas en la forma micelial por subcultivos incubados durante 3 semanas a 28º C, en medio de lactrimel de Borelli. Coccidioides posadasii, CM. JBA Y NG., mantenidas en la forma micelial por subcultivos en medio de agar-glucosado de Sabouraud, incubados durante 3 semanas a 37º C. Siembra e incubación: se siembra en forma masiva, utilizando la masa de los micelios, en medio de asparagina-sales de Smith (cloruro de amonio 7g., asparagina 7g., fosfato dipotásico 1,31 g., citrato de sodio 0,9 g., sulfato de magnesio con 7 H2 O 1,5 g., citrato de hierro en escamas 0,3 g., glucosa 10 g., glicerina 25 g., agua destilada csp. 1.000 ml..) en medio de cultivos debe estar dispuesto en botellas de Roux, formando un capa de 2 a 3 cm. de altura. La incubación se realiza en forma estática, a 28º C, durante 6 meses. Desactivación del cultivo: se hace agregando la solución de mertiolato-borato de sodio hasta la concentración final de 1/10.000 y se dejan a temperatura ambiente durante 48 hs.

5

Maestría en Micología Médica

Preparación de antígenos – Dr. Ricardo Negroni

El micelio es separado por filtración con papel de filtro y el líquido remanente, conteniendo los antígenos, es esterilizado por filtración en filtros Seitz. Las diluciones de los antígenos se hacen en solución salina isotónica estéril con fenol al 0,3 %. La potencia antigénica de cada lote se establece inoculando las diluciones 1/10 y 1/100 de estos antígenos, en piel depilada de los flancos de cobayos machos, que han sido inoculados 4 semanas antes por vía intratesticular, con H.capsulatum o C.posadasii respectivamente. Se considera la dosis óptima de antígeno como la mayor dilución que produce el 80% de reacciones positivas y se calcula que la piel humana es 10 veces más sensible que la de los cobayos. Es decir, si la dosis óptima del cobayo es la dilución 1/10, en el humano debe usarse diluida 1/100. Como antígeno de H.capsulatum puede utilizarse también el exo-antígeno de la forma de levadura que se emplea para pruebas serológicas y la dilución óptima se determina en la misma forma que hemos explicado para los antígenos metabólicos de la forma micelial.

Paracoccidiodina (exo-antígeno de la forma de levadura) Cepa utilizada: P.brasiliensis, V9 (colección de Gioconda de San Blas), mantenida en la fase levaduriforme por subcultivos semanales en agar-glucosado de Sabouraud incubados a 37º C. Siembra e incubación: se deben efectuar siembras masivas de cultivos levaduriformes con 4 días de incubación a 37º C, en botellas de Roux conteniendo agar-glucosado de Sabouraud, estas botellas se incuban a 37º C durante 7 días. Desactivación del cultivo: finalizado el lapso de incubación se inundan las botellas de Roux con una solución de mertiolato-borato de sodio 1/10.000 y quedan a temperatura ambiente durante 48 hs. Las células fúngicas son recogidas con perlas de vidrio y lavadas tres veces con solución salina isotónica buffer de pH 7,2. Seguidamente estas células son resuspendidas en la misma solución buffer adicionada de mertiolato-borato de sodio hasta la concentración final de 1/10.000 y de fenilmetilsulfonilfluoruro al 1/5.000. Esta suspensión queda a temperatura ambiente durante 10 días, para extraer el antígeno y después las levaduras son separadas por centrifugación a 10.000 rpm. durante media hora. El sobrenadante es usado como antígeno, se procede a determinar la concentración de proteínas por el método de Folin-Ciocalteu según Chase y los polisacáridos por la técnica del fenol de Morris y Ribbons. Las diluciones del antígeno se hacen en solución salina isotónica estéril con fenol al 0,3 %.

6

Maestría en Micología Médica

Preparación de antígenos – Dr. Ricardo Negroni

Los controles de capacidad antigénica del lote se realizan mediante la inoculación intradérmica del antígeno puro, diluido 1/10 y 1/50, en los flancos depilados de cobayos inoculados con P.brasiliensis por vía intratesticular 4 semanas antes. La lectura de las pruebas se hace a las 48 hs. y se considera óptima la concentración menor de antígeno que proporciona 80% de reacciones positivas. En general la concentración óptima para los cobayos es de 1/10 y para los humanos se usa diluida 1/50, que corresponde a una concentración de proteínas de 10 µg. para 0,1 ml.

Candidina (antígeno metabólico) Cepa utilizada: Candida albicans, CM. Sabban, mantenida por repiques en agarglucosado de Sabouraud incubados a 37º C, cada semana. Siembra e incubación: la siembra se hace con una suspensión densa de levaduras de un cultivo con 48 hs de incubación, en frascos de Erlenmayer con un medio de cultivo conteniendo dextrosa al 2% y neopeptona al 1% en agua destilada, se incuba en agitador mecánico rotatorio New Brunswick Co. a razón de 90 ciclos por minuto, durante 3 semanas a 37º C. Seguidamente los cultivos son desactivados mediante el agregado de una solución de mertiolato-borato de sodio hasta la concentración final de 1/10.000. Se los deja a temperatura ambiente durante 48 hs y se separan las células fúngicas por centrifugación. El sobrenadante es esterilizado por filtración en filtros Seitz y diluidos 1/25 y 1/50 en solución salina isotónica estéril con fenol al 0,3 %. La capacidad antigénica es medida efectuando intradermorreacciones en voluntarios sanos, con ambas diluciones de antígeno, para determinar la concentración óptima.

Tricofitina (antígeno metabólico) Para la preparación de la tricofitina se emplean cepas de reciente aislamiento de Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Microsporum canis y Epidermophyton floccosum. La preparación de este antígeno se hace en forma similar a la candidina, con las siguientes diferencias: la incubación en el medio líquido donde se obtendrá el antígeno debe hacerse a 28º C, durante 5 semanas y la separación de los micelios se efectúa por filtración. El resto, tanto de la preparación como del control de la capacidad antigénica es igual a la candidina.

Esporotriquina (antígeno de células levaduriformes muertas) Cepa empleada: Sporothrix schenckii, CM. 181.752, mantenido en la fase levaduriforme por repiques semanales, en medio de BHI- agar con sangre de carnero al 5% e incubados a 37º C.

7

Maestría en Micología Médica

Preparación de antígenos – Dr. Ricardo Negroni

Se siembran masivamente botellas de Roux conteniendo agar- BHI con 5% de sangre de carnero, con levaduras de 4 días de incubación. La incubación de las botellas se lleva a cabo a 37º C durante 7 días. Seguidamente para desactivar el cultivo se inundan los frascos de Roux con una solución de mertiolato-borato de sodio 1/10.000, se los deja a temperatura ambiente durante 48 hs. y se recogen la células fúngicas con perlas de vidrio. Las levaduras se lavan tres veces por centrifugación con una solución salina isotónica buffer de pH 7,2. Finalmente se prepara una suspensión 1/1.000 volumen/volumen de las células levaduriformes en la solución buffer adicionada de fenol al 0,3%. Deben hacerse controles de esterilidad de este reactivo sembrando placas de Petri con agar-sangre e incubándolas a 37º C durante 14 días. Los controles de capacidad antigénica se efectúan en cobayos inoculados 4 semanas antes con S. schenckii por vía intratesticular, inyectándole distintas concentraciones del antígeno por vía intradérmicos en los flancos depilados.

Aspergilina (exo-antígeno micelial) Cepa empleada: Aspergillus fumigatus, CM. Rearte, mantenido en subcultivos en medios de lactrimel de Borelli, incubados a 37º C. Siembra e incubación: se siembra una suspensión densa de esporos en un medio de cultivo con dextrosa 2% y neopeptona al 1% en agua destilada, se incuba en agitador mecánico rotatorio a 90 rpm. durante 7 días. Los cultivos se inactivan mediante el agregado de mertiolato-borato de sodio hasta la concentración final de 1/10.000 y se los deja a temperatura ambiente durante 48 hs. Seguidamente el micelio es separado por filtración y lavado con agua destilada abundantemente para eliminar todo vestigio de medio de cultivo, los lavados se llevan a cabo en filtro Buchner y con papel de filtro. Preparación del antígeno: el micelio lavado es homogeneizado en homogeneizador manual de tejidos y luego suspendido en agua destilada con el agregado de mertiolatoborato de sodio 10.000, en un volumen 10 veces inferior al del medio de cultivo en el que habían desarrollado. La suspensión se deja a temperatura ambiente durante 10 días para extraer el antígeno. Finalizado este lapso se separó el micelio por filtración, el líquido sobrenadante, con.los antígenos, fue esterilizado por filtro Seitz y se dosaron proteínas totales y polisacáridos por los métodos expuestos en la preparación de otros antígenos. Para controlar la capacidad antigénico del lotes se efectuaron pruebas de inmunodifusión con sueros positivos de pacientes con aspergilosis y con sueros negativos controles. Para las pruebas cutáneas se recomienda usar las diluciones 1/100 y 1/1.000 de la menor concentración que dio pruebas de inmunodifusión positivas.

8

Maestría en Micología Médica

Preparación de antígenos – Dr. Ricardo Negroni

TÉCNICAS DE EJECUCIÓN DE PRUEBAS SEROLÓGICAS Expondremos aquí las técnicas de la inmunodifusión en gel de gar y la contrainmunoelectroforesis con inmunodifusión secundaria en agarosa, por ser las dos únicas reacciones serológicas que se llevan a cabo habitualmente en los laboratorios de diagnóstico micológico en nuestro medio. La muestra de suero debe ser obtenida por punción venosa del paciente, éste debe tener un ayuno de 6 hs como mínimo y no deben usarse anticoagulantes. Una vez coagulada la sangre se separa el suero, se le agrega mertiolato-borato de sodio hasta al concentración final de 1/10.000 y se los guarda a -20º C. hasta el momento de utilizarse. La solución preservante contiene: etil mercurio tiosalicilato de sodio 1g., borato de sodio 1,4 g. y agua destilada 100 ml.

INMUNODIFUSIÓN EN GEL DE AGAR ( ID ) Equipos y reactivos necesarios: 1. Un sacabocados de 4 mm. de diámetro y un esquema con 6 círculos periféricos de 4 mm de diámetro y otro central de igual tamaño. Los círculos periféricos deben estar separados del central por una distancia de 4 mm. 2. Placas de Petri de 10 cm. de diámetro o portaobjetos de 2,5 cm por 7,5 cm. 3. Pipetas de 100 µl. 4. Agar Noble (DIFCO) o Agar OXOID Nº 3. 5. Polietilenglicol 6.000 (PEG). 6. Fosfato de sodio monopotásico (NaH2 PO4). 7. Fosfato dibásico de sodio (NaHPO4). 8. Fenol. 9. Cloruro de sodio. 10. Citrato de sodio. 11. Agua destilada. 12. Suero patrón positivo. 13. Antígenos estandarizados para ID.

9

Maestría en Micología Médica

Preparación de antígenos – Dr. Ricardo Negroni

14. Sueros problemas. 15. Etilmercurio tiosalicilato de sodio (mertiolato). 16. Borato de sodio. 17. Sistema de iluminación (semejante al de los negatoscopios).

Preparaciones del gel de agar y las soluciones buffer A. Solución buffer de fosfatos de pH 7.4 (debe conservarse en la heladera a 4º C). - M/15 Na2HPO4 ...............80.8 ml. - M/15 NaHP2O4................19.2 ml. B. Preparación del gel. -Agua destilada.....................99ml. - Solución buffer fosfatos.....1.0 ml. - NaCl....................................0.85 g. -Fenol.....................................0.3 ml. - Agar......................................1.0 g. - PEG.......................................1.0 g. El agar es agregado a la solución salina fenolada y se mezcla durante 5 minutos, al mismo tiempo se adiciona el PEG. Se lleva la mezcla a baño de agua a 100º C para su disolución y se distribuye en tubos conteniendo 5 ml o 15 ml de agar cada uno, según sea para usarlos en placas de Petri o en portaobjetos. Una vez solidificados se los tapa y se los guarda a 4º C. C. Solución buffer de citrato de sodio pH 8.2. - Citrato de sodio ..............5g. Solución fisiológica..........100ml.

10

Maestría en Micología Médica

Preparación de antígenos – Dr. Ricardo Negroni

Preparación de la placa de agar 1. El agar es fundido en baño de agua en ebullición. 2. Cuando los tubos se enfrían a 60º C se vuelca el contenido de un tubo de 15 ml en una placa de Petri. Una vez solidificado el agar, la placa se guarda en la heladera, como máximo durante una semana. Para preparar el agar en portaobjetos se diluye 1 ml de agar de inmunodifusión en 7 ml de agua destilada y se lleva a baño de agua a 70º C: con esta preparación se cubre el portaobjetos y se lo deja secar a 37º C hasta que forma una capa opaca y seca. Seguidamente se vuelcan 2,5 ml del agar de inmunodifusión por cada portaobjetos. Cuando el agar está sólido se colocan los portaobjetos en cámara húmeda y se los lleva a la heladera hasta el momento de ser usados.

Realización de la prueba de inmunodifusión Cortar con el sacabocados las siete cavidades del esquema en el agar de inmunodifusión y retirar los cilindros de agar con una aguja o una espátula fina. Numerar en la base de la placa las cavidades periféricas del 1 al 6, llenar las cavidades periféricas con 0,1 ml de los sueros, reservando las 1 y 4 para el suero testigo, en la cavidad central se coloca 0,1 ml del antígeno. La incubación de la prueba se hace a temperatura ambiente durante 72hs. A continuación se cubren las placas con la solución de citrato de sodio pH 8,2 durante 2 hs. Esta solución elimina los precipitados que se producen alrededor de los sueros y las falsas reacciones positivas por una proteína llamada sustancia C. Después de este lapso se vuelca la solución de citrato de sodio y se observan las bandas de precipitación en el negatoscopio. Con los sueros que dan pruebas positivas se realiza una segunda inmunodifusión, en este caso cuantitativa, para ello se llenan las cavidades periféricas con diluciones del suero positivo desde 1/2 hasta 1/32.

Contrainmunoelectroforesis con inmunodifusión secundaria ( CIE ) Equipos y reactivos necesarios. 1. Sacabocados de 6 mm. y de 3 mm.de diámetro. 2. Portaobjetos de 2,5 por 7.5 cm . 3. Esquema de las cavidades, dos grandes en cada uno de los extremos y dos pequeñas en le centro. . La distancia entre las celdas periféricas y las centrales es de 10 mm. 4. Fuente de poder y cuba para electroforesis.

11

Maestría en Micología Médica

Preparación de antígenos – Dr. Ricardo Negroni

5. Micropipetas para 100 µl. 6. Agarosa. 7. Veronal sódico. 8. Polietilenglicol 6.000. 9. Citrato de sodio. 10. Agua destilada. 11. Cloruro de sodio. 12. Solución de mertiolato-borato de sodio. 13. Sueros problema. 14. Antígenos estandarizados para ID y CIE. 15. Suero patrón positivo. 16. Visor (negatoscopio). Preparación de la solución buffer de veronal sódico pH 8.2. Se prepara de la misma forma que para la electroforesis común de proteínas séricas.

Preparación del gel de agarosa Agarosa............................0,85 g. Buffer veronal..................99,0 ml Solución de mertiolato Borato de sodio 1/100.........1 ml. PEG.....................................1 g. La agarosa y el polietilenglicol son agregados a los 99 ml de buffer de veronal más la solución de mertiolato-borato de sodio que actúa como conservador. La mezcla se disuelve en baño de agua hirviendo, se lo deja reposar 5 minutos y se envasa en tubos a razón de 5 ml cada tubo. Una vez solidificado el gel se tapan los tubos y se guardan en la heladera hasta el momento de ser usados.

12

Maestría en Micología Médica

Preparación de antígenos – Dr. Ricardo Negroni

Preparación de los portaobjetos y realización de la CIE Licuar un tubo con gel de agarosa en baño de agua hirviendo: una vez fundido, se coloca con pipeta de 5 ml, 2,5 ml del gel sobre el portaobjetos. Se espera que solidifique a temperatura ambiente y se lo coloca en la heladera durante 30 minutos. Seguidamente se realizan las cavidades, dos periféricas del lado del ánodo con el sacabocados de 6 mm y dos centrales con el sacabocados de 3 mm de diámetro. En la cuba de electroforesis de vuelca la misma solución buffer que se empleó para disolver el gel de agarosa, hasta cubrir los electrodos. Colocar el portaobjetos sobre el puente y poner en sus extremos papel de filtro mojado en el buffer a fin de establecer el paso de corriente eléctrica. A continuación se coloca el suero en la cavidad del ánodo y el antígeno en la central. La corrida se hace a 100 voltios, con una intensidad de corriente de 5 mA y durante 1 hora. Finalizada la corrida se hacen dos nuevas cavidades con el sacabocados de 6 mm. del lado del cátodo a una distancia de 10 mm. de la cavidad del antígeno y en esta nueva cavidad vuelve a colocarse el suero problema, para hacer la inmunodifusión secundaria y captar, de esta forma, las parcelas del antígeno que migraron hacia el cátodo. La incubación se hace en cámara húmeda, a temperatura ambiente y durante 72 hs. Terminado el lapso de incubación se cubre el portaobjetos con la solución buffer de citrato de sodio pH 8.2 durante 2 hs y se procede a la lectura de la reacción en el negatoscopio, anotando el número de bandas de precipitación del ánodo y del cátodo.

Interpretación de los resultados de las pruebas serológicas Las pruebas de inmunodifusión y contrainmunoelectroforesis para detectar anticuerpos específicos han significado una importante ayuda en el diagnóstico de las micosis sistémicas endémicas. En el territorio sudamericano se observan tres de estas micosis, la paracoccidioidomicosis, la histoplasmosis y la coccidiodomicosis. Estas pruebas serológicas tienen poca sensibilidad pero son muy específicas, detectan anticuerpo IgG en las micosis evolutivas de curso crónico y su título es proporcional a la carga fúngica que sufre el paciente y, por lo tanto, a la gravedad de su enfermedad. Se observan reacciones serológicas cruzadas en sólo el 1 % de los pacientes con las técnicas de inmunoprecipitación en agar o en agarosa. En paracoccidioidomicosis el 90 % de los pacientes con enfermedad activa presentan pruebas serológicas positivas y se ha comprobado que los títulos de la prueba de inmunodifusión, así como el número de bandas detectados en la contrainmunoelectroforesis están relacionados a la gravedad de la micosis y descienden cuando evolucionan favorablemente con el tratamiento antifúngico. Las personas infectadas sin enfermedad evolutiva presentan pruebas serológicas negativas habitualmente.

13

Maestría en Micología Médica

Preparación de antígenos – Dr. Ricardo Negroni

En la coccidioidomicosis estas pruebas serológicas poseen el mismo valor que lo señalado en la enfermedad anterior y la sensibilidad de estas reacciones serológicas es aún mayor, más del 92 % de los pacientes presenta reacciones positivas. En la histoplasmosis las reacciones de inmunodifusión y contrainmunoelectroforesis presentan resultados positivos en los enfermos con histoplasmosis de primoinfección respiratoria grave, formas pulmonares crónicas excavadas, formas diseminadas crónicas y formas diseminadas subagudas no asociadas al HIV. Por el contrario estas pruebas suelen dar resultados negativos en una alta proporción de casos en las formas diseminadas agudas, en la histoplasmosis asociada al HIV y en las personas infectadas sin enfermedad evolutiva. Como en los casos anteriores los títulos de la prueba de inmunodifusión y el número de bandas en la contrainmunoelectroforesis es proporcional a la carga fúngica y permite documentar la evolución del paciente durante el tratamiento antifúngico. Las pruebas de inmunoprecipitación en medios gelosados en las aspergilosis suelen presentar resultados positivos en la aspergilosis pulmonar intracavitaria, en la pulmonar invasora crónica y en el 70 % de los enfermos con aspergilosis broncopulmonar alérgica. Estas pruebas suelen ser negativas en las formas invasoras agudas asociadas a neutropenia, en pacientes oncohematológicos, en las sinusitis de cualquier tipo y en las traqueobronquitis. En las candidiasis las pruebas de inmunodifusión con antígeno citoplasmático de C. albicans presenta resultados positivos en pacientes inmunocompetentes que sufren o han sufrido candidemias. Estas últimas pueden ser sintomáticas o no, muchas veces hay candidemias, por traslocación de levaduras a través de la pared intestinal, en personas con una colonización intensa de la luz del tubo digestivo, también se han observado en las personas sometidas a intervenciones quirúrgicas del tubo digestivo y en pacientes con candidiasis mucocutáneas crónicas. Por el contrario, la mayor parte de las candidiasis diseminadas en pacientes con inmunodeficiencias graves tienen un curso muy agudo, que unido a la falla de la inmunidad, impide la formación de suficiente cantidad de anticuerpos para ser detectados por estas técnicas serológicas. Por esta razón la prueba de inmunodifusión con este antígeno ha caído en desuso en la misma medida que se incrementó el número de candidiasis diseminadas vinculadas a inmunodeficiencias graves. En la actualidad la interpretación de esta prueba serológica es difícil, pero aún brinda una orientación importante en el diagnóstico de las endocarditis debidas a Candida sp, que afectan a personas inmunocompetentes y tienen una evolución subaguda.

14

Maestría en Micología Médica

Preparación de antígenos – Dr. Ricardo Negroni

Interpretación de las pruebas cutáneas Las intradermorreacciones con coccidioidina, histoplasmina y paracoccidioidina son pruebas para detectar reacciones de hipersensibilidad retardada. Se leen, como la tuberculina, a las 48 horas de haber efectuado la prueba y la reacción positiva indica que la persona se ha infectado con el microorganismo del cual se obtuvo el antígeno. No es útil para el diagnóstico de micosis-enfermedad salvo en circunstancias especiales. Su principal importancia es la capacidad de detectar infecciones en personas aparentemente sanas, lo permite hacer el reconocimiento de las áreas endémicas de estas micosis. Puede tener valor diagnóstico de infección actual en personas que tenían la prueba negativa antes de entrar a un foco de infección probable y que después de haberse expuesto al mismo se observó el cambio de la prueba de negativa a positiva. También suele considerarse de valor diagnóstico las reacciones positivas en niños menores a 2 años. Estas pruebas cutáneas dependen de la inmunidad mediada por células, por esta razón las intradermorreacciones suelen tornarse negativas en pacientes que sufren formas clínicas graves de las micosis endémicas. En pacientes tratados con éxito se recupera la capacidad de reaccionar positivamente al antígeno específico algunos meses después de haberse observado la mejoría clínica. En aquellas personas, en las que a pesar de haberse producido una respuesta clínica favorable al tratamiento, no se comprueba la positivización de la prueba cutánea, se ha observado que sufren recidivas de las micosis con mayor frecuencia. Las pruebas cutáneas con candidina y tricofitina son también reacciones de hipersensibilidad retardada y dan resultados positivos con bastante frecuencia en la población general, debido a la portación de estos microorganismos en las mucosas del tubo digestivo y la vagina o en la piel. Aproximadamente el 80 % de los adultos sanos reaccionan positivamente a la candidina y lo mismo sucede con el 10 ó 15 % de estas personas frente a la tricofitina. Por lo tanto, no tiene ningún valor diagnóstico, pero han sido de una valiosa ayuda para estudiar el estado de la inmunidad mediada por células en personas con sospecha de inmunodeficiencia. La intradermorreacción con aspergilina es utilizada en la aspergilosis broncopulmonar alérgica, como ya fue señalado, en esta afección se producen tres tipos de respuesta: la inmediata, a los 15-20 minutos, que forma de una roncha urticariana con seudópodos; la semidemorada a las 4-8 horas, que forma una pápula eritematosa y la tardía que determina la aparición de una pápula rojiza de 5 a 10 mm de diámetro a las 48 horas. El estudio histopatológico de la prueba semidemorada presenta los caracteres de una vasculitis con infiltrados de leucocitos polimorfonucleares neutrófilos perivasculares, en tanto que el mismo estudio en la reacción tardía, permite observar infiltrados linfomonocitarios perivasculares y perianexiales. La prueba cutánea con esporotriquina celular presenta respuestas demoradas positivas a las 48 hs, en personas que han sufrido infecciones por Sporothrix schenckii sintomáticas o asintomáticas, esta reacción persiste positiva por años después de la

15

Maestría en Micología Médica

Preparación de antígenos – Dr. Ricardo Negroni

infección. Por esta razón no tiene valor diagnóstico de enfermedad actual, pero es útil para determinar si un área es endémica de esporotricosis.

Bibliografía: 1) Ajello L., Walls K, Moore JC, Falcone R: Rapid production of complement fixation antigen for systemic mycotic diseases. J. Bacteriol. 1968; 77: 753-756. 2) Conti-Diaz, LA, Somma Moreira R E, Gezuele, E, Gimenez AC de, Pena M L, Mackinnon JE.: Immunoelectroosmophoresis immunodiffusion in paracoccidioidomycosis. Sabouraudia, 1973; 11: 39-41. 3) Chase W.: Estimation of proteins by Folin. Ciocalteu reaction. In: Methods in immunology and immunochemistry, V II. Academic Press, London, 1968; pp 273-275. 4) Kaufman L.: Serology: Its value in the diagnosis of coccidioidomycosis, cryptococcosis and histoplasmosis. Proc. Intern. Symp. On the Mycoses. Pan American Health Organization. 1970; pp. 96-100. 5) Kaufman L.: Value of immunodiffusion tests in the diagnosis of systemic diseases. Ann. Clin. Lab. Sci. 1973; 3: 141-146. 6) Manual of standardized serodiagnostic procedures for systemic mycosis. Part I: Immunodiffusion test. Pan American Health Organization. Washington. 1972. 7) Manual of Standardized serodiagnostic procedures for systemic mycosis. Part II: Complement fixation test. Pan American Health Organization, Washington, 1974. 8) Morris J R, Ribbons DW.: Determination of total carbohydrates. The phenol method. Methods in Microbiology III. Academic Press, London. 1971; pp. 272-277. 9) Negroni R.: Inmunología de las candidiasis. Mycopathologia. 1969; 38: 189-97. 10) Negroni R, Iovannitti C, Robles AM.: Estudio de las reacciones serológicas cruzadas entre antígenos del P. brasiliensis e H. capsulatum Rev. Asoc. Arg. Microbiol. 1976; 8: 68-73. 11) Negroni R, Robles AM, Galussio JC.: Estudio comparativo de las reacciones serológicas cuantitativas con un antígeno metabólico de Aspergillus fumigatus. Mycopathologia 1972; 48: 275-287. 12) Robles AM: Estudios inmunológicos en pacientes con micosis sistémicas. Tesis de doctorado. Arch. Argent. Dermatol. 1985; 35: 61-86. 13) Zaror L, Robles AM, Negroni R.: Pruebas de inmunodifusión en medios gelosados con el agregado de polietilenglicol 6000 para el serodiagnóstico de las micosis. Rev. Asoc. Arg. Microbiol.1978; 10: 61-64.

16