ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE SANIDAD ANIMAL

MANUAL DE LAS PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO Y DE LAS VACUNAS PARA LOS ANIMALES TERRESTRES (mamíferos, aves y abejas)

Volumen I

2004

Este Manual de animales terrestres ha sido editado por la Comisión de Estándares Biológicos de la OIE y adoptado por el Comité Internacional de la OIE

Manual de las Pruebas de Diagnóstico y de las Vacunas para los Animales Terrestres Quinta Edición, 2004 (Primera edición en español)

Manual of Recommended Diagnostic Techniques and Requirements for Biological Products: Volumen I, 1989; Volumen II, 1990; Volumen III, 1991. Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines: Segunda Edición, 1992 Tercera Edición, 1996 Cuarta Edición, 2000

ISBN 92-9044-632-3

©

Copyright OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES, 2004 12, rue de Prony, 75017 Paris, FRANCE Telephone: 33-(0)1 44 15 18 88 Fax: 33-(0)1 42 67 09 87 Electronic mail: [email protected] http://www.oie.int

Todas las publicaciones de la OIE (Organización mundial de sanidad animal) están protegidas por un Copyright internacional. Extractos pueden copiarse, reproducirse, adaptarse o publicarse en publicaciones periódicas, documentos, libros o medios electrónicos, y en cualquier otro medio destinado al público, con intención informativa, didáctica o comercial, siempre y cuando se obtenga previamente una autorización escrita por parte de la OIE. Las designaciones y nombres utilizados y la presentación de los datos que figuran en esta publicación no constituyen de ningún modo el reflejo de cualquier opinión por parte de la OIE sobre el estatuto legal de los países, territorios, ciudades o zonas ni de sus autoridades, fronteras o limitaciones territoriales.

PRÓLOGO

El propósito de este Manual de animales terrestres es facilitar el comercio internacional de animales y productos animales, así como contribuir a la mejora de los servicios de salud animal en todo el mundo. Mediante la descripción de los métodos de laboratorio para el diagnóstico de enfermedades y los requisitos para la producción y control de productos biológicos (principalmente vacunas), ambos consensuados internacionalmente, se pone de manifiesto lo que constituye el objetivo del Manual: la armonización de los elementos fundamentales de la prevención, vigilancia y control de las enfermedades animales. Este ambicioso objetivo ha requerido la cooperación de especialistas en salud animal de muchos países. La OIE, Organización Mundial de Sanidad Animal, es, a todas luces, una de las organizaciones más indicadas para acometer la mencionada tarea a nivel global. Las principales actividades de la organización, que fue fundada en 1924 y en 2004 cuenta con 166 estados miembros, son las siguientes: 1.

Asegurar la transparencia de la situación global relativa a la zoonosis y las enfermedades animales.

2.

Recabar, analizar y difundir información científico-veterinaria.

3.

Ofrecer conocimiento experto y promover la solidaridad internacional para el control de las enfermedades animales.

4.

Dentro de su mandato, sujeto al Acuerdo SPS con la OMC, salvaguardar el comercio internacional mediante la publicación de estándares sanitarios para el comercio internacional de animales y productos animales.

5.

Mejorar el marco legal y los recursos de los Servicios Nacionales de Veterinaria.

6.

Garantizar mejor la seguridad de los alimentos de origen animal y mejorar el bienestar animal mediante procedimientos científicos.

El Manual de animales terrestres, que trata de las enfermedades infecciosas y parasitarias de los mamíferos, aves y abejas, se publicó por primera vez en 1989. En cada nueva edición del Manual se han ampliado y actualizado los contenidos del mismo. Esta quinta edición incluye capítulos adicionales sobre infecciones zoonósicas, reflejando así la implicación creciente de la OIE en los temas de salud pública. Como complemento al Código de sanidad animal, el Manual de animales terrestres fija los estándares del laboratorio para todas las enfermedades de las listas A y B de la OIE así como para otras varias enfermedades de importancia global. El Manual se ha venido adoptando ampliamente como un texto de referencia de importancia crucial para los laboratorios de veterinaria de todo el mundo. Las enfermedades de animales acuáticos se tratan por separado en el Manual de animales acuáticos. El Comité Internacional de la OIE asignó a la Comisión de Estándares Biológicos de la Organización la tarea de encargar los capítulos y compilar el Manual de animales terrestres. Los originales se solicitaron a expertos en cada una de las enfermedades o en otros temas incluidos en el Manual. Después de su examen inicial por el Editor Técnico Consultor, los capítulos se enviaron a los revisores científicos y a expertos de los laboratorios de referencia de la OIE. También se enviaron a los países miembros, recabando su revisión y comentarios. Los comentarios recibidos fueron examinados por la Comisión de Estándares Biológicos y el Editor Técnico Consultor, quienes, en muchos casos, se los hicieron llegar a los autores para las aclaraciones pertinentes, antes de dar forma definitiva a los capítulos. El texto final fue aprobado por el Comité Internacional de la OIE. Ante el incremento del volumen de contenidos del Manual de animales terrestres, ha sido necesario publicar esta quinta edición en dos volúmenes. Es nuestro sincero deseo que este Manual resulte de la mayor utilidad para los responsables de diagnóstico veterinario y para los fabricantes de vacunas de todos los Países Miembros de la OIE. Doctor Bernard Vallat Director General de la OIE

Profesor Steven Edwards Presidente de la Comisión de Estándares Biológicos de la OIE Enero 2004

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

iii

AGRADECIMIENTOS

Estoy sumamente agradecido a las muchas personas que han contribuido con su esfuerzo a la preparación del presente Manual de animales terrestres. De forma especial, me gustaría expresar mi agradecimiento a: El Dr. B. Vallat, Director General de la OIE desde 2001 hasta el presente, por propiciar y apoyar el proyecto de preparación de la nueva edición del Manual de animales terrestres, Los Miembros de la Comisión de Estándares de la OIE, Prof. M. Truszczynski, Prof. S. Edwards, Dr. B. Schmitt y Dr. A. Golovko, y los observadores en la reunión de la Comisión de Estándares Biológicos, Dr. A. Diallo y Dr. P. Wright, quienes se responsabilizaron de encargar los capítulos y, junto con el Editor Técnico Consultor, editar las contribuciones hasta completar esta edición del Manual, Los colaboradores relacionados en las páginas xxiv-xxxv, que aportaron su inestimable tiempo y conocimiento experto en la redacción de los capítulos, Los revisores y expertos de los laboratorios de referencia de la OIE, quienes dedicaron su tiempo y conocimiento experto al examen de los capítulos, Los países miembros de la OIE que aportaron comentarios sobre los borradores de los capítulos que previamente se les había enviado. Esos comentarios resultaron esenciales para hacer del Manual un texto internacionalmente aceptable, Ms Sara Linnane, quien, como Editor Científico, organizó este complejo proyecto y contribuyó de forma importante a mejorar la calidad del texto, Los Doctores G.A. Cullen y J.E. Pearson, Editores Técnicos Consultores del Manual de animales terrestres, que contribuyeron en gran medida a la edición y armonización de los contenidos aportando la información requerida para subsanar cualquier laguna informativa, Los miembros del Departamento Científico y Técnico de la OIE y del Departamento de Publicaciones por su apoyo.

Dr. Abdoulaye Bouna Niang Presidente del Comité Internacional de la OIE

Enero 2004

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

v

AGRADECIMIENTOS POR LA EDICIÓN ESPAÑOLA

Deseo expresar mi más sincero agradecimiento a todos los que han posibilitado la primera edición en español del Manual de las pruebas de diagnóstico y de las vacunas para los animales terrestres y a todos los que con su trabajo han colaborado en la traducción al español, muy especialmente a: El Dr. Vallat, por impulsar este Proyecto tan necesario para los veterinarios y técnicos y especialistas de países de habla española. Los gobiernos del Reino de España y de la República de Argentina, y en concreto al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación (España) y al Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (SENASA, Argentina), por sus contribución económica a este Proyecto. Los miembros del “Comité Director para los proyectos de l´OIE (Organización Mundial de Sanidad Animal) de traducción del Manual of Standards for Diagnostics Tests and Vaccines al idioma español y Base terminológica multilíngüe para el ámbito de la Sanidad Animal y ciencias afines”, los Doctores Angot (Francia), Cabello Navarro (España), Acerbi (Argentina), Cruz de Urbina (Colombia), Serrano (Cuba), por su colaboración y apoyo. Los miembros del Grupo ad Hoc correspondiente, Profesores Doctores Rodríguez Ferri, Zepeda Seín, Gimeno, León Vizcaíno, Cuello Gijón y Sánchez Vizcaíno por su participación activa en las correcciones científicas y técnicas de los textos en español, así como por sus aportaciones, comentarios y críticas, que han resultado fundamentales para la calidad de la traducción. El Profesor Dr. Schudel, Jefe del Servicio Científico y Técnico de la OIE, que ha coordinado de forma impecable las relaciones entre nuestra organización y el Comité Director y el Grupo ad Hoc. El Profesor Dr. Gutiérrez Díez, miembro del Grupo ad Hoc, que ha llevado a cabo la coordinación lingüística y traductológica de la versión española de este Manual y a su equipo de traductores. El Profesor Dr. Crespo León, Secretario del Comité Director y del Grupo ad Hoc, que fue el coordinador científico y técnico de este Proyecto.

Dr. Abdoulaye Bouna Niang Presidente del Comité Internacional de la OIE

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

vii

CONTENIDOS

VOLUMEN I

Introducción: cómo usar el Manual de animales terrestres...................................... Lista de pruebas para el comercio internacional...................................................... Abreviaturas más comunes usadas en el Manual de animales terrestres Glosario terminológico.............................................................................................. Colaboradores..........................................................................................................

xi xiii xvii xix xxiv

PARTE I

INFORMACIÓN GENERAL

SECCCIÓN I.1.

CAPÍTULOS INTRODUCTORIOS

Capítulo I.1.1. Capítulo I.1.2. Capítulo I.1.3.

Métodos de muestreo............................................................................................... Gestión de calidad en los laboratorios de pruebas veterinarias............................... Principios de validación para las pruebas de diagnóstico de enfermedades infecciosas………………………………………………………………………………….

21

Capítulo I.1.4.

Validación y control de calidad de los métodos de la reacción en cadena de la polimerasa utilizados para el diagnóstico de enfermedades infecciosas………......

32

Capítulo I.1.5.

Pruebas para esterilidad y ausencia de contaminación en materiales biológico…………………………………………………………………………………….

Capítulo I.1.6. Capítulo I.1.7. Capítulo I.1.8.

Seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiología……………... Principios de producción de vacunas veterinarias.................................................... La Biotecnología en el diagnóstico de las enfermedades infecciosas y el desarrollo de vacunas……………………………………………………….…………….

3 14

40 49 62 75

Capítulo I.1.9.

El papel de los organismos oficiales en la regulación internacional de los productos biológicos de uso veterinario………………………………………………...

99

Capítulo I.1.10.

Métodos de laboratorio para ensayos de sensibilidad de bacterias frente a antimicrobianos……………………………………………………………………………....

112

PARTE 2

LISTADO DE ENFERMEDADES DE LA OIE

SECCCIÓN 2.1.

ENFERMEDADES DE LA LISTA A

Capítulo 2.1.1. Capítulo 2.1.2. Capítulo 2.1.3. Capítulo 2.1.4. Capítulo 2.1.5. Capítulo 2.1.6. Capítulo 2.1.7. Capítulo 2.1.8. Capítulo 2.1.9. Capítulo 2.1.10. Capítulo 2.1.11. Capítulo 2.1.12. Capítulo 2.1.13. Capítulo 2.1.14. Capítulo 2.1.15.

Fiebre aftosa............................................................................................................. Estomatitis vesicular................................................................................................. Enfermedad vesicular porcina.................................................................................. Peste bovina............................................................................................................. Peste de los pequeños rumiantes............................................................................ Pleuroneumonía bovina contagiosa.......................................................................... Dermatosis nodular contagiosa ……………………………………………………........ Fiebre del Valle del Rift…………………………………………………………………... Lengua azúl.............................................................................................................. Viruela ovina y viruela caprina.................................................................................. Peste equina africana............................................................................................... Peste porcina africana.............................................................................................. Peste porcina clásica (cólera del cerdo)................................................................... Gripe aviar muy virulenta.......................................................................................... Enfermedad de Newcastle........................................................................................

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

123 142 150 156 167 178 191 202 213 230 241 254 266 281 293

ix

Contenido

SECCIÓN 2.2.

ENFERMEDADES DE ESPECIES MÚLTIPLES- LISTA B

Capítulo 2.2.1. Capítulo 2.2.2. Capítulo 2.2.3. Capítulo 2.2.4. Capítulo 2.2.5. Capítulo 2.2.6. Capítulo 2.2.7. Capítulo 2.2.8.

Carbunco.................................................................................................................. Enfermedad de Aujeszky.......................................................................................... Equinococosis/Hidatidosis........................................................................................ Leptospirosis............................................................................................................. Rabia......................................................................................................................... Paratuberculosis (enfermedad de Johne) ................................................................ Cowdriosis................................................................................................................ Larva perforada del Nuevo Mundo (Cochliomyia hominivorax) y del Viejo Mundo (Chrysomya bezziana)………………………………………………………………….....

Capítulo 2.2.9. Capítulo 2.2.10. Capítulo 2.2.11.

Triquinelosis.............................................................................................................. Fiebre Q ................................................................................................................... Leishmaniosis...........................................................................................................

SECCIÓN 2.3.

ENFERMEDADES BOVINAS- LISTA B

Capítulo 2.3.1. Capítulo 2.3.2. Capítulo 2.3.3. Capítulo 2.3.4. Capítulo 2.3.5. Capítulo 2.3.6. Capítulo 2.3.7. Capítulo 2.3.8. Capítulo 2.3.9. Capítulo 2.3.10. Capítulo 2.3.11. Capítulo 2.3.12. Capítulo 2.3.13. Capítulo 2.3.14. Capítulo 2.3.15.

Brucelosis bovina...................................................................................................... Campilobacteriosis genital bovina............................................................................ Tuberculosis bovina.................................................................................................. Leucosis bovina enzoótica........................................................................................ Rinotraqueitis bovina infecciosa /vulvovaginitis pustular infecciosa......................... Tricomonosis............................................................................................................. Anaplasmosis bovina................................................................................................ Babesiosis bovina..................................................................................................... Cisticercosis bovina* (ver capítulo 2.10.1)................................................................ Dermatofilosis........................................................................................................... Teileriosis.................................................................................................................. Septicemia hemorrágica........................................................................................... Encefalopatía espongiforme bovina.......................................................................... Fiebre catarral maligna............................................................................................. Tripanosomosis (transmitida por la mosca tsé.tsé)………………………………......

x

307 320 334 343 356 377 391 402 413 421 433

445 477 489 503 514 526 534 548 560 561 564 580 593 615 626

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

INTRODUCCIÓN (Sobre la utilización del Manual de animales terrestres)

•

Estructura del Manual de animales terrestres y sistema de numeración

La Parte I, al comienzo del Manual, contiene diez capítulos introductorios sobre diversos temas generales de interés para los responsables de diagnóstico de los laboratorios de veterinaria. Cada uno de los capítulos es una introducción al tema enunciado, y todos ellos contienen información básica no estandarizada. El cuerpo principal del Manual de animales terrestres (Parte 2) contiene los estándares para las pruebas de diagnóstico y las vacunas para las enfermedades listadas en el Código sanitario de animales terrestres de la OIE. Estas aparecen en el mismo orden y con el mismo sistema de numeración que se utiliza en el Código Sanitario a fin de facilitar las referencias cruzadas entre los dos libros. La Lista A contiene las enfermedades transmisibles que pueden propagarse rápidamente, y con graves consecuencias, a través de las fronteras entre países. Son enfermedades de consecuencias especialmente graves por su incidencia en la salud pública y sus repercusiones socio-económicas. En la Lista B aparecen las enfermedades transmisibles de consecuencias igualmente graves para la salud pública y el ámbito socio-económico, aunque restringidas a ciertos países; tienen un impacto en el comercio internacional de animales y de productos animales. La lista B se subdivide según la especie animal hospedadora. Las cuatro primeras enfermedades de la Sección 2.10 se incluyen en algunas secciones de la Lista B, que se refieren a especies individuales; pero en estos capítulos se tratan varias especies, ofreciendo así una visión más amplia. En la Sección 2.10 se incluyen algunas otras enfermedades que también son importantes para el comercio, y a las que no se les asigna un capítulo específico en el Código sanitario de animales terrestres. Los colaboradores de los distintos capítulos aparecen relacionados en las páginas xxiv–xxxviii, pero la responsabilidad última en relación con los contenidos del Manual de animales terrestres recae en el Comité Internacional de la OIE. Al final del Volumen II se ofrece un índice alfabético de enfermedades.

• Formato de los capítulos Cada capítulo se inicia con un resumen del contenido, a fin de proporcionar a los oficiales veterinarios y a otros lectores una información sucinta sobre las pruebas y las vacunas disponibles para el tratamiento de la enfermedad. A continuación del resumen, se ofrece el texto completo, con información detallada para los operarios del laboratorio. En la Parte A de cada capítulo, se ofrece una introducción general sobre la enfermedad; en la Parte B, se incluye el diagnóstico de la enfermedad en el laboratorio; y en la Parte C (en los casos en que sea pertinente), se tratan los requisitos para las vacunas y los productos biológicos para el diagnóstico in vivo. La información sobre la producción y control de las vacunas o los materiales de diagnóstico se ofrecen a modo de ejemplo: no siempre es necesario ajustarse a esa información, sobre todo en los casos en que existan razones científicamente fundamentadas para la utilización de enfoques alternativos. Al final de cada capítulo, se incluyen las referencias bibliográficas como fuente de información adicional.

• Explicación de las pruebas descritas y del cuadro de las páginas xiii–xvi En el cuadro de las páginas xiii–xvi aparece un listado de las pruebas de diagnóstico clasificadas en dos categorías: “pruebas prescritas” y “pruebas alternativas”. Las prescritas son las pruebas que se exigen en el Código sanitario de animales terrestres para ser aplicadas a los animales antes de su transporte internacional. En el Manual de animales terrestres, tales pruebas aparecen en tipo azul. En la actualidad no se dispone de pruebas prescritas para todas las enfermedades

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

xi

Introducción

de las listas A y B. Las pruebas alternativas son aquellas que conviene aplicar para el diagnóstico de la enfermedad en un ámbito geográfico local, y que también se pueden utilizar de cara a la importación/exportación de animales previo acuerdo bilateral. Dentro de los capítulos, a menudo se describen otras pruebas que pueden ser de utilidad práctica en situaciones de ámbito local o que están todavía en proceso de desarrollo.

• Lista de laboratorios de referencia de la OIE En la Parte 3 del presente Manual de animales terrestres se ofrece una lista de laboratorios de referencia de la OIE. Dichos laboratorios han sido designados por la OIE como centros de excelencia por su conocimiento experto en campos específicos. Tienen capacidad para asesorar a otros laboratorios sobre cuestiones de metodología. En ocasiones pueden obtenerse de estos laboratorios de excelencia cepas estándar de microorganismos o reactivos de referencia (por ejemplo, antisueros o antígenos). La lista de laboratorios de referencia será actualizada cada año por el Comité Internacional de la OIE. Existe una lista actualizada en la página Web de la propia OIE.

* * *

xii

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

LISTA DE PRUEBAS PARA EL COMERCIO INTERNACIONAL

En el cuadro inferior aparece un listado de las pruebas de diagnóstico clasificadas según dos categorías: “pruebas prescritas” y “pruebas alternativas”. Las prescritas se exigen en el Código sanitario de animales terrestres de la OIE para el transporte internacional de animales y de productos animales, y se consideran como las más adecuadas para determinar el estado de salud de los animales. Tales pruebas aparecen impresas en letra azul en el Manual de animales terrestres. En la actualidad no se dispone de pruebas prescritas para todas las enfermedades de las listas A y B. Las pruebas alternativas son las adecuadas para el diagnóstico de la enfermedad en un ámbito geográfico local, y también se pueden utilizar de cara a la importación/exportación de animales, previo acuerdo bilateral. Dentro de los capítulos, se describen a menudo otras pruebas que pueden ser de utilidad práctica en situaciones de ámbito local o que están todavía en proceso de desarrollo.

Capítulo Nº

Nombre de la enfermedad

2.1.1.

Fiebre aftosa

2.1.2.

Estomatitis vesicular

2.1.3.

Enfermedad vesicular porcina

2.1.4.

Peste bovina

2.1.5.

Peste de los pequeños rumiantes

2.1.6.

Pleuroneumonía bovina contagiosa

2.1.7.

Pruebas prescritas

Pruebas alternativas

ELISA*, NV

FC

FC, ELISA, NV

–

NV

ELISA

ELISA

NV

NV

ELISA

FC, ELISA

–

Dermatosis nodular contagiosa

–

VN

2.1.8.

Fiebre del Valle del Rift

–

HI, ELISA, PRN

2.1.9.

Lengua azul

Id. agente, IGDA, ELISA, PCR

NV

2.1.10.

Viruela ovina y viruela caprina

–

NV

2.1.11.

Peste equina africana

FC, ELISA

NV

2.1.12.

Peste porcina africana

ELISA

IFI

2.1.13.

Peste porcina clásica (cólera del cerdo)

NPLA, FAVN, ELISA

–

2.1.14.

Gripe aviar muy virulenta

–

IGDA, HI

2.1.15.

Enfermedad de Newcastle

–

HI

2.2.1.

Carbunco

–

–

2.2.2.

Enfermedad de Aujeszky

ELISA, NV

–

2.2.3.

Equinococosis/Hidatidosis

–

–

2.2.4.

Leptospirosis

–

MAT

2.2.5.

Rabia

NV

ELISA

2.2.6.

Paratuberculosis (enfermedad de Johne

–

DTH, ELISA

2.2.7.

Cowdriosis

–

ELISA, IFI

2.2.8.

Larva perforada del Nuevo Mundo (Cochliomyia hominivorax y del Viejo Mundo (Chrysomya bezziana)

–

Id. agente

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

xiii

Lista de pruebas para el comercio internacional

•

Hay que consultar los capítulos del Manual de animales terrestres para comprobar el método prescrito

Capítulo Nº 2.2.9.

Triquinelosis

2.2.10.

Pruebas prescritas

Pruebas alternativas

Id. agente

ELISA

Fiebre Q

–

CF

2.2.11.

Leishmaniosis

–

Id. agente

2.3.1.

Brucelosis bovina

–

2.3.2.

Campilobacteriosis genital bovina

BBAT, FC, ELISA, FPA Id. agente

2.3.3.

Tuberculosis bovina

2.3.4.

Leucosis bovina enzoótica

2.3.5. 2.3.6.

Rinotraqueitis bovina infecciosa /vulvovaginitis pustular infecciosa Tricomonosis

2.3.7.

Prueba de la tuberculina IGDA, ELISA

– – PCR

NV, ELISA, Id. agente (sólo semen) Id. agente

Agg. moco

Anaplasmosis bovina

–

FC, Agg. card

2.3.8.

Babesiosis bovina

–

ELISA, IFI

2.3.9.

Cisticercosis bovina

–

Id. agente

2.3.10.

Dermatofilosis

–

–

2.3.11.

Teileriosis

Id. agente, IFI

–

2.3.12.

Septicemia hemorrágica

–

Id. agente

2.3.13.

Encefalopatía espongiforme bovina

–

–

2.3.14.

Fiebre catarral maligna

–

NV, IFI, PCR

2.3.15.

Tripanosomosis (transmitida por la mosca tsé-tsé) Epididimitis ovina (Brucella ovis)

–

IFI

FC

ELISA

BBAT, FC

Prueba de la brucelina

–

–

IGDA, ELISA

–

FC

–

2.4.1. 2.4.2. 2.4.3. 2.4.4/5.

xiv

Nombre de la enfermedad

Brucelosis caprina y ovina (no debida Brucella ovis) Agalaxia contagiosa Artritis/encefalitis caprina y Maedi-visna

–

2.4.6.

Pleuroneumonía caprina contagiosa

2.4.7.

–

FC

2.4.8.

Aborto enzoótico de las ovejas (Clamidiosis ovina) Prurigo lumbar

–

–

2.4.9.

Adenomatosis pulmonar ovina

–

–

2.4.10.

Enfermedad de Nairobi

–

–

2.4.11.

Salmonelosis (S. Abortus ovis)

–

Id. agente

2.5.1.

Metritis equina contagiosa

Id. agente

–

2.5.2.

Durina

FC

IFI, ELISA

2.5.3.

–

HI, FC, PRN

2.5.4.

Encefalomielitis equina (del Este y del Oeste) Anemia infecciosa equina

IGDA

ELISA

2.5.5.

Gripe equina

–

HI

2.5.6.

Piroplasmosis equina

ELISA, IFI

FC

2.5.7.

Rinoneumonitis equina

–

NV

2.5.8.

Muermo

Prueba de la maleína, FC

–

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Lista de pruebas para el comercio internacional

Capítulo Nº

Nombre de la enfermedad

Pruebas prescritas

Pruebas alternativas

2.5.10.

Arteritis vírica equina

NV, Id. agente (en muestras de semen)

–

2.5.11.

Sarna equina

–

Id. agente

2.5.12.

Encefalomielitis equina venezolana

–

HI, FC, PRN

2.5.13.

Linfangitis epizoótica

–

–

2.5.14.

Encefalitis japonesa

–

–

2.5.15.

Tripamosomosis (Trypansoma evansi)

–

–

2.6.1.

Rinitis atrófica porcina

–

–

2.6.2.

Brucelosis porcina

ELISA

BBAT, FPA

2.6.3.

Encefalomielitis por enterovirus (anteriormente enfermedades de Teschen/Talfan) Gastroenteriris transmisible

–

NV

–

NV, ELISA

Síndrome reproductivo y respiratorio porcino Cisticercosis porcina

–

ELISA, IFI, IPMA

–

Id. agente

Bursitis infecciosa (Enfermedad de Gumboro ) Enfermedad de Marek

–

IGDA, ELISA

–

IGDA

–

Agg., HI

2.7.4.

Micoplasmosis aviar (Mycoplasma gallisepticum) Clamidiosis aviar

–

–

2.7.5.

Pulorosis y taifosis aviar

–

Agg., Id. agente

2.7.6.

Bronquitis infecciosa aviar

–

NV, HI, ELISA

2.7.7.

Laringotraqueitis infecciosa aviar

–

IGDA, NV, ELISA

2.7.8.

Tuberculosis aviar

–

Prueba de la tuberculina, Id. agente

2.7.9.

Hepatitis vírica del pato

–

–

2.7.10.

Enteritis vírica del pato

–

–

2.7.11.

Cólera aviar (pasteulerosis aviar)

–

–

2.7.12.

Viruela aviar

–

–

2.8.1.

Mixomatosis

–

IGDA, FC, IFI

2.8.2.

Tularemia

–

Id. agente

2.8.3.

Enfermedad hemorrágica del conejo

–

HI

2.9.1.

Acariosis de las abejas

–

–

2.9.2.

Loque americana

–

–

2.9.3.

Loque europea

–

–

2.9.4.

Nosemosis de las abejas

–

–

2.9.5.

Varroosis

–

–

2.9.6.

Infestación de las abejas melíferas por Tropilaelaps (Tropilaelaps clareae, T. koenigerum)

–

–

2.10.1.

Cisticercosis

2.6.4. 2.6.5. 2.6.6. 2.7.1. 2.7.2. 2.7.3.

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Id. agente

xv

Lista de pruebas para el comercio internacional

Capítulo Nº

Nombre de la enfermedad

Pruebas prescritas

Pruebas alternativas

2.10.2.

Enfermedades bunyavirales de animales (excluyendo la Fiebre del Valle del Rift)

–

–

2.10.3.

Salmonelosis

–

Id. agente

2.10.4.

Sarna

–

Id. agente

2.10.5.

Enfermedad de la frontera

Id. agente

–

2.10.6.

Diarrea vírica bovina

Id. agente

–

2.10.7.

Encefalitis del Oeste del Nilo

–

–

2.10.8.

Campylobacter jejuni and C. Coli

–

–

2.10.9.

Criptosporidiosis

–

–

2.10.10.

Enfermedades víricas de Hendra y de Nipah

–

–

2.10.11.

Gripe porcina

–

–

2.10.12.

Toxoplasmosis

–

–

2.10.13.

Escherichia coli Verocitotoxigénica

–

–

2.10.14.

Listeria monocytogenes

–

–

Nota: Las pruebas prescritas por el Código sanitario de animales terrestres a efectos de comercialización internacional se han impreso en letra azul en el Manual de animales terrestres.

Abreviaturas Id. agente

Identificación del agente

HI

Inhibición de la hemaglutinación

Agg.

Prueba de aglutinación

IFI

Inmunofluorescencia indirecta

IGDA

Inmunodifusión en gel de agar

IPMA

Prueba de inmunoperoxidasa en monocapa

BBAT

Prueba con antígeno tamponado de Brucella

MAT

Prueba de aglutinación microscópica

FC

(Prueba de) fijación del complemento

NPLA

Prueba de neutralización acoplada a la peroxidasa

DTH

Hipersensibilidad retardada

PCR

Reacción en cadena de la polimerasa

ELISA

Prueba de enzimoinmunoensayo

PRN

Neutralización por reducción de calvas

FAVN

Neutralización vírica con anticuerpo fluorescente

NV

Neutralización vírica

FPA

Prueba de polarización de la fluorescencia

–

Prueba por designar

xvi

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

ABREVIATURAS UTILIZADAS EN EL MANUAL DE ANIMALES TERRESTRES

ABTS ATCC1 BBAT BFK BGPS BHK BLP BPAT BSA BSF CAM CEF CFU CIEP CK CPLM CSY DEAE DEPC DICT50 DMEM DMSO DTH ECP EGTA EID ELISA EMTM EYL FAT FAVN FBS FC FITC FLK FPA g GIT HA

ácido 2,2’-azino-di-(3-etil-benzotiazolina)6-sulfónico Colección americana de cultivos tipo Prueba con antígeno tamponado de Brucella (Células de ) riñón fetal bovino Medio con extracto de carne-glucosapeptona y suero Línea celular de riñón de hamster neonato Lactosa y peptona tamponada Prueba con antígeno tamponado en placa Albúmina de suero bovino Factores del suero bovino Membrana corioalantoidea Fibroblasto de embrión de pollo Unidad formadora de colonia Contrainmunoelectroforesis Células de riñón de ternero Medio con cisteína-peptona-infusión de hígado y maltosa Medio con caseína-sacarosa y levadura (con agar) Dietilaminoetil Dietil pirocarbonato Dosis infectiva del 50% en cultivo celular Medio de Eagle modificado por Dulbecco Dimetil sulfóxido Hipersensibilidad retardada Efecto citopático Ácido etilén glicol tetra-acético Dosis infecciosa en huevo Prueba de enzimoinmunoensayo Medio de Tobie modificado por Evans Solución salina equilibrada de Earle con lactalbúmina y levadura Prueba de anticuerpo fluorescente Neutralización vírica con anticuerpo fluorescente Suero bovino fetal (Prueba de) fijación del complemento Isotiocianato de fluoresceína (Células de) riñón de cordero fetal Prueba de polarización de la fluorescencia Fuerza centrífuga relativa Prueba de inhibición del crecimiento Hemaglutinación

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

HAD HBSS HEP HEPES HI HRPO IB ICFTU ICPI ID50 IFI IGDA IHA IPMA IVPI LA LD LEP MAb MAT MCS MDT MEM MHC MSV NI NV OGP OPD OPG PAGE PAP PAS PBS PCR PD PFU PHA PPD PPLO PRN

Hemadsorción Solución salina equilibrada de Hanks Alto número de pases en huevo (virus) Ácido N-2-hidroxietilpiperazina, N-2etanosulfónico (tampón) Inhibición de la hemaglutinación Peroxidasa de rábano Prueba de inmunodetección Unidad internacional de la prueba de fijación de complemento Índice de patogenicidad intracerebral Dosis infecciosa media Prueba de inmunofluorescencia indirecta Inmunodifusión en gel de agar Hemaglutinación indirecta Prueba de inmunoperoxidasa en monocapa Índice de patogenicidad intravenosa Aglutinación con látex Dosis letal Bajo número de pases en huevo (virus) Anticuerpo monoclonal Prueba de aglutinación microscópica Stock de células iniciales Tiempo letal medio Medio mínimo esencial Complejo mayor de histocompatibilidad Virus inicial de siembra Índice de neutralización Neutralización viral 1-octil-beta-D-glucopiranósido (tampón) Ortofenildiamina (tampón) Solución conservante con oxalasa-fenol y glicerina Electroforesis en gel de poliacrilamida Peroxidasa–antiperoxidasa (procedimiento de tinción) Reacción de Schiff con ácido periódico Solución salina tamponada con fosfato Reacción en cadena de la polimerasa Dosis protectora Unidad formadora de calvas o halos Prueba de hemaglutinación pasiva Derivado de proteína purificada Organismos semejantes a los causantes de pleuroneumonía Neutralización por reducción de calvas

xvii

Abreviaturas utilizadas en el Manual de animales terrestres

PSG

Solución salina tamponada con fosfato más glucosa RBC Eritrocito RFLP Polimorfismo de fragmentos de restricción RK Riñón de conejo RPM Revoluciones por minuto RSA Aglutinación sérica rápida RT-PCR Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa SAT Prueba de aglutinación sérica SDS Dodecil sulfato sódico

SNC SPF SPG SRBC TMB TSI UI VB VBS Vero

Sistema nervioso central Libre de patógeno específico Sacarosa, fosfato y ácido glutámico Eritrocito de oveja Tetrametil benzidina Medio de hierro y triple azúcar Unidades internacionales Tampón veronal Solución salina tamponada con veronal Células de riñón de mono verde african

ABREVIATURAS DE LOS NOMBRES DE ENFERMEDADES AEC AIE APO AVE BI BIA CA DNC DVB EA EEB EEE EEO EEV EHC EM EV EVP EVP FA FCM FVR GAMV

1

Artritis/encefalitis caprina Anemia infecciosa equina Adenomatosis pulmonar ovina Arteritis vírica equina Bursitis infecciosa Bronquitis infecciosa aviar Clamidiosis aviar Dermatosis nodular contagiosa Diarrea vírica bovina Enfermedad de la frontera Encefalopatía espongiforme bovina Encefalomielitis equina del este Encelalomielitis equina del oeste Encefalomielitis equina venezolana Enfermedad hemorrágica del conejo Enfermedad de Marek Estomatitis vesícular Enfermedad vesicular porcina Enteritis vírica del pato Fiebre aftosa Fiebre catarral maligna Fiebre del Valle del Rift Gripe aviar muy virulenta

GET HVP LA LBE LPNM LPVM LTI MV NPO PBC PEA PNCC PPA PPC PPR RBI/VPI RE SH SRRP

Gastroenteritis transmisible Hepatitis vírica del pato Lengua azul Leucosis bovina enzoótica Larva perforada del nuevo mundo Larva perforada del viejo mundo Laringotraqueitis infecciosa aviar Maedi-visna Neumonía progresiva ovina de las Ovejas Pleuroneumonía bovina contagiosa Peste equina africana Pleuroneumonía caprina contagiosa porcino Peste porcina africana Peste porcina clásica Peste de los pequeños rumiantes Rinotraqueitis bovina infecciosa/ Vulvovaginitis pustular infecciosa Rinoneumonitis equina Septicemia hemorrágica Síndrome reproductivo y respiratorio

Colección americana de cultivos tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, Estados Unidos de América.

xviii

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

GLOSARIO DE TÉRMINOS

Las definiciones dadas a continuación se han seleccionado con el criterio restrictivo de incluir solamente las que pueden ser de utilidad para los usuarios del Manual de animales terrestres.

•

Absorbancia/densidad óptica

Absorbancia y densidad óptica son términos utilizados para indicar la fuerza de la reacción. Se utiliza un espectrofotómetro para medir la cantidad de luz de la longitud de onda específica absorbida por una muestra, y la absorbancia es proporcional a la cantidad de material analizado que está presente.

•

Animal de referencia

Cualquier animal cuyo estatus infeccioso pueda definirse de forma inequívoca; puede incluir animales enfermos, infectados, vacunados, inmunizados o animales sin ninguno de los rasgos anteriores.

•

Armonización

Calibración de métodos de prueba idénticos o similares frente a reactivos internacionales estándar y expresión de los resultados cuantitativos o semi-cuantitativos de la prueba, que han sido normalizados frente a estándares de trabajo incorporados en cada realización de la prueba.

•

Característica de la realización

Propiedad del método de prueba; puede incluir la sensibilidad y especificidad analíticas, la exactitud, la precisión, y/o la sensibilidad y especificidad diagnósticas.

•

Célula maestra (línea, stock, inóculo)

Conjunto de alícuotas de células de un determinado número de pases, que se utilizan en la preparación o prueba de un producto biológico, se distribuye dentro de recipientes en una operación individual, se procesa conjuntamente y se almacena de forma que queda garantizada la uniformidad y la estabilidad, y se evita la contaminación.

•

Células primarias

Grupo de células originales derivadas de tejido normal incluyendo el décimo subcultivo.

•

Centrifugación

En todo el texto del Manual, el promedio de centrifugación se expresa como la fuerza centrífuga relativa, simbolizada por ‘g’. La fórmula es: (rpm ‰ 0,10472)2

‰ radio (cm) = g

980 donde rpm es la velocidad del rotor en revoluciones por minuto, y donde radio (cm) es el radio del brazo del rotor hasta la parte baja del tubo, en centímetros. Puede ser necesario calcular el rpm necesario para alcanzar un valor dado de g, con un rotor específico. La fórmula es: rpm =

«g ‰ 980 /radio (cm) 0,10472

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

xix

Glosario de términos

•

Comparación entre laboratorios (Ensayo en anillo)

Cualquier evaluación de la realización de una prueba y/o de la competencia de un laboratorio para ensayar muestras determinadas, llevada a cabo por dos o más laboratorios; un laboratorio puede actuar como referencia en la definición de los atributos de las muestras a ensayar.

•

Control del proceso

Los procedimientos de prueba llevados a cabo durante la fabricación de un producto biológico para garantizar que el producto cumple con las normas de calidad acordados.

•

Controles internos

Todas las actividades tendentes a garantizar la calidad dentro de un laboratorio y que están directamente relacionadas con el control, la validación, y el mantenimiento de las condiciones de realización y suficiencia técnica de la prueba.

•

Diluciones

Cuando se dan diluciones para preparar reactivos líquidos, éstas se expresan como, por ejemplo, 1 en 4 partes o una cuarta parte (1/4), lo que significa que una parte se añade a cuatro partes, es decir, un 20% de la solución A en B.

•

•

v/v = volumen a volumen (dos líquidos)

•

w/v = peso a volumen (sólido añadido a líquido).

Diluciones utilizadas en las pruebas de neutralización vírica

Hay dos formas convencionales de expresar la dilución utilizada en las pruebas de neutralización vírica (NV). En Europa es costumbre expresar la dilución antes de la adición del antígeno, pero en Estados Unidos y en otros lugares, es común expresar las diluciones después de la adición del antígeno. Estas convenciones alternativas se expresan en el presente Manual como “dilución inicial” o “dilución final”, respectivamente.

•

Eficacia

Capacidad específica que tiene un producto biológico para producir el resultado esperado, cuando aquél se utiliza bajo las condiciones recomendadas por el fabricante.

•

Ensayo

Sinónimo de prueba o método de prueba, como enzimoinmunoensayo o prueba de fijación de complemento.

•

Especificidad (analítica)

Grado en el que los materiales analizados distintos al material problema reaccionan en una prueba; cuanto más alto sea el nivel de reacciones cruzadas, más baja será la especificidad analítica.

•

Especificidad (diagnóstica)

Proporción de animales de referencia no infectados que se sabe que presentan un resultado negativo en la prueba; se considera que los animales infectados que presentan un resultado positivo tienen resultados positivos falsos.

•

Especificidad (relativa)

Proporción de animales de referencia, definidos como negativos mediante un método de prueba o una combinación de métodos, que también dan resultado negativo en el ensayo que se compara.

•

Espécimen

Material sometido a prueba.

•

Esterilidad

Ausencia de microorganismos contaminantes viables, que se establecerá mediante pruebas autorizadas y adecuadas.

xx

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Glosario de términos

•

Exactitud

Nivel de concordancia entre el valor obtenido en la prueba y el valor esperado para un estándar de referencia de actividad o título conocido.

•

Incidencia

Estimación del número de nuevas infecciones en una población susceptible durante un período de tiempo determinado; no debe confundirse con la prevalencia.

•

Inóculo de producción

Un organismo en un determinado número de pases, que se utiliza, sin propagación adicional, para iniciar la preparación de un lote de producción.

•

Inóculo de trabajo

Organismo con un número de pases comprendido entre el inóculo original y el inóculo de producción.

•

Inóculo original (agente, cepa)

Conjunto de alícuotas de un organismo de un determinado número de pases, del que se derivan todos los otros pases del inóculo, que se obtienen de un lote individual, se distribuyen en recipientes en una operación individual, se procesan conjuntamente y se almacenan de forma que queden aseguradas la uniformidad y la estabilidad y se eviten la contaminación.

•

Laboratorio de referencia

Laboratorio de reconocido nivel de capacitación científica y diagnóstica en que concierne a una determinada enfermedad animal y/o a la metodología de pruebas; incluye la capacidad para describir y evaluar los reactivos y muestras de referencia.

•

Libre de patógenos específicos (SPF)

Animales de los que se ha demostrado, mediante el uso de pruebas adecuadas, que están libres de microorganismos patógenos específicos; también se refiere a los huevos provenientes de aves SPF.

•

Línea celular

Línea de células transformada y estable que tiene una alta capacidad de multiplicación in vitro.

•

Lote

Todas las vacunas u otros reactivos, tales como antígeno o antisueros, derivados del mismo lote homogéneo e identificados mediante un solo número de código.

•

Método de la prueba

Procedimiento técnico específico para la detección del material a analizar (sinónimo de ensayo).

•

Muestra

Material obtenido de un espécimen y utilizado en las pruebas.

•

Potencia

La potencia relativa de un producto biológico puesta de manifiesto por los métodos de prueba apropiados. (Inicialmente, la potencia se mide utilizando una prueba de eficacia en animales. Más tarde aquella puede correlacionarse con pruebas de contenido antigénico, o respuesta a anticuerpos, para pruebas rutinarias de potencia de lotes.

•

Precisión

Grado de dispersión de los resultados para una muestra ensayada repetidamente.

•

Prevalencia

Estimación de la proporción de animales infectados dentro de una población en un momento dado. No debe confundirse con la incidencia.

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

xxi

Glosario de términos

•

Producto final(lote)

Todos los recipientes finales sellados, que se han llenado a partir de un mismo lote homogéneo de vacunas en una sesión de trabajo, liofilizados conjuntamente en una operación continua (si es pertinente), sellados en una sesión de trabajo e identificados con un número de código único.

•

Prueba de suficiencia

Medición de la competencia del laboratorio mediante la comparación entre laboratorios; esta definición implica que los laboratorios participantes utilizan los mismos métodos de prueba, los mismos reactivos y controles y que los resultados se expresan cualitativamente.

•

Pruebas

•

Pruebas alternativas Métodos de prueba que aparecen en el Manual de Animales Terrestres, que se consideran adecuados para el diagnóstico de las enfermedades en un ámbito local y que también pueden utilizarse para la importación y exportación reguladas por convenios bilaterales.

•

Pruebas confirmativas Métodos de prueba de alta especificidad diagnóstica que se utilizan para confirmar resultados, generalmente resultados positivos, derivados de otros métodos de prueba.

•

Pruebas de criba Pruebas de alta sensibilidad diagnóstica adecuadas para aplicación a gran escala.

•

Pruebas prescritas Los métodos de prueba exigidos por el Código de Sanidad Animal de la OIE para el transporte internacional de animales y productos animales, y que se consideran óptimos para determinar el estado sanitario de los animales.

•

Pruebas de equivalencia

Determinación de ciertas características de realización de la prueba, propias de métodos de prueba nuevos y/o diferentes, mediante la comparación con un método de prueba estándar llevada a cabo por varios laboratorios. En esta definición está implícito que los laboratorios participantes utilizan sus propios métodos de prueba, sus reactivos y controles, y que los resultados se expresan de forma cualitativa.

•

Punto de corte/umbral

Valor resultante de una prueba seleccionado para distinguir entre resultados positivos y negativos, y que puede incluir zonas indeterminadas o sospechosas.

•

Pureza

Calidad de un producto biológico preparado hasta su forma final y: a)

Relativamente libre de microorganismos y material (orgánico e inorgánico) extraños, lo que vendrá avalado por métodos de prueba adecuados al producto; y

b)

Libre de microorganismos y material extraños que podrían afectar de forma adversa a la inocuidad, la potencia o la eficacia del producto.

•

Reacción cruzada

Actividad detectable en un método de prueba, atribuible a un material a analizar procedente de, o producido por otro organismo que da como resultado una reacción positiva falsa; los ensayos de este tipo tienen una especificidad analítica baja.

•

Reactivos estándar

•

Reactivos estándar internacionales Reactivos estándar por medio de los cuales se contrastan los demás reactivos y pruebas; preparados y distribuidos por un Laboratorio Internacional de Referencia, para ser remitidos a los Laboratorios Nacionales.

xxii

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Glosario de términos

•

Reactivos estándar nacionales Los reactivos estándar contrastados mediante comparación con los reactivos estándar internacionales; son preparados y distribuidos por los laboratorios de referencia nacionales para ser remitidos a las redes de laboratorios nacionales.

•

Estándares de trabajo (reactivos) Reactivos estándar contrastados mediante comparación con los reactivos estándar nacionales; se incluyen en las pruebas de diagnóstico rutinarias como control y/o para normalización de los resultados de la prueba.

•

Repetibilidad

Nivel de acuerdo entre las réplicas de una muestra, tanto dentro una aplicación como entre varias aplicaciones del mismo método de prueba en un mismo laboratorio.

•

Reproducibilidad

La capacidad que una prueba tiene de proporcionar resultados consistentes cuando se aplica a las alícuotas de la misma muestra en diferentes laboratorios.

•

Seguridad

Ausencia de propiedades causantes de reacciones locales indebidas o sistémicas, cuando se utilizan como recomendadas o sugeridas por el fabricante, y sin riesgo conocido para los animales próximos, los humanos o el medio ambiente.

•

Sensibilidad (analítica)

La cantidad más pequeña del material de prueba que se puede detectar; el material de prueba puede consistir en anticuerpos, antígenos, ácidos nucleicos u organismos vivos.

•

Sensibilidad (diagnóstica)

Proporción de animales de referencia infectados que se sabe que dan resultado positivo en la prueba; se considera que los animales infectados que presentan un resultado negativo tienen resultados negativos falsos.

•

Sensibilidad (relativa)

Proporción de animales de referencia, definida como positiva por un método o por una combinación de métodos de prueba, que también presentan un resultado positivo en el ensayo que se compara.

•

Temperatura ambiente

El término “temperatura ambiente” se refiere a la temperatura de un entorno de trabajo confortable. No se pueden fijar límites precisos para este término, pero las cifras de referencia son 18–25°C. Cuando en una prueba se especifica la temperatura ambiente, ésta debería lograrse con aire acondicionado, si es preciso; de lo contrario, los parámetros de la prueba pueden verse afectados.

•

Valor predictivo (negativo)

Proporción de animales con resultado negativo en una prueba sin estar realmente infectados; el valor predictivo está influido por la sensibilidad y especificidad diagnóstica, así como por la prevalencia de la infección.

•

Valor predictivo (positivo)

Proporción de animales que están realmente infectados y presentan un resultado positivo en una prueba; el valor de predicción está influenciado por la sensibilidad y especificidad diagnóstica, así como por la prevalencia de la infección

* * *

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

xxiii

COLABORADORES

L IS T A DE C O L A BO RA DO RE S Y DIRE C C IO NE S P RO F E S IO NA L E S Los capítulos del Manual de animales terrestres han sido confeccionados mediante invitación expresa de la OIE a sus respectivos autores. Siguiendo el procedimiento estándar de esta organización, los capítulos se distribuyen entre sus países miembros y entre expertos en la enfermedad correspondiente a fin de recabar sus comentarios. A continuación, la Comisión de Estándares Biológicos y el Editor Consultor de la OIE proceden a incorporar al texto las modificaciones propuestas. Una vez completado el proceso de revisión del texto y finalizada su redacción, el Manual de animales terrestres se presentó al Comité Internacional de la OIE durante su Sesión General Anual para su aprobación antes de publicarse. De esta forma, el Manual se ha convertido en un texto estándar de la OIE como fruto del consenso internacional. Por esta razón, los nombres de los colaboradores no aparecen en la cabecera del correspondiente capítulo sino que se ofrecen en un listado global. La Comisión de Estándares Biológicos valora enormemente el trabajo de los siguientes colaboradores: I.1.1. Métodos de muestreo

Dr J.E. Pearson 4016 Phoenix St., Ames, Iowa 50014, USA.

I.1.2. Gestión de calidad en los laboratorios de pruebas veterinarias

Dr A. Wiegers USDA, APHIS, VS, Center for Veterinary Biologics, Policy, Evaluation, and Licensing, Biotechnology, Immunology, and Diagnostics, 510 South 17th Street, Suite 104, Ames, Iowa 50010, USA.

I.1.3. Principios de validación para las pruebas de diagnóstico de enfermedades infecciosas

Dr R. Jacobson (retired) Formerly Diagnostic Laboratory, College of Veterinary Medicine, Cornell University, Ithaca, New York 14850-5786, USA.

I.1.4. Validación y control de calidad de los métodos de la reacción en cadena de la polimerasa utilizados para el diagnóstico de enfermedades infecciosas

Dr S. Belak & Dr P. Thorén Department of Virology, National Veterinary Institute, Ulls väg 2B, SE-751 89 Uppsala, Sweden

I.1.5. Pruebas para esterilidad y ausencia de contaminación en materiales biológicos

Dr L. Elsken USDA, APHIS, Center for Veterinary Biologics, Suite 104, 510 South 17th Street, Ames, Iowa 50010, USA.

I.1.6. Seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiología

Dr M. Best Office of Laboratory Security, Centre for Emergency Preparedness and Response, Health Canada, Ottawa, Ontario K1A 0K9, Canada.

I.1.7. Principios de producción de vacunas veterinarias

Dr D.A. Espeseth Espeseth Consulting, 404 Long Leaf Drive, Perkasie, Pennsylvania 18944, USA.

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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Colaboradores

I.1.8. La Biotecnología en el diagnóstico de las enfermedades infecciosas y el desarrollo de vacunas

Dr J. Gorham College of Veterinary Medicine, Department of Veterinary Microbiology and Pathology, Washington State University, Pullman, Washington 99164-7030, USA. Dr D. Knowles & Dr H. Li Animal Disease Research Unit, ARS, USDA, Washington State University, Pullman, Washington 99164-6630, USA. Prof. P.-P. Pastoret Institute for Animal Health, Compton Laboratory, Compton, Newbury, Berkshire RG20 7NN, UK.

I.1.9. El papel de los organismos oficiales en la regulación internacional de los productos biológicos de uso veterinario

Dr Ph. Vannier AFSSA Ploufragan, Laboratoire d’études et de recherches avicoles et porcines, Zoopôle des Côtes d’Armor-Les Croix, BP 53, 22440 Ploufragan, France. Prof. P.-P. Pastoret Institute for Animal Health, Compton Laboratory, Compton, Newbury, Berkshire RG20 7NN, UK. Dr D.A. Espeseth Espeseth Consulting, 404 Long Leaf Drive, Perkasie, Pennsylvania 18944, USA. Dr O. Itoh National Veterinary Assay Laboratory, JMAFF, 1-15-1 Tokura, Kokubunji, Tokyo 185-8511, Japan.

I.1.10. Métodos de laboratorio para ensayos de sensibilidad de bacterias frente a antimicrobianos

Dr D. White Centre for Veterinary Medicine, Food and Drug Administration, Office of Research, HFV-530, 8401 Muirkirk Road, Laurel, Maryland 20708, USA.

2.1.1. Fiebre aftosa

Dr R.P. Kitching National Centre for Foreign Animal Disease, 1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba R3E 3M4, Canada. Dr P.V. Barnett & Dr D.K.J. Mackay Institute for Animal Health, Pirbright Laboratory, Ash Road, Pirbright, Surrey GU24 0NF, UK. Dr A.I. Donaldson, 290 London Road, Burpham, Guildford, Surrey GU4 7LB, UK

2.1.2. Estomatitis vesicular

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Dr B. Schmitt USDA, APHIS, National Veterinary Services Laboratories, P.O. Box 844, Ames, Iowa 50010, USA.

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Colaboradores

2.1.3. Enfermedad vesicular porcina

Dr R.P. Kitching National Centre for Foreign Animal Disease, 1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba R3E 3M4, Canada. Dr D.K.J. Mackay Institute for Animal Health, Pirbright Laboratory, Ash Road, Pirbright, Surrey GU24 0NF, UK. Dr A.I. Donaldson, 290 London Road, Burpham, Guildford, Surrey GU4 7LB, UK

2.1.4. Peste bovina

Dr W.P. Taylor 8 South Terrace, Littlehampton, West Sussex BN17 5NZ, UK. Dr P. Roeder Animal Health Service, Animal Production and Health Division, FAO, Vialle delle Terme di Caracalla, 00100 Rome, Italy.

2.1.5. Peste de los pequeños rumiantes

Dr A. Diallo FAO/IAEA Centre for ELISA and Molecular Techniques in Animal Disease Diagnosis, International Atomic Energy Agency Wagramerstrasse 5, P.O. Box 100, A-1400 Vienna, Austria.

2.1.6. Pleuroneumonía bovina contagiosa

Dr F. Thiaucourt CIRAD-EMVT, Campus international de Baillarguet, Montferriez-sur-Lez, B.P. 5035, 34032 Montpellier Cedex 1, France.

2.1.7. Dermatosis nodular contagiosa

Dr R.P. Kitching National Centre for Foreign Animal Disease, 1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba R3E 3M4, Canada. Dr V. Carn Highbury, Thornford, Sherborne, Dorset DT9 6QD, UK.

2.1.8. Fiebre del Valle del Rift

Dr G.H. Gerdes Onderstepoort Veterinary Institute, Private Bag X05, Onderstepoort 0110, South Africa.

2.1.9. Lengua azul

Dr B. Eaton Australian Animal Health Laboratory, CSIRO, Livestock Industries, 5 Portarlington Road, Geelong, Victoria 3220, Australia.

2.1.10. Viruela ovina y viruela caprina

Dr R.P. Kitching National Centre for Foreign Animal Disease, 1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba R3E 3M4, Canada. Dr V. Carn Highbury, Thornford, Sherborne, Dorset DT9 6QD, UK.

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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Colaboradores

2.1.11. Peste equina africana

Prof. J.M. Sánchez-Vizcaíno Catedrático del Área de Sanidad Animal, Universidad Complutense, Facultad de Veterinaria, Avda. Puerta de Hierro s/n, 28040 Madrid, Spain.

2.1.12. Peste porcina africana

Dr P.J. Wilkinson (retired) Institute for Animal Health, Pirbright Laboratory, Ash Road, Pirbright, Surrey GU24 0NF, UK. Dr D.J. Paton Institute for Animal Health, Pirbright Laboratory, Ash Road, Pirbright, Surrey GU24 0NF, UK.

2.1.13. Peste porcina clásica (cólera del cerdo)

Dr D.J. Paton Institute for Animal Health, Pirbright Laboratory, Ash Road, Pirbright, Surrey GU24 0NF, UK. Dr T. Drew VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey KT15 3NB, UK.

2.1.14. Gripe aviar muy virulenta 2.1.15. Enfermedad de Newcastle

Dr D.J. Alexander VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey KT15 3NB, UK.

2.2.1. Carbunco

Dr P.R. Coker Biological Safety Officer, Office of University Research Compliance, Oklahoma State University, Stillwater, Oklahoma 74078, USA.

2.2.2. Enfermedad de Aujeszky

Prof. B. Toma & Prof. N. Haddad Ecole nationale vétérinaire d’Alfort, 7 avenue du Général de Gaulle, 94704 Maisons-Alfort Cedex, France. Dr Ph. Vannier AFSSA Ploufragan, Laboratoire d’études et de recherches avicoles et porcines, Zoopôle des Côtes d’Armor-Les Croix, BP 53, 22440 Ploufragan, France.

2.2.3. Equinococosis/Hidatisodis

Prof. P.S. Craig Division of Biological Sciences, School of Environment & Life Sciences, University of Salford, Salford M5 4WT, UK.

2.2.4. Leptospirosis

Prof. C.A. Bolin Diagnostic Center for Population & Animal Health, College of Veterinary Medicine, A3 Veterinary Medical Center, Michigan State University, East Lansing, Michigan 48824, USA.

2.2.5. Rabia

Dr F. Cliquet & Dr J. Barrat AFSSA Nancy, Domaine de Pixérécourt, BP 9, F-54220 Malzeville, France.

2.2.6. Paratuberculosis (enfermedad de Johne)

Dr M.-F. Thorel AFSSA Alfort, Laboratoire d’Études et de Recherches en Pathologie Animale et Zoonoses, 22 rue Pierre Curie, BP 67, 94703 Maisons-Alfort Cedex, France.

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

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Colaboradores

Dr E. Camus CIRAD-EMVT, Campus International de Baillarguet – TA/30B, 34398 Montpellier Cedex 5, France.

2.2.7. Cowdriosis

Dr D. Martinez CIRAD-EMVT, Domaine de Duclos, Prise d’Eau, 97170 Petit-Bourg, Guadeloupe. Prof. F. Jongejan Department of Parasitology & Tropical Veterinary Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, Utrecht University, P.O. Box 80.165, 3508 TD Utrecht, The Netherlands AND Department of Veterinary Tropical Diseases, Faculty of Veterinary Science, University of Pretoria, Onderstepoort 0110, South Africa. 2.2.8. Larva perforada del Nuevo Mundo (Cochliomyia hominivorax) y del Viejo Mundo (Chrysomya bezziana)

Dr M.J.R. Hall Department of Entomology, The Natural History Museum, Cromwell Road, London SW7 5BD, UK.

2.2.9. Triquinelosis

Dr H.R. Gamble Director, Fellowships Office, National Research Council, 500 Fifth Street NW, Washington DC 20001, USA.

2.2.10. Fiebre Q

Dr E. Rousset, Dr P. Russo, Dr M. Pépin, & M.F. Aubert AFSSA Sophia Antipolis, Laboratoire d’Études et de Recherches sure les Petits Ruminants et les Abeilles, Les Templiers, 105 route des Chappes, BP 111, 06902 Sophia Antipolis Cedex, France.

2.2.11. Leishmaniosis

Dr L. Gradoni & Dr M. Gramiccia Istituto Superiore di Sanità, Laboratorio di Parassitologia, Viale Regina Elena 299, I-00161 Rome, Italy.

2.3.1. Brucelosis bovina

Dr K. Nielsen Canadian Food Inspection Agency, Animal Diseases Research Institute, P.O. Box 11300, Station H, Nepean, Ontario K2H 8P9, Canada. Dr D.R. Ewalt Mycobacteria and Brucella Section, Diagnostic Bacteriology Laboratory, National Veterinary Services Laboratories, 1800 Dayton Road, Ames, Iowa 50010, USA. Y la importante contribución del Grupo Ad hoc de la OIE en Brucelosis: Dr B. Garin-Bastuji AFSSA Alfort, Unité Zoonoses Bactériennes, Lab. OIE/FAO de référence pour la brucellose, 22 rue Pierre Curie, BP 67, 94703 Maisons-Alfort Cedex, France. Dr A.P. MacMillan VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey KT15 3NB, UK. Dr Peter Wright Canadian Food Inspection Agency, National Centre for Foreign Animal Disease, 1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba R3E 3M4, Canada

2.3.2. Campilobacteriosis genital bovina

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Dr J.A. Wagenaar & M.A.P. Van Bergen, BSc Animal Sciences Group, P.O. Box 65, 8200 AB Lelystad, The Netherlands.

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Colaboradores

2.3.3. Tuberculosis bovina

Dr N.M.A. Palmer VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey KT15 3NB, UK.

2.3.4. Leucosis bovina enzoótica

Dr L. Renström National Veterinary Institute, Department of Virology, SE-751 89 Uppsala, Sweden.

2.3.5. Rinotraqueitis bovina infecciosa /vulvovaginitis pustular infecciosa

Prof. J.T. van Oirschot Animal Sciences Group - Wageningen UR, P.O. Box 65, 8200 AB, Lelystad, The Netherlands.

2.3.6. Tricomonosis

Prof. M. Taylor Veterinary Surveillance Unit, Central Science Laboratory, Sand Hutton, York YO41 1LZ, UK. Dr A.A. Gajadhar & Dr S. Parker Canadian Food Inspection Agency, Saskatoon Laboratory, 116 Veterinary Road, Saskatoon, Saskatchewan S7N 2R3, Canada.

2.3.7. Anaplasmosis bovina

Prof. T.F. McElwain Washington State University, Animal Disease Diagnostic Laboratory, 155 Bustad Hall, Pullman, Washington 99164-7034, USA.

2.3.8. Babesiosis bovina

Dr R.E. Bock Queensland Department of Primary Industries, Animal and Plant Health Service, Tick Fever Research Centre, 280 Grindle Road, Wacol, Queensland 4076, Australia. Dr W.K. Jorgensen & Mr J.B. Molloy Queensland Department of Primary Industries, Agency for Food & Fibre Sciences, 665 Fairfield Rd, Yeerongpilly, Queensland 4105, Australia.

2.3.9. Cisticercosis bovina (ver capítulo 2.10.1.)

Dr S. Lloyd Department of Clinical Veterinary Medicine, University of Cambridge, Madingley Road, Cambridge CB3 0ES, UK.

2.3.10. Dermatofilosis

Prof. D.H. Lloyd Dept of Veterinary Clinical Sciences, Royal Veterinary College, Hawkshead Lane, North Mymms, Hatfield, Hertfordshire AL9 7TA, UK.

2.3.11. Teileriosis

Prof. E. Pipano Koret School of Veterinary Medicine, The Hebrew University of Jerusalem, P.O. Box 12 Rehovot, Israel. Dr S. Morzaria FAO Regional Office for Asia and the Pacific, 39 Phra Athit Road, Bangkok 10200, Thailand. Dr P. Spooner International Livestock Research Institute, Naivasha Road, Nairobi 00100, Kenya. Dr V. Shkap Division of Parasitology, Kimron Veterinary Institute, P.O. Box 12, Beit Dagan, 50250 Israel.

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

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Colaboradores

2.3.12 Septicemia hemorrágica

Dr S. Chandrasekaran Veterinary Research Institute, 59 Jalan Suntan Azlan Shah, P.O. Box 369, 31400 Ipoh, Perak, Malaysia. Dr K. Townsend Diagnostic Bacteriology Laboratory, Veterinary Pathology and Anatomy, School of Veterinary Science, The University of Queensland, Brisbane QLD 4072, Australia.

2.3.13. Encefalopatía espongiforme bovina

Dr D. Matthews, Dr M. Jeffrey, Dr M.M. Simmons, Mr M. Stack, Mr G.A.H. Wells & Prof. J.W. Wilesmith VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey KT15 3NB, UK.

2.3.14. Fiebre catarral maligna

Dr H.W. Reid Moredun Research Institute, International Research Centre, Pentlands Science Park, Bush Loan, Penicuik EH26 0PZ, Scotland, UK.

2.3.15. Tripanosomosis (transmitida por la mosca tsé tsé)

Dr J. Schlater USDA, APHIS, National Veterinary Services Laboratories, P.O. Box 844, Ames, Iowa 50010, USA. Dr P. Van Den Bossche Veterinary Department, Institute of Tropical Medicine, Nationalestraat 155, 2000 Antwerpen Belgium AND Faculty of Veterinary Science, University of Pretoria, Post Bag X04, Onderstepoort 0110, South Africa

2.4.1. Epididimitis ovina (Brucella ovis) 2.4.2. Brucelosis caprina y ovina (excluyendo la infección por Brucella ovis)

Dr B. Garin-Bastuji AFSSA, Unité Zoonoses Bactériennes, OIE Reference Laboratory/FAO Collaborating Centre for Brucellosis, BP 67, F-94703 Maisons-Alfort Cedex, France. Dr J.M. Blasco Dpt Sanidad Animal, Servicio de Investigacion Agraria/DGA, Apartado 727, 50080 Zaragoza, Spain.

2.4.3. Agalaxia contagiosa

Dr R. Nicholas VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey KT15 3NB, UK.

2.4.4/5. Artritis/encefalitis caprina y Maedi-visna

Dr D. Knowles & Dr L.M. Herrmann Animal Disease Research Unit, ARS, USDA, Washington State University, Pullman, Washington 99164-6630, USA.

2.4.6. Pleuroneumonía caprina contagiosa

Dr F.R Rurangirwa Department of Veterinary Microbiology and Pathology, Washington State University, Pullman, Washington 99164-7040, USA. Dr J.H. Kinyili Kenya Veterinary Vaccines Production Institute, P.O. Box 53260, Nairobi, Kenya.

2.4.7. Aborto enzoótico de las ovejas (Clamidiosis ovina)

xxx

Prof. I.D. Aitken & and Dr D. Longbottom Moredun Research Institute, International Research Centre, Pentlands Science Park Bush Loan, Penicuik EH26 0PZ, UK.

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Colaboradores

2.4.8. Prurigo lumbar

Dr D. Matthews, Dr M. Jeffrey Dr M.M. Simmons, Mr M. Stack & Mr G.A.H. Wells VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey KT15 3NB, UK.

2.4.9. Adenomatosis pulmonar ovina

Dr J.M. Sharp VLA, Pentlands Science Park, Bush Loan, Penicuik EH26 0PZ, Scotland, UK.

2.4.10. Enfermedad de Nairobi (ver capítulo 2.10.2.)

Dr G.H. Gerdes Onderstepoort Veterinary Institute, Private Bag X05, Onderstepoort 0110, South Africa.

2.4.11. Salmonelosis (S. abortus ovis) (ver capítulo 2.10.3.)

Dr R. Davies VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey KT15 3NB, UK. Prof. M. Truszczynski National Veterinary Research Institute, 57 Partyzantow St., 24-100 Pulawy, Poland.

2.5.1. Metritis equina contagiosa

Dr N. Chanter Intervet UK Ltd, Walton Manor, Walton, Milton Keynes MK7 7AJ, UK.

2.5.2. Durina

Dr J.B. Katz USDA, APHIS, National Veterinary Services Laboratories, P.O. Box 844, Ames, Iowa 50010, USA.

2.5.3. Encefalomielitis equina (del Este y del Oeste) 2.5.4. Anemia infecciosa equina

Dr E.N. Ostlund USDA, APHIS, National Veterinary Services Laboratories, P.O. Box 844, Ames, Iowa 50010, USA.

2.5.5. Gripe equina

Dr J. Daly Animal Health Trust, Lanwades Park, Kentford, Newmarket, Suffolk CB8 7UU, UK.

2.5.6. Piroplasmosis equina

Dr D.T. de Waal University College Dublin, Faculty of Veterinary Medicine, Department of Veterinary Microbiology & Parasitology, Belfield, Dublin 4, Ireland.

2.5.7. Rinoneumonitis equina

Dr G.P. Allen Department of Veterinary Science, College of Agriculture, University of Kentucky, 108 M.H. Gluck Equine Research Center, Lexington, Kentucky 40546-0099, USA.

2.5.8. Muermo

Dr N.K. Bookova, All-Russian State Centre for Quality and Standardisation of Veterinary Drugs and Feeds, Ministry of Agriculture of the Russian Federation, 5, Zvenigorodskoye shosse, 123022 Moscow, RUSSIA.

2.5.10. Arteritis vírica equina

Dr P.J. Timoney University of Kentucky, Department of Veterinary Science, 108 Gluck Equine Research Center, Lexington, Kentucky 40546-0099, USA.

2.5.12. Encefalomielitis equina venezolana

Dr E.N. Ostlund USDA, APHIS, National Veterinary Services Laboratories, P.O. Box 844, Ames, Iowa 50010, USA.

2.5.13. Linfangitis epizoótica

Dr J.A.W. Coetzer Department of Veterinary Tropical Diseases, Faculty of Veterinary Science, University of Pretoria, Private Bag X04, Onderstepoort 0110, South Africa.

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

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Colaboradores

2.5.14. Encefalitis japonesa

Dr I. Takashima Laboratory of Public Health, Department of Environmental Veterinary Sciences, Graduate School of Veterinary Medicine, Hokkaido University, Sapporo 060-0818, Japan.

2.5.15. Tripanosomosis (Trypanosoma evansi)

Dr A.G. Luckins Centre for Tropical Veterinary Medicine, Easter Bush Veterinary Centre, Roslin, Midlothian, Scotland EH25 9RG, UK.

2.6.1. Rinitis atrófica porcina

Dr K. Register USDA, ARS, National Animal Disease Center, 2300 Dayton Avenue, Ames, Iowa 50010, USA.

2.6.2. Brucelosis porcina

Dr Steve Olsen, USDA, ARS, National Animal Disease Center, 2300 Dayton Avenue, Ames, Iowa 50010, USA.

2.6.3. Encefalomielitis por enterovirus (anteriormente enfermedades de Teschen/Talfan)

Dr V. Mádr Hudcova 66, 62100 Brno, Czech Republic.

2.6.4. Gastroenteritis transmisible

Dr D.J. Paton Institute for Animal Health, Pirbright Laboratory, Ash Road, Pirbright, Surrey GU24 0NF, UK. Dr L.J. Saif The Ohio State Universtiy, Ohio Agricultural Research and Development Center, Food Animal Health Research Program, 1680 Madison Avenue, Wooster, Ohio 44691-4096, USA.

2.6.5. Síndrome reproductivo y respiratorio porcino

Dr L.R. Ludemann USDA, APHIS, Center for Veterinary Biologics, Laboratory, P.O. Box 844, Ames, Iowa 50010, USA. Dr R. Magar Agence canadienne d’inspection des aliments, Laboratoire d’hygiène vétérinaire et alimentaire, 3400 Casavant ouest, Saint-Hyacinthe, Québec J2S 8E3, Canada.

2.6.6. Cisticercosis porcina (ver capítulo 2.10.1.)

Dr S. Lloyd Department of Clinical Veterinary Medicine, University of Cambridge, Madingley Road, Cambridge CB3 0ES, UK.

2.7.1. Bursitis infecciosa (Enfermedad de Gumboro)

Dr N. Eterradossi AFSSA Ploufragan, Unité de virologie, immunologie et parasitologie aviaires et cunicoles, BP 53, 22440 Ploufragan, France

2.7.2. Enfermedad de Marek

Dr J.M. Sharma Veterinary PathoBiology, College of Veterinary Medicine, University of Minnesota, St Paul, Minnesota 55127, USA.

2.7.3. Micoplasmosis aviar (Mycoplasma gallisepticum)

Dr S.H. Kleven University of Georgia, College of Veterinary Medicine, Department of Avian Medicine, Athens, Georgia 30602-4875, USA. Dr F.T.W. Jordan & Dr J.M. Bradbury University of Liverpool, Department of Veterinary Pathology, Veterinary Field Station, Leahurst, Neston, South Wirral CH64 7TE, UK.

2.7.4. Clamidiosis aviar

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Dr A.A. Andersen USDA, ARS, National Animal Disease Center, P.O. Box 70, Ames, Iowa 50010, USA.

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Colaboradores

2.7.5. Pulorosis y tifosis aviar

Dr R. Davies VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey KT15 3NB, UK.

2.7.6. Bronquitis infecciosa aviar

Dr R. Gough (retired) & Dr D.J. Alexander VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey KT15 3NB, UK.

2.7.7. Laringotraqueitis infecciosa aviar

Dr R.C. Jones University of Liverpool, Department of Veterinary Pathology, Jordan Building, Veterinary Field Station, ‘Leahurst’, Neston, South Wirral CH64 7TE, UK.

2.7.8. Tuberculosis aviar

Dr M.-F. Thorel AFSSA Alfort, Laboratoire central de recherches vétérinaires, 22 rue Pierre Curie, BP 67, 94703 Maisons-Alfort Cedex, France.

2.7.9. Hepatitis vírica del pato 2.7.10. Enteritis vírica del pato

Dr P.R. Woolcock California Animal Health and Food Safety Laboratory System – Fresno Branch, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis, 2789 South Orange Avenue, Fresno, California 93725, USA.

2.7.11. Cólera aviar (Pasteurelosis aviar)

Dr R. Kunkle, National Animal Disease Center, P.O. Box 70, Ames, Iowa 50010, USA.

2.7.12. Viruela aviar

Dr D.N. Tripathy University of Illinois at Urbana-Champaign, College of Veterinary Medicine, Department of Veterinary Pathbiology, 2001 South Lincoln Avenue, Urbana, Illinois 61802, USA.

2.8.1. Mixomatosis

Prof. J. Chantal (retired) & Prof. S. Bertagnoli École Nationale Vétérinaire, 23 Chemin de Capelles, 31076 Toulouse Cedex 03, France.

2.8.2. Tularemia

Dr T. Mörner Department of Wildlife, The National Veterinary Institute, 751 89 Uppsala, Sweden Dr G. Sandström Department of Clinical Immunology, Infectious Diseases, Umeå University and National Defence Research Establishment, SE-901 82 Umeå, Sweden.

2.8.3. Enfermedad hemorrágica del conejo

Dr A. Lavazza & Dr L. Capucci Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna, Via Bianchi 7/9, 25124 Brescia, Italy.

2.9.1. Acariosis de las abejas

Dr W. Ritter CVUA-Freiberg, Animal Health, Am Moosweiher 2, D79018 Freiberg, Germany.

2.9.2. Loque americana

Prof. D.C. de Graaf Laboratory of Zoophysiology, University of Gent, K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent, Belgium.

2.9.3. Loque europea

Dr B.V. Ball Plant and Invertebrate Ecology Division, Rothamstead Research, Harpenden, Hertfordshire AL5 2JQ, UK.

2.9.4. Nosemosis de las abejas

Dr A. de Ruijter Research Centre for Insect Pollination and Beekeeping, Ambrosiusweg 1, 5081 NV Hilvarenbeek, The Netherlands.

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

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Colaboradores

2.9.5. Varroosis

Dr W. Ritter CVUA-Freiberg, Animal Health, Am Moosweiher 2, D79018 Freiberg, Germany.

2.9.6. Infestación de las abejas melíferas por Tropilaelaps (Tropilaelaps clareae, T. koenigerum)

Dr D. Sammataro Carl Hayden Honey Bee Research Center, 2000 East Allen Road, Tucson, Arizona 857191596, USA.

2.10.1. Cisticercosis

Dr S. Lloyd Department of Clinical Veterinary Medicine, University of Cambridge, Madingley Road, Cambridge CB3 0ES, UK.

2.10.2. Enfermedades bunyavirales de animales excluyendo la Fiebre del Valle del Rift

Dr G.H. Gerdes Onderstepoort Veterinary Institute, Private Bag X05, Onderstepoort 0110, South Africa.

2.10.3. Salmonelosis

Dr R. Davies VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey KT15 3NB, UK.

2.10.4. Sarna

Dr P. Bates VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey KT15 3NB, UK.

2.10.5. Enfermedad de la frontera

Dr P.F. Nettleton Moredun Research Institute, International Research Centre, Pentlands Science Park, Bush Loan, Penicuik EH26 0PZ, Scotland, UK.

2.10.6. Diarrea vírica bovina

Dr T. Drew VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey KT15 3NB, UK.

2.10.7. Encefalitis del Oeste del Nilo

Dr E.N. Ostlund USDA, APHIS, National Veterinary Services Laboratories, P.O. Box 844, Ames, Iowa 50010, United States of America.

2.10.8. Campylobacterosis

Dr Diane Newell VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey KT15 3NB, UK. Dr W.F. Jacobs-Reitsma & Dr J.A. Wagenaar Animal Sciences Group, Wageningen UR, P.O. Box 65, 8200 AB Lelystad, The Netherlands.

2.10.9. Criptosporidiosis

Prof. H. Smith Scottish Parasite Diagnostic Laboratory, Stobhill General Hospital, Glasgow G21 3UW, UK.

2.10.10. Enfermedades víricas de Hendra y de Nipah

Dr B.T. Eaton & Dr P. Daniels Australian Animal Health Laboratory, CSIRO, Livestock Industries, 5 Portarlington Road, Geelong, Victoria 3220, Australia. Dr M. Narasiman Veterinary Research Institute, 59, Jalan Sultan Azlan Shah, 31400 Ipoh, Perak, Malaysia.

2.10.11. Gripe porcina

Dr S.L. Swenson National Veterinary Services Laboratories, P.O. Box 844, Ames, Iowa 50010, USA. Dr P.L. Foley Center for Veterinary Biologics, 510 S. 17th St., Suite 104, Ames, IA 50010 USA

2.10.12. Toxoplasmosis

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Dr D. Buxton & Dr S.W. Maley Moredun Research Institute, Pentlands Science Park, Bush Loan, by Edinburgh EH26 0PZ, Scotland, UK.

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Colaboradores

2.10.13. Escherichia coli Verocitotoxigénica

Dr F.A. Clifton-Hadley VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey KT15 3NB, UK.

2.10.14. Listeria monocytogenes

Dr Jose Lopez Canadian Food Inspection Agency, National Centre for Foreign Animal Disease, 1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba R3E 3M4, Canada.

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

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C O MIT É D IRE C T O R P A RA L O S P RO YE C T O S DE L A OIE DE T RA DUC C IÓ N A L E S P A ÑO L DE L M A NUA L O F D IA GNO S T IC T E S T S A ND V A C C INE S F O R T E RRE S T RIA L A NIMA L S Y E L A BO RA C IÓ N DE UNA B A S E T E RMINO L Ó GIC A M UL TIL INGÜE PA RA E L Á MBITO DE L A S A NIDA D A NIMA L . Presidente

Vicepresidente

Excmo. Sr. D. Bernard Vallat

Ilmo. Sr. D. Jean-Luc Angot

Director General Organización Mundial de Sanidad Animal, OIE 12, rue de Prony – 75017 Paris. France. Tfno: 33 (0) 1 44 15 18 88 Fax: 33 (0) 1 42 67 09 87 Correo electrónico: [email protected]

Jefe del Servicio Administrativo y Financiero Organización Mundial de Sanidad Animal, OIE 12, rue de Prony – 75017 Paris. France. Tfno: 33 (0) 1 44 15 18 88 Fax: 33 (0) 1 42 67 09 87 Correo electrónico: [email protected]

Vocales Ilmo. Sr. D. Arnaldo Cabello Navarro

Dra. Dña. Luz Alba Cruz de Urbina Subgerente de Prevención y Control Instituto Colombiano Agropecuario (ICA) Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural Calle 37 nº 8-43 PISO 4 Y 5. Apartado Aéreo 7984 y 1511123 El Dorado Santa Fe de Bogotá. Colombia. Tfno: (57-1) 32 o 3654 Fax: (57-1) 232 4695 Correo electrónico: [email protected]

Subdirector General de Sanidad Animal. Dirección General de Ganadería. Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación. Corazón de María nº 8 28002 Madrid. Tfno: 34 91 3 47 83 24 Fax: 34 91 3 47 82 99 Correo electrónico: [email protected]

Dr. D. Rodolfo César Acerbi

Dr. D. Emerio F. Serrano Ramírez

Coordinador Relaciones Internacionales e Institucionales Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria SENASA Avda. Paseo Colón. 367 – 5º p.cont. 1063 Buenos Aires. Republica Argentina Tfno: 00 (54) 11 4331-6041/9 INT. 1323 Fax: 00 (54) 11 4334-4738 Correo electrónico: [email protected]

Director General del Instituto de Medicina Veterinaria. Ministerio de Agricultura. Calle 12 nº 355, entre 17 y 17ª El Vedado. Zona Postal 10400 Ciudad de la Habana. Cuba. Tfno: (53-7) 83 06 6 15 Fax: (53-7) 830 35 37 Correo electrónico: [email protected]

Secretario

Coordinador de la OIE

Profesor Dr. D. Fernando Crespo León

Profesor Dr. D. Alejandro Schudel.

Experto de la OIE Organización Mundial de Sanidad Animal y de la Unión Europea Investigador del Departamento de Ganadería y Acuicultura del Instituto Murciano de Investigación y Desarrollo Agrario y Alimentario. (IMIDA) Calle mayor s/n. 30150 La Alberca. Murcia. España. Tfno: 00 34 968 36 67 99 Fax: 00 34 968 36 67 92 Correo electrónico: [email protected]

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Jefe del Servicio Científico y Técnico Organización Mundial de Sanidad Animal, OIE 12, rue de Prony – 75017 Paris. France Tfno: 33 (0) 1 44 15 18 88 Fax: 33 (0) 1 42 67 09 87 Correo electrónico: [email protected]

xxxvi

Colaboradores

C O O RDINA C IÓ N

C IE NT ÍF IC O - T É C NIC A

DE L A TRA DUC C IÓ N

Profesor Dr. D. Fernando Crespo León Experto de la OIE Organización Mundial de Sanidad Animal y de la Unión Europea Investigador del Departamento de Ganadería y Acuicultura del Instituto Murciano de Investigación y Desarrollo Agrario y Alimentario.(IMIDA) Calle mayor s/n. 30150 La Alberca. Murcia. España. Tfno: 00 34 968 36 67 99 Fax: 00 34 968 36 67 92 Correo electrónico: [email protected]

C O O RDINA C IÓ N

L INGÜÍS T IC A Y

TRA DUC TO L Ó GIC A

Profesor Dr. D. Francisco Gutiérrez Díez Catedrático de Filología Inglesa Director del Máster de Traducción e Interpretación de la Universidad de Murcia Dpto. de Filología Inglesa C/ Santo Cristo nº 1. 30071. Murcia, España Tfno: 00 34 968 36 31 79 Fax: 00 34 968 36 31 85 Correo electrónico: [email protected]

G RUPO A D HO C PA RA L O S P RO YE C T O S DE L A OIE DE T RA DUC C IÓ N A L E S P A ÑO L DE L M A NUA L O F D IA GNO S T IC T E S T S A ND V A C C INE S Y E L A BO RA C IÓ N DE L A B A S E T E RMINO L Ó GIC A M UL TIL INGÜE PA RA E L Á MBITO DE L A S A NIDA D A NIMA L . Profesor Dr. D. Elías Fernando Rodríguez Ferri Catedrático de Microbiología e Inmunología de la Facultad de Veterinaria Departamento de Sanidad Animal Universidad de León Campus de Vagazana. 24071 León. España Tfno: 00 34 987 29 12 97 Fax: 00 34 987 29 11 94 Correo electrónico: [email protected]

Profesor Dr. D. Luis León Vizcaíno Catedrático de Patología Infecciosa de la Facultad de Veterinaria Universidad de Murcia, España. Departamento de Sanidad Animal Campus de Espinardo. 30100 Murcia, España Tfno: 00 34 968 36 47 32 Fax: 00 34 968 36 41 47 Correo electrónico: [email protected]

Profesor Dr. D. Emilio J. Gimeno Coordinator of OIE Representation for the Americas (RR/AA) Cerviño 3101 1425 Buenos Aires. República de Argentina Tfno: (54-11) 48 03 48 77 Fax: (54-11) 48 03 36 88 Correo electrónico: [email protected]

Profesor Dr. D. José Joaquín Cerón Madrigal Profesor Titular del Departamento de Medicina y Cirugía Animal Facultad de Veterinaria Universidad de Murcia Campus de Espinardo. 30100 Murcia. España Tfno: 968 36 47 22 Fax: 968 36 41 47 Correo electrónico: [email protected]

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Profesor Dr. D. Francisco Gutiérrez Díez Catedrático de Filología Inglesa Director del Máster de Traducción e Interpretación de la Universidad de Murcia. Dpto. de Filología Inglesa. C/ Santo Cristo nº 1. 30071. Murcia, España. Tfno: 00 34 968 36 31 79 Fax: 00 34 968 36 31 85 Correo electrónico: [email protected]

Profesor Dr. Pascual Cantos Gómez Profesor Titular de Filología Inglesa. Departamento de Filología Inglesa Universidad de Murcia Campus La Merced. C/ Santo Cristo nº 1. 30071. Murcia España. Tfno: 00 34 968 36 43 65 Fax: 00 34 968 36 31 85 Correo electrónico: [email protected]

Profesor Dr. D. Alejandro Schudel Jefe del Servicio Científico y Técnico Organización Mundial de Sanidad Animal, OIE 12, rue de Prony – 75017 Paris. France Tfno: 33 (0) 1 44 15 18 88 Fax: 33 (0) 1 42 67 09 87 Correo electrónico: [email protected] Profesor Dr. D. Francisco Gutiérrez Díez Catedrático de Filología Inglesa Director del Máster de Traducción e Interpretación de la Universidad de Murcia. Dpto. de Filología Inglesa. C/ Santo Cristo nº 1 30071. Murcia, España. Tfno: 00 34 968 36 31 79 Fax: 00 34 968 36 31 85 Correo electrónico: [email protected]

xxxvii

Colaboradores

T RA DUC TO RE S Profesor Dr. D. Mariano Gacto Fernández Catedrático de Microbiología Universidad de Murcia Dpto. de Microbiología y Genética, Campus de Espinardo, 30071-Murcia, España Fax. 00 34 968 36 39 63 Tfno: 00 34 968 36 71 32 Correo electrónico: [email protected]

Profesora Dra. Dña. Purificación Sánchez Hernández Profesora Titular de Filología Inglesa Universidad de Murcia Profesora del Máster de Traducción e Interpretación Dpto. Filología Inglesa, C/ Santo Cristo, 1.30071-Murcia, España Tfno: 00 34 968 36 48 67 Fax: 00 34 968 36 31 85 Correo electrónico: [email protected]

Profesora Dra. Dña. Jerónima Vicente Soler Profesora Titular de Microbiología Universidad de Murcia Dpto. de Microbiología y Genética, Campus de Espinardo, 30071-Murcia, España Tfno: 00 34 968 43 03 29 Fax: 00 34 968 36 39 63 Correo electrónico: [email protected]

Profesor Dr. D. José Cansado Vizoso

Dña. Elena Cuadrado Caparrós Licenciada en Biología y Máster en Traducción e Interpretación Tfno: 00 34 968 21 55 24 Correo electrónico: islaplana@telefónica.net

Dña. Ruth Elena Pérez Licenciada en Filología Inglesa y Máster en Traducción e Interpretación C/ Olor Palme, 1, 7º B.- 30009-Murcia, España Tfno: 00 34 968 29 45 93 Correo electrónico: [email protected]

Profesor Titular de Microbiología Universidad de Murcia Dpto. de Microbiología y Genética, Campus de Espinardo, 30071-Murcia, España Fax: 968-363963 Tfno: 00 34 968 36 49 53 Correo electrónico: [email protected]

* * *

xxxviii

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

PARTE I INFORMACIÓN GENERAL

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

1

SECCIÓN I.1.

CAPÍTULOS INTRODUCTORIOS

CAPÍTULO I.1.1.

MÉTODOS DE MUESTREO

INTRODUCCIÓN El punto de partida para la investigación de una enfermedad animal en el laboratorio es la toma de muestras. Este primer capítulo introductorio trata algunos de los principios generales relativos a la toma, envío y almacenamiento de muestras. Cada uno de los capítulos sobre enfermedades de este Manual proporciona información específica sobre la toma de muestras para esa enfermedad concreta. Las muestras pueden tomarse de los animales o de su entorno con diferentes fines, tales como el diagnóstico de enfermedades, vigilancia de enfermedades, certificado sanitario o seguimiento de la respuesta a un tratamiento o a la vacunación. Para proporcionar resultados estadísticos válidos, las muestras recogidas deberán ser idóneas para el fin que se persigue y adecuadas en cuanto al número y cantidad. Los laboratorios de diagnóstico solicitan la entrega de muestras adecuadas que lleguen al laboratorio en buenas condiciones. Para el diagnóstico de una enfermedad, los tejidos muestreados deberán ser representativos de la enfermedad investigada y de las lesiones observadas. Las muestras deben tomarse cuidadosamente con el fin de evitar cualquier lesión o estrés excesivo para el animal o cualquier peligro para el operador. Las muestras deben tomarse de forma aséptica y se debe tener cuidado para evitar la contaminación cruzada. Las muestras deben embalarse, etiquetarse y enviarse al laboratorio por el procedimiento más rápido posible, controlando convenientemente la temperatura. Se deben seguir los requisitos específicos para el embalaje y expedición de especímenes para diagnóstico y sustancias infecciosas. También es necesario que el expedidor reciba instrucción sobre los procedimientos de expedición. Cuando se vaya a enviar material a un laboratorio de otro país, se consultará previamente con dicho laboratorio para asegurarse de que está dispuesto a recibir el material y a obtener la correspondiente licencia de importación. Todas las muestras deberán acompañarse de una carta o formulario de envío en el que se indique el nombre y la dirección del remitente, el origen del material, el historial pertinente, identificación del animal y espécimen correspondiente y las pruebas solicitadas.

A. RECOGIDA DE MUESTRAS Antes de tomar las muestras, debe tenerse en cuenta el fin para el que se solicitan. Dicho fin determinará el tipo y número de muestras necesarias para obtener resultados válidos. Cuando las muestras se tomen de animales vivos, se llevará cuidado para evitar heridas o sufrimiento al animal o cualquier peligro para el operador y sus ayudantes. Puede ser necesario el uso de sujeción mecánica, de anestésicos o de tranquilizantes. Siempre que se maneje material biológico de animales vivos o muertos, debe tenerse en cuenta el riesgo de contraer una enfermedad zoonósica y, por lo tanto, deben tomarse precauciones para evitar la infección humana (véase también el Capítulo I.1.6. Seguridad humana en los laboratorios de microbiología veterinaria). Los exámenes post-mortem deben realizarse bajo las más estrictas condiciones de asepsia posibles. Hay que procurar evitar la contaminación ambiental o el riesgo de propagar la enfermedad a través de insectos o fomites. Debe organizarse la forma apropiada y segura de deshacerse de animales y tejidos.

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Capítulo I.1.1. — Métodos de muestreo

Se requieren bastante habilidad y cuidado para decidir qué muestras son apropiadas para enviar al laboratorio. Las muestras recogidas deben ser representativas de la enfermedad que se está investigando y de las lesiones observadas. Con frecuencia, se requiere un combinado de muestras de sangre para pruebas serológicas y de tejidos procedentes de animales muertos o sacrificados selectivamente para cultivos microbiológicos. Más adelante, dentro de este capítulo, se describen recomendaciones para el transporte. Los capítulos sobre enfermedades contenidos en este Manual proporcionan una guía sobre las muestras que deben tomarse, y, por lo tanto, no repetiremos aquí esa información. Además, las autoridades nacionales e internacionales han elaborado los procedimientos para la recogida de muestras y su envío (2, 4, 8, 11, 12). Estas publicaciones ofrecen recomendaciones detalladas de muestras concretas que hay que tomar de diferentes especies, y sobre una amplia variedad de enfermedades de cuya existencia se sospecha. También proporcionan información sobre los procedimientos post-mortem, listados de medios apropiados e instrucciones sobre el envío de muestras. Se debería contactar con el laboratorio que vaya a realizar las pruebas para dilucidar cualquier cuestión relacionada con el tipo de muestreo a realizar.

1.

Toma de muestras de animales vivos

a)

Sangre Las muestras de sangre pueden tomarse para análisis hematológico, para cultivos y/o para el examen directo de bacterias, virus o protozoos, en cuyo caso es normal el uso de anticoagulantes, como el etilén diamino tetra-acético (EDTA) o heparina. También se pueden tomar para pruebas serológicas, en cuyo caso se necesita una muestra coagulada. El plasma sanguíneo también se usa para algunos procedimientos. Las muestras de sangre se toman mediante venepuntura, de la forma más limpia posible. En la mayoría de los grandes mamíferos, se utiliza la vena yugular o una vena caudal, pero también se pueden utilizar venas braquiales y mamarias. En las aves, generalmente se utiliza una vena del ala (vena braquial). En los animales pequeños de laboratorio, las venas auricular o retroorbital pueden ser útiles para obtener muestras de sangre, pudiéndose obtener ésta también por punzamiento del corazón. La sangre se puede extraer con una jeringa y aguja o con una aguja y un tubo de vacío (no es fácil con venas delicadas, pero es cómodo con venas gruesas). Se pueden obtener cómodamente pequeñas cantidades de sangre mediante punción con una aguja triangular de punta sólida. Lo ideal sería rasurar (o desplumar) la piel del lugar de la punción, frotarla con alcohol etílico al 70% y dejarla secar. Cuando las muestras se recogen con anticoagulante, es preciso mezclarlas por completo mediante agitación suave inmediatamente después de su recogida. Es preciso mezclar bien las muestras tomadas con anticoagulantes y/o antibióticos tan pronto como se tomen éstas. También puede ser necesario hacer un frotis sanguíneo en un portaobjetos; se pueden preparar semiextensiones y extensiones de sangre. Para las muestras de suero, la sangre debe dejarse a temperatura ambiente, pero protegida del calor o frío excesivos, durante 1-2 horas, hasta que el coágulo empiece a retraerse. Entonces, se recoge el coágulo con una varilla estéril, girándola, y se colocan los frascos en el frigorífico a 4° C. La muestra se puede centrifugar a 1000 g durante 10-15 minutos después de unas horas o al día siguiente, y el suero se puede decantar o quitar con una pipeta. Con los sueros que van a utilizarse para pruebas de neutralización de virus, deben evitarse los conservantes químicos, tales como el ácido bórico o el tiomersal (mertiolato). A menudo, será necesario tomar muestras de suero pareadas para determinar los títulos de los anticuerpos con intervalos de 14 días. Un método alternativo para el transporte de sangre, que se va a usar en pruebas de sensibilidad a anticuerpos, es la colocación de una gota de sangre sobre papel de filtro; la sangre se seca a temperatura ambiente y la muestra puede entonces remitirse sin necesidad de refrigeración.

b)

Heces Se deben utilizar al menos 10 g de heces recién evacuadas, enviándolas con o sin medio de transporte. Las heces para análisis parasitológico deben llenar por completo el recipiente y enviarse con refrigeración para impedir la eclosión de los huevos de los parásitos, y deben llegar al laboratorio antes de transcurridas 24 horas. Deben utilizarse botellas con tapón de rosca o bolsas de plástico para el transporte. Debe evitarse el uso de tubos con tapón de goma, pues el gas que se genera puede expulsar el tapón del tubo destruyendo así la integridad de la muestra y contaminando otras muestras del mismo paquete. Un método alternativo y a menudo preferible consiste en tomar muestras del recto (o cloaca), procurando arrastrar la superficie mucosa. Los hisopos deben estar visiblemente cubiertos de materia fecal; sin embargo las muestras recogidas con hisopos no suelen ser adecuadas para el análisis parasitológico. Se debe tener cuidado al tomar muestras de animales pequeños y delicados o de aves, para no herirlos; se deberían utilizar los hisopos pequeños que se encuentran en el mercado. Los hisopos deben colocarse en un medio de transporte. Las heces se deben almacenar y transportar a 4°C.

c)

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Piel

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Capítulo I.1.1. — Métodos de muestreo

Las muestras se tomarán de las lesiones mismas, en el caso de enfermedades que producen erupciones vesiculares: se tomarán 2 g del tejido epitelial afectado de la forma más aséptica posible, y se depositarán en 5 ml de medio de transporte de virus con glicerina tamponada con fosfato o caldo de triptosa tamponada con Tris, a pH 7,6. Además, las muestras de fluido vesicular deben tomarse por aspiración con una jeringa, en donde haya vesículas intactas, y depositarse en un tubo estéril independiente. Las muestras de pelo o lana son útiles en los caso de infección por ácaros de superficie, piojos y hongos. Para la detección del antígeno vírico, cuando se sospecha la presencia de la enfermedad de Marek, pueden obtenerse piojos “excavadores” mediante raspado profundo con el borde de un escalpelo, y, en el caso de las aves, pueden tomarse las puntas de las alas.

d)

Tracto genital y semen Las muestras pueden tomarse mediante lavado vaginal y prepucial o utilizando hisopos adecuados. El cérvix y la uretra se muestrean por raspado. Las mejores muestras de semen se obtienen mediante una vagina artificial o por extrusión y estimulación artificial del pene. La muestra debe contener una fracción rica en esperma y debe evitarse la contaminación, mediante el lavado con una solución antiséptica. A menudo se requieren medios y condiciones de transporte.

e)

Ojos La muestra de la conjuntiva puede tomarse separando el párpado y arrastrando suavemente por la superficie. A continuación, el hisopo debe colocarse en un medio de transporte. Los raspados también se pueden depositar sobre portaobjetos. En este caso, las asas de los hisopos de mango de metal son útiles para asegurarse de que se retiran suficientes células para el estudio microscópico. Sólo en raras ocasiones son útiles las secreciones mucopurulentas nasales y lacrimales.

f)

Exudados nasales (saliva, lágrimas) Las muestras también se pueden tomar con hisopos de dracón, algodón o gasa, preferiblemente con mangos de alambre, ya que la madera no es flexible y se puede partir. Puede resultar útil humedecer el hisopo con medio de cultivo antes de tomar la muestra. Es conveniente dejar el hisopo en contacto con las secreciones durante 1 minuto, colocarlo después en un medio de transporte, y enviarlo al laboratorio sin demora, a 4°C. Se deberían utilizar hisopos nasofaríngeos con protección duradera para recoger muestras en algunos casos sospechosos de infección vírica.

g)

Leche Las muestras de leche deben tomarse después de limpiar y secar el pezón, evitando el uso de antisépticos. Debe desecharse el primer chorro de leche y llenar un tubo con el chorro o chorros siguientes. Para algunas pruebas, puede tomarse la muestra de leche de un tanque de almacenamiento. La leche para pruebas serológicas no se debe congelar, calentar o agitar de forma enérgica. Puede añadirse conservante a las muestras de leche recogidas para pruebas serológicas si se va a tardar en enviarlas al laboratorio. Si es preciso se puede congelar la leche destinada a análisis bacteriológico.

2.

Toma de muestras en los exámenes post-mortem

Al realizar el examen post-mortem, se pueden tomar muestras de tejidos de diferentes órganos. En la mayoría de los libros de texto de patología, se detallan los procedimientos para la realización de exámenes post - mortem y para la toma de muestras. Se ha publicado una guía sobre los procedimientos de necropsia (10). Las técnicas post- mortem se recogen también en algunas de las directrices nacionales (2, 4, 8). En este apartado se ofrece un resumen de estos procedimientos. Se debe instruir al personal veterinario sobre los procedimientos que deben seguirse en un examen post-mortem de los animales con los que trabajan. El equipo necesario para realizar este trabajo dependerá del tamaño y de la especie del animal y se requerirán un cuchillo, una sierra, un hacha y también bisturí, fórceps y tijeras, incluidas unas con punta curva en una de sus hojas para abrir los intestinos. Debe disponerse de un abundante número de recipientes adecuados a la naturaleza de la muestra, así como de etiquetas y formularios de informe. Los recipientes deben etiquetarse perfectamente con la fecha y la identificación del tejido y del animal antes de comenzar la necropsia. Pueden necesitarse medios especiales para el transporte de las muestras desde el lugar en el que se toma la muestra. El operador debería llevar vestimenta protectora (traje de protección lavable y guantes y botas de goma). Además, si se están investigando posibles enfermedades zoonósicas, el examen post-mortem debería realizarse en una cabina de seguridad biológica; si esto no es posible, se debería llevar una mascarilla y protección para los ojos. Es normal separar la cabeza del animal, si se sospecha de la rabia o de encefalopatías espongiformes transmisibles (EETs). Los tejidos se recogen para realizar cultivos microbiológicos, diagnósticos de parásitos, análisis bioquímicos, estudios histopatológicos y/o inmunopatológicos, y para la detección de proteínas o ácidos nucleicos del

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Capítulo I.1.1. — Métodos de muestreo

genoma. La persona que realice el examen post-mortem debe poseer conocimientos de anatomía y patología suficientes para seleccionar los órganos correctos y las lesiones más favorables para el muestreo. Cada trozo de tejido se debe colocar en una bolsa de plástico independiente perfectamente rotulada o en un bote con tapa de rosca. Se debe utilizar instrumental esterilizado para la recogida de especímenes destinados a cultivo microbiológico, y hay que tener un cuidado especial de no contaminar los tejidos con contenido intestinal. No deben utilizarse desinfectantes sobre o cerca de los tejidos que vayan a servir de muestra para cultivo bacteriológico o para aislamientos víricos. Los tejidos se pueden enviar secos al laboratorio o en medio de transporte de bacterias o de virus, dependiendo de las pruebas que se soliciten. Tras la recogida, las muestras para examen microbiológico deben refrigerarse hasta su envío. Las muestras se deben congelar si aquél no se hace en 48 horas; sin embargo el almacenamiento prolongado a –20ºC puede resultar perjudicial para el aislamiento de virus. Para los estudios histopatológicos, se cortarán bloques de tejido que no excedan de 0,5 cm de grosor y 1–2 cm2 y se colocarán en formalina al 4–10 % en tampón neutro, que debería ser, al menos, diez veces el volumen de la muestra de tejido. Cuando se sospeche de ciertas enfermedades, se necesitan trozos más grandes de cerebro; el cerebro se secciona haciendo un corte sagital: la mitad se envía fresco, en hielo, y la otra en formalina al 10% tamponada. En el caso de la “tembladera” (scrapie), de la encefalopatía espongiforme bovina y otras EETs, los detalles sobre recolección de muestras se ofrecen en los capítulos correspondientes del presente Manual. Almacene y embale los tejidos fijados con formalina separados de los tejidos frescos, la sangre y los frotis. Hay que asegurarse de que los tejidos fijados con formalina no estén congelados. Una vez fijados, se les puede quitar la formalina y enviarlos al laboratorio, siempre que se mantengan húmedos y estén protegidos (por ejemplo, envolviendo los tejidos en toallas de papel empapadas con formalina y en botes con tapón a rosca herméticamente cerrados).

3.

Toma de muestras medioambientales y de alimentos

Las muestras se pueden tomar para controlar la higiene o como parte de la investigación de enfermedades. Las muestras del medio ambiente se pueden tomar del estiércol o de la cama de los animales y de heces excretadas u orina. Las muestras pueden tomarse de la superficie de los conductos de ventilación, de comederos y de desagües. Este tipo de muestreo es particularmente importante en criaderos, centros de inseminación artificial y mataderos, en los que hay equipamiento especializado. Las muestras también se pueden tomar del forraje de los comederos o de los contenedores de almacenamiento. La toma de muestras de agua se puede hacer de comederos, de bebederos, de tanques de alimentación o de alimentos naturales o manufacturados.

4.

Abejas

Las abejas adultas, estén muertas o moribundas, se pueden recoger en las cercanías de las colonias. A las vivas se las mata por congelación. Las muestras de crías se toman quitando un trozo de panal de cría que presente anormalidades. Se envuelve en papel y se coloca en una caja para transportarla al laboratorio.

B. TAMAÑO DE LA MUESTRA Cuando se investiga un caso de una enfermedad clínica, las muestras recogidas deben ser representativas de la enfermedad que se está investigando y de las lesiones observadas. Cuando se desarrolla un programa de vigilancia y seguimiento de la salud animal, se deben utilizar algunos métodos estadísticos de muestreo generales. Estos métodos de muestreo son necesarios para realizar los estudios científicos especificados en el Código Sanitario para los Animales Terrestres de la OIE (9). Es posible calcular el número de animales de una manada de un tamaño determinado que se deben muestrear, para que la detección de la infección, que se asume que está presente en un determinado porcentaje de animales, alcance una probabilidad del 95% (10). Las formulas siguientes pueden proporcionar datos numéricos aproximados, pero un programa de muestreo específico para el programa de vigilancia planificada debería basarse en fórmulas completas que están disponibles en las referencias (1, 3, 11) o utilizando un programa (FreeCalc) disponible en Internet (http://www.ausvet.com.au/content.php?page=res_software#freecalc). La siguiente fórmula podría utilizarse para calcular el tamaño de la muestra n para detectar al menos un caso de infección, con una prueba que tiene una sensibilidad y especificidad del 100%, donde D es el nivel de significación y 1–D es el nivel de confianza, y p es la prevalencia en la población. Si una enfermedad se presentara en el 5% de una manada de 500 animales, sería necesario muestrear 59 animales, para que la confianza de encontrar al menos un caso positivo sea del 95%, suponiendo que la sensibilidad y la especificidad de la prueba fueran del 100%. Puesto que la mayoría de las pruebas diagnósticas no tienen la especificidad y la sensibilidad del 100%, el número de muestras recogidas debe ajustarse a la sensibilidad y especificidad de la prueba que se utilice (véase también Capítulo I.1.3. Principios de validación para las pruebas de diagnóstico de enfermedades infecciosas).

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Capítulo I.1.1. — Métodos de muestreo

ln (D) n=

ln (1–p)

En el ejemplo anterior D = 0,5, 1–D = 95%, p = 0,05 y n = 59 Si la sensibilidad (Se) es menor del 100%, la fórmula anterior se debería modificar de la siguiente forma: ln (D) n=

ln (1–p.Se)

En el ejemplo anterior con D = 0,05, p = 0,05, especificidad (Sp) = 1 y Se = 0,95, sería necesario muestrear un mínimo de n = 62 animales en vez de 59 para tener una probabilidad de 0,95 de encontrar al menos un animal positivo. El aumento en el tamaño de la muestra desde 59 a 62 se debe a la disminución de la sensibilidad de la prueba desde 1 a 0,95. La gráfica de abajo indica el tamaño de muestra mínimo que se requiere para encontrar al menos un positivo para varias combinaciones de sensibilidad y prevalencia para D = 0,05 y Sp = 1. Si se sabe que la prueba tiene una especificidad menor de 1, los resultados positivos se deberán confirmar mediante una prueba con una especificidad más alta. Si la prevalencia es muy baja y la prueba utilizada tiene una especificidad menor de 1, es muy posible que un resultado positivo de la prueba sea un falso positivo.

Figura 1. Tamaño de muestra mínimo requerido para la confianza del 95% de encontrar la infección para distintas combinaciones de sensibilidad y prevalencia.

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Capítulo I.1.1. — Métodos de muestreo

C. INFORMACIÓN QUE HA DE ENVIARSE CON LAS MUESTRAS Es fundamental que las muestras individuales se identifiquen perfectamente mediante métodos adecuados. Los instrumentos de marcado deben poder resistir las condiciones de uso; por ejemplo, mojarse o congelarse. El lápiz tiene tendencia a borrarse de los contenedores, y las etiquetas, pegadas al plástico, se desprenden cuando se almacenan a –70°C. La información y el historial del caso siempre deberían acompañar a las muestras al laboratorio y deberían colocarse en un sobre de plástico, por fuera del embalaje de transporte. Se sugiere que se sigan los siguientes puntos. Es aconsejable contactar con el laboratorio receptor para determinar si tiene un formulario de envío que quisiera que le remitieran con las muestras o si necesita otra información. i)

Nombre y dirección del propietario/titular donde se dio la enfermedad, con los números de teléfono y fax.

ii)

Nombre, dirección postal, correo electrónico, números de teléfono y fax del remitente.

iii)

Enfermedades de cuya existencia se sospecha y pruebas solicitadas.

iv)

Especie, raza, sexo, edad e identidad del animal muestreado.

v)

Fecha de toma de las muestras y envío.

vi)

Lista de las muestras remitidas y medios de transporte utilizados.

vii)

Debería incluirse un historial completo para el laboratorio, que contemplara los siguientes elementos: a)

Una lista y descripción de los animales examinados y de los hallazgos del examen post-mortem.

b)

El tiempo que han permanecido los animales enfermos en la granja; si son recién llegados y de dónde procedían.

c)

La fecha de los primeros casos y de los posteriores, o de los animales muertos, con los números de referencia de los envíos anteriores.

d)

Una descripción de la extensión de la infección en la manada o rebaño.

e)

El número de animales muertos y de los que presenten signos clínicos, y edad, sexo y raza.

f)

Los signos clínicos y su duración, incluidos el estado de la boca, ojos y patas, y los datos de producción de leche y huevos.

g)

Tipo y normas para la cría, incluidos el tipo de alimento disponible, y posible contacto con venenos o plantas venenosas.

h)

Cualquier medicación administrada a los animales y cuándo se les administró.

i)

Cualquier vacuna administrada y cuándo se administró.

j)

Otras observaciones sobre la enfermedad y manejo de los animales.

D. EMBALAJE Y TRANSPORTE DE MUESTRAS 1.

Autorización de envío de especímenes

Se debe contactar con el laboratorio que va a recibir las muestras, para asegurarse de que está capacitado para realizar las pruebas solicitadas y para consultar si hay requisitos especiales de embalaje o expedición. Cuando el material se envíe a otro país es imprescindible ponerse en contacto con el laboratorio receptor. Normalmente se necesitará una licencia de importación especial para cualquier material biológico, que debe obtenerse con anticipación. La licencia debe colocarse en un sobre en el exterior del paquete.

2.

Transporte de especímenes

Los especímenes deben enviarse al laboratorio por el procedimiento más rápido disponible. Si las muestras pueden llegar al laboratorio antes de 48 horas, se deben enviar refrigeradas. Si se utiliza hielo seco, se deben seguir normas adicionales de empaquetado. Las sustancias infecciosas, que pueden incluir especímenes de diagnóstico, no se pueden enviar como equipaje facturado ni como equipaje de mano, y se deben enviar como cargamento.

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Capítulo I.1.1. — Métodos de muestreo

3.

Embalaje

El remitente debe asegurarse de que los especímenes se embalan de tal forma que lleguen al laboratorio en buenas condiciones y que no hay fugas durante el transporte. El Reglamento sobre Mercancías Peligrosas (DGR) de la Asociación Internacional de Transporte Aéreo (IATA) tiene requisitos explícitos sobre el embalaje y expedición de especímenes para diagnóstico en todos los medios comerciales de transporte aéreo. En muchos países se exigen requisitos similares para los envíos terrestres y por servicio postal. Los requisitos para el transporte aéreo se especifican de forma detallada en las publicaciones de la IATA, que son actualizadas cada año. Se espera que el remitente conozca y siga los procedimientos esbozados en el Reglamento para Mercancías Peligrosas (DGR). A continuación se ofrece un resumen del Reglamento vigente en el momento en que este Manual se envió a la imprenta, y que deberían seguirse para cualquier envío. También anticipamos que a partir del 1 de enero de 2005 tendrán efecto algunos cambios importantes en las citadas normas. Si hay cambios significativos en las DGR, colocaremos una versión revisada de este capítulo en la red, en el sitio Web www.oie.int . Los remitentes deberán consultar siempre la última versión de las DGR de la IATA antes de proceder al envío de especímenes de diagnóstico. Además, tres de las directrices nacionales ofrecen instrucciones explícitas para el embalaje y envío de especímenes de diagnóstico, estando tales directrices basadas en los requisitos de la IATA (2, 4, 8). Las DGR esboza los procedimientos para el envío de sustancias infecciosas, incluidos los especímenes de diagnóstico. Las DGR define las sustancias sospechosas como sustancias de las que se sabe o se sospecha que contienen patógenos. Los patógenos se definen como microorganismos (incluidas bacterias, virus, rickettsias, parásitos y hongos) o microorganismos recombinantes (híbridos o mutantes) de los que se sabe o se tiene una sospecha razonable de que causan enfermedades en los humanos o los animales. La IATA (5, 6) menciona como exento del Reglamento sobre Mercancías Peligrosas el siguiente supuesto: Las sustancias que no contienen sustancias infecciosas o las sustancias que no es probable que causen enfermedades en humanos o animales no están sujetas a estas Regulaciones salvo que se ajusten a criterios por los que se las pueda incluir en otra clase. También hay excepciones para algunos productos biológicos, y el remitente debe consultar el Reglamento de la IATA ya que algunos de esos productos no están exentos. A continuación ofrecemos la definición de productos biológicos que aparece en las DGR: Los productos biológicos provienen de organismos vivos. Estos se fabrican y distribuyen de acuerdo con los requisitos exigidos por las correspondientes autoridades gubernativas de ámbito nacional; estos productos están sometidos a requisitos para obtener licencias y se utilizan para la prevención, tratamiento o diagnóstico de enfermedades humanas o animales, o para el desarrollo, experimentación e investigación relacionados con los propósitos antes mencionados. Entre esos productos se incluyen productos acabados o no acabados como las vacunas y los materiales de diagnóstico. Las DGR especifica que las sustancias infecciosas (incluidos los especímenes que puedan contener patógenos que afectan a los humanos o los animales) se designan como N2814, NU2900 o UN3373. Las muestras enviadas para fines diagnósticos deberían designarse como UN 2814 o UN 2900 si contienen material proveniente de humanos o animales afectados por cualquier enfermedad contagiosa para las que normalmente no existe tratamiento efectivo ni medidas preventivas1. Las sustancias infecciosas que se ajusten a esta definición y afecten a los humanos, incluidos los agentes zoonósicos, se designan como UN 2814. Las que sólo afectan a los animales se designan como UN 2900. Las sustancias infecciosas enviadas con fines diagnósticos, y que no se ajustan a los criterios por los que se las designaría como UN2814, o, UN 2009, son asignadas a la clase UN 3373 y designadas como “Especímenes de Diagnóstico”. Las DGR de la IATA contiene una lista indicativa de los patógenos que se deben asignar a UN 2814, o, UN 2900 (Cuadros 1 y 2). Los patógenos incluidos en estas listas no se pueden asignar a UN 3373 (5, 6).

1

La definición propuesta para la versión de la DGR en el 2005 es: “Sustancia infecciosa que se transporta de tal forma que, en caso de exposición a la misma, es capaz de provocar invalidez permanente, peligro para la vida o enfermedad letal en humanos y animales.

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Capítulo I.1.1. — Métodos de muestreo

Cuadro 1. Sustancias infecciosas que afectan a los humanos y que deben denominarse UN 2814. Bacilo del ántrax (sólo cultivos)

Virus de la Encefalitis japonesa (sólo cultivos)

Brucella abortus (sólo cultivos)

Virus de Junin

Brucella melitensis (sólo cultivos)

Virus de la Enfermedad de la Selva de Kyasanur

Brucella suis (sólo cultivos)

Virus de Lassa

Burkholderia mallei – Pseudomonas mallei – Muermo (sólo cultivos)

Virus Machupo

Burkholderia pseudomallei – Pseudomonas pseudomallei (sólo cultivos)

Virus de Marburg

Chlamydia psittaci – cepas aviares (sólo cultivos)

Mycobacterium tuberculosis (sólo cultivos)

Clostridium botulinum (sólo cultivos)

Virus de la Viruela del mono

Coccidioides immitis (sólo cultivos)

Virus de Nipah

Coxiella burnetii (sólo cultivos)

Virus de la Fiebre hemorrágica de Omsk

Virus de la Fiebre hemorrágica de Crimea-Congo

Virus de la Polio (sólo cultivos)

Virus del Dengue (sólo cultivos)

Virus de la Rabia

Virus de la Encefalitis equina del Este (sólo cultivos)

Rickettsia prowazekii (sólo cultivos)

Escherichia coli, verotoxigénico (sólo cultivos)

Rickettsia rickettsii (sólo cultivos)

Virus del Ébola

Virus de la Fiebre del Valle del Rift

Virus Flexal

Virus de la Encefalitis rusa de primavera-verano (sólo cultivos)

Francisella tularensis (sólo cultivos)

Virus de la Sabia

Virus Guanarito

Virus de la Disentería Shigella tipo 1 (sólo cultivos)

Virus Hantaan

Virus de la Encefalitis rusa estival (sólo cultivos)

Hantavirus causante del Síndrome pulmonar por Hantavirus

Virus de la Viruela

Virus de Hendra

Virus de la Encefalitis equina venezolana

Virus de la Hepatitis B (sólo cultivos)

Virus del Oeste del Nilo (sólo cultivos)

Virus del Herpes B (sólo cultivos)

Virus de la Fiebre amarilla (sólo cultivos)

Virus de la Inmunodeficiencia humana (sólo cultivos)

Yersinia pestis (sólo cultivos)

Virus de la Gripe aviar muy virulenta (sólo cultivos)

Cuadro 2. Ejemplos indicativos de patógenos animales prohibidos que deben enviarse como sustancias infecciosas que afectan a los animales (UN 2900). Virus de la Peste equina africana

Mycoplasma mycoides – Pleuroneumonía contagiosa bovina

Virus de la Peste porcina africana

Virus de la Peste de los pequeños rumiantes

Virus de la Enfermedad de Newcastle

Virus de la Peste bovina

Virus de la Lengua azul

Virus de la Viruela ovina

Virus del Cólera porcino

Virus de la Viruela caprina

Virus de la Fiebre aftosa

Virus de la Enfermedad vesicular porcina

Virus de Dermatosis nodular contagiosa

Virus de la Estomatitis vesicular

Cualquier agente infeccioso que pueda producir una enfermedad en humanos o animales que se haya incrementado en cultivo así como los patógenos nuevos o emergentes deben asignarse a UN2814 o UN 2900, He aquí la definición de incremento en cultivo ofrecida por la IATA: Los cultivos (stocks de laboratorio) son el resultado de un proceso por el que los patógenos se multiplican o propagan para generar grandes concentraciones, de lo que se deriva un gran riesgo de infección cuando se da una exposición a los mismos. Esta definición se refiere a los cultivos preparados con la intención de generar patógenos y no incluye los cultivos producidos con fines clínicos y de diagnóstico.

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Capítulo I.1.1. — Métodos de muestreo

En el siguiente diagrama de producción se ofrece una clasificación resumida de muestras de diagnóstico.

Puede Puedela lasustancia sustanciacontener contenermicroorganismos? microorganismos? No No

Sí Sí Es Espoco pocoprobable probableque quela la sustancia sustancia cause cause una una enfermedad enfermedadhumana humana oo animal? animal? No No

Sí Sí

Está Está exenta exentade delas las Regulaciones Regulaciones de de Mercancías Mercancías Peligrosas-. Envíar en paquete a prueba Peligrosas-. Envíar en paquete a pruebade depérdidas. pérdidas.

La Lasustancia sustanciapuede puede tener tenerpatógenos patógenosque quepueden pueden causar causarenfermedades enfermedades graves gravesde de tipo tipohumano humanooo animal muy contagiosas que no pueden curarse animal muy contagiosas que no pueden curarseoo prevenirse prevenirse con con rapidez, rapidez,oo los lospatógenos patógenoslistados listadosen en el el Cuadro Cuadro 11ooCuadro Cuadro 22?? No No La Lasustancia sustanciaes esun uncultivo cultivo (exceptuados (exceptuadoslos los cultivos cultivos producidos producidospara parafines finesclínicos clínicosoo de dediagnóstico)? diagnóstico)?

Sí Sí

Sí Sí

No No La Lasustancia sustanciase se transporta transportapara para fines finesde dediagnóstico? diagnóstico?

No No

Sí Sí

Consígnese Consígnese como como espécimen espécimen de de diagnóstico diagnóstico (UN (UN 3373) 3373)

Consígnese Consígnese como como sustancia sustancia infecciosa infecciosa (UN (UN 2814 2814 or or UN UN 2900) 2900)

El embalaje de sustancias y especímenes infecciosos procedentes de enfermedades animales graves, Un 2814, o, UN 2900, se trata de forma resumida en la instrucción de embalaje 602; La Declaración de Mercancía Peligrosa por parte del remitente debe cumplimentarse y entregarse junto con las muestras. También existe el requisito de que el remitente reciba entrenamiento sobre procedimientos de embalaje aprobados por la IATA para los embarques de UN 2814 y UN 2900. Debido a la complejidad de estas directrices, se le recomienda al remitente que consulte el Reglamento de la IATA par obtener más información sobre los embarques de UN 2814 y UN 2900. El otro grupo, UN 3373, cubre los “Especímenes de Diagnóstico”. Esta categoría entraña un riesgo menor, y los paquetes que contienen tales especímenes deben llevar la etiqueta “Especímenes de Diagnóstico”; no es necesario hacer una declaración de mercancías peligrosas. La instrucción de embalaje 650 de la IATA proporciona las directrices para embalar sustancias infecciosas clasificadas como NU3373, ofreciéndose a continuación un resumen de las instrucciones de embalaje mencionadas. No obstante, debe seguirse el procedimiento completo, tal como se explica en el Reglamento de Mercancías Peligrosas más recientes de la IATA (5, 6). i)

Los especímenes para diagnóstico (UN 3373) deben disponerse en embalajes de buena calidad, que deben ser suficientemente fuertes para resistir los golpes y el peso que tienen que soportar durante el transporte. Los embalajes se deben hacer y cerrar de forma que se evite cualquier fuga de contenido que pudiera producirse en condiciones normales de transporte.

ii)

El espécimen deberá colocarse en un recipiente o recipientes primarios, ya sean botellas de cristal, tubos o contenedores de plástico.

iii)

El recipiente o recipientes primarios se envolverán en material absorbente adecuado para absorber todo el fluido de los mismos.

iv)

Si se utilizan varios recipientes primarios éstos deberán envolverse individualmente o por separado para impedir el contacto entre ellos.

v)

El recipiente o recipientes primarios y el material absorbente se colocarán dentro de un recipiente secundario.

vi)

Los recipientes primario y secundario que se utilizan para los líquidos deben ser a prueba de fugas, y deben resistir, sin fuga, una presión diferencial interna no inferior a 95 kPa entre –40°C y 55°C.

vii)

El recipiente o recipientes primarios para los sólidos deben ser a prueba de fugas.

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Capítulo I.1.1. — Métodos de muestreo

viii) El recipiente o recipientes primarios no deben contener más de 500 ml de especímenes líquidos, ni más de 500 g de sólidos. El embalaje exterior no debe exceder los 4 litros o 4 kilos para especímenes líquidos o sólidos, respectivamente. ix)

Debe incluirse una lista detallada del contenido entre el embalaje secundario y el exterior.

x)

Si el envío se realiza a temperatura ambiente o superior, el recipiente primario tiene que tener un medio que asegure su estanqueidad, tal como un cierre hermético, un cierre sellable por calor o un tapón con reborde. Si se usan tapones a rosca, deben reforzarse con cinta adhesiva.

xi)

Las bolsas refrigerantes o el hielo seco deben colocarse fuera del recipiente secundario. Si se usa hielo seco debe haber un soporte interno que mantenga el recipiente secundario en la posición original, una vez que el hielo seco se haya derretido. El embalaje exterior debe permitir la liberación de dióxido de carbono. Cuando se utiliza nitrógeno líquido, hay requisitos adicionales que se describen en el DGR.

xii)

Los recipientes primario y secundario se pondrán dentro de un embalaje de transporte con material de amortiguamiento.

xiii) El embalaje debe resistir una prueba de caída desde 1,2 metros. Existen requisitos adicionales de resistencia de embalajes usados para los especímenes NU2900 y NU2814. xiv) El paquete se etiquetará como “Especímenes para Diagnóstico”. En la casilla de “Naturaleza y Cantidad de Mercancías” de la guía de carga aérea constará “ESPECÍMENES PARA DIAGNÓSTICO EMBALADOS CONFORME A LA INSTRUCCIÓN DE EMBALAJE 650 DE LA IATA”.

4.

Documentos de embarque

Todos los documentos de embarque, incluidos la licencia de importación y el formulario de envío deben ponerse en un sobre pegado en la parte exterior del embalaje de transporte. Los formularios y las etiquetas de mercancía peligrosas requeridas se cumplimentarán tal como se explica en el DGR y se ponen también en la parte exterior del embalaje.

E. CONSERVACIÓN DE MUESTRAS EN ALMACENAMIENTOS PROLONGADOS Puede resultar muy útil establecer una colección de muestras para futuros estudios. La colección puede incluir cultivos para la comparación con futuros aislados, muestras de tejido o de suero que pueden utilizarse para validación de nuevas pruebas, y una colección de tejidos fijados o bloques de parafina para futuros exámenes histológicos. Posiblemente la colección más útil es el almacenamiento de muestras de suero. Estas muestras pueden resultar útiles si se lleva a cabo una investigación retrospectiva para comparar el estado actual de la enfermedad con el de otras veces anteriores.

Œ

Bancos de suero

Las muestras de suero pueden proporcionar información sobre los animales de los que se han tomado. Se pueden analizar diversos constituyentes de éstas, tales como inmunoglobulinas, elementos traza, toxinas, hormonas y enzimas. Si el número de muestras de suero recogido al azar de la población es suficiente, se pueden hacer comparaciones sobre la influencia del sexo, edad, raza y localización geográfica. Los resultados de esta comparación permiten identificar grupos de alto riesgo, se pueden establecer prioridades de vacunación y establecer patrones e índices de enfermedades (5). Un banco de suero es una colección catalogada de sueros que se almacenan para conservar sus propiedades inmunológicas y otras bioquímicas. Las condiciones de catalogación y almacenamiento son fundamentales para que un banco de suero sea eficaz. Cada uno de los sueros se deberá documentar e identificar perfectamente. Las bases de datos deberían contener toda la información pertinente sobre el origen de la muestra y los resultados obtenidos de las pruebas. También se pueden incluir datos adicionales que pueden ser de interés, tales como las condiciones climáticas y la productividad del animal. Es fundamental la exactitud de los datos y estos deben obtenerse cuando se toman las muestras de sangre. El primer dato fundamental es la identificación completa del animal. La cantidad de detalles registrados dependerá de la pericia del operador, siendo más importante la exactitud que la cantidad de información. Debería evitarse la mezcla de sueros, pues, aunque reduce la cantidad de documentación y el espacio de almacenamiento, también reduce enormemente la utilidad del material. La recogida de muestras de sangre debe hacerse de la forma más aséptica posible, y la esterilidad debe mantenerse durante la separación del suero y otras manipulaciones. El catálogo del banco de suero debe organizarse bien, y mantenerse en una base de datos computarizada, con una adecuada copia de seguridad. Se ha sugerido y descrito con detalle una metodología (7). Los sueros se pueden almacenar para un uso periódico o se pueden mantener almacenados a largo plazo para objetivos históricos, estas dos funciones deberán mantenerse separadas. Las condiciones de almacenamiento de los sueros deberán minimizar la pérdida de propiedades inmunológicas y de otras propiedades bioquímicas.

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Capítulo I.1.1. — Métodos de muestreo

Hay tres métodos de almacenamiento: ultracongelación, almacenamiento en seco sobre discos de papel a temperatura ambiente y liofilización (congelación-desecación). Deberá mantenerse una temperatura central por debajo de –60°C para el almacenamiento de sueros a largo plazo mediante ultracongelación. Cuanto más baja sea la temperatura mejor, pero resulta más caro de mantener. El nitrógeno en fase líquida se encuentra a – 196°C, el nitrógeno en fase de gas se encuentra a –100°C y un congelador de temperatura ultrabaja se mantendrá a –90°C. Algunos bancos de suero se han mantenido a –20°C, pero el suero puede deteriorarse y no ser apropiado para la detección de algunas propiedades, especialmente, si se almacena durante largos períodos de tiempo a esta temperatura. Los ultracongeladores deberían tener un sistema de aviso si la temperatura sube, debido a avería mecánica o a un fallo de energía. Es imprescindible un generador de emergencia junto con un espacio alternativo para el almacenamiento en frío por si hay que transferir los contenidos del congelador. El almacenamiento en disco de papel es un método simple y barato, pero sólo permite almacenar una pequeña cantidad de suero, y el suero eluído sólo es apropiado para un número limitado de pruebas. Los discos deberán mantenerse en un lugar fresco y seco. Puede que proporcionen resultados satisfactorios durante 5 años. En general, se considera la liofilización como el mejor método para almacenamiento de sueros a largo plazo. Si se optimizan las condiciones de ultracongelación, se reducirá la pérdida de características séricas. Para la liofilización se precisa un equipo caro y, además, hay que invertir mucho tiempo. Los viales liofilizados deben mantenerse a 4°C.

REFERENCIAS 1.

CAMERON A.R. & BALDOCK F.C. (1998). A new probability formula for surveys to substantiate freedom from disease. Prev. Vet. Med., 34, 1–17.

2.

CANADIAN FOOD INSPECTION AGENCY, LABORATORY DIRECTORATE: ANIMAL HEALTH (2002). Manual of Common Procedures. Section: Specimen Collection and Submission; Specimen Packaging; Specimen Transportation. Canadian Food Inspection Agency, Ottawa, Canada, 61 pp.

3.

CANNON R.M. & ROE R.T. (1982). Livestock Disease Surveys – A Field Manual for Veterinarians. Department of Primacy Industry, Water and Environment, Australia, 15 pp.

4.

COOK R., BARTON M., GLEESON L. & MAIN C. (1996). AUSVETPLAN Management Manual: Laboratory Preparedness. Animal Health Australia, Canberra, 56 pp. http://www.aahc.com.au/ausvetplan/index.htm.

5.

INTERNATIONAL AIR TRANSPORT ASSOCIATION (2004). Dangerous Goods Regulations, 44th Edition. International Air Transport Association, 800 Place Victoria, P.O. Box 113, Montreal, Quebec H4Z 1M1, Canada, 801 pp.

6.

INTERNATIONAL AIR TRANSPORT ASSOCIATION (2003). Infectious Agents and Diagnostic Specimens Shipping th Guidelines, 4 Edition. IATA, 800 Place Victoria, P.O. Box 113, Montreal, Quebec H4Z 1M1, Canada, 208 pp.

7.

MOORHOUSE P.D. & HUGH-JONES M.E. (1981). Serum banks. Vet. Bull., 51, 277–290.

8.

NATIONAL VETERINARY SERVICES LABORATORIES (2003). Procedures for Collection and Submission of Specimens. National Veterinary Services Laboratories, Ames, Iowa, USA. www.aphis.usda.gov/vs/nvsl.

9.

OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES (2003). Terrestrial Animal Health Code. Office International des Epizooties, Paris, France. www.oie.int.

10. STRAFUSS A.C. (1988). Necropsy: Procedures and Basic Diagnostic Methods for Practicing Veterinarians. Charles C. Thomas, Springfield, IL, USA, 244 pp. 11. VETERINARY LABORATORIES AGENCY (1998). Submission of Samples to VI Centres. Veterinary Laboratories Agency, New Haw, Addleston, Surrey, United Kingdom, 36 pp. 12. WORLD HEALTH ORGANIZATION/FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS (WHO/FAO) (1994). Basic Procedures for Veterinary Laboratories in Developing Countries, Pini A., Parodi P., Demeneghi D., Belemu U., Kabilika H. & Ghirotti M., eds. WHO/FAO Collaborating Centre, Viale Regina Elena 299, 00161 Rome, Italy, 142 pp.

* * *

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CAPÍTULO I.1.2.

GESTIÓN DE CALIDAD EN LOS LABORATORIOS DE PRUEBAS VETERINARIAS

RESUMEN Es esencial para el diagnóstico, la vigilancia y la comercialización que los resultados del laboratorio sean válidos. Dichos resultados deben alcanzarse mediante el uso de buenas prácticas de manejo, métodos de prueba y calibración válidos, técnicas apropiadas, control y garantía de calidad, todo ello dentro de un sistema de calidad. Estos temas comprenden un área compleja de suma importancia en la conducción e interpretación de las pruebas. Podemos denominar a este asunto “gestión de calidad del laboratorio”, e incluye elementos administrativos, operativos y técnicos. Un programa de gestión de calidad debe permitir al laboratorio demostrar que opera con un sistema de calidad viable, que es técnicamente competente, y es capaz de generar resultados técnicamente válidos. Además, un laboratorio debe llevar a cabo un programa de gestión de calidad que sea apropiado para su territorio, sus clientes, sus necesidades y objetivos, y que pueda demostrar su eficacia en la consecución de los objetivos de calidad. La necesidad y los requisitos de los programas de gestión de calidad de los laboratorios, también están determinados por la necesidad de una aceptación recíproca de los resultados de las pruebas realizadas para el comercio internacional y por la aceptación de los estándares internacionales tales como la Norma 1 Internacional 17025 de la ISO/IEC (4) para la acreditación del laboratorio. La OIE ha publicado normas detalladas sobre este tema (7). No es nuestro propósito recordar en este capítulo los requisitos de los mencionados documentos de la ISO o de la OIE. Más bien se presenta un esquema de los asuntos y consideraciones importantes que un laboratorio debe acometer en el diseño y el mantenimiento de su programa de gestión de calidad.

CONSIDERACIONES CLAVE PARA EL DISEÑO Y MANTENIMIENTO DE UN PROGRAMA DE GESTIÓN DE CALIDAD DEL LABORATORIO. Con el fin de asegurar que el programa de gestión de calidad sea apropiado, debe elaborarse cuidadosamente el diseño. En las siguientes siete secciones de este capítulo, se presenta un esquema de las principales categorías a tener en cuenta, y de los asuntos y actividades clave dentro de cada una de dichas categorías.

1.

El trabajo, las responsabilidades y los objetivos del laboratorio

Son muchos los factores que influyen en los elementos necesarios y los requisitos de un programa de gestión de calidad. Dichos factores son: i) ii) iii) iv) v) vi) vii)

1

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El tipo de prueba realizada. El uso de los resultados de la prueba. La repercusión de un resultado cuestionable o erróneo. El nivel de tolerancia de riesgo y de responsabilidad. Las necesidades del cliente (por ejemplo, sensibilidad y especificidad de los métodos de prueba, costes y tiempo para la devolución). El papel del laboratorio en el trabajo legal o en los programas reguladores. El papel del laboratorio en la asistencia, confirmación y/o supervisión del trabajo de otros laboratorios, y

Organización Internacional para la Estandarización/Comisión Internacional Electroquímica.

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Capítulo I.1.2.

— Gestión de calidad en los laboratorios de pruebas veterinarias

viii) Los objetivos comerciales del laboratorio, incluyendo la necesidad de algún reconocimiento y/o acreditación por parte de terceros.

2.

Estándares, directrices y referencias

Se recomienda que el laboratorio seleccione estándares y directrices acreditadas y fiables para ayudar en el diseño del programa de gestión de calidad. El estándar de la OIE sobre este tema, constituye una directriz útil (7). Para los laboratorios que deseen acreditarse, es esencial la utilización de la norma 17025 ISO/IEC (4) o del estándar de la OIE (7). Puede obtenerse información adicional sobre los estándares en los organismos de estándares nacionales de cada país, en el Laboratorio Internacional para la Cooperación de la Acreditación (ILAC) y en los organismos de acreditación (por ejemplo, la Asociación Internacional de Autoridades de Pruebas [NATA], en Australia; la Asociación Americana de Acreditación de Laboratorio [A2LA], en EE.UU; el Servicio de Acreditación del Reino Unido [UKAS] y en el Consejo de Estándares de Canadá [SCC]). Algunas organizaciones internacionales y técnicas, tales como la AOAC Internacional (la antigua Asociación de Químicos Analistas Oficiales) y la ISO, publican referencias, directrices y/o estándares útiles que completan los requisitos generales de la norma 17025 de la ISO/IEC. La Norma Internacional 9001 de la ISO (5), que es un norma general para los sistemas de gestión de calidad y una de las muchas normas incluidas en el grupo denominado comúnmente “Las series 9000 de la ISO”, no se utiliza para la acreditación, puesto que el cumplimiento de los requisitos, no implica ni garantiza necesariamente la competencia técnica. (Véase sección 3 abajo). Aunque un laboratorio puede llevar a cabo un sistema de gestión de calidad que cumpla con los requisitos del la norma ISO 9001, el registro o la certificación se utilizan para indicar conformidad con la norma. La norma 17025 de la ISO/IEC incluye una comparación, mediante cuadros con cláusulas numeradas, entre dicha norma, la norma ISO 9001 (de 1994) y la norma ISO 9002 de 1994. Estos dos últimos documentos han sido reemplazados por la versión 2000 (de 9001) (5).

3.

Acreditación

Si el laboratorio ha determinado que necesita un reconocimiento formal de su programa de gestión de calidad, entonces será necesaria la verificación por parte de terceros de su conformidad con el estándar o estándares seleccionados. El ILAC ha publicado los requisitos y las directrices específicas, para los laboratorios y los organismos de acreditación. Los términos acreditación, “un procedimiento por medio del cual un organismo autorizado reconoce formalmente que una persona u organismo es competente para llevar a cabo tareas específicas” (2), y la acreditación del laboratorio, “el reconocimiento formal de la competencia de un laboratorio para llevar a cabo pruebas específicas o tipos específicos de pruebas” (2), son propios de los requisitos del ILAC y del uso de la Norma 17025 de la ISO/EC y del estándar de la OIE como base para la acreditación. Por competencia se entiende algo significativo: quiere decir mucho más que tener y seguir procedimientos documentados. Tener competencia también significa que el laboratorio: i)

Tiene validez técnica, métodos de prueba validados, procedimientos y especificaciones que estén documentados de acuerdo con los requisitos de las normas y/o directrices seguidas.

ii)

Tiene personal cualificado y adecuado, capaz de entender el componente científico que subyace bajo los procedimientos.

iii)

Tiene el equipo correcto y adecuado.

iv)

Tiene instalaciones adecuadas y control medioambiental.

v)

Tiene los procedimientos y especificaciones que garantizan unos resultados precisos y fiables.

vi)

Puede prever las necesidades y problemas técnicos.

vii)

Puede solucionar y prevenir los problemas técnicos que puedan surgir.

viii) Puede controlar y calcular de forma precisa la incertidumbre en los resultados de las pruebas; y ix)

Puede demostrar competencia en la aplicación de los métodos de prueba utilizados.

4.

Selección de un organismo de acreditación

Para que una acreditación pueda propiciar la aceptación de los resultados de una prueba de laboratorio con fines comerciales, dicha acreditación debe ser reconocida por la comunidad internacional. Por lo tanto, el organismo de acreditación debe ser reconocido como competente para acreditar laboratorios. Los programas para el reconocimiento de los organismos de acreditación están basados, dentro del esquema del ILAC, en los requisitos del Estándar Internacional 17011 de la ISO/EC (3). Se puede obtener información sobre organismos de acreditación reconocidos, de las organizaciones que los reconoce, tales como la Cooperación Nacional para la Acreditación de Laboratorios (NACLA), la Cooperación Asia-Pacífico para la Acreditación de Laboratorios (APLAC), la Cooperación Interamericana para la Acreditación (IAAC), y la Cooperación Europea para la Acreditación (EA).

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Capítulo I.1.2.

5.

— Gestión de calidad en los laboratorios de pruebas veterinarias

Determinación del ámbito del programa de gestión de calidad y/o de la acreditación del laboratorio

El programa de gestión de calidad debería cubrir preferentemente las áreas de actividad que afectan a cualquier prueba realizada en el laboratorio. Sin embargo, y a efectos de acreditación, el laboratorio debería determinar el rango de pruebas que se van a incluir en la acreditación. Los factores que pueden afectar el ámbito de acreditación elegido por un laboratorio son: i)

La disponibilidad y coste del personal necesario, de las instalaciones y del equipo.

ii)

El coste del control medioambiental para evitar una contaminación cruzada.

iii)

La fecha límite para la acreditación.

iv)

El impacto de los resultados de las pruebas.

v)

El número de pruebas realizadas.

vi)

Si las pruebas efectuadas son rutinarias o no rutinarias.

vii)

Si alguna parte de la prueba se subcontrata para su realización en otro lugar.

viii) La garantía de calidad necesaria para los materiales, los reactivos y el medio. ix)

La disponibilidad de estándares de referencia (por ejemplo, los reactivos estandarizados, muestras de control de calidad interno, los cultivos de referencia).

x)

La disponibilidad de pruebas de competencia.

xi)

La disponibilidad de estándares y/o métodos de prueba plenamente validados, procedentes de fuentes fiables.

xii)

La evaluación y validación de los métodos de prueba que se van a utilizar.

xiii) La complejidad técnica del (los) método (s). Los organismos de acreditación también acreditan a los proveedores y operadores de programas de pruebas de competencia, y pueden exigir el uso de un proveedor acreditado, con el fin de entregar al laboratorio un certificado de acreditación.

6.

Métodos de Prueba

La norma 17025 de la ISO/IEC exige el uso de métodos apropiados y señala los requisitos para la selección, desarrollo y validación. El documento de la OIE también proporciona los requisitos para la selección y la validación. En los capítulos sobre enfermedades específicas, el presente Manual ofrece recomendaciones sobre la selección de métodos de prueba realizados con fines comerciales y de diagnóstico. Además se suministra un listado de pruebas para el comercio internacional. Tal como se indica en la introducción de este listado, las pruebas prescritas que aparecen en la lista son las exigidas por el Código sanitario de animales terrestres de la OIE. Se considera que estas pruebas tienen la validación adecuada para proporcionar resultados fiables al decidir qué animales son aptos para el transporte internacional. También se ofrece una lista de pruebas alternativas apropiadas para el diagnóstico de enfermedades de ámbito local, pero que pueden haber tenido una validación limitada. Generalmente se trata de pruebas serológicas. En la profesión veterinaria, otros métodos estandarizados (métodos publicados en los estándares internacionales, regionales o nacionales) o plenamente validados (métodos que han sido sometidos a un estudio colaborativo y han sido publicados o emitidos por un organismo técnico con autoridad, tal como el Internacional de la AOAC), pueden no estar disponibles aunque su uso fuera preferible. Muchos laboratorios veterinarios desarrollan o modifican los métodos, y muchos de dichos laboratorios tienen programas de prueba que utilizan métodos no estándares o una combinación de métodos estándar y no estándar. A fin de garantizar resultados válidos en los laboratorios veterinarios, incluso cuando se utilizan métodos estandarizados, por lo general debe realizarse una evaluación, una optimización y/o una validación internas.

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Capítulo I.1.2.

— Gestión de calidad en los laboratorios de pruebas veterinarias

Los clientes y el personal del laboratorio deben tener muy claro cuál es el resultado que se espera de una prueba. Muchos laboratorios de pruebas veterinarias, tendrán, por tanto la necesidad de demostrar su competencia en el desarrollo, adaptación y validación de los métodos de prueba. En el capítulo I.1.3 del presente Manual se proporciona asesoramiento detallado y específico sobre la selección, optimización, estandarización y validación de las pruebas. En los siguientes apartados se tratan los temas relacionados con la metodología de la prueba, temas que son de sumo interés para el personal implicado en una gestión de calidad de un laboratorio.

a)

Selección del método de la prueba Los resultados válidos comienzan con la selección de un método de prueba apropiado para los temas de diagnóstico de que se trate. Las consideraciones para la selección del método de prueba son: i)

Aceptación internacional.

ii)

Aceptación científica.

iii)

Vigencia del método.

iv)

Características de ejecución (por ejemplo, sensibilidad y especificidad analítica y de diagnóstico, tasa de aislamiento, precisión (repetibilidad, reproducibilidad, replicabilidad, precisión e incertidumbre).

v)

Comportamiento en las especies y en la población pertinente.

vi)

Recursos y tiempo disponibles para la realización, adaptación y/o evaluación.

vii)

Tiempo de realización y de devolución.

viii) Tipo de muestra (por ejemplo, suero, tejido) y la calidad o estado en que se espera que aquella llegue al laboratorio. ix)

Sustancia a analizar (por ejemplo, anticuerpo, antígeno).

x)

Recursos y tecnología del laboratorio.

xi)

Naturaleza del uso que se le pretende dar al método (por ejemplo, exportación, importación, vigilancia, protección, confirmación, utilización con un animal solo o con la manada).

xii)

Expectativas del cliente.

xiii) Factores de seguridad. xiv) Número de pruebas a realizar. xv)

Coste de la prueba por muestra.

xvi) Existencia de estándares de referencia, incluyendo los materiales de referencia; y xvi) Disponibilidad de planes sobre para pruebas de competencia.

b)

Optimización y estandarización del método de prueba Una vez seleccionado el método debe ponerse en marcha en el laboratorio. Tanto si el método se ha desarrollado localmente como si ha sido importado de una fuente externa, se requiere una optimización adicional. La Optimización consiste en una serie de experimentos seguida de un análisis posterior de los datos. La optimización establece las especificaciones esenciales y los estándares de ejecución para el proceso de la prueba y para su utilización a la hora de monitorizar la correcta ejecución de la prueba. La optimización debe garantizar que el método se somete al correspondiente control estadístico. La optimización también debe determinar: i)

Las especificaciones esenciales para el equipamiento y el instrumental.

ii)

Las especificaciones esenciales para los reactivos (por ejemplo, químicos o biológicos).

iii)

Las especificaciones esenciales para los estándares de referencia, materiales de referencia y controles internos.

iv)

La robustez (si es aplicable).

v)

Los puntos críticos de control esenciales y los rangos, características o comportamiento aceptables en los puntos de control esenciales, utilizando procedimientos aceptables desde el punto de vista estadístico.

vi)

Las actividades de control de calidad necesarias para monitorizar los puntos de control esenciales.

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Capítulo I.1.2.

vii)

— Gestión de calidad en los laboratorios de pruebas veterinarias

El tipo, número, alcance, frecuencia y/o disposición de los controles de ejecución de la prueba que sean necesarios.

viii) Los requisitos para controlar el comportamiento de la aceptación o rechazo no subjetivos de los resultados de la prueba.

c)

ix)

Los elementos de un método de prueba fijado y documentado, para ser usado por el personal del laboratorio; y

x)

El nivel de competencia técnica que deben reunir aquellas personas que realizan y/o interpretan la prueba.

Validación del método de la prueba La validación sirve además para evaluar la prueba según su adecuación a un determinado uso. La validación establece las características aplicables al método de la prueba, tales como el grado de sensibilidad, especificidad y aislamiento, y los parámetros de diagnóstico tales como corte positivo/negativo, y título de interés o significación. La validación debe hacerse utilizando un procedimiento optimizado, documentado y fijado. Dependiendo de los factores logísticos y de riesgo, la validación puede incluir cualquier número de actividades y cantidad de datos, con el posterior análisis de los datos mediante el uso de estadísticas apropiadas. La validación de pruebas se trata en el capítulo I.1.3., titulado Principios de validación para las pruebas de diagnóstico de enfermedades infecciosas, y en el capítulo I.1.4, titulado Validación y control de calidad de los métodos de reacción en cadena de la polimerasa utilizados para el diagnóstico de enfermedades infecciosas. Las actividades de validación podrían incluir: i)

Estudios de campo y/o epidemiológicos.

ii)

Comparación con otros métodos, preferiblemente con métodos estándar.

iii)

Comparación con estándares de referencia (si están disponibles).

iv)

Estudios en colaboración con otros laboratorios, utilizando el mismo método documentado e incluido el intercambio de muestras, con preferencia, aquellas cuya composición o dosificación no estén explicitadas. Es preferible que dichos estudios sean dirigidos por un laboratorio cualificado, que organice dichos estudios y evalúe los resultados proporcionados por todos los participantes.

v)

Reproducción de los datos a partir de un método estándar aceptado o de una publicación acreditada.

vi)

Estudios experimentales de comprobación; y

vii)

Análisis de los datos de control de calidad internos.

La norma 17025 de la ISO/IEC reconoce que “La Validación es siempre un equilibrio entre los costes, los riesgos y las posibilidades técnicas”. También admite que hay muchos casos en los que aspectos tales como la exactitud y la precisión, sólo pueden darse de forma simplificada.

d)

Incertidumbre Los laboratorios deben ser capaces de evaluar la incertidumbre suscitada por los métodos de prueba aplicados en el laboratorio. Esto incluye los métodos usados por el laboratorio para calibrar el equipo (3). Los requisitos de la norma 17025 de la ISO/IEC relacionados con este asunto, se mencionan en las secciones 5.1.2, 5.4.4k, 5.4.6.2, 5.4.6.3 y 5.10.3.1c de dicho documento. La determinación de la incertidumbre de una medición (MU), no es nueva en metrología. Sin embargo, la aplicación de los principios de la MU en los laboratorios de ciencias biológicas, es nueva. La mayor parte de los trabajos realizados hasta la fecha están relacionados con ámbitos de ensayos distintos al de las ciencias biológicas, y la mayor parte de las aportaciones son de tipo teórico. Sin embargo, a medida que la acreditación ha ido cobrando importancia, se han ido desarrollando aplicaciones en otras áreas. Es importante tener en cuenta que la MU no implica duda acerca de la validez del resultado de una prueba o de una medición, ni es equivalente a un error, ya que puede aplicarse a todos los resultados de las pruebas derivados de un procedimiento particular. La MU puede considerarse como una expresión cuantitativa de fiabilidad y se expresa comúnmente con un número después del signo +/- (es decir, el valor real cae dentro del rango establecido, ya que el MU se expresa como un rango). La desviación estándar y el intervalo de confianza son ejemplos de la expresión de la MU. Un ejemplo del uso de la desviación estándar para expresar duda, lo constituyen los límites permitidos en los controles de realización de una prueba en un enzimoinmunoensayo, comúnmente expresado como +/- n SD.

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Capítulo I.1.2.

— Gestión de calidad en los laboratorios de pruebas veterinarias

Aunque la determinación y expresión de la MU no han sido estandarizadas para los laboratorios de pruebas veterinarias, existen algunas directrices bien fundadas. En el laboratorio debe estimarse el MU para cada método que haya de ser acreditado. Puede estimarse mediante una serie de pruebas realizadas sobre muestras control. La MU puede también estimarse utilizando características manejadas en publicaciones (6), pero antes el laboratorio debe demostrar una actuación aceptable al aplicar el método. Las agencias gubernamentales pueden fijar metas para los valores de la MU para los métodos oficiales, (por ejemplo: Health Canadá). Organizaciones técnicas de prestigio (como la AOAC Internacional, ISO, NATA, A2LA, SCC, UKAS, Eurachem y la Cooperación para la Trazabilidad Internacional en Química Analítica [CTAC]), imparten cursos y ofrecen directrices sobre MU para los laboratorios que solicitan la acreditación. Codex Alimentarius, que especifica los estándares para las pruebas con alimentos, ha asumido el principio de que no es necesario que un laboratorio obtenga una estimación adicional de la MU, si dicho laboratorio cumple con los principios de Codex relativos a la calidad: es decir, que el laboratorio está acreditado por la norma 17025 de ISO/IEC y usa métodos validados ( por ejemplo, que conozca parámetros aplicables tales como sensibilidad y especificidad, así como el intervalo de confianza en torno a dichos parámetros), y que participe en los Programas de Pruebas de Competencia, y en los estudios en colaboración, y utilice procedimientos de control de calidad internos que sean apropiados. El “uso de procedimientos adecuados de control de calidad, de carácter interno”, implica que el laboratorio debe utilizar procedimientos de control de calidad para identificar las principales fuentes de incertidumbre. No es preciso tratar cada componente por separado. Los componentes pueden estimarse mediante experimentos de laboratorio (estimaciones de Tipo A) o a partir de otras fuentes (materiales de referencia, certificaciones de calibración, etc.) (estimaciones de Tipo B). Un procedimiento tradicional de muestra control, llevado a cabo muchas veces por todos los analistas, normalmente identifica todas las fuentes principales de duda, con la posible excepción de la preparación de la muestra. Puede utilizarse la variación de las muestras control como una estimación de aquellas fuentes combinadas de duda. La norma 17025 de ISO/IEC exige que el laboratorio identifique todas las fuentes importantes de incertidumbre, y que obtenga estimaciones fiables de MU. Puede darse el caso de que los laboratorios deseen establecer especificaciones aceptables, criterios y/o intervalos en los puntos críticos de control para cada componente. Donde proceda, los laboratorios pueden implementar el control adecuado de calidad en los puntos críticos asociados con cada fuente o intentar reducir el tamaño de un componente. Entre las fuentes de incertidumbre, están el muestreo, las condiciones de almacenamiento, los efectos de la muestra, la extracción y recuperación la calidad del reactivo, la pureza del material de referencia, las manipulaciones volumétricas, las condiciones ambientales, la contaminación, los efectos del equipamiento, el sesgo del operador o analista, y otros defectos desconocidos o debidos al azar. Es de esperar que el laboratorio se ocupe de cualquier error que se haya producido de forma sistemática. (Véase también la Sección 6.b., puntos i-vii). Los errores sistemáticos (por sesgo) deben corregirse con cambios metodológicos, ajuste matemático, anotación de cualquier sesgo en el documento de informe. Si se produce un ajuste del procedimiento, puede ser necesaria o no una re-evaluación de la incertidumbre. Si se produce un ajuste para corregir el sesgo, se estará introduciendo una nueva fuente de incertidumbre (la incertidumbre de la corrección). Esta debe añadirse a la MU de la estimación. Las tres formas principales de estimación de la MU son: 1. La aproximación por componentes (aproximación de abajo hacia arriba o “bottom-up”), en la que se identifican todas las fuentes de incertidumbre, se hacen estimaciones razonables para cada componente, se desarrolla un modelo matemático que relaciona entre sí a los componentes y se combinan las variaciones utilizando reglas para la propagación del error (1). 2. La aproximación en que se utilizan muestras control (aproximación de arriba hacia abajo o “top-down”), en la que se utilizan mediciones de material control estable para estimar la variación combinada de muchos componentes. Debe añadirse la variación procedente de fuentes adicionales. 3. La aproximación que tiene en cuenta las características del método, en la que se utilizan como incertidumbres combinadas los datos de actuación de un estudio colectivo válido (se pueden añadir otras fuentes de incertidumbre). Los laboratorios deben cumplir con los criterios definidos para el tratamiento del sesgo y la repetibilidad a fin de que las estimaciones de MU sean válidas. Estas deberían ser mayores que las obtenidas por los laboratorios competentes mediante la utilización de sus propias muestras control o mediante le modelo de componentes.

e)

Aplicación y uso del método de la prueba Los analistas deben demostrar su competencia en el uso del método de la prueba, según se va realizando ésta, antes de elaborar el informe con los resultados.

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Capítulo I.1.2.

— Gestión de calidad en los laboratorios de pruebas veterinarias

El laboratorio debe garantizar, mediante la gestión de proyectos adecuados y documentados, el registro de datos, el manejo de datos y los procedimientos de archivado, que puede recrear de nuevo, si es necesario, todos los aspectos relacionados con la selección, el desarrollo, la optimización, la estandarización, la validación, la realización y el uso de la prueba. Ello incluye las actividades de control y garantía de calidad.

7.

Plan Estratégico

Es esencial que haya un perfeccionamiento continuo. Se recomienda que el laboratorio esté informado y al día en torno a cualquier obstáculo que se presente relacionado con los estándares y los métodos utilizados, con el fin de demostrar la competencia del laboratorio y establecer y mantener la validez técnica. Los métodos para llevar esto a cabo son: i)

Asistencia a conferencias.

ii)

Participación en organizaciones locales e internacionales.

iii)

Participación en la redacción de estándares nacionales e internacionales (por ejemplo, participación en las comisiones del ILAC y de ISO).

iv)

Consulta de publicaciones.

v)

Visitas a otros laboratorios.

vi)

Participación en programas de colaboración (por ejemplo, con el Instituto Interamericano de Cooperación para la Agricultura).

vii)

Intercambio de procedimientos, métodos, reactivos, muestras, personal e ideas; y

viii) Siempre que sea posible, acreditación por medio de terceros de que dicho laboratorio está reconocido como competente para emitir acreditaciones.

REFERENCIAS 1.

AMERICAN NATIONAL STANDARDS INSTITUTE (1997). ANSI/NCSL Z540-2-1997, US Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement, First Edition. American National Standards Institute, 1819 L Street, NW, Washington, DC 20036, USA.

2.

ISO/IEC INTERNATIONAL STANDARD 17000 (2005) . Conformity Assessment – General Vocabulary. International Organisation for Standardisation (ISO), ISO Central Secretariat, 1 rue de Varembé, Case Postale 56, CH - 1211, Geneva 20, Switzerland.

3.

ISO/IEC INTERNATIONAL STANDARD 17011 (2003) . General Requirements for Bodies Providing Assessment and Accreditation of Conformity Assessment Bodies– General Requirements for Operation and Recognition. International Organisation for Standardisation (ISO), ISO Central Secretariat, 1 rue de Varembé, Case Postale 56, CH - 1211, Geneva 20, Switzerland.

4.

ISO/IEC INTERNATIONAL STANDARD 17025 (1999). General Requirements for the Competence of Testing and Calibration Laboratories. International Organisation for Standardisation (ISO), ISO Central Secretariat, 1 rue de Varembé, Case Postale 56, CH - 1211, Geneva 20, Switzerland.

5.

ISO INTERNATIONAL STANDARD 9001 (2000). Quality management systems – Requirements. International Organization for Standardization (ISO), ISO Central Secretariat, 1 rue de Varembé, Case Postale 56, CH 1211, Geneva 20, Switzerland.

6.

ISO DTS 21748 (draft). Guide to the use of repeatability, reproducibility and trueness estimates in measurement uncertainty estimation. International Organisation for Standardisation (ISO), ISO Central Secretariat, 1 rue de Varembé, Case Postale 56, CH - 1211, Geneva 20, Switzerland.

7.

OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES (2000). Standard for Management and Technical Requirements for Laboratories Conducting Tests for Infectious Animal Diseases. In: OIE Quality Standard and Guidelines for Veterinary Laboratories: Infectious Diseases (2002). Office International des Epizooties (OIE), 12 rue de Prony, 75017 Paris, France, 1–31.

2

3

* * * 2

3

20

ISO/IEC International Standard 17000 replaces ISO/IEC GUIDE 2 (1996). Standardisation and Related Activities – General Vocabulary. ISO/IEC International Standard 17011 replaces ISO/IEC Guide 58 (1993). Calibration and Testing Laboratory Accreditation Systems – General Requirements for Operation and Recognition.

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CAPÍTULO I.1.3.

PRINCIPIOS DE VALIDACIÓN PARA LAS PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS

INTRODUCCIÓN La validación consiste en la evaluación de un proceso a fin de determinar su idoneidad para un uso particular. Una ensayo validado produce resultados que identifican la presencia de un compuesto concreto (por ejemplo, un anticuerpo) y permite la posibilidad de formular predicciones sobre el estado de los sujetos analizados. Las pruebas realizadas sobre individuos o sobre poblaciones tienen varios propósitos, tales como ayudar a documentar la ausencia de una determinada enfermedad en un país o región, evitar su propagación a través del comercio, erradicar una infección de una zona, confirmar el diagnóstico de los casos clínicos, estimar la prevalencia de una infección para facilitar análisis de riesgo, identificar los animales infectados con vistas a desarrollar medidas de control, y clasificar los animales según su salud o estado de inmunización ECP la vacunación. Es posible validar una única prueba para uno o varios propósitos mejorando algunas características de su realización en cada caso (por ejemplo, elevando el nivel de sensibilidad del diagnóstico - hasta el 99,99%- y disminuyendo a la vez su especificidad para un ensayo general, o inversamente, estableciendo una alta especificidad asociada a un bajo nivel de sensibilidad en una prueba confirmativa). Si consideramos las variables que pueden afectar a la realización de un ensayo, podremos apreciar más claramente los criterios que deben tenerse en cuenta para su validación. Estas variables pueden agruparse en tres categorías: (a) la muestra - que refleja las interacciones hospedador/organismo que influye en la composición y concentración del componente a analizar en la muestra de suero; (b) el sistema de ensayo - que incluye factores físicos, químicos, biológicos y técnicos que afectan a la capacidad de la prueba para detectar en la muestra un componente específico; y (c) el resultado de la prueba - es decir, la capacidad del sistema de ensayo para predecir de forma precisa el estado del individuo o de la población en relación con el componente en cuestión. Los factores que influyen en la concentración y en la composición de un componente de la muestra de suero dependen en gran medida del hospedador y son factores naturales (como la edad, sexo, raza, estado nutritivo, embarazo, respuesta inmunológica), o bien factores adquiridos (como la adquisición pasiva de anticuerpos, la inmunidad activa obtenida por vacunación o infección). Otros factores que no dependen del hospedador, como la contaminación o el deterioro de la muestra, también pueden afectar al componente a analizar en dicha muestra. Los principios de validación que se consideran en este capítulo se refieren fundamentalmente a métodos para detectar anticuerpos en sueros. No obstante, estos mismos principios se pueden aplicar a la valoración de pruebas para otros componentes en sueros o tejidos. El capítulo I.1.4., que trata de la validación y el control de calidad de métodos de la reacción en cadena de la polimerasa usados para el diagnóstico de enfermedades infecciosas, aplica los principios generales descritos aquí a un método directo de detección de agentes infecciosos, mediante ensayos de diagnóstico molecular.

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Capítulo I.1.3. — Principios de validación para las pruebas diagnósticas de enfermedades infecciosas

Los factores que interfieren en la precisión analítica del sistema de ensayo incluyen la instrumentación, el error técnico, la elección de los reactivos (tanto desde el punto de vista químico como biológico), la calibración, ajuste y límites de validez de los controles, los recipientes de las reacciones, la calidad del agua, el pH y la fuerza iónica de los tampones y diluyentes, las temperaturas de incubación y su duración, así como los errores que se introducen por detección de compuestos estrechamente relacionados, del tipo de anticuerpos con reacción cruzada, factores reumatoides, o anticuerpos heterófilos. Los factores que influyen en la capacidad del resultado de una prueba para predecir de forma 1 precisa la infección o el nivel de un componente analizado en el hospedador son la sensibilidad del diagnóstico, la especificidad del mismo, y la prevalencia de la enfermedad en la población objeto de la prueba. La sensibilidad y la especificidad diagnóstica derivan de resultados de pruebas con muestras obtenidas de animales de referencia previamente seleccionados. Los métodos empleados para seleccionar estos animales son importantes para la precisión de las estimaciones (5). El grado en que dichos animales representen todas las variables ambientales y del hospedador en la población examinada tiene una influencia fundamental en la adecuada interpretación de los resultados. Por ejemplo, los clínicos experimentados saben que un ensayo validado para un tipo de ganado del norte de Europa puede que no sea adecuado para suministrar resultados válidos cuando se aplica a poblaciones de ganado de África. La capacidad del resultado positivo o negativo de una prueba para predecir de forma precisa el estado de un animal o población con respecto a una infección es la consideración más importante para la validación de un ensayo. Esta capacidad no sólo depende de un ensayo preciso y muy fiable, y de estimaciones cuidadosamente obtenidas acerca de la sensibilidad y la especificidad de diagnóstico, sino que también está muy influenciada por la prevalencia de la infección en la población sometida a análisis o por la probabilidad de que un animal esté infectado según criterios clínicos. Sin una estimación real de la prevalencia de la enfermedad en esa población o de la probabilidad de infección en un animal aislado, la interpretación del resultado positivo o negativo de una prueba puede resultar dudosa. Por supuesto, antes de considerar validado un ensayo se deben tener en cuenta muchas variables (15,13). Sin embargo, no hay consenso sobre si el concepto de validación de un ensayo es un proceso temporalmente limitado, en el que solamente se optimizan y estandarizan aquellos factores inherentes al ensayo, o bien si supone una validación continuada del ensayo por todo el tiempo en el que el ensayo puede ser usado. De acuerdo con lo descrito, el término "ensayo validado" puede llevar a varias interpretaciones entre los técnicos de laboratorio y los veterinarios clínicos. Por consiguiente, se ofrece una definición funcional de la validación de un ensayo como marco para las directrices esbozadas a continuación. En teoría, todos las pruebas diagnósticas deberían ser completamente validadas para uno o varios fines, pero en la práctica a veces existen limitaciones para una completa validación.

1

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A lo largo de este capítulo, los términos “positivo” y “negativo” se emplean con relación a los resultados de pruebas y nunca para designar el estado de infección o el nivel de anticuerpo/antígeno en el hospedador. Cuando se hace referencia a “infección” o “compuesto a analizar” se supone la existencia de algun modo de exposición a un agente infeccioso que puede ser detectado de modo directo (como antígeno) o indirecto (como anticuerpo) por una prueba de ensayo.

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Capítulo I.1.3. — Principios de validación para las pruebas diagnósticas de enfermedades infecciosas

A. DEFINICIÓN DE LA VALIDACIÓN DE UN ENSAYO Un ensayo validado proporciona de modo repetitivo unos resultados mediante un test que identifican a los animales como positivos o negativos para un componente o proceso determinado (por ejemplo un anticuerpo, un antígeno, o la induración cutánea localizada en el sitio de prueba) y, por deducción, permite predecir de 2 modo preciso el estado de infección de animales con un grado predeterminado de fiabilidad estadística . Este capítulo se centrará en los principios que fundamentan el desarrollo y el mantenimiento de una prueba validada. Se incluyen también algunas indicaciones acerca de los estadios iniciales del desarrollo del ensayo porque constituyen parte del proceso mismo de validación. La capacidad del resultado final del test en cuanto a proporcionar fiabilidad diagnóstica está influenciada de un modo notable por el modo en que se lleva a cabo este proceso inicial. Debe hacerse hincapié en que un ensayo, cuando se aplica a poblaciones, minimizará la clasificación de animales como falsos positivos o falsos negativos solamente en la medida en que su validez esté garantizada en todas las fases del proceso de validación del ensayo. Esto supone que un método de prueba bien diseñado y documentado, así como unos reactivos adecuados, en combinación con técnicos bien preparados, proporcionarán un ensayo estable de laboratorio. También implica el empleo minucioso de un riguroso diseño experimental y de herramientas epidemiológicas y estadísticas. Estos son elementos requeridos para eliminar sesgo, errores aleatorios y falsas suposiciones acerca de la población de animales sobre la que se formulan las estimaciones del ensayo (5). Además, se supone que el ensayo se adapta bien al propósito que se persigue (por ejemplo, es probable que un ensayo confirmativo suministre muchos resultados del tipo falsos positivos si se usa como una prueba general de detección). Finalmente, esto también supone que, en la práctica, el ensayo se aplica dentro del contexto de un programa riguroso de control de calidad. La definición funcional de validación de un ensayo que se emplea en este capítulo generaliza un proceso que conlleva diferentes aspectos en función de la intención o el fin para el cual se desarrolla. Dejando a un lado el tipo concreto de ensayo, sin la existencia de rigor científico en el proceso validativo, el ensayo no cumplirá las expectativas. No obstante, existen muchas técnicas tradicionales con un uso muy extendido que no han sido sometidas a un proceso de validación completo.

B. ESTADIOS DE LA VALIDACIÓN DE UN ENSAYO El desarrollo y la validación de un ensayo es un proceso secuencial que consta de al menos de cinco fases: 1) Determinación de la viabilidad del método para un uso específico; 2) Elección, optimización y estandarización de los reactivos, técnicas y métodos; 3) Determinación de las características de funcionamiento del ensayo; 4) Evaluación continuada del funcionamiento; y 5) Mantenimiento y refuerzo de los criterios de validación durante el uso rutinario del ensayo (Figura 1). Aunque algunos científicos pueden cuestionar la relevancia de la cuarta y quinta fase, tales estadios se incluyen aquí porque un ensayo solo se considera válido cuando los resultados de las pruebas son válidos, es decir, si están dentro de límites estadísticamente definidos y proporcionan deducciones precisas. En la práctica, hay muchas técnicas tradicionales de amplio uso que no se han sometido al proceso de validación formal expuesto. Se deberían hacer esfuerzos para validar formalmente las características de funcionamiento de estos ensayos, mediante el uso de datos históricos o bien a través de un estudio prospectivo. Esto daría crédito a la creencia de que tales ensayos son útiles para lo que se pretende. En dichos casos se puede comenzar el proceso en los estadios 4 y 5, reuniendo un conjunto de datos de validación para ensayos que carezcan de la información necesaria correspondiente a las fases 1-3. Es muy importante no detenerse después de los dos primeros estadios de validación de un ensayo -ya que eso no constituye un ensayo validado para uso diagnóstico. Aunque la mejora del protocolo y de los reactivos son factores importantes, el factor más crítico es probablemente la selección de las poblaciones de referencia. Cuando se revisa la literatura no resulta raro encontrar un amplio espectro de valoraciones sobre la sensibilidad diagnóstica y la especificidad diagnóstica para un mismo ensayo básico. Aunque parte de la variación se puede atribuir a los reactivos escogidos, es probable que la variación en las valoraciones de la sensibilidad y de la especificidad se deba a una selección sesgada de los sueros sobre los que se "valida" la prueba. Este estadio en la validación de un ensayo necesita más atención de la que ha recibido con anterioridad. Esto es

2

Según esta definición, la sensibilidad y especificidad diagnósticas son características de la realización de una prueba para una población estudiada. Ambas características determinan –en conjunción con la prevalencia de la enfermedad en la población- la probabilidad de que un resultado concreto de una prueba refleje el verdadero estado del animal. Puede aceptarse como validada una prueba si se dispone de estimaciones fiables de la sensibilidad y la especificidad diagnósticas para la población estudiada. Esto no implica la exigencia de unos determinados valores-umbral de esos dos parámetros. En aplicaciones prácticas, unos valores de sensibilidad o especificidad bajos o problemas de diagnóstico debidos a una prevalencia baja de la enfermedad se compensan con el diseño de muestreo o combinando muchas pruebas de diagnóstico ya sea en paralelo, ya sea secuenciadas. La selección de las pruebas, el proceso de muestreo, la combinación de múltiples pruebas en un determinado régimen de ensayo y la regla de interpretación de resultados hacen posible una definición del proceso de diagnóstico.

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Capítulo I.1.3. — Principios de validación para las pruebas diagnósticas de enfermedades infecciosas

particularmente cierto ante la atmósfera actual de acuerdos de comercio internacional y todas sus implicaciones respecto al movimiento de animales y sus productos derivados.

Seleccionar método

FASE 1 Viabilidad

Seleccionar sueros estándar

Seleccionar sueros control Estudios de viabilida

FASE 2 Desarrollo y estandarización

FASE 3 Caracterización operativa del ensayo

Problemas que requieren reconsideración

Sueros de animales infectados y no infectados

Optimizar y estandarizar reactivos y protocolos

Sensibilidad analítica

Ensayar muestras de animales de referencia

Normalizar datos

Especificidad analítica Valoraciones iniciales de repetitividad

Estándares de suero conocidos Establecer cortes

FASE 4 Comprobación de la realización y validez del ensayo

Resultados normalizados de pruebas de rutina

Categorizar los resultados en Pos/Neg

Controlar precisión y exactitud

FASE 5 Mantenimiento y mejora de criterios de validación

Cambio de reactivos estandarizados por comparación con reactivos en uso

Calcular precisión y exactitud

Calcular especificidad y sensibilidad diagnóstica

Determinar la prevalencia en la población

Calcular VPr+ y VPr- para una interpretación válida de resultados

Extensión de la validación a otras poblaciones probando sueros de animales de referencia representativos de dichas

Fig. 1. Fases consecutivas del proceso de validación de un ensayo

En este capítulo usaremos un ensayo indirecto basado en la unión de una enzima a un inmunoadsorbente (técnica ELISA) para la detección de anticuerpos a fin de ilustrar los principios de validación de un ensayo. Es un formato de prueba que puede resultar difícil de validar debido a la amplificación de la señal tanto de los componentes específicos como de los inespecíficos (2). Esta metodología sirve para destacar los problemas a los que hay que enfrentarse en cualquier proceso de validación. Los mismos principios básicos se usan en la validación de otros formatos de ensayo simples o complejos. El Capítulo I.1.4., sobre validación y control de calidad de los métodos de reacción en cadena de la polimerasa que se usan para el diagnóstico de enfermedades infecciosas, describe los principios para validar técnicas de amplificación de genes. Por limitaciones de espacio, este capítulo introductorio proporciona únicamente directrices básicas en los principios relacionados con la validación de un ensayo. Su presentación deriva de un tratamiento más detallados del tema (8).

1ª FASE. ESTUDIOS DE VIABILIDAD En el ejemplo de las técnicas ELISA, los estudios de viabilidad constituyen la primera fase para validar un nuevo ensayo. Se llevan a cabo para determinar si los reactivos y el protocolo que han sido seleccionados tienen la capacidad de distinguir entre un intervalo de concentraciones de anticuerpo frente a un agente infeccioso a la vez que proporcionan una mínima actividad inespecífica de fondo. Los estudios de viabilidad también suministran estimaciones iniciales de reproducibilidad, y de sensibilidad y especificidad analíticas.

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Capítulo I.1.3. — Principios de validación para las pruebas diagnósticas de enfermedades infecciosas

1.

Muestras control

Resulta útil seleccionar cuatro o cinco muestras (suero en nuestro caso) que difieran en cuanto al nivel de anticuerpos contra el agente infeccioso en cuestión. Además, se requiere una muestra que no contenga anticuerpos. Estas muestras se usarán para optimizar los reactivos y el protocolo del ensayo durante los estudios de viabilidad, y más tarde como muestras control. En teoría, las muestras deberían representar tanto a animales que se consideran infectados como aquellos no infectados dentro de la población que finalmente va a ser objeto del ensayo validado. Por otra parte, las muestras deben haber dado los resultados esperados en uno o más ensayos serológicos además de aquél en el que se está validando. Con preferencia, las muestras deben proceder de animales individuales, aunque también pueden derivar de la acumulación de muestras de varios animales. Una práctica que resulta adecuada es preparar un gran volumen de cada muestra (por ejemplo, 10 ml) y dividirlo en alicuotas de 0,1 ml para almacenamiento a -20ºC o por debajo de esta temperatura. Luego, una alícuota de cada muestra se descongela, se utiliza para los experimentos y después se desecha. Si resulta poco práctico descartar la alícuota, se puede mantener la misma a -4ºC para experimentos sucesivos hasta alrededor de 2 semanas, aunque en estas circunstancias existe la posibilidad de que la muestra se deteriore. A continuación, se descongela otra alícuota para ulterior investigación. Este método proporciona una misma fuente de suero con idéntico número de ciclos de congelación-descongelación para todos los experimentos (la congelación y descongelación repetida del suero puede desnaturalizar los anticuerpos, de modo que debería evitarse). También, la variación se reduce cuando el investigador usa la misma fuente de suero para todos los experimentos en vez de cambiar entre varios sueros. Este enfoque tiene la ventaja añadida de generar una serie de datos válidos para muestras que se manejan repetidamente. Después de que se completan las fases iniciales de validación de un ensayo, una o más muestras se pueden convertir además en controles de suero que son la base para la expresión de los datos y la evaluación de la reproducibilidad tanto dentro de un ensayo como entre diferentes ensayos. Pueden también servir como estándar de referencia si su actividad ha sido predeterminada; esos estándares normalizados proporcionan la seguridad de que la realización de los ensayos produce datos precisos (13). Es muy deseable incluir los sueros internacionales estandarizados de la OIE u otros sueros estandarizados, si puede disponerse de ellos. Su uso proporcionaría una adecuada armonización entre el ensayo en desarrollo y cualquier otro método normalizado que use normalmente sueros de tipo estándar internacional (12).

2.

Selección del método para lograr resultados normalizados

La normalización ajusta los resultados directos del test para todas las muestras con relación a los valores de los controles incluidos en cada desarrollo del ensayo (no confundir esto con una transformación de datos para lograr una distribución normal de Gauss). El método de normalización y expresión de los datos debería determinarse, preferiblemente, antes del final de los estudios de viabilidad. Las comparaciones de resultados día a día y entre laboratorios son más precisos cuando se usan datos normalizados. Por ejemplo, en los sistemas ELISA, los valores directos de densidad óptica (absorbancia) son medidas absolutas influenciadas por las temperaturas ambientales, los parámetros de comprobación y la instrumentación fotométrica. Para tener en cuenta esta variabilidad, los resultados se expresan en función de la reactividad de una o más muestras control de los sueros que se incluyen en cada desarrollo del ensayo. En el método indirecto de la técnica ELISA, la normalización de los datos se logra expresando los valores de absorbancia en una de varias formas posibles (13). Un método simple y útil es expresar todos los valores de absorbancia como porcentaje de un control único de suero altamente positivo que se incluye en cada placa. Este método resulta adecuado para la mayoría de las aplicaciones. El procedimiento de normalización puede resultar más riguroso si se calculan los resultados a partir de una curva estándar generada por varios controles de suero. Esto requiere un algoritmo más sofisticado, tal como un ajuste de regresión lineal o un análisis de tipo log-logit. Este método es más preciso porque no descansa solamente en una muestra control altamente positiva para la normalización de datos, sino que usa varios controles de suero, ajustados a valores esperables, para obtener una curva estándar desde la que puede extrapolarse el valor de la muestra. Este método también permite la exclusión de un valor control que puede caer fuera de los límites de confianza esperados. Para ensayos de punto final por titulación de la muestra, como la neutralización vírica por suero, cada ensayo realizado se acepta o se rechaza en función de si los valores control caen dentro de límites predeterminados. Ya que los valores de la muestra no se ajustan normalmente a un valor control, los datos no resultan normalizados en estricta definición del término. Sea cual sea el método usado para la normalización de los datos, es esencial incluir controles adicionales para cada reactivo que pueda introducir variabilidad y que pueda limitar por tanto los intentos de lograr un ensayo validado. Los valores normalizados para tales controles tienen que caer dentro de límites predeterminados (dentro de un múltiplo apropiado de la desviación estándar de la media de muchas reacciones de cada control). Los límites escogidos deberían reflejar una tasa tolerable de rechazo de ensayo y un riesgo aceptable de que algunas muestras de test puedan estar mal clasificadas.

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2ª FASE. DESARROLLO Y ESTANDARIZACION DEL ENSAYO Una vez establecida la viabilidad del método, el paso siguiente es proceder al desarrollo del ensayo y la estandarización de los reactivos y los protocolos seleccionados.

1.

Selección de las concentraciones óptimas de reactivo y parámetros de protocolo

Las concentraciones o diluciones óptimas del antígeno fijado a la placa, del suero, del conjugado enzima/anticuerpo y de la solución de sustrato se determinan mediante valoraciones de tipo "tablero de ajedrez" enfrentando cada uno de los reactivos contra todos los demás, confirmándose después la elección mas apropiada de los recipientes de reacción (generalmente por evaluación de dos o tres tipos de microplacas, con características de fijación diferentes, para minimizar la actividad de fondo y conseguir la máxima diferencia en actividad entre muestras negativas y positivas altas). Experimentos adicionales determinan las variables temporales, químicas y físicas óptimas del protocolo, incluyendo las temperaturas y duración de la incubación; el tipo, pH, y la molaridad del disolvente y de los tampones de lavado y bloqueantes; así como el equipamiento usado en cada fase del ensayo (como por ejemplo las pipetas y los sistemas de lavado que proporcionan una mejor reproducibilidad). La optimización de los reactivos y del protocolo conlleva una comprobación de la exactitud mediante la inclusión, en cada realización de la prueba, de uno o mas estándares de suero con un nivel conocido de actividad debida a la sustancia a analizar. Un ensayo optimizado que proporcione los mismos resultados de forma repetitiva para un estándar de suero y para los controles puede ser considerado como una prueba estandarizada.

2.

Reproducibilidad- estimaciones preliminares

Las evidencias preliminares de reproducibilidad (concordancia entre los duplicados dentro de un mismo ensayo y entre distintas realizaciones de la prueba) resultan necesarias para garantizar el posterior desarrollo del ensayo a validar. Esto se lleva a cabo evaluando los resultados de réplicas de todas las muestras en cada placa (variación intraplaca), y analizando la variación interplaca usando las mismas muestras en placas diferentes dentro de un mismo ensayo o entre diferentes realizaciones del mismo. En las técnicas ELISA, en esta fase de validación se usan normalmente los valores basales de absorbancia porque es dudoso que los resultados del suero de control altamente positivo, que podrían usarse para calcular valores normalizados, sean reproducibles en las realizaciones iniciales del ensayo. Además aún no se han determinado los correspondientes valores de los controles. Para obtener estimaciones preliminares de reproducibilidad suele ser suficiente realizar tres o cuatro réplicas de cada muestra y llevar a cabo el ensayo en al menos cinco placas en cinco ocasiones diferentes. En esta fase del desarrollo del ensayo, coeficientes de variación (desviación estandar de las réplicas/media de las mismas) inferiores al 20% en los valores de absorbancia indican una reproducibilidad adecuada. Sin embargo, si se pone de manifiesto una excesiva variación (mayor del 30%) en la mayor parte de las muestras en una misma o diferentes realizaciones de la prueba, deberían hacerse más estudios preliminares para determinar si es posible estabilizar el ensayo o si se debería abandonar el tipo de test. Esto resulta particularmente importante ya que un ensayo intrínsecamente variable tiene una alta probabilidad de no resistir las exigencias de las pruebas diarias con muestras procedentes de la población animal a estudiar.

3.

Determinación de la sensibilidad y la especificidad analítica

La sensibilidad analítica de un ensayo es la cantidad más pequeña de la sustancia en cuestión que puede detectar, y la especificidad analítica es el grado en que el ensayo no muestra reacción cruzada con otras sustancias. Estos parámetros son diferentes de la sensibilidad y especificidad diagnóstica que se definen mas adelante. La sensibilidad analítica puede ser determinada mediante diluciones a punto final, lo que revela la dilución del suero en la que el anticuerpo ya no puede detectarse. La especificidad analítica se determina usando un conjunto de sueros procedentes de animales que han experimentado infecciones relacionadas y que pueden estimular la formación de anticuerpos con reacción cruzada. Por ejemplo, si el ensayo no detecta anticuerpo a diluciones límite de suero con la misma eficacia que otros ensayos, o si se producen reacciones cruzadas con sueros procedentes de animales con otras infecciones relacionadas, se necesitará recalibrar o sustituir los reactivos o, alternativamente, debería abandonarse el ensayo. No obstante, una prueba con baja especificidad puede ser válida para uso como “prueba tamiz” en situaciones donde se requiere analizar un gran número de muestras, con tal de que su sensibilidad sea alta, y donde exista una “prueba confirmativa” que tenga elevada especificidad.

3ª FASE. DETERMINACIÓN DE LAS CARACTERÍSTICAS OPERATIVAS DEL ENSAYO Si los estudios iniciales de desarrollo y estandarización indican que el ensayo es factible y potencialmente aplicable a las condiciones de campo, el paso siguiente es establecer las características operativas del ensayo.

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Capítulo I.1.3. — Principios de validación para las pruebas diagnósticas de enfermedades infecciosas

1.

Sensibilidad y especificidad diagnóstica

a)

Principios y definiciones Los valores de sensibilidad y especificidad diagnóstica constituyen los parámetros más importantes que se establecen durante la validación de un ensayo. Constituyen la base para el cálculo de otros parámetros a partir de los cuales se realizan deducciones sobre los resultados. Por consiguiente, es muy importante que las estimaciones sobre la sensibilidad y la especificidad diagnóstica sean tan exactas como sea posible. En teoría, estos valores derivan del ensayo de una serie de muestras procedentes de animales de referencia cuya historia es conocida, así como su estado de infección/enfermedad, y que son además animales representativos de la región o país donde se pretende usar la prueba. La sensibilidad diagnóstica es la proporción de los animales de referencia infectados que dan respuesta positiva en el ensayo; los animales infectados que dan respuesta negativa se consideran como resultados falsos negativos. La especificidad diagnóstica es la proporción de animales de referencia no infectados que dan respuesta negativa a la prueba; aquellos animales no infectados que dan resultados positivos se consideran como falsos positivos. Para establecer la sensibilidad y la especificidad diagnóstica, tanto el número como el origen de los animales de referencia son aspectos clave cuando se intenta una validación adecuada del ensayo para su uso con la población de animales a la que va dirigida. Resulta posible calcular el número de muestras de referencia derivadas de animales cuyo estado es conocido en cuanto a infección, que es necesario para determinar la sensibilidad y la especificidad diagnóstica dentro de ciertos límites estadísticos definidos. Las fórmulas y cuadros para determinar el número de muestras requeridas se presentan en otra parte (5,8). Sin embargo, el número de muestras de referencia obtenidas de estas fórmulas y cuadros puede resultar inadecuado para un ensayo bien validado debido al gran número de variables que deben tenerse en cuenta a nivel poblacional al establecer los sueros de referencia. Tales limitaciones y una exposición de los criterios de selección para sueros estándar se desarrollan con detalle en otra parte (4, 6). Debido a las muchas variables a tener en cuenta, es conveniente incluir al menos 300 muestras de referencia de animales infectados y unas 1000 de animales no infectados para obtener estimaciones iniciales sobre la sensibilidad y la especificidad, respectivamente. La obtención de un número tan grande de muestras de animales de referencia puede ser difícil o incluso imposible. A veces, iniciar el proceso con menos animales, y continuar luego la estimación de la sensibilidad y la especificidad a medida que es posible disponer de mas animales de referencia, es el único modo, en la práctica, de obtener las estimaciones iniciales (ver más adelante, Fase 5).

b)

Estándares de comparación para el nuevo ensayo En serología, el “estándar de comparación” es el resultado de un método o combinación de métodos con el que se compara el nuevo ensayo. Aunque se usa normalmente el término “estándar de oro” para describir cualquier standard de comparación, debería limitarse el término a métodos que clasifiquen los animales como infectados o no infectados de modo inequívoco. Algunos métodos de aislamiento tienen problemas propios de reproducibilidad y sensibilidad. Los métodos con estándar de oro incluyen el aislamiento del agente causal o criterios histopatológicos patognomónicos. Como establecer un estándar de oro es imposible, a menudo son necesarios estándares relativos de comparación; éstos se basan en resultados de otros ensayos serológicos y en animales vacunados o infectados experimentalmente. Los cálculos de sensibilidad y especificidad diagnóstica son más fiables cuando descansan en un estándar de oro para comparación. Cuando solo se dispone de estándares relativos de comparación, las estimaciones de estos parámetros en el nuevo ensayo pueden verse afectadas debido al error previo de estos valores en el estándar relativo, que se acumula en el nuevo ensayo. Si no se dispone de un estándar para la comparación, se pueden establecer la sensibilidad y la especificidad diagnóstica (3, 7).

c)

Precisión, repetición, reproducibilidad, y exactitud En un ensayo, la repetición y reproducibilidad son indicaciones de precisión. La precisión es una medida de la dispersión de los resultados en una muestra repetidamente ensayada; un ensayo preciso muestra solo una pequeña dispersión. La repetición en un ensayo diagnóstico consta de dos elementos: el nivel de concordancia entre las réplicas de cada muestra (normalmente dos o tres) dentro del desarrollo de un ensayo, y el nivel de concordancia para los valores normalizados de cada muestra control entre diferentes series de ensayos. La reproducibilidad es el grado de coincidencia de resultados para las mismas muestras ensayadas en laboratorios diferentes. La exactitud es el nivel de concordancia entre el valor del ensayo y el valor esperado para la sustancia en cuestión en una muestra estándar de actividad conocida (título o concentración). Un sistema de ensayo puede ser preciso, pero no exacto, si los resultados de la prueba no concuerdan con los valores esperados para un estándar.

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Capítulo I.1.3. — Principios de validación para las pruebas diagnósticas de enfermedades infecciosas

Se pueden obtener estimaciones fiables de repetitividad y exactitud, tanto dentro de una misma ejecución del ensayo como entre distintas realizaciones del mismo, mediante el uso de los resultados normalizados obtenidos de las muchas pruebas del nuevo ensayo que se requirió hacer para evaluar los sueros de los animales de referencia (se obtienen resultados menos fiables a partir de datos preliminares sobre valores directos de absorbancia). Al menos 10 ejecuciones del ensayo, y con preferencia 20, permitirán una estimación inicial razonable de estos parámetros. Los métodos para evaluar estos parámetros se han descrito con detalle (8). La exactitud se puede determinar incluyendo uno o más estándares (muestras de título o concentración conocida, etc.) en cada ejecución del ensayo. Los estándares pueden ser sueros control siempre que la cantidad de la sustancia a analizar (es decir, su titulo o concentración) se haya determinado previamente en cada uno de ellos mediante comparación con estándares primarios o secundarios de referencia (13) y que los sueros control no se usen en el proceso de normalización de datos. La reproducibilidad de los ensayos se determina en laboratorios distintos utilizando un ensayo idéntico (en cuanto a protocolo, reactivos y controles) sobre un grupo de al menos 10 muestras, preferiblemente por duplicado hasta un total de 20 muestras. Es preciso que estas muestras representen el intervalo completo de las concentraciones esperadas de la sustancia analizada en las muestras de la población. El grado en que se desvían los resultados colectivos de cada muestra respecto a los valores esperados es una medida de la reproducibilidad del ensayo. El grado de concordancia entre los datos de los laboratorios constituye una base adicional sobre la que establecer si las características de realización del ensayo son las adecuadas para que un ensayo pueda considerarse validado.

2.

Selección del nivel de corte (umbral de positividad y negatividad)

Para llevar a cabo valoraciones de sensibilidad y especificidad diagnóstica, los resultados de las pruebas tienen primero que reducirse a la categoría de positivo o negativo. Esto implica considerar un punto de corte (umbral o límite de decisión) en la escala continua de resultados de la prueba. Aunque se han descrito muchos métodos a este respecto, los tres ejemplos que siguen a continuación ilustrarán los diferentes enfoques, junto a sus ventajas y limitaciones. El primer método establece un corte basado en la distribución de frecuencias de los resultados con animales de referencia infectados y no infectados (8). Este corte se puede establecer por inspección visual de la distribución de frecuencias, por análisis de las características de tipo receptor-operador (6, 14), o por una selección que favorezca la sensibilidad o la especificidad, dependiendo del uso que se pretenda con el ensayo determinado (11). Un segundo enfoque consiste en establecer el corte basados solo en animales de referencia no infectados; esto permite una estimación de la especificidad diagnóstica pero no de la sensibilidad diagnóstica. El tercer método proporciona un “corte intrínseco” basado en resultados de sueros tomados al azar dentro de la población estudiada sin conocerse de antemano el estado de infección de los animales (4). Aunque por este método no se obtienen estimaciones de la sensibilidad y especificidad, éstas se pueden determinar a partir de datos confirmativos acumulados. Si existe una superposición considerable en las distribuciones de los valores de las pruebas con animales infectados y no infectados, resulta difícil seleccionar un punto de corte que permita clasificar adecuadamente estos animales con relación a su estado infectivo. Entonces, en lugar de un único corte, se pueden seleccionar dos cortes que definan una sensibilidad diagnóstica elevada (por ejemplo, con inclusión del 99% de los valores de animales infectados) y una especificidad elevada (con 99% de los valores de los animales no infectados). Los valores que se encuentren entre estos percentiles deberían clasificarse como sospechosos o equívocos y podrían requerir otra prueba de ensayo confirmativo o para detectar la existencia de seroconversión.

3.

Cálculo de la sensibilidad y la especificidad diagnóstica

La selección de cortes o umbrales permite clasificar los resultados de una prueba como positivos o negativos. La determinación de la sensibilidad y la especificidad se facilita asociando los datos positivos y negativos con el estado conocido de la infección de cada animal mediante un cuadro de dos por dos (Cuadro 1). Una vez establecido el corte, los resultados de las pruebas de los sueros estándares se pueden clasificar como verdaderos positivos (VP) o verdaderos negativos (VN) si están de acuerdo con los estándares de oro (u otros estándares de comparación). Alternativamente, se pueden clasificar como falsos positivos (FP) o falsos negativos (FN) si no concuerdan con el estándar. La sensibilidad diagnóstica se calcula como VP/(VP+FN), mientras que la especificidad diagnóstica se expresa como VN/(VN+FP); los resultados de ambas determinaciones se suelen indicar como porcentajes (Cuadro 1).

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Capítulo I.1.3. — Principios de validación para las pruebas diagnósticas de enfermedades infecciosas

Cuadro 1. Cálculo de la sensibilidad diagnóstica y de la especificidad diagnóstica con ayuda de cuadro de 2 x 2 que asocia el estado de infección con resultados de la prueba en 2000 animales de referencia.

Animales de referencia con estado infectivo conocido Infectados (n = 600) Positiva

No infectados (n = 1400)

570

46

Resultado

TP

FP

de la prueba

FN

TN

Negativa

30

1354

Sensibilidad diagnóstica TP TP + FN

4.

=

570

= 95.0%

600

Especificidad diagnóstica TN TN + FP

=

1354

= 96.7%

1400

Armonización de los ensayos

Cuando para la determinación de un componente existe ya un método estándar internacional (12), es posible comparar dicho método con el que se está desarrollando. Este proceso requiere el uso de los mismos controles de suero y de estándares en ambos ensayos. Si se dispone de sueros internacionalmente estandarizados se deberían incluir al menos tres de ellos (uno negativo, otro con baja positividad, y otro con alta positividad) en el estudio comparativo de los ensayos. Esto podría conducir a un nuevo ensayo considerado como un método estándar internacional y a sueros de estándar internacional (12). La armonización de los dos ensayos sería entonces posible.

4ª FASE. COMPROBACIÓN DE LA VALIDEZ DE LA REALIZACIÓN DEL ENSAYO 1.

Interpretación de los resultados — factores que influyen en la validez del ensayo

Los resultados de una prueba sólo son útiles si las deducciones que permiten alcanzar son correctas. Un error muy común consiste en suponer que un ensayo con un 99% de sensibilidad y un 99% de especificidad originará aproximadamente un solo falso positivo y un falso negativo en los resultados de cada 100 ensayos con animales de una determinada población. Tal ensayo puede ser preciso y exacto pero puede, sin embargo, producir resultados que no permitan predecir adecuadamente el estado de infección. Por ejemplo, si la prevalencia de una enfermedad en una población analizada por el ensayo es solo de 1 entre 1.000 animales, y la tasa de falsos positivos en la prueba es de 1 por cada 100 animales (especificidad diagnóstica 99%), entonces en cada 1.000 pruebas sobre esa población habrá 10 falsos positivos y solo uno será verdadero positivo. Por tanto, tan solo aproximadamente el 9% de los resultados positivos de la prueba permitirá predecir de manera exacta el estado del animal en cuanto a infección; los resultados de la prueba clasificarán erróneamente al animal el 91% de las veces. Esta situación ejemplifica que la capacidad de los resultados de una prueba positiva o negativa para definir el estado de infección depende de la prevalencia de la infección en la población estudiada (9). Por supuesto, la prevalencia probablemente se habrá determinado a su vez mediante el uso de una prueba serológica con el error de clasificación de resultados que la misma conlleva. La determinación de la prevalencia en la población resulta necesaria para calcular los valores predictivos positivos (VPr+) o negativos (VPr-) del ensayo. Cuando los valores de la prueba se indican sin disponer de datos acerca de la especificidad o la sensibilidad, no es posible inferir predicciones sobre el estado infectivo a partir de los resultados (6). Por consiguiente, es muy conveniente disponer de una especie de interpretación adicional, acompañando los resultados con un pequeño cuadro que indique VPr+ y VPr- en un intervalo de prevalencias posibles en la población. Sin dicha información, los resultados de los ensayos de la prueba pueden carecer de lo requerido para clasificar con exactitud el estado de infección de los animales y, por tanto, no reflejarán un ensayo completamente validado.

FASE 5ª. MANTENIMIENTO Y MEJORA DE LOS CRITERIOS DE VALIDACIÓN Un ensayo validado necesita un constante seguimiento y un mantenimiento para conservar tal designación. Una vez que el ensayo se ha puesto ya en uso rutinario, hay que realizar un control interno de calidad comprobando repetidamente el ensayo en cuanto a repetitividad y exactitud (1).

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Capítulo I.1.3. — Principios de validación para las pruebas diagnósticas de enfermedades infecciosas

La reproducibilidad entre laboratorios debería comprobarse al menos dos veces por año. Es deseable formar parte de un consorcio de laboratorios interesados en evaluar los resultados. En un futuro próximo, una buena práctica de laboratorio que incluya la aplicación de un programa para asegurar la calidad total será un requisito esencial para aquellos que intenten un reconocimiento nacional o internacional (véase Capítulo I.1.2). El examen de aptitud es una forma de control externo de calidad para una determinada prueba. Normalmente, esto se lleva a cabo por un laboratorio de referencia que distribuye lotes de muestras, recibe resultados de los laboratorios, analiza los datos, y devuelve los informes a los laboratorios implicados. Si los resultados de un determinado laboratorio están dentro de límites aceptables y muestran evidencias de exactitud y reproducibilidad, el laboratorio puede disponer de un certificado emitido por agencias gubernamentales o laboratorios de referencia que lo acreditan como laboratorio oficial para dicha prueba (10). Las muestras de suero para el examen de aptitud deberían contener una representación completa de la concentración de la sustancia a analizar en los animales de una población bajo estudio. Si las muestras representaran solo sueros altamente positivos o débilmente positivos (con ninguna muestra próxima al nivel de corte del ensayo), el ejercicio solo pondría en evidencia la reproducibilidad en los extremos de concentración de la sustancia analizada, pero no aclararía si los resultados de pruebas rutinarias en la población clasifican de modo conveniente el estado de infección de los animales. Debido al extraordinario número de variables que inciden en la realización de las pruebas serodiagnósticas, es conveniente ampliar el número de sueros estándar correspondientes a animales con reconocida infección debido a que el error en las estimaciones de sensibilidad y especificidad se reduce cuando aumenta el tamaño de las muestras. Además, cuando se pretende transferir el ensayo a una región geográfica completamente distinta, es esencial efectuar una nueva validación del ensayo para el nuevo uso, ajustándolo a sueros de poblaciones de animales que residan en las condiciones locales. Lo mismo cabe decir a la hora de establecer la sensibilidad y especificidad diagnósticas para subpoblaciones (ej., grupos de edad, vacunado/no vacunado, etc.). Cuando una muestra de suero control está a punto de agotarse, resulta necesario preparar y probar repetidamente otro suero de repuesto antes de que se acabe. La nueva muestra de control se incluye en 10-20 realizaciones del ensayo antes del agotamiento del control original para establecer su relación proporcional con el que se está acabando. Si la muestra en vías de desaparición era un control positivo en técnicas ELISA, donde el valor normalizado se expresa como porcentaje del control positivo, la diferencia proporcional de actividad en el ensayo ELISA entre el suero original y el de recambio debe ser convertido en un factor de normalización para mantener el mismo nivel de corte, y por tanto la misma sensibilidad y especificidad diagnóstica en el ensayo. Cuando hay que reemplazar otros reactivos, como el antígeno para captura de los anticuerpos, esto debería llevarse a cabo siguiendo los mismos criterios que con los reactivos originales y deberían probarse en al menos cinco desarrollos del ensayo utilizando una serie de muestras de suero diseñadas para tal propósito. Siempre que sea posible, es importante cambiar cada vez solamente un reactivo para evitar el problema de tener que evaluar simultáneamente mas de una variable.

REFERENCIAS 1.

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2.

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4.

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7. 8.

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Capítulo I.1.3. — Principios de validación para las pruebas diagnósticas de enfermedades infecciosas

9.

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10. OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES (2002). OIE Guide 3: Laboratory Proficiency Testing. In: OIE Quality Standard and Guidelines for Veterinary Laboratories: Infectious Diseases. OIE, Paris, France, 53–63. 11. SMITH R.D. (1991). Clinical Veterinary Epidemiology. Butterworth-Heinemann, Stoneham, MA, USA, 1–223. 12. W RIGHT P.F. (1998). International standards for test methods and reference sera for diagnostic tests for antibody detection. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 17, 527–533. 13. W RIGHT P.F., NILSSON E., VAN ROOIJ E.M.A., LELENTA M. & JEGGO M.H. (1993). Standardization and validation of enzyme-linked immunosorbent assay techniques for the detection of antibody in infectious disease diagnosis. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 12, 435–450. 14. ZWEIG M.H. & CAMPBELL G. (1993). Receiver-operating characteristic (ROC) plots: a fundamental evaluation tool in clinical medicine. Clin. Chem., 39, 561–577.

* * *

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CAPÍTULO I.1.4.

VALIDACIÓN Y CONTROL DE CALIDAD DE LOS MÉTODOS DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA UTILIZADOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS

INTRODUCCIÓN El diagnóstico de enfermedades infecciosas se realiza mediante la detección directa e indirecta de los agentes infecciosos. Mediante los métodos directos se detectan las partículas de los agentes infecciosos y/o sus componentes, tales como los ácidos nucleicos, proteínas estructurales y no estructurales, enzimas, etc. Los métodos indirectos ponen de manifiesto los anticuerpos inducidos por las infecciones. Los métodos más comunes de detección directa son: el aislamiento o el cultivo in vitro, la microscopía electrónica, la inmunofluorescencia, la inmunohistoquímica, el enzimoinmunoensayo (ELISA), la hibridación de ácidos nucleicos (NAH) y la amplificación de ácidos nucleicos, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). También se denominan métodos de diagnóstico molecular, puesto que los ensayos de NAH y PCR tienen como objetivo las moléculas de ácidos nucleicos. Los métodos indirectos más comunes de detección del agente infeccioso son las pruebas serológicas tales como: la neutralización vírica, la detección de anticuerpos mediante ELISA y las pruebas de inhibición de la hemoaglutinación. En general, los laboratorios de diagnóstico aplican simultáneamente los dos métodos para garantizar un diagnóstico seguro. Hasta la fecha, los principios de validación de la OIE se han desarrollado para los métodos de detección indirecta, esto es, para la prueba ELISA de anticuerpos. El objetivo de este capítulo es ampliar las normas a un método directo de detección de un agente infeccioso, es decir, adaptar los principios de validación a los ensayos de PCR. Las experiencias de la última década indican que las técnicas de PCR finalmente sustituirán a muchos de los métodos directos clásicos de detección de agentes infecciosos. Está claro que la PCR está reemplazando el aislamiento de virus o cultivo de bacterias para la detección de agentes que son difíciles o imposibles de cultivar. Hay varias razones para esta tendencia, teniendo en cuenta que el aislamiento de los virus requiere: i) la presencia de los virus que se replican; ii) los cultivos celulares caros y el mantenimiento de las instalaciones; iii) hasta varias semanas para completar el diagnóstico; y iv) una pericia especial, que se está perdiendo o disminuyendo hoy en muchos laboratorios. Aunque los ensayos de PCR inicialmente eran caros y engorrosos, hoy en día, son herramientas relativamente baratas, seguras y fáciles de utilizar en los laboratorios de diagnóstico (2, 7). Generalmente, la sensibilidad y especificidad de la PCR es mayor que los procedimientos ELISA de aislamiento y captura.

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Capítulo I.1.4. — Validación y control de calidad de los métodos de la reacción en cadena de la polimerasa utilizados en el diagnóstico de enfermedades infecciosas

A. MÉTODOS DE PCR UTILIZADOS EN DIAGNÓSTICOS MOLECULARES RUTINARIOS 1.

Principios de la técnica de PCR

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) implica que en el ensayo hay una reacción de amplificación basada en enzimas. El término “reacción en cadena” se refiere a varios ciclos de copiado de un tramo específico de ADN o de ácidos nucleicos diana (nucleótidos), en este caso a partir del genoma del agente infeccioso. La región que hay que amplificar está definida por dos (o más) secuencias de nucleótidos cortos denominados sitios de los cebadores, que flanquean a la secuencia diana. Los cebadores, oligonucleótidos cortos que son complementarios a los sitios de los cebadores, se unen a las hebras de ADN para ser copiadas. Utilizando una polimerasa que no se desnaturalice durante el ciclo de calentamiento, es posible copiar la secuencia diana uniendo los nucleótidos libres a los cebadores. Repitiendo el régimen de ciclos de calentamiento de 20 a 40 veces, la cantidad de ADN diana copiado que se obtiene es suficiente para operaciones posteriores, tales como detección, clonación y secuenciación. La sensibilidad de diagnóstico de la PCR es muy alta, porque se producen varios millones de copias de la diana seleccionada. La especificidad de la reacción puede ser también muy alta, ya que está determinada por las secuencias específicas de nucleótidos de la diana seleccionada, así como por el diseño del cebador. Los cebadores pueden diseñarse para detectar secuencias específicas de nucleótidos en los genomas de los agentes infecciosos diana seleccionados o pueden diseñarse para ser complementarios de las secuencias muy comunes que se dan en la naturaleza. Estos cebadores no específicos, llamados cebadores universales, son capaces de aglutinar una gama más amplia de ADN y pueden utilizarse para detectar miembros dentro de una familia o género del agente infeccioso.

a)

Amplificación del ADN Si el genoma del agente infeccioso es de ADN, la amplificación se realiza directamente, con o sin purificación previa del ADN diana. En muchos casos el empleo de ADN extraído y purificado del material que se va a utilizar en la prueba, dará como resultado un aumento en la sensibilidad analítica y diagnóstica.

b)

Amplificación del ARN (PCR de trascripción inversa) Los genomas de muchos agentes infecciosos contienen ácido ribonucleico (RNA) que no se puede amplificar directamente mediante la PCR. Para la amplificación por PCR se necesita un ADN diana monocatenario, y éste no está disponible en los virus de ARN. El problema puede resolverse por la adición de una etapa antes de comenzar la PCR. Utilizando la trascriptasa inversa, el ARN se puede transcribir a ADN complementario (ADNc), que es ADN de doble cadena y, por tanto, se puede usar en el ensayo de PCR (el procedimiento se denomina PCR de trascripción inversa: RT-PCR). Tradicionalmente, la reacción de trascripción inversa se realiza en un tubo aparte y el ADNc producido se transfiere después a un tubo nuevo para la reacción de la PCR. Sin embargo, ya se dispone de polimerasas de ADN termoestables con actividad trascriptasa inversa y tampones específicos en los cuales las polimerasas RT y ADN están activas. Ambas permiten una reacción RT-PCR que tiene lugar en el mismo tubo en secuencia directa sin manipulación adicional y con menos probabilidad de seguir contaminando. En la mayoría de los casos será necesario extraer y purificar el ARN antes de la trascripción inversa. Sin embargo, en algunos casos, es suficiente con hervir la muestra antes de la RT-PCR (p. ej. muestras de materias fecales en PBS).

c)

Detección del amplímero por PCR El producto PCR o amplímero puede detectarse utilizando varios procedimientos. El más común incluye la detección no específica del producto de la PCR, basada en una medida amplímera utilizando electroforesis en gel de agarosa y tiñendo el ADN con un tinte no específico, como el bromuro de etilo, o el reconocimiento específico de la secuencia diana amplificada utilizando una transferencia de ADN por Southern blot seguido de hibridación con sondas de oligonucleótidos complementarias de la secuencia diana. Las sondas de hibridación pueden ser, enzima, marcado como quimiluminiscente o radionucleótido para permitir la detección de la secuencia diana específica. Más abajo se dan algunos ejemplos de métodos de PCR utilizados actualmente.

2.

PCR convencional

En la “PCR convencional” (o simplemente PCR) se utiliza un par de cebadores oligonucleótidos para amplificar una parte pequeña del genoma del agente infeccioso. La sensibilidad analítica es relativamente alta con un número mínimo de 100 a 1000 copias de ADN diana detectable. La especificidad analítica también es bastante alta. La sensibilidad y especificidad analíticas se pueden mejorar mediante la aplicación de la PCR anidada (véase más adelante el punto 3). La especificidad se puede mejorar posteriormente utilizando el método

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Capítulo I.1.4. — Validación y control de calidad de los métodos de la reacción en cadena de la polimerasa utilizados en el diagnóstico de enfermedades infecciosas Southern blot de transferencia a papel y comprobando los productos de la PCR con una sonda marcada, pero esto lleva mucho tiempo y no es una práctica común hoy día en los laboratorios de diagnóstico.

3.

PCR anidada

En los ensayos de la PCR anidada se utilizan dos ciclos de amplificación con cuatro cebadores, denominados cebadores externos e internos. En general, los ensayos de la PCR anidada proporcionan una sensibilidad y especificidad analíticas superiores si se comparan con las pruebas de PCR convencionales. La sensibilidad analítica es típicamente 36 se considera una reacción positiva. Valores de 24 en el título deben confirmarse volviendo a probar el antígeno amplificado por pases en cultivo de tejidos.

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Capítulo 2.1.1. — Fiebre aftosa

c)

Métodos de reconocimiento del ácido nucleico Se puede utilizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar los fragmentos del genoma del virus de la FA en materiales para diagnóstico (2, 8). Se han diseñado cebadores específicos para distinguir cada uno de los siete serotipos. Para investigar la presencia del ARN del virus de la FA en muestras de tejidos se han desarrollado técnicas de hibridación in situ (44). Estas técnicas solo se utilizan en laboratorios especializados. La epidemiología molecular de la FA se basa en la comparación de las diferencias genéticas entre los virus aislados. Se han publicado dendogramas que muestran la relación genética entre las cepas vacunales y naturales de los siete serotipos respecto a secuencias derivadas del gen 1D. La amplificación del ARN del virus de la FA por PCR con transcripción inversa (RT-PCR) es la opción preferida actualmente para generar los datos de secuencias que permiten realizar estas comparaciones. El Laboratorio Mundial de Referencia (WRL) y otros laboratorios han desarrollado técnicas para realizar estos estudios, y actualmente se mantiene una base de datos con más de 3000 secuencias. El método recomendado es el siguiente: i)

Extraer el ARN del virus directamente de suspensiones epiteliales, o de pases bajos en cultivo celular.

ii)

Realizar una RT-PCR del gen VP1 completo (o, si sólo una parte del gen VP1, el extremo 3´del gen es más útil)

iii)

Determinar la secuencia nucleotídica del producto de la PCR (o, por lo menos, 170 nucleótidos [preferiblemente 420 para los tipos SAT] en el extremo 3´del gen).

Se puede disponer de un protocolo completo con secuencias cebadoras, previa solicitud del WRL, o se puede bajar de la siguiente dirección en la World Wide Web: http://www.iah.bbsrc.ac.uk/virus/picornaviridae/aphtovitus/fmd.htm

2.

Pruebas serológicas La infección por el virus de la FA se puede diagnosticar por la detección de una respuesta de anticuerpos específicos. Las pruebas generalmente utilizadas son la neutralización del virus (NV) y el ELISA (24, 25, 41). Éstas son también las pruebas ordenadas para el comercio de ganado. La prueba NV es específica de serotipo, requiere disponer de servicios de cultivos celulares y tarda 2-3 días en proporcionar resultados. La prueba ELISA es un ensayo de tipo bloqueante o competitivo que utiliza anticuerpos poli o monoclonales específicos de serotipo. Por consiguiente, es específica de serotipo, sensible y cuantitativa, y tiene la ventaja de que es más rápida de realizar, es menos variable y no depende del uso de sistemas de cultivos celulares. Por cualquiera de las dos pruebas se puede esperar una proporción baja de sueros de título bajo con reacciones positivas falsas. Una combinación de análisis por ELISA y la confirmación de los positivos por la prueba de NV reduce los resultados falsos positivos. La OIE ha coordinado la producción de sueros de referencia para estandarizar las pruebas serológicas de la FA; están disponibles en el WRL. La detección de anticuerpos contra las proteínas no estructurales (NSPs) del virus de la FA se ha utilizado para identificar infecciones pasadas o actuales con algunos de los siete serotipos del virus, independientemente de que el animal haya sido también vacunado. Esto se ha realizado de modo convencional, midiendo el anticuerpo contra el antígeno vírico asociado a la infección (VIAA; la proteína de la ARN polimerasa vírica 3D) por medio de inmunodifusión en gel de agar (IGDA) (31). Aunque es relativamente insensible, la prueba es barata, fácil de llevar a cabo y utilizada ampliamente en Sudamérica para detectar la actividad vírica en una población durante las campañas de erradicación de la FA. La prueba VIAA está actualmente superada por pruebas que miden anticuerpos frente a NSPs del virus de la FA producidas por técnicas recombinantes en una variedad de sistemas de expresión in vitro. En general, se considera que los indicadores más fiables de infección son los anticuerpos contra las poliproteínas 3AB o 3ABC (11, 30, 39). En animales seropositivos para anticuerpos contra 3AB o 3ABC, los anticuerpos contra una o más de las otras NSPs, incluyendo la proteína L, 2C, 3A, 3B o 3D, sirven de confirmación adicional de la infección (9, 30, 39). La prueba se puede utilizar para detectar la infección por el virus de la FA en poblaciones vacunadas y no vacunadas. Sin embargo, la pureza de la vacuna es una consideración importante ya que la presencia de trazas de NSPs en algunas preparaciones de vacunas puede originar reacciones positivas falsas en animales que han sido vacunados repetidamente. A la inversa, hay evidencia experimental de que unos pocos animales, vacunados y después probados en desafío con virus vivos y con infección persistente, pueden pasar sin ser detectados en algunas pruebas anti-NSP, originando resultados negativos falsos (28). Por tanto, las pruebas NSP pueden utilizarse a nivel poblacional, pero no a nivel de animal individual, para detectar la circulación del virus de la FA en poblaciones vacunadas.

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Capítulo 2.1.1. — Fiebre aftosa

a)

Neutralización de virus (una prueba prescrita para el comercio internacional) La microprueba cuantitativa NV para anticuerpo contra la FA se realiza con células IB-RS-2, BHK-21 o con células de riñón de cordero o cerdo, en placas de microtitulación para cultivo de tejidos con pocillos de fondo plano. Los virus se cultivan en monocapas celulares y se guardan a -20ºC después de añadir glicerol al 50%. (El virus es estable en estas condiciones por lo menos durante 1 año). Antes de la prueba, los sueros de ensayo se inactivan a 56ºC durante 30 minutos. El suero control estándar es suero de convaleciente de 21 días (normalmente de cerdo). Un medio adecuado es el medio completo de Earle/LYH (solución salina equilibrada de Hank con hidrolizado de levadura y lactoalbúmina) más antibióticos. La prueba utiliza volúmenes idénticos de 50 µl. •

Procedimiento de la prueba:

i)

Comenzando con la dilución 1/4, se diluyen los sueros en soluciones dobles seriadas por la placa, utilizando al menos dos filas de pocillos por suero, preferiblemente cuatro filas, y un volumen de 50 µl.

ii)

Se añade virus previamente titulado; cada 50 µl de suspensión vírica debe contener aproximadamente 100 DICT50 (dosis infectiva 50% cultivo de tejidos) dentro de un margen aceptable (por ejemplo, 35350 DICT50).

iii)

Los controles incluyen un antisuero estándar de título conocido, un suero negativo, un control de células, un control de medio y una titulación vírica empleada para calcular el título real del virus utilizado en la prueba.

iv)

Incubar a 37ºC durante 1 hora con las placas cubiertas.

v)

Se prepara una suspensión celular de 106 células/ml en medio que contenga 10% de suero bovino (negativo para el anticuerpo específico) para el crecimiento celular. A cada pocillo se añaden 50 µl de la suspensión celular.

vi)

Las placas se cierran a presión con las tapas y se incuban a 37ºC durante 2-3 días. Alternativamente, se cubren con las tapas flojas y se incuban a 37ºC durante 2-3 días en una atmósfera de 3-5% de dióxido de carbono.

vii)

Después de 48 horas se pueden realizar lecturas microscópicas. Finalmente las placas se fijan y se tiñen, por lo general, al tercer día. La fijación se hace con 10% formol en solución salina durante 30 minutos. Para la tinción las placas se sumergen en 0,05% de azul de metileno con 10% de formalina durante 30 minutos. Una alternativa de fijación y tinción consiste en utilizar una solución de azul negro de naftaleno (0,4% [p/v] de azul negro de naftaleno, 8% [p/v] de ácido cítrico en solución salina) (23). Las placas se lavan con agua del grifo.

viii) Los pocillos positivos (allí donde el virus se ha neutralizado y las células permanecen intactas) contienen capas celulares teñidas de azul; los pocillos negativos (donde el virus no ha sido neutralizado) están vacías. Los títulos se expresan como la dilución final del suero presente en la mezcla suero/virus al punto final del 50%, como en el método de Kärber. La prueba se considera válida cuando la cantidad de virus utilizada por pocillo está comprendida en el intervalo log10 1.5-2.5 DICT50, y el suero positivo estándar está dentro de un margen equivalente a dos veces su título esperado. ix)

b)

La interpretación de las pruebas puede variar entre laboratorios respecto al punto final tomado. Los laboratorios deben establecer sus propios criterios con referencia a reactivos estándar que pueden obtenerse del WRL de la FAO para FA (ver nota a pie de página 1). En el WRL, un título de 1/45 o más de la dilución final del suero en la mezcla suero/virus se considera positivo. Títulos de 1/16 a 1/32 se consideran dudosos, y se necesitan más muestras de suero para prueba. El animal se considera positivo, si la segunda muestra presenta un título de 1/16 o superior. Un título de 1/8 o inferior se considera negativo.

Enzimoinmunoensayo competitivo en fase sólida (prueba prescrita para el comercio internacional) Como anticuerpo de captación, se utiliza antisuero de conejo contra el antígeno 146S de uno de los 4 siete tipos de virus de la FA a una concentración óptima predeterminada en tampón carbonato/bicarbonato, pH 9.6.

4

130

Se realiza una titulación del tipo en tablero de ajedrez del antisuero captador de conejo, del antisuero de cobaya y del antisuero anti-cobaya. Antes de utilizar el ELISA de captación de antígeno o el ELISA de bloqueo en fase líquida, se titula cada uno de estos reactivos, uno frente al otro, manteniendo el tercero a una concentración constante. De este modo, se pueden determinar las diluciones óptimas (para color positivo y para bajo color de fondo). Estas dilucione predeterminadas" se pueden utilizar después para todas las pruebas que en el futuro utilicen estos lotes particulares de reactivos.

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Capítulo 2.1.1. — Fiebre aftosa

Los antígenos se preparan inactivando virus procedentes de cultivos celulares con etilenimina, utilizando los procedimientos descritos para la producción de vacunas. La dilución final escogida es la que, después de añadir un volumen idéntico de diluyente, proporciona una absorbancia en la parte superior de la región lineal de la curva de titulación (densidad óptica aproximada de 1,5). Como diluyente se utiliza PBS que contiene 0,05% de Tween 20 y rojo de fenol como indicador (PBST). Como anticuerpos de detección, se utilizan antisueros de cobaya, preparados mediante inoculación de cobayas con el antígeno 146S de uno de los siete serotipos y prebloqueado con suero normal de bovino. Las concentraciones óptimas predeterminadas se preparan en PBS que contiene 0,05% de Tween 20 y 5% de leche desnatada en polvo (PBSTM). La inmunoglobulina anti-cobaya de conejo (o de oveja) se emplea a una concentración óptima predeterminada en PBSTM conjugada con peroxidasa de rábano y prebloqueada con NBS. Los sueros de ensayo se diluyen en PBST. Los estudios realizados en colaboración han indicado que el ELISA competitivo en fase sólida es más específico que el ELISA de bloqueo en fase líquida, pero de sensibilidad similar (29). •

Procedimiento de la prueba

i)

Las placas ELISA se recubren con 50 µl/pocillo de anticuerpo de conejo contra el antígeno vírico de la FA diluido en tampón carbonato/bicarbonato, pH 9.6, y se deja toda la noche a 4ºC en una cámara húmeda.

ii)

Las placas ELISA se lavan cinco veces con PBS.

iii)

A continuación se añaden, a cada pocillo de la placa de ELISA, 50 µl del antígeno del virus de la FA diluido en tampón de bloqueo. (Tampón de bloqueo: 0,05% [p/v] de Tween 20, 10% [v/v] de suero bovino normal, 5% [v/v] de suero de conejo normal). Las placas se tapan y se colocan en un agitador orbital a 37ºC durante 1 hora, con agitación continua.

iv)

Después de lavar cinco veces con PBS, se añaden a cada pocillo 40 µl de tampón de bloqueo y 10 µl de suero de ensayo (o de suero control), lo que proporciona una dilución inicial de suero de 1/5.

v)

Inmediatamente se añaden 50 µl de antisuero de cobaya contra el virus de la FA diluido en tampón de bloqueo, obteniendo una dilución final del suero de 1/10.

vi)

Las placas se tapan y se colocan en un agitador orbital a 37ºC durante 1 hora.

vii)

Después de lavar cinco veces con PBS, se añaden 50 µl de Ig anti-cobaya conjugada, diluida en tampón de bloqueo. Las placas se tapan y se colocan en un agitador orbital a 37ºC durante 1 hora.

viii) Después de lavar cinco veces con PBS, se añaden a cada pocillo 50 µl de solución de substrato que contiene 0,05% de H2O2 más ortofenilén diamina o un cromógeno alternativo adecuado.

c)

ix)

La reacción se para a los 10 minutos añadiendo 50 µl de ácido sulfúrico 2 M. Las placas se leen en un espectrofotómetro acoplado a un ordenador.

x)

Controles: Se utilizan dos pocillos por cada placa para los controles de conjugado (sin suero de cobaya), cuatro pocillos para sueros positivos fuertes y débiles, dos pocillos para sueros negativos y cuatro pocillos para competición nula (sin suero de ensayo).

xi)

Interpretación de los resultados: Para cada pocillo se calcula un porcentaje de inhibición, visualmente o mediante un programa adecuado de ordenador (100 – [densidad óptica de cada valor de ensayo o control/densidad óptica media del resultado de competición nula] x 100) que represente la competición entre el suero de ensayo y el antisuero de cobaya contra el virus de la FA en la placa de ELISA. Inhibiciones superiores al 60% son positivas (35).

Enzimoinmunoensayo de bloqueo en fase líquida Los antígenos se preparan a partir de cepas seleccionadas de virus de la FA cultivados en monocapas de células BHK-21. Se utilizan los sobrenadantes sin purificar y se pretitulan con diluciones seriadas dobles, pero sin suero. La dilución final elegida es la que, después de añadir el mismo volumen de diluyente (ver a continuación), proporciona una absorbancia en la parte superior de la región lineal de la curva de titulación (Densidad óptica aproximada de 1,5). Como diluyente se emplea PBS con 0,05% de Tween 20 y rojo de fenol como indicador (PBST). Los otros reactivos utilizados en la prueba son los mismos que para ELISA de bloqueo en fase sólida.

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Capítulo 2.1.1. — Fiebre aftosa

•

Procedimiento de la prueba

i)

Las placas ELISA se recubren con 50 µl/pocillo de antisuero de conejo contra el antígeno 146S que se va a ensayar y se dejan toda la noche en una cámara húmeda a temperatura ambiente.

ii)

Las placas ELISA se lavan cinco veces con PBS.

iii)

En placas multipocillo con fondo en U (placas portadoras) se preparan por duplicado 50 µl de diluciones seriadas dobles de cada suero de ensayo, comenzando con ¼. A cada pocillo, se añaden 50 µl de una dosis constante de antígeno vírico homólogo al antisuero de conejo utilizado para recubrir las placas, y las mezclas se dejan toda la noche a 4ºC, o se incuban a 37ºC durante 1 hora. La adición del antígeno aumenta la dilución inicial del suero a 1/8.

iv)

A continuación se transfieren 50 µl de las mezclas suero/antígeno de las placas portadoras a las placas ELISA recubiertas con suero de conejo y se incuban las placas a 37ºC durante 1 hora en un agitador orbital.

v)

Después de lavar, se añaden a cada pocillo 50 µl de antisuero de cobaya homólogo al antígeno utilizado en el paso previo (iv). A continuación, las placas se incuban a 37ºC durante 1 hora en un agitador orbital.

vi)

Se lavan las placas y se añaden a cada pocillo 50 µl de inmunoglobulina de conejo anti-cobaya, conjugada con peroxidasa de rábano. Se incuban las placas a 37ºC durante 1 hora en un agitador orbital.

vii)

Las placas se lavan de nuevo tres veces y se añaden a cada pocillo 50 µl de la solución de substrato que contiene 0,5% de H2O2 más ortofenilén diamina o un cromógeno alternativo adecuado.

viii) La reacción se para a los 15 minutos mediante la adición de 50 µl de ácido sulfúrico 1 M. Las placas se leen en un espectrofotómetro acoplado a un ordenador.

d)

ix)

Controles: En cada placa se incluye un mínimo de cuatro pocillos para cada uno de los sueros bovinos de referencia (muy positivo, débilmente positivo y negativo) a una dilución final de 1/32 junto con un número equivalente de pocillos para control de antígeno, que contengan sólo antígeno en diluyente sin suero. Para pruebas de titulación a punto final, en cada prueba se debe incluir por duplicado, por lo menos en una placa, una serie de diluciones dobles de sueros bovinos de referencia positivos y negativos.

x)

Interpretación de los resultados: Los títulos de anticuerpo se expresan como el 50% del título a punto final, es decir, la dilución a la que la reacción de los sueros ensayados origina una densidad óptica igual al 50% de inhibición de la densidad óptica media de la reacción en los pocillos control (antígeno) (Kärber). La mediana se calcula como la media de dos valores medios de la reacción en los pocillos control, eliminando del cálculo los valores más altos y los más bajos (alternativamente, se puede utilizar el valor medio después de ajustar unos límites adecuados de tolerancia al control para variaciones entre los pocillos). Los títulos superiores a 1/40 se consideran positivos. Los títulos próximos a 1/40 se deben volver a probar utilizando la prueba NV.

Pruebas de anticuerpo contra proteínas no estructurales Los anticuerpos contra las NSPs expresadas en virus recombinantes de la FA se pueden medir por ELISA o inmunotransferencia. En varios laboratorios se ha comprobado que varios métodos ELISA indirectos son sensibles, específicos y fiables. Estos enzimoinmunoensayos utilizan antígenos purificados que se adsorben directamente en microplacas o emplean anticuerpos policlonales o monoclonales para capturar antígenos específicos de preparaciones semi-purificadas (9, 11, 30). También se ha desarrollado un ELISA competitivo (39). Más adelante se describen con detalle ejemplos de una técnica de ELISA y de una inmunotransferencia. Como se ha indicado con anterioridad, la prueba IGDA para detectar anticuerpos contra la VIAA (proteína de la ARN polimerasa vírica 3D) se ha utilizado mucho en Sudamérica (31). Actualmente se ha substituido en gran medida por pruebas de tipo ELISA o de inmunotransferencia.

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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Capítulo 2.1.1. — Fiebre aftosa

• Enzimoinmunoensayo indirecto •

Preparación de antígenos recombinantes (ver Sección B.2.d. Prueba de enzimoinmunotransferencia, más adelante)

•

Procedimiento de la prueba

i)

Las microplacas se recubren durante toda la noche a 4ºC con 1 µg/ml del antígeno de fusión 3ABC en tampón carbonato/bicarbonato, pH 9.6 (100 µl por pocillo). El antígeno 3ABC se expresa y purifica como se indica para las pruebas EITB (33).

ii)

Se lavan las placas seis veces con PBS, pH 7,2, que contiene 0,05% de Tween 20 (PBST).

iii)

Se añaden los sueros de ensayo (100 µl por pocillo) a una dilución 1/20 en tampón de bloqueo que consiste en PBS, 0,05% de Tween 20, 5% de leche en polvo desnatada, 10% de suero de caballo y 0,1% de lisado de Escherichia coli. Cada placa incluye un juego de controles positivos, fuertes y débiles, y de controles negativos, calibrados frente a los Sueros Internacionales Estándar descritos más abajo.

iv)

Se incuban las placas durante 30 minutos a 37ºC y se lavan seis veces con PBST.

v)

Se añaden 100 µl por pocillo de IgG de conejo contra la especie, conjugada con peroxidasa de rábano y diluida de modo óptimo en tampón de bloqueo. Se incuban las placas durante 30 minutos a 37ºC.

vi)

Después de seis lavados, cada pocillo recibe 100 µl de 3´3´, 5´5´-tetrametilbenzidina más 0,004% (p/v) de H2O2 en tampón fosfato/citrato, pH 5.5.

vii)

La reacción se para a los 15 minutos de incubación a temperatura ambiente añadiendo 100 µl de ácido sulfúrico 0,5 M. La absorbancia se lee a 450 nm y a 620 nm para corrección de fondo.

viii) Interpretación de los resultados: Los resultados se expresan como porcentaje relativo de positividad respecto al control positivo fuerte [(densidad óptica del pocillo de ensayo o control/densidad óptica del control positivo fuerte) x 100]. Los valores de corte, con y sin zonas de sospecha, se determinan por los laboratorios individuales en función de la finalidad de la prueba y de la población objeto del análisis. •

Sueros Internacionales Estándares

Se están desarrollando en la actualidad sueros internacionales estándares sobre la base del método descrito arriba. Se trata de tres estándares: un positivo fuerte, un positivo débil y otro negativo, obtenidos de acuerdo con las Normas de la OIE (34). Estos sueros serán los materiales de referencia para calibrar otros métodos de prueba y otros reactivos y como prototipos para la producción de estándares nacionales y de trabajo. El estándar positivo fuerte representará el nivel superior de detección de anticuerpo. El estándar positivo débil representará el nivel inferior de detección o la sensibilidad analítica del método de la prueba. Es importante advertir que la dilución de estándar positivo débil debe elegirse de tal modo que sea inequívocamente positiva en todos los ensayos. El estándar negativo, utilizado para preparar diluciones de los estándares positivos, actuará como control de la línea basal o de fondo para los estándares positivos. •

Prueba de enzimoinmunotransferencia (EITB)

La prueba EITB se ha empleado mucho en Sudamérica para el control y determinación de riesgos asociados con el desplazamiento de animales. Actualmente, el procedimiento consiste en un análisis inicial utilizando un ELISA indirecto para anticuerpos contra 3ABC, seguido por una prueba confirmativa EITB, si las muestras dan resultados positivos o sospechosos. En particular, se recomienda esta combinación de pruebas cuando el control implica un gran número de muestras. Se dispone de más información en el Laboratorio de Referencia de la OIE de Brasil (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual). •

Preparación de las tiras de ensayo con los antígenos recombinantes

i)

Las cinco NSPs del virus de la FA sometidas a ingeniería genética, 3A, 3B, 2C, 3D, y 3ABC, se expresan en E. coli C600 por termo-inducción. El polipéptido 3D se expresa en su forma completa (33), mientras que el resto de las proteínas se obtiene como productos de fusión con la porción Nterminal del gen de la polimerasa del MS-2 (40).

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

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Capítulo 2.1.1. — Fiebre aftosa

ii)

La polimerasa expresada se purifica en fosfocelulosa, y después por columnas de Sefarosa poli-U. Las proteínas de fusión 3A, 3B, 2C y 3ABC se purifican por extracción secuencial de los extractos bacterianos con concentraciones crecientes de urea. La fracción 7M, que contiene las proteínas de fusión, se purifica por una SDS-PAGE preparativa al 10% (dodecil sulfato sódico-electroforesis en gel de poliacrilamida). La banda de proteínas de fusión se separa del gel y se electroeluye (33).

iii)

Mediante SDS-PAGE al 12.5%, se separa una mezcla que contenga 20 ng/ml de cada uno de los polipéptidos recombinantes purificados y se transfieren electroforéticamente a nitrocelulosa (33).

•

Procedimiento de la prueba

i)

Debe determinarse la cantidad necesaria de tiras de muestra considerando que, por cada lámina de nitrocelulosa que define un gel de transferencia, se debe probar un suero positivo, otro positivo débil, otro de corte, y un control de suero negativo. En general, de un gel deben derivar 24 tiras de nitrocelulosa, cada una de 3 mm de ancho.

ii)

A cada pocillo se añaden 0,8 ml de tampón de saturación (50 mM de Tris-HCl, pH 7,5; 150 mM NaCl; 0,2% Tween 20; 5% de leche desnatada en polvo y 0,05% de lisado bacteriano de E.coli). Las tiras con antígeno se bloquean colocando las placas en un agitador durante 30 minutos a temperatura ambiente (20-22ºC).

iii)

Se añade a los sitios adecuados una dilución 1/200 de los sueros de ensayo y de cada uno de los controles. Las tiras deben estar sumergidas por completo, mirando hacia arriba y mantenidas en esa posición durante todo el proceso.

iv)

Se incuban las tiras durante 60 minutos en un agitador a temperatura ambiente.

v)

Se elimina el líquido de las bandejas y cada tira de ensayo se lava tres veces con solución de lavado (50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 150 mM NaCl y 0,2% Tween 20) con agitación durante 5 minutos.

vi)

Se añade a cada pocillo de la prueba la solución de suero de conejo anti-bovino conjugado con fosfatasa alcalina, y las tiras se incuban con agitación durante 60 minutos a temperatura ambiente.

vii)

Se elimina el líquido de las bandejas y cada tira se lava tres veces con solución de lavado como anteriormente.

viii) En tampón de substrato (100 mM NaCl; 5 mM MgCl2; y 100 mM Tris-HCl, pH 9.3) se prepara la solución de substrato (0,015% fosfato de bromocloroindol/0,03% de nitroazul tetrazolio) y se añade a cada pocillo de ensayo. ix)

Las tiras se incuban colocando la bandeja de la prueba en un agitador orbital hasta que el control de corte muestre claramente cinco bandas distintas. Las tiras se lavan abundantemente con agua desionizada y se dejan secar al aire.

x)

Interpretación de los resultados: La prueba EITB se puede escanear con un densitómetro pero se considera que la lectura visual, aunque es más subjetiva, también resulta adecuada. Se presentan controles individuales de los sueros que exhiben un color mínimo pero repetitivo para cada uno de los cuatro antígenos. Una muestra de ensayo se considera positiva si los antígenos 3ABC, 3A, 3B y 3D (+2C) muestran densidades de color iguales o mayores que las de sus controles adecuados. Una muestra se considera negativa si dos o más antígenos muestran densidades inferiores a las de sus sueros control. Las muestras que no encajan con estos modelos se consideran indeterminadas.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO Normalmente, el control de la FA es una responsabilidad nacional y, en muchos países, la vacuna solo puede utilizarse con autorización. Las normas para la producción de vacunas veterinarias se presentan en el Capítulo I.1.7. Principios de producción de vacunas veterinarias. Las directrices que se indican aquí y en el Capítulo I.1.7 son de carácter general y pueden suplementarse con requisitos nacionales y regionales. Para producir vacunas contra la FA se deben emplear virus virulentos de la FA; por tanto, las instalaciones de producción de la vacuna contra la FA deben funcionar bajo normas y prácticas apropiadas de bioseguridad. Las instalaciones deben cumplir los requisitos para patógenos del Grupo de Contención 4 como se indica en el Apéndice I.1.6.1 del Capítulo I.1.6 de este Manual.

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Capítulo 2.1.1. — Fiebre aftosa

La vacunación contra la FA se utiliza de forma rutinaria en muchos países donde la enfermedad es endémica. En contraste, varios países que están libres de la enfermedad no han vacunado nunca su ganado y cuando se han presentado brotes prefieren utilizar controles estrictos del desplazamiento y el sacrificio de los animales infectados y los que han estado en contacto con ellos. No obstante, muchos países libres de la enfermedad mantienen la opción de vacunar y disponen de sus propias reservas estratégicas de preparaciones concentradas de virus inactivados. Tales reservas de antígeno suponen la posibilidad de suministrar vacunas a corto plazo en el caso de una "emergencia" (17). Las vacunas contra la FA son preparaciones del virus químicamente inactivado derivado de cultivos celulares, que han sido mezcladas con un adyuvante adecuado. En el caso de vacunas destinadas a utilización en cerdos, se prefieren los adyuvantes oleosos. Debido a la existencia de varios serotipos del virus, muchas vacunas contra la FA son multivalentes, y es común la práctica de preparar vacunas con dos o más cepas diferentes de virus. En las áreas donde la enfermedad se mantiene en búfalos de vida libre, se necesita incluir más de un virus por serotipo para asegurar una cobertura antigénica amplia contra los virus predominantes.

1.

Control del inóculo

a)

Características del inóculo En teoría, la selección de los virus del inóculo debería basarse en su facilidad de crecimiento en cultivo celular, en la tasa de virus, en la estabilidad y en un amplio espectro antigénico (37). Las cepas de producción se deben caracterizar y distribuir por laboratorios oficiales de control y deben seleccionarse de acuerdo con la importancia epidemiológica de cada variante.

b)

Método de cultivo Muchos productores de vacunas contra la FA utilizan cepas vacunales que proceden de aislamientos locales naturales y, para las procedentes de cultivo celular, de su adaptación a crecer en células en suspensión o en monocapas, por pases seriados. Para eliminar el riesgo de cualquier virus contaminante que contenga lípidos en estos aislamientos naturales, se recomienda un tratamiento con un solvente orgánico antes de la adaptación, o durante ella. Es aconsejable mantener bajo el número de pases en cultivo celular, pues existen pruebas de que, durante estos procesos, el virus puede presentar una "deriva" antigénica.

c)

Validación como una vacuna Los virus del inóculo deben estar caracterizados antigénicamente y se debe demostrar que están libres de todos los agentes extraños declarados por la autoridad competente para establecer la homología con el virus original aislado, así como su pureza y eficacia contra las cepas circulantes frente a las que se dirigen. A menudo, esto supone varios métodos, pero, para establecer su adecuación a las cepas naturales, se suele utilizar la prueba NV. Los virus de siembra se pueden guardar a -20ºC con glicerina o a temperatura inferior sin glicerina (por ejemplo, a -70ºC). Los virus del inóculo de trabajo se pueden amplificar por uno o varios pases del inóculo original y utilizarlos para infectar el cultivo celular final a una proporción aproximada de 1 PFU (unidades formadoras de placas o calvas) por cada 100 células.

2.

Método de producción

En general, el virus de la FA se produce a gran escala en sistemas celulares en suspensión bajo condiciones asépticas. Es esencial que todas las tuberías y contenedores estén cuidadosamente esterilizados para asegurar que en el sistema no existen áreas que contengan microorganismos. Además de las condiciones generales de esterilidad, es importante destacar que el virus es vulnerable al ataque por enzimas proteolíticas, como las producidas por microorganismos (13). También resulta crítico el control del pH y de la temperatura debido a la labilidad del virus a estos factores (12). La temperatura óptima para el crecimiento celular y vírico, y para la desnaturalización, que suele ser de alrededor de 37ºC y 26ºC, respectivamente, debe controlarse con precisión. Durante otras fases de la producción, la temperatura debe reducirse a 4-6ºC. Los virus deben mantenerse a un pH cercano a 7,6 y nunca por debajo de 7,0. Se utiliza una cepa adecuada de virus para infectar una suspensión de una línea celular transformada, como la BHK. Tales cultivos deben estar libres de microorganismos contaminantes. Resulta común mantener los stocks de células BHK en nitrógeno líquido y darles un pase cuando sea necesario. Después de el pase, se extienden en medio nutritivo en un volumen y a una densidad celular apropiados para sembrar el cultivo principal. Como 6 una aproximación indicativa, se siembra el cultivo principal para dar una densidad inicial de 0,2-0,5 x 10 6 células/ml, y se deja multiplicar hasta 2-3 x 10 células/ml antes de infectarlo con el virus.

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

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Capítulo 2.1.1. — Fiebre aftosa

Cuando el virus alcanza su título máximo, lo cual se determina por infectividad, FC y otras pruebas, el cultivo se clarifica y se filtra, a menudo con centrifugación. A continuación, el virus se inactiva añadiendo etilenimina (EI), normalmente en forma de etilenimina binaria (BEI). Esto se prepara disolviendo, a una concentración de 0,1 M, hidrobromuro de 2-bromoetilamina en una solución de hidróxido sódico 0,2 N, e incubando a 37ºC durante 1 hora (4, 5). El BEI formado se añade luego a una suspensión de virus mantenida a 26ºC, a una concentración final de 3 mM. Normalmente, la inactivación se prolonga durante 24 horas, seguida de una segunda dosis de BEI durante otras 24 horas. Después de la inactivación, cualquier BRI residual en el producto se puede neutralizar añadiendo una suspensión de tiosulfato a una concentración final de 2%. Para disminuir la probabilidad de que en la segunda aplicación no entren en contacto virus vivos con la BEI, es importante transferir inmediatamente el contenido de los recipientes a un segundo recipiente estéril, donde se deja que la inactivación continúe hasta 48 horas. El virus inactivado se puede concentrar por ultrafiltración, precipitación con polietilenglicol o adsorción con óxido de polietileno (1, 43). Si es necesario, estos antígenos concentrados se pueden mantener a -70ºC o a temperaturas más bajas durante muchos años, y, cuando se requiera, convertirlos en vacunas mediante dilución en un tampón adecuado y adición de adyuvantes (15). Normalmente, las vacunas convencionales contra la FA se presentan en una de dos formas. La utilizada más corrientemente en el ganado vacuno se prepara adsorbiendo el virus en gel de hidróxido de aluminio, que es uno de los adyuvantes de la preparación final de la vacuna. Otros componentes del producto final incluyen antiespumante, rojo de fenol (si está permitido en el país que necesita la vacuna), hidrolizado de lactalbúmina, caldo de triptosa con fosfato, antibióticos, aminoácidos, vitaminas y sales tamponadas. También se incorpora un segundo adyuvante, la saponina, derivada del árbol sudamericano Quillaja saponaria mollina, y también mertiolato/cloroformo como conservante. Una fórmula alternativa utiliza como adyuvantes aceites minerales, como Marcol y Drakeol. Estas preparaciones tienen varias ventajas sobre la vacuna estándar con hidróxido de aluminio/saponina, sobre todo su eficacia en los cerdos. Se utilizan mucho en Sudamérica para vacunar ganado bovino debido a una mayor duración de la inmunidad obtenida. El aceite mineral se pre-mezcla, por lo general, con un agente emulsionante, como el monooleato de manosa, antes de añadir un volumen igual de fase acuosa de la vacuna, y emulsionar mediante un dispersador coloidal, o un emulsificador mecánico continuo o de flujo ultrasónico. Se pueden producir emulsiones dobles más complejas (agua/aceite/agua) emulsionando de nuevo en una fase acuosa que contenga una pequeña cantidad de Tween 80 (26). La introducción de adyuvantes con aceites alternativos "listos para usar" ha supuesto un avance significativo en los últimos años. Los aceites con ésteres del ácido octadecenoico y 2,5 anhidro-d-manitol, por ejemplo, forman fácilmente emulsiones dobles o mezcladas (agua/aceite/agua) que son estables y de baja viscosidad sin que se necesite un equipo emulsionantes sofisticado (6, 17).

3.

Control interno

En general, los títulos de virus alcanzan niveles óptimos a las 24 horas de la infección de los cultivos celulares. El tiempo escogido para recoger el cultivo se puede basar en ciertas pruebas; por ejemplo, la muerte celular. La concentración de virus se puede determinar por pruebas de infectividad, gradiente de densidad de sacarosa (14) o técnicas serológicas. Es preferible utilizar un método que mida masa antigénica, como el análisis en gradiente de densidad de sacarosa, junto con uno que mida infectividad, ya que las dos propiedades no coinciden necesariamente y los diferentes métodos pueden complementarse. Durante la inactivación del virus se deben tomar muestras a intervalos de tiempo regulares para controlar la velocidad y linealidad del proceso de inactivación. Los títulos de virus en las muestras se determinan por inoculación de cultivos celulares que sean muy susceptibles al virus de la FA, por ejemplo, células BHK o de tiroides bovino. Dichos cultivos permiten la prueba de muestras estadísticamente significativas en condiciones reproducibles. Los valores lg10 de la infectividad de las muestras se representan en función del tiempo, y el proceso de inactivación no se considera correcto a menos que la última parte de la pendiente de la línea sea 4 recta y que la extrapolación indique que hay menos de una partícula infecciosa por cada 10 litros de preparación al final del período de inactivación.

4.

Control de lotes

a)

Esterilidad Tanto la masa total de antígeno inactivado, como los adyuvantes, los tampones de dilución, y el producto final deben someterse a pruebas de esterilidad. Esto se puede realizar directamente con los componentes de la vacuna y con el producto final, pero el método preferido es recoger cualquier microorganismo contaminante por filtración en membrana del material a examinar y detectarlo por incubación de la

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Capítulo 2.1.1. — Fiebre aftosa

membrana en medios de cultivo. Este procedimiento permite la eliminación de conservantes y otras substancias que puedan inhibir la detección de los microorganismos. En la Farmacopea Europea 1997 se describen normas sobre técnicas y medios de cultivo que permiten la detección de una amplio espectro de microorganismos (ref. 19; consultar también el Capítulo I.1.5).

b)

Inocuidad A efectos de demostrar la ausencia de virus infecciosos, después de la inactivación se debería probar una muestra de cada lote de antígeno inactivado, que represente por lo menos 200 dosis, por inoculación de monocapas celulares que sean sensibles, si es posible del mismo origen que las utilizadas para la producción del antígeno. Para hacer esto puede preferirse concentrar el antígeno, en cuyo caso se debe demostrar que el concentrado no interfiere con la sensibilidad o la estimación de la prueba. Las monocapas celulares se examinan diariamente durante tres días, después de lo cual el medio gastado se transfiere a monocapas frescas y las originales se rellenan con medio nuevo. Empleando este método, se pueden amplificar trazas de virus vivo mediante pases y detección del ECP observado. Normalmente, se emplean dos o tres pases de la preparación original del virus. Una variante de este método es congelar y descongelar la monocapa para liberar el virus intracelular, que puede detectarse por pases sucesivos.

c)

Potencia La potencia se examina solamente en el producto final (ver Sección C.5.b.). Se puede utilizar la carga de antígeno como indicador de la potencia, si se ha establecido previamente una correlación al respecto.

d)

Duración de la inmunidad Para establecer un nivel satisfactorio de inmunidad, lo normal es proceder a una primera fase de dos inoculaciones, separadas 2-4 semanas entre sí, seguida por una revacunación cada 4-12 meses. La frecuencia de revacunación dependerá de la situación epidemiológica y del tipo y calidad de la vacuna utilizada. Cuando el acceso a los animales resulta difícil, es preferible emplear vacunas con adyuvantes con aceite a los 4 meses y al año de edad, y después revacunar cada año. En terneros nacidos de vacas vacunadas, se debe retrasar la primera vacunación lo máximo posible para permitir que descienda el nivel de anticuerpos maternos, pero no más allá de los 4 meses, tiempo al que se espera que una elevada proporción responda eficazmente a la vacunación. En terneros nacidos de vacas no vacunadas, la primera vacuna puede administrarse a la primera semana de edad (3).

e)

Estabilidad La caducidad de las vacunas convencionales contra la FA suele ser de 1-2 años a 4ºC pero son sensibles a la temperatura y no deberían congelarse ni mantenerse por encima de 4ºC.

f)

Conservantes Los conservantes más utilizados son cloroformo y mertiolato. Este último se utiliza a una concentración final de 1/30.000 (p/v).

g)

Precauciones (riesgos) Las vacunas actuales contra la FA son inocuas y no presentan riesgo tóxico para el usuario. Se debe tener cuidado para evitar la autoinyección de vacunas con adyuvantes que contienen emulsiones de aceite.

5.

Pruebas sobre el producto final

a)

Inocuidad Es necesario probar las vacunas contra la FA para asegurarse de que el producto final no es infeccioso ni tóxico. Algunos laboratorios determinan la falta de infectividad eluyendo el virus de la vacuna, pero esto no es aplicable a todas las preparaciones. Por ejemplo, la saponina influye mucho en la elución del virus de las vacunas con hidróxido de aluminio/saponina (16). Si el procedimiento de elución es apropiado a una preparación particular, debe ser validado sembrando muestras paralelas de vacuna con pequeñas cantidades de virus vivo (7). La toxicidad y la falta de infectividad se pueden determinar simultáneamente en el ganado bovino mediante una prueba in vivo (18). En la superficie dorsal de la lengua de cada una de tres cabezas de ganado sanas y seronegativas, se inocula intradérmicamente 0,1 ml de vacuna en 20 sitios (cuatro filas de cinco puntos de inoculación). Los animales se observan por lo menos durante 4 días, al cabo de los cuales se administra a cada animal tres dosis completas de vacuna por la ruta recomendada por el fabricante. Los animales se observan otros 6 días. Si alguno de los animales desarrollara síntomas de FA, la vacuna no supera la prueba de inocuidad. Del mismo modo, se debe determinar cualquier toxicidad anormal atribuible a la vacuna que pueda invalidar su aceptación. En teoría, las vacunas para otras especies deben probarse en

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Capítulo 2.1.1. — Fiebre aftosa

cuanto a inocuidad en las especies a las que van dirigidas, administrando una dosis doble de vacuna de acuerdo con las instrucciones recomendadas por el fabricante en cuanto a ruta y volumen de la dosis. Los animales deberían examinarse diariamente durante un mínimo de 7 días para poner de manifiesto signos de toxicidad o de FA.

b)

Potencia Se debe utilizar ganado de más de 6 meses de edad, obtenido de áreas sin FA, que no se hayan vacunado previamente contra la FA y que carezcan de anticuerpos frente a los diferentes tipos de virus de la FA. Se deben vacunar, por la ruta indicada por el fabricante, tres grupos de por lo menos cinco animales. La vacuna se debe administrar a diferentes dosis por cada grupo, inoculando diferentes volúmenes de la vacuna. Por ejemplo, si el prospecto señala que una inyección de 2 ml corresponde a la administración de una dosis de vacuna, 1/4 de dosis corresponderá a inyectar 0,5 ml y 1/10 de dosis a 0,2 ml. Estos animales, y un grupo control de otros dos no vacunados, se inoculan para desafío 3 semanas después de la inoculación con una suspensión de virus bovino completamente virulento y apropiado a los tipos de virus presentes en el vacuna ensayada, inoculando intradérmicamente 10.000 ID50 (dosis infectiva al 50%) en dos sitios de la superficie superior de la lengua (0,1 ml por sitio). Los animales se observan durante 810 días. Los animales control no protegidos mostrarán lesiones en otros sitios además de la lengua y desarrollarán lesiones en al menos tres patas. Del número de animales protegidos en cada grupo, se calcula la PD50 (dosis protectora media) que contiene la vacuna. Existen varios métodos para calcular la PD50 (22), pero se prefieren los procedimientos basados en el método de Kärber. La vacuna debe contener al menos 3 PD50 por dosis para el ganado bovino cuando se emplea con fines profilácticos, aunque es preferible emplear 6 PD50 por dosis. En ocasiones una vacuna de potencia elevada evita el desarrollo de lesiones locales en la lengua. En algunos países de Sudamérica se realiza una variación de la prueba de potencia, la prueba PGP (porcentaje de protección contra la infección generalizada de la pata). Se vacuna con una dosis completa por la ruta recomendada por el fabricante a un grupo de 16 animales de 1824 meses de edad, con las mismas características que las descritas para la PD50. Estos animales, y un grupo control de dos animales no vacunados, se inoculan en desafío 4 semanas después de la vacunación con una suspensión de virus bovino completamente virulento y apropiado a los tipos de virus presentes en la vacuna ensayada, inoculando intradérmicamente 10.000 BID50 (dosis infectiva bovina al 50%) en dos sitios de la superficie superior de la lengua. Los animales control no protegidos mostrarán lesiones en otros sitios, además de la lengua, y desarrollarán lesiones en al menos tres patas; para uso profiláctico rutinario, la vacuna debe proteger al menos a 12 de los 16 animales vacunados. No son corrientes las pruebas de potencia en otras especies, como ovejas, cabras o búfalos, y se considera que es suficiente una prueba correcta en ganado bovino para garantizar su uso en otras especies. Cuando se produzca una vacuna para uso principal en una especie particular, puede ser más apropiado realizar las pruebas de potencia de la vacuna en esa misma especie. Sin embargo, teniendo en cuenta los datos limitados que se poseen sobre el búfalo africano o el asiático (Bubalus bubalis) y las ovejas, y la frecuente naturaleza subclínica de la enfermedad en estas especies, los resultados de la prueba de potencia en el ganado bovino suelen ser un buen indicador de la aplicabilidad de la vacuna a otras especies. Para la prueba de potencia de las vacunas contra la FA en cerdos, se puede adoptar un protocolo similar a la prueba en ganado bovino. Utilizando tres grupos de cinco cerdos, se vacuna un grupo con la dosis completa recomendada por el fabricante, otro grupo con 1/4 de la dosis y el tercer grupo con 1/16 de la dosis. Tradicionalmente, la respuesta a las vacunas con aceite se deja desarrollar durante más tiempo, y el día 28 después de la vacunación se inyectan los tres grupos, más dos cerdos control no vacunados, en una prueba de desafío. El desafío consiste en la inyección intradérmica en los bulbos del talón de una pata, de 10.000 DICCT50 (0,2 ml), calculado por crecimiento en un cultivo celular porcino adecuado, de un virus virulento homólogo a una cepa utilizada en la vacuna. Los animales se observan diariamente durante 10 días para vigilar la aparición de síntomas de FA, y se van eliminando tan pronto desarrollan una FA generalizada para evitar una excesiva dosis de desafío a los restantes. Los animales control deben desarrollar síntomas en más de una pata. Del número de animales protegidos en cada grupo, se calcula el contenido en PD50 de la vacuna. Existen varios métodos para calcular la PD50 (22), pero se prefieren los procedimientos basados en el método de Kärber. La vacuna debe contener al menos 3 PD50 por dosis para cerdos. También se puede adoptar para cerdos un protocolo similar a la prueba PGP en el ganado bovino, utilizando un grupo de 16 animales vacunados con una dosis completa de vacuna y dos animales control no vacunados. El desafío se hace por inyección intradérmica en los bulbos del talón de una pata con 10.000 BID50 (0,2 ml) de un virus virulento homólogo a la cepa utilizada en la vacuna. Para establecer la potencia de una vacuna, se pueden utilizar otras pruebas, como la medida en cultivo celular de los anticuerpos neutralizantes del virus después de la vacunación, o de los anticuerpos por ELISA, o de los anticuerpos de protección en ratones lactantes, con tal de que se haya establecido estadísticamente una correlación satisfactoria entre los resultados obtenidos por la prueba con el serotipo particular de la vacuna y la prueba de potencia en el ganado (42). Por ejemplo, se utiliza el porcentaje esperado de protección para analizar los sueros de un grupo de al menos 16 animales y para expresar la probabilidad de que un animal resulte protegido midiendo los anticuerpos neutralizantes, los anticuerpos por

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Capítulo 2.1.1. — Fiebre aftosa

ELISA o los anticuerpos de protección. En un grupo único al que se suministra una dosis completa de vacuna, el porcentaje medio de protección individual esperado sería igual o mayor que el 75% si se emplean 16 animales o igual o mayor que el 70% cuando se utilizan 30 animales en el grupo experimental. La presencia en la vacuna de más de un serotipo no interfiere con la inducción de anticuerpos frente a otro serotipo o con la correlación del título de anticuerpos y la protección.

c)

Pureza El Código de Salud de la OIE para animales terrestres estipula que un criterio para volver a establecer un estado de ausencia de FA después de un brote, si se utilizan vacunas, es probar a los animales vacunados para la presencia de anticuerpos contra NSP. Por consiguiente, la vacuna o el antígeno que se utilice en estas circunstancias debe estar purificado para reducir el contenido en NSP. Si la vacuna se produce para un mercado donde no se utilizará la prueba NSP, no será necesaria esta pureza respecto a NSP. Un método de prueba que se puede utilizar para determinar la pureza de la vacuna es vacunar tres veces a tres terneros de 3-6 meses y después probarlos para la presencia de anticuerpos contra NSP utilizando las pruebas descritas en la Sección B.2.d. de este capítulo. Si se detecta anticuerpo contra NSP, la vacuna se debe purificar más, antes de su distribución. Un método alternativo consiste en vacunar los terneros empleados en la prueba de inocuidad dos veces más en 3-6 meses y luego probarlos para presencia de anticuerpos contra NSP.

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Capítulo 2.1.1. — Fiebre aftosa

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* * *

NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Fiebre aftosa (ver Cuadro en la parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar la página web de la OIE para una lista actualizada: www.oie.int)

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CAPÍTULO 2.1.2.

ESTOMATITIS VESICULAR

RESUMEN La estomatitis vesicular (EV) es una enfermedad vesicular de los caballos y el ganado bovino y porcino causada por un vesiculovirus de la familia Rhabdoviridae. Cuando no afecta a los caballos, es indistinguible clínicamente de la fiebre aftosa o glosopeda (FA), el exantema vesicular (EV) o la enfermedad vesicular de los cerdos (EVC). Las ovejas, cabras y muchas otras especies salvajes pueden resultar infectadas. El hombre también es susceptible. La enfermedad está limitada a América; sin embargo, se describió previamente en Francia y en Sudáfrica. Aunque la EV se transmite directamente por la ruta transcutánea o a través de la mucosa, el virus de la EV se ha aislado de la mosca de la arena (Phlebotomus) y de mosquitos, lo que sugiere que puede ser transmitida por insectos. En consecuencia, existe una variación estacional en los casos de EV: desaparece al final de la estación lluviosa en áreas tropicales, y con las primeras heladas en zonas templadas. También hay evidencias de que el virus de la EV podría ser un virus vegetal y que los animales son el final de la cadena epidemiológica. La patogénesis de la enfermedad está poco aclarada, y se ha observado que los anticuerpos humorales específicos no siempre evitan la infección por el virus de la EV. Aunque se puede sospechar que se trata de EV cuando hay caballos afectados además de cerdos y vacas, es esencial un diagnóstico diferencial temprano porque los síntomas clínicos de la EV son indistinguibles de los de la FA cuando afecta a ganado bovino y porcino, y de los de la EVC o la EV cuando solo afecta a cerdos. Identificación del agente: El virus de la EV se puede aislar fácilmente por inoculación de varios sistemas de cultivo de tejidos, ratones lactantes o huevos embrionados de pollo. El antígeno vírico se puede identificar por un enzimoinmunoensayo indirecto de tipo "sandwich" (IS-ELISA) -ésta es la prueba más rápida y barata. La prueba de fijación de complemento (FC) es también una buena alternativa. Puede utilizarse la prueba de neutralización del virus (NV), pero es elaborada y lleva tiempo. Pruebas serológicas: Los animales convalecientes desarrollan anticuerpos con especificidad de serotipo a los 4-8 días de la infección que se demuestran por un ELISA de bloqueo en fase líquida, por un ELISA competitivo (C-ELISA) y por NV. Otras pruebas que se han descrito son FC, inmunodifusión en medio sólido y contra-inmunoelectroforesis. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: En EE.UU. y en Colombia se han usado vacunas con virus inactivados y con hidróxido de aluminio o aceite como adyuvantes, respectivamente. Ambas vacunas inducen niveles altos de anticuerpos específicos en los sueros del ganado vacunado. Sin embargo, no está todavía claro que los anticuerpos séricos eviten la enfermedad. Se ha utilizado en condiciones de campo una vacuna con virus atenuados de eficacia desconocida.

A. INTRODUCCIÓN La estomatitis vesicular (EV) se describió en EE.UU. en 1926 (18) y 1927 (7) como una enfermedad vesicular de los caballos, y, posteriormente, de ganado bovino y porcino. Las vesículas las causa el virus de la EV en la lengua, labios, mucosa bucal, pezones, y en el epitelio de la banda coronaria de las patas del ganado vacuno, caballos, cerdos, y muchas otras especies de animales domésticos y salvajes. También son susceptibles muchas especies de animales de laboratorio. La enfermedad se limita a América; no obstante, se describió en Francia (1915 y 1917) y en Sudáfrica (1886 y 1897) (11).

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Capítulo 2.1.2. — Estomatitis vesicular

En humanos que están en contacto con animales afectados de EV o que manejan el virus infeccioso de la EV, se han observado síntomas semejantes a los de la gripe, normalmente sin vesículas. Todas las manipulaciones que impliquen el virus de la EV, incluyendo el material infeccioso de los animales, deben llevarse a cabo con las adecuadas medidas de bioseguridad. Hay dos tipos inmunológicos principales del virus de la EV, el de New Jersey (NJ) y el de Indiana (IND). Ambos virus pertenecen al género Vesiculovirus, de la familia Rhabdoviridae, y se han estudiado con detalle a nivel molecular. En las últimas décadas se han aislado de animales enfermos otros rhabdovirus estrechamente relacionados. Estos virus de la EV están representados por las cepas Salto-Argentina/63 y Alagoas-Brasil/64, que se consideran como los subtipos 2 y 3, respectivamente, del serotipo IND (8). Se han identificado las cepas del serotipo NJ y del subtipo IND-1 en áreas endémicas de la enfermedad: Sudeste de EE.UU., México, América central, Panamá, Venezuela, Colombia, Ecuador y Perú. La cepa IND-2 Salto-Argentina/63 se aisló de caballos en Argentina en 1963. 18Esta cepa, junto con la IND-2 Maipú-Argentina/86 y otras dos cepas aisladas en 1966 y 1979 en Brasil, y clasificadas en el mismo subtipo, sólo afectan a caballos (2, 3). El ganado que vive junto a caballos afectados no presenta conversión de anticuerpos (2). El subtipo IND-3, representado por la cepa Alagoas-Brasil/64, sólo se ha identificado esporádicamente en Brasil. Hasta 1977, las cepas del subtipo IND-3 solo se aislaban de caballos. Sin embargo, la cepa IND-3 Espinosa-Brasil/77 fue la primera aislada de ganado bovino. Las cepas IND-3 conocidas afectan al ganado bovino en menor grado que a los caballos (2,3). Este hecho confirma las primeras descripciones de 1926 y 1927 (7,18) de los serotipos NJ e IND en caballos, y posteriormente en ganado bovino y en cerdos. El mecanismo de transmisión del virus de la EV no está claro. El hecho de que el virus se aísle de la mosca de la arena (Phlebotomus), mosquitos y otros insectos, apoya la hipótesis de que puede ser transmitido por insectos (6, 10, 17). También hay hipótesis que sostienen que el virus de la EV es un virus vegetal presente en el pasto (17) y que los animales están al final de la cadena epidemiológica. Bajo circunstancias especiales, el virus podría sufrir un proceso de adaptación para infectar a los animales, seguido de una transmisión directa entre animales susceptibles. Durante el brote epizoótico de 1982 en el este de EE.UU., hubo varios casos de transmisión directa de animal a animal (20). Aunque no todos los años se diagnostica EV en el ganado en EE.UU., se considera que es endémica entre los cerdos salvajes en Ossabaw Island, Georgia (5). La incidencia de la enfermedad varía mucho entre el ganado afectado. Normalmente el 10-15% de los animales muestra signos clínicos, que se observan sobre todo en los animales adultos. Los bóvidos y caballos de menos de 1 año de edad son raramente afectados. La mortalidad en ambas especies está cercana a cero. Sin embargo, se ha observado una elevada mortalidad en cerdos afectados por el virus NJ. Los animales enfermos se recuperan aproximadamente a las 2 semanas. Las complicaciones de importancia económica más corrientes son mastitis, y pérdida de producción láctea (16). Tanto los serotipos NJ e IND-1 en los brotes de 1995, 1997 y 1998 en EE.UU. causaron fundamentalmente síntomas clínicos en caballos, aunque se observó seroconversión en bóvidos.

B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO La EV no se puede diferenciar clínicamente con certeza de otras enfermedades vesiculares, como la fiebre aftosa o glosopeda (FA), el exantema vesicular (EV), y la enfermedad vesicular de los cerdos (EVC) cuando no hay caballos implicados. En cualquier caso sospechoso de EV, es urgente un diagnóstico de laboratorio temprano. La toma de muestras y la tecnología utilizada para el diagnóstico de la EV debe estar en concordancia con la metodología empleada para el diagnóstico de FA, EV y EVC, a fin de facilitar el diagnóstico diferencial de estas enfermedades vesiculares. Nota: el virus de la EV es un patógeno para humanos y se deben de tomar precauciones adecuadas cuando se trabaja con tejidos potencialmente infectados o con el virus (ver Capítulo I.1.6. Seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiología). Las mejores muestras para el diagnóstico son el fluido vesicular, el epitelio que cubre las vesículas sin romper, los trozos de epitelio de vesículas recién rotas, o frotis de las vesículas abiertas. Estas muestras se toman de las lesiones de la boca, así como de las patas y de otros sitios que muestren desarrollo de vesículas. Se recomienda sedar a los animales antes de tomar las muestras para evitar daños a los trabajadores y por razones de cuidado animal. Las muestras epiteliares se colocan en botellas con caldo de triptosa y rojo de fenol tamponado con Tris, pH 7,6. Si se va a realizar una fijación de complemento (FC) para la detección del antígeno, la muestra se puede recoger en tampón glicerol/fosfato, pH 7,2-7,6. (Nota: el glicerol resulta tóxico para el virus de la EV y disminuye la sensibilidad del aislamiento del virus; por consiguiente sólo se recomienda para toma de muestras para la prueba FC). Las muestras deben mantenerse refrigeradas, y si pueden llegar al laboratorio en 48 horas después de recogidas, deben enviarse refrigeradas. En caso de que las muestras se envíen congeladas en hielo seco, deben tomarse precauciones especiales para asegurarse de que el CO2 no entre en la muestra y destruya el

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Capítulo 2.1.2. — Estomatitis vesicular

virus. Hay requisitos especiales de embalaje para enviar muestras con hielo seco (ver Capítulo I.1.1. Métodos de muestreo, para información adicional sobre el envío de muestras para diagnóstico). Cuando en el ganado bovino no hay tejido epitelial disponible, se pueden recoger muestras de líquido esofágicofaríngeo (OP) por medio de una copa de esputo. En los cerdos, se puede tomar un frotis de garganta y enviarlo al laboratorio para aislamiento de virus. Este material debe enviarse al laboratorio refrigerado y en caldo de triptosa tamponado con Tris. Si las muestras van a estar embaladas más de 48 horas después de la recogida, deben mandarse congeladas en hielo seco, como se indicó previamente. Las muestras de esputos para el aislamiento del virus de la EV no deben tratarse con solventes tales como el cloroformo. Los virus se pueden aislar de tejidos orales y nasales a los 7 días post-infección. Cuando no es posible tomar muestras para la identificación del agente, se pueden utilizar muestras de suero de los animales recuperados para detectar y cuantificar anticuerpos específicos. Se prefiere la toma de pares de sueros del mismo animal, recogidos por separado entre 1-2 semanas, para comprobar el cambio en el título de anticuerpo. Los reactivos para un diagnóstico específico del virus de la EV no están comercialmente disponibles y cada laboratorio debe producir los suyos u obtenerlos de un laboratorio de referencia. Los dos laboratorios de referencia de la OIE para la estomatitis vesicular (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual) y el Instituto de Salud Animal1, producen y distribuyen reactivos para diagnóstico, previa petición.

1.

Identificación del agente

Para la identificación del virus de la EV y el diagnóstico diferencial de las enfermedades vesiculares, se deben someter a pruebas inmunológicas las suspensiones clarificadas de las muestras que sean sospechosas de contener el virus. Para el aislamiento del virus, se inoculan las mismas muestras en cultivos celulares apropiados. La inoculación de la muestra misma en cultivos celulares de riñón de mono verde africano (Vero), riñón de hámster neonato (BHK-21) o IB-RS-2 permite la diferenciación de las enfermedades vesiculares: el virus de la EV causa efecto citopático (ECP) en las tres líneas celulares; el virus de la FA origina ECP en BHK-21 y en IB-RS-2, mientras que el virus de la EVC sólo causa ECP en IB-RS-2. Muchas otras líneas celulares, así como la mayoría de los cultivos primarios de células de origen animal, son susceptibles al virus de la EV. El virus de la EV se multiplica y puede ser aislado de embriones de pollo de 8-10 días de edad por inoculación en el saco alantoideo, de ratones lactantes de 2-7 días por inoculación a través de cualquier ruta, o de ratones de 3 semanas por inoculación intracerebral. En los tres casos, el virus de la EV causa la muerte entre los 2 y 5 días después de la inoculación. La ruta más susceptible para los caballos y el ganado bovino es la administración lingual intradérmica. Los cerdos se inoculan en la banda coronaria de las patas o en el morro. Las lesiones vesiculares se pueden observar a los 2-4 días de la inoculación en el tejido epiteliar de la boca, pezones y patas. La presencia de vesículas secundarias por inoculación de ganado bovino y equino depende fundamentalmente de la cepa de virus de la EV utilizada. Normalmente, el morro resulta afectado en los cerdos. Si se desarrolla un ECP en los cultivos, la suspensión se puede identificar para la identificación del agente mediante diversas pruebas inmunológicas y el cultivo celular se puede teñir con un anticuerpo fluorescente específico para la EV. Se pueden realizar pruebas similares en suspensiones homogenizadas de tejidos del músculo esquelético diseccionado de ratones muertos y de embriones de pollo y con suspensiones de muestras epiteliales. El tejido cerebral de los ratones es una fuente excelente de virus. Debido a las diferentes características morfológicas de los rhabdovirus (virus de la EV), picornavirus (virus de la FMD y de la SDV) y calicivirus (VE), y al gran número de partículas víricas en los líquidos vesiculares y en los tejidos epiteliales, la microscopía electrónica puede ser un instrumento diagnóstico útil para diferenciar la familia de virus implicada. Los métodos inmunológicos preferidos para identificar en el laboratorio los antígenos víricos son el enzimoinmunoensayo (ELISA) (2, 9), la prueba FC (2, 13) y la tinción con anticuerpo fluorescente. La prueba de neutralización del virus (NV), con antisueros positivos conocidos contra el virus de la EV de serotipos NJ e IND, se puede utilizar en cultivo de tejidos, ratones lactantes o huevos embrionados, pero lleva más tiempo.

a)

Aislamiento del virus i)

1

Inocular el cultivo celular en tubos Leighton y en botellas de 25 cm2 con la suspensión clarificada, tejidos o con el líquido de las vesículas.

Institute for Animal Health, Pirbright Laboratory, Ash Road, Pirbright, Woking, Surrey GU24 0NF, United Kingdom.

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Capítulo 2.1.2. — Estomatitis vesicular

ii)

Incubar los cultivos celulares inoculados a 37°C durante 1 hora.

iii)

Retirar el inóculo y lavar tres veces los cultivos celulares con medio de cultivo y añadir medio de cultivo que contenga 2,5% se suero fetal bovino (FBS).

iv)

Incubar los cultivos de tejidos en tubos Leighton a 33-35°C y observar el ECP.

v)

Después de 18-24 horas de incubación, el cubre de un cultivo en tubo Leighton por cada muestra inoculada se tiñe con anticuerpo fluorescente (AF) específico de las cepas New Jersey e Indiana del virus de la EV.

vi)

El resto de los tubos Leighton y de las botellas de cultivo de 25 cm2 se incuban a 35-37°C otros 6 días y se observa diariamente el EPC.

vii)

A los 7 días de la inoculación, el resto de los cubres de los tubos Leighton se tiñen con AF. Si no se observa fluorescencia ni en los recipientes de cultivo se evidencia ECP, las muestras se consideran negativas en cuanto a aislamiento del virus de la EV.

viii) Si se observa ECP y la tinción con AF es negativa, se realiza un segundo pase, como se indicó anteriormente, usando las células de una botella de 25 cm2.

b)

Enzimoinmunoensayo La técnica indirecta de ELISA tipo "sándwich" (IS-ELISA) (2, 9) es en la actualidad el método diagnóstico elegido para la identificación de los serotipos víricos en la EV y otras enfermedades vesiculares. Específicamente, el procedimiento ELISA identifica todas las cepas del virus de la EV de serotipo IND, con un juego de antisueros polivalentes de conejo/cobaya preparados contra viriones de las cepas representativas de los tres subtipos del serotipo IND (2). Para la detección de las cepas New Jersey del virus de la EV, es adecuado un juego de antisueros monovalentes de conejo/cobaya (2, 9). •

Procedimiento de la prueba:

i)

Fase sólida: Las placas ELISA se recubren, durante 1 hora a 37°C o durante la noche a 4°C, con antisuero de conejo y con suero normal de conejo (como se describe en las refs. 2 y 4) que se han diluido de manera adecuada en tampón carbonato/bicarbonato, pH 9.6. Después, las placas se lavan una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se bloquean durante 1 hora a temperatura ambiente con 1% de ovoalbúmina en PBS. Las placas se utilizan de inmediato o se lavan tres veces y se guardan a -20°C para uso futuro.

ii)

Muestras de ensayo: Se depositan en los correspondientes pocillos las suspensiones de antígeno de las muestras de ensayo (suspensiones al 10-20% de tejido epitelial, tejido muscular esquelético de embrión de pollo o de ratones en PBS, o sobrenadantes clarificados de cultivos celulares sin diluir) y se incuban las placas 30 minutos a 37°C en un agitador orbital.

iii)

Detector: A los pocillos correspondientes se añaden antisueros monovalentes o polivalentes de cobaya contra los serotipos NJ e IND, respectivamente, del virus de la EV, que sean homólogos al suero de conejo de recubrimiento y que se han diluido convenientemente en PBS que contiene 0,05% de Tween 20, 1% de ovoalbúmina, 2% de suero normal de conejo y 2% de suero bovino normal (PBSTB). Se deja reaccionar durante 30 minutos a 37°C en un agitador orbital.

iv)

Conjugado: Se añade un conjugado de peroxidasa/ IgG de conejo o cabra anti-cobaya, diluido en PBSTB, y se deja reaccionar durante 30 minutos a 37°C en un agitador orbital.

v)

Substrato: Se añade H2O2 como substrato y se deja reaccionar a temperatura ambiente durante 15 minutos, añadiendo después ácido sulfúrico para detener la reacción. Los valores de absorbancia se miden en un lector de ELISA. A lo largo de la prueba, se utilizan volúmenes de 50 µl para los reactivos. Las placas se lavan cinco veces en cada paso con PBS que contiene 0,05% de Tween 20. Se incluyen controles de los reactivos utilizados.

vi)

Interpretación de los resultados: Un antisuero que dé una absorbancia superior al 20% de la de otro antisuero, del suero negativo y de los controles, se considera positivo para el correspondiente subtipo vírico.

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Capítulo 2.1.2. — Estomatitis vesicular

c)

Prueba de fijación de complemento El método ELISA es preferible a la prueba FC, porque es más sensible y no está afectado por factores proo anti-complemento. Sin embargo, cuando no se dispone de reactivos para ELISA, se puede realizar la prueba FC. Se describe la prueba FC para placas de microtitulación con pocillos de fondo en forma de U, utilizando los reactivos titulados por la prueba CF50%. •

Procedimiento de la prueba

i)

Antisuero: Se deposita en los pocillos de la placa antisuero monovalente anti-NJ de cobaya y antisuero polivalente anti-IND de cobaya contra el virus de la EV, diluidos en tampón veronal (VB) a una dilución que contenga 2,5 CFU50 (unidades de 50% de fijación de complemento), contra el virus homólogo. Los antisueros son los detectores utilizados en la prueba ELISA.

ii)

Muestras de ensayo: Se añaden a los pocillos con suero las suspensiones de antígeno de las muestras de ensayo, preparadas como se describe para la prueba IS-ELISA.

iii)

Complemento: Se añaden al suero y al antígeno 4 CHU50 (unidades hemolíticas de complemento del 50%). (Una alternativa es utilizar 7,5, 10 y 20 CHU50 con objeto de alcanzar 4 CHU50 en la prueba). La mezcla de antisueros, muestras de ensayo y complemento se incuba a 37°C durante 30 minutos.

iv)

Sistema hemolítico: Se añade a los pocillos una suspensión de eritrocitos de oveja (RBCs) en VB, sensibilizados con 10 HU50 (unidades hemolíticas del 50%) de suero de conejo anti-RBC de oveja. El sistema hemolítico tiene un valor de absorbancia de 0,66 a 545 nm, en la proporción de dos volúmenes de sistema hemolítico + tres volúmenes de agua destilada. La mezcla se incuba durante 30 minutos a 37°C. A continuación, las placas se centrifugan y la reacción se observa visualmente.

Se necesitan volúmenes de 25 µl para los antisueros, muestras de ensayo y complemento, y 50 µl para el sistema hemolítico. Se incluyen controles apropiados de los antisueros, antígenos, complemento, y sistema hemolítico. Es posible realizar la prueba CF50% en tubos (2) utilizando volúmenes de reactivos ocho veces mayor que los indicados para la FC en placas de microtitulación. Con la prueba CF50%, la reacción se puede expresar como lectura espectrofotométrica de la absorbancia a 545 nm. v)

Interpretación de los resultados: Cuando los controles son los esperados, las muestras con hemolisis 1.3 (1/20) se consideran positivos.

•

Enzimoinmunoensayo competitivo (una prueba prescrita para el mercado internacional)

También se ha desarrollado un método ELISA competitivo para la detección de anticuerpos. El procedimiento que se describe aquí se basa en el descrito por Afshar et al. (1). Utiliza antígenos recombinantes NJ e IND-1 de la estomatitis vesicular según lo descrito por Katz et al. (15).

b)

•

Procedimiento de la prueba

i)

Fase sólida: Los antígenos se diluyen en tampón carbonato/bicarbonato, pH 9,6, y se añaden 50 µl a cada pocillo de una placa ELISA de 96 pocillos. Se incuban las placas durante toda la noche a 4°C; las placas recubiertas se pueden guardar hasta 60 días a -70°C. Se descongelan las placas, se decanta el antígeno y se añaden 100 µl de solución bloqueante. A continuación se incuban las placas durante 30 minutos a 25°C y se decanta la solución bloqueante. Las placas se lavan tres veces con una solución de PBS/0.05% de Tween 20.

ii)

Fase líquida: A cada uno de los pocillos duplicados de cada muestra se añaden 50 µl de suero diluido 1/8 con PBS y 1% de leche en polvo desnatada. En cada placa ELISA se debe incluir un control de suero positivo y de suero negativo para cada serotipo. Se incuban las placas a 37°C durante 30 minutos. Sin lavar, se añaden 50 µl de líquido ascítico policlonal a cada pocillo y las placas se incuban a 37°C durante 30 minutos.

iii)

Detector: Se lavan las placas tres veces y se añade a cada pocillo 50 µl de suero anti-ratón obtenido en cabra conjugado con peroxidasa de rábano y diluido en 1% de leche en polvo desnatada. Se incuban las placas a 37°C durante 30 minutos, se lavan tres veces, y se añade a cada pocillo 50 µl de solución de tetrametil-benzidina (TMB) como substrato. Se incuban las placas a 25°C durante 510 minutos y después se añade a cada pocillo 50 µl de ácido sulfúrico 0,05 M. Se leen las placas a 450 nm y la densidad óptica de los pocillos del control del diluyente debe ser < 1.0.

iv)

Interpretación de los resultados: Una muestra es positiva si la absorbancia es 99,5%, la prueba FC puede detectar casi todos los animales enfermos con lesiones agudas, pero sólo una pequeña proporción de animales en las primeras fases de la enfermedad o con lesiones crónicas. Además, las intervenciones terapéuticas o las operaciones profilácticas ejecutadas de modo incorrecto (sacrificio parcial de la población) pueden aumentar el número de reacciones negativas falsas. Sin embargo, para grupos de animales (una manada o unidad epidemiológica) la FC es capaz de detectar prácticamente el 100% de los grupos infectados. La naturaleza de la patogénesis de la enfermedad es tal que el período de incubación, durante el cual los anticuerpos resultan indetectables por la prueba FC, puede prolongarse varios meses. Pese a la alta sensibilidad de la prueba FC, pueden producirse resultados positivos falsos. Una causa importante de ello es la existencia de reacciones serológicas cruzadas con otros micoplasmas, en particular con otros miembros del grupo M. mycoides. La validez de los resultados debe confirmarse mediante examen post-mortem y bacteriológico, y mediante pruebas serológicas con sangre tomada en el momento del sacrificio.

b)

Enzimoinmunoensayo competitivo (prueba prescrita para el comercio internacional) Se ha sometido a evaluación (3) un enzimoinmunoensayo competitivo (C-ELISA) desarrollado por el Centro de Colaboración de la OIE para el diagnóstico y Control de Enfermedades Animales en Países Tropicales (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual) (16). En la actualidad, la IAEA está evaluando un ELISA indirecto basado en una lipoproteína (1). En mayo de 2000 se designó a la C-ELISA como una "prueba alternativa" por el Comité Internacional de la OIE y en mayo 2004 como una prueba prescrita. Comparada con la prueba FC, la prueba C-ELISA tiene una sensibilidad similar pero una especificidad mayor. La C-ELISA es una prueba para poblaciones de animales más fácil de realizar que la FC, pero sus características no han

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Capítulo 2.1.6. — Pleuroneumonía bovina contagiosa

sido determinadas por completo, todavía (16). Los reactivos para C-ELISA se pueden obtener como preparaciones comercializadas1. Las pruebas de validación llevadas a cabo en varios países europeos y africanos (3, 16) indican i) que la verdadera especificidad de C-ELISA es de al menos 99,9%; ii) que la sensibilidad es similar a la de la prueba FC; y iii) que mediante C-ELISA los anticuerpos se detectan muy poco tiempo después de que se pueden detectar por la prueba FC y que los anticuerpos detectados por C-ELISA persisten mediante más tiempo. Esta prueba C-ELISA se suministra ahora como una preparación comercial lista para ser utilizada, que contiene todos los reactivos necesarios incluyendo placas recubiertas, que se mantienen selladas por papel de aluminio. La preparación se ha diseñado especialmente para ser resistente y ofrecer una buena reproducibilidad. Los sueros se analizan en pocillos únicos. El substrato se ha modificado y en la actualidad es TMB (tetrametil benzidina) en tampón líquido y la lectura se realiza a 450 nm. El color del substrato cambia de verde pálido a azul en una primera fase y es amarillo después de añadir la solución de parada. Los controles de MAbs muestran un color más oscuro mientras que los controles de suero muy positivo son muy claros. El punto de corte se ha tomado al 50% y debería ser válido en cualquier país. En una población afectada muchos animales mostrarán resultados positivos.

c)

•

Reactivos

i)

El antígeno base se prepara lavando una suspensión concentrada de micoplasmas (2 mg/ml) y lisando con dodecil sulfato sódico al 0,1%. El antígeno base se mantiene a -20ºC hasta su uso.

ii)

Los MAbs se pueden conseguir del Centro de Colaboración de la OIE para el Diagnóstico y Control de Enfermedades Animales en Regiones Tropicales (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual).

iii)

El conjugado es DAKO P260 diluido 1/1500 en PBS con 0,5% de suero de caballo y 0,05% de Tween 20.

iv)

El substrato es 1 mM ABTS (2, 2´-azino-bis-[3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico]) y H2O2 en tampón citrato.

•

Procedimiento de la prueba

i)

Las placas para ELISA se recubren con una solución pH 7,4 (100 µl/pocillo) y se incuban toda la noche a 4ºC.

ii)

Se lavan las placas una vez en PBS diluido 1/5 con 0,05% de Tween 20.

iii)

Sueros no inactivados por el calor (diluidos 1/10) y MAb diluidos en PBS con 0-5% de suero de caballo y 0,05% de Tween 20 se dejan en contacto con el antígeno durante 1 hora a 37ºC con agitación moderada, en una cámara húmeda. El suero inactivado por calor no proporciona buenos resultados.

iv)

Se lavan las placas dos veces y se añade el conjugado a todos los pocillos (100 µl); luego se incuba durante 1 hora a 37ºC.

v)

Se lavan las placas tres veces y se añade el substrato a todos los pocillos (100 µl).

vi)

Se realiza la lectura a 405 nm cuando la absorbancia alcanza 0,8-1,6 en el control de MAb.

de

antígeno

lisado

en

PBS,

Prueba de inmunotransferencia Se ha desarrollado una prueba inmunoenzimática denominada prueba de inmunotransferencia (prueba IB) que se considera con valor diagnóstico. Una estimación en condiciones de campo indicó una sensibilidad y especificidad más altas que la prueba de FC. Se considera inmunodominante un perfil básico de bandas antigénicas, que se presentan en animales infectados tanto experimental como naturalmente. La visión ajustada del estado inmune del animal que proporciona esta prueba se debe a la posibilidad de un análisis más preciso de la respuesta inmune del hospedador en relación con el perfil electroforético de los antígenos de MmmSC; por tanto, esta prueba supera problemas relacionados con unión inespecífica. Debería utilizarse fundamentalmente como una prueba confirmativa, después de otras pruebas, y en todos los casos en los que la prueba FC ha dado un resultado falso sospechoso. Particularmente, posee valor donde se están implantando políticas de control o erradicación de la enfermedad.

1

184

International Atomic Energy Agency, Wagramerstrasse 5, P.O. Box 100, A-1400 Viena, Austria, o CIRAD/EMVY, Santé Animale, Campus International de Baillarguet, TA30/G, 34398 Montpellier cedex 5, Francia.

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Capítulo 2.1.6. — Pleuroneumonía bovina contagiosa

•

Preparación de tiras de antígeno

i)

El antígeno se prepara lavando una suspensión de células de micoplasmas obtenida de un cultivo de 48 horas.

ii)

Se prepara una SDS/PAGE (dodecil sulfato sódico/electroforesis en gel de poliacrilamida) con gel de concentración al 4% y gel de resolución en gradiente del 5-15% y se utiliza para electroforesis de la muestra con marcadores apropiados de peso molecular.

iii)

Las proteínas separadas se transfieren a membranas de 0,45 µm de nitrocelulosa (14 x14 cm) a un voltaje constante de 70 V en tampón de transferencia (20% de metanol en 193 mM de glicina, 25 mM de Tris/HCl, pH 8,3).

iv)

Se seca la membrana y se marca el lado sobre el que se encuentran las proteínas. Se incuba la membrana de nitrocelulosa en tampón de bloqueo (PBS que contiene 5% de leche desnatada, 1 M de glicina y 1% de ovolabúmina) durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de tres lavados de 15 minutos en PBS con 0,1% (v/v) de Tween 20, la membrana se lava de nuevo con PBS solo. Se seca la membrana y se corta una tira del borde, que se ensaya. Se identifican las bandas específicas de 110, 98, 95, 62/60 y 48 kDa.

v)

La hoja de la membrana de nitrocelulosa se corta en tiras de 0.4 cm de anchura y se marca cada tira. Estas tiras son el antígeno usado en la transferencia.

•

Procedimiento de la prueba

NB: Las tiras deben disponerse con el antígeno hacia arriba durante el procedimiento.

d)

i)

Las muestras del suero de prueba se diluyen al 1/3 y se preparan sueros control positivo y negativo utilizando tampón de dilución (PBS con 0,1% de leche desnatada y 0,1% de ovoalbúmina).

ii)

Se coloca una tira de antígeno en cada muestra de estudio (y en los controles) y se incuba a 37ºC durante 2 horas con agitación continua. Después se lavan las tiras, como antes.

iii)

Las tiras se incuban con una dilución adecuada de Ig anti-bovina (cadenas H +L) conjugada con peroxidasa, en tampón de dilución, durante 1 hora a temperatura ambiente y con agitación continua. Después, lavar como antes.

iv)

El substrato se prepara añadiendo 30 mg de 4-cloro-1-naftol, disuelto en 10 ml de metanol, a 50 ml de PBS y 30 µl de H2O2. Se añade substrato a las tiras, que se dejan en la oscuridad con agitación continua y se examinan periódicamente hasta que las bandas de proteínas aparecen oscuras. La reacción se detiene con agua destilada.

v)

Lectura de los resultados: Las tiras se secan y se examinan respecto a la presencia del perfil básico de inmunotransferencia de IgG para cinco bandas antigénicas específicas de 110, 98, 95, 62/60 y 48 kDa. Los sueros que dan un perfil inmunológico similar se consideran positivos.

Otras pruebas Para detectar aglutininas específicas se ha desarrollado una prueba rápida de campo de aglutinación en porta (SAT) con sangre entera o con suero (30): el antígeno es una suspensión densa de micoplasmas coloreados que se mezcla con una gota de suero o sangre. Debido a una sensibilidad escasa, la prueba sólo detecta animales en los estados iniciales de la enfermedad (es decir, la fase aguda). Debe usarse solo a nivel poblacional. Se ha desarrollado una prueba de aglutinación con látex que es más fácil de interpretar que la SAT (4). Para la PBC, las pruebas FC y ELISA se pueden utilizar en programas de análisis y erradicación, y la prueba IB altamente específica debería usarse como confirmativa. Sin embargo, la prueba IB no satisface el análisis masivo y puede ser difícil de estandarizar en países con servicios de laboratorio marginales.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO Desde principios del siglo XX se han descrito muchas vacunas contra la PBC (vacunas muertas y vacunas heterólogas), pero ninguna ha sido realmente satisfactoria. En la actualidad, las únicas vacunas utilizadas se producen con cepas atenuadas de MmmSC.

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Capítulo 2.1.6. — Pleuroneumonía bovina contagiosa

1.

Control del inóculo

a)

Características del inóculo Para preparar vacunas contra la PBC se utilizan dos cepas: la cepa T1/44, una cepa atenuada naturalmente y aislada en 1951 por Sheriff & Piercy en Tanzania, y la cepa T1sr (34, 35). El pase número 44 por huevo es lo suficientemente atenuado para proteger al ganado sin producir reacciones postvacunales importantes. Después de la vacunación pueden presentarse reacciones locales en el punto de la vacunación. Las razas de ganado deben caracterizarse en cuanto a sensibilidad antes de proceder a vacunar en masa. Debe advertirse que cuando la vacuna se suministra por intubación puede producir PBC; sin embargo, si se inyecta subcutáneamente no debe crear un problema serio de enfermedad (15). La identidad de la cepa se puede comprobar con la inserción del perfil de la secuencia o por ensayo específico con PCR (18). La cepa de inóculo original se mantiene en forma liofilizada a -20ºC.

b)

Método de cultivo Para la producción de vacunas se utiliza un sistema de lotes de inóculos liofilizados que se obtienen de cultivos del inóculo primario. Estos lotes de inóculo se mantienen a -20ºC. Los medios utilizados para los cultivos de siembra son el medio de Gourlay o el medio F66: ambos contienen los mismos ingredientes básicos, pero el F66 es más complejo (24). Los medios se esterilizan por filtración, poseen un pH de 7,8-8,0, y deben utilizarse en pocos días después de su preparación. El medio se debe distribuir en tubos incubados a 37ºC durante 48 horas para comprobar su esterilidad antes del uso. Para cultivos en masa de la cepa de vacuna se debe inocular directamente el contenido completo de un vial de inóculo de siembra a 100 ml de medio, para evitar el riesgo de clonar sin pretenderlo el inóculo de la vacuna.

2.

Método de producción

Los medios para producir vacunas, de Gourlay o F66, se describen en la Sección C.1.b. Deben distribuirse en matraces de 1 litro (500 ml por matraz) y de 10 litros (5 litros por matraz) e incubarse a 37ºC durante 48 horas para comprobar la esterilidad antes de su utilización. Para obtener un recuento bacteriano alto, se deben recoger los cultivos justo antes del final de la fase logarítmica de crecimiento, antes del punto máximo, pues el número de micoplasmas viables se reduce después rápidamente. Por consiguiente se debe realizar una cinética de la curva de crecimiento en cada laboratorio de producción. El contenido de un vial de inóculo de trabajo se usa en tubos en diluciones seriadas. Si no se produce contaminación después de la incubación, se utiliza el segundo tubo, cuando el cultivo aún está en fase exponencial, para inocular matraces de 1 litro. Los matraces de 10 litros se inoculan con el cultivo de 48 horas de un matraz de 1 litro (10 ml/ litro de medio) y se incuban a 37ºC. Después de 24 horas de incubación, se recomienda que la agitación magnética sea lenta. Justo antes de que se alcance el máximo (entre 60 y 70 horas de incubación), se prepara el cultivo para liofilización. Los siguientes pasos deben hacerse en hielo: •

Adición del medio protector de liofilización: leche en polvo desnatada (al 4,5%, es decir 225 g por cada 5 litros).

•

Distribución en viales (el volumen depende del número de dosis necesarias por vial y de los pasos de la liofilización).

Para liofilizar se recomiendan liofilizadores con estantes para controlar y observar los diferentes pasos. Los viales deben cerrase en la máquina del liofilizador para evitar roturas.

3.

Control interno

En cada paso deben realizarse exámenes microscópicos de preparaciones teñidas con la tinción de Gram del caldo, o de cultivos del caldo en medio sólido con sangre, para comprobar la ausencia de contaminación bacteriana.

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Capítulo 2.1.6. — Pleuroneumonía bovina contagiosa

También debe realizarse un examen rápido para comprobar la presencia de MmmSC en el medio recogido, por microscopía de contraste de fases y mediante FAT con un suero hiperinmune marcado. Se inoculan muestras liofilizadas de las vacunas en agar micoplasma o en caldo para llevar a cabo pruebas de inhibición del crecimiento (11).

4.

Control de lotes

a)

Esterilidad Se inoculan caldos bacteriológicos, así como agar sangre, y se incuba a 37ºC. Todos los medios deben permanecer estériles (24). Las pruebas para esterilidad pueden encontrarse en el Capítulo I.1.5.

b)

Titulación El título mínimo es de 107 micoplasmas por dosis de vacuna, pero se recomiendan títulos más altos, de al menos 108. La titulación se lleva a cabo después de reconstituir la vacuna liofilizada en el diluyente recomendado para la vacunación. Las titulaciones se deben realizar en al menos cinco viales de cada lote. Técnica clásica: Se realizan diluciones decimales en medio de Gourlay. Para homogenizar la suspensión en cada tubo resulta útil emplear un agitador de tipo vórtex. Primero, 5 ml de los tubos con diluciones de 10-6 a 10-12 se inoculan en cinco tubos de medio (1 ml por tubo, cinco tubos por dilución). Todos los tubos se incuban luego 4 días a 37ºC y se detecta el crecimiento por el cambio de color en el indicador. El título se obtiene utilizando la tabla del "Número Más Probable" de MacCrady o por modificación del método de Reed & Muench. Esta técnica es simple y fácil de realizar pero carece de precisión (+ 0,5 log). Se ha descrito un método de microtitulación que es más exacto (27) y que debería utilizarse cuando sea posible. Existen procedimientos alternativos de titulación que incluyen el uso de diluciones decimales preliminares, como en la técnica clásica, pero la siembra de 20 alícuotas de 100 µl, por cada dilución, en una microplaca que ya contiene el "medio con glucosa" y un indicador de pH. Se pueden probar cuatro diluciones en una microplaca, dejando dos columnas para el control del medio. El título se calcula por una modificación del método de Reed y Müench que consiste en restar 0,25 log del título final para obtener un "número de organismos viables" y no una dosis infectiva del 50%. La precisión final debe ser del orden de 0,2-0,25 log. Se pueden obtener titulaciones comparativas sembrando alícuotas de 20 µl de cada una de las diluciones primarias en un medio sólido conveniente. Los títulos se obtienen luego como CFU (unidades formadoras de colonias) y no debería diferir mucho de los títulos obtenidos en medio líquido. La titulación en medio sólido requiere más destreza que en medio líquido.

c)

Inocuidad Después de la reconstitución en tampón frío, la vacuna se inocula subcutáneamente en dos ratones, e intraperitonealmente en otros dos ratones y en dos cobayas machos. Ninguno de los animales debe morir en el mes siguiente y los cobayas no deben mostrar signos de orquitis. Las pruebas de inocuidad se deben realizar por lo menos en dos cabezas de ganado bovino o de cebúes. Cada una se inocula con diez dosis de vacuna y se observan para efectos adversos durante 4 semanas.

d)

Potencia Se inyectan subcutáneamente por lo menos diez cabezas de ganado bovino en el sitio recomendado, indicado en el prospecto. Se mantienen como controles no vacunados otros tantos animales. Después de por lo menos 2 meses, todos los animales se ponen en contacto con ganado infectado experimentalmente, en un espacio cerrado, utilizando al menos un donante de la infección por cada tres cabezas sometidas a prueba. El ganado se mantiene en contacto durante 3 meses. Después, se sacrifican todos los animales y se realizan exámenes post-mortem. Los animales vacunados no deberían mostrar más que síntomas clínicos ligeros de la enfermedad, ni presentar lesiones post-mortem de pleuroneumonía. Al menos el 80% de los animales control deben mostrar las típicas lesiones post-mortem. Esta prueba de potencia solo se necesita realizar una vez; los lotes siguientes no se tienen que volver a probar, siempre que se produzcan con arreglo a un protocolo estándar (34, 35). Cualquier modificación de tal protocolo estándar, como incrementar el número de pases in vitro, debe estar estrictamente prohibido. Otras modificaciones, como la producción en fermentadores con ajuste continuo de pH o adición de reactivos, debe acompañarse siempre de una prueba de potencia para asegurar que la protección inducida no se ha visto alterada.

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Capítulo 2.1.6. — Pleuroneumonía bovina contagiosa

e)

Duración de la inmunidad La cepa T1/44 confiere una protección aproximada de 1 año (14), pero la lograda con la cepa T1sr puede durar sólo 6 meses. En algunos animales se produce seroconversión (prueba FC). Los anticuerpos desaparecen a los tres meses de la vacunación.

f)

Estabilidad La titulación periódica de la vacuna almacenada permite calcular la caducidad. Las vacunas liofilizadas deben conservarse a -20ºC. A esta temperatura su período de conservación es de por lo menos 1 año (24), y la viabilidad se puede conservar por muchos años sin pérdida de titulación, lo que permite la constitución de stocks de emergencia. Naturalmente, los títulos de estos depósitos necesitan un control regular.

g)

Conservantes Para liofilizar se añade leche desnatada en polvo: 45 g/litro de medio de cultivo. Para la reconstitución de una vacuna liofilizada se utiliza solución salina normal. Alternativamente, se utiliza a temperatura ambiente una solución molar de sulfato magnésico (248 g por litro). Esta solución molar protege a los micoplasmas de la inactivación por el calor (24). Es importante la pureza de las sales que se emplean.

h)

Precauciones (riesgos) Los procedimientos para uso en condiciones de campo y la reconstitución de las vacunas liofilizadas se han descrito por Provost et al. (24). Cuando se vacunan animales infectados, pueden aparecer reacciones intensas, como las que tuvieron lugar recientemente después de las campañas de vacunación de emergencia en el este de África. Por lo general, estas reacciones se presentan en 2-3 días. También pueden aparecer reacciones locales en el sitio de la inyección después de 2-3 semanas con la cepa T1/44. Estas reacciones se conocen como "reacción de Willems" y comprenden un edema invasivo que lleva a la muerte si no se administra tratamiento antibiótico con tetraciclina o tilosina. La cepa T1sr carece por completo de patogenicidad residual, lo que supone una alternativa de elección a la T1/44, aunque la duración de la inmunidad es más corta. Hubo sospechas de ineficacia de la T1sr para controlar brotes en África del sur, lo que llevó a su suspensión (29). La sensibilidad general de una población bovina determinada debe probarse primero vacunando grupos de muestra (24).

5.

Pruebas sobre el producto final

Estas pruebas se deben realizar después de la reconstitución de un conjunto de al menos cinco viales de la vacuna liofilizada con el diluyente recomendado.

a)

Inocuidad Las pruebas de inocuidad deben realizarse en ganado bovino o cebúes, de acuerdo con lo expuesto en la Sección C.4.c.

b)

Potencia Esta prueba se realiza siguiendo el protocolo descrito en la sección C.4.d. Debido a que la PBC no se puede reproducir experimentalmente con facilidad, y por su coste, solo se necesita realizar una prueba de potencia en cada lote de inóculo, con tal de que el título sea satisfactorio y que no cambien los parámetros de producción.

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* * *

NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Pleuroneumonía bovina contagiosa (ver Cuadro en la parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar la página web de la OIE para una lista actualizada: www.oie.int)

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CAPITULO 2.1.7.

DERMATOSIS NODULAR CONTAGIOSA

RESUMEN La dermatosis nodular contagiosa de los bóvidos (DNC) (Lumpy skin, LSD), knopvelsiekte) es una enfermedad del ganado debida a poxvirus que se caracteriza por fiebre, nódulos en la piel, en membranas mucosas y órganos internos, extenuación, inflamación de los nódulos linfáticos, edema cutáneo, y a veces muerte. La enfermedad tiene importancia económica porque causa un descenso en la producción, particularmente en vacas de leche. También causa daños en la piel. DNC es producida por cepas de capripoxvirus que son indistinguibles de las que causan la viruela de la oveja y de la cabra. Sin embargo, DNC tiene una distribución geográfica diferente a la viruela ovina y caprina, lo que sugiere que las cepas de capripoxvirus de bóvidos no infectan ni se transmiten a ovejas y cabras. Se estima que la transmisión del virus productor de DNC se efectúa predominantemente a través de insectos, y que la transmisión natural por contacto en ausencia de insectos vectores es poco efectiva. Hasta 1988, esta enfermedad se limitaba al África sub– sahariana, pero luego se extendió a Egipto. Sólo se ha confirmado en laboratorio un brote de DNC fuera de África, en 1989 en Israel, que se eliminó por sacrificio de todos los animales infectados o en contacto con ellos, y por vacunación. Los brotes descritos en 1993 en Bahrain y Reunion no pudieron confirmarse mediante aislamiento de los virus. Identificación del agente: La confirmación más rápida de la DNC es la demostración de los viriones típicos de los capripoxvirus en materiales de biopsias o en las costras desecadas usando el microscopio electrónico de transmisión en combinación con una historia clínica de la dermatosis nodular contagiosa generalizada y de inflamación de los ganglios linfáticos superficiales en el ganado. El capripoxvirus es distinto del parapoxvirus, que causa la estomatitis papular bovina y la seudo–viruela bovina, pero no puede diferenciarse morfológicamente del de la viruela bovina y del virus vacunal, que son en ambos casos ortopoxvirus que infectan a los bóvidos. Sin embargo, ninguno de éstos producen una infección generalizada y ambos son bastante raros en los bóvidos. El virus productor de la DNC crece en cultivos de tejidos de origen bovino, ovino y caprino, aunque el mejor crecimiento se obtiene utilizando células testiculares de cordero. El capripoxvirus produce un efecto citopático, y cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos característicos, y difiere del virus de la seudo–DNC (Allerton–mamitis herpética), que es un herpesvirus productor de sincitios y cuerpos de inclusión intranucleares. El antígeno del virus se puede poner de manifiesto en cultivo de tejidos mediante tinción con inmunoperoxidasa o inmunofluorescencia y el virus se puede neutralizar utilizando antisueros específicos. Para la detección del antígeno se ha desarrollado un enzimoinmunoensayo (ELISA) usando en la detección un suero policlonal obtenido frente a un recombinante del antígeno inmunodominante del capripoxvirus. También se ha descrito la detección del genoma usando cebadores específicos del capripoxvirus que corresponden a los genes que codifican las proteínas responsables de la fusión y de la unión. Pruebas serológicas: La prueba de neutralización vírica representa la técnica serológica más específica, pero, debido a que la inmunidad a la infección por la DNC es fundamentalmente de tipo celular, el ensayo no es lo suficientemente sensible como para identificar animales que han tenido contacto con el virus productor de la DNC y que han desarrollado solo bajos niveles de anticuerpo neutralizante. Las pruebas de inmunodifusión en gel de agar y las de inmunofluorescencia indirecta son menos específicas debido a reacciones cruzadas con anticuerpos frente a otros poxvirus. La técnica Western blot utilizando la reacción entre el antígeno P32 del virus de la DNC con sueros problema es sensible y específica, pero de realización difícil y costosa. El uso de este antígeno,

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Capítulo 2.1.7. — Dermatosis nodular contagiosa

expresado por un vector adecuado, en un enzimoinmunoensayo ofrece perspectivas para constituir una técnica serológica aceptable y estandarizada. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Todas las cepas de capripoxvirus examinadas hasta la fecha, bien sean derivadas de ganado vacuno, ovino o caprino, comparten antígenos inmunizantes. Se han empleado como vacunas vivas cepas atenuadas de origen bovino y cepas derivadas de ovejas y cabras.

A. INTRODUCCIÓN La dermatosis nodular contagiosa de los bóvidos (DNC) se detectó primero en Zambia en 1928, extendiéndose a Botswana en 1943 (15), y luego a Sudáfrica, donde infectó a más de ocho millones de cabezas de ganado causando importantes pérdidas económicas. En 1957 alcanzó a Kenia, asociada a un brote de viruela ovina (24). En 1970, la DNC se extendió hacia el norte por Sudán, y en 1974 se extendió al oeste alcanzando Nigeria, siendo descrita en Mauritania, Mali, Ghana y Liberia en 1977. Otra epizootia de DNC afectó entre 1981 y 1986 a Tanzania, Kenia, Zimbabwe, Somalia y Camerún, con un nivel de mortalidad del 20% en el ganado infectado. Sin embargo la verdadera dimensión de esta epizootia no está clara y probablemente afectó a un área considerable de África central. En 1988, la DNC se estableció en Egipto, y en 1989 se describió en Israel un único brote. La DNC debe ser considerada como una enfermedad potencialmente capaz de establecerse fuera de África. El método principal de transmisión es mecánico por medio de artrópodos vectores (6, 9). La gravedad de los signos clínicos de la DNC (Dermatosis nodular contagiosa), o DNC (Lumpy skin, Neethling o knopvelsiekte), depende de la cepa de capripoxvirus y de la raza del hospedador. Bos taurus es más susceptible a la enfermedad que Bos indicus; también se ha descrito que el búfalo asiático es susceptible. Dentro de Bos taurus, la raza Channel Island de piel fina desarrolla una enfermedad mas grave, siendo los terneros lactantes los que presentan mas riesgo. No obstante, incluso dentro de grupos de ganado de la misma raza mantenidos juntos en las mismas condiciones, existe una amplia variación en cuanto a los signos clínicos presentes, que varía desde una infección subclínica hasta la muerte (7). Puede darse el caso de imposibilidad de infección de un grupo entero por el virus, en función de la prevalencia del vector. En animales con infección aguda, se presenta fiebre inicial, que puede superar los 41°C y persistir durante una semana. El período de incubación en condiciones de campo no se ha descrito, pero, después de una inoculación, es de 6–9 días hasta la aparición de la fiebre. Aparece rinitis y conjuntivitis, y en ganado lechero se produce una reducción notable en la producción. Se desarrollan nódulos de 2–5 cm de diámetro por todo el cuerpo, en especial por la cabeza, cuello, ubres y periné. Estos nódulos afectan a la dermis y a la epidermis e inicialmente pueden exudar suero, aunque en las siguientes dos semanas se convierten en tapones necróticos que atraviesan todo el grosor de la piel. Todos los nódulos linfáticos superficiales aumentan de tamaño, los miembros se vuelven edematosos y el animal tiende a no moverse. Los nódulos que aparecen en las membranas mucosas de los ojos, la nariz, la boca, el recto, las ubres y los genitales se ulceran rápidamente, y por entonces todas las secreciones contienen virus DNC. Con la aparición de los signos clínicos, las descargas nasales y oculares se vuelven mucopurulentas y puede aparecer queratitis. También se desarrollan nódulos en la boca, tejido subcutáneo y en el músculo, en la tráquea y tracto alimentario, sobre todo en el abomaso, y en los pulmones, desembocando en una neumonía primaria y secundaria. Las vacas preñadas pueden abortar, y se han descrito abortos con fetos cubiertos de nódulos. Los toros pueden quedar estériles de modo permanente o temporal. La recuperación de la infección grave es lenta; el animal queda extenuado, puede presentar neumonía y mamitis, y los tapones necróticos de la piel, que pueden haber sido objeto de ataque por las moscas, se eliminan dejando profundos huecos en la piel (21). El virus de la DNC no se transmite a humanos.

B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO 1.

Identificación del agente

•

Recogida de muestras, envío y preparación

El material para aislamiento del virus y detección del antígeno debe recogerse de los nódulos de la piel, lesiones pulmonares o nódulos linfáticos mediante biopsia o post–mortem. Las muestras para aislamiento de virus y la detección de antígeno por enzimoinmunoensayo (ELISA) se deberían recoger en la primera semana de aparición de los síntomas clínicos, antes de que se desarrollen anticuerpos neutralizantes (12). Las muestras para detección genómica por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) pueden obtenerse cuando los anticuerpos neutralizantes ya estan presentes. No obstante, la presencia de virus se puede evidenciar hasta transcurridos 35 días en lesiones antiguas. También se puede usar para aislar el virus la capa pardusca que aparece en la sangre

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Capítulo 2.1.7. — Dermatosis nodular contagiosa

mantenida en heparina o EDTA (ácido etilén diamino tretraacético) durante la fase virémica del DNC (antes de la generalización de las lesiones o dentro de los 4 días de la generalización). Las muestras para histología deben incluir tejido del área adyacente y han de ser colocadas inmediatamente después su recogida en formalina al 10% en un volumen 10 veces superior al volumen de la muestra. Los tejidos con formalina no necesitan requisitos especiales de transporte. Las muestras de sangre con anticoagulante para el aislamiento de virus a partir de la capa pardusca deben colocarse inmediatamente en hielo y procesarse tan pronto como sea posible. En la práctica, las muestras pueden mantenerse a 4°C hasta 2 días antes de su posterior manipulación, pero no deberían congelarse ni mantenerse a temperatura ambiente. Los tejidos para aislamiento de virus y detección de antígeno deben mantenerse a 4°C, en hielo o a –20°C. Si resulta necesario transportar las muestras a grandes distancias sin refrigeración, el medio debe contener glicerol al 10%; las muestras deben de ser de un tamaño suficiente para que el medio no penetre durante el transporte la parte central de la biopsia, que debería usarse para el aislamiento de virus. El material para histología debe prepararse por técnicas estándar y teñirse con hematoxilina y eosina (H&E) (2). El material de las lesiones para aislamiento de virus y detección de antígeno se trocea usando tijeras y pinzas estériles y luego se pulveriza a mano en un mortero estéril con arena estéril y un volumen igual de tampón fosfato salino (PBS) también estéril que contiene penicilina sódica (1.000 unidades internacionales [UI]/ml, sulfato de estreptomicina (1 mg/ml), micostatin (100 UI/ml) o fungizona (2.5 µg/ml) y neomicina (200 UI/ml). La suspensión se congela y descongela tres veces y luego se clarifica parcialmente mediante centrifugación usando una centrífuga de mesa a 600 g durante 10 minutos. Las capas de color pardusco se preparan a partir de sangre no coagulada por centrifugación a 600 g durante 15 minutos, y la capa se extrae con cuidado usando una pipeta Pasteur estéril y se lleva a 5 ml de agua fría doblemente destilada. Después 30 segundos se añaden 5 ml de medio de crecimiento frío a doble concentración y se mezcla. La mezcla se centrifuga a 600 g durante 15 minutos, se elimina el sobrenadante y el precipitado sedimento celular se suspende en 5 ml de medio de crecimiento, como medio Eagle modificado de Glasgow (GMEM). Después centrifugar a 600 g otros 15 minutos, el precipitado sedimento resultante se resuspende en 5 ml de CMEM fresco. Alternativamente, la capa pardusca se puede separar de una muestra con heparina utilizando un gradiente de Ficoll.

a)

Cultivo El virus de la DNC crecerá en cultivos de tejidos de origen bovino, ovino o caprino, aunque se considera que los cultivos primarios y secundarios de células de testículo de cordero (LT) son las más adecuadas, especialmente las procedentes de la raza ovina de lana. La muestra se prepara como antes, es decir, 1 ml de sobrenadante clarificado o de la capa pardusca se inocula en un frasco de cultivo de 25 cm2 a 37°C y se permite la absorción durante 1 hora. El cultivo se lava luego con PBS caliente y se recubre con 10 ml de un medio adecuado, como GMEM, que contenga antibióticos y 2% de suero fetal bovino. Si se dispone de ellos, también se infectan tubos de cultivo de tejidos que contengan células LT y un cubreobjetos, o portaobjetos para cultivo de tejidos. Los frascos de cultivo se examinan diariamente durante 14 días para observar el efecto citopático (ECP) y se reemplaza el medio cuando aparece turbio. Las células infectadas desarrollan un ECP característico que consiste en la retracción de la membrana celular de las células adyacentes, y en un eventual redondeamiento de las células y la marginación de la cromatina nuclear. Al principio sólo se ven pequeñas áreas de ECP, a veces tan sólo a los 2 días después de la infección; en los siguientes 4–6 días las áreas se extienden hasta abarcar toda la lámina de células. Si no aparece ECP después 14 días, el cultivo se debe congelar y descongelar tres veces, y el sobrenadante clarificado se inocula en un cultivo fresco de células LT. Al primer signo de ECP en los frascos, o antes si se usan cubres infectados, se toma un cubre, se fija con acetona y se tiñe con H&E. La presencia de cuerpos de inclusión citoplasmáticos que sean eosinofílicos, variables en tamaño pero que pueden ser como la mitad del núcleo y rodeados por un halo claro, constituye un diagnóstico de infección por poxvirus. El ECP se puede evitar o retrasar incluyendo en el medio un antisuero específico anti–DNC. El herpesvirus o el virus seudo–DNC producen un cuerpo de inclusión intranuclear de tipo Cowdry A. La formación de sincitios no es una característica de la infección por capripoxvirus, a diferencia del herpesvirus que causa la seudo–DNC. Algunas cepas de capripoxvirus que causan DNC se han adaptado para crecer en la membrana corioalantoidea de huevos de gallina embrionados y en células de riñón de mono verde africano (células Vero). Esto no es recomendable para el aislamiento primario. •

Microscopía electrónica

Antes de la centrifugación, el material de la suspensión de la biopsia original se prepara para su examen en el microscopio electrónico de transmisión colocando una rejilla hexagonal de malla 400 para microscopía electrónica, cubierta con una película de carbón activado por descarga en vapor de pentilamida, sobre una gota de la suspensión colocada sobre parafina o una placa de cera. Después de 1 minuto, la rejilla se transfiere a una gota de tampón Tris/EDTA, pH 7,8, durante 20 segundos y luego a una gota de ácido fosfotúngstico al 1%, pH 7.2, durante 10 segundos. La rejilla se deseca con papel de filtro, se seca al aire y

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se coloca en el microscopio electrónico. El virión del capripoxvirus tiene forma de ladrillo, está cubierto por cortos elementos tubulares y mide aproximadamente 290 x 270 nm. Una membrana que procede de la célula hospedadora puede rodear algunos de los viriones, y se deben examinar tantos como sea posible para confirmar su aparición (19). Los viriones de los capripoxvirus no se diferencian de los de los ortopoxvirus, pero, aparte del virus vacunal y del virus de la viruela, que no son comunes en el ganado y no causan infección generalizada, ningún otro ortopoxvirus causa lesiones en el ganado vacuno. No obstante, el virus vacunal puede causar infección generalizada en terneros jóvenes inmunocomprometidos. Por el contrario, los ortopoxvirus son una causa corriente de enfermedades cutáneas en el búfalo doméstico originando la viruela del búfalo, una enfermedad que normalmente se manifiesta con lesiones de varioliformes en los pezones, pero que también puede causar lesiones cutáneas en otros sitios, como el periné, la zona media de los muslos y la cabeza. Los ortopoxvirus que causan la viruela del búfalo no pueden distinguirse fácilmente por microscopía electrónica de los capripoxvirus. Los viriones de los parapoxvirus que producen la estomatitis papular bovina y la seudoviruela son mas pequeños, de tamaño oval y cada uno está cubierto por un único elemento tubular continuo que aparenta formar estriaciones sobre el virión. El capripoxvirus es también distinto del herpevirus que provoca la seudo–DNC (Allerton– mamitis herpética).

b)

Métodos inmunológicos •

Pruebas con anticuerpos fluorescentes

El antígeno del capripoxvirus puede también identificarse en los cubres infectados o en los portas de cultivo de tejidos usando pruebas con anticuerpos fluorescentes. Los cubres o los portas deben estar lavados y secos y fijados en acetona fría durante 10 minutos. El método indirecto, en el que se utilizan sueros de ganado inmune, presenta mucho color de fondo y reacciones no específicas. Sin embargo, se puede preparar un conjugado directo a partir de sueros de ganado vacuno enfermo (o de ovejas o cabras enfermas por el capripoxvirus) o a partir de conejos hiperinmunizados con capripoxvirus purificado. Se debe incluir un cultivo de tejidos no infectado como control negativo ya que pueden causar problemas las reacciones cruzadas, debidas a la presencia de anticuerpos contra el cultivo celular. •

Inmunodifusión en gel de agar

Se ha usado una prueba de inmunodifusión en gel de agar (IGDA) para detectar el antígeno precipitante del capripoxvirus, pero tiene la desventaja de que este antígeno también lo presentan los parapoxvirus. Se prepara agarosa (al 1%) en tampón borato, pH 8,6, se calienta para disolver, y se vierten 2 ml en un porta (76 x 26 mm). Cuando el agar se solidifica, se cortan pocillos sobre él para originar una roseta de seis pocillos alrededor de un pocillo central. Cada pocillo tiene 5 mm de diámetro y debe haber una distancia de 7 mm entre el centro del pocillo central y el centro de cada pocillo periférico. Los pocillos se llenan del siguiente modo: a tres pocillos periféricos se añaden 10 µl de la suspensión al 10% a partir de las lesiones, alternando con pocillos que contengan controles positivos de antígeno, mientras que al pocillo central se añaden 10 µl de suero control positivo contra capropoxvirus. Los portas se colocan en una cámara húmeda a temperatura ambiente durante 48 horas , y se examinan para ver líneas de precipitación con un transiluminador. El material ensayado es positivo si aparece una línea de precipitación con el suero control que resulta confluente con la producida por el control positivo de antígeno. Para preparar el antígeno para la prueba IGDA, se toman dos frascos de cultivo de 125 cm2 con células LT, se infecta uno con el capripoxvirus y se recoge cuando presenta un 90% de ECP (8–12 días). El frasco se congela y descongela dos veces, y las células se agitan para que se liberen de la superficie del frasco. El contenido se centrifuga a 4.000 g durante 15 minutos, la mayor parte del sobrenadante se decanta y se guarda, y el precipitado se resuspende en el resto de sobrenadante. Las células se lisan usando un dispositivo de ultrasonicación durante aproximadamente 60 segundos. Este homogenado se centrifuga luego como antes, y el sobrenadante resultante se mezcla con el anteriormente obtenido. El sobrenadante conjunto se añade a continuación a un volumen idéntico de sulfato amónico saturado a pH 7,4 y se deja a 4°C durante 1 hora. Esta solución se centrifuga a 4.000 g durante 15 minutos, y se recoge el precipitado resuspendiéndolo en un pequeño volumen de solución salina al 0.8% para su uso en la prueba IGDA. El frasco no infectado se somete al mismo procedimiento para obtener un control de antígeno del cultivo de tejidos (18). •

Enzimoinmunoensayo

Después la clonación de la proteína estructural P32 del capripoxvirus que es muy antigénica, es posible usar el antígeno recombinante expresado para la producción de reactivos diagnósticos, incluyendo la obtención de antisuero policlonal monoespecífico contra P32 y la producción de anticuerpos monoclonales (Mabs). Estos reactivos han facilitado el desarrollo de un ELISA altamente específico. Utilizando antisuero de conejo hiperinmune, obtenido mediante inoculación a conejos de capripoxvirus purificado, el antígeno del virus presente en suspensiones de biopsias o en sobrenadantes de cultivo de tejidos puede ser

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inmovilizado en una placa de ELISA. La presencia del antígeno puede así demostrarse utilizando suero de cobaya, producido contra el grupo específico de la proteína estructural P32, inmunoglobulina anti–cobaya comercial obtenida en conejo conjugada con peroxidasa de rábano y una solución de substrato cromogénico.

c)

Métodos de reconocimiento de ácidos nucleicos Mediante técnicas serológicas no es posible distinguir entre cepas de capripoxvirus de ganado vacuno, ovejas o cabras. Sin embargo, se pueden caracterizar las cepas comparando los fragmentos genómicos que se generan mediante digestión con el enzima HindIII a partir de sus ADN purificados (1,3,17). Esta técnica ha establecido diferencias entre aislamientos realizados en diferentes especies, pero no son sólidas y existe evidencia de la existencia de movimiento de cepas entre especies distintas y de recombinación de cepas en condiciones naturales (14). Se puede utilizar PCR para detectar el genoma del capripoxvirus en muestras de biopsias o de cultivo de tejidos. Los cebadores para los genes correspondientes a las proteínas víricas de unión y de fusión son específicos para capripoxvirus, y la naturaleza de los productos obtenidos por PCR se puede confirmar usando los sitios reconocidos por enzimas de restricción (16). El genoma del virus productor de la DNC contiene unos 156 genes (23).

2.

Pruebas serológicas

a)

Neutralización de virus Un suero problema se puede titular frente a una concentración constante de capripoxvirus (100 DICT50 [50% dosis infectiva en cultivo de tejidos]) o bien una cepa estándar de virus se puede titular frente a una dilución constante del suero problema para calcular el índice de neutralización. Debido a variaciones en la sensibilidad del cultivo de tejidos a los capripoxvirus, y la consiguiente dificultad en asegurar el uso de 100 DICT50 , el método preferido es el índice de neutralización. El método se describe usando una placa de microtitulación para cultivo de tejidos con 96 pocillos de fondo plano, pero puede realizarse igualmente en tubos de cultivo de tejidos con los cambios de volumen adecuados, aunque resulta más difícil determinar en tubos los resultados de punto final. Se ha descrito que el uso de células Vero en el ensayo de neutralización del virus suministra resultados más repetitivos. •

Procedimiento del ensayo

i)

Los sueros problema, incluyendo un control positivo y un control negativo, se diluyen al 1/5 con medio Eagle/HEPES (N–2–hidroxietilpiperazina, ácido N–2–etanosulfónico) y se inactivan a 56°C durante 30 minutos.

ii)

A continuación, se añaden 50 µl del primer suero inactivado a los pocillos de las columnas 1 y 2 , de las filas A hasta la H, en la placa de microtitulación. El segundo suero se coloca en las columnas 3 y 4, el tercero en las columnas 5 y 6, el control de suero positivo en las columnas 7 y 8, el control de suero negativo en las columnas 9 y 10, y se añaden 50 µl de Eagle/HEPES sin suero en las columnas 11 y 12 y a todos los pocillos de la fila H.

iii)

Una cepa de referencia de capripoxvirus, normalmente una cepa vacunal que se sepa que crece bien en cultivo de tejidos, y con un título superior a 6 log10 DICT50 por ml se diluye con Eagle/HEPES en pequeños recipientes para dar una dilución seriada de 5.0; 4.0; 3.5; 3.0; 2.5; 2.0; 1.5 log10 DICT50 por ml (equivalente a 3.7; 2.7; 2.2; 1.7; 1.2; 0.7; 0.2 log10 DICT50 por 50 µl).

iv)

Comenzando por la fila G y la preparación de virus más diluida, se añaden 50 µl de virus a cada pocillo de esa fila. Esto se repite con cada dilución de virus, colocando la dilución de virus de titulación mayor en la fila A.

v)

Las placas se cubren y se incuban 1 hora a 37°C.

vi)

A partir de monocapas crecidas con anterioridad se preparan células LT en una suspensión que contenga 105 células/ml en medio Eagle con antibióticos y 2% de suero fetal bovino. Después incubar las placas de microtitulación, se añaden 100 µl de la suspensión celular a todos los pocillos excepto a los pocillos H11 y H12, que sirven como control para el medio. El resto de los pocillos de la fila H son los controles de las células y del suero.

vii)

Las placas de microtitulación se cubren e incuban a 37°C por 9 días.

viii) Utilizando un microscopio invertido, las monocapas se examinan diariamente a partir del día 4 para observar ECP. No debería apreciarse ECP en las células de la fila H. Utilizando la cepa vacunal 0240 KSGP de capripoxvirus, la lectura final se hace al día 9, y el título del virus en cada titulación por duplicado se calcula según Kärber (1931). Si se deja más tiempo, aparece de modo invariable un

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aumento de virus debido a que el virus que fue en principio neutralizado parece disociarse del anticuerpo. ix)

Interpretación de los resultados: El índice de neutralización es el logaritmo del título de la diferencia entre el título del virus en el suero negativo y en el suero problema. Un índice > 1.5 se considera positivo. El ensayo se puede hacer más sensible si se examina el suero del mismo animal antes y después de la infección. Debido a que la inmunidad a los capropoxvirus está predominantemente mediada por células, un resultado negativo, en especial después una vacunación en que la respuesta es necesariamente suave, no implica que el animal del que deriva el suero no está protegido. Se ha descrito un método con virus–constante y suero–variable empleando diluciones de suero del orden de 1/5 a 1/500 y células de músculo fetal bovino. Como estas células tienen menor sensibilidad al capripoxvirus que las células LT, se evita el problema del aumento de virus cuando el ensayo se deja más tiempo. Los anticuerpos al capripoxvirus se pueden detectar a los dos días de la aparición de los síntomas clínicos. Permanecen detectables durante unos 7 meses, pero normalmente se aprecia el título más alto entre los días 21 y 42.

b)

Inmunodifusión en gel de agar La prueba IGDA no es recomendable como prueba serológica en el diagnóstico de la DNC por la reacción cruzada con anticuerpos contra los virus de la estomatitis papular bovina y de la seudoviruela. Una consecuencia de estas reacciones cruzadas es la aparición de resultados positivos falsos. La escasa sensibilidad de la prueba también puede conducir a resultados negativos falsos.

c)

Prueba de inmunofluorescencia indirecta Para la prueba de inmunofluorescencia indirecta se puede usar un cultivo de tejidos infectado por capripoxvirus crecido sobre cubres o sobre portas de los usados en microscopía. Se debe incluir en la prueba un cultivo de tejidos no infectado, así como un control de suero positivo y negativo. Los cultivos infectados y el control se fijan en acetona a –20°C durante 10 minutos y se mantienen a 4°C. Las diluciones del suero problema se realizan en PBS, empezando a 1/20 o 1/40, y los positivos se identifican usando una gamma–globulina anti–bovina conjugada con isotiocianato de fluoresceína. El título de anticuerpos puede superar 1/1000 después la infección. Los sueros pueden ser probados a 1/50 y 1/500. Pueden existir reacciones cruzadas con el virus orf (dermatitis pustular contagiosa de la oveja), el de la estomatitis papular bovina y quizás con otros poxvirus.

d)

Análisis Western blot La técnica de Western blot realizada con sueros problema frente a lisados de células infectadas por capripoxvirus representa un sistema sensible y específico para detectar anticuerpos contra las proteínas estructurales del capripoxvirus, aunque la prueba resulta costosa y difícil de realizar. Las células LT infectadas por capripoxvirus deben recogerse cuando se aprecia un 90% de ECP, se congelan y descongelan tres veces, y los restos celulares se sedimentan por centrifugación. El sobrenadante se decanta, y las proteínas se preparan para separación por SDS/PAGE (dodecil sulfato sódico/electroforesis en gel de poliacrilamida). Se recomienda un sistema vertical de gel discontinuo, usando gel concentrador con acrilamida al 5% en Tris (125 mM), pH 6,8 y SDS (0,1%), y gel de resolución con acrilamida (10–12.5%) en Tris (560 mM), pH 8,7, y SDS (0,1%), empleando como tampón de desarrollo un tampón de glicina conteniendo Tris (250 mM), glicina (2M), y SDS (0.1 M). Las muestras de sobrenadante se preparan por ebullición durante 5 minutos con un tampón de lisis apropiado antes de su carga en la electroforesis. Alternativamente, el antígeno derivado del cultivo de tejidos puede ser reemplazado por virus purificados o por antígenos recombinantes. Se deben correr en paralelo con las proteínas de la muestra una serie de marcadores de peso molecular. Las proteínas separadas en el gel después la SDS/PAGE se transfieren electroforéticamente a una membrana de nitrocelulosa (NCM). Después de la transferencia, la NCM se lava exhaustivamente con PBS y se bloquea con 3% de seroalbúmina bovina (BSA) en PBS, o con 5% de leche en polvo desnatada en PBS, en un agitador rotatorio a 4°C durante toda la noche. A continuación, la NCM se puede trocear empleando un aparato comercial para permitir el ensayo simultáneo de múltiples muestras de suero, o se puede cortar en tiras y cada una de ellas incubarse luego por separado. La NMC se lava cuidadosamente con cinco cambios de PBS durante 5 minutos en un agitador rotatorio y luego se incuba a temperatura ambiente durante 1,5 horas en un agitador con el suero apropiado a una dilución 1/50 en tampón

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bloqueante (3% BSA y 0.05% de Tween 20 en PBS; o 5% de leche en polvo desnatada y 0,05% de Tween 20 en PBS). La membrana se lava de nuevo exhaustivamente y se incuba (en tampón bloqueante) con anti–inmunoglobulinas de la especie conjugadas con peroxidasa de rábano a una dilución determinada por la titulación. Después una incubación posterior a temperatura ambiente durante 1,5 horas, se lava la membrana y se añade una solución de tetrahidrocloruro de diaminobenzidina (10 mg en 50 ml de 50mM Tris-HCl, pH 7,5, y 20 µl de peróxido de hidrógeno al 30% [v/v]). Esto se incuba luego durante aproximadamente 3–7 minutos a temperatura ambiente en un agitador con observación constante, y la reacción se detiene lavando con PBS antes de que se desarrolle un excesivo color de fondo. En cada ocasión se debería usar un suero negativo y positivo como control. Las muestras que se consideran positivas en el ensayo y el control positivo producirán un modelo de bandas que corresponde a la reacción frente a proteínas de peso molecular 67, 32, 26, 19 y 17 kDa –que son las principales proteínas estructurales del capripoxvirus– mientras que las muestras de suero negativo no reaccionarán conforme a este modelo. Un suero hiperinmune preparado contra parapoxvirus (estomatitis papular bovina, seudoviruela) reaccionará con algunas de las proteínas de capripoxvirus, pero no con la proteína de 32 kDa que es específica de capripoxvirus.

e)

Enzimoinmunoensayo Se ha desarrollado una técnica ELISA para capripoxvirus usando la proteína estructural expresada P32 del capripoxvirus y Mabs obtenidos contra la proteína P32 (8).

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO Se han usado dos cepas atenuadas de capripoxvirus como vacunas para el control específico de la DNC (3, 4): una cepa de poxvirus de oveja y cabra de Kenia mantenida en cultivo durante 18 pases en células LT o células de músculo fetal bovino, y una cepa de Sudáfrica, después 60 pases de cultivo en células de riñón de cordero y 20 pases en membrana corioalantoidea de huevos embrionados de gallina. Todas las cepas de capripoxvirus examinadas hasta la fecha, bien sean de origen bovino, ovino o caprino, comparten un sitio común de neutralización, de modo que los animales que se recuperan de la infección por una cepa se hacen resistentes a la infección por cualquier otra cepa. Por ello, es posible proteger al ganado contra la DNC utilizando cepas de capripoxvirus procedentes de ovejas o cabras (10). En 1989 y 1990 la cepa Rumana de la vacuna de la viruela ovina se empleó para ayudar a controlar el brote de la DNC en Egipto (20). Sin embargo, resulta esencial realizar ensayos controlados antes de introducir una cepa vacunal no utilizada normalmente en el ganado, sobre todo cuando se usan las razas más susceptibles en el período de lactancia. La protección después la vacunación es probablemente duradera, pero a medida que la inmunidad desaparece, puede ocurrir una replicación localizada de capripoxvirus en el lugar de inoculación, aunque el virus no llegará a tener una extensión generalizada. Las dos cepas de capripoxvirus que se han utilizado rutinariamente como vacunas pueden producir una fuerte reacción local en el sitio de inoculación en razas de Bos taurus, que algunos propietarios consideran inaceptable. Esto ha desalentado el uso de vacunas pese a que las consecuencias de un brote de la DNC son con seguridad mas graves. Se está desarrollando una nueva generación de vacunas que emplea el genoma de los capripoxvirus como un vector para genes de otros patógenos de rumiantes, por ejemplo genes de los virus de la peste bovina y de la peste de pequeños rumiantes. La vacuna recombinante proporcionará protección contra la DNC y contra la peste bovina mediante una única vacunación (22).

1.

Control del inóculo

a)

Características del inóculo La cepa de capripoxvirus usada en la producción de vacunas debe estar acompañada de una historia que recoja su origen y sus pases en cultivo de tejidos o en animales. Debe ser segura en cuanto a su uso en todas las razas de ganado en las que se pretende emplearla, incluyendo animales gestantes. También debe ser no transmisible, permanecer atenuada después posteriores pases en cultivo de tejidos, y proporcionar una protección completa frente al desafío de cepas virulentas naturales durante un mínimo de 1 año. Se debe preparar y almacenar una cantidad de inóculo original del virus vacunal para disponer de inóculos de trabajo repetitivos para la producción regular de la vacuna.

b)

Método de cultivo El inóculo de vacuna debe ser liofilizado y guardado en viales de 2 ml a –20°C. Se puede guardar en estado húmedo a –20°C, pero entonces es más estable a –70°C o a temperatura inferior. Para un rendimiento

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Capítulo 2.1.7. — Dermatosis nodular contagiosa

óptimo, el virus debería ser cultivado en cultivos primarios o secundarios de células LT procedentes de oveja de lana. También pueden emplearse células Vero.

c)

Validación como vacuna Los lotes de inóculo deben ser: i)

Puros: Libres de virus ajenos, en particular de pestivirus, tal como los virus de la enfermedad de la frontera y de la diarrea vírica bovina, y libres de contaminación por bacterias, hongos y/o micoplasmas.

ii)

Seguros: Producir una reacción clínica mínima en todas las razas de ganado cuando se administran por la vía recomendada.

iii)

Eficaces: Estimuladores de inmunidad completa frente a la DNC en todas las razas de ganado durante al menos 1 año.

Las pruebas necesarias se describen en la Sección C.4.

2.

Método de producción

Los lotes de vacuna se producen en monocapas frescas de cultivos secundarios de células LT. Se reconstituye un vial de inóculo con GMEM y se inocula sobre una monocapa de células LT que previamente se ha lavado con PBS templado, y se permite la absorción durante 15 minutos a 37°C antes de añadir más GMEM. Después 4– 6 días, se apreciará un ECP generalizado (50–70%). El cultivo se congela y descongela tres veces, y se extrae la suspensión centrifugándola a 600 g durante 20 minutos. Antes de la recogida, se debe examinar el cultivo para detectar cualquier evidencia de ECP no específica, turbidez del medio o cambio en el pH del medio. Se puede necesitar un segundo pase para producir el virus suficiente para formar un lote productivo (para obtener 106 dosis se necesita la producción de 5 frascos de cultivo de 175 cm2). El proceso se repite y las cosechas de frascos numerados individualmente se mezclan cada una por separado con un volumen igual de 5% de hidrolizado de lactoalbúmina estéril y 10% de sacarosa, y se transfieren a botellas con numeración individual para almacenamiento a –20°C. Antes de la conservación, se retiran 0,2 ml de cada botella para control de esterilidad. Se extraen otros 0,2 ml adicionales; se obtiene una mezcla de 2 ml para uso en titulación de virus, a partir de muestras de 0,2 ml tomadas de 10 botellas. Se debe llevar un registro escrito de todos los procedimientos para todos los lotes de vacunas.

3.

Control interno

Células: Las células deben proceder de los testículos de corderos jóvenes sanos de una manada de ovejas de lana que esté exenta de priones (scrapie). Normalmente se suelen subcultivar con éxito hasta diez veces. Cuando se usan para producción de vacunas, se deben crecer en paralelo cultivos control no infectados que se mantienen durante al menos un pase adicional para observación posterior. Deben ser analizados para descartar la presencia de cepas no citopáticas de virus de la diarrea vírica bovina o de la enfermedad de la frontera mediante técnicas de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa. Si resulta posible, se deben preparar y analizar las células antes de la producción de vacunas, y mantener un stock estéril en DMSO (dimetil sulfóxido) conservado en nitrógeno líquido (alícuotas de 1–2 ml conteniendo 20 x 106 células /ml). El suero empleado en el medio de crecimiento debe carecer de anticuerpos frente a capripoxvirus y de contaminación con pestivirus. Virus: El inóculo de virus y la vacuna final deben valorarse en tubos de cultivo de tejidos o placas de microtitulación. La dosis de campo mínima recomendada de las vacunas de Kenia y de Sudáfrica es 3,5 log10DICT50, aunque la dosis protectora mínima es 2,0 log10 DICT50. El capripoxvirus es muy susceptible a la inactivación por la luz solar, y se deben tomar medidas para evitar la pérdida de actividad en condiciones de campo. La dosis de campo recomendada en bóvidos para la vacuna Rumana de viruela ovina es 2,5 log10dosis infectivas en la oveja (SID50), y la dosis recomendada para bóvidos de la cepa adaptada RM65 de la vacuna Rumana de la viruela ovina es 3 log10DICT50 (11). Se deben examinar muestras de vacunas para descartar la presencia de virus no deseados incluyendo cepas citopáticas y no citopáticas de pestivirus, y se deberían mezclar con un suero inmune de alto título frente a capripoxvirus que se haya visto antes que sea negativo para anticuerpos frente a pestivirus, a fin de evitar que el virus mismo de la vacuna interfiera en la prueba. La vacuna puede mantenerse a –20°C hasta que se completen

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Capítulo 2.1.7. — Dermatosis nodular contagiosa

todas las pruebas de esterilidad y de titulación, y después debe ser liofilizada. Se realiza una titulación posterior en cinco viales de las preparaciones liofilizadas escogidas al azar para confirmar el nivel de virus.

4.

Control de lotes

a)

Esterilidad Las pruebas para esterilidad y ausencia de contaminación con otros materiales biológicos pueden encontrarse en el Capítulo I.1.5.

b)

Seguridad y eficacia Seis cabezas de ganado de sensibilidad a la DNC conocida se confinan en una unidad animal amplia de alto nivel de contención y se recogen muestras de suero. Cinco viales escogidos al azar de la vacuna liofilizada se reconstituyen con PBS estéril y se mezclan. Dos cabezas se inoculan con 100 veces la dosis de campo de la vacuna, el resto de la vacuna se diluye con PBS estéril y se inoculan subcutáneamente dos cabezas de ganado con la dosis de campo recomendada. Las restantes dos cabezas son los animales control. Los animales se examinan clínicamente todos los días y se anotan sus temperaturas rectales. El día 21 después la inoculación se toman de nuevo muestras de suero y se infectan mediante inoculación intradérmica con una cepa virulenta conocida de capripoxvirus. Se anota la respuesta clínica durante los siguientes 14 días. Los animales control deberían desarrollar los síntomas clínicos típicos de la DNC, mientras que no debería haber reacción sistémica o local en los vacunados, excepto una reacción de hipersensibilidad tardía, que debe desaparecer a los 4 días. Se toman de nuevo muestras de suero a los 30 días de la vacunación. Las muestras de suero del día 21 se analizan para detectar seroconversión respecto a enfermedades víricas seleccionadas que pudieran haber contaminado la vacuna, y las muestras de los días 0 y 30 se comparan para confirmar la ausencia de anticuerpos frente a pestivirus. Debido a la variable respuesta del ganado a la infección por la DNC, puede no observarse una enfermedad generalizada en los animales control, aunque debería presentarse una amplia reacción local. La vacuna totalmente reconstituída también se prueba en ratones y cobayas. Dos cobayas se inoculan intramuscularmente con 0,5 ml en la pata trasera, y dos cobayas y seis ratones se inoculan intraperitonealmente con 0,5 ml y 0,1 ml, respectivamente. Otros dos cobayas y cuatro ratones se mantienen como controles no inoculados. Los animales se observan durante tres meses, se sacrifican y se realiza un examen. No debería haber evidencia de patología debida a la vacuna.

c)

Pruebas de potencia Las pruebas de potencia en el ganado deben realizarse para cepas vacunales de capripoxvirus si no se conoce la dosis mínima inmunizante. Esto se lleva a cabo normalmente comparando el título de un virus de prueba en el costado de animales vacunados y de animales control. Después de la vacunación, los flancos de al menos tres animales y tres controles se afeitan para eliminar el pelo. Se preparan diluciones logarítmicas decimales del virus prueba en PBS estéril y se inoculan intradérmicamente seis diluciones (0,1 ml por inóculo) a lo largo de la longitud del costado; cuatro réplicas de cada dilución se inoculan más abajo del costado. Se desarrollará un hinchamiento edematoso posiblemente en todos los 24 puntos de inoculación en los animales control, aunque habrá poca o nula reacción en los cuatro sitios de los inóculos más diluídos. Los animales vacunados deben desarrollar una reacción inicial de hipersensibilidad en los sitios de inoculación a las 24 horas, que remiten con prontitud. Pueden aparecer pequeñas áreas de necrosis en el sitio de inoculación del virus de prueba más concentrado. Se calcula el título del virus prueba para animales vacunados y animales control; una diferencia > 2.5 log10 en el título logarítmico se considera como evidencia de protección.

d)

Duración de la inmunidad Después la vacunación, la inmunidad frente al virus natural virulento dura dos años con la cepa de Kenia y tres años con la vacuna de Sudáfrica, y la protección contra una infección generalizada después de inoculación intradérmica es eficaz para toda la vida. La duración de la inmunidad producida por otras cepas vacunales debe ser establecida en bóvidos realizando ensayos controlados en un medio en el que no haya posibilidad de que las cepas naturales de capripoxvirus de campo interfieran los resultados.

e)

Estabilidad Las preparaciones de vacuna la DNC adecuadamente liofilizadas, particularmente aquellas que contienen un agente protector, como sacarosa e hidrolizado de lactoalbúmina, son estables durante más de 25 años si se guardan a –20°C, y durante 2–4 años si se almacenan a 4°C. Hay evidencias de que pueden

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Capítulo 2.1.7. — Dermatosis nodular contagiosa

permanecer estables a temperaturas más elevadas, pero no se han descrito experimentos controlados de larga duración.

f)

Conservantes Las preparaciones liofilizadas no requieren mas que un conservante, como sacarosa o hidrolizado de lactoalbúmina.

g)

Precauciones (riesgos) No existen más precauciones que las descritas anteriormente para esterilidad y ausencia de agentes no deseados. Las cepas de la DNC no constituyen un riesgo para la salud humana.

5.

Pruebas sobre el producto final

a)

Inocuidad Se debe realizar pruebas de inocuidad en el producto final de cada lote como se indica en la Sección C.4.b.

b)

Potencia Una vez que se ha determinado la potencia de la cepa particular usada para la producción de vacuna en cuanto a la dosis mínima requerida para producir inmunidad, no es necesario repetir esto en el producto final de cada lote, con tal que se haya determinado el título del virus presente.

REFERENCIAS 1.

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Capítulo 2.1.7. — Dermatosis nodular contagiosa

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* * *

NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Dermatosis nodular contagiosa (ver Cuadro en la parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar la página web de la OIE para una lista actualizada: www.oie.int)

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

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CAPITULO 2.1.8.

FIEBRE DEL VALLE DEL RIFT

RESUMEN La fiebre del Valle del Rift (FVR) es una zoonosis aguda o hiperaguda de rumiantes domésticos de África. Está causada por un único serotipo de un bunyavirus del género Phlebovirus que es transmitido por mosquitos. La enfermedad se presenta en condiciones climáticas que favorecen la reproducción de los mosquitos vectores y se caracteriza por lesiones hepáticas. La enfermedad es más grave en ovejas, cabras y ganado bovino, en los que origina abortos en animales gestantes y una alta tasa de mortalidad en los recién nacidos. Los animales adultos no gestantes, aunque son susceptibles a la infección, son más resistentes a las manifestaciones clínicas de la enfermedad. Existe una amplia variación en la susceptibilidad al FVR entre animales de distinto genotipo. Aquellas razas o cepas que son exóticas en África o que proceden de áreas donde la FVR no es endémica, tienden a ser más susceptibles. Los camellos sufren una infección asintomática por FVR, pero las tasas de aborto pueden ser tan altas como en el ganado bovino. Los humanos resultan sensibles a la infección mediante contacto con material infectado o por picaduras de mosquito. La infección humana por vectores es una característica llamativa en países con una población relativamente pequeña de animales hospedadores. En tales áreas, la FVR puede manifestarse primero en humanos. Ha causado enfermedad grave en personal de laboratorio y debe ser manejado con un alto nivel de bioseguridad (13,15). Se recomienda que el personal de laboratorio esté vacunado. Identificación del agente: el virus FVR representa un único serotipo de un bunyavirus del género Phlebovirus y tiene las propiedades morfológicas y fisicoquímicas típicas de los bunyavirus. El virus tiene un genoma segmentado con ARN de una sola cadena y polaridad negativa y consta de tres segmentos: L (grande), M (medio) y S (pequeño), cada uno de los cuales está contenido en una nucleocápsida separada dentro del virión. El segmento S es un ARN de doble sentido, es decir, presenta codificación bidireccional (9). El virus se puede aislar de la sangre, recogida preferentemente con anticoagulante, durante la fase febril de la enfermedad, o del hígado, bazo y tejidos cerebrales de animales muertos o de los órganos de fetos abortados. Los aislamientos primarios se hacen normalmente en cultivos celulares de varios tipos, tales como células de riñón de mono verde africano (células Vero), células de riñón de hámster neonato, retículo de embrión de pollo (CER: células desarrolladas por Tsunemasa Motohashi en el Nippon Institute for Biological Science, Tokio, Japón) o en células primarias de origen ovino o bovino. Alternativamente, para el aislamiento primario del virus se pueden usar hámsteres, ratones adultos o lactantes, huevos de gallina embrionados o corderos de dos días de edad. Se puede efectuar un diagnóstico rápido usando como antígeno el sobrenadante de muestras homogenizadas en pruebas de neutralización vírica (NV); por tinción inmunofluorescente de frotis de hígado, bazo, cerebro o cultivos celulares infectados; o por demostración del virus en el suero tomado durante la fase febril de la enfermedad mediante enzimoinmunoensayo o por inmunodifusión. La presencia de lesiones histopatológicas características en el hígado sirve de ayuda al diagnóstico. Pruebas serológicas: Los animales infectados desarrollan anticuerpos específicos que pueden ser demostrados por NV a los 3 días después de la infección o por enzimoinmunoensayo a los 67 días, y por inhibición de la hemaglutinación. Otras pruebas serológicas menos usadas incluyen inmunofluorescencia, fijación de complemento e inmunodifusión.

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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Capítulo 2.1.8. — Fiebre del Valle del Rift

Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Las vacunas con virus vivos y los antígenos para uso en países donde FVR es endémica o en otros durante brotes epidémicos, deben prepararse a partir de cepas no patógenas de virus FVR crecidas en cultivos celulares de ratón o atenuadas por mutación. La cepa de FVR atenuada por mutación no se encuentra todavía en fase recomendable para su uso. En países que están libres del virus FVR, las vacunas y las pruebas diagnósticas deben limitarse a aquellas en las que se emplea virus inactivado. Se pueden obtener cepas adecuadas de virus en el Laboratorio de Referencia para FVR de OIE (véase Cuadro presentada en la Parte 3 de este Manual).

A. INTRODUCCIÓN La Fiebre del Valle del Rift (FVR) es una enfermedad febril zoonósica aguda o hiperaguda, transmitida por mosquitos, y causada por un virus de la familia Bunyaviridae, género Phlebovirus. Normalmente se presenta en forma epizoótica en extensas áreas de un país después de fuertes lluvias e inundaciones, y se caracteriza por altas tasas de abortos y mortalidad neonatal, principalmente en ovejas, cabras y ganado bovino. La susceptibilidad al FVR varía considerablemente en razas diferentes. Algunos animales autóctonos de África muestran sólo infecciones asintomáticas, mientras que los foráneos o de otras razas sufren una manifestación clínica grave con mortalidad y aborto. Los animales susceptibles de mayor edad no gestantes y algunas otras especies no muestran signos de enfermedad. Los camellos se han relacionado con frecuencia con las epidemias de FVR en el este de África y Egipto. La enfermedad clínica no aparece en camellos adultos, pero se presentan abortos y se han observado algunas muertes postnatales tempranas. Los síntomas de la enfermedad suelen ser poco específicos, haciendo difícil el reconocimiento de casos individuales (5-8, 16, 28). Sin embargo, es característica la existencia de numerosos abortos y de mortalidad entre animales jóvenes, junto a la enfermedad en humanos. La FVR tiene un período de incubación corto: 12-36 horas en corderos. Puede aparecer una fiebre bifásica de hasta 41°C, y la fiebre permanece alta hasta poco antes de la muerte. Los animales afectados muestran decaimiento, poca tendencia al desplazamiento o a la alimentación, y pueden presentar hinchazón en los nódulos linfáticos superficiales y dolor abdominal. Los corderos raramente sobreviven más de 36 horas tras la aparición de los signos de enfermedad. Los animales mayores de 2 semanas pueden morir con manifestaciones agudas, hiperagudas o desarrollar una infección asintomática. Algunos animales pueden regurgitar la ingesta y presentar diarrea hemorrágica o sanguinolenta de olor nauseabundo junto con descargas nasales mucopurulentas con restos de sangre. A veces se puede observar ictericia, particularmente en los bóvidos. Además de estos síntomas, el ganado adulto puede presentar lagrimeo, salivación y falta de producción láctea. En ovejas gestantes, la mortalidad y la frecuencia de aborto varían del 5% a casi el 100% en diferentes brotes y en diferentes manadas. La tasa de muerte en el ganado vacuno es normalmente inferior al 10%. Las lesiones hepáticas de la FVR son muy similares en todas las especies, variando principalmente con la edad del individuo infectado (6). Las lesiones más notables se presentan en fetos abortados y corderos recién nacidos y consisten en un aumento de tamaño moderado o grande del hígado que se presenta blando y sin consistencia, con color que varía de marrón amarillento a marrón rojizo y manchas irregulares de congestión. En el parénquima, siempre se presentan numerosos focos necróticos de color blanco grisáceo, pero que pueden no ser fácilmente discernibles. En la oveja adulta, las lesiones son menos graves y aparecen focos necróticos distribuidos por todo el parénquima de color rojizo o blanco grisáceo. Por lo general, la pared de la vesícula biliar presenta hemorragias y edema. Las lesiones hepáticas en los corderos se acompañan casi siempre de numerosas hemorragias pequeñas en la mucosa del rumen. El contenido del intestino delgado y del rumen es de color chocolate oscuro a consecuencia de la presencia de sangre parcialmente digerida. En todos los animales, el bazo y los nódulos linfáticos periféricos se inflaman, están edematosos y pueden presentar petequias. A nivel microscópico, la lesión más evidente de la FVR tanto en animales como en humanos es la necrosis hepática. En los fetos y neonatos de ganado vacuno y ovino, los focos necróticos consisten en agregados densos de restos celulares y nucleares, algo de fibrina y unas cuantas células inflamatorias. Existe una importante necrosis lítica en la mayoría de los hepatocitos y se pierde la arquitectura normal del hígado. En casi el 50% de los hígados afectados, se encuentran cuerpos de inclusión intranuclear que son eosinofílicos y ovales o bacilares. También se observa mineralización de los hepatocitos necrosados. En los animales adultos, la necrosis hepática es menos difusa y en las ovejas la ictericia es mas frecuente que en los corderos (26). En humanos, las infecciones por FVR son normalmente asintomáticas o asociadas a una manifestación no fatal similar a la gripe que varía de moderada a grave (15). Una minoría de pacientes puede desarrollar lesiones oculares, encefalitis o una enfermedad hepática grave con manifestaciones hemorrágicas, que, por lo general, es fatal. En humanos, el virus FVR ha causado infección grave entre personal de laboratorio. La plantilla debe ser vacunada y trabajar con un nivel 3 de contención, en condiciones de un nivel 4 de contención, o llevar protección

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Capítulo 2.1.8. — Fiebre del Valle del Rift

respiratoria. Se necesita tener un cuidado especial cuando se trabaja con animales infectados o cuando se realizan análisis post-mortem (ver Capítulo I.1.6. Seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiología). No se han demostrado diferencias antigénicas significativas entre aislamientos de FVR y cepas cultivadas en laboratorio de muchos países, pero se han visto diferencias en cuanto a patogenicidad (27). La infección en humanos a través de mosquitos vectores es una característica propia de países que, como Egipto, tienen una población relativamente escasa de animales hospedadores y una gran población de mosquitos. La FVR se presenta normalmente como epizootias en África, que pueden incluir varios países en una región aislada y al mismo tiempo. Estas manifestaciones siguen a ciclos periódicos de lluvias excepcionalmente fuertes que pueden ocurrir muy raramente en zonas semiáridas (ciclos de 25-35 años), o más frecuentemente (ciclos de 5-15 años) en praderas de la sabana. En períodos entre epizootias puede ocurrir un bajo nivel indetectable de FVR. Se debe sospechar la existencia de FVR cuando a lluvias extraordinariamente fuertes sigue la presentación de abortos junto a una enfermedad fatal caracterizada por necrosis y hemorragias en el hígado, que afecta sobre todo a corderos, cabritos y terneros, y que es paralela a la aparición de una enfermedad semejante a la gripe en trabajadores de granjas y personal que maneja carne cruda. Cuando existen sospechas de que se manipula carne y muestras de tejido infectadas por el virus FVR se deben utilizar medidas preventivas para proteger a los trabajadores de la infección.

B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO 1.

Identificación del agente

El virus FVR se puede aislar del suero y de la sangre recogida con anticoagulante durante la fase febril de la enfermedad, del hígado, del bazo, y del cerebro de animales que hayan muerto, o de fetos abortados. Normalmente el aislamiento primario se realiza en hámsteres, ratones jóvenes o adultos, o en cultivos celulares de varios tipos.

a)

Cultivo Para el aislamiento de virus debe disponerse de aproximadamente 5 ml de sangre recogida durante el estado febril de la enfermedad o unos 5 g de hígado, bazo o cerebro recogidos tras la muerte. Las muestras deben mantenerse a 0-4°C durante el transporte. Si es probable que dicho transporte dure más de 24 horas, la muestra se debe congelar y enviar en hielo seco. Se suspende aproximadamente 1 g de tejido homogenizado al 1/10 en medio de cultivo celular o solución salina tamponada, pH 7.5, conteniendo penicilina sódica (1.000 Unidades Internacionales [UI]/ ml), sulfato de estreptomicina (1 mg/ml), micostatin (100 UI/ ml) o fungizona (2.5 µg/ ml). La suspensión se centrifuga a 1.000 g durante 10 minutos y el sobrenadante líquido se inyecta intracerebralmente en ratones de 1-5 días o intraperitonealmente en hámsteres o ratones adultos. Los ratones jóvenes morirán o estarán claramente enfermos al día 2. Los ratones adultos muestran signos de afección 1-3 días más tarde. Aunque los animales de laboratorio preferidos son los ratones y hámsteres, también se pueden usar corderos y huevos de gallina embrionados. Para el cultivo del virus de la FVR pueden utilizarse varias células en monocapa, entre las que se incluyen células de riñón de mono verde africano (Vero), riñón de hámster neonato (BHK), retículo de embrión de pollo (CER: células desarrolladas por Tsunemasa Motohashi en el Nippon Institute for Biological Research, Tokio, Japón; recaracterizada como una línea celular de hámster) (3) y células primarias de riñón o testículo de ternero y cordero, que se inoculan con 1 ml de sobrenadante de la muestra y se incuban a 37°C durante 1 hora . Se aconseja inocular también algunos cultivos con una dilución 1/100 del inóculo. Con esto se evita la producción de partículas defectivas que se produce con el uso de inócula con muy alta concentración de virus. También deben prepararse algunos tubos con cubreobjetos. Los cultivos se lavan con tampón fosfato salino a temperatura ambiente y se recubren con medio que contiene 2% de suero exento de anticuerpos contra FVR. Los cultivos se observan microscópicamente durante 5-6 días. El virus FVR produce un efecto citopático (ECP) caracterizado por provocar una ligera redondez en las células y a continuación la destrucción de toda la monocapa celular en 12-24 horas. La identificación específica del antígeno del virus FVR se puede realizar 18-24 horas tras la infección mediante tinción por inmunofluorescencia de las preparaciones en los cubres.

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Capítulo 2.1.8. — Fiebre del Valle del Rift

El virus también puede ser detectado por inmunofluorescencia en frotis de hígado, bazo y cerebro. A veces se puede hacer un diagnóstico rápido demostrando la presencia del antígeno vírico en tejidos o sueros de animales febriles por pruebas de fijación de complemento o de inmunodifusión en gel de agar (IGDA). También se puede lograr un diagnóstico rápido mediante detección del ARN vírico usando una reacción en cadena de la polimerasa con trascripción inversa (RT-PCR).

b)

Inmunodifusión en gel de agar La prueba IGDA es de utilidad en laboratorios sin disponibilidad de servicio de cultivo de tejidos. Se homogeniza aproximadamente 1 gramo de tejido, preferentemente hígado, y se hace una suspensión al 1020% en tampón borato salino, pH 9,0. El material se centrifuga a 1.000 g y el sobrenadante se usa en la prueba. Las versiones de micro-IGDAs se realizan en portas estándar para microscopía que se cubren con 3 ml de agarosa al 1% en tampón borato salino. Se preparan diseños de seis pocillos periféricos y un pocillo central que se llenan con los reactivos del siguiente modo: un suero positivo, preferentemente hiperinmune, en el pocillo central, control positivo de antígeno en los pocillos 1 y 4, tejidos problema en los pocillos 2 y 5, y tejidos negativos en los pocillos 3 y 6. Se debe formar una línea continua de precipitado entre el antígeno control y el suero positivo que debería extenderse hasta incluir una línea entre el tejido problema y el suero en caso de la prueba que fuera positiva.

c)

Reacción en cadena de la polimerasa Se puede conseguir también un diagnóstico rápido por detección del ARN vírico (23) usando una prueba RT-PCR. La PCR se usó, entre otras técnicas, para la detección de antígeno en dos recientes brotes de FVR en África –uno en Kenia en 1998 y un brote limitado en Sudáfrica en 1999. La RT-PCR seguida por secuenciación de la región que codifica la proteína NS(S) se ha empleado en análisis filogenéticos para caracterizar dos ramas distintas del virus FVR –una egipcia y otra sub-sahariana- convirtiendo a esta técnica en un poderoso instrumento de epidemiología molecular (22).

d)

Histopatología El examen histopatológico del hígado de los animales afectados revelará una citopatología característica, y la inmunotinción permitirá la identificación específica del antígeno viral del FVR en las células infectadas. Esta es una herramienta diagnóstica importante porque el hígado y otros tejidos se pueden mantener en formol salino en condiciones de campo con propósitos de diagnóstico, lo que facilita el manejo y transporte en áreas alejadas del laboratorio.

2.

Pruebas serológicas

Las pruebas de neutralización del virus (NV) incluyendo la microneutralización, la neutralización por reducción de placas (PRN) y la neutralización en ratón se han usado para detectar anticuerpos contra el virus FVR en el suero de una variedad de especies. Las pruebas de neutralización son muy específicas y reflejarán las respuestas más tempranas, pero estas pruebas sólo pueden llevarse a cabo con virus vivos y su uso no es recomendable fuera de las áreas endémicas o en laboratorios sin los adecuados servicios de bioseguridad y personal vacunado. Otras pruebas disponibles son enzimoinmunoensayo (ELISA), inhibición de la hemaglutinación (HI), IGDA, inmunofluorescencia, radioinmunoensayo y fijación de complemento. Sin embargo, en estas pruebas pueden ocurrir reacciones cruzadas entre el virus FVR y otros phlevovirus. Una ventaja de estas pruebas es el hecho de que pueden realizarse con antígeno inactivado y, por consiguiente, pueden ser utilizadas en países exentos de FVR. La técnica ELISA es un método seguro y sensible que puede usarse con varias especies para detectar anticuerpos contra el virus FVR. Una prueba ELISA con captura de IgM permite diagnosticar una infección reciente en una muestra aislada de suero. La prueba de HI puede emplearse con gran seguridad en áreas no endémicas. No obstante, los sueros de individuos que han tenido infecciones previas con phlebovirus distintos de FVR pueden reaccionar con el antígeno de FVR a títulos tan altos como 40 y, más raramente, a títulos de 320 (27). En casos sospechosos, el Laboratorio de Referencia de la OIE para FVR (ver Cuadro mostrado en la Parte 3 de este Manual) puede ayudar a realizar pruebas de neutralización para determinar la especificidad. El título de anticuerpos por HI tras la vacunación con virus FVR vacunal puede ser tan alto como 640 o, raramente, 1.280, mientras que los títulos que se alcanzan tras infecciones naturales por el virus FVR son, por lo general, significativamente más altos.

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Capítulo 2.1.8. — Fiebre del Valle del Rift

a)

Neutralización vírica La prueba NV se puede usar para determinar la presencia de anticuerpos en animales infectados por vía natural y en animales vacunados con la vacuna VRF. La prueba es muy específica y se puede usar para probar sueros de cualquier especie. Normalmente se usa para medir la eficacia de la vacuna. Algunos factores, además de los anticuerpos neutralizantes, pueden jugar un papel en la resistencia frente al FVR. Como antígeno se usa una cepa neurotrópica para cerebro de ratón muy atenuada del virus FVR denominada cepa Smithburn (25), también conocida como virus vivo modificado y adaptado a cultivos celulares. El antígeno se guarda a 4°C en forma liofilizada. Este stock se titula para determinar la dilución que producirá 100 DICT50 (dosis infectiva del 50% en cultivo de tejidos) en 25 µl bajo las condiciones de la prueba. •

Procedimiento de la prueba

i)

Inactivar el suero problema durante 30 minutos en un baño a 56°C.

ii)

Añadir 25 µl del medio de cultivo celular con 5% de suero negativo para FVR y antibióticos en cada uno de los 96 pocillos de una placa de cultivo celular.

iii)

Añadir 25 µl del suero problema al primer pocillo de cada fila y hacer diluciones dobles. Titular cada suero por duplicado de 1/10 a 1/80 a efectos de prueba o por cuadruplicado y a más altas diluciones para determinar el título de punto final. Incluir controles positivos y negativos de sueros conocidos.

iv)

Añadir 25 µl de antígeno vírico FVR (diluido con medio del cultivo celular y calculado para suministrar 100 DICT50 por pocillo) a cada pocillo que contenga el suero problema diluido y a los pocillos de las filas que contengan controles de suero positivo y negativo. Además, hacer diluciones dobles de antígeno en al menos dos filas de las que contienen solo medio del cultivo celular.

v)

Incubar 30 minutos a 37°C.

vi)

Añadir 50 µl por pocillo de células Vero, CER o cualquier otra suspensión celular apropiada, a una concentración de 3 x 105 células/ml o a una dilución que se conozca que origina una monocapa confluente en 12 horas.

vii)

Incubar las placas durante 3-5 días en una atmósfera de 3-5% de CO2.

viii) Las monocapas se examinan diariamente usando un microscopio invertido para evidenciar ECP. No debería producirse ECP en las filas que contienen el suero control positivo y debería presentarse un ECP claro en las filas que contengan el suero control negativo indicando la presencia de virus. Determinar los resultados por el método de Spearman-Kärber.

b)

Enzimoinmunoensayo Se ha desarrollado y utilizado ampliamente un método indirecto ELISA que emplea un antígeno inactivado producido en cultivo celular y conjugado con proteína G-peroxidasa (21). El antígeno FVR para ELISA se prepara a partir de cultivos Madin-Darby y el control negativo de antígeno se prepara a partir de monocapas no inoculadas. Los sedimentos celulares se extraen con un método que emplea sacarosa-acetona (4) y se inactivan con beta-propriolactona (24). •

Procedimiento de la prueba A menos que se señale lo contrario, los volúmenes usados son 50 µl/ pocillo, todas las diluciones se hacen con tampón con 3% (peso/volumen) de leche deshidratada, y todos los lavados se repiten tres veces.

206

i)

Cubrir la mitad de la placa con 50 µl/pocillo de antígeno positivo y la otra mitad con antígeno negativo a una dilución predeterminada. Incubar toda la noche a 4°C. Lavar la placa.

ii)

Añadir 100 µl/pocillo de tampón bloqueante, incubar 1 hora a 37°C. Lavar la placa.

iii)

Añadir el suero problema y los sueros control a una dilución predeterminada por duplicado al antígeno positivo y al negativo. Incubar 1 hora a 37°C. Lavar la placa.

iv)

Añadir el conjugado de Proteína G/peroxidasa de rábano a dilución adecuada. Incubar 1 hora a 37°C. Lavar la placa.

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Capítulo 2.1.8. — Fiebre del Valle del Rift

v)

Añadir el substrato tetrametilbenzidina como se presenta comercialmente y dejar la placa 20 minutos a temperatura ambiente (22°C) en la oscuridad (tiempo de desarrollo).

vi)

Añadir solución que detiene la reacción (ácido sulfúrico 2 M) y leer la placa a una densidad óptica de 450/650 nm.

vii)

La disposición de la placa es como se indica:

1

2

3

4

5

6

7

8

9

A

(1)

(1)

(5)

B

(2)

(2)

(6)

C

(3)

(3)

(19)

D

(4)

(4)

(20)

E

(1)

(1)

(5)

F

(2)

(2)

°(6)

10

11

12

(5)

(cc)

(cc)

(6)

(c++)

(c++)

(19)

(c+)

(c+)

(20)

(c– –)

(c– –)

(5)

(cc)

(cc)

(6)

(c++)

(c++)

G

(3)

(3)

(19)

(19)

(c+)

(c+)

H

(4)

(4)

(20)

(20)

(c– –)

(c– –)

A, B, C y D = Ag positivo; E, F, G, y H= Ag negativo

c)

Inhibición de la Hemaglutinación La prueba IH adaptada en versión de microtécnica se basa en Clarke & Casals (4). Se emplea antígeno de hígado de hámster extraído en sacarosa/acetona en una placa de ensayo de 96 pocillos con fondo en U y se diluye de modo que se usan en la prueba 4 unidades hemaglutinantes. Los inhibidores inespecíficos de la hemaglutinina se extraen de los sueros antes de la prueba mediante extracción con caolín y luego por adsorción en eritrocitos de ganso prensados (RBC). Las diluciones dobles seriadas de los sueros se hacen en tampón borato salino, pH 9,0, y se ensayan frente a volúmenes iguales de antígeno. Las placas se dejan a 4°C durante la noche antes de añadir 50 µl de RBC al 0,5% a cada uno de los pocillos. Las placas se leen tras 30 minutos a temperatura ambiente y los puntos finales se indican como el inverso de la dilución más alta de suero que produce una inhibición total de la hemaglutinación. En cada prueba se incorporan sueros control positivo y negativo. Una prueba se considera válida solamente si los sueros control dan los resultados esperados. Los sueros con títulos inferiores a 1/40 se consideran negativos. La técnica de HI es una prueba adecuada de ensayo para inspecciones aunque no es muy específica. Entre los phlebovirus ocurren reacciones cruzadas notables, pero los títulos homólogos exceden a los heterólogos. Experimentalmente, se ha demostrado que hay phlebovirus africanos distintos del FVR que no son patógenos para los rumiantes, y no es probable que los anticuerpos que ellos puedan inducir originen confusión en el diagnóstico de FVR (27).

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO Se ha usado una vacuna viva preparada con la cepa atenuada Smithburn del virus FVR para controlar FVR en ganado bovino y ovino no gestante en áreas endémicas y durante brotes epidémicos, mientras que se usan virus vacunales inactivados a partir de cepas naturales en el caso de animales gestantes y en países libres de FVR (1, 2). Las vacunas con virus inactivados deben prepararse a partir de cepas muy inmunogénicas del virus FVR producidas en cultivo celular. El virus debe inactivarse con formaldehído y mezclarse con un adyuvante para potenciar la inmunogenicidad. Las vacunas inactivadas deben ensayarse muy cuidadosamente en cuanto a seguridad para garantizar que no existe ningún virus vivo residual. Las directrices para la producción de vacunas veterinarias se presentan en el Capítulo I.1.7. Principios de producción de vacunas veterinarias. Las normas dadas aquí y en el Capítulo I.1.7 intentan ser de naturaleza genérica y pueden ser suplementadas con requisitos nacionales o regionales.

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207

Capítulo 2.1.8. — Fiebre del Valle del Rift

En humanos, se ha usado durante 25 años una vacuna experimental inactivada con considerable éxito en cuanto a protección de personas con riesgo de FVR. En la actualidad esta vacuna se está produciendo en células diploides. Sin embargo, la limitada disponibilidad de esta vacuna impide su uso en la población general. Dos nuevas candidatas a vacunas producidas a partir de aislamientos humanos de FVR están siendo sometidas a diversos ensayos con vistas a reemplazar las vacunas existentes. La primera, MV P12, es una cepa mutada de virus cultivado en presencia de 5-fluorouracilo con mutagénesis seriada que produce en una atenuación para el ratón. Se ha probado en ovejas la inmunogenicidad y la patogenicidad y el virus no provoca abortos en ovejas gestantes (17). MV P12 confirió protección en corderos jóvenes (10,14) y en ganado bovino (18, 19). En pruebas posteriores más extensas realizadas en ovejas la vacuna produjo abortos y teratología fetal grave cuando se usó después de 28 días de gestación (12). La segunda candidata, Clon 13, una variante de virus que origina pequeñas placas de lisis y que no reacciona con dos anticuerpos monoclonales específicos, resultó ser avirulenta para ratones y hámsteres y muy inmunogénica. Su inmunogenicidad y patogenicidad se ha probado en corderos, ovejas, y cabras jóvenes y adultas (20). En ensayos adicionales se comportó como no abortiva en ovejas gestantes y confirió más de un 80% de protección frente a un virus prueba de desafío (11). El virus Clon 13 presenta la pérdida de una porción del segmento de ARN pequeño que codifica proteínas no estructurales, lo que podría conducir a una vacuna estable. En la siguiente descripción de producción de vacunas, se suministra información sobre la producción de vacuna viva junto a información sobre producción de vacuna inactivada. Debe resaltarse que las vacunas vivas y las inactivadas nunca deben producirse simultáneamente en los mismos servicios, debido al riesgo de contaminar la vacuna viva atenuada con una cepa virulenta de virus antes de ser inactivada. El personal que maneja virus FVR vivo debe estar vacunado y trabajar con nivel de contención 3 para minimizar el riesgo de autoinfección.

1.

Control del inóculo

a)

Características del inóculo vírico Vacuna viva: El stock de antígeno deriva de la cepa original neurotrópica de Smithburn. Esta cepa no es letal en ratones adultos inyectados intraperitonealmente y es segura cuando se usa en todas las razas de ganado vacuno, ovejas y cabras. Sin embargo, puede causar anormalidades fetales o aborto en animales gestantes. Vacuna inactivada: Se puede usar como virus de inóculo una cepa de virus FVR altamente inmunogénica adaptada a crecer en cultivos celulares. Se diferencia de la cepa atenuada en que es letal para los ratones adultos cuando se inyecta intraperitonealmente.

b)

Método de cultivo Tanto las cepas de virus atenuado como la inactivada se producen en cultivos celulares de células BHK, Vero o CER. Los virus se guardan en forma liofilizada en viales que contienen 1 ml de una suspensión de cultivo celular. El título vírico (tras inoculación intracerebral en ratones jóvenes) debe ser de al menos 106.5 LD50 en el ratón (50% de la dosis letal) por ml.

c)

Validación como vacuna Los virus inoculados deben carecer de agentes indeseables, ser seguros para el uso y capaces de estimular una inmunidad eficaz en las especies y razas a las que va dirigida. Œ

Pruebas

El inóculo de virus liofilizado se regenera en medio de cultivo celular estéril sin antibióticos y se comprueba la ausencia de bacterias y hongos. El contenido de un vial así reconstituído se inocula en dos tubos de medio con tioglicolato y en dos tubos de medio con hidrolizado de soja y caseína. Los cultivos con tioglicolato se incuban a 37°C durante 7 días y los cultivos con hidrolizado de soja y caseína a 20°C durante 14 días. Los cultivos deberían permanecer negativos. Además, se mezclan 5 ml del inóculo de virus reconstituído con un mismo volumen de antisuero específico contra FVR producido en conejos. Después de incubar las mezclas suero/virus a 37°C durante 30 minutos, las suspensiones víricas se ensayan en cultivos celulares antes y después de una neutralización, así como en ratones adultos y jóvenes, huevos embrionados y cobayas. El virus neutralizado es:

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Capítulo 2.1.8. — Fiebre del Valle del Rift

i)

Sembrado en seis cultivos en tubos rotativos con células primarias de riñón de cordero y seis cultivos en tubos rotativos con células BHK. Los cultivos celulares se incuban a 37°C y se observan diariamente durante 7 días para observar ECP, tras los cuales se someten a la prueba de hemadsoción con RBCs de cobaya a 4°C y a 37°C. No debería presentarse ECP ni hemadsorción. Si el cultivo degenera o presenta sospechas de ECP, el material de estos cultivos debería mezclarse de nuevo con antisuero y reinocularse en cultivos celulares frescos, que se observan durante otro período adicional de 14 días. La presencia de ECP específico o de hemadsorción descalifica la muestra como inóculo vírico.

ii)

Inoculado intraperitonealmente (0,2 ml) en grupos de al menos seis ratones adultos y seis ratones de 2-5 días de edad. Los ratones deberían permanecer sanos durante 14 días. Si muriera algún ratón, se emulsiona un tejido adecuado, se mezcla con antisuero y se reinocula en otros grupos de ratones, observándolos de nuevo durante otro período de 14 días. Si existe alguna evidencia de mortalidad específica, se descalifica la muestra como inóculo vírico.

iii)

Inoculado en al menos diez huevos de gallina embrionados de 8 días mediante el método del punzón (combinación de la ruta de la membrana coriolantoidea y del saco alantoideo). Los huevos se incuban a 37°C durante 8 días y se observan diariamente con transiluminación. Los embriones que mueren a las 24 horas se eliminan. Si después de 24 horas permanecen vivos menos del 70% de los embriones, la prueba debería, no obstante, repetirse. La causa de muerte embrionaria durante el consiguiente período de observación debería determinarse estableciendo pruebas adecuadas de esterilidad y de HI, y por examen de frotis del saco vitelino. Si estas pruebas resultan negativas, debería hacerse, como antes, una reinoculación de suspensiones obtenidas de los embriones mezcladas con antisuero. Al día 4 de incubación, se abren al menos 4 huevos y se recoge el líquido del alantoides. Los huevos restantes se abren el día 8 de incubación. Se examinan las membranas de ambos grupos en cuanto a lesiones y en cuanto a anormalidades del embrión. El líquido del alantoides se somete a una prueba HI con RCBs de cobaya y pollo a 4°C y a 37°C. La evidencia de mortalidad embrionaria específica, de actividad hemaglutinante en el líquido alantoideo, cualquier lesión en las membranas o anormalidades embrionarias descalifican la muestra como inóculo vírico.

iv)

Inyectado intraperitonealmente con 1,0 ml de inóculo vírico en dos cobayas. Los cobayas deben permanecer sanos en un período de observación de 14 días.

No superar cualquiera de estas pruebas descalifica al antígeno para uso como inóculo vírico.

2.

Método de producción

Un vial de inóculo vírico liofilizado se reconstituye y se diluye entre 1/100 y 1/1.000 con medio Eagle en el caso de las vacunas atenuadas y 1/1.000 en el caso de vacunas inactivadas. Para preparar una suspensión de trabajo, se siembra el virus diluído en un cultivo confluente de células BHK en botellas rotativas y se incuba a 37°C. Cuando el 70% de las células aparecen afectadas (ECP), se recoge el medio y las células y este material se diluye entre 1/100 y 1/1.000, tras lo cual se siembran de nuevo 10 ml en botellas rotativas con células BHK confluentes y se incuba otra vez. Tan pronto como se observa un 70% de ECP, se recoge el medio y las células y se almacenan. Tanto las suspensiones virales de las vacunas atenuadas como de las inactivadas se titulan intracerebralmente en ratones neonatos y deberían presentar un título de la menos 106.5 LD50/ml en ratón. Alternativamente, se puede realizar una titulación de lesiones en células CER. La vacuna atenuada se liofiliza inmediatamente después de completar las pruebas de titulación y de esterilidad. Debería usarse un estabilizador, como por ejempo 5% de peptona en tampón fosfato 0,3 M. El volumen de la vacuna inactivada se ajusta de modo que la vacuna final contenga al menos 106.5 LD50/ml. La suspensión viral ajustada se inactiva luego a 37°C durante 24 horas con formaldehído a una concentración final de 0,2%. Tras la inactivación, se añade a la suspensión el mismo volumen de gel de hidróxido de aluminio. La vacuna debe tener un pH final de 7-7,5.

3.

Control el proceso

Previamente a la inoculación de los cultivos celulares, el inóculo vírico se somete a pruebas de esterilidad en medios con tioglicolato y con hidrolizado de soja y caseína (ver Sección C.1.c y Capítulo I.1.5. Pruebas para esterilidad y ausencia de contaminación en materiales biológicos).

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

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Capítulo 2.1.8. — Fiebre del Valle del Rift

Se selecciona una muestra representativa de cada lote de vacuna y cada contenido se reconstituye con 5 ml de agua destilada estéril analizándose para comprobar ausencia de bacterias y hongos. En las vacunas inactivadas, debe comprobarse la inactivación mediante dos pases en el mismo tipo de cultivo celular que se usó en la producción de la vacuna.

4.

Control de lotes

a)

Esterilidad Antes de la liofilización o de la inactivación, cada envase de vacuna almacenada, y después muestras representativas de cada lote, se prueban respecto a esterilidad en medio con tioglicolato e hidrolizado de soja y caseína (ver también Capítulo I.1.5. de este Manual).

b)

Inocuidad Vacuna viva: Se seleccionan al azar recipientes finales de la vacuna atenuada liofilizada y cada uno se reconstituye en agua destilada como si se tratara de una vacunación. Se inyectan subcutáneamente cuatro ovejas susceptibles con una dosis de vacuna. Las ovejas se observan diariamente durante 14 días y se anota su temperatura rectal. Las ovejas deben permanecer sanas. La vacuna también se inyecta intraperitonealmente en seis ratones adultos (0,25 ml en cada uno), dos hámsteres y dos cobayas (1 ml en cada uno). Los animales se observan diariamente durante un período de 14 días durante el cual deben permanecer sanos. Una mortalidad atribuíble a la vacuna descalifica el lote. Vacuna inactivada: En el caso de la vacuna inactivada contra FVR, se inyectan subcutáneamente cuatro ovejas susceptibles con 2,0 ml de vacuna, se observan diariamente durante 3 semanas y se anota la temperatura rectal. Las ovejas deben permanecer sanas. Además, la seguridad se determina también por inyección intracerebral de seis ratones adultos y dos familias de ratones neonatos, y mediante inyección intraperitoneal de dos cobayas y dos hámsteres. Los ratones, hámsteres y cobayas se observan durante 14 días. Deben permanecer sanos. Una mortalidad atribuíble a la vacuna descalifica el lote.

c)

Potencia Vacuna viva: Se recostituye la vacuna atenuada liofilizada de dos recipientes finales y se titula intracerebralmente en ratones neonatos. La vacuna final debe contener al menos 104.4 LD50/dosis en ratón. Alternativamente, se pueden hacer las titulaciones en cultivos celulares. Dos recipientes finales se mantienen una semana a 37°C, se recosntituyen y se titulan como antes. Cada uno debe contener al menos 103.4 LD50/dosis en ratón. Alternativamente, se pueden hacer las titulaciones en cultivos celulares. Las ovejas inoculadas (ver sección C.4.b.) se sangran a las 2 y 3 semanas de la vacunación y su respuesta en anticuerpos se determina por PRN. Un título de anticuerpo neutralizante frente al virus de 100 o más es considerado satisfactorio. Vacuna inactivada: Las ovejas, inyectadas subcutáneamente para determinar la seguridad (Sección C.4.b.), se sangran a las tres semanas y su respuesta en anticuerpos se determina por la prueba NV. Un título de anticuerpo neutralizante frente al virus de 100 o más es considerado satisfactorio.

d)

Duración de la inmunidad Tanto las vacunas vivas atenuadas como las inactivadas han tenido un amplio uso en condiciones de campo. Se considera que la vacuna viva induce una inmunidad que dura toda la vida contra la enfermedad clínica, aunque existe cierta controversia sobre la inmunogenicidad de la vacuna Smithburn. Sin embargo, el ganado vacuno se puede inmunizar con la vacuna de virus vivo usando esta cepa. La experiencia sobre la eficacia de campo de las vacunas inactivadas es limitada porque se han empleado en áreas donde FVR no es endémica, y donde en consecuencia no existe desafío natural frente a la vacuna. Sin embargo, durante el brote de 1976-1978 en Sudáfrica, observaciones realizadas por veterinarios estatales apoyan la eficacia de la vacuna. En epizootias más recientes en otras partes, la vacuna inactivada no tuvo éxito en la protección de los animales contra el aborto, tras dos vacunaciones. Cuando se usa la vacuna inactivada, se

210

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Capítulo 2.1.8. — Fiebre del Valle del Rift

debe dar una dosis de recuerdo a los 3-6 meses de la vacunación inicial y después la vacunación se debería repetir anualmente (1, 2).

e)

Estabilidad Cuando se mantienen a 4°C, las vacunas atenuadas liofilizadas son estables durante al menos 4 años, mientras que la vacuna inactivada puede mantenerse muchos años. No se recomienda el almacenamiento a temperaturas superiores.

f)

Conservantes No se usan conservantes.

g)

Precauciones (riesgos) Aunque los humanos se pueden infectar durante el manejo de material infectado, no se conoce ningún caso de enfermedad en el hombre con virus de la vacuna atenuada, pero a menudo ocurre seroconversión. Sin embargo, las cepas usadas para preparar vacuna inactivada pueden causar enfermedad. Por tanto, todo personal con probabilidad de exposición al virus de la vacuna debería ser vacunado con la vacuna inactivada con formalina para el hombre.

5.

Pruebas en el producto final

a)

Esterilidad Se recogen muestras representativas del producto final y se ensayan como se indica en la Sección C.4.a.

b)

Contenido en humedad La humedad presente en muestras liofilizadas de la vacuna atenuada no debería superar el 3%.

•

Agradecimiento

Partes de este capítulo se tomaron del capítulo sobre FVR en las ediciones previas de este Manual o están basadas en él.

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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

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Capítulo 2.1.8. — Fiebre del Valle del Rift

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* * * NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Fiebre del valle del Rift (ver Cuadro en la parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar la página web de la OIE para una lista actualizada: www.oie.int)

212

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

CAPÍTULO 2.1.9.

LENGUA AZUL

RESUMEN La lengua azul (LA) es una enfermedad vírica infecciosa, no contagiosa y transmitida por insectos, que se presenta en las ovejas y los rumiantes domésticos y salvajes, como cabras, ciervos, ovejas cimarrón, la mayor parte de los antílopes africanos y muchos otros miembros de los artiodáctilos. El efecto de la infección varía desde una manifestación que pasa desapercibida en la gran mayoría de los animales infectados hasta un resultado mortal en algunas ovejas, cabras, ciervos y rumiantes salvajes infectados. Los síntomas clínicos de la enfermedad en rumiantes domésticos y salvajes incluyen una respuesta febril caracterizada por inflamación y congestión, edema facial con hemorragias, y ulceración de las membranas mucosas. En los casos graves la lengua azul puede mostrar una hiperemia intensa y llegar a estar edematosa y sobresalir de la boca. La hiperemia se puede extender a otras partes del cuerpo, en particular a las ingles, axilas y perineo. A menudo ocurre una grave degeneración muscular. La dermatitis puede ocasionar rotura de la lana. Las ovejas pueden presentar cojera a consecuencia de coronitis, es decir, inflamación de la banda coronaria de las pezuñas, o de miopatía esquelética. Una enfermedad grave similar de los rumiantes salvajes es la causada por el virus de la enfermedad hemorrágica epizootica (EHDV) que, como el virus de la LA (BTV), es un miembro del género Orbivirus, pero que está clasificado en un serogrupo diferente. A veces, la EHD puede causar en el ganado síntomas clínicos que parecen similares a los de la lengua azul. Identificación del agente: El BTV es un miembro del género Orbivirus de la familia Reoviridae. Dentro del género hay 14 serogrupos. El serogrupo LA contiene 24 serotipos. Los primeros se diferencian por pruebas inmunológicas que detectan proteínas víricas que están conservadas dentro de cada serogrupo. La mayoría de los serogrupos parecen ser diferentes desde el punto de vista inmunológico, pero existe una reacción cruzada considerable entre los integrantes de los serogrupos LA y EHD. El serotipo de los virus individuales dentro de cada serogrupo se identifica mediante pruebas de neutralización. Las partículas completas de BTV tienen una cápsida doble y la cápsida externa contiene dos proteínas, una de las cuales es el determinante principal de la especificidad del serotipo. La cápsida interna icosaédrica contiene dos proteínas mayoritarias, tres proteínas minoritarias y diez módulos de ARN de cadena doble. La proteína VP7 es una proteína importante de la cápsida que posee los antígenos que confieren especificidad a cada serogrupo. La identificación tradicional del virus implica su aislamiento la amplificación en cultivos de tejido y la subsiguiente aplicación de pruebas específicas para establecer el serogrupo y el serotipo. Recientemente, la aplicación de la tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha permitido la amplificación muy rápida del ARN del BTV en muestras clínicas, y, en la actualidad, existen procedimientos basados en la PCR que permiten obtener información sobre el serogrupo y el serotipo del virus. Pruebas serológicas: En los rumiantes las respuestas serológicas aparecen a los 7-14 días después de la infección por BTV y, por lo general, son duraderas. Para detectar los anticuerpos específicos contra un serogrupo de LA se usaban hasta hace poco pruebas como la inmunodifusión en medio sólido o el enzimoinmunoensayo indirecto (ELISA), aunque estas pruebas tenían el inconveniente importante de ser incapaces de distinguir de forma fiable entre anticuerpos contra los virus de los serogrupos de LA y de EDH. Un método competitivo ELISA basado en anticuerpos monoclonales ha resuelto este problema y para detectar específicamente anticuerpos anti-BTV se recomiendan ensayos de tipo ELISA competitivo. Los procedimientos actuales para determinar la especificidad de serotipo de los anticuerpos son tediosos porque requieren determinar la capacidad de los sueros de ensayo para inhibir la infectividad de una serie de virus de serotipo conocido mediante pruebas de neutralización de larga duración.

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

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Capítulo 2.1.9. — Lengua azul

Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: En varios países, como Sudáfrica, donde no vacunar puede conducir a brotes de la enfermedad, se utilizan vacunas vivas atenuadas que son específicas en cuanto a serotipo. Los virus atenuados se preparan por pases seriados del virus natural en huevos embrionados de pollo o en células cultivadas. La virulencia se atenúa después de los pases seriados y, en paralelo, los virus se replican con títulos más bajos en las ovejas. Las vacunas con virus atenuados son teratogénicas y no se deben administrar a ovejas grávidas durante la primera mitad del embarazo, debido a que pueden causar la muerte fetal y anormalidades. Cuando se establece un grado adecuado de atenuación a efectos de la vacuna, se debe buscar un equilibrio entre un nivel de replicación suficiente para reducir la virulencia, pero debe estimular la inmunidad de protección en las ovejas, y la necesidad de reducir el título del virus en sangre para evitar la infección de insectos picadores. Los procedimientos para ensayar la eficacia de la vacuna y el potencial teratogénico en ovejas son de realización fácil. En contraste, se han realizado pocos estudios para determinar si los virus atenuados pueden o no transmitirse de ovejas vacunadas a otros animales mediante insectos. El hecho de que los virus atenuados sean teratogénicos hace que la determinación de su transmisión sea un asunto muy importante, especialmente si se usan por primera vez en un país vacunas con virus vivos.

A. INTRODUCCIÓN Las moscas del género Culicoides transmiten el virus de la lengua azul (BTV) a animales susceptibles, y a partir de ellos, llegando a infectarse durante su alimentación sobre vertebrados con viremia. Después de un período de replicación de 6-8 días, y después de su aparición en la glándula salivar, el virus se puede transmitir a un hospedador vertebrado durante la ingestión de sangre. Las moscas infectadas permanecen infectadas toda la vida. El papel central del insecto en la epidemiología de la LA implica que la prevalencia de la enfermedad está gobernada por factores ecológicos, como pluviosidad elevada, temperatura, humedad y características edáficas que favorezcan la supervivencia del insecto (6). En muchas partes del mundo la enfermedad tiene, por tanto, una frecuencia estacional (13). La LA es una enfermedad vírica infecciosa, no contagiosa y transmitida por insectos, que se presenta en las ovejas y los rumiantes domésticos y salvajes, como cabras, ciervos, ovejas cimarronas, la mayor parte de los antílopes africanos y otros artiodáctilos. El efecto de la infección varía desde una manifestación que pasa desapercibida en la gran mayoría de los animales infectados hasta un resultado mortal en algunas ovejas, cabras, ciervos y rumiantes salvajes infectados. Aunque en general la frecuencia de infección por BTV es mayor en el ganado bovino que en las ovejas, la enfermedad típica es rara en el ganado bovino y los síntomas, cuando ocurren, son mucho más suaves que en las ovejas. En los rumiantes no domésticos, la enfermedad puede variar de una manifestación hemorrágica aguda con alta mortalidad, como la que se observa en el ciervo de cola blanca (Oidocoilus virginianus), hasta una enfermedad desapercibida como la del alce norteamericano (Cervus canadensis). El virus de la enfermedad hemorrágica epizootica (EHDV) puede producir una enfermedad en los rumiantes salvajes con manifestaciones clínicas idénticas a las observadas después de la infección por BTV. Los síntomas clínicos de la enfermedad en los rumiantes domésticos y en los salvajes varían desde estados subclínicos en la mayor parte de los casos hasta una respuesta febril aguda caracterizada por inflamación y congestión, que conduce a un edema en la cara, párpados y orejas, y hemorragias y ulceración de las membranas mucosas. Pueden aparecer grandes erosiones en los carrillos y en la parte de la lengua opuesta a los molares. La lengua puede tener una hiperemia intensa y aspecto edematoso, sobresalir de la boca y, en casos graves, volverse cianótica. La hiperemia se puede extender a otras partes del cuerpo, en particular a las ingles, axilas y perineo. A menudo existe una grave degeneración muscular. La dermatitis puede originar roturas de la lana. Es corriente la presencia de coronitis con hemorragia en la banda coronaria de la pezuña, pudiendo causar cojera. Cuando una oveja muere a consecuencia de la enfermedad de la LA aguda, los pulmones pueden mostrar hiperemia interalveolar con edema alveolar grave y el árbol bronquial puede contener espuma. La cavidad torácica puede contener varios litros de líquido parecido al plasma y el saco del pericardio puede presentar hemorragias petequiales. La mayor parte de los casos presentan una hemorragia característica cerca de la base de la arteria pulmonar (11). El BTV es un miembro del género Orbivirus, que es uno de los nueve géneros clasificados en la actualidad dentro de la familia Reoviridae. Dentro del género Orbivirus, se diferencian 14 grupos, desde el punto de vista serológico. Los orbivirus mejor estudiados pertenecen a los serogrupos de la LA, EHD y la enfermedad africana del caballo (AHS). Dentro de los serogrupos, los miembros individuales se diferencian por pruebas de neutralización y hasta la fecha se han descrito 24 serotipos de BTV. Existe una notable reacción cruzada inmunológica entre los miembros de los serogrupos de la LA y la EHD (16). En este capítulo no se presentarán detalles de las pruebas específicas para la EHD.

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Capítulo 2.1.9. — Lengua azul

Las partículas del BTV se componen de tres capas proteicas. La cápsida externa contiene dos proteínas, la VP2 y la VP5. La VP2 es el antígeno de neutralización más importante y el determinante de la especificidad de serotipo. Esta proteína es también la responsable de la hemaglutinación y de la unión del BTV a las células de mamíferos. La capacidad de un MAb contra VP5 para neutralizar el virus de la AHS (AHSV) y para reaccionar con la proteína equivalente del BTV y del EDHV confirma el papel de VP5 en la neutralización de los orbivirus y destaca la extensión de la reacción cruzada inmunológica entre los miembros de los distintos serogrupos de Orbivirus (24). La eliminación de la cápsida externa VP2/VP5 deja una partícula con una cápsida icosaédrica interna formada por dos capas compuestas de dos proteínas mayoritarias, la VP7 y la VP3, tres proteínas minoritarias, y diez módulos de ARN de cadena doble. La VP7 es un determinante importante de la especificidad de serogrupo y el componente que contiene los epítopos que se usan en enzimoinmunoensayos competitivos (CELISA) para detectar anticuerpos contra BTV. La VP7 también puede ser la responsable de la unión del BTV a las células de insectos (39). Las subunidades de VP7 contienen dos dominios.

B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO 1.

Identificación del agente (una prueba prescrita para el comercio internacional)

a)

Aislamiento del virus Se usan los mismos procedimientos para rumiantes domésticos y salvajes. Hay varios sistemas en uso para el aislamiento de virus, pero dos de los más eficaces son los huevos embrionados de pollo (ECE) y la oveja. La identificación de BTV por inoculación en oveja puede ser una estrategia útil si el título de virus en la muestra de sangre es muy bajo, como suele ser el caso después de varias semanas después de la infección vírica. Los intentos de aislar el virus en cultivos celulares in vitro pueden ser más adecuados, pero con frecuencia la probabilidad de éxito es mucho menor que la lograda mediante sistemas in vivo. Dentro de una población de virus, no todas las partículas de BTV son idénticas a nivel genético y de composición en aminoácidos, y sólo una pequeña proporción de los virus presentes en la sangre de animales infectados, quizás ínfima, puede tener las secuencias de aminoácidos precisas en las proteínas víricas que son críticas para unirse y replicarse en las células en cultivo. Este puede ser el motivo por el que la inoculación directa de células cultivadas con sangre virémica que contiene un número relativamente pequeño de partículas virales sea un modo ineficaz de aislar el BTV. Por uno o dos pases en ECE es más probable que se genere una preparación con un título alto de virus, y una que contenga virus con la capacidad de replicarse en cultivo de tejidos. El cultivo celular parece ser una técnica más sensible para el aislamiento del EHDV. •

Aislamiento en huevos embrionados de pollo

i)

Se recoge sangre de animales febriles con un anticoagulante como heparina, EDTA (ácido etilamina diamina tetra-acético) o citrato sódico, y las células sanguíneas se lavan tres veces con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS). Las células lavadas se resuspenden en PBS o en cloruro sódico isotónico y se guardan a 4°C o se usan inmediatamente para intentar el aislamiento del virus.

ii)

Para guardar a largo plazo cuando no es posible la refrigeración, las muestras de sangre se recogen en oxalato-fenol-glicerina (10). Si las muestras se pueden congelar, se recogen entonces en solución tamponada de peptona con lactosa o dimetil sulfóxido al 10% (36) y se mantienen a –70°C o a temperatura inferior. El virus no es estable a –20°C en períodos largos.

iii)

El bazo y los nódulos linfáticos son los órganos preferidos para intentos de aislamiento del virus en casos mortales. Los órganos y tejidos deben mantenerse a 4°C y transportarse a un laboratorio donde se homogenizan en PBS o solución salina isotónica, y se utilizan como se describe más adelante para las células de la sangre.

iv)

Se resuspenden en agua destilada células de la sangre lavadas o se sonican en PBS y se inoculan 0,1 ml intravascularmente en 6-12 ECE de 9-12 días de edad. Este proceso es difícil de realizar y requiere práctica. El trabajo de Clavijo et al. contiene los detalles (8).

v)

Los huevos se incuban en una cámara húmeda a 33,5°C y se observan diariamente al trasluz. Cualquier muerte embrionaria ocurrida en las primeras 24 horas post-inoculación se considera inespecífica.

vi)

Los embriones que mueren entre los días 2 y 7 se mantienen a 4°C y los que permanecen vivos el día 7 se sacrifican. Con frecuencia, los embriones infectados presentan un aspecto hemorrágico. Los embriones muertos y los que vivían el día 7 se homogenizan por separado. Se homogenizan los embriones completos, después de eliminar sus cabezas, u órganos concretos, como el hígado, y los restos de eliminan por centrifugación.

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Capítulo 2.1.9. — Lengua azul

vii)

El virus se puede identificar directamente en el sobrenadante mediante ELISA de captura de antígeno (18) o indirectamente por métodos de detección de antígenos, como inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa, después de su amplificación en cultivo celular, como se describe en la sección siguiente.

viii) Si, después de la inoculación con el material de la muestra, los embriones no mueren, se hace un inóculo con el material del primer pase por huevo y se vuelve a pasar por ECE o por cultivo celular. •

Aislamiento en cultivo celular

Los virus también se pueden añadir a células L de ratón en cultivo, o a células de riñón de hámster neonato (BHK-21), de riñón de mono verde africano (Vero) o de Aedes albopictus (AA). Mediante adición directa a células en cultivo, la eficacia del aislamiento suele ser más baja en comparación con la que se alcanza en ECE. La mejor eficacia de aislamiento en cultivo celular se logra pasando primero los homogenados de ECE por células AA, y luego por aplicación de procedimientos de detección de antígeno o pases adicionales por líneas celulares de mamíferos, como células BHK-21 o Vero. En células AA no se observa necesariamente un efecto citopático (ECP). Se analizan las monocapas celulares para observar la presencia de un ECP durante 5 días a 37°C con 5% de CO2 y humedad. Si no aparece ECP, se realiza un segundo pase en cultivo celular. La identidad del BTV en el medio de cultivo de células que manifiestan un ECP se puede confirmar mediante varios métodos que se describen más adelante, incluyendo la prueba ELISA de captura de antígeno, inmunofluorescencia, inmunoperoxidasa, o neutralización del virus (NV).

b)

•

Aislamiento en oveja

i)

Las ovejas se inoculan con células lavadas procedentes de 10 ml a 500 ml de sangre, o con 10-50 ml de suspensión de tejido. Los inóculos se administran subcutáneamente en alícuotas de 10-20 ml. Volúmenes superiores pueden facilitar el aislamiento del virus y deben administrarse intravenosamente.

ii)

Las ovejas se mantienen 28 días para comprobación de los anticuerpos utilizando la prueba de inmunodifusión en medio sólido (1) o la prueba C-ELISA como se describe más adelante.

Métodos inmunológicos •

Serogrupo de los virus

Los aislamientos de Orbivirus se suelen seroagrupar por su reactividad con antisueros estándar específicos que detectan proteínas, como la VP7, que se conservan dentro de cada serogrupo. La reacción cruzada entre miembros de los serogrupos LA y EHD plantea la posibilidad de que un aislamiento de EHD pueda confundirse con BTV debido a una reacción de inmunofluorescencia débil con un antisuero policlonal antiBTV. Por esta razón, se puede usar un MAb específico del serogrupo LA. Varios laboratorios han generado tales reactivos específicos de grupo (3, 22). En contraste con el seroagrupamiento, el método corriente de serotipado es mediante pruebas de NV usando métodos que se describen más adelante. Los métodos más utilizados para la identificación de los virus a nivel de serogrupo son los siguientes. i)

Inmunofluorescencia Se infectan monocapas de células BHK o Vero sobre portas de vidrio con virus adaptado al cultivo de tejido o con virus de lisados de ECE. Después de 24-48 horas, o después de la aparición de un ECP incipiente, las células infectadas se fijan con agentes como paraformaldehído, acetona o metanol, se deja secar y el antígeno vírico se detecta utilizando un antisuero anti-BTV y los procedimientos estándar para inmunofluorescencia.

ii)

Enzimoinmunoensayo de captura de antígeno Se pueden detectar directamente los virus en lisados de ECE, en el medio de cultivo y en insectos infectados. En esta técnica, los virus y/o las partículas de la cápsida se capturan por el anticuerpo adsorbido a una placa ELISA y el virus unido se detecta usando un segundo anticuerpo. El anticuerpo de captura puede ser policlonal o un MAb específico de serogrupo. Para detectar los virus capturados, se han usado con éxito MAbs específicos de serogrupo y anticuerpos policlonales contra las partículas de la cápsida expresadas en baculovirus (18).

iii)

Prueba inmune puntual (14) Se adsorben sobre nitrocelulosa pequeños volúmenes (2 µl) de sobrenadante de cultivo de células infectadas o de células infectadas que han sido lisadas o sonicadas y se deja secar. Los sitios de unión inespecífica se bloquean incubando con una solución que contenga proteína de leche

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Capítulo 2.1.9. — Lengua azul

desnatada. Después de incubar con un MAb reactivo para el serogrupo LA, el anticuerpo se detecta utilizando IgG anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano. •

Serotipado por neutralización de virus

Las pruebas de neutralización son específicas de tipo para los 24 serotipos de BTV actualmente reconocidos y pueden emplearse para serotipar un virus aislado o modificarse para determinar la especificidad de los anticuerpos en los sueros. En el caso de un aislamiento no tipado, la localización regional característica de los serotipos de BTV eliminará, por lo general, la necesidad de realizar la neutralización con todos los 24 antisueros, en particular cuando se han identificado los serotipos endémicos. Existe una serie de métodos disponibles, que se basan en el cultivo celular, para detectar la presencia de anticuerpos neutralizantes anti-BTV. Las líneas celulares más utilizadas son BHK, Vero y L929. Más adelante se resumen cuatro métodos para serotipar el BTV. Se ha descrito que los antisueros específicos de serotipo generados por cobayas y conejos presentan menos reacción cruzada que los obtenidos de ganado vacuno u ovino. Es importante incluir controles del antisuero para asegurarse de que se utiliza un nivel eficaz de antisuero de referencia frente a títulos comparables y estandarizados de virus de referencia y virus no tipado. i)

Reducción de placas (o calvas) El virus que va a ser serotipado se diluye hasta que contenga aproximadamente 100 unidades formadoras de placas (PFU) y se incuba sin suero o con antisueros individuales estándar de una serie de serotipos de BTV. Se añaden las mezclas de virus/antisuero a las monocapas celulares y se determina el título de virus mediante ensayos de placas (o calvas). Se considera que el virus no identificado es serológicamente idéntico a un serotipo estándar cuando éste último resulta neutralizado de forma similar si se realiza la prueba en paralelo con el virus problema.

ii)

Inhibición de placas (o calvas) Las pruebas se realizan en placas Petri de 90 mm de diámetro que contienen monocapas celulares confluentes que se infectan con aproximadamente 5 x 104 PFU de virus estándar y de virus no tipado. Después de la adsorción y la eliminación del inóculo, la monocapa se cubre con agarosa. En discos individuales de papel de filtro se añaden antisueros estándar anti-BTV, que se colocan sobre la superficie de agarosa. Las placas se incuban por lo menos 4 días. Alrededor del disco que contenga el antisuero homólogo aparecerá una zona de neutralización del virus con la consiguiente supervivencia de la monocapa celular.

iii)

Neutralización en microtitulación En una placa de microtitulación con pocillos de fondo plano se añaden aproximadamente 100 DICT50 (dosis infectiva del 50% en cultivo de tejidos) del virus estándar y del virus no tipado en un volumen de 50 µl por pocillo, y se mezcla con el mismo volumen de antisuero estándar diluido con medio de cultivo de tejidos. En un volumen de 100 µl se añaden aproximadamente 104 células por pocillo y, después de incubar durante 4-6 días, se leen los resultados de la prueba utilizando un microscopio invertido. Los pocillos se analizan respecto al grado de ECP observado. Los pocillos que contengan sólo células o células y antisuero no deberían mostrar ECP. Por el contrario, los pocillos con células y virus deberían mostrar un ECP claro. Se considera que el virus no identificado es serológicamente idéntico al serotipo estándar de BTV si ambos resultan neutralizados en la prueba con un grado similar.

iv)

Prueba de inhibición de la fluorescencia (5) Este método de neutralización, rápido y sencillo, requiere varias concentraciones de un virus desconocido y concentraciones estándar de antisueros de referencia. Los virus aislados que han crecido en cultivo celular se diluyen en serie y se mezclan con antisueros individuales de referencia en los pocillos de una placa Lab-Tek durante 1 hora antes de añadir las células. Después de incubar 16 horas, las células se fijan y se tratan con un procedimiento inmunofluorescente que utiliza un MAb específico del serogrupo LA. El serotipo del virus se indica por la especificidad del antisuero que causa una reducción mayor en el número de células fluorescentes.

c)

Reacción en cadena de la polimerasa (prueba prescrita para el mercado internacional) La amplificación del ácido nucleico vírico dirigida por cebadores ha revolucionado el diagnóstico de la LA (8, 26, 37). Las técnicas de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) han permitido la identificación rápida del ácido nucleico vírico del BTV en la sangre y otros tejidos de animales infectados. Respecto al comercio internacional, la PCR ha permitido la identificación de animales con anticuerpos contra BTV que son negativos para la presencia del ácido nucleico viral, lo que permite su importación. La PCR también se puede emplear para establecer el serogrupo de los Orbivirus y, en último término, para serotipar el BTV a los pocos días de recibir una muestra clínica, como sangre de una oveja infectada. Los enfoques clásicos, que dependen del aislamiento del virus y de su identificación serológica, pueden tardar por lo menos 3-4 semanas en suministrar información sobre serogrupos y serotipos.

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Capítulo 2.1.9. — Lengua azul

Los cebadores oligonucleotídicos utilizados hasta ahora derivan del ARN 7 (gen VP7) (37), del ARN 6 (gen NS1) (9), del ARN 3 (gen VP3) (30), del ARN 10 (gen NS3) (4) y del ARN 2 (VP2) (26). En general, el tamaño de los productos amplificados de la transcripción es pequeño -del orden de varios centenares de nucleótidos- pero también puede ser un gen completo. En el procedimiento que se describe más adelante con detalles se amplifica un fragmento del ARN 6 con 101 nucleótidos. Los cebadores que derivan de genes más conservados, como el VP3, VP7 y NS1, se pueden utilizar para serogrupos (es decir, reaccionarán con todos los miembros del serogrupo LA), mientras que aquellos cuya secuencia deriva de las secuencias de genes VP2 permiten obtener información sobre el serotipo vírico. Se ha utilizado un ensayo de PCR múltiple, que depende del tamaño de los productos amplificados, para identificar en una sola reacción los cinco serotipos norteamericanos del BTV, tanto aislados como en mezclas (19). En el BTV, la secuencia nucleotídica de genes homólogos puede variar en función del área geográfica del aislamiento del virus (17). Esto supone una oportunidad única para complementar estudios epidemiológicos sobre el BTV, al suministrar información sobre el potencial origen geográfico de los virus aislados, un proceso que se denomina genotipado o topotipado. Por tanto, la determinación de la secuencia de porciones del ARN 3 y ARN 6 puede indicar si el virus procede de Australia, Norteamérica o Sudáfrica. Parece probable que la secuenciación de BTV aislados de otras partes del mundo permita una discriminación más fina del origen geográfico. No obstante, la relación entre la secuencia y el origen geográfico puede no ser directa. Por análisis mediante PCR del ARN del segmento genómico 7 (38) los genotipos específicos de zonas geográficas no quedaron tan claramente definidos como lo fueron usando el ARN del segmento genómico 3 (17). El desarrollo del topotipo como instrumento epidemiológico depende, por tanto, de la adquisición de datos sobre las secuencias de BTV aislados de muchas regiones diferentes del mundo y de la disponibilidad de los datos en bancos de datos de fácil acceso. En principio, con una base de datos sobre secuencias del ARN 2 suficientemente grande, se podría determinar rápidamente el serotipo del virus por amplificación del ARN 2 mediante PCR. Para facilitar este proceso, se deberían hacer accesibles nuevos datos de secuenciación derivados tanto de aislamientos de BTV caracterizados como no caracterizados enviando los datos a sitios de la web tales como: http://www.iah.bbsrc.ac.uk/dsRNA_virus_proteins/ and http://www.iah.bbsrc.ac.uk/dsRNA_virus_proteins/btv_sequences.htm. El sitio de la web http://www.iah.bbsrc.ac.uk/dsRNA_virus_proteins/btv2-segment-2-tree.htm presenta análisis de árboles filogenéticos de aislamientos de BTV basados en la secuencia del ARN 2. Estos datos representarán un recurso para estudios epidemiológicos, la identificación de nuevos aislados y el diseño de nuevos cebadores para PCR posterior por trascripción inversa (RT) y, posiblemente, para pruebas específicas de serotipo de BTV. Se ha observado que en la sangre de terneros y ovejas infectadas se puede detectar el ácido nucleico del BTV durante al menos 30 días, y a veces hasta 90 días, después de que el virus pueda aislarse. Cuando la sangre positiva para el virus (infecciosa) o negativa para el virus pero positiva por PCR (detectable sólo por PCR) se inoculó o se dio por alimento al vector Culicoides sonoriensis, se demostró que el virus se multiplicada y se transmitía sólo por los vectores expuestos a la sangre infecciosa. Los vectores expuestos a sangre sólo positiva por PCR no amplificaban ni transmitían el BTV (23). Debido a esto, el diagnóstico basado en PCR debe interpretarse con limitaciones. El procedimiento basado en PCR detecta ácido nucleico específico del virus, pero no indica necesariamente la presencia de virus infeccioso. La capacidad de las pruebas PCR para detectar un pequeño número de moléculas de ácido nucleico significa que tales pruebas son muy sensibles a la contaminación por ácidos nucleicos extraños, incluyendo cualquier cebador utilizado en el laboratorio o polonucleótidos amplificados previamente. Por tanto es importante disponer de un área "limpia" que contenga todo el equipo necesario para la preparación de los reactivos y de las pruebas y un área separada para el propio equipo de amplificación. Se deben utilizar guantes de látex y cambiarlos con frecuencia en todas las fases del procedimiento, en particular después de trabajar con muestras de ARN o de ADN amplificado. Esto ayuda a proteger a los reactivos y a las muestras de la contaminación por ARNasas ubicuas y otros agentes y de la contaminación cruzada con ADN. La posibilidad de falsos positivos por contaminación de la muestra realza la importancia de secuenciar los productos de la PCR para determinar, por ejemplo, si la secuencia amplificada es idéntica o diferente de la de un control positivo. Los resultados negativos falsos, debidos, por ejemplo, a muestras de baja calidad o a cebadores inadecuados, se pueden identificar determinando la imposibilidad de amplificar algún gen del BTV o del hospedador, como el de la globina, en extractos de células infectadas. La prueba de PCR que se describe comprende tres procedimientos separados. En el primero se extrae el ARN del BTV a partir de sangre mediante un agente caotrópico como tiocianato de guanidina (GuSCN) para desnaturalizar las proteínas y liberar el ARN vírico. Para esto existen varias preparaciones comerciales en el mercado y el protocolo indicado describe la utilización de uno de esos preparados, el IsoQuick (Orca Research, Bothell, Washington, EE.UU.). Los reactivos suministrados con la preparación vienen numerados y su uso se indica en el protocolo descrito más adelante. Existen otras preparaciones disponibles y una de

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ellas, la TRIZOL (Life Technologies, Grand Island, New York, EE.UU.), es particularmente útil para la extracción del ácido nucleico del virus del bazo o de coágulos de sangre. Los operadores deben seguir las indicaciones señaladas en cada caso y el uso de las soluciones de los reactivos suministradas o recomendadas. El segundo procedimiento es la desnaturalización del ARN vírico de cadena doble y la transcripción inversa para generar cADN, que se amplifica por PCR. En el procedimiento descrito a continuación se utiliza el Superscript™ Amplification System (Life Tecnologies) para transcribir el ARN vírico y reactivos de Perkin-Elmer para la PCR. Existen preparaciones y reactivos equivalentes en otras fuentes comerciales. El paso final del proceso es el análisis del producto de la PCR por electroforesis. Los procedimientos para determinar la secuencia del producto amplificado no se describen aquí. •

Extracción del ARN viral

i)

Se recoge, en tubos con EDTA, sangre entera de los animales a ensayar y de controles no infectados y se centrifuga a 800-1.000 g durante 10 minutos. Se aspira el plasma y los eritrocitos (RBCs) se resuspenden suavemente en PBS estéril. Los RBCs se sedimentan por centrifugación a 1.000 g durante 10 minutos y se elimina el sobrenadante.

ii)

A continuación se añaden 400 µl de los RBCs de ensayo a cada uno de cuatro tubos de microcentrífuga de 1,7 ml y otros 400 µl de RBCs control a cada uno de dos tubos de microcentrífuga. A cada tubo se añade el mismo volumen de agua libre de ARNasa y se agitan brevemente en un vórtex para mezclar y lisar las células. Se congelan dos tubos que contengan los RBCs de ensayo a 70°C con fines de reposición y se continúa la extracción por duplicado.

iii)

Se centrifugan los RBCs lisados del ensayo y del control a 12.000-16.000 g durante 10 minutos y se elimina el sobrenadante. Luego se añaden 800 µl de agua libre de ARNasa y los tubos se agitan en un vórtex y se centrifugan de nuevo a la misma velocidad durante 10 minutos. Se elimina el sobrenadante y el precipitado con los RBCs se deja escurrir.

iv)

Se añade un pequeño volumen de BTV (por ejemplo, 5 µl que contengan de 103 a 107 PFU) a uno de los dos tubos con el precipitado de RCBs control. Este es el control positivo. El otro tubo que contiene el precipitado de RCBs control se convierte en el control negativo.

v)

A continuación se añade a cada precipitado 75 µl de tampón de muestra (reactivo A de IsoQuick), y se agitan vigorosamente en un vórtex, añadiendo después 125 µl de la solución de lisis que contiene GuSCN (reactivo 1 de IsoQuick). La mezcla se agita vigorosamente en un vórtex durante 30 segundos.

vi)

Antes de utilizar la matriz de extracción que acompaña a la preparación comercial (reactivo 2 de IsoQuick más el colorante 2A) se agita vigorosamente y se añaden 500 µl a los lisados. Después se añaden 400 µl de tampón de extracción (reactivo 3 de IsoQuick) y los tubos se agitan en un vórtex durante 10 segundos.

vii)

Se incuban los tubos a 65°C durante 10 minutos, se agitan brevemente después de 5 minutos y se centrifugan a 12.000 g durante 5 minutos.

viii) La fase acuosa (500 µl) se transfiere a un tubo nuevo de microcentrífuga y se añade el mismo volumen de matriz de extracción (reactivo 2 de IsoQuick). Los tubos se agitan en vórtex durante 10 segundos y se centrifugan a 12.000 g durante 5 minutos. ix)

La fase acuosa (330 µl) se transfiere a un tubo nuevo de microcentrífuga y se añaden 33 µl acetato sódico al 10% (reactivo 4 de IsoQuick) y 365 µl de isopropanol. Después de mezclar suavemente, se colocan los tubos de 20 minutos a 1 hora a -20°C.

x)

El ARN se precipita por centrifugación a 12.000 g durante 10 minutos. Se decanta el sobrenadante y se añade 1,0 ml de etanol al 70% mezclando suavemente. Después de centrifugar a 5.000 g durante 5 minutos, se decanta el sobrenadante y se añade 1,0 ml de etanol al 100%. Se guardan los tubos a –70°C hasta que se usen en la RT-PCR.

•

Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa

i)

Se centrifuga el ARN en etanol a 12.000 g durante 5 minutos. Se decanta el l etanol y se invierten los tubos para dejar escurrir. El precipitado, que puede pasar desapercibido, no debe secarse porque esto haría difícil su resuspensión. También es posible que un precipitado seco se desprendiera del tubo invertido.

ii)

Se añade a cada tubo 12 µl de agua libre de ARNasa, se mezcla y se calienta a 65°C durante 510 minutos. Las muestras se colocan en hielo.

iii)

En una campana de bioseguridad "limpia", se preparan en agua libre de ARNasa las soluciones stock que contienen 200 pmoles/µl de los cebadores A, B, C y D y se guardan a -70°C.

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Cebadores de la primera fase de la PCR (para amplificar el ARN 6 desde el nucleótido 11 al 284) Cebador A: 5’-GTT-CTC-TAG-TTG-GCA-ACC-ACC-3’ Cebador B: 5’-AAG-CCA-GAC-TGT-TTC-CCG-AT-3’ Cebadores de la PCR (para amplificar el RNA 6 del nucleótido 170 al 270) Cebador C: 5’-GCA-GCA-TTT-TGA-GAG-AGC-GA-3’ Cebador D: 5’-CCC-GAT-CAT-ACA-TTG-CTT-CCT-3’ iv)

Las soluciones stock de los cebadores se diluyen a una concentración de 15-20 pmoles/µl. Se preparan los cebadores para la primera fase de la reacción de PCR mezclando volúmenes iguales de A y B. Se preparan los cebadores para la otra fase de la reacción de PCR mezclando volúmenes iguales de C y D. Las mezclas de cebadores se congelan a -20°C en pequeñas alícuotas.

v)

Se rotulan los tubos de reacción y se añade a cada tubo 4 µl de mezcla de los cebadores (A+B) para la primera fase de síntesis. Los tubos se dejan en hielo.

vi)

En una campana extractora de humos "limpia" se diluyen por separado, en agua libre de ARNasa, hidróxido metilmercúrico a 50 mM (dilución 1/20) y 2-mercaptoetanol a 350 mM (dilución 1/40). Estos compuestos están catalogados respectivamente como extremadamente tóxico y muy tóxico. Hay que utilizar ambos con mucho cuidado y eliminarlos, así como las puntas de pipeta utilizadas con ellos, según las normas de seguridad,

vii)

Después se añaden 4 µl de las muestras de ARN de ensayo y de control positivo y negativo (paso (ii)) sobre los 4 µl de mezcla de cebadores de PCR (38).

viii) A cada tubo de PCR se añaden 2,0 µl de la dilución 1/20 de hidróxido metilmercúrico con agitación suave y se deja estar a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de añadir 2,0 µl de la dilución 1/40 de 2-mercaptoetanol. Por razones de seguridad, algunos laboratorios utilizan formamida en vez de hidróxido metilmercúrico para desnaturalizar el ARN de dos cadenas. Sin embargo, es preferible el hidróxido metilmercúrico para una sensibilidad óptima. ix)

En una campana "limpia" se prepara una mezcla para ADNc que contenga los siguientes reactivos en volumen suficiente para el número de muestras que se van a ensayar. La cantidad indicada es por muestra y los reactivos son los contenidos en la preparación Superscript™ Preamplification System (Life Technologies). 10‰tampón SuperscriptTM (200 mM Tris/HCl, pH 8,4, y 500 mM KCl) MgCl2 (25 mM Mezcla de dNTP (10 mM de dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Dithiothreitol (DTT) (0,1 M) Transcriptasa inversa (200 units/µl)

2,0 2,0 1,25 2,0 0,75

µl µl µl µl µl

x)

Después se añaden 8 µl de la mezcla a cada tubo de PCR hasta un volumen final de20,0 µl.

xi)

Se colocan los tubos de PCR en un termociclador, como el GeneAmp™ PCR System 9600, que se programa para transcripción inversa del siguiente modo: Mantener 44°C Mantener 4°C

xii)

50 minutos Constante

Se sacan los tubos del termociclador y se añade a cada tubo 1,0 µl de ARNasa H y una bola de cera. El ciclador se programa del siguiente modo: Mantener 37°C Mantener 98°C Mantener 4°C

20 minutos 4 minutos Constante

xiii) En una campana "limpia" se prepara una mezcla de primera amplificación que contenga los siguientes reactivos en volumen suficiente para el número de muestras de ensayo. Todos los reactivos, excepto el agua, son comercializados por Perkin-Elmer. La cantidad que se indica es por muestra. ARNasa sin agua 10‰tampón PCR Perkin-Elmer (100 mM Tris/HCl, pH 8,3, y 500 mM KCl) MgCl2 (25 mM) Mezcla de dNTP (2,5 mM de dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Taq ADN polimerasa (5 unidades/µl)

62,0 µl 7,0 µl 7,0 µl 4,0 µl 0,85 µl

xiv) La mezcla de la primera fase se saca del área "limpia" y se lleva al área del termociclador y se depositan 80 µl en cada tubo con muestra. La capa de cera no debe romperse. Cada tubo debe contener entonces 101 µl.

220

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Capítulo 2.1.9. — Lengua azul

xv)

Se colocan los tubos en el termociclador que se programa como se indica para la primera fase de amplificación (correcto para el GeneAmp PCR System 9600 -la programación en otros termocicladores debe determinarse): Un ciclo:

Mantener 95°C Mantener 58°C Mantener 72°C

3 minutos 20 segundos 30 segundos

40 ciclos:

Mantener 95°C Mantener 58°C Mantener 72°C

20 segundos 20 segundos 20 segundos

Un ciclo:

Mantener 95°C Mantener 58°C Mantener 72°C Mantener 4°C

20 segundos 20 segundos 5 minutos Constante

xvi) 15 minutos antes de que se complete la programación, se preparan tubos de PCR para la siguiente reacción en una campana "limpia", y se mantienen en hielo: ARNasa sin agua Mezcla de cebadores (C+D) Bola de cera

17 µl por tubo 4,0 µl por tubo

xvii) Cuando se completa la primera fase de amplificación, se sacan los tubos del termociclador y se colocan en una cabina de seguridad biológica (no la campana "limpia). Después, se transfiere 1,5 µl del producto de la primera fase al tubo correspondiente de PCR de la segunda fase que contiene cebador, agua y una bola de cera. xviii) Se colocan los tubos en el termociclador que se programa como se indica para la formación de una capa de cera: Mantener 98°C Mantener 4°C

4 minutos Constante

xix) En una campana "limpia" se prepara la mezcla de los siguientes reactivos en volumen suficiente para el número de muestras a ensayar. Los reactivos son los mismos que en la primera fase (paso xii). Las cantidades que se indican son por muestra: ARNasa sin agua 10 ‰ tampón PCR MgCl2 Mezcla de dNTP Taq ADN polymerasa

17,0 µl 5,0 µl 3,5 µl 4,5 µl 0,5 µl

xx)

La mezcla se pasa de la campana "limpia" al termociclador y se depositan 30 µl en cada tubo. Cada tubo debe contener entonces 52 µl.

xxi)

Se colocan los tubos en el termociclador, que se programa como se indica para la segunda amplificación. Después de completar el proceso, los tubos se mantienen a 4°C o a –20°C hasta la electroforesis: Un ciclo:

40 ciclos:

Un ciclo:

Mantener 95°C Mantener 58°C Mantener 72°C

3 minutos 20 segundos 30 segundos

Mantener 95°C Mantener 58°C Mantener 72°C

20 segundos

Mantener 95°C Mantener 58°C Mantener 72°C Mantener 4°C

20 segundos

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

20 segundos 20 segundos

20 segundos 5 minutos Constante

221

Capítulo 2.1.9. — Lengua azul

•

Análisis electroforético del producto de la PCR

i)

Al principio se prepara tampón 1 x TBE (Tris/borato, pH 8,6, y EDTA 1,5 mM) a partir de una solución stock x 10. Para el sistema de Bio-Rad Wide Mini-Sub cell, se preparan 700 ml (100 ml para el gel y 600 ml para el depósito de tampón).

ii)

Se prepara en tampón TBE una solución al 3% de agarosa NuSieve 3/1 (FMC Bioproducts, Rockland, Maine, EE.UU.) o una agarosa equivalente. La solución se hierve hasta que la agarosa se disuelve por completo y luego se deja enfriar hasta 40°C. Se añade bromuro de etidio a una concentración de 0,5 µg/ml tanto al tampón de la agarosa como al del depósito. El bromuro de etidio es mutagénico y tóxico. Se debe utilizar siempre guantes, ropa protectora y protección ocular.

iii)

Se cierran los extremos de la bandeja de electroforesis y se vierte la solución de agarosa. El peine se inserta en la agarosa hasta que se solidifica en una superficie nivelada a los 30-60 minutos. El peine y el cierre se eliminan con cuidado de la bandeja de electroforesis.

iv)

Verter el tampón en el depósito del aparato de electroforesis e insertar la bandeja con la agarosa de modo que el tampón cubra la agarosa.

v)

Las muestras de ensayo y los controles positivos y negativos se preparan para electroforesis en tubos de microcentrífuga del modo siguiente: Solución de gel de carga (Cat. G-2526, Sigma, St Louis, Missouri, EE.UU.) 5,0 µl ADN amplificado de cada tubo de PCR y un tubo extra para un ADN marcador 15,0 µl Solución de gel de carga (Cat. G-2526, Sigma, St Louis, Missouri, EE.UU.) 5,0 µl Marcador de 100 pares de bases (Cat. 15268-019, Life Technologies, Grand Island, New York, EE.UU.) 1,0 µl

vi)

Se cargan las muestras en los pocillos adecuados del gel y se corren a 65-75 voltios durante 1-1,5 horas o hasta que el colorante alcance la mitad de la longitud del gel. El gel se lleva a un transiluminador y se fotografía para documentación permanente. Usar protección ocular para visualizar las bandas en el gel.

vii)

Las muestras positivas para LA tendrán una banda de 101 pares de bases. Para que la prueba sea válida, el control positivo debe mostrar una banda del tamaño correcto, y el negativo y los controles sin ARN no deben mostrar banda. Las muestras se consideran positivas si hay una banda del mismo tamaño que la del control positivo. Las muestras duplicadas deberían mostrar la misma reacción. Si existe disparidad, la prueba debe repetirse.

viii) Durante una noche se coloca en el tampón del depósito un envase (Ameresco, Solon, Ohio, EE.UU.) al objeto de eliminar el bromuro de etidio. Después se puede verter el tampón al alcantarillado y debe colocarse el envase, después de reutilizarlo 10-15 veces, en un recipiente identificado adecuadamente como bromuro de etidio y, finalmente, incinerado. Los equipos y reactivos para dos pruebas serológicas ordenadas - la prueba de inmunodifueión en gel de agar (IGDA) y la prueba C-ELISA- se pueden obtener de tres fabricantes autorizados en EE.UU (VMRD, P.O. Box 502, Pullman, Washington 99163, U.S.A.; o Veterinary Diagnostic Technology, 4980 Van Gordon Street, Suite 101, Wheat Ridge, Colorado 80033, U.S.A.; o Diagxotics, 27 Cannon Road, Wilton, Connecticut 06897, U.S.A.). Los reactivos para C-ELISA están disponibles en: European Union ‘Community Reference Laboratory’ for BTV (Pirbright Laboratory, Ash Road, Pirbright, Woking GU24 0NF, United Kingdom).

2.

Pruebas serológicas

Los anticuerpos contra BTV generados en animales infectados pueden detectarse de varios modos que dependen de la sensibilidad y el tipo de prueba utilizada. Se inducen tanto anticuerpos específicos de serogrupo como anticuerpos específicos de serotipo, y si el animal no ha estado previamente expuesto al BTV, los anticuerpos neutralizantes que se generan son específicos para el virus infectante. Las infecciones múltiples con diferentes serotipos de BTV dan lugar a la producción de anticuerpos capaces de neutralizar serotipos a los que el animal no ha estado expuesto. Hay dos explicaciones para este fenómeno. Primero, varios serotipos comparten epítopos de neutralización definidos por MAbs monoclonales. Segundo, los serotipos también comparten un gran número de epítopos que están presentes en una conformación neutralizante en un serotipo, pero en conformaciones no neutralizantes en otros serotipos.

a)

Fijación de complemento Hasta 1982 se utilizó ampliamente una prueba de fijación de complemento (7) para detectar anticuerpos contra BTV, que fue en gran medida reemplazada por la prueba IGDA aunque la prueba FC todavía se utiliza en algunos países.

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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Capítulo 2.1.9. — Lengua azul

b)

Inmunodifusión en gel de agar (una prueba prescrita para el mercado internacional) La prueba IGDA para detectar anticuerpos anti-BTV es de desarrollo simple y el antígeno utilizado en la prueba es relativamente fácil de generar. Desde 1982, la prueba ha sido el procedimiento estándar de ensayo para controlar el movimiento internacional de rumiantes. Sin embargo, una de las desventajas de la IGDA utilizada para LA es su falta de especificidad, por la que puede detectar anticuerpos contra otros Orbivirus, en particular los del serogrupo EHD. Por tanto, los sueros positivos por IGDA deben ser probados de nuevo utilizando una prueba específica para el serogrupo LA. La falta de especificidad y la subjetividad que se ejerce durante la lectura de los resultados ha promovido el desarrollo de procedimientos basados en ELISA para la detección específica de anticuerpos anti-BTV. La versión preferida, una técnica C-ELISA, se describe en la sección B.2.c.

c)

•

Procedimiento de la prueba

i)

Se prepara una capa de 2,8 mm de grosor de agarosa al 0,9% en NaCl al 0,85% y se cortan pocillos circulares de 4,0 mm de diámetro separados entre sí 2,4 mm, con un pocillo central y seis pocillos periféricos.

ii)

Se prepara antígeno vírico generando una preparación soluble de células BHK o Vero infectadas 2448 horas antes con un serotipo individual de BTV. El antígeno se puede concentrar por precipitación o ultrafiltración.

iii)

Se colocan tres sueros positivos y tres sueros de ensayo de forma alterna en los pocillos que rodean el pocillo central que contiene el antígeno y se incuban las placas 24 horas en un ambiente húmedo a 20-25°C.

iv)

Se forma una serie de líneas de precipitina entre el antígeno y los sueros positivos, y las líneas generadas por los sueros de ensayo positivos se juntarán con las de los controles positivos. Con muestras débilmente positivas las líneas control se curvan hacia el antígeno y se separan del pocillo de la muestra de ensayo, pero no forman una línea continua con los pocillos de control de la prueba. Con muestras negativas, las líneas de precipitina continúan en los pocillos de la muestra sin curvarse hacia el antígeno.

v)

Todas las muestras débilmente positivas y otras muestras que produzcan resultados dudosos deben repetirse utilizando pocillos de 5,3 mm de diámetro separados entre sí 2,4 mm o probarse de nuevo utilizando C-ELISA como se describe a continuación.

Enzimoinmunoensayo competitivo La prueba competitiva ELISA, o prueba ELISA bloqueante para LA, se desarrolló para medir anticuerpos específicos contra BTV sin detectar anticuerpos de reacción cruzada con otros Orbivirus (1, 3, 22, 28, 31). La especificidad es el resultado de utilizar uno de varios MAbs con reactividad de serogrupo para LA, como MAb-3-17-A3 (3) o MAb 20E9 (21, 22). Los anticuerpos proceden de varios laboratorios y, aunque son diferentes, todos parecen unirse a la región amino-terminal de la principal proteína de la cápsida, VP7. En la prueba C-ELISA, los anticuerpos de los sueros de ensayo compiten con los MAbs para unirse al antígeno. El siguiente procedimiento de C-ELISA se ha estandarizado después de estudios comparativos en varios laboratorios internacionales. •

Procedimiento de la prueba

i)

Durante una noche a 4°C o durante 1 hora a 37°C, se recubren los 96 pocillos de las placas de microtitulación con 50-100 µl de antígeno derivado de cultivos celulares obtenido por sonicación (3) o del antígeno principal de la cápsida VP7 expresado en baculovirus (29) o levaduras (25), y diluidos en 0,05 M de tampón carbonato, pH 9,6.

ii)

Las placas se lavan cinco veces con PBST (0,01 M de PBS con 0,05% o 0,1% de Tween 20, pH 7,2).

iii)

A continuación se añaden por duplicado 50 µl de sueros de ensayo a una única dilución, 1/5 (1) o 1/10 (22), en PBST que contenga 3% de seroalbúmina bovina (BSA).

iv)

Inmediatamente, se añade a cada pocillo 50 µl de una dilución predeterminada de MAb diluido en PBST que contenga 3% de BSA. Los pocillos de control de MAb contienen tampón de dilución en vez de suero de ensayo.

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Capítulo 2.1.9. — Lengua azul

v)

Se incuban las placas 1 hora a 37°C o 3 horas a 25°C, con agitación continua.

vi)

Después de lavar como se indicó anteriormente, los pocillos se llenan con 100 µl de una dilución apropiada de IgG (H+L) anti-ratón obtenida en conejo y marcada con peroxidasa de rábano, realizada en PBST con 2% de suero normal bovino.

vii)

Después de incubar 1 hora a 37°C, se elimina la solución del conjugado y las placas se lavan cinco veces con PBS o PBST. Los pocillos se llenan con 100 µl de solución de substrato que contiene 1,0 M de ABTS (2,2´-azino-bis-[3-etilbenzotiazolina-6 ácido sulfónico]), y 4 mM de H2O2 en 50 mM de citrato sódico, pH 4,0, y las placas se agitan a 25°C durante 30 minutos. (Se pueden utilizar otros substratos y dejar que la reacción continúe con agitación por un tiempo adecuado para permitir el desarrollo de color).

viii) La reacción se detiene adicionando un agente bloqueante, como azida sódica. ix)

Después de poner a cero el lector de ELISA con los pocillos que sólo contienen substrato y agente bloqueante, se miden los valores de absorbancia a 414 nm. Los resultados se expresan como porcentajes de inhibición y derivan de los valores medios de absorbancia de cada muestra por la fórmula siguiente: % inhibición = 100 -[(Media de la absorbancia de la muestra de ensayo) / (Media de la absorbancia del control de MAb)] x 100. NB: Algunos laboratorios prefieren usar un control de suero negativo que previamente se ha visto que tiene un porcentaje de inhibición igual a cero como alternativa al control de MAb.

x)

Porcentajes de inhibición >50% se consideran positivos. Una inhibición entre el 40% y el 50% se considera sospechosa. Los resultados de los duplicados de los sueros de ensayo pueden variar con tal de que los valores caigan dentro del valor de inhibición escogido.

xi)

En cada placa se deben incluir sueros positivos fuertes y débiles y un control de suero negativo. Un positivo débil debe dar un 60-80% de inhibición y un negativo menos de 40% de inhibición.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO De las varias opciones de vacunas posibles, es decir, las vivas atenuadas, las muertas, o las recombinantes, sólo están en uso las vacunas con virus vivos atenuados en varios países. En Sudáfrica, por ejemplo, se han usado durante más de 40 años y se saben que inducen una inmunidad eficaz y duradera (11). Aunque algunos estudios de laboratorios han investigado la eficacia de las vacunas inactivadas contra el virus (15), éstas no parecen haberse utilizado en condiciones de campo. Existen varias posibilidades en el desarrollo de vacunas recombinantes contra BTV, como la presentación por otros virus vivos de los antígenos de neutralización del BTV y de partículas incompletas (VLP) que se generan en células de insectos infectadas por medio de baculovirus recombinantes que expresan las cuatro proteínas mayoritarias de la cápsida VP2, 3, 5 y 7. Sólo la última posibilidad ha demostrado ser una promesa significativa (33). Sin embargo, queda aún mucho por determinar, como la duración de la respuesta neutralizante generada con las VLP, la necesidad de múltiples VLPs de diferentes serotipos, y el escalado comercial de la producción de VLP como proceso eficaz y de coste adecuado. La descripción que sigue es aplicable a las vacunas con virus atenuados.

1.

Control del inóculo

a)

Características del inóculo El inóculo base o primario se prepara a partir de una placa o calva única de BTV atenuado que se ha cultivado por pases seriados. Los lotes de inóculo secundario, que se utilizan como inóculos en la producción de vacunas, derivan por lo general de no más de tres pases adicionales respecto al inóculo primario. El virus del inóculo primario debe estar exento de bacterias, virus, hongos y micoplasmas contaminantes, y en particular de contaminación por pestivirus, y tiene que mostrar la especificidad serotípica deseada. Antes de la producción de la vacuna, cada lote de inóculo primario debería probarse también para transmisión y reversión de la virulencia. Se deben probar en ovejas la avirulencia, seguridad e inmunogenicidad de muestras de la vacuna preparada de inóculos víricos secundarios del máximo nivel de pases permitidos.

b)

Método de cultivo Las primeras vacunas de la LA se propagaron en ECE (2). Más recientemente, se han utilizado varias células diferentes para adaptarlas al cultivo celular y a los pases seriados. Entre éstas están las células

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Capítulo 2.1.9. — Lengua azul

primarias de embrión bovino, células de riñón de cordero y de cordero fetal, y la línea celular continua de células BHK. Las células utilizadas para la atenuación deben ser cuidadosamente comprobadas para detectar la presencia de virus contaminantes. No sólo las líneas celulares pueden contener virus oncogénicos, sino que también las células primarias pueden tener infecciones latentes o no aparentes, como las debidas a contaminación por pestivirus. A este respecto, se debe tener un cuidado especial con el suero fetal bovino utilizado en los cultivos celulares, pues puede estar contaminado. Los virus de las vacunas se atenúan por pases en ECE, en cultivos celulares, o en ambos sistemas.

c)

Validación como vacuna Las vacunas atenuadas contra la LA deben ser seguras y eficaces, y a continuación se presenta una descripción breve de las pruebas relacionadas con estos parámetros. Además, los virus atenuados no deben revertir a virulentos durante su replicación en animales vacunados ni transmitirse desde tales animales por insectos vectores. Este último criterio es muy importante porque la transmisión de virus atenuados mediada por insectos desde animales vacunados a no vacunados, con los subsiguientes pasos replicativos en cada especie hospedadora, aumenta la probabilidad de reversión a la virulencia. Aunque las pruebas de reversión a virulencia y de transmisión se realizan raramente, se resumen en una breve descripción los requisitos. i)

Avirulencia Se inoculan varias ovejas, que por C-ELISA sean seronegativas para LA, con el stock de inóculo primario o un volumen equivalente de medio de cultivo celular. Las temperaturas se anotan dos veces al día. Los animales se controlan regularmente durante 28 días para síntomas clínicos o reacciones locales y sistémicas a fin de asegurar la avirulencia e seguridad. Las muestras de sangre que se toman a intervalos regulares se pueden utilizar para determinar la viremia y la respuesta de anticuerpos. La prueba es válida si todas las ovejas inoculadas con vacuna muestran evidencia de crecimiento vírico sin signos de enfermedad, excepto una enfermedad suave y pasajera. En Sudáfrica se calcula un índice de reacción clínica (33) para cada animal entre los días 4 y 14, y debe estar por debajo de un valor estándar específico.

ii)

Inocuidad Las pruebas de inocuidad de las vacunas atenuadas no contemplan la cuestión de la teratogenicidad (34). Las vacunas con virus atenuados son teratogénicas y no deben administrarse a ovejas gestantes durante la primera mitad del embarazo debido a que pueden causar anormalidades fetales y muerte (20).

iii)

Eficacia Las ovejas vacunadas y no vacunadas reciben un inóculo de desafío con virus virulento del mismo serotipo, y los animales se analizan para síntomas clínicos de LA. Se toman diariamente las temperaturas rectales dos veces. Las ovejas control no vacunadas deberían mostrar signos de LA. Sin embargo, es difícil asegurar la aparición de la enfermedad clínica en ovejas por la inoculación de algunos serotipos y aislados de BTV y, por tanto, la evidencia de infección en las ovejas control no vacunadas puede reducirse a la aparición de un aumento de temperatura de por lo menos 1.7°C sobre la media anterior al inóculo de desafío. Se analizan los sueros, pre- y post-vacunación, para la presencia de anticuerpos neutralizantes.

iv)

Transmisión Los procedimientos para determinar si un virus atenuado se puede transmitir por insectos que se alimentan sobre ovejas virémicas vacunadas son difíciles de realizar y de analizar estadísticamente. Por ello, es raro que se investigue este criterio de validación de la vacuna Hay datos que indican que los virus adaptados a condiciones de laboratorio se pueden transmitir por insectos vectores (35). Un procedimiento adecuado para determinar la transmisión de un virus atenuado requiere que las ovejas estén vacunadas y que, durante la viremia, estén expuestas a Culicoides no infectados a los que se deja alimentar sobre animales no infectados controlados para presencia de BTV y anticuerpos antiBTV. Como el título de virus atenuados en la sangre de las ovejas vacunadas es muy bajo, se necesitarían muchos Culicoides, y sólo una pequeña proporción de éstos llegarían a infectarse y vivir lo suficiente para alimentarse sobre otra oveja no infectada y transmitirle potencialmente el virus. Es difícil diseñar un experimento de laboratorio que tenga en cuenta el número de variables presentes en situaciones de campo. Sin embargo, en Sudáfrica se estima que el título mínimo de virus circulante en el torrente sanguíneo de un animal debe ser por lo menos 103 antes de que un Culicoides se infecte al alimentarse, aunque también se ha sugerido que a veces un título inferior puede resultar infectivo. Para seleccionar una cepa de virus atenuado que sea adecuada, se recoge sangre completa entre los días 4 y 14 post-vacunación y se determina el título viral. Sólo los virus atenuados que generan títulos inferiores a 103 se consideran aceptables para vacunas. Lo datos actuales indican que durante la viremia, y a diferencia de los virus de tipo salvaje, las cepas de BTV adaptadas a condiciones de laboratorio pueden aparecer en el semen de toros y carneros (32). Las implicaciones de estas observaciones en la transmisión de los virus son confusas.

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Capítulo 2.1.9. — Lengua azul

v)

Reversión a la virulencia Los estudios de validación confirman que en ovejas vacunadas los virus atenuados no revierten a virulentos. Por consiguiente, si los insectos no transmiten los virus atenuados de animales vacunados a no vacunados, la reversión a la virulencia resulta ser sólo una posibilidad teórica. Sin embargo, si los virus atenuados pudieran transmitirse de animales vacunados, la reversión a la virulencia durante varios ciclos de replicación en oveja-insecto sería una posibilidad bien distinta. El único modo apropiado de comprobar la reversión a la virulencia bajo estas circunstancias es comparar la virulencia del virus vacunal con la del virus sujeto a varios ciclos de replicación oveja-insecto, como se comentó anteriormente. Esto es difícil de realizar. Por consiguiente, no se ha determinado el efecto de varios pases en insecto y en oveja sobre la virulencia de los virus atenuados. En Sudáfrica se considera que si, durante la fase virémica, la sangre de los animales vacunados se pasa en serie tres veces por oveja sin reversión a la virulencia, las posibilidades de reversión en el campo serán muy pequeñas.

2.

Método de producción

La atenuación de aislados naturales de BTV se realizó primero por pases seriados en ECE. Más recientemente, parece claro que el pase por células en cultivo también resulta en atenuación de la virulencia. No se han hecho estudios para relacionar con precisión el número de pases y el grado de atenuación de virus o serotipos individuales. Para preparar virus atenuados, los aislamientos de campo se adaptan a cultivo celular y se pasan in vitro hasta 40 veces o más. En teoría, en esta etapa se seleccionan varios virus purificados de placas o calvas y cada uno se examina para el nivel de viremia que generan y su capacidad para inducir una respuesta inmune de protección en ovejas vacunadas. El virus ideal es el que se replica a bajo título pero que induce respuesta inmune protectora y éste puede representar la fuente del stock de virus para inóculo primario de la vacuna.

3.

Control interno

Todos los componentes de origen animal, como el suero y las células, deben probarse para presencia de bacterias, virus, hongos o micoplasmas viables.

4.

Control de lotes

a)

Esterilidad Cada lote de vacuna tiene que ser probado para presencia de bacterias, virus extraños, hongos y micoplasmas, y en particular contaminación por pestivirus. Por ejemplo, en Sudáfrica, se inocula un conjunto de diez ampollas seleccionadas al azar en caldo de soja y caldo de tioglicolato y se incuba a temperatura ambiente y a 37°C, respectivamente, durante 14 días. Si el cultivo aparece contaminado, el lote queda descalificado.

b)

Inocuidad Cada lote se prueba para inocuidad en ratón adulto y neonato, en cobayas y en oveja. Si se advierten reacciones adversas o síntomas notables, se repite la prueba. Cualquier incremento en la temperatura corporal del animal por encima de la esperada para esa cepa particular de virus atenuado que se está ensayando debe considerarse como sintomático. Si los resultados no son satisfactorios, el lote se descalifica.

c)

Potencia Cada lote se prueba inoculando ovejas susceptibles. Los sueros de pre-vacunación y los de 21 y 28 días post-vacunación se prueban por ensayos NV para determinar los niveles de anticuerpos neutralizantes. Para superar este aspecto, el título de anticuerpo debe ser igual o superior a unos valores establecidos por estándares internacionales de vacunas.

d)

Duración de la inmunidad Los estudios sobre vacunas con BTV vivo atenuado han mostrado que en ovejas los anticuerpos aparecen antes del día 10 post-vacunación, alcanzan un máximo aproximadamente 4 semanas después y persisten durante más de un año. Existe una relación temporal entre el aumento en el título de anticuerpos neutralizantes y la desaparición del virus de la circulación periférica. Las vacunas con BTV vivo atenuado se han usado más de 40 años y se sabe que inducen una inmunidad eficaz y duradera (13). En áreas endémicas de Sudáfrica se presentan muchos serotipos de BTV, y se usan vacunas polivalentes. La inclusión en la vacuna de 15 serotipos implica que no se genera una respuesta inmune eficaz frente a todos los serotipos, probablemente porque la masa antigénica de algunos antígenos individuales específicos de serotipo es pequeña. Para intentar ampliar la respuesta, se repite anualmente la vacunación (12).

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Capítulo 2.1.9. — Lengua azul

e)

f)

Estabilidad La estabilidad debe probarse a lo largo de un período de 2 años. Se considera que las vacunas en forma líquida o liofilizada tienen una caducidad de 1 y 2 años, respectivamente. Cada lote de vacuna se somete a una prueba de caducidad acelerada, guardándolas a 37°C durante 7 días. Luego se titulan y evalúan con arreglo a un procedimiento estándar, como se determina en las pruebas iniciales de la vacuna. Precauciones (riesgos) La vacuna polivalente es segura excepto cuando se usa en ovejas en la primera mitad del embarazo. Los corderos que tengan inmunidad por el calostro no pueden ser vacunados con eficacia antes de los 6 meses de edad.

5.

Pruebas sobre el producto final

a)

Inocuidad

b)

Ver C.4.b. Potencia Ver C.4.c.

AGRADECIMIENTOS Se agradece al Dr. Peter Mertens su valiosa correspondencia sobre el futuro del diagnóstico por PCR, al Dr. H. Aitchison por suministrar información sobre la producción y ensayo de la vacuna LA en Sudáfrica, a los Laboratorios Nacionales de Servicios Veterinarios en Ames, Iowa, EE.UU., por facilitar el protocolo detallado de PCR para la lengua azul, y a todos los críticos del capítulo publicado previamente en el Manual del año 2000.

REFERENCIAS 1.

AFSHAR A., THOMAS F.C., W RIGHT P.F., SHAPIRO J.L. & ANDERSON J. (1989). Comparison of competitive ELISA, indirect ELISA and standard AGID tests for detecting bluetongue virus antibodies in cattle and sheep. Vet. Rec., 124, 136–141.

2.

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3.

ANDERSON J. (1984). Use of monoclonal antibody in a blocking ELISA to detect group specific antibodies to bluetongue virus. J. Immunol. Methods, 74, 139–149.

4.

BILLINIS C., KOUMBATI M., SPYROU V., NOMIKOU K., MANGANA O., PANAGIOTIDIS C.A. & PAPADOPOULOS O. (2001). Bluetongue virus diagnosis of clinical cases by a duplex reverse transcription–PCR: a comparison with conventional methods. J. Virol. Methods, 98, 77–89.

5.

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6.

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Capítulo 2.1.9. — Lengua azul

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* * *

NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Lengua azul (ver Cuadro en la parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar la página web de la OIE para una lista actualizada: www.oie.int)

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CAPÍTULO 2.1.10.

VIRUELA OVINA Y VIRUELA CAPRINA

RESUMEN La viruela ovina y caprina son enfermedades víricas de las ovejas y de las cabras que se caracterizan por fiebre, aparición de pápulas o nódulos generalizados, vesículas (raramente), lesiones internas (particularmente en los pulmones), y por la muerte. Ambas enfermedades están causadas por cepas de capripoxvirus, que pueden infectar a las ovejas y a las cabras, y, aunque la mayoría de las estirpes examinadas causan la enfermedad clínica en su forma más grave ya sea en las ovejas o en las cabras, se han aislado algunas cepas que son igualmente patógenas en ambas especies. Se ha propuesto que se haga referencia a la viruela maligna de las ovejas y de las cabras causada por capripoxvirus, incluyendo la viruela ovina y caprina de Kenia, la dermatitis caprina de India y la forma nodular de la enfermedad de las ovejas y de las cabras del norte de África, como la viruela caprina. La viruela caprina es endémica en África (al norte del Ecuador), Oriente Medio, Turquía, Irán, Afganistán, India, Nepal, en zonas de la República Popular China, y, desde 1984, en Bangladesh. Recientemente, la enfermedad ha hecho frecuentes apariciones en el sur de Europa. Identificación del agente: La confirmación más rápida de la viruela caprina en el laboratorio es la identificación de los viriones típicos de la viruela caprina utilizando el microscopio electrónico de transmisión en combinación con una historia clínica de la infección generalizada de la viruela caprina. El virión de la viruela caprina es diferente del de otro poxvirus que comúnmente infecta a las ovejas y a las cabras – un parapoxvirus que causa el ectima contagioso o dermatitis pustular contagiosa. Se puede identificar un antígeno de precipitación mediante una prueba de inmunodifusión en gel de agar (IGDA) utilizando material de biopsia de un ganglio linfático de un caso temprano de viruela caprina y de sueros inmunes específicos; sin embargo, se produce una reacción cruzada con parapoxvirus. El capripoxvirus crece en los cultivos de tejidos de origen ovino, caprino o bovino, aunque los aislados de campo pueden necesitar hasta 14 días para crecer, o requerir uno o más pases adicionales en cultivos de tejidos. El virus produce inclusiones intracitopasmáticas que se observan con claridad mediante la tinción con hematoxilina y eosina. El antígeno se puede detectar también en cultivos de tejidos utilizando sueros específicos y las técnicas de inmunoperoxidasa o de inmunofluorescencia. El antígeno de capripoxvirus y los cuerpos de inclusión se pueden observar en secciones obtenidas en un criostato o en secciones de parafina teñidas de material procedente de lesiones de biopsias o exámenes post-mortem. Se ha elaborado un enzimoinmunoensayo (ELISA) utilizando un suero de detección policlonal obtenido frente a un recombinante del antígeno inmunodominante de capripoxvirus. Se ha descrito también la detección del genoma empleando cebadores específicos de capripoxvirus para los genes de las proteínas de fusión y de unión. Pruebas serológicas: La prueba de neutralización viral es la prueba serológica más específica, pero, debido a que la inmunidad a la infección de la viruela caprina está predominantemente mediada por células, la prueba no es lo suficientemente sensible para identificar a los animales que han tenido contacto con el virus y que sólo han desarrollado niveles bajos de anticuerpo neutralizante. Las pruebas IGDA y de inmunofluorescencia indirecta son menos específicas debido a las reacciones cruzadas con anticuerpos frente a otros poxvirus. El análisis de inmunoelectrotransferencia (Western blotting) es sensible y específico, pero resulta caro y difícil de llevar a cabo utilizando la reacción entre el antígeno P32 de capripoxvirus y los sueros de ensayo.

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Capítulo 2.1.10. — Viruela ovina y viruela caprina

El uso de este antígeno, expresado en un vector adecuado, en una prueba ELISA ofrece la posibilidad de realizar una prueba serológica aceptable y estandarizada. Requisitos para las vacunas y los biológicos de diagnóstico: Las vacunas vivas y las inactivadas se han empleado para el control de la viruela caprina. Todas las cepas de capripoxvirus examinadas hasta ahora comparten un sitio de neutralización principal y muestran protección cruzada. Las vacunas inactivadas proporcionan inmunidad a corto plazo en el mejor de los casos.

A. INTRODUCCIÓN La viruela ovina y la viruela caprina son endémicas en África del norte y central, en Oriente Medio y en India. La viruela caprina está causada por cepas de capripoxvirus y produce una enfermedad clínica característica en razas sensibles de ovejas y cabras, que no puede confundirse con ninguna otra. En los animales autóctonos, la enfermedad y la mortalidad generalizadas son menos frecuentes, aunque sí se observan en los lugares donde la enfermedad ha estado ausente en una zona o en un pueblo durante un período de tiempo al introducir métodos intensivos de cría, o en asociación con otros agentes causantes de enfermedades, tal como el virus de la peste de los pequeños rumiantes o el virus de la fiebre aftosa. La viruela caprina es la restricción más importante para la introducción de razas exóticas de ovejas y cabras, y para el desarrollo de la producción intensiva de animales de cría. Las cepas de capripoxvirus que originan la dermatosis nodular contagiosa (tal como la Neethling) se encuentran también en bovinos, pero no hay pruebas de que estas cepas causen la enfermedad en ovinos y en caprinos de forma natural. La distribución geográfica de la dermatosis nodular contagiosa difiere de la de la viruela ovina y caprina. Las cepas de capripoxvirus se transmiten entre los ovinos y los caprinos, aunque la mayoría solamente causan la enfermedad clínica más grave en una especie; también se produce recombinación entre estas cepas, originando un espectro que muestra preferencias intermedias por el hospedador y un rango de virulencia. Algunas cepas son igualmente patógenas en ovinos y en caprinos. La viruela caprina tiene la capacidad de propagarse y establecerse en países fuera de su distribución normal. En 1983 se propagó a Italia, en 1985 y 1989 a Chipre, y en 1988 y en numerosas ocasiones posteriores a Grecia, pero no llegó a establecerse en estos países. Sin embargo, en 1984 se propagó a Bangladesh donde persiste. Durante la última década se produjeron apariciones más frecuentes en Grecia y en Bulgaria. El período de incubación está entre 8 y 13 días después del contacto entre un animal infectado y animales susceptibles. Dicho período puede reducirse a 4 días después de una infección experimental por inoculación intradermal o por transmisión mecánica por insectos. Algunas razas de oveja europea, tal como la Soay, pueden morir de una infección aguda antes del desarrollo de las lesiones cutáneas. En otras razas se produce una elevación inicial de la temperatura rectal por encima de los 40°C, seguido, en primer lugar, por el desarrollo de máculas – pequeñas zonas rodeadas de hiperemia que son más obvias sobre la piel no pigmentada – entre los 2–5 días, y, posteriormente, por el desarrollo de pápulas – hinchazones duras de entre 0,5 y 1 cm de diámetro – que pueden cubrir el cuerpo o restringirse a la entrepierna, la axila y el perineo. Las pápulas pueden estar cubiertas por vesículas llenas de fluido, pero esto no es muy común. En algunas razas de cabra europea se ha observado una forma de viruela caprina hemorrágica, en la que todas las pápulas parecen coalescer o unirse por todo el cuerpo; esta forma es siempre mortal. Dentro de las 24 horas de la aparición de pápulas generalizadas, los animales infectados desarrollan rinitis, conjuntivitis y el aumento del tamaño de todos los nódulos linfáticos superficiales, en particular de los nódulos linfáticos prescapulares. Las pápulas sobre los párpados producen blefaritis de gravedad variable. Conforme se ulceran las pápulas de las membranas mucosas de los ojos y de la nariz, las secreciones se vuelven mucopurulentas, y las mucosas de la boca, el ano, y el prepucio o la vagina se necrosan. La respiración se hace pesada y ruidosa debido a la presión en el tracto respiratorio superior producida por los nódulos linfáticos retrofaríngeos hinchados, y al desarrollo de lesiones pulmonares. Si el animal afectado no muere en esta fase aguda de la enfermedad, las pápulas comienzan a necrosarse a partir de la necrosis isquémica después de la formación de trombos en los vasos sanguíneos situados en la base de la pápula. En los siguientes 5–10 días, las pápulas forman costras que persisten hasta 6 semanas dejando pequeñas cicatrices. Las lesiones cutáneas son susceptibles al ataque de las moscas, y es común una neumonía secundaria. No es habitual la anorexia a no ser que las lesiones en la boca interfieran físicamente la alimentación. El aborto es poco común. Las lesiones cutáneas son a menudo menos obvias en el examen post-mortem del animal con infección aguda que en el animal vivo. Las membranas mucosas están necrosadas y todos los nódulos linfáticos del cuerpo han

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Capítulo 2.1.10. — Viruela ovina y viruela caprina

aumentado de tamaño y están edematosos. Las pápulas, que pueden ulcerarse, se pueden encontrar habitualmente en la mucosa abomasal, y algunas veces en la pared del rumen y del intestino grueso, en la lengua, en el paladar duro y en el blando, en la tráquea y en el esófago. Ocasionalmente, pueden observarse zonas de aproximadamente 2 cm de diámetro en la superficie del riñón y del hígado, y se ha descrito su presencia en los testículos. Hay numerosas lesiones graves de hasta 5 cm de diámetro por todas partes de los pulmones y en particular, en los lóbulos diafragmáticos. Los signos clínicos y las lesiones observadas en el examen post-mortem varían considerablemente con la raza del hospedador y la cepa de capripoxvirus. Las razas autóctonas son menos sensibles y, con frecuencia, muestran sólo unas pocas lesiones que pueden confundirse con picaduras de insectos o con la dermatitis pustular contagiosa. Sin embargo, con frecuencia se observan casos de animales afectados de viruela caprina de forma generalizada y a veces mortal en casos de: corderos que han perdido su inmunidad derivada de la maternidad; animales que han sido mantenidos aislados; y animales traídos a zonas endémicas, procedentes de pueblos aislados, y, en particular, si se les ha sometido a estrés durantes el desplazamiento a largas distancias y se les ha mezclado con otras ovejas y cabras y sus patógenos. Después de la infección con capripoxvirus se produce invariablemente una gran mortalidad en razas ovinas y caprinas importadas sin ninguna protección previa. La viruela caprina no es infecciosa para los humanos.

B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO 1.

Identificación del agente

Œ

Recogida, envío y preparación de muestras

El material para el aislamiento del virus y la detección del antígeno debe recogerse mediante biopsia o en el examen post-mortem de las pápulas cutáneas, de las lesiones de los pulmones o de los nódulos linfáticos. Las muestras para el aislamiento del virus y para el enzimoinmunoensayo (ELISA) de detección de antígenos se recogerán en la primera semana de la manifestación de los signos clínicos, antes de que se produzcan anticuerpos neutralizantes. Las muestras para la detección genómica mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) pueden recogerse cuando ya está presente el anticuerpo neutralizante. Para el aislamiento del virus se puede también utilizar la capa leucoplaquetaria de la sangre recogida en heparina o EDTA (ácido etilendiamino tetracético) durante el estadio virémico de la viruela caprina (antes de la generalización de las lesiones o en los cuatro días de generalización de la enfermedad). Las muestras para el examen histológico han de incluir tejido procedente de las áreas circundantes, y se han de colocar inmediatamente después de su recogida en formalina al 10% en un volumen que sea diez veces el de la muestra. Los tejidos en formalina no necesitan requisitos especiales para el transporte. Las muestras de sangre con anticoagulante para el aislamiento del virus a partir de la capa leucoplaquetaria se colocarán inmediatamente en hielo y se procesarán lo antes posible. En la práctica, las muestras deben conservarse a 4°C durante dos días antes de su procesamiento, pero no deben congelarse o mantenerse a temperatura ambiente. Los tejidos destinados al aislamiento de virus, la detección de antígenos o la detección de genoma se conservarán a 4°C, en hielo o a –20°C. Si hay que transportar las muestras a largas distancias sin refrigeración, el medio de transporte deberá contener glicerol al 10%; las muestras tendrán el tamaño suficiente para que el medio de transporte no llegue a la parte central de la biopsia que se utilizará para el aislamiento/detección del virus. El material para el análisis histológico se preparará mediante técnicas normalizadas y se teñirán con hematoxilina y eosina (H-E). El material de las lesiones para el aislamiento de virus y para la detección del antígeno se corta empleando tijeras y fórceps, y después se muele en un almirez con la mano de mortero con arena estéril y un volumen igual de tampón fosfato (PBS) que contenga penicilina sódica (1.000 unidades internacionales [UI]/ml, sulfato de estreptomicina (1 mg/ml), micostatina (100 UI/ml) o fungizona (2,5 µg/ml) y neomicina (200 UI/ml). La suspensión se congela y descongela tres veces y posteriormente se clarifica por centrifugación, empleando una centrífuga de mesa, a 600 g durante 10 minutos. La capa leucoplaquetaria puede prepararse a partir de sangre sin coagular por centrifugación a 600 g durante 15 minutos, y transferirse cuidadosamente a 5 ml de agua bidestilada fría empleando una pipeta Pasteur estéril. Pasados 30 segundos, se añaden 5 ml de medio de crecimiento frío y a doble concentración, y se mezclan. La mezcla se centrífuga a 600 g durante 15 minutos, se desecha el sobrenadante y el sedimento de células se resuspende en 5 ml de medio de crecimiento como el medio de Eagle modificado de Glasgow (GMEM). Después de la centrifugación a 600 g durante 15 minutos, el sedimento resultante se resuspende en 5 ml de GMEM recién preparado. Alternativamente, la capa leucoplaquetaria se puede preparar a partir de una muestra heparinizada utilizando un gradiente de Ficoll.

a)

Cultivo El capripoxvirus crecerá en cultivos de tejidos de origen bovino, ovino y caprino, aunque se considera que los cultivos primarios y secundarios de células de testículo (LT) o de riñón (LK) de cordero son las más

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Capítulo 2.1.10. — Viruela ovina y viruela caprina

susceptibles, en particular las que se derivan de una raza ovina lanar. Se inocula un frasco de cultivo celular de 25 cm2 de células ovinas de testículo o riñón (con un 90% de confluencia) con 1 ml ya sea de la suspensión de la capa leucoplaquetaria o del sobrenadante de la preparación clarificada de la biopsia, y se permite la absorción a 37ºC durante 1 hora. Posteriormente, se lava el cultivo con PBS caliente y se cubre con 10 ml de un medio adecuado, como GMEM, conteniendo antibióticos y suero fetal bovino al 2%. Si se dispone de ellos, se infectan también tubos de cultivos de tejidos que contengan células LT o LK y un cubreobjetos, o portaobjetos con cultivos de tejidos. Los frascos se examinarán diariamente durante 14 días en busca de indicios de efecto citopático (ECP), y si el medio está turbio se reemplaza. Las células infectadas desarrollan un ECP característico consistente en la retracción de la membrana celular de las células circundantes, y finalmente en el redondeamiento de las células, quedando la cromatina nuclear situada en el margen. Al principio sólo se observan pequeñas zonas de ECP, algunas veces tan sólo 4 días después de la infección, que se expanden durante los siguientes 4-6 días hasta cubrir todo el tapiz celular. Si antes de 14 días no hay pruebas del ECP, se congelará y descongelará el cultivo tres veces, y el sobrenadante clarificado se inoculará en un cultivo fresco de células LT o LK. Al primer signo de ECP en los frascos, o antes, en el caso de que se estén usando varios cubreobjetos infectados, se tomará un cubreobjetos, se fijará con acetona y se teñirá empleando H-E. La presencia de los cuerpos de inclusión intracitoplásmáticos eosinófilos que son de tamaño variable, pero que pueden ser hasta la mitad del tamaño del núcleo y están rodeados por un halo claro, constituye un diagnóstico de la infección por poxvirus. La formación de sincitios no es una característica de la infección por capripoxvirus. El efecto citopático se puede evitar o retrasar mediante la inclusión en el medio de un suero anticapripoxvirus. Algunas cepas de capripoxvirus se han adaptado para crecer en las células de riñón de mono verde africano (células Vero), pero éstas no se recomiendan para el aislamiento primario.

•

Microscopía electrónica

Antes de la centrifugación, el material de la suspensión original se prepara para su examen en un microscopio electrónico de transmisión de la siguiente manera: sobre una gota de la suspensión colocada sobre parafina o sobre una placa de cera, se deja flotar una rejilla de microscopía electrónica de 400 mallas hexagonales con un substrato de pileoform-carbón activado por una descarga luminiscente en vapor de pentilamina. Transcurrido 1 minuto, la rejilla se transfiere a una gota de tampón Tris/EDTA, pH 7,8, durante 20 segundos y después a una gota de ácido fosfotungsténico al 1%, pH 7,2, durante 10 segundos. Se escurre la rejilla empleando papel de filtro, se deja secar al aire y se coloca en el microscopio electrónico. El virión de la viruela caprina tiene forma de ladrillo, y está cubierto por elementos tubulares cortos y mide aproximadamente 290 ‰ 270 nm. Algunos de los viriones pueden rodearse de una membrana que procede de la célula del hospedador y se debe examinar el mayor número posible de células para confirmar su aparición (16). Los viriones de los capripoxvirus no se distinguen de los de ortopoxvirus, pero, aparte del virus vacunal, ningún ortopoxvirus causa lesiones en las ovejas o en las cabras. Los viriones de parapoxvirus que causan dermatitis pustular contagiosa son más pequeños, de forma ovalada, y cada uno de ellos está cubierto por un único elemento tubular continuo que aparece como estriaciones sobre el virión.

•

Histología

Después de la preparación, de la tinción con H-E y del montaje del material de biopsia fijado con formalina, se examinarán varias secciones al microscopio óptico. En el examen histológico, los aspectos más característicos de las lesiones cutáneas en estado agudo son un infiltrado celular masivo, vasculitis y edema. Las lesiones tempranas se caracterizan por una inflamación perivascular marcada. Inicialmente, la infiltración es por macrófagos, neutrófilos y ocasionalmente eosinófilos, y a mediada que progresa la lesión se infiltran más macrófagos, linfocitos y células plasmáticas. Un rasgo característico de todas las infecciones por capripoxvirus es la presencia en la dermis de cantidades variables de “células de la viruela ovina”. Estas células de la viruela ovina pueden aparecer también en otros órganos en los que hay lesiones microscópicas de viruela ovina y caprina. Estas células son grandes, estrelladas, eosinófilas, con inclusiones intracitoplásmáticas mal definidas y núcleos vacuolados. La vasculitis va acompañada de trombosis e infartación, produciendo edema y necrosis. Los cambios epidérmicos consisten en acantosis, paraqueratosis e hiperqueratosis. Los cambios en los órganos son similares, con infiltración celular predominante y vasculitis. Las lesiones en el tracto respiratorio superior se caracterizan por la ulceración.

•

Inoculación animal

El sobrenadante de la preparación de la biopsia clarificada (véase Sección B.1.a. Cultivo) se puede utilizar también para la inoculación intradermal en corderos sensibles. Estos corderos se examinarán diariamente en busca de evidencias de una reacción cutánea.

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Capítulo 2.1.10. — Viruela ovina y viruela caprina

b)

Métodos inmunológicos •

Pruebas con anticuerpos fluorescentes

El antígeno de capripoxvirus puede también identificarse en cultivos de tejidos infectados sobre cubreobjetos o sobre portaobjetos, utilizando las pruebas con anticuerpos fluorescentes. Los cubreobjetos o los portaobjetos se lavarán, se dejarán secar al aire y se fijarán con acetona fría durante 10 minutos. La prueba indirecta utilizando sueros ovinos o caprinos está expuesta a la aparición de un color de fondo muy oscuro y a reacciones no específicas. Sin embargo, se puede preparar un conjugado directo a partir de sueros de ovejas o cabras convalecientes o de conejos hiperinmunizados con capripoxvirus purificado. Como un control negativo, deben incluirse los cultivos de tejidos sin infectar, porque las reacciones cruzadas pueden causar problemas debido a los anticuerpos contra los antígenos de los cultivos de tejidos. Se ha utilizado también la técnica con anticuerpos fluorescentes sobre portaobjetos en cortes de tejido preparados en un criostato.

•

Inmunodifusión en gel de agar

Para la detección del antígeno de precipitación de capripoxvirus se ha utilizado la prueba de inmunodifusión en gel de agar (IDGA), pero tiene la desventaja de que este antígeno es compartido por el parapoxvirus. La agarosa (1%) se prepara en tampón borato, pH 8,6, se disuelve por calor, y se vierten 2 ml sobre un portaobjetos de cristal (76 ‰ 26 mm). Cuando al agar ha solidificado, se excavan 6 pocillos formando una roseta alrededor de un pocillo central. Cada pocillo mide 5 mm de diámetro, y hay una distancia de 7 mm entre el centro del pocillo central y el centro de cada uno de los pocillos periféricos. Los pocillos se llenan de la siguiente manera: en tres pocillos de la periferia se depositan 18 µl de la suspensión de la lesión alternando con el antígeno de control positivo, y en el pocillo central se depositan 18 µl de suero de control positivo de capripoxvirus. Los portaobjetos de colocan en una cámara húmeda a temperatura ambiente durante 48 horas, y se examinan para detectar la formación de líneas de precipitación visibles empleando un transiluminador. El material ensayado es positivo si se forma una línea de precipitación con el suero control que es confluyente con la producida por el antígeno de control positivo. Esta prueba, sin embargo, no permite distinguir entre la infección de la viruela caprina y la dermatitis pustular contagiosa (ectima contagioso). Para preparar el antígeno para la prueba IDGA, uno de los dos frascos de 125 cm2 con células LT o LK se infecta con capripoxvirus, y cuando se alcanza un grado de efecto citopático del 90% (8–12 días) se recogen las células. Se congela y descongela el frasco dos veces, y se agita éste para liberar las células del frasco. El contenido se centrifugan a 4.000 g durante 15 minutos, se decanta la mayor parte del sobrenadante y se guarda, y el sedimento se resuspende en el sobrenadante restante. Las células se lisarán utilizando una sonda ultrasónica durante 60 segundos aproximadamente. A continuación este homogenado se centrifuga como antes, el sobrenadante resultante se mezcla con el que ya está recogido. El sobrenadante mezclado se añade a un volumen igual de sulfato amónico saturado a pH 7,4 y se deja a 4°C durante 1 hora. Esta solución se centrifuga a 4.000 g durante 15 minutos, y el precipitado se recoge y se resuspende en un volumen pequeño de solución salina al 0,8% para su uso en la prueba IGDA. El frasco que no se ha infectado se procesa de forma totalmente idéntica para obtener el antígeno control del cultivo celular (14).

•

Enzimoinmunoensayo

Después de la clonación de la proteína estructural P32 de capripoxvirus, que es muy antigénica, se puede utilizar el antígeno recombinante expresado para la producción de reactivos para el diagnóstico, incluyendo la obtención de antisuero policlonal monoespecífico contra P32 y la producción de anticuerpos monoclonales (MAbs). Estos reactivos han facilitado la elaboración de un ELISA muy específico (4). Utilizando antisuero de conejo hiperinmune, obtenido por inoculación a conejos con capripoxvirus purificado, se puede inmovilizar el antígeno de la viruela caprina procedente de suspensiones de biopsias o del sobrenadante de cultivos de tejidos en una placa ELISA. A continuación, la presencia del antígeno inmovilizado puede ponerse de manifiesto utilizando un suero de cobaya obtenido contra el grupo específico de la proteína estructural P32, la inmunoglobulina comercial anticobaya de ratón conjugada con peroxidasa de rábano y una solución substrato cromogénico.

c)

Métodos de reconocimiento de ácidos nucleicos Mediante técnicas serológicas no es posible distinguir entre cepas de capripoxvirus bovinos, ovinos o caprinos. Sin embargo, estas cepas se pueden caracterizar comparando los fragmentos genómicos originados por la digestión con HindIII de su ADN purificado (1, 13). Con esta técnica se han identificado diferencias entre aislados de diferentes especies, pero no son consistentes, y hay pruebas de movimiento de cepas entre especies y de recombinación entre cepas en condiciones naturales (9). La técnica de la PCR se puede utilizar para detectar el genoma de capripoxvirus en muestras de biopsia o en cultivos de tejidos. Los cebadores para los genes de las proteínas virales de unión y de fusión son específicos para capripoxvirus, y la naturaleza de los productos de la PCR puede confirmarse utilizando los lugares de reconocimiento de las enzimas de restricción (10, 11).

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2.

Pruebas serológicas

a)

Neutralización viral Un suero de ensayo se puede titular bien frente a un título constante de capripoxvirus (100 DICC50 [dosis infectiva 50% en cultivo celular]) o bien una cepa de un virus de referencia se puede titular frente a una dilución constante de un suero de ensayo para calcular el índice de neutralización. El método preferido es el índice de neutralización debido a la sensibilidad variable de los cultivos de tejidos a capripoxvirus, y la consecuente dificultad para garantizar el uso de 100 DICC50. La prueba se describe utilizando placas de microtitulación de cultivos de tejidos de 96 pocillos de fondo plano, pero se puede realizar perfectamente igual en tubos de cultivos de tejidos introduciendo los cambios apropiados para los volúmenes utilizados, aunque la lectura de un punto final en los tubos es más difícil. Se ha descrito que el uso de células Vero en la prueba de neutralización de virus produce resultados más consistentes.

•

Procedimiento del ensayo

i)

Los sueros de ensayo, incluyendo un control positivo y un control negativo, se diluyen 1/5 en medio Eagle/HEPES (N-2-hidroxietilpiperazina, ácido N-2-etanosulfónico) y se inactivan a 56°C durante 30 minutos.

ii)

A continuación, se deposita un volumen de 50 µl del primer suero inactivado en los pocillos de las columnas 1 y 2, de las filas A a H de la placa de microtitulación. El segundo suero se coloca en los pocillos de las columnas 3 y 4, el tercero en las columnas 5 y 6, el suero de control positivo en las columnas 7 y 8, el control de suero negativo en las columnas 9 y 10, y se depositan 50 µl de medio Eagle/HEPES sin suero en las columnas 11 y 12 y en todos los pocillos de la fila H.

iii)

Una cepa de referencia de capripoxvirus, que normalmente es una cepa vacunal que se sabe que crece bien en cultivos de tejidos, con un título superior a log10 6 DICC50 por ml se diluye en medio Eagle/HEPES en botellas con tapa de rosca para obtener diluciones logarítmicas seriadas de log10 5,0; 4,0; 3,5; 3,0; 2,5; 2,0; 1,5 DICC50 por ml (equivalente a log10 3,7; 2,7; 2,2; 1,7; 1,2; 0,7; 0,2 DICC50 / 50 µl).

iv)

Comenzando por la fila G y por la preparación de virus más diluida, se añaden 50 µl de virus a cada pocillo de esa fila. Esto se repite con cada dilución del virus, colocando la dilución con el título más alto en la fila A.

v)

Las placas se cubren y se incuban a 37°C durante 1 hora.

vi)

Las células LT se preparan a partir de monocapas crecidas con anterioridad en una suspensión de 105 células/ml en medio Eagle con antibióticos y suero fetal bovino al 2%. Después de la incubación de las placas de microtitulación, se añaden 100 µl de la suspensión celular a todos los pocillos, excepto a los pocillos H11 y H12, que sirven como pocillos de control para el medio. Los restantes pocillos de la fila H son los controles celulares y séricos.

vii)

Las placas de microtitulación se cubren y se incuban a 37°C durante 9 días.

viii) A partir del día 4 se examinan diariamente las monocapas en busca de pruebas de ECP, utilizando un microscopio de inversión. En las células de la fila H no ha de haber ECP. Utilizando la cepa vacunal 0240 KSGP de capripoxvirus, la lectura final se toma el 9º día, y el título del virus en cada titulación réplica se calcula según el método Kärber (1931). Si se deja más tiempo, siempre se produce un aumento del virus, de modo que el virus que al principio estaba neutralizado parece disociarse del anticuerpo. ix)

Interpretación de los resultados: El índice de neutralización es la diferencia del entre el título del virus en un suero negativo y el del suero de ensayo. Un índice ≥1.5 es positivo. La prueba puede hacerse más sensible si el suero del mismo animal se examina antes y después de la infección. Debido a que la inmunidad a la viruela caprina está predominantemente mediada por células, un resultado negativo, en particular después de la vacunación en la que la respuesta es débil, no implica que el animal del que deriva el suero no esté protegido. Se ha descrito un método que mantiene constante el virus y varía el suero en el que se utilizan diluciones del suero en un rango desde 1/5 a 1/500 y células de músculo fetal bovino. Debido a que estas células tienen menor sensibilidad a capripoxvirus que las células LT, el problema del aumento del virus queda resuelto.

b)

Inmunodifusión en gel de agar La prueba IGDA no puede recomendarse como una prueba serológica para la diagnosis de la viruela caprina, debido a la reacción cruzada con anticuerpos contra el virus de la dermatitis pustular contagiosa, que es la principal prueba diagnóstica diferencial. Una consecuencia de esta reacción cruzada es la aparición de resultados falsos positivos.

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c)

Prueba indirecta con anticuerpos fluorescentes Para la prueba indirecta con anticuerpos fluorescentes se pueden utilizar los cultivos de tejidos infectados con capripoxvirus cultivados sobre cubreobjetos o los cultivos de tejidos sobre portaobjetos. En la prueba se incluirán el control del cultivo celular sin infectar y los sueros de control positivo y negativo. Los cultivos infectados y los cultivos control se fijan con acetona a –20°C durante 1 hora y se guardan a 4°C. Las diluciones de los sueros de ensayo se realizan en PBS, comenzando con una dilución 1/5, y los positivos se identifican utilizando una gammaglobulina antioveja conjugada con isocianato de fluoresceína (7). Las reacciones cruzadas pueden tener lugar con el virus del ectima contagioso, con el de la estomatitis papular bovina y quizás con otros poxvirus.

d)

Análisis por inmunoelectrotransferencia (Western blot) El análisis por inmunoelectrotransferencia de los sueros de ensayo frente a lisados de células infectadas por capripoxvirus proporciona un sistema sensible y específico para la detección del anticuerpo contra las proteínas estructurales de capripoxvirus, aunque la prueba es cara y difícil de llevar a cabo (6). Las células LT infectadas por capripoxvirus deben recogerse cuando se observe un efecto citopático del 90%, a continuación se congelan y descongelan tres veces, y los desechos celulares se sedimentan por centrifugación. Se decanta el sobrenadante y las proteínas se separan después por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS/PAGE). Se recomienda un sistema vertical de gel discontinuo, empleando gel de concentración con acrilamida (5%) en Tris (125 mM), pH 6,8, y SDS (0,1%), y gel de resolución con acrilamida (10–12,5%) en Tris (560 mM), pH 8,7, y SDS (0,1%), utilizando un tampón de desarrollo de glicina conteniendo Tris (250 mM), glicina (2 M), y SDS (0,1%). Antes de cargar el gel, se preparan las muestras del sobrenadante mediante ebullición con un tampón de lisis adecuado. Como alternativa al antígeno del cultivo celular, se puede utilizar también un virus purificado o la proteína recombinante expresada de P32 (5, 10). Simultáneamente con las muestras de proteínas, se hacen correr los marcadores de peso molecular. Una vez separadas las proteínas en el gel SDS/PAGE se transfieren electroforéticamente a una membrana de nitrocelulosa (NCM). Después de la transferencia, la membrana se aclara exhaustivamente con PBS y se bloquea con albúmina sérica bovina (BSA) al 3% en PBS, o con leche en polvo desnatada al 5% en PBS, y se deja en un agitador rotatorio a 4ºC toda la noche. A continuación, la NCM puede separarse en tiras utilizando un aparato comercial que permite el ensayo simultáneo de múltiples muestras de suero, o bien se puede cortar en tiras e incubar luego cada una de ellas por separado. La NCM se lava cuidadosamente realizando cinco cambios de tampón PBS durante 5 minutos en un agitador rotatorio, y después se deja en un agitador a temperatura ambiente durante 1,5 horas con el suero apropiado a una dilución de 1/50 en tampón de bloqueo (3% BSA y Tween 20 al 0,05% en PBS; o leche en polvo al 5% y Tween 20 al 0,05% en PBS). Se lava de nuevo la membrana exhaustivamente y se incuba (en el tampón bloqueante) con antiinmunoglobulinas de la especie conjugadas con peroxidasa de rábano a una dilución determinada previamente mediante titulación. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 1,5 horas, la membrana se lava y se le añade una solución de diamino bencidina tetrahidrocloruro (10 mg en 50 ml of 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, y 20 µl de peróxido de hidrógeno al 30% [v/v]. Acto seguido se incuba en un agitador a temperatura ambiente durante aproximadamente 3–7 minutos con observación constante, y se detiene la reacción mediante lavado con PBS antes de que el color de fondo se vea en exceso. Para cada ocasión se utilizará un suero de control positivo y negativo. Las muestras que se consideren positivas en el ensayo y el control positivo originarán un patrón de bandas consistente con una reacción con las proteínas de pesos moleculares 67, 32, 26, 19, y 17 kDa – las proteínas estructurales principales de capripoxvirus – mientras que las muestras de suero negativas no reaccionarán dando este patrón. El suero hiperinmune preparado contra parapoxvirus (virus del ectima contagioso) reaccionará con algunas de las proteínas de capripoxvirus, pero no con la de 32 kDa que es específica de capripoxvirus.

e)

Enzimoinmunoensayo Se ha elaborado un ELISA para capripoxvirus empleando la expresión de la proteína estructural P32 de capripoxvirus y MAbs obtenidos contra la proteína P32 (5, 10).

C. REQUISITOS PARA VACUNAS Y MATERIALES DE DIAGNÓSTICO Se ha utilizado una variedad de vacunas de capripoxvirus vivas atenuadas e inactivadas para proteger a las ovejas y a las cabras contra la viruela caprina (véanse referencias 3 y 12 para las revisiones). Todas las cepas de capripoxvirus de origen ovino, caprino o bovino examinadas hasta ahora comparten un sitio de neutralización principal, de forma que los animales recuperados de la infección con una cepa son resistentes a la infección por cualquiera de las otras (2). En consecuencia, es posible utilizar una sola cepa de capripoxvirus para proteger a

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las ovejas y a las cabras contra todas las cepas de campo del virus, con independencia de que su origen estuviera en Asia o África (15, 17). Hay dos formas antigénicas de capripoxvirus, el virión intacto cubierto por elementos tubulares cortos, y el virión intacto cubierto además por una membrana que procede de la célula hospedadora. Ésta última es la forma producida normalmente por el animal infectado, mientras la primera es la que se observa cuando el virus se produce por congelación y descongelación de cultivos de tejidos infectados. Las vacunas muertas producidas a partir de cultivos de tejidos están formadas por viriones casi completamente desnudos, y cuando se utilizan como una vacuna no estimulan la inmunidad para que el virión se envuelva con la membrana. Esto explica en parte el poco éxito que tienen las vacunas inactivadas. Un factor adicional es que las vacunas inactivadas son menos eficaces que las vivas (que replican al virus vacunal) en la estimulación de la respuesta inmune mediada por células, que es la respuesta protectora predominante a la infección por poxvirus. Las vacunas muertas de la viruela caprina proporcionan, como mucho, una protección temporal. Una serie de cepas de capripoxvirus han tenido un uso extendido como vacunas vivas (8), por ejemplo, la cepa de la viruela ovina y caprina de Kenia 0240 utilizada en ovejas y cabras, las cepas Rumana y RM-65 utilizadas principalmente en ovejas, y Mysore y Gorgan utilizadas en cabras. La inmunidad en ovejas y cabras contra la viruela caprina después de la vacunación con la cepa 0240 dura más de un año, y probablemente proporcionará una protección para toda la vida frente al desafío letal. La cepa 0240 no se utilizará en razas bovinas Bos taurus. Se está elaborando una nueva generación de vacunas de la viruela caprina que utiliza el genoma de capripoxvirus como vector para los genes de otros patógenos de rumiantes, por ejemplo, los genes de los virus de la peste bovina y de la peste de los pequeños rumiantes (PPR). La vacuna recombinante proporcionará protección contra la viruela caprina, la peste bovina y la PPR en una sola vacuna (18).

1.

Control del inóculo

a)

Características del inóculo Una cepa de capripoxvirus utilizada en la producción de una vacuna debe ir acompañada de un historial en el que se describa su origen y su pase por cultivos de tejidos o animales. Debe ser inocua para utilizarla en todas las variedades de ovejas y cabras en las que se pretende emplear, incluyendo los animales preñados. No debe ser transmisible, debe permanecer atenuada después del pase posterior por un cultivo celular, y proporcionar una protección completa frente el desafío de cepas de campo virulentas por un mínimo de un año. Será conveniente preparar una cantidad de inóculo original del virus vacunal y guardarlo con el fin de proporcionar un inóculo de trabajo constante para la producción regular de vacunas.

b)

Método de cultivo El inóculo de vacuna debe liofilizarse y guardarse en viales de 2 ml a –20°C. Se puede guardar en estado húmedo a –20°C, pero de ser así, es más estable a –70°C o a temperatura más baja. Para obtener un rendimiento óptimo, el virus debe cultivarse en células primarias o secundarias LT o LK de oveja lanar. También pueden utilizarse células Vero.

c)

Validación como vacuna Debe demostrarse que los lotes de siembra son: i)

Puros: Libres de virus ajenos, en particular de pestivirus, tales como el virus de la enfermedad de Border y de la diarrea viral bovina, y libres de contaminación por bacterias, hongos y/o micoplasmas.

ii)

Inocuos: No produce reacción clínica en ninguna de las razas de ovejas o cabras cuando se les administra por la vía recomendada.

iii)

Eficaces: Estimuladores de inmunidad completa a la viruela caprina en todas las razas de ovejas y cabras durante al menos 1 año.

En la Sección C.4. se describen las pruebas necesarias.

2.

Método de producción

Los lotes de vacuna se producen sobre monocapas de células secundarias LT o de células primarias LK. Se reconstituye un vial de inóculo viral con GMEM y se inocula en una monocapa de células LT o LK, que previamente se ha lavado con PBS templado, y se permite la absorción a 37ºC durante 15 minutos antes de recubrir la mezcla con GMEM adicional. Transcurridos 4–6 días, deberá apreciarse un gran efecto citopático (50– 70%). El cultivo deberá examinarse en busca de indicios de ECP no específico, turbidez del medio o cambio en el pH. Se congela y descongela el cultivo tres veces, se recoge la suspensión y se centrifuga a 600 g durante 20 minutos. Puede requerirse un segundo pase para producir una cantidad de virus suficiente para obtener un lote productivo (para producir suficiente cantidad para 106 dosis se requiere la producción de cinco frascos de 175 cm2).

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Se repite el procedimiento y el producto recogido de cada uno de los frascos numerados por separado se mezcla también por separado con un volumen igual de hidrolizado estéril de lactalbúmina al 5% frío y sacarosa al 10%, y se transfiere a botellas numeradas por separado para su conservación a –20°C. Antes se toman 0,2 ml de cada botella para un control de esterilidad, y una muestra adicional de 0,2 ml. Las mezclas de 2 ml formadas por las muestras de 0,2 ml tomadas de las diez botellas se utilizan para la titulación del virus. Debe conservarse un registro escrito de todos los procedimientos para todos los lotes de vacunas. Las vacunas inactivadas se producen normalmente a partir de cepas de campo de capripoxvirus sin atenuar, crecidas en cultivos de tejidos como se ha descrito anteriormente, inactivadas con formaldehído al 0,03%, y mezcladas con un volumen igual de alhydrogel de adyuvante. Ya no se considera adecuado el formaldehído para la inactivación de otras vacunas virales debido a que su modo de acción no puede garantizar que sea totalmente eficaz para la inactivación de todos los virus vivos. Este extremo no ha sido completamente investigado para capripoxvirus.

3.

Control durante el proceso

Células: Las células se obtendrán de testículo o riñón de un cordero joven y sano de un rebaño libre de “tembladera” de una raza de ovejas lanares. Las células deben observarse durante el cultivo en busca de pruebas de efecto citopático y de células con morfología normal (predominantemente fibroblástica). Normalmente se pueden hacer con éxito hasta diez pases de estas células. Cuando éstas se utilicen para la producción de vacunas, se realizarán paralelamente cultivos control sin infectar, y se mantendrán al menos durante un pase más para su posterior observación. Se revisarán para determinar la presencia de cepas de virus no citopáticos de la diarrea viral bovina o de la enfermedad de Border mediante técnicas de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa. Si resulta posible, se hará una preparación de células y una criba antes de la producción de la vacuna, y se guardará un stock en DMSO estéril (dimetilsulfóxido) en nitrógeno líquido (alícuotas de 1–2 ml conteniendo 20 ‰ 106 células/ml). El suero utilizado en el medio de crecimiento debe estar libre de anticuerpos contra capripoxvirus o de contaminación con pestivirus. Virus: El virus de inóculo y la vacuna final deben titularse en tubos de cultivo celular o en placas de microtitulación. Las muestras de vacunas deben examinarse para la presencia de virus ajenos, incluyendo cepas de pestivirus citopáticas y no citopáticas, y deben mezclarse con suero inmune contra capripoxvirus con un título alto que haya dado resultado negativo con relación al anticuerpo para pestivirus, con el fin de impedir que el virus vacunal mismo interfiera con la prueba. El material de la vacuna puede mantenerse a –20°C hasta que se completen todas las pruebas de esterilidad y de titulación, y entonces se liofilizará en alícuotas de 1 ml en viales suficientes para 100 dosis. El producto vacunal diluido con hidrolizado de lactalbúmina y sacarosa tendrá un título mínimo de log10 4,5 DICC50 por mililitro después de la liofilización, equivalente a una dosis de campo de log10 2,5 DICC50. Se lleva a cabo una titulación posterior en cinco viales de la preparación liofilizada, elegidos al azar para confirmar el título.

4.

Control de lotes

a)

Esterilidad Las pruebas para determinar la esterilidad y la ausencia de contaminación de los materiales biológicos pueden encontrarse en el Capítulo I.1.5.

b)

Inocuidad y eficacia En una unidad animal de alto nivel de contención se confinan cuatro ovejas y cuatro cabras de sensibilidad conocida a capripoxvirus, y se recogen muestras de suero. Se reconstituyen cinco viales elegidos al azar de la vacuna liofilizada en 1 ml de PSB estéril cada uno, y se mezclan. Se inoculan intradermalmente una oveja y una cabra con 0,2 ml de la vacuna concentrada. La vacuna restante se diluye 20 veces con PBS estéril y se inoculan dos ovejas y dos cabras subcutáneamente con 0,2 ml – la dosis de campo recomendada. Los animales control son la oveja y la cabra restantes. Los animales se examinan clínicamente a diario y se registra la temperatura rectal. Al cabo de 21 días después de la vacunación, se toman nuevas muestras de sangre a los ocho animales y se ensayan mediante inoculación intradermal con una cepa virulenta conocida de capripoxvirus. Se anota la respuesta clínica durante los 14 días siguientes. Los animales control desarrollarán signos clínicos típicos de la viruela caprina, mientras que no deberá haber reacción local o sistémica en los vacunados excepto una reacción de hipersensibilidad tardía, que desaparecerá a los 4 días. Se tomarán nuevas muestras de suero 30 días después de la vacunación. Las muestras de suero del día 21 se examinan para observar si se produce seroconversión en cuanto a las enfermedades víricas seleccionadas que podrían haber contaminado la vacuna, y las muestras del día 0 y 30 se comparan para confirmar la ausencia de anticuerpos contra pestivirus. La vacuna totalmente reconstituida se prueba también en ratones y cobayas. Se inoculan dos cobayas con 0,5 ml por vía intramuscular en la pata trasera, y dos cobayas y seis ratones intraperitonealmente con 0,5 ml y 0,1 ml respectivamente. Como controles sin inocular se conservan dos cobayas y cuatro ratones. Los animales se observan durante tres semanas, se sacrifican de forma humanitaria y se lleva acabo un examen post-mortem. No deberá haber evidencia de patología debido a la vacuna.

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c)

Pruebas de potencia Es suficiente con menos de 1 DICC50 de la cepa 0240 para inmunizar a una oveja o una cabra. Sin embargo, deben realizarse pruebas de potencia para otras cepas de capripoxvirus si no se conoce la dosis mínima inmunizante. Esto se lleva a cabo mediante la comparación del título de un virus de prueba virulento y el de los animales control por inoculación en los costados de los animales vacunados. Después de la vacunación, se afeita la lana o el pelo del costado de al menos tres animales y de tres controles. Se preparan diluciones logarítmicas decimales del virus prueba en PBS estéril, y se inoculan intradermalmente seis de estas diluciones (0,1 ml por inóculo) a lo largo de la longitud del flanco; inoculando adicionalmente cuatro réplicas de cada dilución verticalmente de arriba hacia abajo también en el flanco. Es posible que se desarrolle una inflamación edematosa en los 24 sitios de inoculación en los animales de control, aunque preferiblemente habrá poca reacción o ninguna en los cuatro sitios de los inóculos más diluidos. Dentro de las 24 horas los animales vacunados desarrollarán una reacción de hipersensibilidad inicial en los sitios de inoculación que disminuirá rápidamente. Pueden desarrollarse pequeñas zonas de necrosis en el lugar de inoculación del virus problema más concentrado. El título del virus problema se calcula para los animales vacunados y para los animales de control; una diferencia en el título logarítmico >log10 2,5 se toma como evidencia de protección.

d)

Duración de la inmunidad La inmunidad de las ovejas y de las cabras a los virus de campo virulentos después de la vacunación con la cepa 0240 dura más de 1 año, y la protección contra la infección generalizada después de la vacunación intradermal dura al menos tres años, y es eficaz durante toda la vida. La duración de la inmunidad producida por otras cepas vacunales se establecerá en las ovejas y en las cabras mediante la realización de ensayos controlados en unas condiciones en las que no haya posibilidad de que las cepas de campo de capripoxvirus interfieran los resultados. Las vacunas inactivadas proporcionan inmunidad menos de un año y, por las razones expuestas al comienzo de esta sección, no confieren inmunidad a la forma de capripoxvirus normalmente asociada con la forma de transmisión natural.

e)

Estabilidad Las preparaciones de la vacuna de la viruela caprina adecuadamente liofilizadas, en particular aquéllas que incluyen un protector como la sacarosa y el hidrolizado de lactalbúmina son estables más de 25 años cuando se guardan a –20°C, y 2–4 años si se hace a 4°C. Hay evidencias de que son estables a temperaturas más altas, pero no se tiene constancia de experimentos controlados a largo plazo. Las vacunas inactivadas deben conservarse a 4ºC, y su período de validez está normalmente fijado en 1 año.

f)

Conservantes Aparte de un protector, como la sacarosa y el hidrolizado de lactalbúmina, no se requieren conservantes para la preparación del liofilizado.

g)

Precauciones (riesgos) No existen precauciones, aparte de las descritas anteriormente, en relación con la esterilidad y la ausencia de agentes extraños. La cepa vacunal 0240 no se empleará en razas bovinas Bos taurus. El capripoxvirus no infecta a los humanos.

5.

Pruebas sobre el producto final

a)

Inocuidad Las pruebas de inocuidad deben llevarse a cabo sobre el producto final de cada lote, como se describe en la Sección C.4.b.

b)

Potencia Una vez que se haya determinado la potencia de una cepa concreta que se esté utilizando para la producción de vacunas, en relación con la dosis mínima que se requiere para proporcionar inmunidad, no es necesario repetir la prueba de potencia sobre el producto final de cada lote, si se ha determinado el título del virus.

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9.

GERSHON P.D., KITCHING R.P., HAMMOND J.M. & BLACK D.N. (1989). Poxvirus genetic recombination during natural virus transmission. J. Gen. Virol., 70, 485–489.

10. HEINE H.G., STEVENS M.P., FOORD A.J. & BOYLE D.B. (1999). A capripoxvirus detection PCR and antibody ELISA based on the major antigen P32, the homolog of the vaccinia virus H3L gene. J. Immunol. Methods, 227, 187–196. 11. IRELAND D.C. & BINEPAL Y.S. (1998). Improved detection of capripoxvirus in biopsy samples by PCR. J. Virol. Methods, 74, 1–7. 12. KITCHING R.P. (1983). Progress towards sheep and goat pox vaccines. Vaccine, 1, 4–9. 13. KITCHING R.P., BHAT P.P. & BLACK D.N. (1989). The characterization of African strains of capripoxvirus. Epidemiol. Infect., 102, 335–343. 14. KITCHING R.P., HAMMOND J.M. & BLACK D.N. (1986). Studies on the major precipitating antigen of capripoxvirus. J. Gen. Virol., 67, 139–148. 15. KITCHING R.P., HAMMOND J.M. & TAYLOR W.P. (1986). A single vaccine for the control of capripox infection in sheep and goats. Res. Vet. Sci., 42, 53–60. 16. KITCHING R.P. & SMALE C. (1986). Comparison of the external dimensions of capripoxvirus isolates. Res. Vet. Sci., 41, 425–427. 17. KITCHING R.P. & TAYLOR W.P. (1985). Clinical and antigenic relationship between isolates of sheep and goat pox viruses. Trop. Anim. Health Prod., 17, 64–74. 18. ROMERO C.H., BARRETT T., EVANS S.A., KITCHING R.P., GERSHON P.D. & BLACK D.N. (1993). Single capripoxvirus recombinant vaccine for the protection of cattle against rinderpest and lumpy skin disease. Vaccine, 11, 737–742.

* * *

NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Viruela ovina y viruela caprina (ver Cuadro en la parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar la página web de la OIE para una lista actualizada: www.oie.int)

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CAPÍTULO 2.1.11.

PESTE EQUINA AFRICANA

RESUMEN La peste equina africana (PEA) es una enfermedad vírica infecciosa, pero no contagiosa, que afecta a todas las especies de équidos, causada por un orbivirus de la familia Reoviridae y caracterizada por alteraciones de las funciones respiratorias y circulatorias. La PEA se transmite por al menos dos especies de Culicoides. Se han descrito nuevo serotipos diferentes. En el este y el sur de África se presentan todos los serotipos de la PEA. En el oeste africano, solo se han detectado los serotipos 9 y 4, de donde ocasionalmente pasan a países limítrofes del Mediterráneo. Algunos ejemplos de focos ocurridos fuera de África son: en el Oriente Medio (19591963), en España (serotipo 9, 1966, serotipo 4, 1987-1990), y en Portugal (serotipo 4, 1989). El diagnóstico de laboratorio de la PEA es esencial. Aunque los síntomas y las lesiones clínicas son características, se pueden confundir con las de otras enfermedades. Como enfermedad vírica, el diagnóstico de laboratorio de la PEA se puede basar en la identificación del virus infeccioso, del ácido nucleico del virus, de los antígenos víricos o de anticuerpos específicos. En los últimos años, se ha adaptado una amplia variedad de pruebas de laboratorio para detectar tanto el virus de la PEA como los anticuerpos específicos. Identificación del agente: Siempre que ocurran focos fuera de las regiones enzooticas es importante llevar a cabo el aislamiento y el serotipado del virus. El AHSV se puede aislar de sangre tomada durante la fase febril inicial. Otros tejidos adecuados para el diagnóstico y aislamiento del virus son el bazo, los pulmones y los nódulos linfáticos, recogidos en la necropsia. Las muestras se pueden inocular en cultivos celulares, como los de riñón de hámster neonato-21 (BHK-21), células estables de mono (MS) o riñón de mono verde africano (Vero), o bien en cerebros de ratones recién nacidos. Se han desarrollado varios enzimoinmunoensayos (ELISA) para la detección rápida del antígeno del virus de la PEA (AHSV) en tejidos de bazo y en sobrenadantes de células infectadas. También se ha logrado la identificación del ARN del AHSV usando un método de reacción en cadena de la polimerasa por transcripción inversa. Los aislamientos de virus se pueden serotipar por una prueba serológica con especificidad de tipo como la de neutralización vírica (NV) y por una reacción en cadena de la polimerasa por transcripción inversa (PCR). Pruebas serológicas: Los caballos que sobreviven a una infección natural desarrollan anticuerpos contra el serotipo infeccioso del AHSV a los 8-12 días de la infección. Esto se puede demostrar por varios métodos serológicos, como la prueba de fijación de complemento, por ELISA, por inmunotransferencia y por VN. La última técnica es la usada en el serotipado. Otras pruebas que se han descrito son la inmunodifusión y la inhibición de la hemaglutinación. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Actualmente se dispone de vacunas vivas atenuadas (mono y polivalentes) para uso en caballos, mulas y asnos. Se producía una vacuna inactivada monovalente, pero ya no se encuentra en el mercado. Algunas nuevas vacunas, incluyendo una vacuna de subunidades, están en fase de evaluación experimental.

A. INTRODUCCIÓN La peste equina africana (PEA) (African horse sickness, Peste equine) (AHS) es una enfermedad infecciosa de los équidos, no contagiosa y transmitida por artrópodos, que está causada por un orbivirus con ARN de cadena doble perteneciente a la familia Reoviridae. El género Orbivirus también incluye al virus causante de la lengua

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Capítulo 2.1.11. — Peste equina africana

azul y al virus de la enfermedad hemorrágica epizoótica, que tienen propiedades morfológicas y bioquímicas similares pero distintas propiedades patológicas y antigénicas, así como un diferente rango de hospedadores. El genoma del virus de la PEA (AHSV) comprende diez segmentos de ARN de doble cadena que codifican siete proteínas estructurales (VP1-7), la mayor parte de las cuales han sido secuenciadas por completo en los ASHV de serotipo 4,6 y 9 (25, 31, 34), y cuatro proteínas no estructurales (NS1, NS2, NS3, NS3A) (9, 17). Las proteínas VP2 y VP5 forman la cápsida externa del virión, y las proteínas VP3 y VP7 son las proteínas principales de la cápsida interna. Las proteínas VP1, VP4 y VP6 constituyen las proteínas minoritarias de la cápsida interna. Recientemente se ha señalado que las proteínas NS3 son las segundas más variables de entre las proteínas del AHSV (32), siendo la más variable la proteína mayoritaria de la cápsida externa VP2. Esta proteína, VP2, es también la principal responsable de los diferentes serotipos del AHSV y, junto con VP5, de la actividad de neutralización del virus (23). Por ensayos de neutralización se han identificado nueve serotipos antigénicamente distintos en el AHSV, pero no se han observado reacciones cruzadas con otros orbivirus conocidos. La PEA es una enfermedad enzoótica en el África sub-sahariana, aunque se han dado focos ocasionales en el norte de África (1965, 1989-1990), en el Oriente Medio (1959-1961) y en Europa (España, 1966, 1987-1990, y Portugal, 1989). La enfermedad tiene incidencia estacional (final de verano/otoño) y cíclica, con las mayores epizootias durante las estaciones calurosas en Sudáfrica (1). La mortalidad por el AHSV depende de la especie de équido afectada y de la cepa y el serotipo del virus. Existen al menos dos vectores naturales implicados en la transmisión: Culicoides imicola y C. bolitinos. Entre la familia de los équidos, los caballos son los más susceptibles a la AHS, con una mortalidad del 50-95%, seguidos por las mulas, cuya mortalidad es de alrededor del 50%. En las regiones enzooticas de África, los asnos son muy resistentes al AHSV AHS y experimentan solo infecciones subclínicas. Sin embargo, en países europeos y asiáticos, los asnos son moderadamente susceptibles y presentan una mortalidad del 10%. Las cebras son también notablemente resistentes, sin síntomas clínicos, aunque pueden tener una extensa viremia (hasta 40 días).

B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO El diagnóstico de laboratorio es esencial. Aunque algunos síntomas y lesiones clínicas son características, se puede confundir la PEA con otras enfermedades. Por ejemplo, la inflamación supraorbital que se presenta con frecuencia en caballos con PEA subaguda, en combinación con un historial adecuado, es suficiente para un diagnóstico preliminar. Otros signos y lesiones son menos específicos de la PEA, y se deberían excluir otras enfermedades equinas como la encefalosis, la anemia infecciosa, la neumonía por morbilivirus, la arteritis viral, la babesiosis y la púrpura hemorrágica. Hay cuatro formas clásicas de PEA: pulmonar, cardíaca, mixta y enfermedad febril del caballo (6). La forma hiperaguda o pulmonar, que tiene un período de incubación corto (3-5 días), se caracteriza por una disnea grave muy marcada y por complicaciones respiratorias progresivas. El único síntoma puede ser una reacción febril aguda de 1-2 días de duración y que alcanza un máximo de unos 40-41°C. A esto sigue un cuadro de dificultad respiratoria –la frecuencia respiratoria puede aumentar a 60 o incluso a 75 respiraciones por minuto. Se puede observar que el animal se sostiene con sus patas delanteras separadas, con la cabeza extendida y sus ollares completamente dilatados. Es común una notable sudoración y se puede observar una tos espasmódica terminal, con un fluido espumoso exudado por los ollares. La muerte suele ocurrir a las pocas horas de los primeros síntomas clínicos, con el animal literalmente empapado por su propio fluido seroso. Por lo general la forma pulmonar se presenta en animales completamente susceptibles, en animales infectados por una cepa de virus muy virulenta, o en animales que han trabajado durante la fase febril de la enfermedad. La recuperación de esta forma es muy rara y ocurre en 80% y la muerte ocurre a los 3-6 días de la aparición de la reacción febril. La enfermedad febril del caballo es la forma más leve y con frecuencia pasa desapercibida en los focos naturales. El período de incubación varía de 5 a 14 días y continúa con una reacción febril (39-40°C) de tipo intermitente, con remisiones por la mañana y subidas por la tarde, que dura de 5-8 días. Aparte de la reacción febril, son raros otros síntomas clínicos. Las conjuntivas pueden estar débilmente congestionadas, puede aumentar el pulso, y se puede presentar cierta anorexia y depresión. Esta forma de enfermedad se suele observar en animales parcialmente inmunes o en especies resistentes, como el asno y la cebra. No existen evidencias de que el hombre pueda infectarse por alguna cepa natural del AHSV, ni por contacto con animales infectados natural o experimentalmente ni por manipulación del virus en el laboratorio. No obstante, se han descrito algunas cepas vacunales neurotrópicas que pueden causar encefalitis y retinitis en humanos tras infecciones nasales (24). Se ha descrito la transmisión experimental y natural de la PEA a perros por ingestión de carne de caballo infectada (3). Sin embargo, la evidencia de que los perros puedan infectarse por picaduras de insecto es limitada y poco convincente (30).

1.

Identificación del agente

Se dispone de varias técnicas para la identificación vírica de la PEA que varían desde el enzimoinmunoensayo (ELISA), con anticuerpos poli (PAbs) o monoclonales (MAbs), hasta la prueba de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), incluyendo una nueva PCR de transcripción inversa (RT-PCR) para diferenciar los nueve serotipos del AHSV (27), o el cultivo celular y la inoculación en ratones recién nacidos. Si es posible se debe realizar más de una prueba para diagnosticar un brote de PEA, especialmente en el caso inicial. La primera prueba puede ser un ensayo rápido como ELISA o PCR, seguido por el aislamiento del virus en cultivo celular. La neutralización del virus (VN) para identificación del serotipo debe realizarse en un brote lo antes posible para poder seleccionar la vacuna correcta. A continuación, las pruebas ELISA pueden ser muy útiles para el diagnóstico en el laboratorio. Actualmente no hay estándares internacionales para virus ni para reactivos de diagnóstico, ni tampoco una metodología normalizada para la determinación del AHSV. Sin embargo, se ha evaluado una serie de virus y se han realizado estudios comparativos entre diferentes laboratorios sobre técnicas ELISA para determinación de antígeno del AHSV AHSV. Los resultados han demostrado un alto nivel de correlación en cuanto a detección de antígeno (26) usando la técnica indirecta de ELISA en “sandwich” para estudios antigénicos (11,16). Un aspecto muy importante del diagnóstico es la selección de muestras y su transporte al laboratorio.

a)

Muestras para el aislamiento de virus Las mejores muestras para diagnóstico son: sangre completa no coagulada recogida de animales enfermos durante la fase febril de la enfermedad, así como pequeños trozos (2-4 g) de bazo, pulmón y nódulos linfáticos que hayan muerto. Las muestras se deben mantener a 4°C durante el transporte y la conservación.

b)

Cultivo celular Se ha usado con éxito el aislamiento directo del AHSV sobre líneas celulares de riñón de hámster neonato (BHK-21), células estables de mono (MS) y células de riñón de mono verde africano (Vero). Las muestras de sangre recogidas con heparina se pueden usar sin diluir. Tras 60 minutos de adsorción, los cultivos celulares se lavan y se añade medio de mantenimiento. Alternativamente, y de modo más frecuente, los eritrocitos se lavan, se lisa y se diluye 1/10. Este procedimiento elimina anticuerpos indeseables que podrían neutralizar el virus y favorece la liberación de los virus asociados con la membrana celular de los eritrocitos. Cuando se utilizan muestras de tejidos, como bazo, pulmón, etc., se prepara una suspensión de tejido al 10% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) o en medio de cultivo celular, que contenga antibióticos.

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Capítulo 2.1.11. — Peste equina africana

Entre los 2 y 8 días después de la infección puede aparecer un efecto citopático (ECP). Se deben realizar tres pases ciegos antes de considerar una muestra como negativa.

c)

Ratones neonatos Este método de aislamiento del AHSV supone la inoculación intracerebral de dos familias de ratones de 1-3 días de edad. En los casos positivos, los animales desarrollan síntomas nerviosos entre los 5 y 15 días de la inoculación. Se deben tomar los cerebros de los animales enfermos, homogeneizarlos y reinocularlos intracerebralmente en al menos seis ratones de 1-3 días de edad. Este segundo pase debe presentar un período de incubación acortado (2-5 días) y un 100% de infectividad.

d)

Prueba de enzimoinmunoensayo en “sandwich” Se han desarrollado por lo menos dos ensayos ELISA de tipo “sandwich” y se han probado en condiciones de campo para la detección de antígeno del AHSV en muestras naturales y en cultivos de tejidos infectados en el laboratorio (11,16). Una técnica (11) utiliza Pabs contra el AHSV y la otra (6) utiliza Mabs contra una de las proteínas principales y más conservadas en los serotipos –la proteína VP7. Está demostrado que ambos métodos son adecuados para diagnosticar PEA por su elevada sensibilidad y especificidad y por permitir tener resultados en solo 2-4 horas (26). Se ha descrito el uso de una inmunoglobulina (IgY) de pollo para detectar todos los serotipos del AHSV en un ensayo ELISA de tipo “sandwich” con doble anticuerpo (5). Los reactivos para ELISA se pueden obtener de los Laboratorios de Referencia para la peste equina africana de la OIE (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual). •

Lo que sigue es un ejemplo de prueba de enzimoinmunoensayo con un anticuerpo monoclonal. i)

Fase sólida: Recubrir las placas para ELISA (por ejemplo, Nunc Maxisorb de alta capacidad de adsorción) con una mezcla de Mab 5G5 y 3D2 diluida en PBS, pH 7.2 (10 µg/ml de cada uno). Incubar toda la noche a 4°C.

ii)

Lavar las placas cinco veces con agua destilada que contenga 0.05% (v/v) de Tween 20 (solución de lavado). Tocar suavemente las placas con un material absorbente para eliminar cualquier residuo del lavado.

iii)

Bloquear las placas con PBS + 1% de seroalbúmina bovina (BSA), pH 7.2, poniendo 200 µl/pocillo, durante 1 hora a 37°C.

iv)

Eliminar la solución de bloqueo y limpiar ligeramente las placas con un material absorbente.

v)

Muestras de ensayo: Añadir las muestras a probar (diluciones dobles comenzando con homogenados de bazo sin diluir, o con el sobrenadante de cultivo celular de AHSV) diluidas con PBS + 1% de BSA, pH 7.2, poniendo 100 µl/pocillo. Incubar 1 hora a 37°C. (Homogenado de bazo: homogeneizar aproximadamente 2 cm3 [1 g] de bazo con 3 ml de medio de cultivo MEM [medio mínimo esencial]. Centrifugar a 600 g por 3 minutos y guardar el sobrenadante).

vi)

Lavar las placas como en el paso (ii).

vii)

Conjugado: Poner 100 µl/pocillo de Mab 5G5 marcado con biotina diluido 1/500 en PBS + 1% BSA, pH 7.2. Incubar 1 hora a 37°C. Lavar las placas como en el paso ii. Añadir 100 µl/pocillo de avidina/peroxidasa a dilución óptima en PBS + 1% de BSA. Incubar 45 minutos a temperatura ambiente.

viii) Lavar las placas como se describe en el paso (ii).

244

ix)

Substrato: Añadir 200 µl/pocillo de solución de substrato (10 ml de 80.6 mM de DMAB [dimetil aminobenzaldehído] + 10 ml de 1.56 mM MBTH [hidrocloruro de 3-metil-2-benzo-tiazolinona hidrazona] + 5 µl de H2O2). Después de unos 5-10 minutos, el desarrollo del color se detiene añadiendo 50 µl de SO4H2 3N (antes de que el control negativo comience a colorear).

x)

Leer las placas a 600 nm (o a 620 nm).

xi)

Interpretación de los resultados: Calcular el valor de corte del modo siguiente: C + 0.06 = Corte (donde C es el valor de absorbancia obtenido con el control negativo). Las muestras de ensayo con valores de absorbancia menores que el corte se consideran negativas. Las muestras de ensayo con valores de absorbancia superiores al corte + 0,20 se consideran positivas. Las muestras con valores intermedios de absorbancia son dudosas y se debe emplear una segunda técnica para confirmar el resultado.

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Capítulo 2.1.11. — Peste equina africana

e)

Reacción en cadena de la polimerasa Se ha desarrollado un ensayo por PCR para la detección específica del ARN del AHSV. Los cebadores corresponden al extremo 5´ (nucleótidos 1-21) y 3´ (nucleótidos 1160-1179) del segmento 8 del ARN (20, 29, 35). •

Procedimiento de la prueba

La extracción de ácidos nucleicos de las muestras de bazo se hace de la siguiente forma: se homogeniza 1 g de muestra del tejido en 1 ml de solución desnaturalizante (tiocianato de guanidinio 4 M, citrato sódico 25 mM, 2-mercaptoetanol 0,1 M, sarcosil al 0.5%). Tras centrifugar, se añade al sobrenadante 1 µg de ARN de levadura, 0,1 ml de acetato sódico 2 M pH 4, 1 ml de fenol y 0,2 ml de una mezcla de cloroformo/alcohol isoamílico (49/1). La suspensión se agita vigorosamente y se enfría en hielo por 15 minutos. Tras centrifugar, el ARN presente en la fase acuosa se extrae con fenol, se precipita con alcohol y se resuspende en agua estéril. Los métodos para síntesis de cADN y amplificación por PCR se realizan usando en todos los casos 37°C como temperatura de renaturalización. Las secuencias utilizadas como cebadores en la PCR son 5´-GTT-AAA-ATT-CGC-TTA-GGA-TG-3´, que corresponde al ARN con polaridad de mensajero y 5´-GTA-AGT-GTA-TTC-GGT-ATT-G-3´, que es complementario al ARN con polaridad de mensajero. El proceso de la PCR en sí comprende 40 ciclos (94°C por 1 minuto, 55°C por 1.5 minutos, 72°C por 2.5 minutos y 70°C por 7 minutos) y luego los tubos de PCR se mantienen a 4°C. El análisis de los productos de PCR se realiza mediante electroforesis en geles de agarosa al 1.2% (p/v) que contienen bromuro de etidio. Las muestras positivas originarán una banda de 1179 pares de bases. Se ha descrito una nueva RT-PCR para diferenciar los nueve serotipos del AHSV (27). Para cada serotipo específico se diseñaron nueve pares de cebadores. Los resultados obtenidos muestran un perfecto acuerdo entre la prueba RT-PCR y la prueba VN. También se ha realizado el tipado de los nueve serotipos de AHS con sondas desarrolladas a partir de una serie de genes VP2 clonados por completo, y pueden representar una alternativa a la amplificación del segmento genómico 2 (15).

2.

Pruebas serológicas

Existen sueros de Referencia Internacional de la OIE disponibles en el Laboratorio de referencia de la OIE en Valdeolmos, Madrid, España (ver Parte 3 de este Manual). Estos sueros se desarrollaron para estandarizar los ensayos ELISA, que constituyen una prueba recomendada por la OIE. Además, se ha evaluado una serie de antisueros de referencia y se han realizado estudios comparativos entre diferentes métodos ELISA usando Mabs y Pabs en varios laboratorios. Los resultados han demostrado un nivel de correlación alto usando técnicas ELISA indirectas o competitivas para la detección de anticuerpo (10, 18, 26). Más recientemente, se ha generado una serie de sueros que están siendo usados en la garantía anual de calidad de tres métodos ELISA para detección de anticuerpo según se utilizan en laboratorios nacionales de Europa (8, 10, 18). Para la detección de anticuerpos reactivos de grupo anti- AHSV AHSV, las técnicas ELISA indirectas y competitivas que utilizan antígeno soluble del AHSV o una proteína VP7 recombinante (18), y un ELISA competitivo que utiliza antígeno soluble del AHSV , han resultado ser buenos métodos, especialmente para investigaciones a gran escala (26). Ambos tipos de pruebas han sido reconocidos por la Comisión Europea (8). El ELISA competitivo se ha usado también en poblaciones salvajes, pues con este método no se requiere una antiglobulina específica de especie. Se ha adaptado una prueba de inmunotransferencia para determinación de anticuerpos anti-PEA (18). Es particularmente adecuado para pequeños números de sueros. También hay disponible un método ELISA indirecto que utiliza la proteína no estructural NS3 del AHSV del serotipo 4 como antígeno y que puede utilizarse para diferenciar animales infectados o vacunados con la vacuna viva de aquellos otros vacunados con la vacuna inactivada hecha con viriones purificados (19). La prueba de fijación del complemento (CF) se ha usado con profusión, pero algunos sueros muestran actividad anticomplementaria.

a)

Enzimoinmunoensayo indirecto (una prueba prescrita para el comercio internacional) Para la determinación de anticuerpos contra el AHSV se ha usado como antígeno la proteína VP7 recombinante con un alto grado de sensibilidad y especificidad (18, 33). Otras ventajas de este antígeno son su estabilidad y su falta de infectividad. •

Procedimiento de la prueba

i)

Fase sólida: Recubrir las placas para ELISA (por ejemplo, Nunc Maxisorb de alta capacidad de adsorción) con VP7 recombinante de AHSV-4 diluida en tampón carbonato/bicarbonato, pH 9,6. Incubar toda la noche a 4°C.

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Capítulo 2.1.11. — Peste equina africana

ii)

Lavar las placas cinco veces con agua destilada que contenga 0,01% (v/v) de Tween 20 (solución de lavado). Tocar suavemente las placas con un material absorbente para eliminar cualquier residuo del lavado.

iii)

Bloquear las placas con PBS, pH 7,2 + 5% (p/v) de leche desnatada, 200 µl/pocillo, durante 1 hora a 37°C.

iv)

Retirar la solución de bloqueo y limpiar suavemente las placas con un material absorbente.

v)

Muestras de ensayo: Las muestras de suero a ensayar, y los controles de suero positivo y negativo, se diluyen 1/25 en PBS + 5% (p/v) de leche desnatada + 0,05% (v/v) de Tween 20, 100 µl por pocillo. Incubar 1 hora a 37°C. Para la titulación, añadir diluciones dobles seriadas desde 1/25 (100 µl por pocillo), poniendo un suero en cada columna de la placa, y hacer lo mismo con los controles positivos y negativos. Incubar 1 hora a 37°C.

vi)

Lavar las placas como en el paso (ii).

vii)

Conjugado: Depositar 100 µl/pocillo de gamma-globulina anti-caballo conjugada con peroxidasa de rábano diluida en PBS + 5% de leche +0,05% de Tween 20, pH 7,2. Incubar 1 hora a 37°C.

viii) Lavar las placas como en el paso (ii).

b)

ix)

Substrato: Añadir 200 µl/pocillo de solución de substrato (10 ml de DAMB + 10 ml de TBTH + 5 µl de H2O2). Después de unos 5-10 minutos, el desarrollo del color se detiene por adición de 50 µl de H2SO4 3N (antes de que el control negativo empiece a colorear). También se pueden usar otros substratos como ABTS (2,2´-azino-di-[3-etil-benzotiazolina]-6-ácido sulfónico), TMB (tetrametil benzidina) u OPD (ortofenildiamina)

x)

Leer las placas a 600 nm (o a 620 nm)

xi)

Interpretación de los resultados: Calcular el valor de corte añadiendo 0,6 al valor del control negativo (0.06 es la desviación estándar derivada de un grupo de 30 sueros negativos). Las muestras con valores de absorbancia menores que el corte se consideran negativas. Las muestras con valores de absorbancia mayores que el corte + 0,15 se consideran positivas. Las muestras con valores intermedios de absorbancia son dudosas y se requiere una segunda técnica para confirmar el resultado.

Inmunotransferencia La unión de anticuerpos a proteínas víricas separadas por electroforesis y transferidas a papel de nitrocelulosa se ha empleado en la determinación de anticuerpos anti-AHSV (18). •

Procedimiento de la prueba

Las proteínas de AHSV semipurificadas se separan por SDS/PAGE (dodecil sulfato sódico/ electroforesis en gel de poliacrilamida) en geles con 15% (p/v) de acrilamida-N,N´-dialiltartar-diamida (DATD). Las proteínas separadas se transfieren a un filtro de membrana de nitrocelulosa con corriente constante de 280 mA por 6 horas a 4°C. La detección de inmunotransferencia de una membrana de nitrocelulosa cortada en tiras se hace con sueros a una dilución 1/20, una dilución 1/500 de inmunoglobulina anti-caballo obtenida en conejo y conjugada con peroxidasa, y una incubación de 1 hora a 37°C. Las bandas reconocidas por los sueros se visualizan por la técnica del 4-cloro-naftol. Interpretación de los resultados: La comparación entre el modelo de bandas de un control de suero positivo y otro negativo permite la identificación de las bandas víricas específicas. La aparición de una o más bandas específicas en un suero problema permite clasificarlo como un suero anti-AHS PEA positivo.

c)

Enzimoinmunoensayo con NS3 Se ha adaptado y evaluado un ensayo ELISA indirecto para distinguir entre caballos infectados y caballos vacunados con la vacuna inactivada del serotipo 4 de AHSV purificado, usando como antígeno una proteína NS3 recombinante. Los resultados obtenidos (19) indican que la NS3 recombinante puede diferenciar entre animales infectados y vacunados, lo que implica que esta recombinante podría ser un reactivo diagnóstico importante que permitiría el transporte de animales vacunados. Para asegurar la exactitud de los resultados, es esencial que la vacuna inactivada seleccionada contra AHSV sea una vacuna purificada. Esto excluiría con seguridad cualquier traza de NS3 que, si estuviera presente, estimularía la producción de anticuerpos anti-NS3 en los caballos vacunados, simulando por tanto una respuesta a la infección natural. Este método ELISA también será útil para distinguir entre caballos infectados y caballos vacunados con una vacunas de subunidades en la que no esté presente la proteína NS3.

246

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Capítulo 2.1.11. — Peste equina africana

d)

Fijación de complemento (una prueba prescrita para el comercio internacional) La prueba CF se ha usado ampliamente, pero debido al efecto anti-complementario de algunos sueros, y a los buenos resultados obtenidos con ensayos ELISA, su uso está disminuyendo. La prueba CF se utiliza con frecuencia para poner de manifiesto anticuerpos específicos de grupo contra AHSV. Normalmente se utiliza como antígeno un extracto de cerebro de ratón en sacarosa/acetona. •

Reactivos

i)

Solución salina tamponada con Veronal que contiene 1% de gelatina (VBSG).

ii)

Muestras de suero, libres de eritrocitos, que deben ser inactivadas por calor: el suero de caballo a 56°C, el de cebra a 60°C y el de asno a 62°C, durante 30 minutos.

iii)

El antígeno es un extracto en sacarosa/acetona de cerebro de ratón infectado por ASHV. El antígeno control es cerebro de ratón no infectado, extraído del mismo modo. En ausencia de un suero internacional estandarizado, el antígeno debe titularse frente a un control de suero positivo preparado localmente. En la prueba, se utilizan de cuatro a ocho unidades.

iv)

El complemento es un suero normal de cobaya.

v)

La hemolisina es un suero de conejo hiperinmune contra eritrocitos de oveja (SRBCs).

vi)

Los SRBCs se obtienen por punción aséptica de la vena yugular y se conservan en solución de Alsever1 o en citrato sódico.

vii)

El sistema hemolítico se prepara diluyendo la hemolisina hasta contener dos dosis hemolíticas y usando esto para sensibilizar a los SRBCs lavados. Los SRBCs se estandarizan a una concentración del 3%.

viii) Suero control: Se obtiene localmente un suero control positivo y se valida. Como suero control negativo se utiliza suero de un caballo sano negativo para anticuerpos.

e)

•

Procedimiento de la prueba

i)

Los sueros, el complemento y el antígeno se dejan reaccionar a 4°C por 18 horas en placas de microtitulación de fondo cóncavo, o en tubos si se utiliza la macro-técnica.

ii)

Los SRBCs sensibilizados (3%) se añaden a todos los pocillos de la placa.

iii)

La placa se incuba 30 minutos a 37°C.

iv)

Las placas se centrifugan luego a 200 g, y los pocillos se analizan para la presencia de hemolisis.

v)

Se utilizan los siguientes controles: (a) suero y complemento; (b) suero y SRBCs; (c) antígeno FC y control de antígeno, cada uno con 4 CH50 (unidades hemolíticas medias de complemento), 2 CH50, y 1 CH50 de complemento; (d) antígeno FC y SRBCs; (e) control de antígeno y SRBCs; (f) diluciones de complemento de 4 CH50, 2 CH50 y 1 CH50, y (d) SRBCs.

vi)

Los resultados se leen usando un 50% de hemolisis como punto final. El inverso de la dilución más alta de suero que fija específicamente complemento con el antígeno FC representa el título.

vii)

Un título de 1/10 o más es positivo y bajo 1/10 es negativo.

Neutralización de virus El método de elección para serotipado es NV. La prueba puede realizarse como se indica (12,13).

1

i)

Se diluye el virus obtenido para dar 30-100 DICCT50 (dosis infectiva media en cultivo de tejidos) por cada 25 µl, y se añaden 25 µl a cada uno de cuatro pocillos de microtitulación con 25 µl de diluciones de sueros. Para análisis, se utiliza una dilución final de suero de 1/10. Para titulaciones se utilizan diluciones dobles seriadas.

ii)

Las mezclas suero/virus se incuban 60 minutos a 37°C antes de añadir a cada pocillo de ensayo 0,1 ml de una suspensión de células Vero (200.000 células/ml).

iii)

Se prepara una titulación del stock de virus para cada ensayo usando cuatro pocillos por dilución decimal, con 25 µl por pocillo. Las placas de ensayo se incuban a 37°C, con 5% de CO2, con 95% de humedad, durante 4-5 días, hasta que la titulación indique que el stock de virus contiene 30100 DICCT50.

20.5 g de dextrosa (114 mM), 7.9 g de citrato sódico 2 H2O (27 mM), 4.2 g NaCl (71 mM), H2O hasta 1 litro. Ajustar el pH con ácido cítrico 1 M.

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

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Capítulo 2.1.11. — Peste equina africana

iv)

A continuación las placas se fijan y se tiñen con una solución de 0,15% (p/v) de cristal violeta en 2% (v/v) de glutaraldehído y se lavan. Alternativamente, se pueden fijar con etanol y teñirlas con fucsina básica al 1%.

v)

El título del suero a punto final del 50% se calcula por el método de Sperman-Kärber y se expresa como log10 negativo.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO Son de uso general las vacunas vivas atenuadas poli o monovalentes contra AHS que están basadas en la selección de virus genéticamente estables que producen macroplacas de lisis en cultivos de células Vero (7). Se ha producido comercialmente una vacuna monovalente inactivada contra AHSV (de serotipo 4), pero ya no está disponible en la actualidad (4, 14). Los requisitos tanto para vacunas atenuadas como para inactivadas se resumen más adelante. Las directrices para la producción de vacunas veterinarias se indican en el Capítulo I.1.7. Principios de producción de vacunas veterinarias. Las normas dadas aquí y en el Capítulo I.1.7 intentan ser de carácter general y pueden suplementarse con requisitos nacionales y regionales.

C1. Vacuna atenuada contra la peste equina africana 1.

Control del inóculo

a)

Características del inóculo El inóculo de virus se prepara a partir de AHSV genéticamente estable tomado de grandes placas de lisis seleccionadas en células Vero con bajo nivel de pases. Se liofiliza una gran cantidad de este antígeno y se guarda a –20°C como stock de antígeno para la siembra.

b)

Método de cultivo El virus de inóculo se crece en frascos rotatorios de cultivos de células Vero.

c)

Validación como una vacuna Por técnicas apropiadas el virus de inóculo debe estar libre de virus contaminantes, bacterias y micoplasmas. Se confirma la identidad del serotipo del virus de inóculo.

2.

Método de producción

Al principio de una fase de producción, se producen antígenos de trabajo en cultivos celulares de células BHK-21 o Vero a partir del stock de antígeno de inóculo. Los antígenos de trabajo se prueban en cuanto a esterilidad, pureza e identidad y deberían contener un mínimo de 1 x 106 unidades formadoras de placas (PFU)/ml del virus infeccioso. Los cultivos de células Vero se crecen en frascos rotatorios usando en el medio suero bovino irradiado con radiación gamma. Una vez que los cultivos llegan a ser confluentes, el medio se elimina y las células se siembran con los antígenos de trabajo. Tras 1 hora, se añade a los cultivos medio de mantenimiento. La incubación se continúa durante 2-3 días a 37°C. Cuando el ECP está avanzado, se recogen tanto las células como el medio líquido sobrenadante. Los productos del mismo serotipo se agrupan y se guardan a 4°C.

3.

Control interno

El material recogido de los serotipos individuales se analiza para esterilidad y se ensaya para infectividad mediante titulación de formación de placas en cultivos de células Vero. El título mínimo aceptable es de 1 x 106 PFU/ml. Finalmente, se preparan dos vacunas cuatrivalentes mezclando volúmenes iguales de los serotipos 1, 3, 4, 5 y 2, 6, 7, 8 respectivamente. Posteriormente el serotipo 5 de AHSV se ha eliminado de esta vacuna. También se puede preparar un tipo monovalente. Tras la adición de un estabilizador apropiado, la vacuna se distribuye en volúmenes de 1 ml en viales de vidrio y se liofiliza.

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Capítulo 2.1.11. — Peste equina africana

4.

Control de lotes

a)

Esterilidad Después de la liofilización, se seleccionan al azar cinco frascos de vacuna y se ensayan para esterilidad por métodos aceptados internacionalmente. Las pruebas para esterilidad y ausencia de contaminación de los productos biológicos se indican en el Capítulo I.1.5.

b)

Inocuidad La prueba de que una vacuna sea inocua se realiza mediante inoculación de la vacuna reconstituida en ratones (0,25 ml, intraperitonealmente), cobayas (1,0 ml, intraperitonealmente), y un caballo (5,0 ml, subcutáneamente). Todos los animales se observan diariamente durante 14 días. La temperatura rectal del caballo se toma dos veces al día durante 14 días y nunca debe superar los 39°C.

c)

Potencia La potencia depende en gran medida de la concentración de virus en la vacuna. La dosis inmunizante mínima para cada serotipo es de alrededor de 1 x 103 PFU/dosis. El título de infectividad del producto final se ensaya por titulación de placas en cultivo de células Vero y debería contener al menos 1 x 105 PFU/dosis. El caballo usado en la prueba de inocuidad se utiliza también para determinar la inmunogenicidad de una vacuna. Se toman muestras de suero el día de la vacunación y 21 días después, y se ensayan para anticuerpos neutralizantes contra cada serotipo por la prueba de reducción de placas usando diluciones seriadas dobles y unas 100 UPF de virus. El caballo debería desarrollar un título de anticuerpos neutralizantes de al menos 20 contra un mínimo de tres de los cuatro serotipos presentes en la vacuna cuatrivalente.

d)

Duración de la inmunidad La duración de la inmunidad no se confirma en cada lote de vacuna, pero se sabe que la inmunidad persiste por al menos 4 años. Sin embargo, a la vista de una posible interferencia entre los serotipos individuales de cada vacuna cuatrivalente, se recomienda la revacunación anual en regiones enzooticas. La vacunación con vacuna monovalente estimula una inmunidad que dura prácticamente toda la vida.

e)

Estabilidad En estado liofilizado la vacuna retiene su potencia durante muchos años si se guarda a 4-8°C. Sin embargo, se considera normalmente una caducidad de 2 años.

C2. Vacuna inactivada contra la peste equina africana 1.

Control de inóculos

a)

Características del inóculo El virus de inóculo es la cepa vacunal atenuada (AHSV de serotipo 4) que se utiliza ampliamente en el campo en África y en el sur de Europa (existen stocks de inóculo disponibles en el Laboratorio de Referencia de la OIE [Onderstepoort]). Para su atenuación, el virus se pasó diez veces por cerebro de ratón recién nacido, y luego se pasó otras diez veces por cultivo de células BHK-21 en frascos rotatorios. Este material se purificó tres veces por placa en cultivos celulares de células Vero mediante la selección de una placa de lisis grande (4-6 mm) en diluciones terminales. El material de la placa final se pasó una vez más por cerebro de ratón recién nacido y cuatro veces más en cultivos celulares de células Vero. Este material se liofilizó y constituye el inóculo primario de virus.

b)

Método de cultivo El virus atenuado se propaga por pases en células BHK-21 en frascos rotatorios.

c)

Validación como una vacuna Por métodos apropiados, se debe demostrar que el inóculo de virus está libre de virus contaminantes, bacterias y micoplasmas. La identificación del serotipo se confirma usando Mabs por un método ELISA de doble “sandwich”.

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

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Capítulo 2.1.11. — Peste equina africana

2.

Método de producción

El virus se recoge cuando el CPE característico se ha desarrollado por completo. El cultivo posterior se realiza en suspensiones celulares con medio de Stoker sin suero (MEM) a 37°C. El crecimiento del virus se analiza respecto a la viabilidad celular (CPE), y cuando se llega a las condiciones óptimas, se baja la temperatura del fermentador de cultivo a 4°C. La suspensión de virus se recoge en condiciones asépticas. La suspensión filtrada del virus atenuado se inactiva con formaldehído a una concentración final de 1/1.000. La suspensión se transfiere a otro tanque y se mantiene a 4°C con agitación suave durante un mínimo de 10 días para asegurarse de que todo el virus está inactivado. También se realizan controles de inactivación. Tras la inactivación, la suspensión de antígeno se concentra por ultrafiltración y luego se purifica mediante precipitación selectiva con un complejo de óxido de etileno y cationes bivalentes según un proceso patentado.

3.

Control interno

Se realizan pruebas sobre la identidad del virus por ELISA en doble “sandwich”, sobre la titulación del virus antes de la inactivación en líneas celulares Vero, sobre la estimación de la concentración de partículas víricas por análisis en gradiente de sacarosa, y sobre la esterilidad.

4.

Control de lotes

a)

Esterilidad Las pruebas sobre esterilidad y ausencia de contaminación de los productos biológicos se indican en el Capítulo I.1.5.

b)

Inocuidad Se inoculan caballos susceptibles al AHSV por vía intramuscular o subcutánea con una dosis sencilla o doble de la vacuna. Se registran diariamente las temperaturas durante 14 días, y se observan los caballos para posibles signos clínicos. Cinco cobayas reciben una dosis vacunal de caballo por ruta intramuscular. Los sueros recogidos el día 21 se ensayan por NV para anticuerpos.

c)

Potencia El control de potencia se realiza en caballos vacunados mediante una infección de desafío. Se vacuna a algunos animales con una dosis de vacuna y a otros con dos dosis. A los 77 días después de la primera inoculación de vacuna se hace la inoculación de desafío por vía intravenosa. Cuando se emplean dos vacunaciones, la segunda dosis se suministra 21 días después de la primera. Se recogen muestras de suero el día de la vacunación y 21 días después y se ensayan para presencia de anticuerpos neutralizantes y aislamiento de virus.

d)

Duración de la inmunidad No se han realizado estímulos de provocación en caballos, sino solamente estudios serológicos. Si el nivel de anticuerpos después de dos inyecciones (protocolo de campo recomendado) y el de 12 meses después de la vacunación es equivalente al nivel logrado por una vacunación simple a los 28 días después de tal vacunación, se considera que los caballos están protegidos. Con esta norma, la duración de la inmunidad es de 1 año, comenzando a los 7-10 días después de la primera inyección. En los años siguientes es suficiente una dosis de refuerzo cada año para conseguir un nivel de protección. El protocolo de vacunación recomendado por los fabricantes incluye dos vacunaciones (separadas por 21 días) y una dosis de refuerzo a los 365 días después de la primera vacunación.

e)

Estabilidad Como la vacuna inactivada es un producto relativamente nuevo, no hay muchos datos disponibles sobre la duración de su estabilidad. Se han obtenido resultados que demuestran que la estabilidad de la vacuna sobrepasa los 3 años.

C.3 Vacuna de subunidades contra la peste equina africana Se han usado en diferentes combinaciones las proteínas VP2 y VP5 de la cápsida externa del AHSV de serotipo 4, junto con la proteína VP7 de la cápsida interna, para inmunizar caballos (21). Estas proteínas derivaban de

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Capítulo 2.1.11. — Peste equina africana

vectores de expresión de baculovirus con recombinaciones simples y dobles. Los extractos celulares crudos que contenían las tres proteínas estructurales fueron suficientes para obtener una respuesta inmune de protección completa en caballos sometidos a inoculaciones de desafío con virus AHSV virulentos (106 DICCT50). No se detectó viremia en los caballos vacunados (21). Un análisis adicional de un lisado crudo que confería protección parcial reveló que sólo la proteína soluble VP2 era capaz de inducir anticuerpos neutralizantes. Se ha logrado definir los sitios de neutralización de la proteína viral VP2 de los serotipos 3,4 y 9 de AHSV (2, 22, 31) y más recientemente se ha descrito la protección completa de caballos inmunizados con una proteína VP2 soluble y recombinante (de AHSV de serotipo 5) administrada con saponina, frente a un desafío con AHSV letal (28). Aunque se necesita realizar más experimentos para estimar la duración de la inmunidad inducida por estas proteínas, los datos indican la eficacia de esta candidata a vacuna.

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Capítulo 2.1.11. — Peste equina africana

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* * * NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Peste equina africana (ver Cuadro en la parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar la página web de la OIE para una lista actualizada: www.oie.int)

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

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CAPÍTULO 2.1.12.

PESTE PORCINA AFRICANA

RESUMEN La peste porcina africana (PPA) es una enfermedad infecciosa de cerdos domésticos y salvajes que afecta animales de todas las razas y edades y que está causada por un virus que produce una serie de síndromes. La enfermedad aguda se caracteriza por fiebre elevada, hemorragias en el sistema retículoendotelial y elevadas tasas de mortalidad. El virus infeccioso sobrevive durante meses en carne fresca y en derivados cárnicos desecados y salados. El virus de la PPA (ASFV) es el único miembro de la familia Asfarviridae. Los procedimientos de laboratorio para diagnóstico forman dos grupos: el primero incluye pruebas para aislar los virus y la detección de los antígenos víricos, así como el ADN genómico, y el segundo contiene pruebas para detectar anticuerpos. La selección de las pruebas a realizar depende de la situación de la enfermedad en el área o país. En países libres de PPA donde se sospecha su presencia, el diagnóstico debe dirigirse al aislamiento del virus, realizando en paralelo una inoculación de leucocitos de cerdo o cultivos de médula ósea, la detección del antígeno en frotis o cortes de tejidos congelados por la prueba de la inmunofluorescencia directa (IFD) y, cuando resulte posible, la detección del ADN genómico por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Al mismo tiempo también debe llevarse cabo la detección de anticuerpos en líquidos tisulares por inmunofluorescencia indirecta (IFI). Identificación del agente: Los tejidos enviados de casos sospechosos de enfermedad en el campo, deben examinarse en frotis o cortes para el antígeno vírico por FAT y para la presencia de virus por inoculación de cultivos primarios de leucocitos de cerdo, que se analizan diariamente para hemadsorción y efecto citopático. Las células de los cultivos negativos se investigan para el antígeno mediante FAT y se vuelven a inocular en cultivos nuevos de leucocitos. Se puede utilizar PCR para detectar el genoma del virus en los tejidos y resulta particularmente útil si los tejidos son inadecuados para el aislamiento del virus o la detección del antígeno. En casos dudosos, el material se vuelve a cultivar y los procedimientos descritos anteriormente se repiten. Pruebas serológicas: Cuando la enfermedad es endémica o cuando un brote inicial está causado por una cepa de baja virulencia, la investigación de nuevos brotes debe incluir la detección de anticuerpos mediante inmunoensayo en el suero o en los extractos de los tejidos enviados. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Actualmente no existe vacuna para la PPA.

A. INTRODUCCIÓN El virus de la peste porcina africana (ASFV) se clasificó inicialmente como un miembro de la familia Iridoviridae, pero la estructura del genoma y la estrategia de replicación del virus muestran muchas características comunes con los miembros de la familia Poxviridae (14). En 1984, en el Sexto Congreso del Comité Internacional de Taxonomía de Virus (ICTV) en Sendai (Japón), se aceptó la propuesta de que el ASFV se considere como una familia separada de la de los Iridoviridae. En la actualidad el virus se clasifica como el único miembro de la familia denominada Asfarviridae.

254

Manual de la OIE sobre Animales Terrestres 2004

Capítulo 2.1.12. — Peste porcina africana

Los virus de la PPA producen una serie de síndromes que varían desde la enfermedad aguda a la crónica, y existen portadores del virus aparentemente sanos. Las cepas más virulentas producen una enfermedad hemorrágica aguda caracterizada por fiebre elevada, pérdida de apetito, hemorragias cutáneas y de los órganos internos, y muerte a los 2-10 días. Las tasas de mortalidad pueden alcanzar el 100%. Las cepas menos virulentas producen síntomas clínicos suaves –fiebre ligera, apetito reducido y depresión- que pueden confundirse fácilmente con otras condiciones de los cerdos y no llevar a la sospecha de PPA. En varios países, cepas avirulentas y no hemadsorbentes producen una infección subclínica no hemorrágica y seroconversión, pero algunos animales pueden desarrollar lesiones aisladas en los pulmones o en la piel en áreas con salientes óseos y otras zonas susceptibles de traumatismos. La PPA no puede distinguirse de la peste porcina clásica (PPC) (cólera del cerdo) por examen clínico o postmortem, y ambas enfermedades deben considerarse en el diagnóstico diferencial de cualquier síntoma febril agudo y hemorrágico en el cerdo. Las septicemias bacterianas también pueden confundirse con la PPA y la PPC. Para distinguir entre estas enfermedades son esenciales las pruebas de laboratorio. En países libres de PPA donde se sospecha su presencia, el diagnóstico de laboratorio debe dirigirse al aislamiento del virus realizando en paralelo una inoculación de leucocitos de cerdo o cultivos de médula ósea, y a la detección del antígeno en frotis o cortes de tejidos congelados por la prueba de la inmunofluorescencia directa (IFD). Sin embargo, también debe realizarse al mismo tiempo la detección de anticuerpos en el suero o los líquidos tisulares por enzimoinmunoensayo, inmunotransferencia o inmunofluorescencia indirecta (IFI) para evitar retrasos en la detección de la infección por un virus inesperado de baja virulencia. La serología puede ser un instrumento valioso de ayuda para confirmar un brote ya que a menudo se pueden detectar los anticuerpos en animales muertos por enfermedad aguda. Una técnica adicional que está ahora disponible es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que puede emplearse para detectar el genoma vírico en la sangre o en los tejidos, y que es particularmente útil si las muestras disponibles son inadecuadas para aislar el virus o para detectar el antígeno debido a la putrefacción.

B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO 1.

Identificación del agente

Cuando se sospecha PPA, se deben enviar al laboratorio las siguientes muestras: sangre con anticoagulante (heparina o ácido etilén diamino tetra-acético [EDTA]), bazo, amígdalas, riñón y ganglios linfáticos. Las muestras deben mantenerse tan frías como sea posible sin congelarlas. Cuando las muestras llegan al laboratorio, si el proceso de análisis se retrasa, se guardan a –70°C. Como no siempre es posible mantener la cadena de frío, se pueden enviar las muestras en solución salina con glicerol; esto puede reducir ligeramente la probabilidad de identificar el virus, pero facilita la llegada de envíos al laboratorio para poder confirmar un brote.

•

Preparación de muestras para hemadsorción e inoculación en cerdos i)

Preparar suspensiones de los tejidos homogenizando pequeños trozos en un mortero con arena estéril y añadiendo 5-10 ml de una solución salina tamponada o medio de cultivo de tejidos que contenga antibióticos.

ii)

Clarificar las suspensiones mediante centrifugación a 1.000 g durante 5 minutos.

Utilizar el sobrenadante para hemadsorción (Sección B.1.a., más adelante) y para inoculación en cerdos (Sección B.1.d., más adelante), aunque no se recomienda la inoculación en cerdos.

a)

Prueba de hemadsorción La prueba de hemadsorción (HAD) (6) es definitiva para PPA y depende del hecho de que los eritrocitos porcinos se adhieren a la superficie de los monocitos o macrófagos porcinos que están infectados con el ASFV, y de que la mayoría de los aislamientos de virus producen este fenómeno de hemadsorción. Se ha aislado un pequeño número de virus “no hemadsorbentes”, en gran parte avirulentos, aunque algunos producen PPA aguda típica. La prueba se realiza inoculando sangre o una suspensión de tejidos de animales sospechosos a cultivos primarios de leucocitos (Procedimiento 1) o preparando cultivos de leucocitos de la sangre de cerdos inoculados en el laboratorio o de cerdos sospechosos en el campo (Procedimiento 2). Se pueden preparar hasta 300 cultivos de cada 100 ml de sangre desfibrinada o heparinizada recogida. Resulta esencial realizar los procedimientos de forma que se evite la contaminación de los cultivos.

Manual de la OIE sobre Animales Terrestres 2004

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Capítulo 2.1.12. — Peste porcina africana

•

Procedimiento 1: Prueba de hemadsorción en cultivos primarios de leucocitos

i)

Recoger el volumen necesario de sangre de cerdo fresca con heparina (100 Unidades Internacionales [UI]/ml de sangre).

ii)

Centrifugar a 700 g durante 30 minutos, obtener la capa de células leucocitarias y lavar con medio.

iii)

Resuspender las células a una concentración de 107 células/ml en medio de cultivo de tejidos que contenga 10-30% de suero porcino y antibióticos. Para evitar la hemadsorción inespecífica, el medio debe contener suero o plasma del mismo cerdo del que se obtienen los leucocitos. Si se prueba un gran volumen de muestras, los sueros homólogos pueden reemplazarse por suero que se haya identificado como capaz de evitar la formación de auto-rosetas inespecíficas en un pre-análisis.

iv)

Depositar alícuotas de 1,5 ml en tubos de 160 x 16 mm e incubar en posición oblicua (5-10° de la horizontal) a 37°C. Nota: Para diagnóstico rutinario, solo los cultivos de 2-4 días son suficientemente sensibles.

v)

Inocular tres tubos de células añadiendo 0,2 ml de muestras de tejido preparadas por cada tubo. Se aconseja inocular en los cultivos diluciones 1/10 y 1/100, y esto es particularmente importante cuando el material recibido del campo es de mala condición.

vi)

Inocular cultivos control positivos con virus hemadsorbente. Son esenciales los controles negativos no inoculados para controlar la posibilidad de hemadsorción inespecífica.

vii)

A los 3 días, añadir a cada tubo 0,2 ml de una preparación reciente de eritrocitos al 1% en solución salina tamponada.

viii) Examinar diariamente al microscopio los cultivos durante 7-10 días para efecto citopático (ECP) y hemadsorción. ix)

Lectura de los resultados: La hemadsorción consiste en la unión de muchos eritrocitos porcinos a la superficie de las células infectadas. En ausencia de hemadsorción, un ECP basado en la reducción del número de células adherentes puede deberse a citotoxicidad del inóculo, al virus de la enfermedad de Aujeszky o a ASFV no hemadsorbente, lo cual puede detectarse mediante FAT en el sedimento celular o por PCR (ver más adelante). Si no se observa cambio, o si los resultados de la inmunofluoresencia o de PCR son negativos, el sobrenadante se vuelve a inocular en cultivos nuevos de leucocitos.

•

Procedimiento 2: Prueba de hemadsorción en auto-rosetas con leucocitos de sangre periférica de cerdos infectados

Este procedimiento es más rápido que la preparación e inoculación de cultivos primarios de leucocitos porcinos (descrita antes en el Procedimiento 1) y en casos positivos suministra resultados más tempranos. Se puede realizar en laboratorios no equipados para análisis virológicos; los requisitos mínimos son portas y cubres, un microcopio, medio estéril, tubos o botellas y pipetas. Se recoge sangre con heparina de cerdos sospechosos en el campo o de cerdos inoculados en el laboratorio y se preparan cultivos de leucocitos para examen directo de hemadsorción. No obstante, los resultados de la prueba son difíciles de estimar y el método está siendo reemplazado por la PCR.

b)

i)

Recoger 20 ml de sangre completa en una jeringa que contenga 2.000 UI de heparina en 2 ml se solución salina, mezclar y transferir a un tubo de vidrio o a una botella estrecha.

ii)

Colocar el tubo o botella verticalmente en un incubador o en un baño de agua a 37°C y dejar sedimentar las células. La sedimentación se favorece añadiendo 2 ml de un dilatador del volumen del plasma, como “Dextravan 150” que es una solución de Dextrano 150 en NaCl al 0,9% (Fisons, Inglaterra).

iii)

Incubar los cultivos durante 6-8 horas a 37°C y examinarlos después cada 2-3 horas pasando a un porta pequeñas alícuotas del sobrenadante enriquecido en leucocitos, junto con algunos eritrocitos, e identificando al microscopio las células hemadsorbentes.

Detección de antígeno por prueba de inmunofluorescencia Se puede utilizar FAT (2) como un método adicional para detectar antígeno en tejidos de cerdos que son sospechosos en el campo o inoculados en el laboratorio. Por sí sola, esta prueba no es suficiente para un diagnóstico de PPA. También puede emplearse para detectar antígeno del ASFV en cultivos de leucocitos donde no se ha observado HAD y poder así identificar cepas no hemadsorbentes de virus. También distingue entre el ECP producido por ASFV y por otros virus, como el virus de la enfermedad de Aujeszky o por un inóculo citotóxico.

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Capítulo 2.1.12. — Peste porcina africana

c)

•

Procedimiento de la prueba

i)

Preparar cortes o frotis de impresión de tejidos problema, o extender el sedimento celular de cultivos de leucocitos inactivados en portas, secar al aire y fijar con acetona durante 10 minutos a temperatura ambiente.

ii)

Teñir con inmunoglobulina anti-ASFV conjugada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) a la dilución recomendada o pretitulada durante 1 hora a 37°C en una cámara húmeda.

iii)

Fijar y teñir preparaciones control positivas y negativas de forma similar.

iv)

Lavar con solución salina tamponada con fosfato (PBS), montar los tejidos teñidos en PBS/glicerol, y examinar al microscopio de luz ultravioleta con protección adecuada y filtros de excitación.

v)

Lectura de los resultados: Los tejidos son positivos si se observa una fluorescencia granular específica y citoplásmica en el tejido paracortical de órganos linfoides o en los macrófagos fijados en otros órganos.

Detección del genoma vírico por la reacción en cadena de la polimerasa Se han desarrollado técnicas de PCR utilizando cebadores de una región muy conservada del genoma para detectar e identificar una amplia gama de aislamientos pertenecientes a todos los genotipos víricos conocidos, incluyendo virus no hemadsorbentes y de baja virulencia. Las técnicas de PCR son particularmente útiles para identificar virus con ADN en tejidos de cerdos que son inadecuados para el aislamiento de virus o la detección de antígeno debido a que han sufrido putrefacción o cuando hay buenas razones para sospechar que el virus puede haberse inactivado antes de que las muestras hayan llegado al laboratorio. Se describen dos métodos de PCR que consisten en un procedimiento de preparación de la muestra y un procedimiento de la prueba. •

Método de la PCR

Este procedimiento y el procedimiento 2 sirven de modelo general y como un punto inicial para protocolos de PCR. Las condiciones óptimas de reacción (tiempos de incubación y temperatura, modelos y suministradores de equipos, concentraciones de los reactivos de ensayo, como cebadores y dNTPs) pueden variar, de modo que primero deberían comprobarse las condiciones descritas. En el Capítulo I.1.4 de este Manual se presentan detalles sobre validación de la PCR y procedimientos que aseguran la validez de la prueba. Se pueden introducir alteraciones en el protocolo para lograr una mejor realización. •

Preparación de la muestra

i)

Preparar suspensiones de tejido homogenizando pequeños trozos del tejido en un mortero con arena estéril, y hacer una dilución 1/10 añadiendo 5-10 ml de PBS con 1% de suero de buey y antibióticos.

ii)

Centrifugar a 500 g durante 5 minutos.

iii)

Extracción para muestras control: tejidos homogeneizados al 1/10 (los mismos tejidos que las muestras analizadas): (a) un control negativo: utilizar 500 µl de un tejido homogeneizado negativo para ASFV; (b) un control positivo: utilizar 500 µl de un tejido homogeneizado positivo para ASFV.

iv)

Transferir 500 µl a un tubo Eppendorf con tapón roscado y hervir durante 10 minutos.

v)

Centrifugar a 13.000 g en una microfuga durante 5 minutos.

El sobrenadante se utiliza en la prueba de PCR. El procedimiento de preparación de muestra indicado anteriormente es sencillo y barato, pero puede producir resultados negativos falsos por la presencia de inhibidores de la PCR. A continuación se describe un procedimiento alternativo de extracción que utiliza el kit NucleoSpin Virus (Macherey Nagel). Este kit incluye los reactivos, RAV1, RAV3, y columnas filtrantes NucleoSpin. Procedimiento de trabajo para muestras líquidas: plasma, suero, medio de cultivo celular. (Téngase en cuenta que para órganos y muestras de tejidos se debe preparar primero un homogeneizado del material al 1/10 en PBS y centrifugar después a 12.000 g durante 5 minutos. Utilizar el sobrenadante) Extracción para muestras control: tejidos homogeneizados al 1/10 (los mismos tejidos que las muestras analizadas): (a) un control negativo: utilizar 150 µl de un homogeneizadode tejido negativo para ASFV; (b) un control positivo: utilizar 150 µl de un homogeneizado de tejido positivo para ASFV.

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257

Capítulo 2.1.12. — Peste porcina africana

i)

Añadir 600 µl de RAV1 (incluido ARN transportador) a 150 µl de muestra. Pipetear varias veces arriba y abajo y agitar bien con vórtex. Incubar 5-10 minutos a temperatura ambiente.

ii)

Opcional: si la solución resultante es turbia, centrifugarla 1 minuto para su clarificación. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo.

iii)

Añadir 600 µl de etanol para clarificar la solución y mezclar con vórtex.

iv)

Pasar 700 µl de muestra a una columna de NucleoSpin, colocada en un tubo de centrífuga de 2 ml.

v)

Centrifugar durante 60 segundos a 6.000 g a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante.

vi)

Cargar el resto de muestra (unos 600 µl) en la misma columna de NucleoSpin y centrifugar como antes. Eliminar el sobrenadante.

vii)

Añadir 500 µl de tampón RAV3 a la columna de NucleoSpin.

viii) Centrifugar durante 30 segundos a 6.000-8.000 g. Eliminar el sobrenadante y repetir este paso de lavado. ix)

Eliminar el sobrenadante, colocar después la columna de NucleoSpin en un tubo nuevo de centrífuga de 2 ml, y centrifugar durante 5 minutos a la máxima velocidad para eliminar por completo el tampón RAV3.

x)

Elución de ácido nucleicos: Colocar la columna NucleoSpin en un tubo de centrífuga estéril de 1,5 ml, añadir 50 µl de tampón de elución (Tris/HCl 5 mM, pH 8,5, precalentado a 70°C) e incubar durante 2 minutos.

xi)

Centrifugar durante 60 segundos a 8.000 g.

xii)

Hasta uso, mantener a –20°C los 50 µl de ADN eluido.

•

Soluciones de stock

i)

Se dispone comercialmente de ADN polimerasa Taq y de tampón de amplificación de PCR (10x).

ii)

Solución stock de dNTP 1,25 mM: Preparar soluciones stock 50 mM de cada uno de los siguientes nucleótidos: dATP, dCTP, dGTP y dTTP. Añadir 10 µl de cada una de estas soluciones stock a 360 µl de agua destilada estéril.

iii)

Cebadores a concentración de 20 pmol/µl: Secuencia del cebador 1, 5’-ATGGA-TACCG-AGGGAATAGC-3’ (cadena positiva); Secuencia del cebador 2, 5’-CTTAC-CGATG-AAAAT-GATAC-3’ (cadena negativa).

iv)

Tampón de carga: 0,25% de Orange G en una solución acuosa de glicerol al 30%.

v)

Tampón TAE (50x) para el gel de agarosa: Tris base (242 g); ácido acético glacial (57,1 ml); 0,5 M de EDTA, pH 8,0 (100 ml); agua destilada (hasta 1 litro).

vi)

ADN marcador: existe un marcador comercializado de 100 pares de bases.

•

Procedimiento 1

i)

Añadir los siguientes reactivos al número necesario de tubos Eppendorf de 0,75 ml de polipropileno: Agua destilada estéril (24,5 µl); (10x conc.) tampón de amplificación de PCR (5µl); cloruro magnésico 25 mM (4 µl); solución stock de dNTP 1,25 mM (8 µl); cebador 1, 20 µM (1µl); cebador 2 (1 µl); sobrenadante de tejido (10 µl); ADN polimerasa Taq 5U/µl (0,25 µl).

ii)

Los tubos control no contienen sobrenadante de tejido Control negativo (sin ADN): Añadir 10 µl de agua destilada. Control positivo: Añadir 2 µl de ADN de ASFV y 8 µl de agua destilada.

iii)

Cubrir la mezcla con 60 µl de aceite mineral.

iv)

Colocar todos los tubos en un termociclador automatizado de ADN y desarrollar el siguiente programa: Un ciclo a 94°C durante 5 minutos. 35 ciclos a 94°C durante 1 minuto, 50°C durante 1 minuto y 72°C durante 1 minuto.

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Capítulo 2.1.12. — Peste porcina africana

Un ciclo a 72°C durante 10 minutos. Mantener a 4°C. v)

Al final del programa, extraer con cuidado 20 µl de cada mezcla de reacción bajo el aceite mineral, pasar a un tubo nuevo y añadir 2 µl de tampón de carga.

vi)

Poner todas las muestras en el gel de agarosa al 2% en tampón TAE que contenga bromuro de etidio a una concentración final de 0,5 µg/ml. Añadir el ADN marcador a una calle de recorrido a cada lado del gel.

vii)

Correr el gel a voltaje constante de 150 voltios durante 2 horas.

viii) Lectura de los resultados: Examinar el gel con luz UV. En una muestra positiva, se presentará una banda definida que co-emigrará con el producto de la PCR del control positivo. Calcular el tamaño de los productos de PCR en las muestras problema y en el control positivo con referencia a los marcadores estándar. El producto de la PCR del control positivo tiene un tamaño de 278 pares de bases. No deben verse bandas en el control negativo. •

Procedimiento 2: Protocolo de PCR con TaqMan® (5)

•

Preparación de la muestra

El método descrito es el publicado en la referencia 5. Existen otros kits comercializados para extracción de ADN y para la preparación del molde apropiado para la PCR dependiendo de la muestra enviada para análisis, y pueden ser adecuados para utilizarlos en Laboratorios de Referencia. A continuación se describe el procedimiento basado en el QIAamp® Viral RNA Mini Kit (QIAGEN) (protocolo de centrifugación, Enero 1999). Este sistema se puede utilizar con sangre de cerdos sospechosos de estar afectados de peste porcina. En estos casos, la detección del ASFV se puede realizar en paralelo con la del virus de la PPC (ver Capítulo 2. 1. 13 para métodos de detección molecular del CSFV). i)

Pipetear 560 µl del tampón AVL suministrado en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.

ii)

Añadir 140 µl de muestra problema o control y mezclar en un vórtex durante 15 segundos. Se deben procesar en paralelo con las muestras problema otras muestras como control negativo, que consisten en homogeneizados de bazo, médula ósea (PBM) y células mononucleares de sangre periférica (PBL) de cerdos no infectados. También pueden prepararse controles negativos adicionales de extracción para cada muestra problema y un control negativo no infectado desarrollando en paralelo extracciones con agua exenta de nucleasas (todos los controles deben ensayarse después por PCR junto con las muestras problema).

iii)

Incubar por lo menos 10 minutos a temperatura ambiente.

iv)

Centrifugar el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml brevemente para quitar gotas del interior de la tapa.

v)

Añadir 560 µl de etanol a la muestra, someter a vórtex durante aproximadamente 15 segundos y centrifugar brevemente para quitar gotas del interior de la tapa.

vi)

Añadir 630 µl de la solución del paso v) a una columna de centrifugación QIAamp (en un tubo de 2 ml) sin mojar el borde. Cerrar la tapa y centrifugar 1 minuto a 6000 g. Colocar la columna de centrifugación en un tubo limpio de 2 ml y desechar el tubo que contiene el filtrado.

vii)

Abrir cuidadosamente la columna de centrifugación QIAamp y repetir el paso vi.

viii) Abrir cuidadosamente la columna de centrifugación QIAamp y añadir 500 µl de tampón AW1. Cerrar la tapa y centrifugar 1 minuto a 6.000 g. Colocar la columna de centrifugación en un tubo limpio de 2 ml y desechar el tubo que contiene el filtrado. ix)

Abrir cuidadosamente la columna de centrifugación QIAamp y añadir 500 µl de tampón AW2. Cerrar la tapa y centrifugar 3 minutos a 20.000 g.

x)

Colocar la columna de centrifugación QIAamp en un tubo nuevo de microcentrífuga de 1,5 ml. Desechar el tubo anterior con el filtrado. Abrir cuidadosamente la columna de centrifugación QIAamp y añadir 60 µl de tampón AVE. Cerrar la tapa e incubar 1 minuto a temperatura ambiente. Centrifugar 1 minuto a 6.000 g.

xi)

Desechar la columna de centrifugación QIAamp. Guardar a –20°C el ADN extraído (60 µl) hasta que se requiera para el proceso de amplificación por PCR.

Manual de la OIE sobre Animales Terrestres 2004

259

Capítulo 2.1.12. — Peste porcina africana

•

Soluciones stock

i)

Agua estéril exenta de nucleasas u otra agua estéril apropiada y mezcla base de reacción TaqMan® PCR (x 2).

ii)

Cebadores a una concentración de 50 pmoles/µl: Secuencia del Cebador 1 5’-CTGCT-CATGGTATCA-ATCTT-ATCGA-3’ (cadena positiva); Secuencia del Cebador 2 5’-GATAC-CACAA-GATC(AG)GCCGT-3’ (cadena negativa)

iii)

Sonda TaqMan® a una concentración de 5 pmoles/µl: (5’-[6-carboxi-fluoresceína (FAM)]-CCACGGGAGG-AATAC-CAACC-CAGTG-3’-[6-carboxi-tetrametil-rodamine (TAMRA)]).

•

Amplificación por PCR por la prueba TaqMan® (5)

i)

Preparar para cada muestra la mezcla de reacción que se describe abajo, en un tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 ml. Preparar la mezcla de reacción de una sola vez, teniendo en cuenta el número de muestras en la prueba y considerar además una muestra extra adicional. Agua estéril o libre de nucleasa (7,5 µl); (concentrada x2) mezcla base de reacción TaqMan® para PCR (12,5 µl); cebador 1, 50 pmoles (0,5µl); cebador 2, 50 pmoles (0,5µl); sonda TaqMan®, 5 pmoles (1µl).

ii)

Añadir 22 µl de mezcla de reacción a un pocillo de una placa de reacción óptica MicroAmp® por cada muestra ensayada.

iii)

Añadir 3 µl de la muestra del molde extraído o de un control de extracción en blanco, y cubrir bien con una tapa.

iv)

Centrifugar la placa durante 1 minuto en una centrífuga adecuada para mezclar el contenido de cada pocillo.

v)

Colocar la placa en un sistema de detección de secuencias TaqMan®para amplificación por PCR y desarrollar el siguiente programa: Un ciclo a 50°C durante 2 minutos. Un ciclo a 95°C durante 10 minutos. Cuarenta ciclos a 95°C durante 15 segundos, 58°C durante 1 minuto. Nota: Si no se dispone de termociclador TaqMan®, se puede utilizar un termociclador ordinario y analizar los productos de PCR por lectores de fluorescencia a punto final o, alternativamente, por electroforesis en un gel de agarosa al 1,5%.

vi)

d)

Lectura de los resultados: Asignar un valor de ciclo umbral (CT) a cada reacción de PCR en un análisis de todas las representaciones gráficas de amplificación (una gráfica de la señal de fluorescencia frente al número de ciclos). Las muestras problema negativas, los controles negativos no infectados o los controles de extracción en blanco deben tener un valor CT >40,0. Las muestras problema positivas y los controles deben tener un valor CT8,0, y se examinan para focos de fluorescencia. En lugar de tubos Leighton, pueden utilizarse placas de 6 pocillos con cubres. Alternativamente, pueden usarse también para el aislamiento del virus cultivos en placas de microtitulación de fondo plano o placas M24. En tal caso, las placas se fijan y se tiñen como se describe más adelante para la prueba de neutralización ligada con peroxidasa (NPLA). La sangre completa (tratada con heparina o EDTA) de cerdos clínicamente enfermos es una muestra adecuada para diagnosticar PPC. Se puede utilizar la fracción de leucocitos u otros componentes, pero por razones de sensibilidad y sensibilidad, es preferible la sangre completa (9). El procedimiento es el siguiente: i)

Congelar una muestra de sangre completa a -20°C y descongelar en un baño a 37°C.

ii)

Inocular 300 µl de sangre hemolizada en una monocapa de células PK-15 crecidas hasta un 75% de confluencia* en una placa M24, y permitir la adsorción durante 1 hora a 37°C.

iii)

Eliminar el inóculo, lavar la monocapa una vez con BBS de Hanks o MEM de Hanks, y añadir medio de cultivo.

iv)

Después de una incubación de 3-4 días, las placas se lavan, se fijan y se tiñen, como se describe más adelante para NPLA, utilizando en cada paso un volumen de 300 µl para compensar la mayor superficie celular. Nota: este método es menos sensible que el aislamiento convencional del virus para la detección de PPC aguda.

*

La inoculación simultánea, aunque ligeramente más sensible, es menos adecuada pues el anticoagulante puede interferir con la adhesión de las células a la superficie.

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271

Capítulo 2.1.13. — Peste porcina clásica (cólera del cerdo)

•

Reacción de transcripción inversa en cadena de la polimerasa

Se han descrito muchos métodos de transcripción inversa en cadena de la polimerasa (RT-PCR) y otros se están aún desarrollando. Una alternativa internacionalmente aceptada al ELISA de captura de antígeno y al método de aislamiento del virus es una reacción de transcripción inversa en cadena de la polimerasa anidada en un solo tubo (RT-nPCR) (14). Este método es rápido y más sensible que los ELISA de captura de antígeno, el aislamiento vírico o la RT-PCR, lo que lo hace particularmente adecuado al diagnóstico preclínico. Tiene la ventaja adicional de reducir el riesgo de contaminación porque los tubos no se abren entre las transcripciones inversas sucesivas, la primera PCR y la PCR anidada (17). Están en desarrollo métodos de PCR en tiempo real. Aún no hay un método disponible de RT-PCR estandarizado internacionalmente. Se pueden obtener ejemplos de un protocolo adecuado en la literatura o de los laboratorios de referencia de la OIE para la PPC (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual). Debido a su velocidad y sensibilidad, la RT-PCR es un enfoque adecuado para analizar casos sospechosos de enfermedad y está aceptada por la Unión Europea (1), aunque se recomienda que, debido a la facilidad con la que pueden ocurrir positivos falsos, los resultados positivos de brotes deberían confirmarse siempre con otras pruebas. La prueba puede aplicarse a muestras de sangre individual o colectiva así como a órganos sólidos y se ha utilizado con éxito para controlar brotes. La epidemiología molecular de la PPC se basa en la comparación de diferencias genéticas entre los virus aislados. La amplificación del ARN del CSFV por RT-PCR y la secuenciación nucleotídica es el método más simple de obtener los datos de secuencias para hacer estas comparaciones. Se pueden analizar varias regiones diferentes del genoma del CSFV para estudios epidemiológicos moleculares (16). Se han estudiado en particular dos regiones que permiten suministrar muchos datos de la secuencia para comparar nuevos aislamientos. Una de estas zonas se encuentra en la región 5´ no codificante (5´NCR) del genoma (150 nucleótidos) y la otra en el gen de la glicoproteína mayor E2 (190 nucleótidos). En resumen, el método usado consiste en extraer el ARN vírico de cultivos de células PK-15, realizar una RT-PCR para amplificar una o ambas zonas dentro de 5´NCR o del gen E2, y luego determinar la secuencia nucleotídica de los productos y comparar con la información acumulada en las bases de datos. En el Laboratorio de Referencia de la OIE para PPC (Hanover, Alemania) existe una base de datos disponible de estas secuencias. Los CSFV aislados de brotes primarios deben enviarse a un laboratorio de referencia de la OIE para investigación epidemiológica molecular. Se debe obtener un permiso de importación antes de su envío.

2.

Pruebas serológicas

La detección de anticuerpos específicos contra el virus es útil cuando se sospechan infecciones con cepas de PPC de baja virulencia. Debido al efecto inmunosupresor del VPCC, no se pueden detectar anticuerpos hasta 21 días post-infección. Las investigaciones serológicas dirigidas a detectar focos residuales de infección, especialmente en piaras de producción, pueden ser también útiles para la erradicación de PPC en una fase terminal. Como la incidencia de la infección con pestivirus de rumiantes puede ser elevada en instalaciones de cría, solo resultan útiles las pruebas que discriminen entre anticuerpos contra PPC y contra DVB/EF. Las pruebas NV y ELISA que utilizan MAbs satisfacen los requisitos de sensibilidad, pero los resultados positivos deberían confirmarse por pruebas NV comparativas. Las pruebas de neutralización se realizan en cultivos celulares utilizando un método virus constante/suero variable. Como el CSFV no es citopático, cualquier virus no neutralizado debe detectarse, tras multiplicación, por un sistema indicador. La prueba de neutralización vírica con anticuerpo fluorescente (FAVN) (13) y la NPLA (20) son las técnicas más ampliamente utilizadas. Ambas pruebas se pueden llevar a cabo en microplacas. El sistema con peroxidasa tiene la ventaja de que puede estimarse a simple vista.

a)

272

Prueba de neutralización vírica con anticuerpo fluorescente (FAVN) (prueba prescrita para el comercio internacional) i)

Sembrar una suspensión de células PK-15 a una concentración de 2 x 105 células/ml en placas Petri de 5 cm con cubres extendidos en el fondo, o en tubos Leighton con un cubre, o en microplacas de fondo plano.

ii)

Incubar los cultivos 1-2 días a 37°C en una cabina de CO2 hasta que alcancen el 70-80% de confluencia. Se puede utilizar un incubador ordinario para tubos Leighton cerrados.

iii)

Inactivar los sueros durante 30 minutos a 56°C. A efectos del mercado internacional, es mejor probar con una dilución inicial del suero de 1/5 (dilución final 1/10).

iv)

Incubar durante 1-2 horas a 37°C volúmenes iguales de suero diluido y de suspensión vírica que contenga 200 DICT50 (dosis infectiva del 50% en cultivo de tejidos) por 0,1 ml. Por tanto se utiliza una cantidad constante de CSFV de 100 DICT50 por cada pocillo de reacción.

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Capítulo 2.1.13. — Peste porcina clásica (cólera del cerdo)

v)

Extraer los cubres de las placas Petri o de los tubos Leighton, lavar brevemente en medio sin suero, cubrir la capa celular con la mezcla virus/suero (del paso iv) e incubar durante 1 hora a 37°C en atmósfera húmeda.

vi)

Colocar los cubres en un tubo Leighton limpio e incubar los cultivos en medio de mantenimiento durante dos días más.

vii)

Sacar los cubres de los tubos Leighton, lavar las monocapas dos veces con PBS, pH 7,2, durante 5 minutos cada vez, fijar con acetona pura durante 10 minutos y teñir con la solución de trabajo del conjugado durante 30 minutos a 37°C antes de lavar.

viii) Montar para microscopía los cubres en portas sin grasa con 90% de glicerol tamponado con carbonato/bicarbonato, pH > 8,0, y examinar por flluorescencia. Cuando la prueba FAVN se realiza en placas de microtitulación, se puede seguir el procedimiento para la NPLA (ver más adelante) hasta el paso (viii). Las placas se tiñen a continuación con la dilución de trabajo del conjugado durante 30 minutos a 37°C y se examinan para fluorescencia. Nota: cuando se detecta fluorescencia, las microplacas se examinan mejor desde arriba, utilizando una lente objetivo de gran longitud focal.

b)

Prueba de neutralización ligada a peroxidasa (NPLA) (prueba obligada para el comercio internacional). La NPLA se realiza en placas de microtitulación de fondo plano. Los sueros se inactivan antes a 56°C durante 30 minutos. A efectos del mercado internacional, es mejor probar una dilución inicial de suero de 1/5 (dilución final 1/10). Para programas de seguimiento en un país, puede ser suficiente una dilución de 1/10. En cada prueba deben incorporarse controles apropiados para asegurar la especificidad y la sensibilidad de las reacciones. •

Procedimiento de la prueba

i)

En dos pocillos de una placa de microtitulación se depositan 50 µl de diluciones de suero en medio de crecimiento (MEM de Eagle, suero fetal bovino al 5% y antibióticos). El suero fetal bovino debe estar libre de BVDV y de anticuerpos contra dicha enfermedad. Para cada muestra se puede incluir un tercer pocillo con suero y sin virus como un control del suero (para citotoxicidad y/o tinción inespecífica).

ii)

Añadir a los pocillos 50 µl de suspensión vírica, diluida en medio de crecimiento hasta contener aproximademente 100 DICT50/50 µl, y mezclar el contenido en un agitador de microplacas durante 20 segundos.

iii)

Incubar las placas en un incubador de CO2 durante 1 hora a 37°C.

iv)

Añadir a todos los pocillos 50 µl de medio de crecimiento con 2 x 105 células/ml.

v)

Dejar crecer las células en 5% de CO2 hasta confluencia, normalmente en 3-4 días.

vi)

Eliminar el medio de crecimiento y lavar las placas una vez con NaCl 0,15 M.

vii)

Las placas se secan por absorción en papel absorbente.

viii) Las monocapas celulares pueden fijarse por uno de los siguientes métodos:

ix)

•

Las placas se incuban 45 minutos a 37°C, y luego a -20°C durante al menos 45 minutos. Se sacan las placas del congelador, se llenan los pocillos con 100 µl de paraformaldehido al 4% en PBS y se reincuban a temperatura ambiente durante 5-10 minutos. Se elimina el paraformaldehido y las placas se lavan con NaCl 0.15M; o

•

Las placas se incuban a 70-80°C durante 1-2 horas; o

•

Las placas se fijan en acetona al 20% en PBS durante 10 minutos seguidos de un secado total a 25-30°C durante 4 horas. (Esto se puede acelerar mediante la ayuda de un secador de pelo se obtiene un secado completo después de 3-5 minutos-, según se observa por el color blanquecino de la monocapa celular).

Añadir a cada pocillo 50 µl de un suero porcino hiperinmune contra la PPC, diluido en NaCl 0,5 M que contiene 1% de Tween 80 + 0,1 ml de azida sódica, pH 7,6. Incubar a 37°C durante 15 minutos. La

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Capítulo 2.1.13. — Peste porcina clásica (cólera del cerdo)

dilución de trabajo del antisuero debe determinarse por titulación previa: es decir, un suero con un título por NPLA de 1/30.000 puede utilizarse a 1/100. x)

Lavar cinco veces las placas con NaCl 0,15 M que contenga 1% de Tween 80, pH 7,6.

xi)

Añadir a cada pocillo 50 µl de un conjugado de Ig-HRPO antiporcina, diluida a su dilución de trabajo con NaCl 0,5 M que contenga 1% de Tween 80, pH 7,6, y luego incubar durante 10 minutos a 37°C.

xii)

Lavar las placas cinco veces con NaCl 0,15 M que contenga 1% de Tween 80, pH 7,6.

xiii) Añadir 50 µl de solución de cromógeno del substrato a cada pocillo y teñir durante 15-30 minutos a temperatura ambiente. Esta solución se describe en la Sección B.1.a. "Diferenciación de pestivirus mediante anticuerpos monoclonales por el procedimiento de la inmunoperoxidasa". xiv) La prueba se lee visualmente. Las capas celulares infectadas se tiñen total o parcialmente de color marrón rojizo. En casos dudosos, la monocapa debe examinarse por microscopía a baja resolución. El citoplasma de las células infectadas se tiñe de rojo oscuro. xv)

En la prueba se incluyen los siguientes controles: control de células, de suero positivo y de titulación del virus problema. La titulación del virus debe confirmar que el virus se ha utilizado a una concentración entre 30 y 300 DICT50/ 50 µl.

En ocasiones, los sueros de cerdos infectados con BVDV reaccionan a baja dilución en las pruebas FAVN o NPLA como si estuvieran infectados por el CSFV. La amplitud de la reacción cruzada depende de la cepa de BVDV implicada y del intervalo entre la infección y el tiempo de muestreo (27). Los altos niveles de anticuerpo que se alcanzan normalmente después de exposición a la infección por PPC, incluso con cepas de baja virulencia, permiten el uso de diluciones relativamente altas en las pruenas NPLA para anticuerpos contra PPC, lo que evita muchas, aunque no todas, las reacciones cruzadas (20, 21). En caso de duda continuada, son útiles las pruebas comparativas que utilizan una cepa de CSFV, una cepa de BVDV y una cepa de BDV que sean representativas del país o de la región. Las pruebas comparativas de neutralización son titulaciones a punto final en las que la misma serie de diluciones dobles de la muestra de suero sospechoso se prueba por duplicado contra 100 DICT50 de cada cepa vírica seleccionada. Las pruebas comparativas se realizan según los protocolos descritos para FAVN o NPLA; las líneas celulares deben ser adecuadas para el BVDV y el DVB. Los títulos de neutralización se expresan como el inverso de la dilución más alta de suero que evita el crecimiento celular en el 50% de dos pocillos duplicados. Una diferencia de cuatro veces o más entre los puntos finales de dos titulaciones debe considerarse decisiva para una infección por la especie de virus que da el título más alto.

c)

Enzimoinmunoensayo (prueba prescrita para el comercio internacional) Las técnicas competitivas, bloqueantes e indirectas pueden utilizarse con cualquier soporte adecuado. Las pruebas utilizadas deben minimizar las reacciones cruzadas con el BVDV y otros pestivirus. Sin embargo, el sistema de prueba debe asegurar la identificación de todas las infecciones de PPC, y a todas las fases de la respuesta inmune a la infección. Antígeno: El antígeno debe derivar de, o corresponder a, proteínas víricas de una de las cepas recomendadas de CSFV. Las células utilizadas para preparar antígeno deben estar libres de cualquier otra infección con Pestivirus. Antisueros: Los antisueros policlonales para pruebas competitivas o bloqueantes deben obtenerse de cerdos o conejos infectados con una de las cepas recomendadas de CSFV o con la cepa C adaptada a conejo. Los MAbs deben estar dirigidos contra una proteína vírica inmunodominante del CSFV. Los ensayos indirectos deben utilizar una inmunoglobulina anti-cerdo que detecte tanto IgG como IgM. La sensibilidad de la prueba ELISA debe ser lo bastante grande como para considerar positivo cualquier suero de animal convaleciente, es decir, que reaccione en la prueba de neutralización al menos 21 días post-inoculación. La prueba ELISA sólo puede utilizarse con muestras de suero o plasma derivadas de cerdos individuales. Si el procedimiento ELISA empleado no es específico para la PPC, las muestras positivas deben analizarse además por pruebas diferenciales para distinguir entre PPC e infecciones por otros pestivirus. El ELISA bloqueante de captación de complejos (4) es un método de un solo paso muy adecuado para utilizar en sistemas ELISA automatizados. Los sueros se emplean sin diluir. La prueba es rápida y fácil de

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Capítulo 2.1.13. — Peste porcina clásica (cólera del cerdo)

realizar, y detecta anticuerpos contra cepas de CSFV de baja virulencia en las primeras fases de la infección. Como los MAbs son específicos para el CSFV, el ELISA bloqueante de captación de complejos detectará anticuerpos contra el BVDV solo muy raramente, aunque los anticuerpos contra EF pueden ser más problemáticos. Los sueros positivos se vuelven a probar por NPLA para confirmación. Se puede obtener más información sobre los kits comerciales de los laboratorios de referencia de la OIE.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO No existen vacunas eficaces con virus completo inactivado contra la PPC.

C1. Vacunas con virus vivos modificados Las vacunas de tipo MLV se producen con cepas de CSFV que se atenúan por pases en cultivo celular o en una especie hospedadora adecuada que no pertenezca a la familia Suidae. La producción de lleva a cabo basándose en un sistema de lotes de siembra. Éste debe ser validado respecto a identidad, esterilidad, pureza, seguridad, ausencia de transmisión, estabilidad e inmunogenicidad. Las normas para la producción de vacunas veterinarias se presentan en el Capítulo I.1.7. Principios de producción de vacunas veterinarias. Las directrices dadas aquí y en el Capítulo I.1.7. son de naturaleza general y puede suplementarse con requisitos nacionales y regionales. El servicio de producción de vacunas debe funcionar bajo adecuadas medidas y prácticas de bioseguridad. Si se utiliza el CSFV para producción de vacunas o para estudios de desafío de las vacunas, la parte del servicio donde se realiza este trabajo debe cumplir los requisitos de Contención del Grupo 4 de patógenos como se señala en el Apéndice I.1.6.1. del Capítulo I.1.6. de este Manual. Para producir un lote de siembra y una vacuna final de alta calidad, se deben determinar las condiciones óptimas para la obtención del virus. Para las vacunas producidas en cultivos celulares, se deben hacer experimentos con curvas de crecimiento para estudiar el efecto de la composición del medio, de la regulación del pH y del contenido atmosférico del CO2, la concentración inicial de células sembradas, la relación entre la superficie de la capa celular y el volumen de medio, la fase de crecimiento de las células al tiempo de la infección vírica, condición estacionaria o rotatoria del cultivo durante la replicación vírica, etc. Para las vacunas producidas en animales, los factores que deben ser investigados para determinar el máximo de crecimiento vírico y los tejidos a recoger son, entre otros, la edad, raza, peso, tamaño del inóculo (número de ID50 animal [dosis infecciosa del 50%]), patogénesis de la infección, y síntomas clínicos. Cualquiera que sea el método de producción, el substrato debe recogerse en condiciones asépticas y someterse a un ciclo de congelación y descongelación para liberar los virus asociados a las células. Los elementos celulares grandes o los restos de tejidos se eliminan por filtración o centrifugación a baja velocidad. Se añade un estabilizador, como lactosa, a una concentración final de 5%. La vacuna se homogeniza antes de su liofilización para asegurar un lote uniforme. En el producto final, el virus vacunal no debe diferir del material utilizado para validar el lote de siembra en más de cinco pases. La vacuna comercial debe producirse en lotes en forma liofilizada como un producto homogéneo.

1.

Control del inóculo

a)

Características del inóculo Para validar un lote de siembra de una vacuna MLV contra la PPC, las muestras del inóculo de siembra deben superar primero varios experimentos piloto. Excepto para pruebas de confirmación de identidad, esterilidad, pureza y estabilidad de la atenuación, los experimentos piloto también deben realizarse con muestras representativas del producto comercial final. Estas muestras se deben originar del mismo lote de siembra probado antes. A menos que se especifique de otro modo, todos los cerdos utilizados en pruebas piloto son cerdos sanos de 6-8 semanas de edad, sin anticuerpos contra CSFV y BVDV, de la misma raza y origen, agrupados al azar si es necesario, y mantenidos en las mismas condiciones. Las cerdas gestantes deben ser de igual paridad.

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Capítulo 2.1.13. — Peste porcina clásica (cólera del cerdo)

El virus de siembra debe ser estéril e inducir anticuerpos neutralizantes que sean específicos contra una cepa virulenta de CSFV en cerdos.

b)

Método de cultivo La producción se realiza en cultivos celulares o en un hospedador adecuado de una especie que no pertenezca a la familia Suidae.

c)

Validación como vacuna i)

Pureza La vacuna debe ser virológicamente pura. Cada uno de tres cerdos seronegativos se inocula intramuscularmente con una cantidad de virus del lote de siembra equivalente a diez veces la cantidad de virus contenido en una dosis de vacuna. Esto se repite 3 semanas después utilizando la misma dosis y ruta de administración. Se toman muestras de suero 2 semanas después de la última inoculación y se analizan por el método más sensible para ausencia de anticuerpos contra los virus de la peste porcina africana, enfermedad de Aujeszky, DVB, fiebre aftosa (todos los tipos), gastroenteritis transmisible, enfermedad vesicular porcina, síndrome porcino reproductivo y respiratorio, gripe porcina (tipos H1N1 y H3N2), y contra adenovirus porcinos, enterovirus porcinos (tipos 1 y 2), parvovirus porcino y circovirus.

ii)

Seguridad En las pruebas de seguridad, cada uno de diez cerdos seronegativos se inocula intramuscularmente con diez dosis de vacuna. Otros diez cerdos sirven de control. Todos los cerdos se observan durante las 3 semanas siguientes. Diariamente se anotan las temperaturas corporales y se toman muestras de sangre con un anticoagulante durante la primera semana. Se anotan los pesos al tiempo de la inoculación y 2 semanas más tarde. Ningún animal debe morir o mostrar síntomas de enfermedad causada por el virus de la vacuna (lote de siembra). La temperatura diaria media del cuerpo no debe alcanzar o superar los 40,5°C durante el período de la prueba. El aumento diario de peso medio no debe descender significativamente (p< 0,05) respecto al del grupo control. Se puede despreciar la leucopenia (número de leucocitos < 7 x 106 células/ml) si sólo ocurre en un cerdo durante 1 día. Cada uno de diez cerdos se inmunosuprime por inyecciones diarias con 2 mg de prednisolona/kg de peso corporal durante 5 días consecutivos. Al día 3 cada animal se inocula con el equivalente de una dosis de vacuna, y se observa durante las tres semanas siguientes. Ningún animal debe morir o enfermar debido al virus vacunal. Cada una de diez cerdas gestantes de 25-35 días, se inoculan intramuscularmente con el equivalente de una dosis de vacunas. Otros diez animales de la misma paridad y gestación sirven de control. La vacunación no debe de interferir con la gestación a término, y el número de lechones vivos nacidos del grupo de prueba no debe ser significativamente menor (p1/16 (>24 o >log2 4 expresado como el inverso).

ii)

Se inyectan 0,1 ml del virus diluido intravenosamente en diez pollos SPF de 6 semanas de edad.

iii)

Las aves se examinan en intervalos de 24 horas durante 10 días. Durante cada observación cada ave se puntúa como 0 si se encuentra normal, 1 si está enferma, 2 si está muy enferma, 3 si se ha muerto. (El juicio sobre las aves enfermas o muy enfermas es una valoración clínica subjetiva. Normalmente las aves “enfermas” deberían manifestar uno de los siguientes síntomas, y las “muy enfermas” más de uno: afectación respiratoria, depresión, diarrea, cianosis en la piel expuesta o en las barbas, edema en la cara y/o en la cabeza, síntomas nerviosos. Las aves muertas deben puntuarse como 3 en cada uno de los días siguientes de observación después de la muerte.)

iv)

El índice de patogenicidad intravenosa (IVPI) es la puntuación media por ave por observación durante un periodo de 10 días. Un índice de 3,00 significa que todas las aves murieron en 24 horas, y un índice de 0,00 significa que ninguna ave mostró signo clínico alguno durante los 10 días del periodo de observación.

Se han empleado con éxito una variedad de técnicas y estrategias para secuenciar los nucleótidos de la región del gen HA que codifica la región del sitio de corte de la hemaglutinina de los subtipos H5 y H7 del virus de la gripe aviar, lo que permite deducir los aminoácidos presentes. El método utilizado más frecuentemente ha sido RT-PCR empleando parejas de cebadores complementarios a zonas del gen a cada lado de la región codificante del sitio de corte, seguido de secuenciación directa (38). Pueden facilitarse varias fases del protocolo empleando sistemas comerciales y secuenciadores automáticos. Ya que la presencia de múltiples aminoácidos básicos en el sitio de corte de la HA se ha establecido como un indicador preciso de la virulencia o virulencia potencial de los virus de la gripe H5 y H7, parece inevitable que la determinación del sitio de corte mediante secuenciación u otros métodos se convertirá en el método de elección para la valoración inicial de la virulencia de estos virus, y se incorporará en las definiciones acordadas. Ello permitirá reducir el número de ensayos in vivo, aunque, en la actualidad, todavía se requeriría la inoculación de las aves para confirmar un resultado negativo, ya que no puede desecharse la posibilidad de existencia de cultivos víricos que contengan poblaciones mixtas de virus con alta y baja virulencia. Aunque los virus GAMV “verdaderos” aislados hasta la fecha han pertenecido a los subtipos H5 ó H7, se ha descrito que al menos dos aislados, ambos del subtipo H10 (H10 N4 y H10 N5), habrían cumplido las definiciones de la OIE y la UE para los virus GAMV (36), ya que mataron 7/10 y 8/10 pollos con valores IVPI>1,2 cuando las aves se inocularon por vía intravenosa. Sin embargo no produjeron muertes o signos de la enfermedad cuando se inocularon intranasalmente, y no presentaron múltiples aminoácidos básicos en sus sitios de corte de la hemaglutinina.

3.

Pruebas serológicas

a)

Inmunodifusión en gel de agar Todos los virus de la gripe poseen una nucleocápsida y antígenos de la matriz similares antigénicamente. Este hecho permite detectar la presencia o ausencia de anticuerpos frente a cualquier virus de la gripe mediante ensayos IGDA. Las preparaciones concentradas de virus, como se describió anteriormente, contienen antígenos de la matriz y la nucleocápsida; el antígeno de la matriz difunde más rápidamente que el antígeno de la nucleocápsida. Los ensayos IGDA se han empleado extensa y rutinariamente para detectar anticuerpos específicos en rebaños de pollos o pavos como un indicador de la existencia de infección. Generalmente, estos ensayos han utilizado preparaciones enriquecidas de nucleocápsida obtenidas a partir de las membranas corioalantoideas de embriones de pollo (5) que han sido infectados a los 10 días de edad, se han homogenizado, congelado y descongelado tres veces, y centrifugado a 1.000 g. Los fluidos sobrenadantes se inactivan mediante la adición de formalina al 0,1% o betapropiolactona al 1%, se centrifugan de nuevo y se utilizan como antígeno. No todas las especies de aves pueden producir anticuerpos precipitantes después de la infección con el virus de la gripe. Normalmente, los ensayos se realizan empleando geles de agarosa al 1% (p/v) o agar purificado con un 8% (p/v) de NaCl en tampón fosfato 0,1M, pH 7,2, que se vierten en placas de Petri o en portaobjetos hasta obtener un grosor de 2-3 mm. Se cortan pocillos en el agar de aproximadamente 5 mm de diámetro y separados 2-5 mm empleando un molde y un cúter. Usando un patrón para los pocillos, debe colocarse cada suero sospechoso al lado de un suero y antígeno positivo conocido. Ello creará una línea continua de

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Capítulo 2.1.14. — Gripe aviar muy virulenta

identidad entre el control positivo conocido, el suero sospechoso y el antígeno de la nucleocápsida. Deberían añadirse en cada pocillo aproximadamente 50 µl de cada reactivo. Las líneas de precipitina pueden detectarse después de aproximadamente 24-48 horas, aunque esto puede depender de las concentraciones de anticuerpo y antígeno. Estas líneas se observan mejor frente a un fondo oscuro iluminando por detrás. Se considera un resultado específico positivo cuando la línea de precipitina entre el pocillo del control positivo es continua con la línea entre el antígeno y el pocillo problema. Las líneas cruzadas se interpretan como debidas a un suero problema que carece de identidad con los anticuerpos del pocillo del control positivo.

b)

Ensayos de hemaglutinación e inhibición de la hemaglutinación En diferentes laboratorios se realizan distintas variantes de los protocolos de los ensayos de HA y HI. Los siguientes ejemplos recomendados se basan en el uso de placas de micropocillos de plástico con el fondo en V, y en las que el volumen final para ambos ensayos es de 0,075 ml. Los reactivos necesarios para realizar estos ensayos son PBS isotónico (0,1 M), pH 7,0-7,2, y hematíes (RBCs) obtenidos a partir de un mínimo de tres pollos SPF y resuspendidos en un volumen igual de solución de Alsever. (Si no existen pollos SPF disponibles, la sangre se puede recoger a partir de aves seguidas con regularidad, y que se sabe que están libres de anticuerpos frente a la gripe aviar). Las células deberían lavarse tres veces en PBS antes de emplearse como una suspensión al 1% (células concentradas v/v). Cuando sea adecuado deberían utilizarse en cada ensayo antígenos y sueros control positivos y negativos. •

Ensayo de hemaglutinación

i)

Distribuir 0,025 ml de PBS en cada pocillo de un placa de microensayo de plástico con el fondo en V.

ii)

Colocar 0,025 ml de la suspensión vírica (p.ej. fluido alantoideo infectivo) en el primer pocillo. Para una determinación precisa del contenido de HA, debería realizarse a partir de un rango estrecho de una serie de diluciones, p.ej. 1/3, 1/4, 1/5, 1/6, etc.

iii)

Preparar y distribuir diluciones medias de 0,025 volúmenes de la suspensión vírica en toda la placa.

iv)

Distribuir 0,025 ml más de PBS en cada pocillo.

v)

Repartir 0,025 ml de RBCs de pollo al 1% (v/v) en cada pocillo.

vi)

Mezclar cuidadosamente tapando la placa y dejar sedimentar los RBCs durante 40 minutos a temperatura ambiente, p.ej. 20°C, o durante 60 minutos a 4°C si la temperatura ambiente es elevada, por lo que los RBCs deberían sedimentarse hasta observar un botón nítido.

vii)

La HA se determina inclinando la placa y observando la presencia o ausencia de arrastre de los RBCs con forma de gota. El título debería leerse como la dilución más alta que da lugar a una HA completa (ausencia de arrastre); esto representa 1 unidad HA (UHA) y puede calcularse de manera precisa a partir del rango inicial de las diluciones.

•

Ensayo de inhibición de la hemaglutinación

i)

Distribuir 0,025 ml de PBS en cada pocillo de una placa de microtitulación con fondo en V.

ii)

Colocar 0,025 ml de suero en el primer pocillo de la placa.

iii)

Preparar y distribuir diluciones medias de 0,025 volúmenes de suero en toda la placa.

iv)

Añadir 4UHA de virus/antígeno en 0,025 ml a cada pocillo y dejar durante un mínimo de 30 minutos a temperatura ambiente (p. ej. unos 20°C) o 60 minutos a 4°C.

v)

Añadir 0,025 ml de RBCs de pollo al 1% (v/v) en cada pocillo y, después de mezclar cuidadosamente, dejar sedimentar los RBCs durante unos 40 minutos a temperatura ambiente, p. ej. 20°C, o durante 60 minutos a 4°C si la temperatura ambiente es elevada, por lo que los RBCs deberían sedimentarse hasta observar un botón nítido.

vi)

El título HI es la dilución más alta de suero que ocasiona la inhibición completa de 4UHA de antígeno. La aglutinación se valora inclinando las placas. Solamente en aquellos pocillos en los que los RBCs se arrastran en la misma proporción que los pocillos control (que contienen sólo 0,025 ml de RBCs y 0,,05 ml de PBS) debería considerarse que presentan inhibición.

vii)

La validez de los resultados debería evaluarse frente a un suero negativo control, el cual no debería producir un título >1/4 (>22 o >log2 expresado como el inverso), y un suero control positivo en el que el título debería encontrarse dentro de una dilución del título conocido.

Los títulos HI pueden considerarse positivos si existe inhibición a una dilución del suero de 1/16 (>24 o >log2 4 expresado como el inverso) o más alta frente a un antígeno de 4UHA. Algunos laboratorios

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Capítulo 2.1.14. — Gripe aviar muy virulenta

prefieren emplear 8UHA en los ensayos HI. Aunque está permitido, afecta a la interpretación de los resultados de forma que un título positivo es 1/8 (23 o log2 3) o más alto. En este ensayo los sueros de las gallinas raramente dan lugar a reacciones positivas inespecíficas, y por lo tanto no es necesario su pretratamiento. Los sueros de otras especies distintas a las gallinas pueden a veces causar la hemaglutinación de sus RBCs, por lo que esta propiedad debería determinarse antes y eliminarse mediante adsorción del suero con RBCs de gallina. Se realiza añadiendo 0,025 ml de RBCs concentrados de gallina a 0,5 ml de cada antisuero, agitando cuidadosamente y dejando reposar durante al menos 30 minutos; los RBCs se precipitan mediante centrifugación a 800 g durante 2-5 minutos y se decantan los sueros adsorbidos. Alternativamente pueden usarse los RBCs de las aves investigadas. El ensayo de inhibición de la neuraminidasa se ha utilizado para identificar el tipo de neuraminidasa AI de los aislados, y para caracterizar los anticuerpos en las aves infectadas. El procedimiento necesita unos conocimientos y reactivos especializados; en consecuencia este ensayo se realiza normalmente en un Laboratorio de Referencia de la OIE. La estrategia DIVA (distinción de los animales infectados de los vacunados) también se basa en el empleo de un ensayo serológico para detectar anticuerpos específicos anti-N; se ha descrito el procedimiento del ensayo (9). Se encuentran disponibles sistemas comerciales ELISA que detectan anticuerpo frente a la proteína de la nucleocápsida. Se utilizan diferentes ensayos y métodos de preparación del antígeno. Normalmente, tales ensayos han sido evaluados y validados por el fabricante, y es por tanto importante que se sigan cuidadosamente las instrucciones específicas para su empleo.

4.

Técnicas para el diagnóstico de la gripe aviar en vías de desarrollo

En la actualidad, las técnicas convencionales para el aislamiento, caracterización y diagnóstico del virus de la gripe aviar continúan siendo el método elegido, al menos para el diagnóstico inicial de las infecciones. Sin embargo los métodos convencionales tienden a ser costosos, emplean numerosa mano de obra y son lentos. Los últimos 10 años han visto grandes desarrollos y mejoras en las técnicas moleculares y en otras técnicas diagnósticas, muchas de las cuales se han aplicado para el diagnóstico de las infecciones de gripe aviar.

a)

Detección del antígeno El sistema disponible comercialmente Directigen® Flu A (Becton Dickinson Microbiology Systems), que consiste en un sistema de enzimoinmunoensayo de captura antigénica, se ha utilizado concretamente en EEUU para detectar la presencia de virus de la gripe tipo A en las aves de corral (28). El sistema utiliza un anticuerpo monoclonal frente a la nucleoproteína, y por lo tanto debería ser capaz de detectar cualquier virus de la gripe del tipo A. Aunque se desarrolló para detectar virus en infecciones de mamíferos, se ha aplicado con éxito para detectar virus en aves de corral y otras aves, aunque puede existir alguna variación en la sensibilidad en diferentes muestras. La principal ventaja de este ensayo consiste en que puede demostrar la presencia de AI en 15 minutos. Las desventajas son que puede carecer de sensibilidad, no ha sido validado para diferentes especies de aves, no se consigue la identificación del subtipo vírico y es un sistema caro.

b)

Detección directa del ARN Aunque, como queda demostrado por las definiciones actuales de la GAMV, las técnicas moleculares se han empleado para el diagnóstico de la gripe aviar durante algún tiempo, recientemente se han producido avances para su aplicación en la detección y caracterización de los virus de la gripe aviar directamente a partir de muestras clínicas de las aves infectadas. Con la definición de los cebadores adecuados, la técnica de RT-PCR con muestras clínicas podría conllevar una detección rápida e identificación del subtipo (al menos del H5 ó H7), además de posibilitar la obtención de un ADNc que puede emplearse para la secuenciación de nucleótidos (22, 30, 31). Los resultados obtenidos por Koch (19) indicaron que debería ponerse cuidado en qué muestras clínicas se utilizan, ya que, mientras que las muestras traqueales de aves infectadas mostraron una alta sensibilidad y especificidad en relación con el aislamiento del virus, los ensayos de RT-PCR con muestras fecales carecieron de sensibilidad. La aplicación efectiva de los ensayos de RT-PCR puede consistir en la identificación rápida de brotes sucesivos una vez que se han detectado los casos primarios y ha sido caracterizado el virus. Esta técnica se utilizó con éxito durante los brotes de GAMV en 2003 en los Países Bajos. Se han aplicado modificaciones en el empleo de la RT-PCR para reducir el tiempo de identificación del subtipo vírico y la secuenciación. Por ejemplo, Spackman et al. (29) emplearon un sistema de RT-PCR de un sólo paso con cebador/hidrólisis de sonda fluorescente en “tiempo real”, para permitir la detección de virus de la gripe aviar y la determinación del subtipo H5 ó H7. Los autores concluyeron que el ensayo

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Capítulo 2.1.14. — Gripe aviar muy virulenta

cumplió bien su función en relación al aislamiento del virus y ofreció una alternativa más barata y mucho más rápida. Se han diseñado modificaciones del método RT-PCR directo para la detección de ARN vírico con el fin de reducir el efecto de sustancias inhibidoras presentes en la muestra recogida, la posible existencia de ácidos nucleicos contaminantes, y el tiempo necesario para obtener un resultado. Por ejemplo, la amplificación de secuencias basadas en ácidos nucleicos (NASBA) junto con la detección electro-quimioluminiscente (NASBA/ECL) consiste en una reacción isoterma continua en la que no se necesita un equipamiento especializado tipo termociclador. Se han desarrollado ensayos NASBA para la detección en 6 horas del virus de la gripe aviar de los subtipos H5 y H7 en muestras clínicas (10, 18). Parece muy probable que en muy poco tiempo la tecnología basada en métodos moleculares se haya desarrollado lo suficiente para permitir realizar ensayos “ a pie del rebaño” para la detección de la presencia del virus de la gripe aviar, el subtipo específico y los marcadores de virulencia. El grado en que empleen tales ensayos en el diagnóstico de la gripe aviar dependerá mucho del acuerdo y la adopción de definiciones legales de las infecciones con vistas al control y el comercio.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO En algunos países las vacunas designadas para contener o prevenir la GAMV se encuentran prohibidas específicamente o desaconsejadas por las agencias del gobierno porque pueden interferir con las políticas de control de eliminación de la enfermedad. Sin embargo, la mayoría de normas de control de la GAMV se reservan el derecho de utilizar vacunas en caso de emergencias, como ha ocurrido en México y Pakistán. Desde la década de 1970 en EEUU ha existido un empleo generalizado de vacunas inactivadas producidas bajo una licencia especial con fines comerciales (16, 21, 24). Estas vacunas se han utilizado principalmente en pavos frente a virus que no son muy patógenos pero que pueden causar graves problemas, principalmente en circunstancias exacerbantes. Se han utilizado cantidades significativas de vacuna (15, 21). La vacuna inactivada se preparó a partir de un virus de baja virulencia del subtipo H7N3 responsable de una serie de brotes en pavos en Utah en 1995, y se empleó junto con otras medidas para controlar tales brotes (17). Después de la eliminación de los brotes de la GAMV H7N1 en Italia, resurgieron virus de baja virulencia del mismo subtipo y se permitió la vacunación bajo estrictas medidas de control. La existencia de un gran número de subtipos víricos, junto con la conocida variación de diferentes cepas de un subtipo, plantea serios problemas a la hora de seleccionar cepas para producir vacunas de la gripe. Además, algunos aislados no crecen hasta un título suficientemente elevado como para producir vacunas potentes sin tener que realizar una concentración previa costosa. Las vacunas producidas han sido bien endógenas, p. ej., preparadas a partir de aislados implicados específicamente en una epizootia, o se han preparado a partir de virus que poseen el mismo subtipo de hemaglutinina y que proporcionan grandes concentraciones de antígeno. En este último caso en los EEUU se ha llevado a cabo cierta estandarización, en el sentido de que los National Veterinary Services Laboratories han propagado y mantenido virus de la gripe de cada subtipo para su empleo como inóculo vírico en la preparación de vacunas inactivadas (4). Estas vacunas y aquellas que se utilizaron en Italia (9, 12) frente a virus de baja patogenicidad, y frente a GAMV en México (14) y Pakistán (23), se han preparado a partir de líquido alantoideo infectivo, inactivado con beta-propiolactona o formalina y han sido emulsionadas con aceite mineral. Durante el brote que tuvo lugar en Italia entre 1999-2001, fue erradicado el subtipo de GAMV H7N1, pero resurgió un virus de la gripe aviar de baja patogenicidad. Con vistas a complementar las medidas directas de control, se desarrolló una estrategia DIVA basada en el empleo de una vacuna inactivada emulsionada en aceite que contiene el mismo subtipo H que el virus salvaje, pero una N distinta, en este caso H7N3. Las aves vacunadas y las infectadas naturalmente se distinguieron empleando un ensayo serológico para detectar anticuerpos específicos anti-N (7, 8). La información que se da a continuación se basa principalmente en la experiencia en EEUU, y en las instrucciones y política para la licencia de las vacunas de gripe aviar en ese país (34). Los principios básicos de producción de vacunas, concretamente las vacunas inactivadas, son comunes a varios virus, p. ej. la enfermedad de Newcastle (Capítulo 2.1.15). Las instrucciones para la producción de vacunas veterinarias se dan en el Capítulo I. 1. 7. Principios de producción de vacunas veterinarias. Las directrices que se muestran aquí y en el Capítulo I. 1. 7 pretenden ser de carácter general y pueden completarse mediante requisitos nacionales o regionales.

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Capítulo 2.1.14. — Gripe aviar muy virulenta

La instalación para la producción de la vacuna debería funcionar bajo los procedimientos y prácticas de seguridad adecuados. Si se emplea un virus GAMV para la producción de la vacuna o en estudios de sensibilización con la vacuna, la zona de la instalación donde se realiza este trabajo debería cumplir los requisitos para la Contención de los patógenos del Grupo 4 como se resume en el Apéndice I.1.6.1 del Capítulo I.1.6 de este Manual de animales terrestres. No se recomiendan las vacunas vivas convencionales de la gripe frente a ningún subtipo.

1.

Control del inóculo

a)

Características del inóculo Solamente deberían emplearse virus de la gripe tipo A bien caracterizados y de probada baja patogenicidad, obtenidos preferiblemente a partir de un depósito nacional o internacional, para establecer el inóculo original para la obtención de vacunas inactivadas de cualquier subtipo.

b)

Método de cultivo Se establece un inóculo original, y a partir de éste un inóculo de trabajo. Si la cepa ha sido clonada, el establecimiento de un cultivo original puede implicar solamente la producción de un gran volumen de líquido alantoideo infectivo (mínimo 100 ml), que puede almacenarse en alícuotas liofilizadas (0,5 ml).

c)

Validación como vacuna El inóculo original debería revisarse después de su preparación en cuanto a su esterilidad, inocuidad, potencia y ausencia de agentes externos específicos.

2.

Método de fabricación

Para producir la vacuna, en primer lugar se establece un inóculo de trabajo, a partir del cual se producen los lotes de vacuna, mediante la expansión de una alícuota del inóculo original hasta un volumen suficiente que permita la producción de la vacuna durante 12-18 meses. Es mejor almacenar el inóculo original en forma líquida a menos de –60° C, ya que los virus liofilizados no siempre se multiplican con títulos altos después del primer pase. Las vacunas inactivadas de la gripe preparadas a partir de virus convencionales se producen en embriones de pollo. El método de producción consiste básicamente en la propagación del virus de manera aséptica; todos los procedimientos se llevan a cabo en condiciones estériles. Es habitual diluir el inóculo de trabajo en PBS estéril, pH 7,2, de manera que se inoculan en la cavidad alantoidea de 9 ó 10 embriones de pollo SPF de diez días de edad aproximadamente 103-104 EID50 (dosis infectiva 50% por embrión ) por 0,1 ml. Dichos embriones se incuban a 37°C. Los embriones que mueren en 24 horas deberían descartarse. El periodo de incubación dependerá de la cepa de virus que se emplee y tendrá que ser predeterminado para asegurar un máximo rendimiento con el mínimo número de muertes de embriones. Los embriones infectados deberían enfriarse a 4°C antes de concentrarse. Se elimina la cáscara de la parte superior de los huevos y los líquidos alantoideos se aspiran después de hundir el embrión. Deberá evitarse la inclusión de cualquier material de la yema y albúmina. Todos los fluidos deberían almacenarse inmediatamente a 4°C y ensayarse para la existencia de contaminación bacteriana antes de que se preparen grandes cantidades para ser inactivadas. Durante la preparación de vacunas inactivadas, el líquido alantoideo concentrado se trata, bien con formaldehído (una concentración típica es 1/1.000) o beta-propiolactona (una concentración típica final es 1/2.000-1/4.000). El tiempo necesario debe ser suficiente para asegurar la ausencia de virus vivos. La mayoría de las vacunas inactivadas no se concentran; el líquido alantoideo inactivado se emulsiona normalmente con aceite mineral o vegetal. Las formulaciones precisas generalmente son secretos comerciales.

3.

Control del proceso

En las vacunas inactivadas, la eficacia del proceso de inactivación debería ensayarse en embriones de pollo, tomando 25 alícuotas de 0,2 ml de cada lote y pasando cada alícuota tres veces en embriones SPF.

4.

Control del lote

La mayoría de los países han publicado especificaciones para el control de la producción y ensayo de las vacunas, que incluyen la definición de las pruebas obligatorias con las vacunas durante y después de su fabricación.

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Capítulo 2.1.14. — Gripe aviar muy virulenta

a)

Esterilidad Las determinaciones de esterilidad y ausencia de contaminación con materiales biológicos pueden encontrarse en el Capítulo I.1.5.

b)

Inocuidad En las vacunas inactivadas, se administra una dosis doble por la ruta recomendada a diez aves de 3 semanas de edad, y se observa durante 2 semanas la ausencia de signos clínicos de enfermedad o lesiones locales.

c)

Potencia Generalmente, en las vacunas preparadas para proteger frente a GAMV o los subtipos H5 ó H7 puede emplearse un ensayo convencional de potencia que implique la utilización de tres dosis diluidas y la sensibilización con el virus virulento (p. ej. Capítulo 2.1.15.). En las vacunas inactivadas frente a otros subtipos cuando no se encuentran disponibles virus virulentos, los ensayos de potencia pueden basarse en la medida de la respuesta inmune o la sensibilización y valoración de la morbilidad. La valoración del contenido de antígeno de hemaglutinina (37) puede permitir la extrapolación in vitro de la potencia en los siguientes lotes de vacuna.

d)

Estabilidad Cuando se almacena bajo las condiciones recomendadas, la vacuna debería mantener su potencia durante al menos 1 año. Las vacunas inactivadas no deben congelarse.

e)

Conservantes Puede utilizarse un conservante para la vacuna distribuida en contenedores multidosis.

f)

Precauciones (riesgos) Debe tenerse cuidado en evitar la autoinyección con las vacunas emulsionadas en aceite.

5.

Pruebas en el producto final

a)

Inocuidad Ver Sección C. 4. b. arriba

b)

Potencia Ver Sección C. 4. c. arriba

6.

Nuevas vacunas

Se han preparado, evaluado y utilizado en ensayos de campo en México vacunas recombinantes de virus de la viruela aviar que contienen HA H5 (15). Se ha empleado un sistema de expresión en baculovirus para producir antígenos H5 y H7 recombinantes para su incorporación en vacunas (35). El ADN que codifica la hemaglutinina H5 se ha evaluado como una vacuna potencial en aves de granja (20).

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Capítulo 2.1.14. — Gripe aviar muy virulenta

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Capítulo 2.1.14. — Gripe aviar muy virulenta

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* * * NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Gripe aviar muy virulenta (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar el sitio Web de la OIE para encontrar la lista más actualizada: www.oie.int).

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CAPÍTULO 2.1.15.

ENFERMEDAD DE NEWCASTLE

RESUMEN La enfermedad de Newcastle (EN) está causada por virus específicos del paramixovirus aviar de tipo I (APMV-1) que es un serotipo del género Avulavirus perteneciente a la familia Paramyxoviridae. Existen nueve serotipos de paramixovirus aviar designados desde APMV-I a APMV-9. Las cepas del virus de la EN varían ampliamente en cuanto a la severidad de la enfermedad que pueden provocar en las aves. Las cepas menos patógena pueden inducir una enfermedad grave si se exacerban por la presencia de otros organismos o mediante condiciones ambientales adversas. El método preferido de diagnóstico es el aislamiento del virus y su subsiguiente caracterización. Identificación del agente: Se preparan suspensiones en solución antibiótica de muestras traqueales o cloacales (o heces) obtenidas de aves vivas o de heces y muestras de órganos seleccionados procedentes de aves muertas que se inoculan en la cavidad alantoidea de huevos embrionarios de aves de corral de 9–11 días de edad. Los huevos se incuban a 37°C durante 4–7 días. El líquido alantoideo de cualquier huevo que contenga embriones muertos o moribundos, cuando surgen, y todos los huevos al final del periodo de incubación se ensayan para detectar actividad hemaglutinante. Cualquiera de los agentes hemaglutinantes debería probarse para demostrar la inhibición específica con un antisuero monoespecífico frente al virus de la EN. El virus de la EN (APMV-1) puede mostrar alguna relación cruzada antigénica con algunos otros serotipos del paramixovirus aviar, particularmente el APMV-3 y el APMV-7. La patogenicidad de cualquier nuevo virus aislado se puede evaluar mediante la determinación del tiempo medio de muerte en embriones de pollo, el índice de patogenicidad cerebral en polluelos de 1 día de edad o mediante el índice de patogenicidad intravenosa en pollos de 6 semanas. En algunos países se utilizan variaciones de estas técnicas estandarizadas. La patogenicidad de los aislados también se puede valorar empleando técnicas moleculares, p. ej. la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa y la secuenciación. El aislamiento y la caracterización de cepas del virus sospechosas de ser patógenas se deberían llevar a cabo en un laboratorio de seguridad vírica. Pruebas serológicas: La prueba de inhibición de la hemaglutinación es la más ampliamente utilizada en la serología del virus de la EN; su relevancia en el diagnóstico depende del estado inmune vacunal de las aves a ensayar y de las condiciones predominantes de la enfermedad. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Dependiendo de la situación de la enfermedad, se emplean virus vivos de baja virulencia (lentogénicos) o de virulencia moderada (mesogénicos) para la vacunación de aves de corral. También se utilizan vacunas inactivadas. Las vacunas vivas se pueden administrar a las aves por diversas vías. Normalmente se preparan mediante la extracción de líquidos alantoideos/amnióticos infectados procedentes de huevos embrionarios de aves inoculados; algunas se preparan a partir de cultivos celulares infectados. Se debería obtener el producto final de la expansión de los inóculos original y de trabajo. Las vacunas inactivadas se administran por vía intramuscular o subcutánea. Habitualmente se obtienen mediante la adición de formaldehído a preparaciones víricas infectivas o mediante

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Capítulo 2.1.15. — Enfermedad de Newcastle

tratamiento con beta-propiolactona. La mayoría de vacunas inactivadas se prepara para uso mediante una emulsión con aceite vegetal o mineral. Si se emplean formas patógenas del virus de la EN para la producción de vacunas o en estudios de desafío, el servicio debería cumplir los requisitos de la OIE para los patógenos del nivel de Contención del Grupo 4.

A. INTRODUCCIÓN La enfermedad de Newcastle (EN) está causada por el paramixovirus aviar de tipo I (APMV-1), que es un serotipo del género Avulavirus perteneciente a la subfamilia Paramyxovirinae, familia Paramyxoviridae. Los paramixovirus aislados procedentes de especies aviares se han clasificado mediante pruebas serológicas en nueve serotipos designados desde APMV-1 a APMV-9; el virus de la EN se ha denominado APMV-1 (4). Desde su reconocimiento en 1926, la EN se considera endémica en muchos países. La vacunación profiláctica se practica en casi todos los países productores de aves de corral a escala comercial. Una de las propiedades más características de las cepas diferentes del virus de la EN es su enorme variación respecto a la patogenicidad para los pollos. Las cepas del virus de la EN se agrupan en cinco patotipos sobre la base de los signos clínicos observados en los pollos infectados (13). Estos son: 1.

Velogénico viscerotrópico: es muy patogénica en la que se observan frecuentemente lesiones intestinales hemorrágicas;

2.

Velogénico neurotrópico: se presenta con mortalidad elevada, habitualmente seguida de signos respiratorios y nerviosos;

3.

Mesogénico: se presenta con signos respiratorios y signos nerviosos ocasionales pero baja mortalidad;

4.

Lentogénico o respiratorio: se presenta con una infección respiratoria leve o subclínica;

5.

Entérico asintomático: normalmente consiste en una infección entérica subclínica.

Raramente los agrupamientos en patotipos son claros (6), e incluso en infecciones de aves libres de patógenos específicos (SPF), se puede apreciar un considerable solapamiento. Además, puede tener lugar una exacerbación de los signos clínicos inducida por las cepas más benignas si se superponen infecciones de otros organismos o cuando se presentan condiciones medioambientales adversas. Como los signos de la enfermedad clínica en pollos varían ampliamente y el diagnóstico puede complicarse posteriormente por las respuestas diferentes a la infección en los distintos hospedadores, los signos clínicos por sí solos no presentan una base fiable para el diagnóstico de la EN. Sin embargo, los signos clínicos y las lesiones asociadas con los patotipos virulentos proporcionarán una fuerte sospecha de enfermedad.

B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO 1.

Identificación del agente

a)

Muestras para el aislamiento vírico Cuando las investigaciones de la EN son el resultado de la aparición de enfermedad severa y mortalidad elevada en grupos de aves, es corriente intentar el aislamiento del virus a partir de aves muertas recientemente o aves moribundas que se sacrifican de forma indolora. Las muestras procedentes de aves muertas deberían consistir en frotis oronasales, tanto como muestras procedentes de tejidos de pulmón, riñones, intestino (incluyendo contenidos), bazo, cerebro, hígado y corazón. Pueden ser recogidos separadamente o en conjunto, aunque, habitualmente, las muestras intestinales se procesan de forma separada de otras muestras. Las muestras procedentes de aves vivas deberían incluir tanto frotis traqueales como cloacales; las últimas deberían estar visiblemente cubiertas de material fecal. Los pájaros pequeños y delicados pueden dañarse por el muestreo pero la recogida de heces frescas puede servir como alternativa adecuada. En el caso de que sean limitadas las oportunidades de obtener muestras, es importante que se examinen los frotis cloacales (o fecales) y los frotis traqueales (o tejido traqueal) tanto como los órganos o tejidos más afectados o asociados con la enfermedad clínica. Las muestras deberían tomarse en las etapas tempranas de la enfermedad.

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Capítulo 2.1.15. — Enfermedad de Newcastle

Se tendrían que colocar las muestras en solución salina isotónica tamponada con fosfato (PBS), pH 7,0– 7,4, que contenga antibióticos. Los antibióticos pueden variar de acuerdo a las condiciones locales, pero podría ser, por ejemplo, penicilina (2.000 unidades/ml); estreptomicina (2 mg/ml); gentamicina (50 µg/ml); y micostatina (1.000 unidades/ml) para frotis traqueales y de tejidos, pero a concentraciones cinco veces superiores para frotis cloacales y de heces. Es importante reajustar la solución a pH 7,0–7,4 después de la adición de los antibióticos. Las heces y los tejidos tomados finamente deberían prepararse como suspensiones al 10–20% (p/v) en la solución de antibiótico. Las suspensiones deberían procesarse tan pronto como fuera posible después de una incubación durante 1–2 horas a temperatura ambiente. Cuando es impracticable el procesamiento inmediato, las muestras pueden conservarse a 4°C hasta 4 días.

b)

Cultivo del virus Los líquidos sobrenadantes de las heces o las suspensiones de tejidos obtenidos mediante la clarificación por centrifugación a 1.000 g durante aproximadamente 10 minutos a una temperatura que no exceda los 25°C se inoculan en volúmenes de 0,2 ml en la cavidad alantoidea de cada uno de al menos cinco huevos embrionarios de aves SPF de 9–11 días de incubación. Después de la inoculación, se incuban a 35–37°C durante 4–7 días. Los huevos que contengan embriones muertos o moribundos cuando surgen, y todos los huevos que permanezcan hasta el final del periodo de incubación, deberían enfriarse primero a 4°C y probar los líquidos alantoideos para detectar actividad de hemaglutinación (HA). Los líquidos que den una reacción negativa deberían ser pasados en al menos un lote posterior de huevos.

c)

Identificación del virus La actividad HA detectada en líquidos bacteriológicamente estériles recogidos a partir de huevos inoculados puede deberse a la presencia de cualquiera de los 15 subtipos de hemaglutininas de los virus de la gripe A o de los ocho restantes serotipos de paramixovirus. (El líquido no estéril podría contener actividad HA bacteriana). El virus de la EN puede confirmarse empleando antisuero específico en una prueba de inhibición de la hemaglutinación (HI). Habitualmente se utiliza el antisuero de pollo preparado contra una de las cepas del virus de la EN. Las reacciones cruzadas en las pruebas HI entre el virus de la EN y algunos otros APMVs, especialmente los virus de los serotipos APMV-3 y APMV-7 pueden causar algunos problemas que pueden resolverse empleando controles adecuados de antígeno y antisuero.

d)

Índices de patogenicidad La variación extrema en la virulencia de los diferentes aislamientos víricos de la EN y el uso generalizado de vacunas vivas implica que la identificación de un aislamiento como virus de la EN a partir de aves que muestren signos clínicos no confirma un diagnóstico de la EN, por lo que también se requiere una valoración de la virulencia del aislado (véase Sección B.1.f. bajo el título “Definición de la enfermedad de Newcastle”). Se investigan por parte de varios grupos en todo el mundo varias pruebas in vitro potenciales para establecer la virulencia normalmente relacionada con la base molecular de la patogenicidad (Sección B.1.e. más adelante). Hasta la fecha, una valoración definitiva de la virulencia del virus se basa habitualmente en una o más de las siguientes pruebas in vivo, aunque la definición actual de la OIE (Sección B.1.f. abajo) permite una valoración molecular de la virulencia: Œ

Tiempo medio de muerte en huevos

i)

Se diluye el líquido alantoideo infectivo, estéril y fresco en solución salina estéril para preparar diluciones decimales en serie comprendidas entre 10–6 y 10–9.

ii)

Para cada dilución se inocula 0,1 ml en la cavidad alantoidea de cada uno de cinco huevos embrionarios de aves SPF de 9–10-días de edad y entonces se incuban a 37°C.

iii)

Las diluciones víricas restantes se mantienen a 4°C y se inoculan otros cinco huevos con 0,1 ml de cada dilución 8 horas más tarde y se incuban a 37°C.

iv)

Cada huevo se examina dos veces al día durante 7 días y se registran los tiempos a los que muere cada embrión.

v)

La dosis letal mínima es la dilución vírica más alta que causa la muerte de todos los embriones inoculados con ella.

vi)

El tiempo medio de muerte (MDT) es el tiempo medio en horas en el que la dosis letal mínima provoca la muerte de todos los embriones inoculados.

vii)

El MDT se ha utilizado para clasificar las cepas del virus de la EN dentro de los grupos siguientes: velogénico (tarda menos de 60 horas en matar); mesogénico (tarda entre 60 y 90 horas en matar) y lentogénico (tarda más de 90 horas en matar).

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Capítulo 2.1.15. — Enfermedad de Newcastle

Œ

Índice de patogenicidad intracerebral

i)

El líquido alantoideo infectivo y fresco con un título HA >24 (>1/16) se diluye 1/10 en solución salina isotónica estéril sin aditivos, tales como antibióticos.

ii)

Se inyectan por vía intracerebral 0,05 ml del virus diluido en diez polluelos procedentes de huevos de un grupo de aves SPF. En el momento de la inoculación, estos polluelos deben tener más de 24 horas y menos de 48 horas.

iii)

Las aves se examinan cada 24 horas durante 8 días.

iv)

En cada observación, las aves se puntúan: 0 si es normal, 1 si está enferma y 2 si está muerta. (Los individuos muertos deben puntuarse como 2 en cada una de las observaciones diarias siguientes a la muerte).

v)

El índice de patogenicidad intracerebral (ICPI) es la puntuación media por ave y por observación durante el periodo de 8 días.

Los virus más virulentos presentarán índices que se aproximan a la puntuación máxima de 2,0, mientras que las cepas lentogénicas presentarán valores próximos a 0,0. Œ

Índice de patogenicidad intravenosa

i)

El líquido alantoideo infectivo recogido en fresco (que no debería tener más de 24–48 horas y que debería demostrarse que está exento de contaminación bacteriana) con un título HA de >24 (>1/16) se diluye 1/10 en solución salina isotónica estéril.

ii)

Se inyecta por vía intravenosa 0,1 ml del virus diluido en diez pollos SPF de seis semanas.

iii)

Se examinan las aves a intervalos de 24 horas durante 10 días y se puntúa cada observación: 0 si es normal, 1 si está enferma, 2 si está paralizada o muestra algunos signos nerviosos y 3 si está muerta. (Los individuos muertos deben puntuarse como 3 en cada una de las observaciones diarias siguientes a la muerte).

iv)

El índice de patogenicidad intravenosa (IVPI) es la puntuación media por ave y por observación durante el periodo de 10 días.

Las cepas lentogénicas y algunas cepas mesogénicas tendrán valores IVPI de 0, mientras que los índices de las cepas virulentas se aproximarán a 3,0. Se han recomendado algunas variaciones en estas pruebas. El muestreo de la cloaca y de la conjuntiva de pollos de 8 semanas con líquido alantoideo no diluido se ha sustituido por la prueba IVPI (23). La intención es distinguir entre los virus velogénicos viscerotrópicos y los velogénicos neurotrópicos. Œ

Interpretación de los índices de patogenicidad

No resulta sencilla la interpretación de los índices de patogenicidad obtenidos con vistas a un comercio impositivo, o a restricciones en el movimiento u otras políticas. El objetivo es controlar las cepas que son significativamente más virulentas que las cepas lentogénicas, tales como la Hitchner-B1 o La Sota. Como los virus capaces de producir una enfermedad bastante severa pueden tener valores IVPI de 0, se utiliza la prueba ICPI con más frecuencia para tales valoraciones. Sin embargo, como en esta prueba cepas diferentes muestran un rango de valores desde 0,00 hasta 2,00, está claro que cualquier valor utilizado para definirlas debe regirse por el sentido práctico.

e)

Base molecular de la patogenicidad Durante la replicación, las partículas del virus de la EN se producen con un precursor glicoproteico, F0, que tiene que escindirse en F1 y F2 para que las partículas víricas sean infectivas. Esta división posttraduccional está mediada por proteasas de la célula hospedadora. La tripsina es capaz de escindir F0 de todas las cepas víricas de la EN. Parece ser que las moléculas F0 de los virus virulentos para los pollos pueden dividirse mediante una proteasa del hospedador o proteasas encontradas en un rango amplio de células y tejidos y, de este modo, extenderse a través del hospedador dañando órganos vitales, mientras que las moléculas F0 en los virus de baja virulencia están limitadas en su ruptura a ciertas proteasas del hospedador, lo que resulta en la restricción de estos virus a replicarse sólo en ciertos tipos de células hospedadoras. La mayoría de los virus de la EN que son patogénicos para los pollos tienen la secuencia 112R/K-R-Q-K/RR116 en el extremo C-terminal de la proteína F2 y un residuo de F (fenilalanina) en la posición 117, en el extremo N-terminal de la proteína F1, mientras que los virus de baja virulencia tienen secuencias en la misma región de 112G/E-K/R-Q-G/E-R116 y un residuo de L (leucina) en la posición 117. Algunos de las

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Capítulo 2.1.15. — Enfermedad de Newcastle

variantes víricas de la paloma examinadas (PPMV-1) tienen la secuencia 112G-R-Q-K-R-F117, pero tienen valores ICPI altos. De modo que parece que existe el requerimiento de al menos un par de aminoácidos básicos en las posiciones 116 y 115 más una fenilalanina como residuo 117 y un aminoácido básico (R) en la posición 113 si el virus muestra virulencia hacia los pollos. Se han realizado diversos estudios empleando técnicas moleculares para determinar la secuencia del punto de escisión de F0 mediante la reacción en cadena de la polimerasa de trascripción inversa (RTPCR), bien en virus aislados o bien en tejidos y heces procedentes de aves infectadas, realizándose a continuación el análisis del producto mediante el análisis con enzimas de restricción, la hibridación con sonda o la secuenciación de nucleótidos al objeto de establecer una prueba in vitro rutinaria para determinar la virulencia (para una revisión véase ref.2). La determinación de la secuencia de escisión de F0 puede proporcionar una indicación clara de la virulencia del virus y esto se ha incorporado a la definición de la EN (véase Sección B.1.f.). En el diagnóstico de la EN es importante entender que la demostración de la presencia del virus con múltiples aminoácidos básicos en el punto de escisión de F0 confirma la presencia de virus virulentos o potencialmente virulentos, pero la falta de detección de virus o la detección de virus de la EN sin múltiples aminoácidos básicos en el punto de escisión de F0 empleando técnicas moleculares no confirma la ausencia de virus virulentos. Una primera correspondencia mala o la posibilidad de que en una misma población estén mezclados virus virulentos y avirulentos, implica que todavía será necesario el aislamiento del virus y una valoración in vivo de la virulencia. Los análisis recientes de virus aislados en Irlanda en 1990 y los realizados durante los brotes de la EN de 1998–2000 en Australia han proporcionado una clara evidencia de que los virus virulentos pueden surgir a partir de virus progenitores de baja virulencia (5, 39). También se ha generado de manera experimental un virus virulento de la EN a partir de un virus de baja virulencia mediante pases en pollos (34).

f)

Definición de la enfermedad de Newcastle Parece probable que la gran mayoría de aves sea susceptible a la infección con virus de la EN tanto de virulencia alta como de virulencia baja para los pollos, aunque los signos clínicos observados en aves infectadas con el virus de la EN varían ampliamente y dependen de factores tales como: el virus, la especie hospedadora, la edad del hospedador, la infección con otros organismos, el estrés medioambiental y el estado inmune. Bajo algunas circunstancias la infección con los virus extremadamente virulentos puede provocar una mortalidad repentina alta con signos clínicos relativamente escasos. Así que los signos clínicos son variables y están influidos por otros factores de modo que ninguno puede considerarse patognomónico. Incluso en los hospedadores susceptibles, tales como los pollos, los virus de la EN muestran un rango considerable de virulencia. Generalmente, la variación consiste en grupos alrededor de los dos extremos en pruebas utilizadas para valorar la virulencia, pero, por diversas razones, algunos virus pueden mostrar virulencia intermedia. La variación enorme en la virulencia y en los signos clínicos implica la necesidad de definir cuidadosamente lo que constituye la EN para los propósitos de comercio, políticas y medidas de control. La definición de la EN actualmente en uso en todos los estados miembros de la Unión Europea es la que se contempla en la Directiva 92/66/EEC (17). La definición de la OIE para anunciar un foco de la EN es: “La enfermedad de Newcastle se define como una infección de aves causada por un virus del serotipo 1 del paramixovirus aviar (APMV-1) que cumple uno de los criterios siguientes de virulencia: a)

El virus tiene un índice de patogenicidad intracerebral (ICPI) en polluelos de un día (Gallus gallus) de 0,7 o superior. o

b)

Se han demostrado en el virus múltiples aminoácidos básicos (o directamente o por deducción) en el extremo C-terminal de la proteína F2 y un residuo de fenilalanina en la posición 117, la cual está en el extremo N-terminal de la proteína F1. El término “múltiples aminoácidos básicos” se refiere a que existen al menos tres residuos de arginina o lisina entre las posiciones 113 y 116. La imposibilidad de demostrar el modelo característico de residuos de aminoácidos como se ha descrito anteriormente requeriría la caracterización del virus aislado mediante una prueba ICPI.

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Capítulo 2.1.15. — Enfermedad de Newcastle

En esta definición, los residuos de aminoácidos se numeran desde el extreme N-terminal de la secuencia de aminoácidos deducida a partir de la secuencia de nucleótidos del gen F0 donde las posiciones 113–116 corresponden de la –4 a la –1 a partir del punto de escisión.”

g)

Anticuerpos monoclonales Se han utilizado anticuerpos monoclonales de ratón (MAbs) dirigidos contra cepas del virus de la EN en pruebas HI para conseguir una identificación rápida del virus de la EN sin las posibles reacciones cruzadas con otros serotipos APMV que pueden tener lugar con sueros policlonales. Se han creado MAbs que dan reacciones en pruebas HI y que son específicos para cepas particulares o variantes de aislados del virus de la EN (4, 9). Se han empleado tablas de MAbs para establecer perfiles antigénicos de aislamientos del virus de la EN basándose en si reaccionan o no con los virus. Se ha demostrado que es un método valioso para agrupar y diferenciar los aislados del virus de la EN y ha sido particularmente de valor para entender la epidemiología de los brotes (9).

h)

Estudios filogenéticos En los últimos años el desarrollo de técnicas mejoradas para la secuenciación de nucleótidos, la disponibilidad de datos de la secuencia de más virus de la EN en bases de datos informatizadas y la demostración de que incluso longitudes de secuencia relativamente cortas pueden dar resultados significativos en análisis filogenéticos, han conducido a un incremento considerable en tales estudios. Se ha detectado una diversidad genética considerable, pero los virus que comparten parámetros temporales, geográficos, antigénicos o epidemiológicos tienden a encuadrarlos en linajes o grupos taxonómicos específicos, y se ha comprobado que esto es importante para valorar tanto la epidemiología global como la propagación local de la EN (3, 8, 16, 24, 27, 28, 33, 36–38). Aunque en el pasado los estudios filogenéticos han sido impracticables como herramienta rutinaria, en la actualidad la mayor disponibilidad y el incremento en la velocidad de obtención de resultados empleando kits sofisticados y disponibles comercialmente para la RT-PCR y secuenciadores automáticos permite que tales estudios se encuentren dentro de los equipamientos de muchos más laboratorios de diagnóstico y que puedan proporcionar resultados significativos que sean contemporáneos en lugar de retrospectivos (2).

i)

Técnicas moleculares para el diagnóstico Además del uso de la RT-PCR y de otras técnicas similares para la determinación de la virulencia de los virus de la EN (véase Sección B.1.e.) o para estudios filogenéticos (véase Sección B.1.h.), han habido varias publicaciones sobre el uso de tales técnicas moleculares para detectar el virus de la EN en muestras clínicas, con la ventaja de la demostración extremadamente rápida de la presencia del virus e incluso de su virulencia si se emplean cebadores que cubran la parte del genoma que codifica el punto de escisión de F0 (12, 20, 21). Se debería tener cuidado en la selección de muestras clínicas ya que algunos estudios han demostrado falta de sensibilidad en la detección de los virus en algunos órganos y particularmente en las heces (20, 21, 25). Como ocurre en la determinación de la virulencia, es importante que tales técnicas no se empleen solas para registrar un resultado como negativo en las investigaciones en las que se sospeche la EN.

La EN, como se define en la Sección B.1.f. de este capítulo, está sujeta a un control oficial y el virus tiene un riesgo elevado de propagación a partir del laboratorio; en consecuencia, debería llevarse a cabo una valoración del riesgo para determinar el nivel de bioseguridad necesario para el diagnóstico y la caracterización del virus. El servicio debería cumplir los requisitos para el apropiado Grupo de Contención, como se determina mediante la valoración del riesgo y como lo recoge el Apéndice I.1.6.1 del Capítulo I.1.6. de este Manual de animales terrestres. Los países que carezcan de acceso a tales laboratorios especializados, nacionales o regionales, deberían enviar las muestras a un laboratorio de referencia de la OIE.

2.

Pruebas serológicas

El virus de la EN puede emplearse como un antígeno en una variedad amplia de pruebas serológicas, lo que permite que se utilicen las técnicas de neutralización o de enzimoinmunoensayo (ELISA) para el diagnóstico. En la actualidad, la prueba HI es la más ampliamente utilizada. Los sueros de pollo raramente dan reacciones positivas no específicas en esta prueba y es innecesario cualquier pretratamiento de los sueros. Los sueros procedentes de especies distintas a las de los pollos a veces pueden causar aglutinación de los eritrocitos (RBC) de pollo, así que esta propiedad debería determinarse primero, y posteriormente extraer mediante adsorción del suero con RBC de pollo. Esto se realiza adicionando 0,025 ml de RBC de pollo empacados a cada 0,5 ml de antisueros, agitando suavemente y dejándolos durante al menos 30 minutos; a continuación los RBC se precipitan mediante centrifugación a 800 g durante 2–5 minutos y se decantan los sueros adsorbidos.

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Capítulo 2.1.15. — Enfermedad de Newcastle

En diferentes laboratorios se practican variaciones de los procedimientos para las pruebas HA y HI. Los siguientes ejemplos recomendados emplean placas de microtitulación de plástico y fondo en V en las que el volumen final para ambos tipos de prueba es de 0,075 ml. Los reactivos necesarios para estas pruebas son PBS isotónico (0,1 M), pH 7,0–7,2, y RBC procedentes de un mínimo de tres pollos SPF y agrupados en un volumen igual de solución de Alsever. (Si no se dispone de pollos SPF, se puede emplear sangre procedente de aves no vacunadas que se controlen regularmente y muestren estar libres de anticuerpos frente al virus de la EN). Las células se deberían lavar tres veces en PBS antes de usarlas como suspensión al 1% (células empacadas v/v). Debería realizarse en cada prueba, de modo apropiado, un control positivo y negativo de los antígenos y de los antisueros.

a)

Pruebas de hemaglutinación y de inhibición de la hemaglutinación Œ

Pruebas de hemaglutinación

i)

Se distribuyen 0,025 ml de PBS en cada pocillo de una placa de microtitulación de plástico y fondo en V.

ii)

A cada pocillo se adicionan 0,025 ml de la suspensión vírica (p. ej. líquido alantoideo infectivo). Para una determinación precisa del contenido de HA, se debería hacer a partir de una serie de diluciones muy cercanas a una inicial, p. ej. 1/3, 1/5, 1/7, etc.

iii)

A lo largo de toda la placa se practican diluciones al doble de la suspensión vírica en volúmenes de 0,025 ml.

iv)

Posteriormente se adicionan a cada pocillo 0,025 ml de PBS.

v)

En cada pocillo se dispensan 0,025 ml de RBC de pollo al 1% (v/v).

vi)

La solución se mezcla golpeando suavemente la placa. Se dejan estáticos los RBC durante unos 40 minutos a temperatura ambiente, p. ej. aproximadamente a 20°C, o durante 60 minutos a 4°C si las temperaturas son altas, considerando que los RBC control deberían sedimentar de una forma distinta.

vii)

La HA se determina inclinando la placa y observando la presencia o ausencia de una corriente en forma de lágrima de los RBC. Debería leerse la titulación a la dilución más alta a la que se de una HA completa (sin corriente); esto representa 1 unidad HA (HAU) y puede calcularse de forma precisa a partir del rango inicial de diluciones.

Œ

Prueba de inhibición de la hemaglutinación

i)

Se dispensan 0,025 ml de PBS en cada pocillo de una placa de microtitulación de plástico y fondo en V.

ii)

Se adicionan 0,025 ml de suero en el primer pocillo de la placa.

iii)

A lo largo de la placa se realizan diluciones dobles del suero en volúmenes de 0,025 ml.

iv)

A cada pocillo se añaden 4 HAU de virus/antígeno en 0,025 ml y la placa se deja durante un mínimo de 30 minutos a temperatura ambiente, p. ej. en torno a 20°C, o 60 minutos a 4°C.

v)

A cada pocillo se añaden 0,025 ml de RBC de pollo al 1% (v/v) y, después de mezclar suavemente, los RBC se dejan estáticos unos 40 minutos a temperatura ambiente, p. ej. en torno a 20°C, o durante unos 60 minutos a 4°C si las temperaturas del ambiente son altas, considerando que los RBC control deberían sedimentar de una forma distinta.

vi)

El título de HI es la dilución mayor de suero que causa la inhibición completa de 4 HAU de antígeno. La aglutinación se valora inclinando las placas. Debería considerarse que muestran inhibición sólo aquellos pocillos en los que la corriente de RBC se produce a la misma velocidad que los pocillos control (que contienen 0,025 ml de RBC y 0,05 ml de PBS).

vii)

La validez de los resultados debería evaluarse frente a un suero control negativo, que no debería presentar un título >1/4 (>22 o >log2 2 cuando se expresa como el recíproco), y un suero control positivo para el cual el título debería encontrarse entre una de las diluciones del título conocido.

El valor de la serología en el diagnóstico está relacionado claramente con el estado inmune esperado de las aves afectadas. Los títulos de HI pueden considerarse positivos si hay inhibición a una dilución del suero de 1/16 (24 o log2 4 cuando se expresa como el recíproco) o superior contra 4 HAU de antígeno. Algunos laboratorios prefieren usar 8 HAU en las pruebas de HI. Mientras esto se permita, afectará a la interpretación de los resultados de modo que un título positivo será 1/8 (23 o log2 3) o superior. Se debería incluir una nueva titulación del antígeno en todas las pruebas para verificar el número de HAU utilizadas. Los títulos de HI pueden emplearse para evaluar el estado inmune de un grupo de aves. En grupos vacunados que estén siendo controlados serológicamente, es posible identificar respuestas anamnésicas como resultado de una infección de desafío con el virus de campo (11), pero se debería proceder con gran

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Capítulo 2.1.15. — Enfermedad de Newcastle

cautela porque se pueden producir variaciones por otras causas. Por ejemplo, se ha demostrado que las infecciones por el virus APMV-3 de pavos vacunados contra el virus de la EN darán por resultado títulos sustancialmente elevados frente al virus de la EN (7). Se dispone comercialmente de una variedad de kits de pruebas ELISA que se basan en diversas estrategias para la detección de anticuerpos contra el virus de la EN, incluyendo ELISA indirecto, tipo sándwich y de bloqueo o competitivo, que emplean MAbs. Al menos uno de los kits utiliza una subunidad antigénica. Habitualmente estas pruebas se han validado y evaluado por el fabricante y, por tanto, es importante que para su uso, se sigan cuidadosamente las instrucciones especificadas.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO Se ha publicado una descripción detallada de todos los aspectos de las vacunas del virus de la EN, incluyendo su producción y usos (11) y debería consultarse para conocer los detalles de los procedimientos que aquí se recogen. En el Capítulo I.1.7. Principios de producción de vacunas veterinarias, se indican las directrices para la producción de este tipo de vacunas. Las directrices dadas aquí y en el Capítulo I.1.7 pretenden ser de carácter general y pueden complementarse en el caso de que existan requisitos regionales y nacionales. En esta sección se considerarán vacunas convencionales vivas e inactivadas, porque todavía se emplean universalmente. Sin embargo, se debería recordar que existen muchos trabajos recientes sobre la aplicación de técnicas de biología molecular en la producción de nuevas vacunas y hay constancia del éxito en la obtención de inmunidad protectora con virus recombinantes de la viruela aviar, el virus vacunal, el virus de la viruela de la paloma, el herpesvirus del pavo y las células aviares en las que se expresan el gen HN, o el gen F, o los dos genes, del virus de la EN. En algunos países se ha autorizado el uso de varios de estos virus recombinantes. Las cepas víricas de la EN empleadas en las vacunas comerciales de virus vivos se encuadran en dos grupos: vacunas lentogénicas tales como Hitchner-B1, La Sota, V4, NDW, I2 y F, y vacunas mesogénicas, tales como Roakin, Mukteswar y Komarov. Las cepas de ambos grupos han sido seleccionadas y clonadas para satisfacer los diferentes criterios en su producción y aplicación. Todos los virus de vacunas mesogénicas tienen dos pares de aminoácidos básicos en el punto de escisión F0 y valores ICPI de aproximadamente 1,4. Esto significa que las infecciones de aves con estos virus entrarían dentro de la definición propuesta para la EN (Sección B.1.f.) pero como estas vacunas se emplean principalmente en países donde la EN es endémica, este hecho puede que no excluya necesariamente su uso. El servicio de producción de vacunas debería operar bajo los procedimientos y prácticas apropiados de bioseguridad. Si la EN, como se define en la Sección B.1.f. de este capítulo, se utiliza para la producción de vacunas o para estudios de desafío de la vacuna, la parte del servicio donde se realice el trabajo debería cumplir los requisitos para los patógenos del nivel de Contención del Grupo 4, como se recoge en el Apéndice I.1.6.1 del Capítulo I.1.6 de este Manual. La mayoría de vacunas con virus vivos crecen en la cavidad alantoidea de huevos embrionarios de aves pero algunas, notablemente algunas cepas mesogénicas, se han adaptado a una variedad de sistema de cultivos de tejidos. Las vacunas con virus vivos pueden administrarse a las aves incorporándolas en el agua de bebida, administrándose como un spray grueso o mediante instilación conjuntival o intranasal. Algunas cepas mesogénicas se obtienen por inoculación intradérmica en la membrana del ala. Se han preparado vacunas que dan resultados óptimos mediante la aplicación de vías específicas. En general, las vacunas vivas más inmunogénicas son más virulentas y, por tanto, es más probable que causen efectos secundarios adversos. Por ejemplo, la vacunación con la cepa La Sota causará problemas considerablemente mayores en aves susceptibles jóvenes que la cepa Hitchner-B1, aunque La Sota induce una respuesta inmune más fuerte. Las vacunas inactivadas se consideran más caras que las vacunas vivas y su empleo entraña la manipulación e inyección de aves individuales. Se preparan a partir de líquido alantoideo al que se inactiva su infectividad mediante la adición de formaldehído o beta-propiolactona. Se incorpora en una emulsión con aceite mineral y se administra por vía intramuscular o subcutánea. Así las aves individuales reciben una dosis estándar. No se produce la propagación subsiguiente del virus ni reacciones respiratorias adversas. Se utilizan tanto cepas virulentas como avirulentas como inóculo vírico aunque, desde el punto de vista del control de la seguridad, el uso de éstas últimas parece menos adecuado. Como después de la administración no se produce la multiplicación vírica, se requiere una cantidad de antígeno para la inmunización mucho mayor que en el caso de la vacunación con virus vivos. Es importante un rendimiento elevado de virus para producir una vacuna potente, y, para este propósito, es muy adecuada la cepa Ulster 2C. La duración de la inmunidad depende del programa de vacunación elegido. Una de las consideraciones más importantes que afectan a los programas de vacunación es el nivel de inmunidad maternal de los pollos jóvenes

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Capítulo 2.1.15. — Enfermedad de Newcastle

que puede variar considerablemente de granja a granja, de lote a lote y entre pollos individuales. Por esta razón, se emplean diversas estrategias. O los pájaros no se vacunan hasta las 2-4 semanas de vida cuando la mayoría de ellos será susceptible, o se vacunan con 1 sólo día de vida por instilación conjuntival o mediante la aplicación de un spray grueso. Se establecerá una infección activa en algunas aves que persistirá hasta que la inmunidad maternal decrezca. Entonces, se llevará a cabo una revacunación 3-4 semanas más tarde. Se ha demostrado que las vacunas inactivadas también pueden ser empleadas adecuadamente para vacunar polluelos de 1 día que tienen cierto grado de inmunidad maternal (15), y los mejores resultados se han obtenido cuando a los polluelos maternalmente inmunes de 1 día se les da una combinación de vacunas viva e inactivada, comparada con vacunas vivas o inactivadas dadas de forma separada (14). La vacunación de aves de 1 día totalmente susceptibles, incluso con las vacunas vivas más suaves, puede provocar en enfermedad respiratoria, especialmente si están presentes en cantidad significativa bacterias patógenas comunes. Normalmente se practica una vacunación después de 3 semanas de vida sólo en gallinas de crianza y gallinas de puesta. Se debería llevar a cabo con intervalos de suficiente frecuencia para mantener una inmunidad adecuada. Los programas de vacunación emplean con frecuencia vacunas con virus vivos un poco más patogénicos para reforzar la inmunidad de las usadas inicialmente. También pueden usarse estas vacunas vivas más patogénicas después de una vacunación inicial con vacunas inactivadas en emulsión de aceite. Cuando se diseña un programa de vacunación, debería tenerse en consideración el tipo de vacuna utilizada, el estado inmune y de enfermedad de las aves a vacunar y el nivel de protección requerido en relación a cualquier posibilidad de infección con el virus de campo bajo las condiciones locales (11). Aquí se indican dos ejemplos de programas de vacunación que pueden utilizarse en diferentes circunstancias de enfermedad. Para el primer ejemplo, cuando la enfermedad es leve y esporádica se sugiere que se adopte el siguiente orden de vacunación: vacuna viva Hitchner-B1 mediante administración conjuntival o de spray a 1 día de edad; vacuna viva Hitchner-B1 o La Sota a los 18–21 días de vida en el agua de bebida; vacuna viva La Sota en el agua de bebida a las 10 semanas de vida y una vacuna inactivada en emulsión de aceite en el momento de la puesta. Para el segundo ejemplo, cuando la enfermedad es severa y más extendida, se adopta el mismo protocolo ya indicado hasta los 21 días de vida y a esto le sigue la revacunación a los 35–42 días de vida con la vacuna viva La Sota en el agua de bebida o como spray; esta revacunación se repite a las 10 semanas de vida con una vacuna inactivada (o una vacuna viva mesogénica) y de nuevo se repite en el momento de la puesta (11).

1.

Control del inóculo

a)

Características del inóculo El primer principio a considerar cuando se selecciona una cepa para una vacuna viva del virus de la EN es si se va a usar como vacuna primaria o secundaria, siendo su patogenicidad las principal consideración. Los métodos de aplicación y frecuencia de uso son consideraciones válidas. El uso de MAb ha demostrado una variación considerable en la antigenicidad de cepas diferentes (9). Esto puede indicar la necesidad de adaptar las vacunas más cuidadosamente a virus antigénicamente relacionados con cualquier virus de campo predominante. Se ha introducido una vacuna viva basada en la cepa V4 del virus de la EN, seleccionada por su estabilidad al calor, para combatir los problemas específicos asociados con la crianza del pollo campero en los países en desarrollo. La intención es que esta vacuna pueda estar protegida por el alimento para los pollos que se alimentan de restos. Hasta la fecha, los ensayos realizados en diferentes países han producido resultados mezclados; bien puede ser que los factores locales sean extremadamente importantes afectando al éxito de esta estrategia (35). Más recientemente se ha desarrollado la vacuna I2 termoestable específicamente para la vacunación de los pollos camperos; actualmente se recomienda que esta vacuna se suministre mediante gota al ojo (1). El uso de vacunas vivas puede estar restringido por la legislación. Por ejemplo, la Decisión de la Comisión 93/152/EEC (18) restringe el uso de vacunas en los estados miembros de la Unión Europea desde el 1 de Enero de 1995 a aquellos para los que el inóculo original se ha probado y muestra tener un ICPI 4 ml). Este método de evaluar la eficacia de las vacunas con PRV está en la actualidad bien probado y ha permitido establecer un índice objetivo para determinar la eficacia de una vacuna. Tal índice, que compara la pérdida relativa de peso entre cerdos vacunados y cerdos control, puede también ser usado para probar la potencia de los lotes antes de su distribución y para la prueba de eficacia de los lotes. Sin embargo, el valor del índice de corte será diferente si las condiciones del ensayo no son idénticas. La influencia de la inmunidad adquirida pasivamente por anticuerpos derivados de la madre debe de ser evaluada de modo adecuado. 2.

Excreción de virus virulento

Además, es deseable que las vacunas eviten o al menos limiten la excreción de virus en los cerdos infectados (12, 19, 24). Cuando un programa de control de la enfermedad de Aujeszky se basa en la vacunación a gran escala, es esencial escoger las vacunas o el esquema de vacunación que mejor limite la multiplicación del virus virulento en cerdos infectados. A este respecto se han realizado varios ensayos para comparar las vacunas. Generalmente los cerdos se vacunan y se estimulan después a diferentes edades. Lo mejor, pero lo más laborioso en términos de tiempo, es infectar a los cerdos al final del tiempo del mantenimiento. Para medir la excreción de virus, se toman diariamente de cada cerdo frotis nasales (tomados a 10 cm de profundidad en la nariz) desde el día anterior a la estimulación de desafío hasta al menos doce días después. Los bastoncillos de algodón se pueden pesar antes del muestreo e inmediatamente después para calcular el peso exacto del mucus recogido. Se añade luego medio a cada tubo que contiene la muestra de frotis. El virus se titula a partir del medio después de congelación y descongelación. Se pueden utilizar diferentes índices arbitrarios para expresar la cantidad de virus virulentos excretados por los cerdos, teniendo en cuenta la duración y el nivel de la excreción de virus, y el número de cerdos que excretan virus virulentos. 3.

Duración de la inmunidad

Se recomienda que cualquier afirmación en cuanto a la aparición y duración de la inmunidad esté apoyada por datos de ensayos. La determinación de la duración de la inmunidad puede basarse en ensayos de estímulos de desafío o, en la medida de lo posible, en pruebas inmunológicas y serológicas. •

Ensayos de campo En términos generales, resulta muy difícil determinar la eficacia de una vacuna en poblaciones animales. Para hacer esto sería necesario vacunar a los animales en ausencia del patógeno contra el que protege la vacuna, esperar luego al momento de la infección y comparar los efectos de la infección en los animales vacunados (o en la descendencia de cerdas vacunadas) con los efectos en los no vacunados de la misma edad, en el mismo edificio y del mismo lote que los animales vacunados (o los protegidos por inmunización pasiva). Como todas estas condiciones son difíciles de lograr en el campo, los ensayos de campo son más apropiados para pruebas de seguridad que para pruebas de eficacia.

2.

Método de producción

Como inóculo para un producto vacunal solo se puede usar un MSV que se haya establecido que es puro. Las células del MCS se propagan en medios muy diversos. Todos los lotes de vacuna deben proceder de entre el primer y el vigésimo pase del MCS.

3.

Control interno

Es necesario realizar pruebas en cada una de las fases críticas del proceso de producción. Las pruebas de control se realizan también sobre productos intermediarios en la idea de comprobar la solidez del proceso de producción y del producto final.

4.

Control de lotes

Resulta importante diferenciar las pruebas llevadas a cabo de modo rutinario para distribuir los lotes de producto final de aquellas que se realizan para definir las propiedades biológicas de una vacuna. Los ensayos para distribución de los lotes no son los mismos que los efectuados para determinar la eficacia y seguridad de una vacuna. Los controles de los lotes para distribución son siempre ensayos a corto plazo, tan baratos como sea posible, y no siempre realizados en cerdos. Su principal finalidad es asegurar la reproducibilidad de la calidad del producto acabado, que tiene que coincidir con la calidad definida inicialmente en la solicitud para autorización de la publicidad.

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Capítulo 2.2.2. — Enfermedad de Aujeszky

a)

Pruebas de esterilidad y pureza Se deben hacer pruebas de esterilidad y ausencia de contaminación (ver Capítulo I.1.5.) Cada lote de vacuna con PVR debe ensayarse para comprobar la ausencia de virus ajenos. La cepa viva de la vacuna se neutraliza con una mínima cantidad de antisuero monoespecífico y se inocula en cultivos celulares que sean sensibles a virus patógenos para el cerdo. No se debería detectar ECP ni agentes con propiedades de hemadsorción. Las vacunas deben estar exentas de pestivirus.

b)

Inactivación En las vacunas inactivadas se debe comprobar la inactivación efectuando dos pases en el mismo tipo de cultivo celular que se usó en la producción de la vacuna. Se pueden realizar pruebas vacunando animales susceptibles tales como conejos.

c)

Identidad Cuando sea necesario, se debe realizar una prueba específica de identificación del virus.

d)

Seguridad En las vacunas vivas la seguridad se prueba administrando diez dosis de vacuna reconstituida por la ruta mencionada en la hoja de instrucciones a por lo menos dos lechones de la edad mínima recomendada para vacunación y que estén libres de anticuerpos frente a PRV. Se mantienen dos lechones del mismo origen y edad como control. No deberían ocurrir reacciones locales anormales ni sistémicas. La curva de peso de los lechones vacunados no debería diferir mucho de la de los controles. En las vacunas inactivadas, la seguridad se prueba inyectando dos dosis a lechones en las mismas condiciones que las descritas anteriormente.

e)

Potencia Se debe demostrar la potencia de la vacuna utilizando un método apropiado, cuyo resultado tiene que correlacionarse con las pruebas de eficacia descritas anteriormente. El punto más difícil de esta clase de prueba es determinar un umbral de aceptabilidad para usar o rechazar el lote de acuerdo con los resultados obtenidos. Las pruebas sobre el contenido en virus deberían realizarse usando al menos tres recipientes distintos. Se debe determinar el título del virus en la vacuna y, en general, no debería de ser superior a 1/10 de la dosis empleada para comprobar que la vacuna era segura ni inferior al título mínimo de distribución.

f)

Conservantes Si el producto final no contiene conservantes, el fabricante debe demostrar que el producto permanece aceptable durante el período de uso recomendado después de abrir el vial. Debe demostrarse la eficacia de los conservantes en recipientes multidosis de vacuna. También debe comprobarse la concentración del conservante en la vacuna final completa y su persistencia durante el período de caducidad.

g)

Precauciones (riesgos) Toda información sobre posibles reacciones adversas provocadas por la vacuna debe indicarse. Cualquier riesgo potencial para la salud humana en caso de que el usuario reciba accidentalmente una pequeña cantidad del producto tiene que indicarse. El fabricante debería señalar todas las condiciones de uso de la vacuna: mezcla, reconstitución, almacenamiento, asepsia, longitud de la aguja, ruta de administración y estado sanitario de los animales vacunados.

5.

Pruebas sobre el producto final

a)

Seguridad Cada lote de vacunas se debe probar en cuanto a seguridad, como se describe en la Sección C.4.d.

b)

Potencia Cada lote de vacunas se debe probar en cuanto a potencia, como se describe en la Sección C.4.e.

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Capítulo 2.2.2. — Enfermedad de Aujeszky

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Capítulo 2.2.2. — Enfermedad de Aujeszky

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* * *

NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la enfermedad de Aujeszky (véase Cuadro en la Parte 3 de este Manual de animales terrestres o consulte la página Web de la OIE para una lista más actualizada: www.oie.int).

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CAPÍTULO 2.2.3.

EQUINOCOCOSIS/HIDATIDOSIS

RESUMEN El diagnóstico de la equinococosis en perros u otros carnívoros susceptibles depende de la demostración de los cestodos del género Echinococcus en sus heces o en el intestino delgado. En los hospedadores intermediarios, el diagnóstico depende de la detección de la forma larvaria quística que puede infectar casi cualquier órgano, y en particular el hígado y los pulmones. Identificación del agente: Hasta la fecha, se consideran válidas desde el punto de vista taxonómico cuatro especies del género Echinococcus. Estas son E. granulosus, E. multilocularis, E. oligarthrus y E. vogeli. Las dos últimas especies se encuentran con menos frecuencia que las otras. Las cuatro especies son morfológicamente distintas tanto en el estado adulto como larvario. Se han descrito distintas variantes intraespecíficas de E. granulosus, que muestran características morfológicas y biológicas y que se pueden diferenciar de manera fiable mediante el análisis del ADN. Habitualmente las formas larvarias de Echinococcus se pueden detectar visualmente en los órganos. Se debe tener un cuidado especial para realizar el diagnóstico específico de la equinococosis en los casos en los que también Taenia hydatigena es un problema en las ovejas. El examen histológico puede confirmar el diagnóstico después de que el material fijado con formalina se procese mediante métodos convencionales de tinción. Se puede considerar como una característica específica de los metacestodos de Echinococcus la presencia de una capa laminada acelular, positiva a la tinción de ácido periódico de Schiff, con o sin una membrana germinal nucleada y celular interna. La identificación de las larvas de E. multilocularis en roedores y otros hospedadores es posible mediante el examen macroscópico o microscópico y mediante la detección del ADN empleando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En la necropsia se utiliza el intestino delgado para detectar la forma adulta de Echinococcus spp. en carnívoros salvajes o domésticos. Generalmente, se ha adoptado el uso de arecolina en los estudios llevados a cabo para determinar la prevalencia de Echinococcus granulosus en perros. La manipulación del material infectado representa un riesgo para el operador de contraer una enfermedad potencialmente fatal. Se está consiguiendo un progreso significativo en el desarrollo de las pruebas inmunológicas para el diagnóstico de las infecciones intestinales debidas a Echinococcus utilizando métodos de detección de coproantígenos. En la actualidad la técnica se está empleando en el estudio de E. multilocularis en poblaciones de zorros, perros y gatos. Es posible la detección de coproantígenos en muestras fecales recogidas a partir de animales vivos o muertos o procedentes del medio ambiente. En la actualidad se han establecido como técnicas de diagnóstico en los laboratorios especializados los métodos PCR/ADN para la detección en hospedadores definitivos de E. multilocularis y más recientemente de E. granulosus. Pruebas serológicas: Se pueden detectar anticuerpos dirigidos contra antígenos de las oncosferas, fluidos quísticos y protoescólices en el suero de ovejas y perros infectados, pero, hoy en día, esta aproximación es de una utilidad práctica limitada ya que no diferencia entre infecciones actuales y previas. También puede haber reacción cruzada entre las especies de Echinococcus y Taenia. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Se ha logrado un progreso excelente en el desarrollo de una vacuna contra el estado larvario de E. granulosus en ovejas y vacas.

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Capítulo 2.2.3. — Equinococosis/Hidatidosis

A. INTRODUCCIÓN Hasta la fecha, desde el punto de vista taxonómico, se aceptan cuatro especies del género Echinococcus, denominadas E. granulosus, E. multilocularis, E. oligarthrus, y E. vogeli. Son morfológicamente distintas tanto en su estado adulto como larvario. Se han descrito distintas variantes interespecíficas e intraespecíficas en el caso de E. granulosus. Algunos genotipos de E. granulosus exhiben rasgos característicos que justificarían el reconocimiento como especies separadas de acuerdo con algunos autores. Recientemente, se han propuesto otras especies y genotipos de Echinoccocus (21). Se necesitan estudios posteriores para definir el rango completo de diversidad genética (12, 15, 16, 20). Echinococcus granulosus tiene una distribución mundial. E. multilocularis se encuentra en zonas amplias del Hemisferio norte, y E. oligarthrus y E. vogeli están confinadas en América central y Sudamérica. Las cuatro especies son infectivas para el hombre y causan varias formas de equinococosis. La equinococosis quística humana, causada por E. granulosus y la equinococosis alveolar, causada por E. multilocularis, se consideran de interés para la salud pública en muchas partes del mundo (22).

•

Echinococcus granulosus

El parásito se transmite entre los perros domésticos y varias especies unguladas domésticas. El ciclo más importante es el del perro/oveja. También pueden existir hospedadores intermediarios y definitivos salvajes, p.ej. lobo/cérvido. El estado adulto varía de 2 a 7 mm de longitud y habitualmente posee tres o cuatro segmentos, raramente más de seis. El segmento penúltimo es maduro, y normalmente el poro genital se abre posterior a la mitad tanto de los segmentos maduros como grávidos. Normalmente, el segmento último (grávido) supone más de la mitad de la longitud del gusano completo. Presenta ganchos rostelares en el protoescólex formando dos coronas de tamaños variables. El tamaño de los ganchos varía entre 42 y 45 µm en la primera corona y entre 18 y 38 µm en la segunda. El útero grávido tiene saculaciones bien desarrolladas. El estado larvario consiste en una vesícula llena de líquido o quiste hidatídico que es unilocular, aunque también existen cámaras comunicadas. El crecimiento es expansivo, y se pueden producir quistes hijos endógenos. Las vesículas individuales pueden alcanzar un diámetro de hasta 30 cm y tienen lugar con mayor frecuencia en el hígado y los pulmones, pero se pueden desarrollar en otros órganos internos. La infección con esta forma se denomina equinococosis quística. Las especificidades de cepa de E. granulosus en los ciclos domésticos abarcan, perro/oveja en la región mediterránea, Sudamérica (Argentina, Brasil, Chile, Perú y Uruguay), África (Etiopía, Kenia y Sudán), en Oriente medio y regiones orientales, Rusia, Asia central (Kazajstán, Kirguizistán y Uzbekistán), Mongolia, República Popular China y Oceanía; perro/caballo en Bélgica, Irlanda y Reino Unido; perro/vaca en Bélgica, Alemania, Sudáfrica y Suiza; perro/cerdo en Polonia; y perro o lobo/reno en regiones sub-árticas de Noruega, Suecia y Alaska. El estado de la cepa perro/camello requiere una elucidación posterior. Esta cepa se ha identificado recientemente en algunos casos humanos de Argentina, Nepal e Irán (9, 17, 23). Hasta la fecha, todos los genotipos de E. granulosus a excepción de la cepa perro/caballo se ha visto que infectan al hombre.

•

Echinococcus multilocularis

El parásito se transmite entre los hospedadores definitivos salvajes (p.ej. Vulpes vulpes, Alopex lagopus, Canis latrans) y pequeños roedores arvicólidos (ratones de campo y lemmings). Son susceptibles los gatos y perros domésticos, aunque los gatos menos que los perros. El estado adulto varía entre 1,2 y 3,7 mm de longitud y habitualmente posee cuatro o cinco segmentos. El segmento penúltimo es maduro de forma característica, y el poro genital se sitúa en la mitad anterior en los segmentos tanto maduros como grávidos. El útero grávido tiene forma de saco. En el rostelo, la primera corona de ganchos mayores varía en tamaño entre 27,6 y 34,3 µm y la corona interna de ganchos menores, varía entre 22,7 y 31,0 µm. El metacestodo es una estructura multivesicular que consiste en conglomerados de vesículas pequeñas, que normalmente no exceden de unos pocos milímetros de diámetro. A diferencia de E. granulosus, con frecuencia la masa larvaria contiene una matriz semisólida en vez de líquida. Proliferan mediante gemación exógena y esto provoca una infiltración de los tejidos. La infección con esta forma se denomina comúnmente equinococosis alveolar. No hay pruebas de la existencia de genotipos o cepas distintas de E. multilocularis.

•

Echinococcus oligarthrus

Típicamente, el parásito utiliza felinos salvajes como hospedadores definitivos (p.ej. Felis concolor, F. jaguarundi) y roedores grandes (p.ej. Dasyprocta sp., Cuniculus paca) como hospedadores intermediarios. El adulto varía entre 1,9 y 2,9 mm de longitud y normalmente posee tres segmentos, el penúltimo de los cuales es maduro. El poro genital está en la mitad anterior en los segmentos maduros y aproximadamente se sitúa a la mitad en los segmentos grávidos. El útero grávido tiene forma de saco.

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Capítulo 2.2.3. — Equinococosis/Hidatidosis

El metacestodo es poliquístico, está lleno de líquido y tiene tendencia a estar septado y multicompartimentalizado. Los ganchos rostelares del protoescólex varían en longitud entre 25,9 y 37,9 µm. Los ganchos se describen con más detalle en la sección siguiente y se comparan con los de E. vogeli. El quiste único puede alcanzar un diámetro aproximado de 5 cm. Los lugares preferidos son los órganos internos y los músculos. Hasta la fecha, sólo hay constancia de tres casos en el hombre. El parásito parece que no madura en los perros.

•

Echinococcus vogeli

El parásito utiliza el perro de monte (Speothus venaticus) como típico hospedador definitivo salvaje, aunque el perro doméstico también es susceptible, actuando los grandes roedores (p.ej. Cuniculus paca) como hospedadores intermediarios. El adulto varía entre 3,9 y 5,6 mm de longitud, y habitualmente presenta tres segmentos, el penúltimo de los cuales es maduro. El poro genital se sitúa en la mitad posterior en los segmentos tanto maduros como grávidos. El útero grávido no presenta saculaciones laterales y se caracteriza por ser relativamente largo y tener forma tubular, comparado con otros segmentos, que tienen forma de saco. El metacestodo es similar al de E. oligarthrus. Se ha descrito que las dos especies se pueden distinguir si se comparan las diferencias en las dimensiones y las proporciones de los ganchos rostelares en el protoescólex. Los ganchos grandes de E. oligarthrus varían en longitud entre 25,9 y 37,9 µm (media de 33,4 µm) y los pequeños, entre 22,6 y 29,5 µm (media de 25,45 µm). Los ganchos grandes de E. vogeli varían entre 19,1 y 43,9 µm (media de 41,64 µm) y los pequeños entre 30,4 y 36,5 µm (media de 33,6 µm). En el caso de E. oligarthrus los guarda-ganchos dividen el gancho 50:50, en tanto que en el caso de E. vogeli, lo dividen 30:70. Tanto E. vogeli como E. oligarthrus son agentes zoonósicos, si bien la primera de las especies ha causado aproximadamente 60 casos humanos y la segunda sólo ha provocado unos pocos. La infección debida a las dos especies se denomina comúnmente equinococosis poliquística. En el Manual WHO/OIE de equinococosis se puede encontrar una descripción detallada de la equinococosis en el hombre y otros animales (22).

B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO 1.

Identificación del agente

En el hospedador intermediario, el diagnóstico depende de la detección de las formas larvarias quísticas, que pueden encontrarse en casi todos los órganos, pero particularmente en el hígado y los pulmones. El diagnóstico de la equinococosis en los perros y otros carnívoros requiere la demostración de los cestodos de Echinococcus spp. en las heces o el intestino delgado o las pruebas de detección de los coproantígenos específicos. Los investigadores que llevan a cabo estos procedimientos están expuestos a riesgos de infección y enfermedad severa, por lo que deben minimizarlos mediante procedimientos apropiados. El material infectivo se puede descontaminar congelándolo a –80°C (temperatura interna central) durante 48 horas o –70°C durante 4 días. Se deben llevar puestos mascarillas faciales, guantes desechables y un delantal. No es fiable la desinfección química aunque el hipoclorito sódico puede destruir una proporción de huevos (3). El material contaminado se debe destruir por calor; es muy efectiva el agua caliente a una temperatura de 85°C o superior. Se puede conseguir la descontaminación de los laboratorios con una humedad reducida (40%) combinada con una temperatura ambiente elevada (30°C) durante al menos 48 horas.

a)

Diagnóstico de la equinococosis larvaria •

Necropsia

Mientras que la vigilancia de E. granulosus en los animales domésticos puede tener lugar en los mataderos autorizados, la de Echinococcus sp. en los animales salvajes debe realizarse mediante estudios de campo. Las muestras se deben preservar extrayendo el tejido y fijándolas en solución salina con formol al 4% o manteniéndolas frescas a +4°C y congelándolas rápidamente a –20°C para su examen posterior. Las larvas se pueden observar en muchos órganos, pero en los animales grandes, tales como ovejas y vacas, se debería realizar una palpación o incisión. Los cerdos, ovejas y cabras pueden estar infectados con larvas de Taenia hydatigena, y a veces es difícil diferenciar entre estos dos parásitos cuando se encuentran en el hígado. Ascaris suum causa “manchas blancas” en los hígados de las ovejas. Para realizar un diagnóstico diferencial en los animales salvajes, tales como rumiantes y roedores, se debería considerar la posibilidad de otros diversos cestodos larvarios.

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Capítulo 2.2.3. — Equinococosis/Hidatidosis

El material fijado con formalina se puede teñir mediante técnicas histológicas convencionales. La presencia de una capa laminada acelular, positiva a la tinción de ácido periódico de Schiff (PAS), subyacente a una capa de tejido conectivo y con o sin una membrana germinal nucleada celular interna se puede considerar como una característica específica de los metacestodos de Echinococcus. La presencia de protoescólices dentro de cápsulas prolígeras o en arena hidatídica es también un diagnóstico del género. Habitualmente se realiza la genotipificación de E. granulosus o E. multilocularis con ADN procedente de protoescólices o de material de tejido larvario que se congela, refrigera o conserva en etanol al 90%.

b)

Diagnóstico de parásitos adultos en carnívoros •

Necropsia

Invariablemente se emplea la necropsia en el estudio de la equinococosis de animales salvajes y resulta útil si los perros domésticos se sacrifican de forma indolora. Se debería enfatizar que es necesario aislar e identificar el adulto de Echinococcus, porque en condiciones normales del examen fecal, los huevos de Echinococcus no se pueden diferenciar de los de Taenia spp. Actualmente, los huevos de E. multilocularis se pueden identificar y diferenciar de los de otros ténidos mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se extrae el intestino delgado lo antes posible tras la muerte y se atan sus extremos. Si el material no se congela o se fija con formalina (4-10%), se debería examinar rápidamente, ya que el parásito se puede digerir en unas 24 horas. La formalina no destruye los huevos. El intestino fresco se divide en varias secciones y se sumerge en solución salina a 37°C para realizar el examen. Los parásitos (ténidos o cestodes) adheridos a la pared intestinal se puede observar y hacer su recuento mediante una lupa manual (para E. granulosus y E. vogeli). Para realizar recuentos exactos, es mejor dividir el intestino no fijado en cuatro o seis secciones, abrirlas y sumergirlas en solución salina a 37ºC durante 30 minutos para liberar los parásitos. Los contenidos se lavan en otro contenedor para realizar su examen detallado, y la pared intestinal se raspa con una espátula. Todo el material se hierve y lava mediante un tamiz para eliminar la mayoría del material particulado. Los contenidos y raspados intestinales lavados se colocan en una bandeja negra y se cuentan los parásitos con ayuda de una lupa manual o un microscopio estereoscópico. Echinococcus granulosus se encuentra normalmente en el primer tercio del intestino delgado de los perros. •

Frotis mucosales

En la necropsia de zorros (o perros) para detectar E. multilocularis, los canales o los intestinos se deben congelar rápidamente y mantener congelados entre –70°C y –80°C durante 3–7 días antes de llevar a cabo la necropsia. Los huevos de E. multilocularis son resistentes a la congelación por debajo de –50C. Se deben realizar unos raspados mucosales profundos empleando portas para microscopio y el material adherente se transfiere a una placa Petri cuadrada de plástico. Los frotis se aplastan entre los portas y se examinan al microscopio de luz estereoscópica (‰120). Se recomienda realizar cinco frotis mucosales procedentes del tercio próximo, medio y posterior del intestino delgado (total 15). Echinococcus multilocularis se encuentra normalmente en la segunda mitad del intestino delgado. •

Conservación de muestras

Los cestodes intactos son frágiles y para los estudios morfológicos es mejor manejarlos en solución salina normal con una pipeta Pasteur. Se lavan para eliminar cualquier otro material y se dejan aproximadamente 30 minutos para que cese todo movimiento. Tras extraer el líquido, se añade formalina fría al 5–10% (5°C) o fijador FAA (etanol al 95% [80 ml], formaldehído al 37–40% [10 ml], y ácido acético glacial [5 ml]) y los gusanos se dejan durante otras 12 horas. Para la tinción, los parásitos se lavan en agua durante 15 minutos y se transfieren a Paracarmín de Mayer (ácido carmínico [1,0 g], cloruro de aluminio [0,5 g], cloruro cálcico [4,0 g], y etanol al 70% [100 ml]) durante 12–24 horas. Se elimina el exceso de colorante mediante su inmersión en una solución de ácido clorhídrico al 0,5–1,0% durante unos pocos segundos. La deshidratación se logra tras varios pases en concentraciones ascendentes de alcohol (35, 50, 70, 85, 95, 100%) al menos durante 15 minutoss en cada una de ellas, con dos cambios en la del 100%. El alcohol se extrae con xilol (10 minutos) y se aclara con metilsalicilato o creosota. Antes del montaje en un medio adecuado tal como bálsamo, picolyte, etc., se deberían devolver las muestras a xilol durante unos pocos minutos. Al menos una vez al año se aconseja examinar el suero de las personas implicadas en el análisis de estas muestras para detectar posibles anticuerpos anti-Echinococcus (22). Recientemente, se han desarrollado algunos métodos con el propósito de simplificar y mejorar las investigaciones epidemiológicas en las poblaciones de hospedadores definitivos y además permitir el diagnóstico de los animales vivos. Entre estos métodos están la detección de coproantígenos y la detección del ADN mediante PCR (véase más abajo).

c)

Vigilancia e investigaciones con arecolina La arecolina se ha utilizado para llevar a cabo investigaciones de las infecciones por gusanos planos en poblaciones caninas. En la actualidad su empleo como agente de control se ha reemplazado por praziquantel. La arecolina es un agente parasimpaticomimético. Su acción tiene como resultado la sudoración y estimulación de las glándulas salivares, lacrimales, gástricas, pancreáticas e intestinales.

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Capítulo 2.2.3. — Equinococosis/Hidatidosis

Provoca el incremento del tono intestinal y la movilidad del músculo liso, y este efecto es el responsable de la purga. El hígado es el lugar principal de detoxificación. La arecolina también ejerce una acción directa sobre el propio gusano, causa su parálisis, pero no la muerte, y así provoca que se relaje su fijación sobre la pared intestinal. Por tanto, se debe administrar por vía oral. La purgación consecuente expulsa a los parasitos (gusanos) con las heces. Es particularmente adecuada para los estudios de línea de base de E. granulosus, sin embargo, el 15–25% de los perros pueden no resultar purgados. En los animales, la purga con arecolina es de utilidad; de nuevo, los gusanos planos que se recuperen se identifican morfológicamente. Ya no se dispone de productos que contengan arecolina como antihelmíntico, pero se puede obtener de las empresas suministradoras de productos químicos. Como presenta efectos secundarios, se deberían excluir del tratamiento los animales viejos, enfermos o gestantes. Una dosis de 4 mg/kg debería conseguir la purgación en menos de 30 minutos. Los paseos y el masaje abdominal en los casos recalcitrantes o el enema para los perros estreñidos pueden evitar la utilización de una segunda dosis (2 mg/kg), que sólo se debería administrar con mucho cuidado. Los perros que han sido purgados con éxito pueden mostrar al menos dos deposiciones; la primera formará parte de las heces y puede ser ignorada, pero el moco que acompaña puede ser productivo. Este puede dividirse en varias muestras y cada una de ellas ser examinada por separado, pero este método no se recomienda ya que los gusanos serán difíciles de detectar. Preferiblemente, la muestra de moco (aproximadamente de 4 ml) se diluye con 100 ml de agua corriente, se cubre con una capa fina de 1 ml de queroseno (parafina) y se hierve durante 5 minutos. El queroseno evita la formación de espuma y reduce el olor. Los investigadores que llevan a cabo estos procedimientos están expuestos al riesgo de infección y enfermedad severa. El personal debería llevar puestos monos completos, botas, guantes desechables y máscara facial. Los monos se deberían lavar con agua hirviendo tras su utilización y las botas ser desinfectadas con una solución de hipoclorito sódico al 10%. La purga se debería hervir lo antes posible tras su recogida. Los perros pueden continuar excretando huevos, proglótides y parasitos (gusanos) después de la primera purga, por tanto, se aconseja que permanezcan atados durante 2 horas tras la purgación con acceso a agua para bebida. Tras la prueba con arecolina, la zona de tierra empleada para mantener atados a los perros se debería fumigar con queroseno y prender fuego.

d)

Pruebas de detección de coproantígenos Recientemente, se ha desarrollado una alternativa a la prueba con arecolina que se basa en la detección del antígeno fecal mediante un enzimoinmunoensayo (ELISA) de tipo sándwich que ha demostrado ser particularmente prometedora ya que los coproantígenos se pueden detectar poco tiempo después de la infección (10–14 días) y su nivel desciende rápidamente después de la expulsión de los gusanos. Se ha estimado que la sensibilidad y especificidad de la prueba es del 70% y del 98%, respectivamente (1, 3, 7, 8). A partir de la prueba con arecolina se pueden obtener tanto resultados cualitativos como cuantitativos, que resultan de lo más útil en los estudios epidemiológicos de línea básica sobre las tasas comparativas de infección con los ténidos en perros. Los estudios posteriores puede que demuestren que la prueba de detección de coproantígenos es más efectiva respecto al coste que la de arecolina durante la vigilancia rutinaria de E. granulosus en la población canina. Actualmente, se han desarrollado ELISAs1 para detectar el coproantígeno específico con suficiente especificidad y sensibilidad como para reemplazar a la prueba de arecolina en la detección de Echinococcus en perros y en otros hospedadores definitivos (3). Cuando se prueba para detectar los coproantígenos de Echinococcus específicos de género, la especificidad está próxima al 98% y en conjunto la sensibilidad es aproximadamente del 70%; sin embargo, cuando las cargas medias de parásitos (gusanos) son >50–100, la sensibilidad se aproxima al 100% (1, 3, 4, 8). Se han investigado con éxito los perros, dingos, zorros y lobos con ensayos del tipo ELISA de detección de coproantígenos y, significativamente, también se han detectado las infestaciones por el gusano E. multilocularis en zorros rojos y perros domésticos (8, 18). Cuando el ELISA de captura utiliza los anticuerpos anti-ES o los de las proglótides anti-somáticas dirigidos contra E. granulosus, se puede reducir la sensibilidad de detección de la infección debida a E. multilocularis, aunque la especificidad de género permanece intacta. Los ELISAs de coproantígenos basados en anticuerpos policlonales o monoclonales exhiben una sensibilidad y especificidad elevadas para detectar E. granulosus (~80%), incluso aunque se desarrollen para E. multilocularis (6, 18). Sin embargo, para cargas bajas de parásitos (gusanos) ( 0,6, se considera que el animal presenta seroconversión después de la vacunación. Si el título calculado es < 0,6, se considera que el animal no presenta suficiente nivel de anticuerpo. Como el método ELISA es una prueba de ensayo, se deberían realizar pruebas confirmativas de tipo FAVN o RFFIT con las muestras de suero con título < 0,6.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO Las vacunas contra la rabia preparadas de la cepa original 1885 de Pasteur y sus cepas derivadas (virus Pasteur, virus de desafío (challenge) estándar, Pitman-Moore, etc.), y de cepas aisladas más recientemente (Flury, Street-Alabama-Dufferin [SAD], Vnukovo y Kelev), protegen contra todas las cepas de genotipo 1 aisladas hasta la fecha. Las vacunas convencionales contra el virus de la rabia pueden no suministrar una adecuada protección cruzada contra otros lyssavirus; no existe protección contra el virus Mokola (31). Los principios que rigen la preparación de vacunas inactivadas contra la rabia son idénticos para las que se usan en humanos o en animales, aunque en las vacunas para uso en animales se puede añadir un adyuvante. En animales, las vacunas vivas también son eficaces por ruta oral y se pueden distribuir en cebos para inmunizar animales salvajes (o domésticos). También resultan eficaces las vacunas vivas recombinantes (por ejemplo, glicoproteína recombinante del virus de la rabia expresada en poxvirus) (25). Las normas para la producción de vacunas veterinarias se indican en el Capítulo I.1.7. Principios de producción de vacunas veterinarias. Las directrices dadas aquí y en el capítulo I.1.7. son de carácter general y pueden suplementarse con requisitos nacionales y regionales. Se aplican diferentes estándares a las vacunas con virus vivos modificados por pases en animales, huevos o cultivos celulares, para reducir su virulencia en el animal, que a las vacunas preparadas con virus inactivados. Ambos tipos de vacunas tienen sus ventajas e inconvenientes (5), pero los dos tipos pueden utilizarse para inmunizar a animales por períodos de entre 1 y 3 años. En algunos países no se aceptan las vacunas con virus vivos atenuados. No son adecuadas para proteger animales no vacunados previamente que se hayan expuesto a la infección (13). La eficacia de un tratamiento con vacuna sola después de la exposición solamente se ha demostrado en humanos, pero incluso en estos casos se recomienda administrar adicionalmente inmunoglobulina antirrábica. Toda manipulación del virus durante la producción y ensayo de las vacunas debe adaptarse a las estrictas precauciones de seguridad especificadas por la OMS (36, 37), la OIE (Capítulo I.1.6) y las directrices y normas nacionales.

1.

Control de inóculos

a)

Características del inóculo Resulta adecuada cualquier cepa de serotipo 1 que demuestre proteger contra los virus naturales de la rabia (que se encuentren actualmente en el país donde se va a usar la vacuna). La cepa de virus utilizada debe tener propiedades biológicas (patogenicidad) y antigénicas (tipadas por MAbs) bien conocidas. Si se emplea como vacuna viva, el inóculo primario de virus no debe causar rabia clínica. Deben probarse al menos dos animales (preferiblemente cinco o seis por grupo) de cada una de las especies a las que va dirigida la vacuna, y si fuera posible de cualquier especie que pueda estar en contacto con la vacuna o con animales vacunados. Esto se realiza inoculando en un nervio importante o en sus inmediaciones una dosis diez veces superior al título vírico contenido en una dosis del producto final propuesto. Los animales deben observarse por lo menos durante 90 días para cualquier efecto que se pueda atribuir al inóculo primario.

b)

Método de cultivo Se debe preparar y mantener a –70°C, o a temperatura inferior, un stock de células primarias del virus de inóculo, cuyos subcultivos se utilizarán para la producción de vacuna. La multiplicación del virus se comprueba por titulación durante el crecimiento del virus de inóculo.

c)

Validación como vacuna Antes de autorizar una vacuna deben establecerse evidencias de su eficacia mediante inoculaciones de desafío en los animales vacunados y en animales control de cada especie determinada. La prueba de desafío debe realizarse después de la vacunación, al final del período en que el fabricante manifiesta que

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Capítulo 2.2.5. — Rabia

se mantiene la inmunidad. La cinética de producción de anticuerpos debe determinarse también para establecer la correlación entre el título de anticuerpos y la resistencia al desafío. La eficacia de la vacuna producida se determina por estudios con cada especie a la que va dirigida, vacunada previamente según se recomiende. La protección al final del período de inmunidad se controla midiendo los anticuerpos neutralizantes específicos y por desafío con el virus de la rabia. Las condiciones experimentales de este desafío deben reflejar las condiciones naturales de la infección, aunque, desde un punto de vista práctico, puede resultar más fácil obtener un 100% de mortalidad en los animales control con una cepa del virus de la rabia bien conocida que con una aislada localmente. En los animales vacunados con vacunas inactivadas, el porcentaje de seroconversión y el nivel medio de anticuerpos permiten una buena prognosis para superar el desafío (3). Se debe establecer la correlación entre la potencia, en la especie en cuestión, y el valor antigénico determinado en ratones (ver Sección C.4.c. más adelante). A efectos de autorizar una vacuna, se deben realizar pruebas de seguridad en la especie a la que va dirigida. En el caso de las vacunas con virus vivos (incluyendo las vacunas recombinantes) que se utilizan en campañas de vacunación oral, las pruebas de seguridad también deben realizarse en aquellas otras especies que viven en las áreas de vacunación y que podrían estar expuestas a la vacuna (5). La estabilidad de la vacuna se determina probando lotes después de un almacenamiento dilatado, generalmente después de 1-2 años. A veces se utiliza un procedimiento de envejecimiento acelerado, manteniéndola a 37°C durante 1 semana. El tiempo de validez o vencimiento manifestado por el fabricante se comprueba por la autoridad nacional. En general es de 12-18 meses para las vacunas líquidas y posiblemente de 24 meses para las liofilizadas.

2.

Método de producción

Cualquiera que sea el método adoptado, se debe prestar una especial atención a la calidad del substrato. Tanto los animales como los huevos deben ser de un origen SPF, y los cultivos celulares, como las líneas BHK, deben cumplir con los estándares internacionales de esterilidad e inocuidad.

a)

En animales El virus se inocula intracerebralmente y cuando el animal muere en las fases terminales de la rabia se recoge el tejido nervioso. El virus se inactiva por métodos físicos, como irradiación con luz ultravioleta, o químicos, como la adición de fenol o beta-propiolactona. Las vacunas deben prepararse en animales jóvenes (ratones, corderos, etc.) para obtener gran rendimiento vírico y para reducir el contenido en mielina de la vacuna y otros efectos adversos asociados. En algunos casos el virus no se inactiva por completo, como por ejemplo en las vacunas de tipo Fermi tratadas con fenol, pero tales vacunas ya no se recomiendan.

b)

En huevos Se inocula una cepa modificada de virus, adaptada a huevos, en huevos embrionados de pollo SPF, que se incuban a 38°C durante 5-6 días. El virus se recoge en forma de tejidos embrionarios infecciosos y normalmente se liofiliza y se emplea como una vacuna viva. Ejemplos de estas vacunas son las que contienen el Flury de pocos pases en huevo (LEF), o la cepa variante más deseable de muchos pases en huevo (HEP), que es más segura para algunas especies animales como el gato.

c)

En cultivos celulares Los cultivos se infectan con cepas del virus de la rabia adaptadas al cultivo celular y se incuban a 35-36°C. Éstos se pueden utilizar como vacunas con virus vivos (como en las vacunas Flury y SAD) o como vacunas inactivadas después de la adición de fenol (vacuna Semple) o cualquier otro compuesto, como la betapropiolactona. Los cultivos también pueden utilizarse para obtener virus vectores (por ejemplo poxvirus) que lleven el gen que codifica la expresión de la glicoproteína del virus de la rabia (25). Durante la producción se controla la multiplicación de los virus en uno de los substratos antes mencionados y se recoge el virus al tiempo más apropiado, normalmente a los 4-6 días de la inoculación de los animales, los huevos o los cultivos celulares. El virus obtenido se suspende en una solución tamponada a una dilución que provoque una antigenicidad óptima. Si se necesita, la suspensión se inactiva o liofiliza. Se recomienda un adyuvante para vacunas con virus inactivados, así como para otros antígenos de la vacuna que puedan incorporarse a vacunas polivalentes.

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Capítulo 2.2.5. — Rabia

3.

Control del proceso

Consiste en el seguimiento del crecimiento vírico para obtener un título óptimo y asegurar la ausencia de contaminación microbiana indeseable. En vacunas con virus vivos, debe establecerse la cinética del crecimiento vírico para asegurar un título final de virus que se correlacione con la protección deseable de las especies concretas. En vacunas con virus inactivados, deben evaluarse las propiedades inmunogénicas del producto final por técnicas in vitro (por ejemplo, en ELISA, inmunodifusión en medio sólido, pruebas de unión a anticuerpo o tinción de células infectadas). Estas estimaciones indicarán el mejor tiempo para recoger los virus de los cultivos celulares.

4.

Control de lotes

a)

Esterilidad Las pruebas para esterilidad y ausencia de contaminación de los materiales biológicos se encuentran en el Capítulo I.1.5.

b)

Inocuidad Las pruebas de seguridad de los lotes de vacunas con virus inactivados se llevan a cabo mediante inoculación en cultivo celular o intracerebralmente en ratones para detectar virus viables. Para vacunas vivas contra la rabia, debe realizarse una prueba de seguridad adecuada para cada lote de vacuna en la especie hospedadora concreta. Por lo menos tres, y preferiblemente cinco o seis animales de la especie hospedadora en cuestión deben recibir una dosis equivalente a diez veces la dosis de campo recomendada por la ruta normal de administración. Los animales deben observarse durante 90 días para reacciones adversas atribuibles a la vacuna.

c)

Potencia La cantidad de virus presente en vacunas vivas atenuadas y en las recombinantes se determina por titulación. Una vez establecida una correlación entre la actividad de la vacuna en la especie a la que va dirigida y los títulos víricos, las titulaciones representan unos indicadores fiables de la eficacia de la vacuna. Esto se realiza utilizando cultivos celulares o por inoculación intracerebral de ratones lactantes (en ratones solo es posible con unos cuantos virus atenuados). Las vacunas recombinantes deben controlarse para la expresión de la proteína de la rabia hasta asegurar que la estabilidad de la expresión se mantiene en el proceso de producción. El título del vector puede usarse entonces como un indicador fiable de la eficacia de la vacuna. Para las vacunas con virus inactivados, la correlación entre la potencia en la especie a la que van dirigidas y el valor antigénico estimado en ratones representa un indicador fiable de la actividad de la vacuna. En EE.UU. la potencia de la vacuna se establece por la prueba del NIH (National Institutes of Health). En otras partes tiene gran aceptación la prueba de la Farmacopea Europea. De acuerdo con la Farmacopea Europea (20) se inoculan grupos de al menos diez ratones de 3-4 semanas con dosis decrecientes únicas de vacuna, o con dos dosis, separadas por 1 semana, según la prueba del NIH (37). Se compara un número suficiente de diluciones para determinar la dilución a la que el 50% de los ratones se protegen contra una inoculación intracerebral de desafío 14 días después (20, 37). Para la calibración de estándares nacionales existe una vacuna internacional estándar de la OMS (ver nota 2 a pie de página), de modo que los resultados de la prueba de antigenicidad se pueden expresar en IUs. La prueba no es válida a menos que: i)

Tanto para la vacuna examinada y la preparación estándar, la PD50 (dosis de protección al 50%) se encuentre entre la mayor y la menor dosis dada a los ratones.

ii)

La titulación de la suspensión del virus de desafío muestre que 0,03 ml de la suspensión contenía al menos 10 LD50. La dosis de desafío debe estar entre 12-50 LD50 para una prueba válida.

iii)

El intervalo de confianza (ρ = 0,95) para la prueba no debe ser menor del 25% ni superior al 400% de la potencia estimada: el análisis estadístico debe mostrar una notable pendiente sin desviaciones importantes de la linealidad o paralelismo de las líneas dosis-respuesta.

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Capítulo 2.2.5. — Rabia

La vacuna supera la prueba si la potencia estimada es superior a 1 IU por dosis o la potencia demostrada en la prueba de duración de la inmunidad para autorizar el producto es la dosis prescrita más pequeña. También se puede utilizar una prueba simplificada a efectos de anticipar qué vacunas es probable que tengan un valor antigénico > 1 IU por dosis (4). Esta prueba se emplea como prueba de investigación aproximada para reducir el número de ratones utilizados en las pruebas de control de la potencia de la vacuna.

d)

Duración de la inmunidad Debe establecerse la duración de la inmunidad inducida por el producto autorizado, en la especie a la que va dirigida, con un protocolo de vacunación definido. Después de esto, no se prueba cada lote (ver anteriormente Sección C.4.c.)

e)

Estabilidad Se debe comprobar por pruebas adecuadas el vencimiento (la caducidad) que se propone. Estos experimentos incluyen pruebas biológicas y de estabilidad físico-química, y deben realizarse sobre un número suficiente de lotes de vacuna mantenidos en las condiciones recomendadas. La termoestabilidad de las vacunas con virus vivos en forma líquida suele ser baja. En las vacunas liofilizadas con virus inactivados la estabilidad suele garantizarse por 2 años a 4°C.

f)

Conservantes Las vacunas con virus inactivados pueden tener conservantes (formalina, mertiolato). La naturaleza y cantidad de dichos conservantes debe cumplir las normas nacionales de control.

5.

Pruebas sobre el producto final

a)

Inocuidad Ver Sección C.4.b.

b)

Potencia Ver Sección C.4.c.

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* * *

NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Rabia (ver Cuadro en Parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar la página Web de la OIE para una lista más actualizada: www.oie.int).

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CAPÍTULO 2.2.6.

PARATUBERCULOSIS (Enfermedad de Johne)

RESUMEN La paratuberculosis (enfermedad de Johne) es una enteritis crónica de los ruimiantes causada por Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (M. paratuberculosis) (34). Identificación del agente: El diagnóstico de la paratuberculosis se divide en dos partes: el diagnóstico de la enfermedad clínica y la detección de la infección subclínica. Esto último es esencial para el control de la enfermedad en las explotaciones ganaderas, tanto a nivel nacional como internacional. El diagnóstico de la paratuberculosis se realiza sobre bases clínicas que después se confirman demostrando la presencia de M. paratuberculosis en las heces por microscopía, por cultivo o empleando sondas de ADN y la reacción en cadena de la polimerasa. El diagnóstico por necrosis (1) se lleva a cabo mediante la búsqueda de lesiones patognomónicas de la enfermedad en los intestinos, o simplemente (2) con la demostración de los típicos organismos ácido-resistentes en frotis de impresión de las lesiones o histológicamente, y mediante el aislamiento de M. paratuberculosis en cultivo. La detección de la infección subclínica se realiza mediante la detección serológica de anticuerpos específicos, o mediante cultivos de M. paratuberculosis procedentes de heces o tejidos recogidos en la necropsia, o por la demostración de respuesta mediada por células empleando la técnica del interferón gamma. La elección de la prueba depende de las circunstancias y el grado de sensibilidad requerido a nivel individual o a nivel de rebaño. Los cultivos de M. paratuberculosis se pueden obtener a partir de heces o tejidos, después de tratamiento descontaminante, mediante inoculación en medios artificiales con o sin el factor de crecimiento específico –micobactina- que es esencial para el crecimiento de M. paratuberculosis. Pruebas serológicas: El único problema grave en el control de la paratuberculosis es la dificultad de detectar la infección subclínica en los rumiantes. Las pruebas serológicas más habituales para la paratuberculosis en ganado vacuno son la fijación del complemento (FC), la técnica de enzimoinmunoensayo (ELISA) y la inmunodifusión en gel. La sensibilidad y la especificidad se determinan a menudo con referencia al cultivo de heces, el cual por si mismo es de sensibilidad incierta (3) en ganado vacuno infectado subclínicamente. Algunas pruebas, por ejemplo la FC y la técnica ELISA de absorción son muy adecuadas para confirmar el diagnóstico de paratuberculosis en vacas con síntomas clínicos típicos. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: En la fabricación de las vacunas para la paratuberculosis pueden emplearse bacterias vivas atenuadas o muertas a las que (4) se les incorpora un adyuvante o bien se liofilizan y se les adiciona el adyuvante, durante la reconstitución. El recuento celular es difícil y el contenido bacteriano de las vacunas se puede basar en el peso, mientras que la potencia de la vacuna puede estimarse mediante un conjunto de pruebas de desarrollo de capacidad sensibilizante,(5) empleando cobayas. La seguridad de la vacuna o anormal toxicidad también puede ser analizada en cobayas. Para las pruebas diagnósticas cutáneas, se emplean la tuberculina johnina y aviar que son derivados proteicos purificados (PPD) de cultivos tratados por calor de M. paratuberculosis o M. avium, respectivamente. El contenido de PPD en la johnina está estandarizado mediante ensayos químicos y su actividad biológica se identifica en cobayas sensibilizadas con M. paratuberculosis.

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Capítulo 2.2.6. — Paratuberculosis (enfermedad de Johne)

La actividad de la tuberculina aviar se determina en cobayas sensibilizadas con M. avium por comparación con una preparación de referencia calibrada en unidades internacionales.

A. INTRODUCCIÓN Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (M. paratuberculosis) es un organismo que fue observado por primera vez por Johne & Frothingham en 1895. Mycobacterium paratuberculosis causa paratuberculosis o enfermedad de Johne, una infección granulomatosa intestinal. La paratuberculosis, inicialmente reconocida en ganado vacuno, después en ovejas y posteriormente en cabras, se encuentra muy a menudo en rumiantes domésticos y silvestres y presenta una distribución global. Se ha descrito la enfermedad en caballos, cerdos, ciervos y alpacas, y recientemente en conejos, armiños, zorros y comadrejas (3, 10). En condiciones naturales, la enfermedad en vacas se transmite mediante ingestión de M. paratuberculosis a partir del ambiente contaminado. La enfermedad persiste después de la introducción de animales infectados. La infección puede transmitirse verticalmente al feto (16) y el semen puede infectarse con el organismo (31). La fuente primaria de contagio en terneros (6) es la leche procedente de vacas infectadas o leche contaminada con heces de bóvidos enfermos. La identificación de M. paratuberculosis se basa en su requerimiento de micobactina y su patogenicidad en el hospedador. La dependencia de micobactina se ha utilizado ampliamente como una característica taxonómica de M. paratuberculosis porque la mayoría de las micobacterias son capaces de sintetizar micobactina. Sin embargo, Mycobacterium paratuberculosis, M. silvaticum y algunos aislados primarios de M. avium carecen de esta capacidad y requieren micobactina para crecer en el laboratorio. Así, el requerimiento de micobactina no es exclusivo de M. paratuberculosis; esta característica existe en diferentes grados dentro del grupo de M. avium (33). Los síntomas clínicos de la paratuberculosis son debilitamiento lento y progresivo y trastornos diarreicos, que son intermitentes al principio y se hacen progresivamente más severos hasta su presencia constante en los bovinos (9). La diarrea es menos común en rumiantes pequeños. En las etapas tempranas de la infección, las lesiones se encuentran restringidas a las paredes del intestino delgado y provocan el drenaje de los nódulos linfáticos mesentéricos. Cuando progresa la enfermedad, las lesiones aparecen en el íleon, yeyuno, intestino delgado terminal, ciego (7) y colon y en los nódulos linfáticos mesentéricos. Mycobacterium paratuberculosis está presente en las lesiones y, finalmente, por todo el cuerpo. Las lesiones intestinales son responsables de la pérdida de proteínas y del síndrome de malabsorción proteica, lo que conduce a un desgaste muscular. Los síntomas clínicos habitualmente aparecen primero en la etapa adulta temprana pero la enfermedad puede presentarse en animales a cualquier edad por encima de 1-2 años. Después de unas pocas semanas de infección, comienza una fase de multiplicación de M. paratuberculosis en las paredes del intestino delgado. Dependiendo de la resistencia del individuo, esta infección se elimina o el animal permanece infectado como portador asintomático. La proporción de animales en estas categorías es desconocida. Una última fase de multiplicación de los organismos en una proporción de portadores, conduce a la extensión de las lesiones, la interferencia con el metabolismo intestinal y los síntomas clínicos de la enfermedad. Los portadores subclínicos excretan un número variable de M. paratuberculosis en las heces. En la mayoría de los casos se excreta un gran número organismos cuando se desarrolla la enfermedad clínica. La hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) se detecta tempranamente durante la infección y permanece presente en una proporción de los portadores asintomáticos, pero cuando la enfermedad progresa, la DTH decrece y puede estar ausente en los casos clínicos. Los anticuerpos séricos se detectan con posterioridad a la DTH. También pueden estar presentes en los portadores que se han recuperado de la infección. Los anticuerpos séricos están presentes de forma más constante y son de mayor título cuando las lesiones se extienden, reflejando la cantidad de antígeno presente. En las ovejas, puede haber una respuesta serológica detectable en los casos clínicos. Otras enfermedades e infecciones micobacteriales, incluyendo la tuberculosis de mamíferos y aves, causa DTH y la presencia de anticuerpos séricos. Por tanto, estas enfermedades necesitan ser diferenciadas de la paratuberculosis y de la infección por M. paratuberculosis, tanto clínicamente como mediante el uso de pruebas diagnósticas específicas. La exposición a micobacterias saprófitas del ambiente puede también sensibilizar al ganado, provocando reacciones de DTH inespecíficas. Los animales vacunados contra la paratuberculosis desarrollan tanto DTH como anticuerpos séricos. La vacunación ayuda a prevenir la enfermedad clínica pero no evita necesariamente la infección. También interfiere con programas de diagnóstico y control de la tuberculosis bovina. Así, si se necesita diagnosticar la infección en los vacunados, sólo se pueden usar pruebas de detección de M. paratuberculosis en las heces (14).

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Capítulo 2.2.6. — Paratuberculosis (enfermedad de Johne)

En animales individuales, especialmente procedentes de una explotación ganadera en la que previamente no ha sido diagnosticada la enfermedad, un diagnóstico clínico presuntivo puede confirmarse mediante pruebas de laboratorio. Sin embargo, el diagnostico definitivo puede ser garantizado en base a fundamentos clínicos sólo si los síntomas clínicos son típicos y la enfermedad es reconocida como presente en el rebaño. La confirmación de paratuberculosis depende del descubrimiento de lesiones gruesas con la demostración de los típicos organismos ácido-resistentes en frotis de impresión o por la aparición de las lesiones patognomónicas microscópicas y el aislamiento en cultivo de M. Paratuberculosis

B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO Para diagnosticar la presencia de paratuberculosis en un animal individual clínicamente sospechoso, pueden utilizarse varias pruebas de laboratorio que incluyen: frotis fecales, cultivos fecales y de tejidos, sondas de ADN que emplean materiales fecales o tejidos, pruebas serológicas, de necropsia (9) e histológicas. En los rebaños se llevan a cabo pruebas de detección de la infección subclínica para determinar la prevalencia de la infección, normalmente con la finalidad de establecer medidas de control. Como ninguna prueba es 100% sensible o específica, el control de la enfermedad por eliminación de los reactivo-positivos se realiza con pruebas repetidas a intervalos de 6 meses o de un año durante varios años y la eliminación de los reactivopositivos a las pruebas serológicas o vertidos fecales; también se considera prudente la separación de la descendencia de las hembras reactivas. Incluso estos procedimientos no siempre tienen éxito sin cambios en los hábitos de higiene y en el manejo del ganado para reducir la transmisión de la infección en el rebaño (2).

1.

Identificación del agente

a)

Necropsia La paratuberculosis no puede ser diagnosticada en un examen superficial de los intestinos buscando síntomas de engrosamiento. Los intestinos deben ser abiertos desde el duodeno al recto para exponer la mucosa. No existe una relación estrecha entre la gravedad de los síntomas clínicos y la extensión de las lesiones intestinales. La mucosa, especialmente del íleon terminal, se inspecciona para detectar el plegamiento y engrosamiento patognomónico. Las lesiones tempranas se ven manteniendo el intestino hacia la luz, entonces pueden visualizarse las placas discontinuas. Los nódulos linfáticos mesentéricos pueden ser prominentes y edematosos. Los frotis de la mucosa afectada y los cortes superficiales de los nódulos linfáticos deben teñirse por el método de Ziehl–Neelsen y examinarse microscópicamente para observar los organismos ácido-resistentes que tienen la morfología característica de M. paratuberculosis. Sin embargo, los organismos ácido-resistentes no están presentes en todos los casos. Es por tanto mejor confirmar el diagnóstico recogiendo múltiples muestras de pared intestinal y de nódulos linfáticos mesentéricos en un fijador (solución salina con formol al 10%) para el subsiguiente examen histológico. Deben examinarse las secciones teñidas con hematoxilina-eosina y las secciones teñidas según el método de Ziehl–Neelsen. Las lesiones patognomónicas consisten en la infiltración de la lámina propia, las placas de Peyer y el cortex de los nódulos linfáticos mesentéricos con células epiteloides grandes, teñidas pálidamente y células multinucleadas gigantes de Langhans, en las que se encuentran habitualmente, pero no invariablemente, bacilos ácido-resistentes en agregados o de forma aislada. Las células gigantes de Langhans no son inusuales y contienen algunos organismos. Las lesiones en ovejas y cabras son similares a las observadas en vacas. A menudo, hay sólo un ligero engrosamiento e inflamación de la mucosa, pero a veces se forman nódulos de caseificación y calcificación en el intestino y los nódulos linfáticos asociados. El aumento de tamaño de los nódulos linfáticos mesentéricos ha sido observado en alpacas. En ocasiones se ha observado la forma pigmentada de la paratuberculosis en ovejas.

b)

Bacteriología (microscopía) Los frotis fecales teñidos según el método de Ziehl–Neelsen se examinan al microscopio. Se puede diagnosticar paratuberculosis si se encuentran agregados (tres o más organismos) de pequeños (0,5–1,5 µm) y fuertemente teñidos bacilos ácido-resistentes. La presencia de bacilos ácido-resistentes aislados en ausencia de agregados no permite un diagnóstico definitivo. La desventaja de esta prueba es que sólo un tercio aproximado de los casos puede confirmarse mediante examen microscópico de una muestra fecal única.

c)

Bacteriología (cultivo) La infección por Mycobacterium paratuberculosis afecta principalmente a la parte final del intestino delgado y ciego adyacente. Las bacterias Mycobacterium paratuberculosis están en un número muy superior al de otras bacterias en muestras de heces y tejidos intestinales.

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Capítulo 2.2.6. — Paratuberculosis (enfermedad de Johne)

Las colonias primarias de M. paratuberculosis pueden aparecer en cualquier momento a partir de las 5 a 14 semanas, después de la inoculación. Las colonias primarias en el medio de Herrold conteniendo micobactina1 son muy pequeñas (1 mm de diámetro), incoloras, translúcidas y hemisféricas. Son redondas y de contorno liso y sus superficies son suaves y brillantes. Cuando prosigue la incubación, las colonias se hacen más opacas y aumentan de tamaño (4 o 5 mm). La morfología colonial cambia con la edad de suave a rugosa y de hemisférica a mamilar (32). La inusual cepa pigmentada amarilla brillante de ovejas es difícil de crecer en medio artificial. Se ha descrito que las cepas no pigmentadas de oveja crecen peor que las cepas bovinas, pero no se deberían descartar cultivos como negativos sin realizar una incubación prolongada. Para la identificación de M. paratuberculosis, se deben realizar resiembras empleando pequeños inóculos de las colonias sospechosas en el mismo medio con o sin micobactina, para demostrar la dependencia a la micobactina. (Las pruebas no son fiables si está presente un gran número de bacilos). Hay dos métodos básicos para cultivar M. paratuberculosis a partir de muestras clínicas: el método que emplea ácido oxálico y NaOH para la descontaminación y el medio Löwenstein–Jensen para el crecimiento, y el método que emplea cloruro de hexadecilpiridinio (HPC) para la descontaminación en combinación con el medio de yema de huevo de Herrold (HEYM) para el crecimiento. Ambos medios contienen micobactina. •

Medios

Ejemplos de medios adecuados son: i)

Medio de yema de huevo de Herrold con micobactina (19) Para 1 litro de medio: 9 g de peptona; 4,5 g de cloruro sódico; 2,7 g de extracto de buey; 27 ml de glicerol; 4,1 g de piruvato sódico; 15,3 g de agar; 2 mg de micobactina; 870 ml de agua destilada; seis yemas de huevo (120 ml); y 5,1 ml de una solución acuosa de verde de malaquita al 2%. Se miden los primeros seis ingredientes y se disuelve calentando en el agua destilada. Se ajusta el pH del medio líquido a 6,9–7,0 usando NaOH al 4%, y se prueba para asegurar que el pH de la fase sólida es de 7,2–7,3. Se añade la micobactina y se disuelve en 4 ml de alcohol etílico. Se autoclava a 121°C durante 25 minutos. Se enfría hasta 56°C y de forma aséptica se añaden seis yemas de huevo estériles2 y la solución estéril de verde de malaquita. Se mezcla suavemente y se distribuye en tubos estériles. Se puede añadir 50 mg de cloranfenicol, 100.000 U de penicilina y 50 mg de anfotericina B.

ii)

Medio modificado de Dubos (28) Para 1 litro de medio: 2,5 g de casaminoácidos de Difco; 0,3 g de asparragina; 2,5 g de fosfato disódico anhidro; 1 g de fosfato monopotásico; 1,5 g de citrato sódico; 0,6 g de sulfato magnésico cristalino; 25 ml de glicerol; 50 ml de una solución al 1% de Tween 80; y 15 g de agar. Disolver cada sal en agua destilada con un suave calentamiento y llevar hasta 800 ml. Añadir micobactina en una solución alcohólica al 0,05% (2 mg disueltos en 4 ml de alcohol etílico), calentar el medio a 100°C hasta ebullición, y después esterilizar en autoclave a 115°C durante 15 minutos. Enfriar hasta 56°C en un baño de agua, añadir los antibióticos (100.000 U de penicilina; 50 mg de cloranfenicol; y 50 mg de anfotericina B) y suero (200 ml suero bovino esterilizado por filtración a través de un equipo Seitz ‘EX’ e inactivado calentando a 56°C durante 1 hora). El medio se mezcla minuciosamente y entonces se distribuye en tubos estériles. Una ventaja de este medio es que es transparente, lo cual facilita la detección temprana de las colonias.

1 2

380

iii)

Medio Middlebrook 7H9, 7H10 y 7H11 (Difco), y medio Bactec 7H12 enriquecido con micobactina en la misma proporción que para el medio de Herrold pueden ser también usados. La ventaja de este medio es que es transparente, lo cual facilita la detección temprana de las colonias.

iv)

Medio Löwenstein–Jensen con o sin micobactina (13).

La micobactina se puede obtener comercialmente (mycobactin J) a partir de Allied Monitor, P.O. Box 71, 201 Golden Drive, Fayette, MO 65248, USA, o Symbiotic Society, 299 av. Jean Jaurès, 69007 Lyon, Francia. Use huevos frescos sin que hayan transcurrido más de 2 días desde su puesta y que no hayan recibido antibióticos. Con un cepillo, limpie los huevos con agua y detergente. Enjuage con agua y coloque los huevos en alcohol de 70° durante 30 minutos. Séquelos insertándolos entre dos toallas estériles. Con unos fórceps de diente de rata estériles, chasque un extremo de la cáscara, haciendo un agujero de aproximadamente 10 mm y elimine la clara con ayuda de los fórceps y de la gravedad. Agrande el agujero y rompa la yema. Mezcle la yema de huevo y elimine el vitelo. Vierta la yema de huevo mezclada en el medio.

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Capítulo 2.2.6. — Paratuberculosis (enfermedad de Johne)

•

Preparación de la muestra

Aunque el cultivo de materia fecal es técnicamente complicado y lento, sigue siendo un método adecuado para el diagnóstico de paratuberculosis en animales vivos. Es la única prueba que no produce resultados falso-positivos (100% de especificidad). Detectará animales infectados 6 meses o más antes de que desarrollen los síntomas clínicos, y durante la etapa clínica su sensibilidad se aproxima al 100%.

•

Procesamiento de las muestras de tejido No se deben emplear conservantes químicos. Los tejidos pueden ser congelados a –20°C. Para evitar la contaminación, se deben eliminar las heces de las porciones del tracto intestinal antes de su envío al laboratorio.

i)

Digestión de los tejidos Aproximadamente 4 g de mucosa de la válvula íleocecal o 4 g de nódulo mesentérico se introducen en una jarra batidora estéril conteniendo 50 ml de tripsina (2,5%). La mezcla se ajusta hasta neutralidad con NaOH al 4% y papel de pH, agitándose durante 30 minutos a temperatura ambiente con un agitador magnético. La mezcla digerida se filtra a través de gasa. El filtrado se centrifuga aproximadamente a 2.000–3.000 g durante 30 minutos. El sobrenadante se extrae y se desecha.

ii)

Descontaminación del inóculo. El precipitado se resuspende en 20 ml de HPC al 0,75% y se mantiene estático durante 18 horas a temperatura ambiente. Las partículas que precipitan al fondo del tubo se emplearán como inóculo y serán extraídas con una pipeta sin remover el sobrenadante. Se pueden utilizar otros métodos de descontaminación, como por ejemplo el tratamiento con ácido oxálico al 5%.

iii)

Inoculación del medio de cultivo e incubación Se transfieren aproximadamente 0,1 ml de inóculo a cada tres tubos de agar inclinado con medio de Herrold conteniendo micobactina y a un tubo sin micobactina. El inóculo se distribuye uniformemente sobre la superficie inclinada de los tubos. Los tubos permanecerán en posición inclinada a 37°C durante aproximadamente 1 semana con los tapones de rosca aflojados. Los tubos se pondrán en posición vertical una vez que se haya evaporado la humedad libre de la superficie. Se aprietan los tapones y los tubos se colocan en cestos y se incuban a 37°C. El huevo del medio de Herrold contribuye con suficientes fosfolípidos a neutralizar la actividad bactericida del HPC residual en el inóculo. Los otros medios (Dubos modificado y Middlebrook) no tienen esta propiedad. Se pueden utilizar otros tratamientos para la descontaminación de la muestra, por ejemplo ácido oxálico al 5%. El HPC es relativamente ineficaz para controlar el crecimiento de hongos contaminantes. Merkal & Richards (22) encontraron que la anfotericina B (fungizona) resulta efectiva para impedir el desarrollo fúngico en los medios inoculados. La fungizona puede incorporarse en el medio de Herrold a una concentración final de 50 µg por ml de medio. Debido a la pérdida de actividad antifúngica, el almacenamiento del medio de Herrold conteniendo fungizona debe limitarse a 1 mes a 4°C. Los tubos de agar inclinado se incuban durante 15–20 semanas y se observan semanalmente a partir de la sexta semana en adelante.

•

Procesamiento de las muestras fecales No se emplean refrigerantes ni conservantes químicos. Las muestras fecales pueden congelarse a –70°C.

i)

Suspensión y descontaminación de las heces 1 g de heces se transfiere a un tubo de 50 ml conteniendo 20 ml de agua destilada estéril. Se agita la mezcla durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las partículas de mayor tamaño sedimentarán a los 30 minutos. Los 5 ml de la parte superior de la suspensión de heces se transfieren a un tubo de 50 ml conteniendo 20 ml de HPC. Se invierte la posición del tubo varias veces para asegurar una distribución homogénea y se mantiene estático durante 18 horas a temperatura ambiente.

ii)

Inoculación del medio de cultivo 0,1 ml del sedimento que ha permanecido estático se transfiere a cada uno de cuatro tubos de agar inclinado conteniendo medio de Herrold, tres con micobactina y uno sin ella. Se puede realizar un frotis del sedimento tiñendo la muestra según el método de Ziehl–Neelsen.

iii)

Incubación y observación de los tubos de agar inclinado Lo mismo que para las muestras de tejido.

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Capítulo 2.2.6. — Paratuberculosis (enfermedad de Johne)

Se han descrito variaciones de los métodos anteriores (4, 15, 21, 24, 27, 38, 39). La sensibilidad del cultivo puede aumentar usando medios líquidos y centrifugación en lugar de técnicas de sedimentación. El método de la doble incubación ayuda a la descontaminación del inóculo (30). Una técnica más rápida para el aislamiento de M. paratuberculosis emplea un sistema radiométrico de detección, the Bactec 460. El crecimiento de las micobacterias se valora mediante la liberación de 14CO2 a partir de palmitato como consecuencia del metabolismo bacteriano. Sin embargo, como este sistema está basado en la radiometría, no es posible su uso en algunos laboratorios y en otros ha sido reemplazado. Recientemente se han comenzado a emplear tres métodos rápidos basados en fluorescencia, el sistema Bactec 960, el sistema MGIT (Mycobacterial Growth Indicator Tube) (tubo indicador del crecimiento de micobacterias) (Becton Dickinson) y el sistema MBBact (Organon Technica). Durante los experimentos iniciales surgieron serios problemas cuando se probaron estos métodos con muestras fecales, debido al desarrollo de otras bacterias (formas esporuladas y hongos); sin embargo, estos métodos se han desarrollado posteriormente y hoy en día se emplean con bastante éxito en muchos laboratorios.

d)

Sondas de ADN Se han desarrollado sondas de ADN que permiten detectar M. paratuberculosis en el diagnóstico de muestras e identificar rápidamente las bacterias aisladas (8, 20). Se han empleado para diferenciar M. paratuberculosis de otras micobacterias, especialmente aquéllas del grupo de M. avium . McFadden et al. han identificado una secuencia (17, 18), denominada IS900, que es una secuencia específica de inserción de M. paratuberculosis. Se ha descrito que un pequeño número de aislados distintos a M. paratuberculosis producen productos amplificados del mismo tamaño que el esperado en el caso de M. paratuberculosis. Se puede aplicar la digestión con enzimas de restricción a los productos positivos IS900 para confirmar que su secuencia corresponde a la de M. paratuberculosis (5). Se ha publicado la utilización de la IS900 como sonda de ADN para la identificación específica de M. paratuberculosis en muestras fecales de ganado vacuno mediante la amplificación enzimática del ADN empleando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (36). Se ha desarrollado una prueba diagnóstica comercial basada en la detección de las secuencias IS900 después de el aislamiento de las micobacterias a partir de muestras fecales y el enriquecimiento de la fracción de ADN correspondiente a las secuencias IS900 mediante PCR. La prueba está disponible en forma de kit3 adecuado para uso en laboratorios. Presenta una reducida sensibilidad diagnóstica comparada con los cultivos fecales. Actualmente se dispone de otro kit, PCR Adiavet Paratb3.

2.

Pruebas serológicas

Las pruebas serológicas usadas habitualmente para la paratuberculosis en ganado vacuno son la fijación del complemento (FC), la técnica de enzimoinmunoensayo (ELISA) y la inmunodifusión en gel de agar (IGDA) (29) en lo referente a inmunidad humoral, y la técnica del interferón gamma cuando se trata de inmunidad celular.

a)

Prueba de fijación del complemento La prueba FC ha sido durante muchos años la prueba estándar empleada en bóvidos. La prueba FC es adecuada cuando se trata de animales clínicamente sospechosos, pero no presenta suficiente especificidad para fiarse de su uso con propósitos de control en la población general. Sin embargo, a menudo es solicitada por países que importan ganado. Se usan internacionalmente una variedad de procedimientos de la prueba FC. Un ejemplo de un método de microtitulación mediante FC es como sigue:

3

382

i)

Se emplea como antígeno un extracto acuoso de la bacteria del que se han eliminado los lípidos (cepa M. paratuberculosis 316F). También se puede usar Mycobacterium avium D9.

ii)

Todos los sueros se inactivan en un baño de agua a 60°C durante 30 minutos y se diluyen 1/4, 1/8 y 1/16. Para cada placa se debe incluir un suero control positivo y un suero control negativo. También se preparan los siguientes controles: antígeno control, complemento control y control de sistema hemolítico.

iii)

El complemento liofilizado y reconstituido se diluye hasta contener seis veces H50 (dosis hemolítica 50%) calculándose mediante titulación frente al antígeno.

iv)

Los eritrocitos de oveja, 2.5%, se sensibilizan con 2 unidades de H100 hemolisina.

v)

Todas las diluciones y reactivos se preparan en tampón veronal calico/magnesio; se distribuyen volúmenes de 25 µl de cada reactivo en placas de microtitulación de 96 pocillos de fondo redondo.

Kit de pruebas IDEXX DNA Probe para la detección de Mycobaterium paratuberculosis o el kit PCR Adiavet Paratb.

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Capítulo 2.2.6. — Paratuberculosis (enfermedad de Johne)

b)

vi)

La incubación primaria es a 4°C toda la noche y la incubación secundaria es a 37°C durante 30 minutos.

vii)

Lectura e interpretación de resultados: Se pueden dejar las placas hasta que sedimenten o centrifugarse e interpretarse como se indica a continuación: 4 = 100% fijación, 3 = 75% fijación, 2 = 50% fijación, 1 = 25% fijación y 0 = hemolisis completa. El título del suero problema será el recíproco de la dilución mayor de suero que provoca el 50% de fijación. Una reacción de 2 en la dilución 1/8 se considera positiva. Los resultados deben interpretarse en relación a los síntomas clínicos y a otros descubrimientos de laboratorio.

Técnica de enzimoinmunoensayo La técnica ELISA es, hasta el momento, la prueba más sensible y específica para ensayos de anticuerpos séricos contra M. paratuberculosis. Su sensibilidad es comparable con la de la prueba FC en los casos clínicos, pero es mayor que la de FC en portadores asintomáticos. La especificidad de la prueba ELISA se incrementa mediante la absorción de sueros a M. phlei. El ELISA de absorción ideado por Yokomizo et al. (43, 44) y modificado por Milner et al. (23), fue desarrollado en forma de kit comercial por Cox et al. (6). Este kit fue evaluado por Ridge et al. (25), y se encontró que tenía una sensibilidad en casos clínicos del 88,3%, y en casos subclínicos del 48,8%, y una especificidad del 99,8% en vacas, y en ovejas una sensibilidad del 35–54% y una especificidad del 98,2– 98,5%. Sin embargo, otros investigadores han encontrado una sensibilidad y especificidad menor (40). El ELISA de absorción combina la sensibilidad del ELISA con la especificidad añadida de una etapa de absorción. Los sueros a analizar se diluyen en un tampón que contiene un antígeno soluble de M. phlei antes de ser ensayados mediante un ELISA indirecto El procedimiento elimina los anticuerpos que provocan reacciones cruzadas inespecíficas. En versiones anteriores, los sueros se absorbían a M. phlei completo que se eliminaba por centrifugación antes de la prueba. Se ha desarrollado un formato de placa de microtitulación en el que el antígeno M. paratuberculosis recubre los 96 pocillos de las placas. Las muestras se diluyen en diluyente de muestra conteniendo M. phlei para eliminar los anticuerpos que provocan reacción cruzada. Durante la incubación en los pocillos de la muestra diluida, el anticuerpo específico contra M. paratuberculosis forma un complejo con los antígenos ligados a los pocillos. Después de lavar para eliminar los materiales no unidos en los pocillos, se adiciona inmunoglobulina anti-bovina marcada con peroxidasa de rábano (HPRO). Esto reacciona con las inmunoglobulinas unidas al antígeno de la fase sólida. La tasa de conversión del sustrato es proporcional a la cantidad de inmunoglobulina unida. El color desarrollado, medido (a 450 nm) espectrofotométricamente es proporcional a la cantidad de anticuerpo presente en la muestra problema. El antígeno usado para recubrir las placas ELISA está disponible comercialmente. Como conjugado se emplea una IgG anti-bovina marcada con HRPO. La solución sustrato-cromogénica es peroxido de hidrógeno tetrametil benzidina. Se emplea una solución de H2SO4 0,5 M para parar la reacción cuando la absorbancia del suero control positivo alcanza un punto predeterminado. Se dispone comercialmente de varios kits ELISA de absorción. En las instrucciones que acompañan al kit comercial se describe detalladamente el método y materiales necesarios para realizar la prueba, la interpretación de los resultados y los cálculos. El procedimiento es el mismo que el de cualquier ELISA de rutina. En las pruebas de chequeo se emplea habitualmente un pocillo para cada suero, pero son poco fiables, y las pruebas diagnósticas deben ser realizadas en pocillos por duplicado.

c)

Prueba de inmunodifusión en gel de agar La prueba IGDA es útil para confirmar la enfermedad en vacas, ovejas y cabras clínicamente sospechosas. (26). Están en uso diversas variaciones de este método. El antígeno empleado es un extracto protoplásmico crudo de una cepa de laboratorio de M. avium 18 (anteriormente M. paratuberculosis 18) preparado mediante rotura celular en un fraccionador de células a presión hidráulica. Las células se rompen y centrifugan a 40.000 g durante 2 horas para eliminar los restos de paredes celulares, y la fracción sobrenadante se conserva y liofiliza. Este antígeno se resuspende en agua a una concentración de 10 mg/ml. La agarosa se disuelve en tampón barbital, pH 8,6, conteniendo azida sódica, hasta una concentración final de agarosa de 0,75%. La agarosa puede ser vertida en placas Petri o en portas. Se cortan los pocillos según un modelo hexagonal. Los pocillos son de 4 mm de diámetro, con una separación de 4 mm y el agar debe tener 3–4 mm de profundidad. El antígeno se añade en el centro de los pocillos. Los sueros problema, control positivo y negativo se adicionan a pocillos periféricos alternos.

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Capítulo 2.2.6. — Paratuberculosis (enfermedad de Johne)

Las placas se incuban en una cámara húmeda a temperatura ambiente. Los geles se examinan para observar las líneas de precipitación después de 24 y 48 horas de incubación. La aparición de una o más línea(s) de precipitación definida(s), mostrando identidad con aquélla de un suero positivo control, antes o a las 48 horas, constituye un resultado de prueba positivo. La ausencia de cualquier línea de precipitación es considerada como un resultado de prueba negativo. Se pueden producir líneas inespecíficas.

3.

Pruebas de inmunidad mediada por células

a)

Técnica del interferón gamma Esta técnica se basa en la liberación de interferón gamma a partir de linfocitos sensibilizados durante un periodo de incubación de 18–36-horas con antígeno específico (tuberculina del tipo derivado proteico purificado [PPD] aviar, tuberculina PPD bovina o johnina) (42). La detección cuantitativa del interferón gamma bovino se lleva a cabo mediante un ELISA tipo sandwich que emplea dos anticuerpos monoclonales para el interferón gamma bovino. La sensibilidad y especificidad puede compararse con la reacción cutánea de la tuberculina. Se ha desarrollado una prueba diagnóstica comercial basada en la detección de interferón gamma. En las instrucciones que acompañan al kit4 comercial se describe detalladamente el método y materiales necesarios para realizar la prueba, la interpretación de los resultados y los cálculos.

b)

Hipersensibilidad de tipo retardado La prueba de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) es una medida de inmunidad mediada por células, pero tiene un valor limitado. La prueba se realiza mediante la inoculación intradérmica de 0,1 ml de tuberculina PPD aviar5 o johnina (la tuberculina aviar y la johnina son de una sensibilidad y especificidad comparable) en una zona esquilada o afeitada, normalmente en el costado del tercio medio del cuello. El grosor de la piel se mide con un calibrador antes y 72 horas después de la inoculación. Los aumentos del grosor de piel por encima de 2 mm se considerarán indicativos de la presencia de DTH. Debe destacarse que las reacciones positivas en los ciervos pueden tener apariencia de placas difusas más que inflamaciones localizadas discretas, lo que dificulta la interpretación de los resultados. La presencia de cualquier inflamación en estas especies debe ser considerada como positiva. Sin embargo, la sensibilización hacia el complejo M. avium está muy extendida en animales, y ni la tuberculina aviar ni la johnina son muy específicas (12). Una prueba en una explotación ganadera únicamente da idea del número de animales sensibilizados y puede así ser usada sólo como una prueba preliminar previa a la iniciación de un programa de control.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO Vacunas: Las vacunas empleadas contra la paratuberculosis son: vivas, atenuadas, con aceite y piedra pómez incorporados; liofilizadas, vivas, atenuadas que pueden emplear como adyuvante, por ejemplo, aceite adicionado en la reconstitución; y bacterinas muertas por tratamiento térmico. Las vacunas se pueden preparar a partir de una cepa de M. paratuberculosis 316F o 2E (Weybridge) o M. paratuberculosis 3 y 5 o II (cepas Canadienses), o las tres juntas. La información que se indica más adelante tiene aplicación para el caso de una vacuna viva atenuada adyuvada con aceite y piedra pómez (7, 35, 41). La vacunación puede causar una reacción en la zona de inyección. La vacunación también puede interferir con los programas de erradicación basados en la eliminación de los animales infectados y puede interferir con la interpretación de las pruebas cutáneas de DTH de la tuberculosis bovina. Productos diagnósticos: La PPD johnina es una preparación de los productos tratados por calor del crecimiento y lisis de M. paratuberculosis. La tuberculina PPD aviar es una preparación de productos tratados por calor del crecimiento y lisis de M. avium D4ER o TB 56. Los detalles de la tuberculina PPD aviar están en el Capítulo 2.7.8. Tuberculosis aviar. Estas dos preparaciones se emplean, mediante inyección intradérmica, para revelar DTH como una medida de identificación de animales infectados o sensibilizados con M. paratuberculosis. Las directrices a seguir para la producción de vacunas de interés veterinario se indican en el Capítulo I.1.7. Principios de producción de vacunas veterinarias. Las directrices dadas aquí y en el Capítulo I.1.7 pretenden ser en esencia generales y pueden ser complementadas ante requerimientos regionales y nacionales.

4 5

384

Kit de pruebas Mycobacterium paratuberculosis gamma-interferon, CSL Limited (Veterinary), 45 Poplar Road, Parkville, Victoria 3052, Australia. La tuberculina aviar puede obtenerse de VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey KT15 3NB, Reino Unido, o a partir de Symbiotic Society, 299 av. Jean Jaurès, 69007 Lyon, Francia.

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Capítulo 2.2.6. — Paratuberculosis (enfermedad de Johne)

1.

Control del inóculo

a)

Características del inóculo Vacuna: Las cepas del inóculo deben ser de un tipo prevalente, que puede ser comprobado mediante biotipado o análisis genético. Debe haberse demostrado que son inocuas al administrarse siguiendo la ruta de vacunación recomendada para las especies diana a las que va dirigida. Johnina: Las cepas de M. paratuberculosis empleadas para preparar los cultivos del inóculo deben identificarse mediante biotipado o análisis genético. Debe demostrarse que están libres de organismos contaminantes.

b)

Método de cultivo Vacuna: Los cultivos del inóculo se pueden hacer empleando cortes de patata parcialmente inmersos en un medio adecuado, como por ejemplo el medio sintético de Reid6 (37). Los cultivos deben almacenarse liofilizados. Los cultivos activos se incuban normalmente a 37°C. Johnina: Debe demostrarse que el sustrato del cultivo es capaz de proporcionar un producto libre de sustancias reconocidas que puedan causar reacciones tóxicas o alérgicas. Un medio adecuado para cultivar el inóculo es el medio de Reid, solidificado con agar al 1,75%, en tubos de tapón de rosca. Los cultivos también pueden almacenarse liofilizados.

c)

Validación como vacuna Vacuna: Las pruebas de pureza deben realizarse en los cultivos del inóculo y la masa microbiana final mediante frotis teñidos. La vacuna debería ser utilizada como una parte del programa de control y no proporcionará por ella misma una protección completa evitando la enfermedad causada por M. paratuberculosis (41). Normalmente hay un buen control de la enfermedad clínica pero la infección subclínica persiste en los ganados vacunados aunque a un nivel reducido. La vacuna debe ser administrada a los animales sólo en etapas tempranas de la vida, p. ej. terneros en su primer mes de vida. Debe inocularse subcutáneamente y causa una pequeña inflamación. Gradualmente se sustituye por un nódulo fibro-caseificado, indoloro y frío, que varía en su tamaño y podrá persistir a lo largo de los años. Se ha empleado la vacunación para controlar la enfermedad en ovejas y cabras, incluyendo animales de mayor edad. Con el objeto de conseguir los mejores resultados de la vacunación, son también oportunas las prácticas de manipulación para el control de la enfermedad. El uso de vacunas puede interferir con el resultado de las pruebas diagnósticas cutáneas para la tuberculosis. Esto debería tenerse en cuenta cuando se planifica un programa de control (11). Johnina: Deben examinarse los cultivos mediante frotis teñidos para detectar la presencia de organismos contaminantes. Para probar la falta de efecto sensibilizador, a tres cobayas que no hayan sido tratados previamente con ningún material que pueda interferir en la prueba, se les aplican inyecciones intradérmicas en tres ocasiones a intervalos de 5 días, con 0,01 mg de la preparación que se está probando en un volumen de 0,1 ml. Cada cobaya, junto con cada uno de los tres cobayas control que no ha sido inyectado previamente, es inyectado intradérmicamente 15–21 días después de la tercera inyección con la misma dosis de la misma johnina. Las reacciones de los dos grupos de cobayas deben ser significativamente distintas al medirlas 24–48 horas más tarde.

6

L-Asparragina, 5,0 g Fosfato monopotásico (KH2PO4, anhidro), 2,0 g Sulfato magnésico (MgSO4-7H2O), 1,0 g Citrato amónico ([NH4]3 C6H5O7), 2,0 g Cloruro sódico, 2,0 g Citrato de hierro y amonio, 0,075 g Dextrosa monohidrato B.P., 10 g Glicerol B.P. (48 ml), 60 g Agua destilada hasta 1.000 ml pH (no ajustado) 5,65,8 Cuando sea necesario, este medio se solidifica adicionando agar granulado al 1,5% (Difco). Se esteriliza a 121°C durante 15 minutos.

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Capítulo 2.2.6. — Paratuberculosis (enfermedad de Johne)

2.

Método de producción

Vacuna: Para los lotes de vacunas, los organismos pueden crecerse en un medio sintético líquido como el medio sintético de Reid. Los organismos crecen formando una película en la superficie del líquido. Para asegurar una correcta área de superficie, conviene usar recipientes tales como frascos cónicos conteniendo un tercio de su volumen nominal de medio líquido. Estos frascos pueden inocularse directamente a partir de cultivos en cortes de patata, pero con algunas cepas, pueden necesitarse uno o más pases en medio líquido para asegurar el adecuado crecimiento formando película hasta el pase final del lote de vacuna. Tales resiembras se deberían realizar, habitualmente, a lo largo de dos semanas puesto que periodos más largos pueden derivar en un envejecimiento y hundimiento de la película. La incubación se realiza a 37°C. Para preparar la vacuna, la película procedente de cultivos crecidos 2 semanas de cada cepa a probar debe separarse del medio líquido por decantación, filtración y presión entre bloques de papel de filtro. El cultivo húmedo de M. paratuberculosis se mezcla con un adyuvante, como parafina líquida, aceite de oliva y piedra pómez (7). Johnina: La johnina para las pruebas diagnósticas cutáneas es un PPD preparado a partir de una o más cepas de M. paratuberculosis (disponible a partir de VLA Weybridge o CDI, Lelystad, Países Bajos). Puede prepararse según el método siguiente. Las cepas de Mycobacterium paratuberculosis se crecen en medio líquido de Reid hasta formar una película. Los cultivos de producción se inoculan habitualmente a partir de cultivos líquidos del inóculo en lugar de inóculo directamente recogido de medio sólido (medio sintético de Reid). Los cultivos de producción se incuban a 37°C durante 10 semanas. Al final del periodo de incubación, el medio de cultivo tiene un pH aproximado de 5 y sólo se podrá obtener poca o no se obtendrá ninguna johnina a menos que aumente el pH, usando hidróxido sódico, hasta aproximadamente 7,3 antes de calentar al vapor. Después de una mezcla minuciosa, los cultivos se mantienen en ebullición durante 3 horas. La mayor parte de los organismos muertos se elimina mediante una tamización y el filtrado se clarifica con una posterior filtración. La proteína del filtrado se precipita químicamente con ácido tricloroacético al 40%, se lava y se resuspende (disolvente alcalino). El producto se esteriliza por filtración. Puede adicionarse un conservante antimicrobiano que no provoque reacciones falso-positivas, como el fenol (no más del 0,5% [w/v]). Como estabilizador se puede añadir glicerol (no más del 10% [w/v]). El producto se distribuye asépticamente en contenedores estériles de vidrio, que posteriormente se sellan.

3.

Control interno

Vacuna: Debe comprobarse tanto el crecimiento adecuado de los cultivos como la pureza de los mismos. La presencia de organismos contaminantes se puede detectar mediante pruebas de esterilidad de las colecciones. Las pruebas de micobacterias patógenas se realizan mediante la inyección de cultivo húmedo, previamente mezclado con adyuvante y diluido diez veces en solución salina, en dos cobayas, recibiendo cada uno 1 ml. Se observan durante 8 semanas, se sacrifican de forma indolora, y se examinan para encontrar lesiones anormales. Johnina: Después de la filtración final se comprueba la esterilidad de cada filtrado de la solución de PPD. Se determina el contenido de proteínas de los filtrados estériles mediante el método de Kjeldahl (1). El contenido de proteínas se ajusta para que el producto final contenga entre 0,475 y 0,525 mg/ml de proteína. El pH se ajusta hasta el rango 6,5–7,5.

4.

Control de lotes

a)

Esterilidad En el Capítulo I.1.5. se pueden encontrar pruebas de control de esterilidad y de ausencia de contaminación. El organismo de la vacuna normalmente no crecerá a un nivel apreciable en las pruebas convencionales de esterilidad.

b)

Inocuidad Vacuna: Estas pruebas se realizan normalmente con animales de laboratorio, aunque también resultan satisfactorias las pruebas de multidosis en los animales diana a los que va dirigida la vacuna. Una típica prueba con un animal de laboratorio sería como se indica a continuación. Dos cobayas se inoculan, subcutáneamente, con un lote aceptable de vacuna a una fracción de la dosis previamente determinada que empleada en vacas produce un nódulo pero no una necrosis manifiesta en la zona de la inyección. Los

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Capítulo 2.2.6. — Paratuberculosis (enfermedad de Johne)

animales se observan durante 8 semanas, se sacrifican de forma indolora y se examinan para encontrar lesiones anormales. Johnina: Dos cobayas se inyectarán subcutáneamente con 0,5 ml de la johnina a probar. No se deben apreciar lesiones locales significativas o sistémicas durante 7 días (1). Las pruebas de johnina para micobacterias vivas pueden llevarse a cabo empleando el material inmediatamente antes de ser introducido en los contenedores finales o con muestras procedentes de los propios contenedores finales. Se debe tomar una muestra de al menos 10 ml, e inyectarla vía intraperitoneal o subcutánea en al menos dos cobayas, dividiendo a partes iguales el volumen a probar entre las cobayas. Es aconsejable tomar una muestra mayor, por ejemplo 50 ml, y concentrar cualquier micobacteria residual mediante centrifugación o filtración de membrana. Las cobayas se observarán durante al menos 42 días y también se realizarán exámenes post-mortem. Cualquier lesión macroscópica se examinará tanto al microscopio como mediante cultivo.

c)

Potencia Vacuna: Como las pruebas de protección parecen ser impracticables, se puede emplear una prueba de la capacidad sensibilizadora. Esto podría entonces relacionarse con el contenido bacteriano basado en el peso. Una prueba típica podría ser como sigue: los cobayas se sensibilizan mediante una inyección intramuscular de 0,5 ml de la vacuna a probar diluida 100 veces en parafina líquida. Las pruebas cutáneas se realizan seis semanas después de la sensibilización usando inoculaciones intradérmicas de 0,2 ml de al menos tres diluciones seriadas de un antígeno de M. paratuberculosis, tal como la PPD johnina, Las diluciones se elegirán para que produzcan reacciones cutáneas esperadas de 8 mm a 25 mm de diámetro. Cada cobaya recibe varias diluciones por cada costado, eligiéndose un diseño en cuadrado latino para su distribución. Después de 24–48 horas, se miden las reacciones cutáneas. Todavía no se ha establecido totalmente una preparación de referencia para las pruebas de este tipo. La tuberculina PPD aviar, calibrada en unidades internacionales, puede usarse como antígeno de la prueba cutánea en las pruebas de este tipo para asegurar que la vacuna es capaz de producir una sensibilización adecuada (correspondiendo a la vacunación). Johnina: La potencia de la johnina se determina actualmente mediante ensayo químico del contenido de proteínas empleando el método de Kjeldahl. Se recomienda un contenido de PPD de 0,5 ± 0,025 mg/ml en el producto final (1). La identidad del material debería confirmarse mediante inyección intradérmica de cobayas sensibilizadas mediante inyecciones de M. paratuberculosis (100 mg de micobacteria en polvo  25 ml de vaselina  100 mg de piedra pómez) muertos 6 semanas antes. Es posible realizar una prueba de potencia empleando diluciones de johnina en cobayas sensibilizados con M. paratuberculosis, de forma similar a las pruebas de potencia de la tuberculina bovina y aviar, pero todavía no ha sido totalmente establecida una preparación estándar para este tipo de prueba.

d)

Duración de la inmunidad Vacuna: Después de la vacunación a la edad de 14–30 días el efecto de la vacunación se expresa como la reducción en la tasa de excretores entre los animales vacunados en comparación con los bovinos no vacunados (14). Normalmente hay un buen control de la enfermedad clínica pero persiste un nivel reducido de la infección subclínica. Los resultados favorables probablemente reflejan una menor exposición a la infección como consecuencia de la reducción del número de fuertes excretores en el rebaño.

e)

Estabilidad Vacuna: La vacuna debe almacenarse a 2–8°C durante 9–12 meses sin pérdida de potencia. No se debe congelar. Johnina: La johnina debe estar protegida de la luz y almacenarse a 2–8°C. Bajo estas condiciones retendrá su potencia durante al menos cinco años.

f)

Conservantes Normalmente se incluye un conservante de vacunas en los contenedores multidosis. Para el caso de la johnina el fenol empleado no sobrepasa el 0,5% (w/v). Se debe comprobar la concentración del conservante en el producto final y su persistencia a lo largo del periodo de validez.

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Capítulo 2.2.6. — Paratuberculosis (enfermedad de Johne)

g)

Precauciones (riesgos) Vacuna La vacuna causa algunos efectos colaterales, formación de nódulos y sensibilización de los animales a la prueba de la tuberculina (11). En humanos, la inyección accidental de la vacuna provoca reacciones inflamatorias crónicas que requieren tratamiento quirúrgico (14).

5.

Pruebas sobre el producto final

a)

Inocuidad Ver Sección C.4.b.

b)

Potencia Ver Sección C.4.c.

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* * *

NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Paratuberculosis (ver Cuadro en Parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar la página Web de la OIE para una lista más actualizada: www.oie.int).

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CAPÍTULO 2.2.7.

COWDRIOSIS (HIDROCARDITIS)

RESUMEN La cowdriosis (también conocida como heartwater) es una enfermedad producida por rickettsias en los rumiantes, causada por Ehrlichia ruminantium (anteriormente Cowdria ruminantium) y transmitida por garrapatas Amblyomma. Tiene lugar en casi todos los países de Africa y en Madagascar, y también en el Caribe, amenazando al continente americano. Desde el punto de vista clínico, la enfermedad se caracteriza por fiebre alta repentina, frecuente hidropericardio, edema pulmonar y, en las formas agudas e hiperagudas, por trastornos nerviosos y alta mortalidad. También se produce la cowdriosis subaguda, con una tasa alta de recuperaciones. Los animales salvajes pueden jugar un papel importante ya que son el reservorio de la enfermedad. El ciervo tipo Rusa parece ser el único rumiante en el cual la cowdriosis tiene impacto económico. Identificación del agente: El diagnóstico específico de la cowdriosis se basa en la observación de colonias de E. ruminantium en células endoteliales de los capilares del cerebro. En ausencia de herramientas adecuadas, se puede retirar un trozo del cerebelo con una cucharilla a través del foramen magnum después de cortar la cabeza. Se puede obtener una muestra de la corteza cerebral a través de un agujero hecho en el cráneo con un martillo y un clavo largo. Se preparan frotis del cerebro aplastando un trozo pequeño de la corteza del cerebro o del cerebelo entre dos portas de microscopio. Los capilares se extienden en monocapa pasando un porta a lo largo del otro. Los frotis se secan al aire, se fijan con metanol y se tiñen con Giemsa. Con colorantes rápidos, los frotis pueden fijarse y teñirse en un minuto. El color de las colonias (agrupaciones) varía de morado rojizo a azul, y a menudo están próximas al núcleo de las células endoteliales infectadas. Pueden ser escasas y difíciles de encontrar, especialmente en casos hiperagudos, pero están siempre presentes en el cerebro de los rumiantes que mueren de cowdriosis, si no se han tratado con fármacos. Las colonias pueden verse dos días después de la muerte en un cerebro mantenido a temperatura ambiente y hasta 34 días después en un cerebro almacenado en un refrigerador. La sangre fresca recogida de animales sospechosos puede inocurlarse intravenosamente en cabras u ovejas susceptibles. El desarrollo de síntomas clínicos y la presencia de Ehrlichia en el cerebro de los animales inoculados son claves para el diagnóstico de la cowdriosis. Ehrlichia ruminantium puede aislarse de la sangre de un hospedador infectado utilizando cultivos con células endoteliales de rumiantes. Cuando se produce un efecto citopático que consiste en la formación de placas de lisis celular, se confirma la presencia de mórulas características por tinción de la monocapa celular con azul de metileno y eosina o mediante técnicas de immunoflorescencia o immunoperoxidasa usando un antisuero específico. Se dispone de sondas de ADN y especialmente de técnicas más sensibles basadas en la reacción en cadena de la polimerasa para revelar la presencia de E. ruminantium en la sangre de animales infectados activamente y en menor grado en la sangre o médula ósea de animales portadores y en las garrapatas que actúan como vector. La técnica de PCR tiene un amplio uso en la investigación del genoma de Ehrlichia y en estudios epidemiológicos, además de su uso diagnóstico. Pruebas serológicas: Las pruebas serológicas incluyen pruebas de inmunofluorescencia indirecta, enzimoinmunoensayos (ELISA) e inmunotransferencia (Western blotting. Sin embargo,

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cuando se usan células completas de Ehrlichia como antígeno, se producen reacciones cruzadas con otras especies de Ehrlichia en todas las pruebas. Dos enzimoinmunoensayos desarrollados recientemente, que utilizan como antígenos la principal proteína antigénica 1 recombinante (MAP1)- el ensayo ELISA MAP1B y el ensayo ELISA competitivo MAP1- presentan una notable mejora en especificidad en comparación con las pruebas previas, lo que hace más fiable la interpretación de los resultados serológicos en regiones donde se producen infecciones por Ehrlichia en rumiantes. Estas pruebas pueden ser útiles para controlar las infecciones experimentales, examinar el estado inmunológico de animales inmunizados, y analizar el estado de los animales antes de la importación. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: aún se lleva a cabo en algunos países la inmunización contra la cowdriosis por el método de "infección y tratamiento" usando garrapatas de Amblyomma pre-alimentadas con sangre infectada u homogeneizada. Una vacuna de primera generación que consiste en cuerpos elementales de E. ruminantium purificados e inactivados, emulsionados en adyuvante Montanide ISA 50 ha dado resultados prometedores en condiciones experimentales controladas, y se está evaluando en áreas endémicas. En un futuro próximo, podría reemplazar al método de infección y tratamiento, que presenta dificultades prácticas.

A. INTRODUCCIÓN La cowdriosis (heartwater) es una enfermedad de rumiantes salvajes y domésticos producida por rickettsias, causada por Ehrlichia ruminantium (anteriormente Cowdria ruminantium) y transmitida por garrapatas Amblyomma (2, 6, 23). También se la conoce con los sinónimos malkopsiekte (Africa), pericarditis exudativa infecciosa (Francia), hidrocarditis infecciosa (Portugal), hidropericarditis de los rumiantes (Italia), y una gran variedad de nombres en diferentes lenguas africanas (5). Ehrlichia ruminantium se clasifica en el orden Rickettsiales, tribu Ehrlichieae, junto con el género Anaplasma. La cowdriosis se da en casi todos los países subsaharianos de África donde las garrapatas Amblyomma están presentes y en las islas circundantes: Madagascar, Reunión, Mauricio, Zanzíbar, las Islas Comoro y Santo Tomé. La enfermedad ha sido también descrita en el Caribe (Guadalupe, Maria Galante y Antigua) (21), desde donde amenaza al continente americano. Todos los rumiantes domésticos y salvajes pueden resultar infectados, pero los primeros parecen ser más susceptibles. Los rumiantes domésticos indígenas son generalmente más resistentes a la enfermedad. Los animales salvajes podrían jugar un papel importante como reservorio, pero el ciervo Rusa parece ser el único rumiante salvaje en el cual la cowdriosis tiene un impacto económico. El periodo de incubación natural medio es de 2 semanas, pero puede variar de 10 días a 1 mes. En la mayoría de los casos, la cowdriosis es una enfermedad febril aguda, con un rápido aumento en la temperatura corporal, que puede pasar de los 41°C entre 1 y 2 días después del comienzo de la fiebre. Se mantiene alta con pequeñas fluctuaciones y baja inmediatamente antes de la muerte. La fiebre va seguida de inapetencia, algunas veces apatía, diarrea, particularmente en el ganado vacuno (3), y disnea, indicativa de edema pulmonar. Los trastornos nerviosos se desarrollan gradualmente. El animal está inquieto, camina en círculos, hace movimientos de succión y está de pie muy rígido con temblores en los músculos superficiales. El ganado vacuno puede empujar su cabeza contra una pared o presentar comportamiento agresivo o ansioso. Finalmente, el animal cae al suelo, moviendo sus patas como en pedaleo y mostrando opistótonos, nistagmos y movimientos de masticación. El animal muere generalmente durante un ataque nervioso o inmediatamente después. La manifestación subaguda de cowdriosis con síntomas menos pronunciados y la hiperaguda con muerte repentina, se pueden dar también dependiendo de la raza del rumiante y de la cepa de Ehrlichia. Las lesiones macroscópicas más comunes son hidropericardio, hidrotorax, edema pulmonar, congestión intestinal, edema de los nódulos linfáticos mediastínicos y bronquiales (3), petequia del epicardio y endocardio, congestión del cerebro y esplenomegalia moderada. Un diagnóstico provisional de cowdriosis se basa en la presencia de vectores de Amblyomma, de trastornos nerviosos clínicos, y de transudados en el pericardio y en el tórax en el examen post-mortem. Debería hacerse un diagnóstico clínico diferencial con la babesiosis cerebral bovina y la teileriosis, la anaplasmosis, botulismo e infección por nemátodos (haemonchiosis) de los pequeños rumiantes.

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B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO 1.

Identificación del agente

Se pueden observar colonias típicas de E. ruminantium en frotis del cerebro después de la muerte. No es necesario llevar a cabo la tediosa labor de abrir el cráneo. Un método alternativo (26) consiste en cortar la cabeza por la primera vértebra cervical. Después se introduce una cucharilla a través del foramen magnum, entre la médula y las meninges. Se vuelve la cucharilla hacia el cerebro y se retira con un trozo de cerebelo. Otro método sencillo consiste en hacer un agujero en el cráneo con un martillo y un clavo largo y aspirar una muestra de corteza cerebral con una aguja unida a una jeringa. Estos métodos también disminuyen el riesgo para el operador en los casos en los que los trastornos nerviosos han sido producidos por rabia. En los animales vivos, se puede obtener una biopsia del cerebro aséptica e inofensivamente después de anestesia local, aunque con dificultad y ciertas restricciones en animales grandes y especialmente en aquellos con cuernos. Las colonias de Ehrlichia se observan durante el periodo febril. Este método es útil para estudios experimentales, pero no es adecuado para diagnósticos rutinarios. Las colonias de Ehrlichia aún están presentes 48 horas después de la muerte en un cerebro mantenido a temperatura ambiente y hasta 34 días en un cerebro almacenado en un refrigerador (4). Se coloca un fragmento pequeño de materia gris (de tamaño aproximado a una cabeza de cerilla) en un porta de microscopio, aplastado por otro porta y, mientras se mantiene la presión, los portas se deslizan a lo largo uno sobre otro para producir una monocapa celular. Los portas se secan al aire, se fijan en metanol, se tiñen con Giemsa diluida con tampón Sörensen (2,54 g KH2PO4; 8,55 g Na2 HPO4.H2O; cantidad suficiente para 5 litros con agua destilada), pH 7,2, y lavado con agua del grifo. Tinciones rápidas Giemsa (DiffQuick, RAL555, tinción de Field, tinción rápida de CAM) proporcionan resultados más rápidos, pero el contraste de color es generalmente más pobre. Algunas tinciones "rápidas" proporcionan un contraste excelente, por ejemplo la tinción Hema 3. Los portas se examinan al microscopio con un aumento bajo (objetivo x10) para localizar los capilares cerebrales. Para identificar las colonias de rickettsias resulta útil una lente para aceite de inmersión con un aumento de al menos x50. Se necesita experiencia para identificar colonias de Ehrlichia y para diferenciarlas de otros parásitos de la sangre (Babesia bovis), de ciertas células sanguíneas (trombocitos, granulocitos), de estructuras subcelulares normales (mitocondrias, gránulos de mastocitos), o artefactos de la tinción (precipitados del colorante), etc. Se puede mejorar la especificidad de la lectura tiñendo secciones del cerebro fijadas con formalina utilizando técnicas de inmunoperoxidasa. Las colonias de Ehrlichia están formadas por agrupaciones de gránulos (0,2-0,5 µm), organizados a veces formando un anillo o una herradura (1-3 µm), situados cerca del núcleo dentro de la célula endotelial. Los gránulos pueden ser escasos, particulamente en casos hiperagudos, pero se encuentran siempre en el cerebro de los animales que han muerto de cowdriosis. Sin embargo, si el animal fue tratado con fármacos 24 horas antes, los gránulos de Ehrlichia tienden fundirse, lo que hace que el diagnóstico sea muy difícil, y a veces imposible. La sangre fresca completa recogida de animales sospechosos puede inocularse intravenosamente a una oveja o cabra susceptible. El desarrollo de síntomas clínicos y la evidencia de Ehrlichia en el cerebro del rumiante inoculado constituyen un diagnóstico de la cowdriosis. Se ha utilizado microscopía electrónica de transmisión para demostrar que los organismos de Ehrlichia se desarrollan dentro de una estructura vacuolar, rodeada de una membrana en el citoplasma de la célula endotelial (25). Cada organismo está rodeado por en una membrana doble. Dentro de la estructura vacuolar, se identifican formas de Ehrlichia densas a los electrones (cuerpos elementales), así como formas reticuladas intermedias.

a)

Aislamiento de Ehrlichia ruminantium usando cultivos in-vitro El aislamiento de E. ruminantium en cultivos celulares no es la prueba elegida para confirmar el diagnóstico de cowdriosis, ya que el procedimiento de laboratorio es largo, aunque muchas líneas celulares permiten su crecimiento. Sin embargo, el aislamiento de Ehrlichia es necesario para tipificar las cepas presentes en una región a efectos de los programas de vacunación. Se puede aislar Ehrlichia de la sangre de los animales infectados por cultivo sobre células endoteliales de rumiantes. Las células endoteliales del cordón umbilical, la aorta o la arteria pulmonar de diferentes especies de rumiantes (ganado vacuno, cabras, ovejas) se utilizan a menudo para el aislamiento, aunque se han descrito otros tipos de células endoteliales (capilares del cerebro, células endoteliales circulantes, etc.) para el cultivo rutinario de microorganismos. Líneas

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celulares endoteliales de marta, antílope orix, búfalo, kudo, y el cerdo salvaje se pueden utilizar también para cultivar E. ruminantium. No se han designado aún líneas celulares estándar para aislamiento. •

Procedimiento de aislamiento

i)

La sangre del animal infectado se recoge en anticoagulante (heparina o citrato sódico) y se diluye a 1/2 en el medio de cultivo que consiste en el medio mínimo esencial de Glasgow (MEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado, 2,95 mg/ml de caldo de triptosa y fosfato, 200 mM de Lglutamina, y antibióticos si es preciso (penicilina 100 unidades internacionales/ml, estreptomicina 100 µg/ml).

ii)

El medio de cultivo se elimina de la monocapa celular endotelial y se añade sangre infectada (aproximadamente 2 ml para una botella de 25 cm2 ). La botella se incuba a 37°C en una agitador rotatorio durante 2 horas.

iii)

Después de la incubación, se elimina la sangre y la monocapa se lava cuidadosamente tres veces con medio de cultivo precalentado. Se añade medio de cultivo fresco y la botella se incuba a 37°C. El medio se cambia dos veces por semana. (El uso de plasma en lugar de sangre es más eficaz cuando se toma de un animal con una reacción febril >41°C. En este caso, los pasos (ii) y (iii) mencionados anteriormente pueden reemplazarse por lo siguiente:

iv)

b)

•

Se siembran 4 ml de plasma sobre un cultivo celular endotelial susceptible y se incuban durante 1 hora a 37°C en un agitador rotatorio.

•

Se retira el plasma lavándolo con medio de cultivo y se añaden 5 ml de medio de crecimiento (por botella de 25 cm2 ) y se observa el desarrollo del efecto citopático.

La monocapa se inspecciona regularmente para observar la aparición de pequeñas placas de lisis celular. Las primeras placas aparecen generalmente después de dos semanas. El pase a monocapas celulares sin infectar se lleva a cabo cuando la lisis alcanza el 80% de la capa celular. Las células restantes se tiñen con azul de metileno y eosina y se examinan microscópicamente para detectar la presencia de mórulas de E. ruminantium. Alternativamente, se pueden teñir las células mediante una prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFI) o mediante una prueba con inmunoperoxidasa, utilizando un antisuero específico de Ehrlichia.

Aislamiento de Ehrlichia ruminantium utilizando cultivos in-vivo. Es posible evaluar la presencia de cowdriosis en una manada, región o país, o aislar una cepa de Ehrlichia inoculando sangre o un homogenado de garrapata en un animal susceptible. La sangre de animales individuales, o sangre del colectivo, se inyecta lentamente a una dosis de 10-100 ml por vía intravenosa a un oveja o cabra susceptible. Otro método consiste en recoger y homogeneizar garrapatas Amblyomma adultas, y después de centrifugar el homogenado, inocular el sobrenadante resultante. El último método es muy sensible porque la concentración de Ehrlichia es más alta en las garrapatas que en la sangre. Sin embargo, la tasa de infección de garrapatas es variable y a veces tan baja como el 1% (5). En este caso, para detectar una infección, se necesitan al menos 100 garrapatas y se deben utilizan tantas como sea posible. En ambos casos, el inóculo se puede almacenar con 10% de dimetil sulfóxido en nitrógeno líquido durante varios años. Hay que tener en cuenta que la inoculación de homogenados de garrapatas en animales susceptibles puede causar anafilaxia, lo que se puede evitar mediante la administración simultánea de adrenalina. El desarrollo de síntomas clínicos y la detección de bacterias circulantes mediante métodos moleculares y/o la existencia de Ehrlichia en el cerebro del rumiante inoculado son diagnósticos de cowdriosis.

2.

Métodos moleculares

a)

Detección de Ehrlichia ruminantium utilizando sondas de ADN Se ha clonado un fragmento específico de ADN genómico para E. ruminantium y se ha utilizado como sonda de ácido nucleico (29). Reconoce todas las cepas de E. ruminantium probadas hasta ahora. Esta sonda, llamada pCS20, detecta fácilmente la infección en animales clínicamente enfermos y garrapatas Amblyomma infectadas experimentalmente. Sin embargo, no es suficientemente sensible para detectar a la mayoría de los animales portadores y/o infecciones de bajo nivel en garrapatas. Sin embargo, se ha demostrado que la sonda pCS20 es más sensible que las sondas 16S y MAP1 (proteína 1 antigénica más importante) para la detección de E. ruminantium en garrapatas cuando hibridan sobre el producto del fragmento de ADN homólogo amplificado por una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (1).

b)

Detección de Ehrlichia ruminantium utilizando PCR y PCR anidada A partir de la secuencia de ADN de la sonda pCS20 (15) se han diseñado dos cebadores -AB128 y AB129para uso en PCR. Una modificación del método PCR consiste en la transferencia de la sonda pCS20 sobre

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el fragmento de amplificación en un paso adicional, que origina un aumento de 10 veces en la sensibilidad (24). Se ha demostrado que esta última técnica (PCR/hibridación) es 350 veces más sensible que la sonda de ácido nucleico sola. Se han detectado por PCR niveles bajos de infección en animales y en garrapatas alimentadas de animales portadores, mientras que una reacción de hibridación con la sonda de pCS20 sola resulta generalmente negativa (24). Desde el punto de vista experimental, se encontró que el límite de detección del ensayo convencional de PCR estaba entre 10 y 102 organismos, mientras que después de la PCR/hibridación estaba entre 1 y 10 organismos. Se ha demostrado la utilidad de la técnica PCR/hibridación para detectar 37 cepas de todas las áreas endémicas con una especificidad del 98%. Sin embargo, la sensibilidad del ensayo PCR es variable, oscilando entre 97 a 88% con muestras de garrapatas que contienen 107a 104 organismos, y cayendo hasta 61% y 28% con muestras que contienen 103 y 102 organismos, respectivamente (22). Consecuentemente, la tasa de 86% de garrapatas que dan positivo en las pruebas cuando se alimentan de animales infectados cayó al 21% cuando se alimentan de animales portadores debido a una rickettsemia más baja en tales animales. También se ha desarrollado una PCR anidada dirigida al mismo fragmento de ADN pCS20 (18). El par de cebadores externos incluye el cebador AB128 con sentido junto con un cebador llamado AB130 anti sentido. Estos amplifican un fragmento de 413 bp usado como matriz en una segunda vuelta de PCR utilizando AB128 y AB129 como cebadores internos. El uso de los cebadores AB128 y AB129 evita la necesidad de repetir una evaluación completa de la especificidad de la prueba. La PCR anidada muestra una mejora en sensibilidad de 2 log 10 si se la compara con una simple PCR, y un límite de detección promedio de 6 organismos. La implicación directa de esto fue un aumento en el índice de detección en garrapatas salvajes del 1,7% al 36% en un estudio epidemiológico en el Caribe. El límite de detección es comparable al del método de PCR/hibridación que, sin embargo, es mucho más complejo y largo de realizar. La PCR anidada con pCS20 permitió la detección regular de organismos de E. ruminantium en garrapatas, sangre, cerebro y pulmones de animales infectados, tanto si las muestras fueron procesadas frescas o después de la congelación o conservación en etanol al 70%. Se ha desarrollado una PCR anidada dirigida al gen polimórfico map1 completo en paralelo para tipificar las cepas por el polimorfismo de los fragmentos de restricción o secuenciando el fragmento de amplificación directamente de las muestras patológicas que dan positivo en la PCR anidada con pCS20 (18). Se observa una gran diversidad genética de E. ruminantium en el campo que influye en la formulación de vacunas y ha de ser investigado con más detenimiento. La PCR anidada con map1 funciona bien aunque con una sensibilidad ligeramente más baja que la PCR anidada con pCS20. Su límite de detección se evaluó en alrededor de 60 organismos y solamente el 91% de las muestras que resultaron positivas en la PCR anidada con pCS20 también dieron positivo en la PCR anidada con map1; algunos positivos de baja intensidad encontrados usando la PCR anidada con pCS20 resultaron negativos en la PCR con map1. Aunque los métodos PCR han resultado ser muy efectivos para detectar infección en garrapatas o en muestras de animales durante la fase clínica de la enfermedad o después de la muerte, solamente se han llevado a cabo estudios limitados para evaluar su valor en rumiantes sanos portadores. Ehrlichia ruminantium se puede encontrar fácilmente en la sangre de animales infectados inmediatamente antes del comienzo del periodo febril o unos cuantos días después de la recuperación, pero después de esto parece ausente de la circulación a un nivel detectable durante periodos largos. En un estudio en Zimbabwe solo dieron positivos entre 3,3 y 26,7% del ganado vacuno, y 23,3% de las cabras mientras que casi 100% de ellos habían sido infectados con Ehrlichia (13). No se sabe si la falta de detección de la enfermedad en la mayoría de los animales portadores se debe a una sensibilidad insuficiente de los métodos PCR para detectar rickettsemia muy baja, o se debe a una liberación intermitente de organismos en la circulación. Una técnica útil para confirmar el estado de un animal portador sospechoso, cuya sangre es negativa por PCR, es alimentar lotes de garrapatas sobre el animal y después probar las garrapatas mediante PCR. No se sabe si las garrapatas actúan simplemente concentrando organismos circulantes o también amplificando su número o incluso induciendo la liberación de microorganismos en la circulación durante la alimentación. Los cebadores 32F1 y 32R1 diseñados de la secuencia del gen MAP1 de E. ruminantium se usaron con éxito en una PCR para detectar el patógeno en la sangre y en la médula ósea de ovejas portadoras y ungulados salvajes africanos, pero el método no ha sido evaluado ni utilizado con amplitud.

c)

Detección de Ehrlichia ruminantium utilizando la técnica de transferencia lineal inversa La ténica de transferencia lineal inversa (RLB) se ha utilizado para la detección e identificación simultáneas de las especies de Anaplasma y Ehrlichia que se sabe que existen en rumiantes sobre la base de las diferencias en el gen de la subunidad pequeña del ARNr (2). Los cebadores 16S8FE y B-GA1B-nuevo se diseñaron a partir de dominios conservados y se utilizaron para amplificar un fragmento de 492-498 bp del gen del ARNr 16S atravesando la región V1 variable. Se diseñaron sondas de oligonucleótidos con especificidad de especie en este asa V1 para permitir la detección específica de E. ruminantium, E. ovina, E. sp. Cepa Omatjenne, Anaplasma marginales, A. centrale, A. bovis, A. ovis y A. phagocytophilum. También se diseño una sonda de oligonucleótido de reacción cruzada con todas las especies (sonda

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general) para que sirviera como control en el caso de que un producto PCR no hibridará con ninguna de las sondas con especificidad de especie. En el método, las sondas con especificidad de especie se unen covalentemente a la membrana de hibridación, que se hibrida con el producto de la PCR obtenido utilizando los cebadores 16S8FE y B-GA1B-nuevo. Se demostró que los productos PCR obtenidos de los microorganismos mencionados anteriormente se unían solo con sondas de oligonucleótidos específicos. No se detectó ningún producto PCR ni se produjo ninguna hibridación cuando se aplico PCR-RLB a Theileria annulata, Babesia bigemina o ADN de mamífero. De forma similar, las garrapatas control negativas fueron siempre negativas en la prueba RLB mientras que se pudo detectar infección por Ehrlichia ruminantium en 15-70% de las garrapatas alimentadas de ovejas infectadas experimentalmente o portadoras crónicas. En Mozambique, se pudo detectar E. ruminantium en la sangre de 12 pequeños rumiantes colocados en el campo con los animales infectados; se detectó infección mixta en cinco de los animales centinela infectados, demostrando de esa forma la utilidad del método para detectar múltiples infecciones. Sin embargo, no se ha determinado aún la sensibilidad del ensayo y se necesita validar esta técnica en estudios epidemiológicos amplios.

•

Lectura de los resultados Teniendo en cuenta que E. ruminantium es una bacteria intracelular obligada que no puede cultivarse en medios acelulares y que su aislamiento es complejo y dura varias semanas, las técnicas de detección molecular son los métodos mejores para el diagnóstico de cowdriosis. La PCR es más fácil de llevar a cabo y más sensible que las sondas de ADN. Sin embargo, en las pruebas PCR hay que tener cuidado de asegurar que no se produzca contaminación cruzada entre las muestras. Se deben incluir controles positivos y negativos en cada prueba. Considerando que la serología de la cowdriosis tiene muchas limitaciones (ver Sección B.3.), la PCR podría utilizarse para confirmar los resultados serológicos cuando, por ejemplo, animales seronegativos de un área endémica deben llevarse a un área de riesgo (con presencia de vectores potenciales) libre de cowdriosis. Sin embargo, a pesar de los interesantes resultados experimentales para detectar portadores subclínicos, no hay suficiente información disponible sobre la fiabilidad de la detección de portadores por PCR, y se necesita más investigación antes de diseñar una prueba estándar de sensibilidad conocida. Los resultados actuales obtenidos con la PCR, la PCR anidada o la prueba RLB, muestran que la detección directa de E. ruminantium en la sangre solo es fiable durante y alrededor de la fase febril de la enfermedad. Los métodos basados en la PCR parecen ser más fiables para detectar la infección en garrapatas, y esto podría tener cierto valor epidemiológico para determinar la distribución geográfica de Ehrlichia. Además, cuando es necesario en áreas endémicas, la inclusión de garrapatas de prueba (originalmente sin infectar) alimentadas sobre un animal sospechoso mejoraría la sensibilidad de la detección de portadores cuando han fallado la serología y la PCR con sangre. Sin embargo, este procedimiento no es conveniente para laboratorios de diagnóstico rutinario ya que requiere el mantenimiento de colonias de garrapatas y la capacidad para infectar animales experimentalmente.

3.

Pruebas serológicas

Se han descrito varias pruebas serológicas para diagnosticar cowdriosis: una prueba IFI con cultivo de células endoteliales infectadas de E.ruminantium como antígeno (prueba CIFA), ELISA indirecto, un ELISA competitivo (C-ELISA), y una inmunotransferencia (Western blot). La prueba IFI que utiliza macrófagos del peritoneo de ratón infectado con E. ruminantium (MIFA) se utiliza raramente en la actualidad. Un inconveniente de todas estas pruebas es la detección de reacciones positivas falsas debido a determinantes antigénicos comunes entre E. ruminantium MAP1 y la presencia de proteínas similares en varias especies de Ehrlichia. Casi todas estas pruebas ya no se usan para epidemiología o diagnóstico. La prueba CIFA se usa aún en algunos lugares, pero hay que tener cuidado cuando se interpretan los resultados por el problema de las reacciones positivas falsas. Para superar el problema de las reacciones cruzadas con Ehrlichia, se han desarrollado dos ELISAs sobre un antígeno MAP1 recombinante. El primero es un ELISA indirecto que utiliza una región inmunogénica de la proteína MAP1 (llamada MAP1-B) y produce muchas menos reacciones cruzadas con Ehrlichia spp. (ELISA con MAP1-B) (28). El segundo es un ELISA competitivo que utiliza el gen MAP-1 clonado en un baculovirus y anticuerpos monoclonales (MAbs) producidos contra la proteína MAP1 (C-ELISA con MAP1) (10). Ambas pruebas han mejorado la especificidad notablemente, pero aún muestran alguna reactividad con sueros de título alto contra E. canis, E. chaffeensis y un agente no clasificado del ciervo de cola blanca. Hasta ahora, el ELISA con MAP 1-B ha sido el de utilización más amplia y se describirá con más detalles.

a)

Prueba de inmunofluorescencia indirecta con cultivo de tejido celular endotelial como antígeno (prueba CIFA) (17) Para preparar el antígeno, se cultiva una cepa de E. ruminantium en cultivos de células endoteliales de rumiantes. Cuando la mayoría de las células se lisan, se recogen las células adherentes restantes y se

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mezclan con el sobrenadante. Las células se centrifugan tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 200 g durante 10 minutos. En cada pocillo de un porta para inmunofluorescencia se colocan 10 µl de la suspensión celular lavada. Los portas con antígeno se secan, se fijan en acetona y se almacenan a -20°C.

b)

•

Procedimiento de la prueba

i)

Los sueros problema se diluyen 1/20 en PBS, se añaden a los pocillos con antígeno y se incuban durante 30 minutos en una cámara húmeda a 37°C.

ii)

Se lavan las placas en tampón durante 15 minutos.

iii)

Para cubrir los pocillos se añaden los conjugados anti-especies apropiados, diluidos generalmente 1/60. Las portas se incuban de nuevo durante 30 minutos a 37°C.

iv)

Después de un segundo lavado, los portas se ponen en glicerina tamponada bajo un cubre y se examinan con un microscopio de fluorescencia.

v)

Se incluyen sueros control positivos y negativos en cada porta.

Prueba de inmunofluorescencia indirecta con macrófagos del peritoneo de ratón infectado como antígeno ( prueba MIFA) (8) Se inyectan intraperitonealmente ratones con 0,2 ml de estabilizado de la cepa de Kümm después de recuperarlo del almacenamiento en nitrógeno líquido. Los síntomas clínicos – pelo erizado y aletargamientoaparecen 12 días después, y pueden morir varios ratones. Los ratones supervivientes son sacrificados. Las células peritoneales que contienen algunos macrófagos con colonias de mórulas se extraen inyectando 2 ml de PBS en la cavidad peritoneal y recuperando el líquido. El líquido peritoneal recuperado se centrifuga durante 5 minutos a 2.000 g y el precipitado se resuspende en 0,3 ml de tampón. Se coloca una gotita de la suspensión de células en cada pocillo de un porta para inmunofluorescencia para formar una monocapa de células. Las placas con antígeno se secan al aire, se envuelven en tejido y papel de estaño y se almacenan a 4°C durante 21 días, a –18°C durante 6-9 meses, o por debajo de –70° durante más de 1 año. Inmediatamente antes de utiliziarlas, los portas con antígeno se sumergen en metanol frió durante 1-3 egundos. Se utiliza un instrumento para separar los pocillos a fin de evitar la confluencia de suero entre los pocillos. El procedimiento IFI es el mismo que en la prueba anterior, pero la dilución inicial del suero es 1/80.

c)

Enzimoinmunoensayo con MAP1-B (28) Utilizando el vector pQE9, el fragmento de PCR MAP1-F2R2, que codifica los aminoácidos 47-152 de la proteína MAP1 que incluye la región inmunogénica MAP1-B, se expresa en Escherichia coli M15[pREP4] como una proteína de fusión que contiene seis residuos adicionales de histidina. La MAP1-B recombinante se purifica utilizando Ni2+-NTA agarosa (ácido nitrilotriacético-agarosa) bajo condiciones desnaturalizantes como lo describe el fabricante1. El antígeno se conserva a 4°C y se titula cada lote. El antígeno se diluye a 0,5 µg/ml en tampón carbonato sódico 0,05 M, pH 9,6, y se inmoviliza sobre placas de poliestireno mediante incubación durante 1 hora a 37°C, y se guarda a 4°C hasta su uso.

1

•

Procedimiento de la prueba

i)

Las placas se bloquean durante 30 minutos añadiendo 100 µl por pocillo de PBS 0,1M, pH 7,2, suplementado con Tween 20 al 0,1% y leche desnatada seca al 3% (PBSTM).

ii)

Se lavan las placas tres veces con PBS suplementado con Tween 20 al 0,1 % (PBST) y dos veces con agua destilada.

iii)

Se añaden en pocillos duplicados 100 µl de suero de la prueba diluidos al 1/100 en PBSTM, y se incuba durante 1 hora a 37°C.

iv)

Se lavan las placas tres veces en PBST y dos veces en agua destilada

v)

Se añaden 100 µl por pocillo de IgG anti-especie conjugada con peroxidasa de rábano diluida óptimamente y la placa se incuba durante 1 hora a 37°C.

Qiagen, Max-Volmer-Strasse 4, 40724 Hilden, Alemania.

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Capítulo 2.2.7. — Cowdriosis

d)

vi)

Después de lavar como en el paso iv, cada pocillo se llena con 100 µl con tampón citrato 0,1M, pH 5,5, que contiene 0,5 mg/ml de ortofenilén-diamina y 3 µl/ml de 9% de H2O2.

vii)

La reacción se para después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente añadiendo 50 µl de H2SO4 2N. La absorbancia se lee a 495 nm. Se incluyen controles positivos y negativos en cada placa.

Enzimoinmunoensayo competitivo con MAP1 (20) El antígeno recombinante MAP1 se prepara de la siguiente forma: se infectan larvas del insecto Trichoplusia ni de 8 días por un baculovirus que expresa el gen map1 y se homogenizan las larvas moribundas (10% [p/v] en PBS suplementado con 0,001% (v/v) de Triton X-100. El anti-MAP1 MAb se prepara de la siguiente forma: células de bazo de ratón BALB/C previamente inoculadas con homogenado de larvas se funden con células SP2/0. Se analizan los sobrenadantes líquidos del cultivo celular del hibridoma para detectar la reactividad con MAP1 por métodos de inmunotransferencia (immnunoblotting) (e inmunoperoxidasa. Se subclona un cultivo celular reactivo, se isotipa y posteriormente se utiliza para la producción de ascites. Después de una dilución posterior en PBS 1/800 (v/v), se inmoviliza el antígeno sobre placas de poliestireno (Placas polySorp Nunc-Inmuno) mediante incubación durante la noche a 4°C, y se guardan a –70°C. •

Procedimiento de la prueba

i)

Antes de su utilización, las placas se bloquean durante 30 minutos añadiendo 100 µl por pocillo de PBS, pH 7,2, suplementado con 0,05% de Tween 20 y 5% de leche seca desnatada.

ii)

Las placas se lavan tres veces con PBS/Tween, se añaden 50 µl/pocillo de suero problema diluido 1/50 en PBS suplementado con 0,05% de Tween 20 y 1% de leche seca desnatada (PBSTM) por duplicado y las placas se incuban durante 30 minutos a 37°C.

iii)

Sin ningún paso intermedio, se añaden 75 µl /pocillo de MAb diluido 1/4.000 (v/v) en PBSTM y se incuban las placas durante otros 30 minutos a 37°C.

iv)

Se lavan las placas tres veces en PBS/Tween y se añaden 50 µl por pocillo de IgG anti- ratón conjugada con peroxidasa de rábano diluida de forma óptima en PBSTM. La placa se incuba durante 1 hora a 37°C.

v)

Después de tres lavados como se describió anteriormente, se añaden a cada pocillo 100 µl de tampón citrato 0,1 M, pH 5,5, que contienen 0,5 mg/ml de O-fenilén diamina y 3 µl/ml de 9% de H2O2. Después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente en la oscuridad, se detiene la reacción añadiendo 50 µl de H2SO4 2 N y se lee la absorbancia a 495 nm. En cada placa se incluyen controles positivos y negativos.

•

Lectura de resultados

Todas las pruebas serológicas basadas en antígenos de Ehrlichia no recombinantes, tales como CIFA, ELISAs e inmunotransferencia, se utilizan aún para estudios experimentales, pero no para estudios seroepidemiológicos. Las pruebas se han comparado y aplicado a sueros positivos y negativos conocidos para E. ruminantium (7). No se observaron reacciones positivas falsas en ninguna de las pruebas con sueros negativos conocidos. Existe una buena correlación entre las pruebas, pero la especificidad de las cinco pruebas es baja porque se producen reacciones cruzadas con algunas Ehrlichia spp. La interpretación de los resultados de varias pruebas aplicadas a estudios de campo es, por tanto, difícil en áreas donde se producen infecciones por Ehrlichia en rumiantes, que es probablemente el caso en la mayoría de las regiones de Africa donde la cowdriosis es endémica. Esta situación también se ha visto en granjas sin Amblyomma pero infectadas con especies de garrapatas que no se ha demostrado que sean vectores de E. ruminantium. Tanto el ELISA con MAP1-B como el C-ELISA con MAP1 han mostrado una gran especificidad después de su evaluación en el suero de 3000 rumiantes (cabra, oveja y ganado vacuno) recogidos de 14 islas de las Antillas Menores infectadas con A.-variegatum, de las que solamente tres se sabe que están infectadas por E. ruminantium (20). La especificidad total calculada de las 11 islas sin cowdriosis fue 98,5% y 99,4% para el C-ELISA con MAP1 y el ELISA con MAP1-B, respectivamente. Aunque aún se encuentran unos cuantos sueros positivos falsos, es probable que estas pruebas resuelvan muchos de los problemas de especificidad de las anteriores pruebas serológicas. La evaluación de la sensibilidad de las pruebas es más problemática ya que requiere el conocimiento de la situación exacta de un número alto de animales muestreados en el campo. Como se mencionó

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Capítulo 2.2.7. — Cowdriosis

anteriormente, en la actualidad no hay ninguna técnica sencilla disponible para confirmar si un animal está infectado. Desde el punto de vista experimental, se describió que la sensibilidad de C-ELISA en cabras era de 91,6-95,4% para el ELISA con MAP1-B, y de 96,3-96,9% para el C-ELISA con MAP1 (20). Sin embargo, en otro estudio la sensibilidad media era de 95% para valores de corte establecidos al 31% y 26,6% del suero control positivo para sueros de ovejas y cabras, respectivamente (19). De hecho, los cálculos se basan en un número limitado de animales inoculados experimentalmente en un periodo de tiempo inmediatamente después de la inoculación, cuando casi todos los animales son aún positivos. La sensibilidad en el ganado vacuno es incluso más baja y hay varios informes que demuestran que, después de la infección, la mayoría de los animales se convierten de nuevo en seronegativos en menos de 6 meses y algunos animales incluso nunca presentan seroconversión. Esta observación coincide con la diferencia en la prevalencia de anticuerpos observada entre rumiantes pequeños y ganado vacuno en inspecciones epidemiológicas que no se pueden explicar por un menor riesgo de infección de los últimos. Por ejemplo, en las granjas de Zimbabwe situadas en áreas endémicas, más del 90% de las cabras presentaban anticuerpos en su suero en comparación con el 33% del ganado vacuno mantenido en las mismas condiciones (14). Se han hecho observaciones similares en el Caribe. Las pruebas serológicas son útiles para la evaluación de la infección de cowdriosis en animales vacunados. Las pruebas se pueden utilizar también para analizar animales antes de su importación a áreas libres de cowdriosis, teniendo en cuenta que los anticuerpos se mantienen a niveles detectables en rumiantes domésticos infectados naturalmente durante sólo unos pocos meses, y que los anticuerpos circulantes desaparecen más rápidamente en ganado vacuno que en rumiantes pequeños. Por tanto, es posible que los animales que dan negativo en las pruebas serológicas puedan ser portadores de infección. La serología debería considerarse, por tanto, como un método de diagnóstico aplicable a nivel de manada, no a nivel individual. Los métodos moleculares, tales como pruebas de PCR, podrían ayudar potencialmente a detectar animales portadores sin anticuerpos detectables, pero esta posibilidad presenta aún inconvenientes importantes (ver sección B.2. Métodos moleculares).

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO Aunque se han obtenido resultados prometedores con organismos inactivados o atenuados, no existen actualmente vacunas comerciales. El único método de inmunización contra la cowdriosis es el método de "infección y tratamiento" utilizando sangre infectada o con homogenados de garrapatas infectadas pre alimentadas seguido por tratamiento de los animales infectados con tetraciclina. Este método se usa aún en varias zonas. Sin embargo, es probable que sea reemplazado pronto por la vacunación con preparados de cuerpos elementales de E. ruminantium inactivados emulsionados en adyuvantes lipídicos, después de la demostración de que las cabras susceptibles pueden protegerse con Ehrlichia inactivada en adyuvante de Freund (16). Esta vacuna también protegía contra inoculación de desafio en ovejas (11) utilizando diferentes cepas de E. ruminantium, y en ganado vacuno (27) utilizando la misma cepa que en cabras. Se ha demostrado que una preparación de vacunas de primera generación de Ehrlichia inactivada en adyuvante lipídico Montanide ISA 50 (adyuvante autorizado para uso en animales) era tan efectiva como la preparación con adyuvante de Freund en inoculaciones experimentales de laboratorio en cabras inmunizadas. Los animales se pueden inmunizar con dos inyecciones subcutáneas de 250 µg de antígeno emulsionado (50/50) en adyuvante Montanide ISA 50 en un volumen de 2 ml. En la actualidad se están llevando a cabo estudios adicionales sobre la optimización de producción de vacunas, control de calidad y eficacia en las diferentes especies a las que van dirigidas. En condiciones experimentales, se ha demostrado en cabras que la dosis de vacuna puede bajarse hasta 32 µg del antígeno sin disminuir el efecto de protección. La evaluación de una vacuna inactivada con adyuvante ISA 50 ha puesto de manifiesto que protege a las ovejas contra la exposición natural en Zimbabwe (12). Además, se están llevando a cabo en la actualidad muchos intentos de evaluación en condiciones de campo en varias granjas de África. Un desafío importante es la caracterización de la amplitud de la diversidad de cepas en una región que va a ser cubierta por una vacuna adecuada. Este conocimiento resultará esencial para la generación de nuevas vacunas que se desarrollen en el futuro.

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Capítulo 2.2.7. — Cowdriosis

20. MONDRY R., MARTINEZ D., CAMUS E., LIEBISCH A., KATZ J.B., DEWALD R., VAN VLIET A.H.M. & JONGEJAN F. (1998). Validation and comparison of three enzyme-linked immunosorbent assays for the detection of antibodies to Cowdria ruminantium infection. Ann. N.Y. Acad. Sci., 849, 262–272. 21. PERREAU P., MOREL P.C., BARRE N. & DURAND P. (1980). Existence de la cowdriose (heartwater) à Cowdria ruminantium chez les ruminants des Antilles françaises (La Guadeloupe) et des Macareignes (La Réunion et Ile Maurice). Rev. Elev. Med. Vet. Pays Trop., 33, 21–22. 22. PETER T.F., BARBET A.F., ALLEMAN A.R., SIMBI B.H., BURRIDGE M.J. & MAHAN S.M. (2000). Detection of the agent of heartwater, Cowdria ruminantium, in Amblyomma ticks by PCR: validation and application of the assay to field ticks. J. Clin. Microbiol., 38, 1539–1544 23. PETER T.F., BURRIDGE M.J. & MAHAN S.M. (2002). Ehrlichia ruminantium infection (heartwater) in wild animals. Trends Parasitol., 18, 214–218. 24. PETER T.F., DEEM S.L., BARBET A.F., NORVAL R.A.I., SIMBI B.H., KELLY P.J. & MAHAN S.M. (1995). Development and evaluation of PCR assay for detection of low levels of Cowdria ruminantium infection in Amblyomma ticks not detected by DNA probe. J. Clin. Microbiol., 33, 166–172. 25. PIENAAR J.G. (1970). Electron microscopy of Cowdria (Rickettsia) ruminantium (Cowdry, 1926) in the endothelial cells of the vertebrate host. Onderstepoort J. Vet. Res., 37, 67–78. 26. SCHREUDER B.E.C. (1980). A simple technique for the collection of brain samples for the diagnosis of heartwater. Trop. Anim. Health Prod., 12, 25–29. 27. TOTTE P., MCKEEVER D., MARTINEZ D. & BENSAID D. (1997). Analysis of T-cell responses in cattle immunised against heartwater by vaccination with killed elementary bodies of Cowdria ruminantium. Infect. Immun., 65, 236–241. 28. VAN VLIET A.H.M., VAN DER ZEIJST B.A.M., CAMUS E., MAHAN S.M., MARTINEZ D. & JONGEJAN F. (1995). Use of a specific immunogenic region on the Cowdria ruminantium MAP1 protein in a serological assay. J. Clin. Microbiol., 33, 2405–2410. 29. WAGHELA S.D., RURANGIRWA F.R., MAHAN S.M., YUNKER C.E., CRAWFORD T.B., BARBET A.F., BURRIDGE M.J. & MCGUIRE T.C. (1991). A cloned DNA probe identifies Cowdria ruminantium in Amblyomma variegatum ticks. J. Clin. Microbiol., 29, 2571–2577.

* * * NB: Existe un laboratorio de referencia de la OIE para Cowdriosis (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual de animales terrestres o consulte el sitio Web de la OIE para una lista más actualizada: www.oie. int).

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CAPÍTULO 2.2.8.

LARVA PERFORADORA DEL NUEVO MUNDO (COCHLIOMYIA HOMINIVORAX) Y DEL VIEJO MUNDO (CHRYSOMYA BEZZIANA)

RESUMEN 1

La larva perforadora del Nuevo Mundo (LPNM), Cochliomyia hominivorax (Coquerel), y la larva 1 perforadora del Viejo Mundo (LPVM), Chrysomya bezziana Villeneuve, son parásitos estrictos de los mamíferos durante sus estados larvarios. Ambas especies se incluyen en la subfamilia Chrysomyinae de la familia Calliphoridae del orden Diptera (moscas verdaderas). Las larvas que se alimentan de la piel y de los tejidos subyacentes del hospedador originan heridas y una condición denominada miasis traumática que puede ser mortal. La infestación se suele adquirir en sitios con lesiones previas, debidas a causas naturales o a las prácticas ganaderas, pero también pueden ocurrir en las membranas mucosas de los orificios corporales. Las moscas hembras son atraídas por las heridas, en cuyos bordes cada hembra deposita una media de 175 huevos (en el caso de LA LPVM) o 340 (en el caso de la LPNM). Las larvas emergen al cabo de 12–24 horas e inmediatamente comienzan a alimentarse, perforando cabeza abajo en la herida. Después de un crecimiento que incluye dos fases de muda, las larvas abandonan la herida y se dejan caer al suelo al que perforan para realizar la fase de pupación. La duración del ciclo de vida fuera del hospedador depende de la temperatura, siendo más corta cuanto mayor es la temperatura, y en los trópicos el ciclo completo puede completarse en menos de 3 semanas. En general, se efectúa un tratamiento a base de aplicar insecticidas organofosforados en las heridas con infestación, tanto para matar a las larvas como para suministrar una protección residual frente a la reinfestación. Las medidas preventivas incluyen la pulverización o el baño del ganado susceptible con compuestos organofosforados y, más recientemente, el uso de avermectinas en inyecciones subcutáneas a animales "con riesgo". También es una medida preventiva el control estricto del movimiento de animales fuera de las áreas afectadas. Identificación del agente: Las larvas de LPNM y DE LPVM se pueden confundir fácilmente entre sí y con las larvas de otros agentes de miasis. Un diagnóstico ajustado implica la identificación de las larvas extraídas de la parte más profunda de las heridas infestadas. Las larvas maduras del tercer estadio larvario son las más adecuadas para este fin y las de LPNM se pueden identificar por sus troncos traqueales dorsales de pigmentación obscura que se extienden desde el segmento duodécimo hasta el décimo o el noveno. Esta pigmentación es peculiar de las larvas de LPNM entre las especies que se pueden encontrar relacionadas con la miasis de heridas. La confirmación de LA LPVM descansa en el reconocimiento de una combinación característica en la espinulación, en el número de lóbulos del espiráculo anterior (4–6), y en la pigmentación de los troncos traqueales secundarios. En la fase adulta, las especies del género Cochliomyia se pueden distinguir de otros géneros relacionados con la miasis de las heridas confirmando el color del cuerpo, que normalmente es azul/verdoso metálico y con tres rayas longitudinales obscuras presentes siempre en el tórax. En este capítulo se presenta la separación de LPNM de la muy similar C. macellaria y la identificación de la LPVM adulta.

1

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En este capítulo, el término "Nuevo Mundo" se refiere a América del Norte, Central y del Sur, y el término "Viejo Mundo" se refiere a Europa, África y Asia.

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Capítulo 2.2.8.  Larvas perforadoras (Cochliomyia hominivorax y Chrysomya bezziana)

Pruebas serológicas: En la actualidad no hay pruebas serológicas aplicables, ni resultan apropiadas para la identificación de la enfermedad. No obstante, la serología puede tener un papel en el futuro en estudios sobre la prevalencia de la miasis. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: No hay vacunas disponibles ni materiales de diagnóstico excepto el uso de moscas macho esterilizadas en la técnica del insecto estéril (SIT). En esta técnica, se liberan al medio de forma secuencial un gran número de moscas macho estériles cuyo acoplamiento con hembras produce huevos no fertilizados que conduce a una reducción inicial de la población y, progresivamente, a la erradicación.

A. INTRODUCCIÓN La mosca de la larva perforadora del Nuevo Mundo (LPNM), Cochliomyia hominivorax (Coquerel), y la del Viejo Mundo, Chrysomya bezziana Villeneuve, pertenecen a dos géneros de la subfamilia Chrysomyinae de la familia de dípteros Calliphoridae (moscardas o moscas azules). Ambas especies son parásitas obligadas de mamíferos y, más raramente, de aves. Pese a ser de diferentes géneros y estar geográficamente separadas, ambas especies han evolucionado de forma notablemente paralela. Tienen ciclos vitales casi idénticos porque ocupan nichos idénticos de parasitismo en sus respectivas zonas geográficas. La siguiente exposición se refiere a ambas especies, excepto cuando se indique lo contrario. A diferencia de otras especies de moscardas azules, la hembra adulta de las larvas perforadoras no deposita sus huevos en inmundicias. En vez de eso, deposita los huevos en el borde de las heridas de mamíferos vivos con lesiones o en sus orificios corporales. Prácticamente cualquier herida resulta atractiva, bien sea natural (de luchas, depredadores, espinas, enfermedad, y/o mordeduras por garrapatas e insectos) o producida por el hombre (en el esquileo, marcaje, castración, corte de cuernos, corte de rabo, y/o marcaje en las orejas). Las heridas naturales más frecuentemente infestadas son los ombligos de los animales recién nacidos y las regiones vulvares o perianales de sus madres, especialmente si muestran traumatismo. Si los huevos se depositan en las membranas mucosas, las larvas pueden invadir las aberturas naturales del cuerpo como los orificios nasales y los senos asociados, las órbitas de los ojos, la boca, el oído y los genitales. A las 12–24 horas de la deposición de los huevos, las larvas emergen y comienzan a alimentarse de inmediato de los fluidos de las heridas y los tejidos subyacentes, penetrando de forma gregaria en las heridas con la cabeza hacia debajo de una manera típicamente perforadora. A medida que se alimentan rompiendo los tejidos con sus partes bucales en forma de gancho, la herida se agranda y se hace más profunda, originando una amplia destrucción tisular. A menudo, las heridas infestadas emiten un olor característico, que puede ser la primera indicación de que al menos un animal está infestado dentro de un grupo. Aunque el olor no es siempre percibido por los humanos, parece resultar muy atractivo para las hembras grávidas (18), que depositan más lotes de huevos incrementando así la extensión de la infestación. Una infestación grave sin tratamiento puede ocasionar la muerte del hospedador. A los 5–7 días de la eclosión de los huevos, las larvas alcanzan la madurez después de dos mudas. Detienen su alimentación y abandonan la herida, cayendo al suelo donde penetran para la pupación. La pupa se desarrolla dentro de un pupario, una estructura protectora en forma de tonel que se forma por endurecimiento y oscurecimiento de la cutícula de la larva madura. Después de completar el desarrollo, la mosca adulta suele emerger del pupario por la mañana y consigue subir a la superficie del suelo, donde extiende sus alas para endurecerlas antes de volar. Los machos alcanzan la madurez sexual y son capaces de acoplarse a las 24 horas, pero las hembras solo maduran sus ovarios, responden a los machos y se acoplan a los 3 días. A los 4 días del acoplamiento, la mosca hembra está dispuesta para la ovoposición. Busca un hospedador adecuado y deposita los huevos, todos orientados en la misma dirección, y firmemente unidos entre sí y al substrato en que se depositan. El número de huevos por puesta depende de muchos factores (por ejemplo, de la cepa de mosca, de molestias durante la ovoposición), pero la media de la primera puesta es del orden de 175 huevos para la LPVM y de 340 para la LPNM (38). Después de la primera puesta, siguen otras a intervalos de 3–4 días (46). Las moscas adultas viven un promedio de 2–3 semanas en el campo alimentándose en las flores, y las hembras también toman proteínas, por ejemplo de los fluidos serosos de las heridas animales. La velocidad de desarrollo de los estados inmaduros está influenciada por la temperatura ambiental y la de las heridas, siendo menor a bajas temperaturas, aunque no ocurre una verdadera diapausia. Este efecto es más pronunciado en la fase de pupa fuera del hospedador, cuya duración puede variar de 1 semana a 2 meses dependiendo de la estación (23). Así, el ciclo de vida completo de la LPNM puede ser de 2–3 meses en tiempo

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403

Capítulo 2.2.8.  Larvas perforadoras (Cochliomyia hominivorax y Chrysomya bezziana)

frío (33), mientras que en condiciones templadas con una temperatura media del aire de 22°C, se completa en 24 días (23), y en condiciones tropicales a 29°C se completa en unos 18 días (46). El grado de frío que pueden tolerar la LPNM y la LPVM tiene una influencia notable en sus distribuciones, lo que está mejor documentado en el caso de la LPNM. Históricamente, el alcance de la LPNM se extendía desde los estados del sur de los Estados Unidos de América (EE.UU.), a través de México, América Central, las islas del Caribe y los países del norte de América del Sur hasta Uruguay, el norte de Chile y el de Argentina (21). Esta distribución se contraía durante los meses de invierno y se expandía durante los meses de verano, produciendo una estacionalidad anual en sus bordes alrededor de las poblaciones de las áreas centrales –los trópicos del Nuevo Mundo. La utilización de la técnica del insecto estéril (SIT) en programas importantes ha conducido a la erradicación de la LPNM de EE.UU. (6), México (16), Curaçao, Puerto Rico, y las islas Virgin, y en América Central, de Guatemala, Belize, El Salvador, Honduras, Nicaragua, y en el año 2000, de Costa Rica (49). El programa de erradicación en América Central continúa en Panamá, donde se liberaron moscas estériles por primera vez en Julio de 1998. El objetivo final es establecer una barrera en Panamá que suponga el futuro límite norte de la LPNM en América. También se inició oficialmente un programa de erradicación de la LPNM en Jamaica en Julio de 1998, como parte de un plan para eliminar la especie de todo el Caribe. Aunque la LPNM es una especie del Nuevo Mundo, en 1988 se detectó en el norte de África en Libia, donde amenazó con establecerse firmemente. Sin embargo fue erradicada en 1991 con una campaña intensiva de SIT (13, 24). La amenaza de extensión de las larvas perforadoras, favorecida por los rápidos sistemas de transporte moderno, siempre está presente, y requiere una vigilancia constante de cuarentena y otras medidas frontales de sanidad animal y humana en las áreas no afectadas. Se han descrito recientemente casos de LPNM en México, EE.UU. e incluso en el Reino Unido (28). La distribución de la LPVM está limitada al Viejo Mundo, como sugiere su nombre, principalmente a través de África (desde Etiopía y los países sub–saharianos hasta el norte de Sudáfrica), los países del Golfo, el subcontinente indio, y el sudeste asiático (desde el sur de la República Popular China a través de la península de Malasia y las islas de Indonesia y Filipinas hasta Papúa Nueva Guinea) (21, 38, 42, 50). También se ha descrito la miasis por la LPVM en Argelia (1), por un pastor local, pero la ausencia de otros casos descritos, en particular casos en animales, sugiere que es improbable su presencia continuada. La situación en el área del Golfo es dinámica, con casos recientes confirmados en Irán (32) e Irak (2). Las necesidades climáticas de las dos especies de larvas perforadoras son muy similares y su distribución potencial, si no se limitara, se superpondría en gran medida (42). Los insecticidas organofosforados como el diclofention, fenclorfos, y en particular, el coumafos son recomendables para el tratamiento de las heridas infestadas con la LPVM y la LPNM (15, 34, 40). Tiene el efecto de expulsar las larvas, que caen al suelo. Para favorecer una protección residual contra la reinfestación, deben aplicarse a intervalos de 2–3 días hasta que la herida sane. Los contenidos de bolsitas individuales para el tratamiento de las heridas, como por ejemplo 5 g de coumafos en polvo mojable al 5%, deben espolvorearse directamente sobre una herida o, para mayor eficacia, extendidos sobre la herida como una pasta después de mezclar con aceite ordinario de cocina (33 ml). Los compuestos organofosforados también se pueden aplicar como aerosoles pulverizados, con colorantes marcadores y bacteriostáticos incorporados, o como polvos aplicados a la herida mediante opresión de botellas de plástico. El diclorodifention se utiliza en Sudamérica en aerosol al 1% para tratar casos de LPNM y es también eficaz contra la LPVM (34). Para evitar la sepsis, debe eliminarse de la herida cualquier larva muerta. Siempre se debe prestar atención a las instrucciones de seguridad de los fabricantes. Se puede obtener una prevención directa de la infestación por larvas perforadoras mediante pulverización o inmersión del ganado con coumafos (suspensión acuosa al 0.25% de polvo mojable al 50%) o con otros insecticidas organofosforados a la concentración máxima ordenada para el control de parásitos externos. Los efectos de tales tratamientos son dobles: primero, el tratamiento mata directamente las larvas y proporciona protección residual; segundo, el tratamiento mata garrapatas y otros parásitos externos, lo que implica que habrá menos heridas disponibles como sitios de ovoposición. Potencialmente, los piretroides sintéticos pueden controlar las larvas perforadoras en las heridas, pero ha habido pocos ensayos descritos sobre su efecto en las larvas (por ejemplo, Permetrin contra la LPNM, 35). La inmersión o pulverización de un grupo de animales está indicada cuando algún miembro del grupo está infestado, o cuando el animal atraviesa o abandona un área infestada, o después de prácticas ganaderas que pueden inducir heridas en los animales, como el esquileo. Para evitar la presencia de la LPVM en los cortes umbilicales de terneros recién nacidos (34) y en los cortes escrotales de terneros castrados (39) resultó eficaz una única inyección subcutánea de ivermectin (200 µg/kilo). El ivermectin también evita la reapertura de cortes de heridas tratadas en ganado adulto. El tratamiento del ganado con cápsulas de liberación sostenida de ivermectin no desarrolló miasis entre los 14 y los 102 días después del tratamiento. Sin embargo, debido a los efectos negativos sobre la fauna del estiércol, se recomienda

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que las cápsulas se reserven para utilización en casos de epidemias de LPVM. Los resultados iniciales sugirieron que el ivermectin puede resultar ineficaz contra la LPNM (Mackley & Brown, en ref. 16), pero estudios más recientes han demostrado que produce un notable descenso en la incidencia de miasis umbilical y escrotal debida a la LPNM (7, 26). Aunque los resultados de ensayos con ivermectin muestran variaciones, los resultados con doramectin son mayoritariamente positivos (17). Se ha registrado un gran número de publicaciones que describen que una inyección subcutánea de doramectin (200 µg/kilo) fue efectiva al 100% como medida profiláctica contra la LPNM, evitando la infestación de heridas artificiales, las heridas umbilicales y de castración en terneros, y la infestación de ganado después del parto, hasta 12–14 días después del tratamiento (4,30,31). La eficacia depende de factores tales como la raza del ganado y el grado del estímulo. En un ensayo comparativo de doramectin e ivermectin, inyectados ambos subcutáneamente a 200 µg/kilo, se obtuvo una protección del 100% y del 50%, respectivamente, frente a miasis por LPNM experimentalmente inducida 2 horas después del tratamiento (29). Doramectin también produjo una protección completa después de 21 días y parcial (56%) a los 28 días del tratamiento (29). En otro estudio comparativo más amplio, doramectin tuvo una eficacia media de 94.6% (intervalo 53.3–100%), en comparación con el 43.7% (rango 0–100%) de ivermectin (10). El abamectin (por inyección subcutánea a 200 µg/kilo) dio una buena prevención, pero no del 100%, contra la miosis por castración debida a la LPNM (3). Fórmulas mixtas de moxidectin, eprinomectin y doramectin dieron una protección baja contra la miasis por LPVM en comparación con fórmulas inyectables de doramectin contra LPNM (48). Hay algunas indicaciones de que el fipronil (un fenil–pirazol) puede ser eficaz en la prevención de la miasis después de la castración. De modo similar, la aplicación tópica de un regulador del crecimiento de los insectos (IGR), el diciclanil, dio una buena protección (>90%) contra la miasis por la LPNM en heridas de ganado castrado. Los IGRs son muy específicos de los insectos, y por tanto son menos peligrosos para el medio que muchos otros grupos de insecticidas. Para la prevención indirecta de infestación por moscas con larvas perforadoras se precisa lo siguiente: evitar la producción de heridas en la época del año en que las larvas son numerosas, el manejo cuidadoso del ganado para minimizar las heridas, la eliminación de objetos punzantes (como alambres de espino) de los corrales de ganado, y la utilización de medidas para reducir otros parásitos causantes de heridas, particularmente garrapatas, como por ejemplo, por inmersión en insecticidas o con marcadores impregnados de insecticida en las orejas. Para evitar la extensión de las larvas perforadoras más allá de los límites actuales, es necesaria la observación estricta de los requisitos existentes para el mercado internacional, como se indica en el Código Sanitario de Animales Terrestres de la OIE.

B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO 1.

Identificación del agente

Resulta difícil la identificación morfológica de los huevos y el primer estado larval de los agentes de la miasis y, debido a que raramente se encuentran estas fases durante la recogida de muestras en heridas infestadas, no se consideran aquí con más detalle. Las larvas recogidas para el diagnóstico deben tomarse de la parte más profunda de la herida para reducir la posibilidad de tomar especies distintas a las de las larvas perforadoras, que podrían infestar las partes más superficiales de la herida. Las muestras vivas deben examinarse primero en cuanto a la pigmentación de los troncos traqueales dorsales (Figura 1) y luego deben conservarse en etanol al 80% antes de examinarlas en el laboratorio en un microscopio de disección con hasta x50 aumentos (para técnicas adicionales, ver refs. 12, 20, 37, 50). La conservación óptima de las larvas en su estado natural extendido se logra matándolas por una breve inmersión en agua hirviendo (15 segundos) antes de conservarlas en etanol al 80%. Segunda fase larvaria: En la segunda fase las larvas tienen solo dos hendiduras espiraculares en cada una de las placas espiraculares posteriores y tres en la tercera fase larvaria (Figuras 2 y 3). Las larvas de LPNM en segunda fase se pueden diagnosticar por la presencia de pigmentación obscura en los troncos traqueales dorsales, sobre casi la mitad de la longitud del último segmento. Otras especies tienen una pigmentación de los troncos traqueales dorsales menos extensa, por ejemplo, tales troncos están pigmentados hasta no más de un tercio de su longitud en el segmento duodécimo de LPVM. Los espiráculos anteriores de la segunda fase larvaria de LPNM tienen de siete a nueve ramas en comparación con las cuatro que presentan en la LPVM (22). Se puede obtener una identificación más positiva criando larvas vivas inmaduras hasta la tercera fase larvaria. Esto se hace en el medio estándar de carne utilizado para crecimiento a gran escala de LPNM antes de la

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introducción de dietas en gel, es decir, para un litro de agua, 1.3 Kg. de carne picada de caballo, 50 g de sangre bovina seca, y 1.5 ml de formalina (44), mezclado y mantenido a 35–38°C en una humedad relativa del 70%. En el caso de crecer larvas simplemente para identificación, el tipo exacto de carne y de sangre no es esencial, y se puede utilizar sangre fresca, que es más fácilmente disponible, en lugar de la sangre seca. Tercera fase larvaria: Tanto en la LPNM como en la LPVM, las larvas en la tercera fase larvaria tienen un aspecto robusto típico de gusano, con un cuerpo cilíndrico de 6–17 mm de largo y 1.1–3.6 mm de diámetro, afilado en el extremo anterior (23, 37). Las larvas completamente maduras de LPNM y LPVM desarrollan un tenue color rosado frente al blanco cremoso de las larvas más jóvenes. Ambas especies de larvas perforadoras tienen anillos prominentes de espinas alrededor del cuerpo y estas espinas aparecen como largas y llamativas bajo el microscopio en comparación con las de especies no perforadoras, siendo las más largas de 130 µm. Las espinas en la LPNM pueden tener punta sencilla o doble, pero en la LPVM la punta siempre es sencilla. Cada uno de los espiráculos anteriores de LPNM tiene de seis a once ramas bien separadas, normalmente de siete a nueve (Figura 2). En la LPVM, cada espiráculo anterior tiene de tres a siete ramas, normalmente de cuatro a seis (Figura 2). Este último carácter no debe utilizarse como propio para identificar la LPVM, pues las larvas en la tercera fase de la especie causante de miasis Wohlfahrtia magnifica (Diptera: Sarcophagidae), cuya distribución se superpone con la LPVM en el Oriente Medio, tiene espiráculos con ramificación similar. Por tanto, al utilizar cualquier clave de identificación, como la de la Figura 1, es esencial que cada muestra recorra toda la clave para evitar identificaciones erróneas. En la cara posterior del segmento terminal de la LPNM y de la LPVM, las placas espiraculares posteriores tienen un peritremo incompleto y con pigmentación obscura que encierra tres aberturas rectas, con perfil ligeramente ovalado, que apuntan hacia el hueco en el peritremo. Estas características diagnósticas se ilustran en la Figura 3. Los troncos traqueales dorsales son de mayor valor diagnóstico, que se extienden hacia delante desde las placas espiraculares posteriores y están pigmentadas de negro hasta el segmento décimo o noveno en la LPNM (Figura 1; ver también las refs. 12, 14, 17, 20, 21, 37, 50 para claves de identificación). Esta característica se ve más fácilmente en larvas vivas. Las mantenidas en conservante pueden requerir disección para extraer los tejidos opacos que tapan los troncos. Los troncos traqueales dorsales de la LPVM solo están pigmentados en el segmento duodécimo. Sin embargo, en la LPVM las tráqueas secundarias que se ramifican a partir de los troncos traqueales dorsales están pigmentadas desde el segmento decimosegundo hacia delante hasta el segmento décimo al menos (confirmado en muestras de diversa distribución, de Malasia, Bahrain y Zimbabue; M.J.R. Hall, datos no publicados). Por el contrario, estas tráqueas secundarias no están pigmentadas en la LPNM, y solo lo están las tráqueas dorsales. Por tanto, la pigmentación traqueal parece invertida en las dos especies de larvas perforadoras. Adultos: Las moscas adultas necesarias para identificación se suelen capturar utilizando trampas orientadas al viento (8) y con trampas pegajosas (37) cebadas con una substancia olorosa sintética, el swormlure–4 (27). Para fines de investigación, se han usado sistemas de muestreo alternativos con mallas eléctricas o superficies adherentes en objetivos visuales cebados con olor (18). La identificación de moscas adultas no suele ser necesaria para el diagnóstico de la miasis, ya que los estados larvarios son los más aparentes a los propietarios de ganado y al personal veterinario (4). No obstante, se incluye una breve descripción. i)

LPNM: La longitud del cuerpo suele ser de 8–10 mm y tiene un color metálico fuerte azulado o azul grisáceo, con tres bandas longitudinales obscuras en la superficie dorsal del tórax. Esta combinación de color y bandeado no es compartida por ninguna otra especie normalmente implicada en las miasis de heridas a excepción de la larva secundaria perforadora del Nuevo Mundo, Cochliomyia macellaria (Fabricius). Estas dos especies de Cochliomyia se pueden distinguir por la presencia de sétulas negras en las placas fronto–orbitales de la cabeza de LPNM en comparación con los escasos pelos amarillos que presenta en dicha zona C. macellaria. El quinto terguito abdominal de la LPNM (el cuarto visible) tiene un aspecto lateral muy ligeramente polvoriento mientras que el de C. macellaria presenta una densa carga de suciedad que produce un par de manchas laterales distinguibles de aspecto blanco plateado. Además, las hembras de la LPNM tienen una basicosta obscura de tono negro marrón, que en C. macellaria es amarilla (Figura 4; ver también las refs. 11, 14, 23, 37).

ii)

LPVM: El cuerpo mide hasta 10 mm de largo y tiene color metálico azul, azul–verdoso o azul–púrpura, es decir, es muy similar a la LPNM, pero sin las bandas torácicas. La escama alar inferior (s, en la Figura 4) difiere de la de la LPNM en que está cubierta con pelos finos en su parte superior en la LPVM y otras especies de Chhrysomya, mientras que en la LPNM carece de pelos, excepto en la base. Los adultos de la LPVM se pueden distinguir de otras Chrysomya en casos de miasis por la combinación de la presencia de los espiráculos torácicos anteriores que están coloreados de marrón obscuro o naranja obscuro (en vez de amarillo pálido, color crema o blanco) y las escamas alares inferiores de color blanco céreo (en vez de marrón obscuro o gris sucio) (37, 50).

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Extraer la larva de la herida y examinar la estructura superficial global

Larva “peluda” con salientes corporales llamativos

Larva lisa con bandas espinales no llamativas excepto en el último segmento

Chrysomya albiceps, C. rufifacies, C. varipes

Espiráculos posteriores casi escondidos en una cavidad profunda en la “cara” posterior del último segmento

Espiráculos posteriores no en cavidad sino expuestos en la “cara” posterior del último segmento

Sarcophagidae

Peritremo del espiráculo posterior cerrado

Peritremo del espiráculo posterior abierto

Muscidae y especies de Lucilia/Calliphora

Troncos traqueales dorsales con pigmentación oscura desde el segmento 12 al 10 o incluso hasta el 9

Troncos traqueales dorsales sin pigmentación oscura excepto posiblemente la mitad posterior del segmento 12

Cochliomyia hominivorax

Espiráculo anterior con 4–6 lóbulos, raramente con 7

Espiriáculo anterior con 9 o más lóbulos

Chrysomya bezziana

Otras especies de Chrysomya, Cochliomyia, Phormia or Protophormia

Fig.1. Clave de identificación para el diagnóstico del tercer estado larvario de Cochliomyia hominivorax y de Chrysomya bezziana de casos de miasis de las heridas. Para evitar errores de clasificación, es esencial que se use la clave desde el principio con cada muestra.

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as

Fig. 2. Cabeza y primeros dos segmentos torácicos del tercer estado larvario de Cochliomyia hominivorax (as = espiráculo anterior; el inserto es el espiráculo anterior de Chrysomya bezziana).

Fig.3. características del tercer estado larvario de Cochliomyia hominivorax : (A) aspecto lateral de la larva completa; (B) cara posterior del segmento terminal; (C) placa espiracular posterior; a = espiráculo anterior; b = botón adyacente a la abertura del peritremo; p = peritremo; sl = hendidura espiracular; sp = espinas). (Según Laake et al. [23].) p

Fig. 4. Características de Cochliomyia hominivorax en fase adulta; nótense las barras torácicas longitudinales; b = basicosta; p = placa fronto—orbital, vista desde arriba en la Cochliomyia hominivorax completa y lateralmente en la cabeza de una mosca típica de la familia Calliphoridae; s = escama alar inferior, con superficie sin pelo excepto en la base; v = vena mayor con pelos en la superficie dorsal posterior.

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Además de las técnicas morfológicas estándar comentadas previamente, hay otras más recientes para la identificación de las larvas perforadoras y de su origen geográfico que incluyen el análisis hidrocarbonado de la cutícula (9), el análisis del ADN mitocondrial (19, 25, 45), y el uso de la reacción en cadena de la polimerasa para amplificación al azar del ADN polimórfico (RAPD–PCR) (36). Los problemas de identificación de larvas o adultos en casos de miasis se pueden dirigir al Centro de Colaboración sobre Insectos Causantes de Miasis y Su 2 Identificación de la Organización para la Alimentación y Agricultura (FAO) de las Naciones Unidas.

2.

Pruebas serológicas

No existen en la actualidad pruebas serológicas estandarizadas, ni están indicadas para el diagnóstico de la enfermedad. Sin embargo, varios estudios experimentales han mostrado que las técnicas serológicas tienen un valor potencial en futuras investigaciones sobre la prevalencia de las infestaciones de las larvas perforadoras en las poblaciones animales, detectando los anticuerpos correspondientes después de la infestación (47).

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO Actualmente no se dispone de productos tales como vacunas. Sin embargo, están en marcha investigaciones sobre el desarrollo de vacunas potenciales (5) (43). El único método probado de erradicación de la LPNM se basa en una técnica biológica, la técnica del insecto estéril, SIT (16, 24), que también se ha aplicado experimentalmente en el caso de la LPVM (41). En esta técnica, se liberan al campo secuencialmente grandes cantidades de moscas macho en su fase pupal última que han sido esterilizados por radiación gamma. Cualquier apareamiento con moscas hembra origina solo huevos que no son fértiles, originando una reducción progresiva de la población y, eventualmente, su erradicación. En situaciones operativas, la técnica SIT se apoya con un tratamiento con insecticidas de las heridas infestadas en el ganado por las larvas perforadoras, con el control estricto del movimiento del ganado, con cuarentena de los animales infestados y con una campaña activa de publicidad. La técnica SIT resulta muy cara por el coste de la producción continua y la dispersión aérea de las moscas estériles. Históricamente, solo se ha considerado rentable cuando se utiliza como una estrategia de erradicación en situaciones donde la geografía puede favorecer tal programa (por ejemplo, referencias 13,24). En la actualidad, solo existe una instalación en el Nuevo Mundo para producir larvas perforadoras estériles, en 3 4 Tuxtla Gutierrez al sur de México. Otra será construida en Panamá . En 1998 se abrió una instalación experimental en Malasia para producir LPVM estériles.

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2

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Capítulo 2.2.8.  Larvas perforadoras (Cochliomyia hominivorax y Chrysomya bezziana)

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* * *

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CAPITULO 2.2.9.

TRIQUINELOSIS

RESUMEN La infección que causa la Trichinella en los animales destinados a la alimentación y los de caza es importante debido al riesgo que dicha infección comporta para los humanos que consumen carne cruda o poco cocinada. Los adultos de las especies de la Trichinella sobreviven menos de dos meses y se pueden encontrar en el intestino delgado de los humanos, los cerdos, las ratas, los osos, las morsas, y en cualquier otro mamífero carnívoro y ocasionalmente en caballos. Las larvas de la mayoría de los genotipos de la Trichinella se sitúan en los tejidos musculares de sus hospedadores y la ingestión de tejido que contenga dichas larvas, transmite la infección a los individuos susceptibles. Las pruebas de diagnóstico para la infección por Trichinella se agrupan en dos tipos: 1) la detección directa de la primera etapa de la larva enquistada o libre en tejido de músculo estriado, y 2) la detección indirecta de la infección mediante pruebas para anticuerpos específicos. La sensibilidad y especificidad de los métodos serológicos están estrechamente relacionadas con el tipo y la calidad del antígeno utilizados. En los cerdos se ha alcanzado un buen nivel de validación. Sin embargo, una respuesta serológica en cerdos con indicios de infección moderada, no se detecta comúnmente hasta las 3 semanas o más después de que las larvas de los músculos se hacen infectivas. En tales casos se podría obtener un resultado serológico falso negativo. Se ha descrito un índice bajo de resultados falsos positivos en las pruebas serológicas. Con el fin de efectuar una inspección de la carcasa individual, sólo pueden recomendarse los métodos directos. Para un seguimiento o verificación de las manadas o regiones libres de triquinas, son aceptables los métodos serológicos. Identificación del agente: Para detectar directamente la infección por Trichinella se utilizan dos métodos: el método de compresión o el método de digestión del tejido muscular. Ambos métodos prueban la presencia de parásitos en los tejidos donde la infección es más fuerte, siendo la incidencia de los mismos en los cerdos, de mayor a menor: en primer lugar sobre el diafragma, luego la lengua, y, los músculos maseteros y abdominales, aunque esto depende en parte del grado de infección. En los caballos, los músculos de la lengua y los maseteros hospedan la mayoría de las lombrices seguidos por el diafragma y los músculos del cuello. El método de compresión consiste en una inspección visual de piezas comprimidas de tejido muscular para comprobar la presencia de las larvas “in situ”. Este método se puede llevar a cabo con un estéreomicrospcopio, pero generalmente se utiliza un microcopio especializado como el triquinoscopio que tiene una eficacia estimada de detección de como mínimo tres larvas por gramo de tejido. Este método tiene la desventaja de que requiere mucho tiempo para la inspección de múltiples muestras de cada carcasa. También es muy difícil detectar la larva de T. pseudospiralis, T. papuae, y T. zimbabwensis de los cocodrilos africanos, que no estén envueltas en colágeno. Por estas razones, la compresión no está recomendada en una inspección rutinaria, pero es útil para detectar medianas a grandes infecciones, cuando se necesita examinar unos pocos animales y las instalaciones no están preparadas para una prueba de digestión artificial. Los métodos de digestión artificial incluyen la digestión enzimática de muestras de tejido muscular individuales o agrupadas, seguida de procedimientos de revisión selectiva, de filtración y de sedimentación. Las muestras procesadas con estos métodos se examinan microscópicamente para comprobar la presencia de larvas. Los métodos de digestión incluyen homogenización y

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Capítulo 2.2.9. — Triquinelosis

agitación mecánica, usándose una muestra de 1 g para cerdos y otra de 10 g para animales de caza y caballos y tienen una eficacia de aproximadamente 3 larvas por gramo de tejido examinado. Estos métodos se recomiendan en la inspección individual de carcasas de cerdos, caballos y animales de caza cuando su carne está destinada al consumo humano. Pruebas Serológicas: El enzimoinmunoensayo (ELISA) es el único método apropiado para la detección ante–mortem de la infección por Trichinella y en los cerdos se han detectado niveles de 1 larva/100 g de tejido. La especificidad de ELISA para detectar la infección por Trichinella está directamente relacionada con el tipo y la calidad del antígeno empleado en la prueba. Los antígenos secretores que se han recogidos manteniendo in vitro por breve tiempo las larvas T. spiralis del músculo y los antígenos carbohidratados sintéticos, proporcionan actualmente la fuente más específica y económica, aunque en algunos estudios se han obtenido índices bajos de falsos positivos. Se puede obtener un índice bajo de resultados falsos negativos en un ELISA con animales recientemente infectados que tienen un grado de infección bajo. Por esta razón se recomienda el uso de antígenos secretores en un ELISA para programas de seguimiento pero no en pruebas de carcasas individuales. Se recomienda la digestión de 100 g o más de tejido como prueba confirmatoria para animales serológicamente positivos. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: La vacuna para la infección por Trichinella no es práctica en animales destinados a la alimentación. No se requieren reactivos biológicos en los métodos directos de detección. En los métodos indirectos (serológicos) se deben usar los antígenos TSL–1 para garantizar la especificidad de la prueba. Estos antígenos pueden obtenerse como productos secretores recuperados a partir del mantenimiento de las larvas del músculo in–vitro o como antígenos carbohidratados sintéticos producidos comercialmente.

A. INTRODUCCIÓN La infección por Trichinella en animales destinados a la alimentación es importante debido al riesgo de triquinelosis en los humanos que comen carne cruda o poco cocida. Los adultos de Trichinella sp. se pueden encontrar en el intestino delgado de los humanos, cerdos, ratas, osos, morsas y en cualquier otro mamífero carnívoro, pero también puede afectar a los caballos, los pájaros y los cocodrilos. El parásito tiene un ciclo de vida directo. Las hembras son ovovivíparas. Las larvas se esparcen en las venas mamarias, entran en la glándula linfática, alcanzan la sangre venosa y entonces muchas mueren, otras sobreviven estableciéndose en los músculos estriados, especialmente los del diafragma y la lengua de los cerdos y la lengua y los músculos maseteros de los caballos. Las larvas se enquistan en el tejido muscular y la ingestión del tejido que contiene estas larvas transmite la infección a otro hospedador. Se reconocen 8 especies de Trichinella (19, 23, 24). La Trichinella spiralis (también llamada T–1) que se distribuye en zonas templadas de todo el mundo y se asocia comúnmente con cerdos domésticos. Es muy infecciosa para los cerdos, ratones y ratas. La Trichinella nativa (T–2) y sus sub–especies, la Trichinella T–6 encontrada en Norteamérica, es una especie adaptada a los climas fríos. Es moderadamente infecciosa para los cerdos, pero se encuentra comúnmente en cánidos, osos y morsas. Además se distingue por su resistencia a la congelación. La Trichinella britovi (T–3) se encuentra principalmente en animales salvajes, aunque ocasionalmente se pueda encontrar en cerdos o caballos. Se da en regiones templadas de Europa y Asia. La Trichinella britovi y los genotipos con ella relacionados, Trichinella T–8 de Sudáfrica y Trichinella T–9 de Japón, tienen algunas características intermedias de otras especies, incluyendo una cierta resistencia a la congelación, infectividad moderada en los cerdos y formación lenta de cápsulas (en algunos casos las larvas han sido confundidas con especies no encapsuladas). La Trichinella murrelli (T–5) es una especie de Norteamérica encontrada en la fauna silvestre y ocasionalmente en caballos y en humanos. Es muy poco infectiva para los cerdos domésticos, pero representa un riesgo para los humanos que comen carne de caza. Se ha aislado Trichinella nelsoni (T–7) esporádicamente de la fauna silvestre de África. Se caracteriza por su gran resistencia a temperaturas elevadas comparada con otras especies de Trichinella. Tres especies de Trichinella no forman cápsula de colágeno en el músculo. La Trichinella pseudospiralis (T–4) tiene una distribución cosmopolita y ha sido recuperada de las aves de rapiña, de los carnívoros salvajes y de los omnívoros, ratas y marsupiales, en Asia, Norteamérica, Europa y el subcontinente Australiano. La Trichinella papuae (T–10) es una segunda especie que no forma cápsula. Hasta la fecha sólo se ha descubierto en cerdos salvajes y en humanos de Papua en Nueva Guinea. Es resistente a la congelación, tiene poca infectividad para los cerdos y se encuentra en una gran variedad de animales mamíferos salvajes y ha sido señalada como causante de enfermedad en los humanos. Recientemente se ha descubierto la Trichinella zimbabwensis (T–11) en cocodrilos de granjas de Zimbabwe. Las especies pueden infectar a los cerdos y a las ratas. Todas las especies y los genotipos de Trichinella causan enfermedad en los humanos.

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Capítulo 2.2.9. — Triquinelosis

La triquinelosis en los humanos es una enfermedad seria que puede causar mucho sufrimiento y ocasionar la muerte. Las lombrices pueden tener poco efecto en los intestinos, pero pueden ocurrir señales y síntomas severos como resultado de la migración de las larvas y su presencia en los músculos estriados. La enfermedad se transmite por comer carne infectada que no ha sido suficientemente cocinada (o que sea segura por cualquier otro procedimiento). Para prevenir la infección en los humanos es necesario inspeccionar la carne procesándola (bien sea cocinándola, congelándola o curándola) y evitando el contacto de los animales comestibles con carne infectada, incluyendo desperdicios de comida sin cocinar, con roedores y con otros animales salvajes. La carne procedente de la caza debería considerarse siempre como una fuente potencial de infección y, por tanto, dicha carne debe ser controlada o cocinada cuidadosamente. La Trichinella que se encuentra en la carne procedente de la caza (principalmente la T. nativa, la T–6 y, en menor grado, la T. britovi) puede ser resistente a la congelación y, por lo tanto, la carne congelada puede también representar un riesgo para la salud pública.

B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO Los métodos para detectar la infección por Trichinella en los cerdos y en otras especies pueden agruparse según dos tipos de resultado: (a) la demostración directa del parásito en muestras de tejido o digesto; (b) la demostración indirecta del parásito mediante la detección de anticuerpos específicos usando los métodos serológicos.

1.

Identificación del agente (prueba prescrita para el comercio internacional)

La demostración directa de los parásitos se limita a la inspección post–mortem de las carcasas. La sensibilidad de los métodos de prueba directos depende de la cantidad de tejido examinado y del lugar del que se ha obtenido la muestra. Los métodos de prueba actuales mediante la digestión artificial en los que se utiliza una muestra de 1 g (2, 3), tienen una sensibilidad de aproximadamente 3 larvas por gramo de tejido (9, 13); utilizando una muestra de 5 g aumenta la sensibilidad a 1 larva por gramo de tejido. Los métodos directos permitirán la identificación de cerdos, caballos u otros animales infectados en un plazo mínimo de 17 días después de la exposición al parásito, intervalo que coincide con el tiempo necesario para que las larvas alojadas en los músculos, adquieran la capacidad de infectar a un nuevo hospedador. Los métodos directos continúan siendo efectivos siempre y cuando las larvas permanezcan viables. La sensibilidad de esta prueba aumenta considerablemente cuando grandes cantidades de tejido (hasta 100 g) están disponibles para la digestión. El inconveniente de los métodos de detección directa, en especial la triquinoscopia, radica en su larga y laboriosa ejecución. Generalmente se utilizan dos métodos para el diagnóstico directo de la triquinelosis.

a)

Método del triquinoscopio o de compresión. El uso de la triquinoscopía para el examen de carne de cerdo ha sido descrito con anterioridad en otras fuentes. (2, 3). Las muestras para esta prueba se toman de los pilares del diafragma y se trocean en al menos 28 pedazos, de un tamaño aproximado de 2 x 10 mm. cada uno. La lengua, los músculos maseteros y los músculos abdominales son zonas alternativas para la extracción del tejido, aunque se necesitan muestras más grandes para obtener una sensibilidad comparable. (Los sitios del músculo preferidos por las larvas varían en función de las especies hospedadoras y sólo se han establecido con certeza en los cerdos y en los caballos. Por regla general, la lengua es uno de los músculos más infectados). Los tejidos se comprimen entre placas de vidrio (compresor de Hauptner Herberholz, Solingen, Alemania) hasta que se vuelven translúcidos. Es entonces cuando se pueden examinar en busca de larvas utilizando un microscopio de proyección diseñado especialmente a tal efecto, el triquinoscopio, aunque también cabe usar un estéreomicroscopio convencional a 15–40 aumentos. La mayoría de las larvas aparecerán enroscadas dentro de una fibra de músculo individual y la célula muscular tiene casi siempre una forma ovalada debido a la formación de la cápsula. En el caso de infecciones graves pueden observarse múltiples larvas dentro de una sola célula. Las Trichinella no encapsulada como la T. pseudospiralis, la T. papuae y la T. zimbabwensis de los cocodrilos puede observarse fuera de las células musculares, que por lo general no están enroscadas, siendo muy difícil la identificación de estas especies mediante la triquinoscopía. Debido a esta limitación y a su baja sensibilidad comparada con los métodos de digestión artificiales, la triquinoscopía y los métodos de compresión similares no se recomiendan para el examen rutinario de la carne de animales destinados a la alimentación y de animales de caza.

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b)

El método de la digestión El tejido muscular puede digerirse con fluido gástrico artificial liberando las triquinas vivas de los músculos. En la Unión Europea (2, 3) se recomiendan los procedimientos digestivos, y pueden consultarse las Directivas de la UE para más detalles. Muchos otros países tienen una legislación similar para la inspección post–mortem de la carne de cerdo (8) y de caballo (4). La Comisión Internacional para la Triquinelosis (ICT) también proporciona directrices generales sobre la aplicación de los métodos artificiales de digestión. El “método del agitador magnético para muestras agrupadas”, ampliamente usado, puede emplearse en gran número de circunstancias con un equipamiento mínimo. He aquí un esbozo general de los principios de este método: •

Toma de muestras

Las muestras de músculo se toman de los pilares del diafragma o de la lengua de los cerdos, o de la lengua o músculos maseteros de los caballos; por regla general, la lengua es uno de los músculos más infectados. Otras zonas tienen, por lo general, un número inferior de larvas. El tamaño de las muestras puede variar. Pueden tomarse muestras individuales de 100 g de un animal o se pueden recoger múltiples muestras de varios animales para hacer un agrupamiento de 100 g. El tamaño de las muestras que componen este último agrupamiento determinará la sensibilidad el método. Las directivas de la UE exigen muestras de 1–g en agrupamientos de 100–g para los ensayos con carcasas de cerdos. En los Estados Unidos de América (EE.UU.) se requieren muestras de 5–g para los cerdos, y en Canadá se ensayan 10 g por cerdo. En el caso de zonas endémicas, la ICT recomienda utilizar un mínimo de 5–g. Para pruebas con carne de caballo, la UE exige muestras de un mínimo de 5 g. Para la carne de los caballos originarios de zonas endémicas, se recomiendan muestras de 10 g. Para facilitar la digestión de las muestras es necesario triturarlas, desmenuzarlas o cortarlas en dados antes de la prueba. •

Digestión y recuperación

Cada unidad de 100 g de tejido se digiere en 1 a 2 litros de fluido gástrico artificial, que contenga pepsina al 1% (w/v) (concentración 1/10.000 formulada por estándares nacionales) y ácido clorhídrico al 1% (v/v) (0,12 N final). Se introduce la muestra troceada o triturada en el fluido digestivo y se remueve la mezcla con un agitador magnético a 37°C durante 3 horas (o durante menos tiempo a temperatura superior (por ejemplo, 30–60 minutos a 44–46°C)). Al finalizar la digestión se deja sedimentar el producto de la digestión durante 15–20 minutos y a continuación se decantan los dos tercios superiores del fluido. Se transfieren el líquido restante y el sedimento a un vaso cónico de sedimentación haciéndolos pasar por una malla de filtro de 355 µm (177–180 µm también es aceptable) y se deja sedimentar durante otros 15–20 minutos. Transcurrido este tiempo se aspira el máximo volumen posible de sobrenadante, sin remover el sedimento: se lava este último con agua caliente del grifo a (37°C) y se deja reposar por otros 15–20 minutos. Esta operación de lavado se repite tantas veces como sea necesario hasta que el sobrenadante no muestre la menor turbidez. Se transfiere entonces el sedimento lavado a un tubo de 50–ml, se deja reposar y se aspira el contenido hasta alcanzar un volumen final de 10 ml. Los 10 ml se vierten en una placa de Petri con rejilla y se examinan para larvas Trichinella con un microscopio de disección (a 15–40 aumentos). Alternativamente, tras preparar la digestión en 3 litros de fluido gástrico artificial, se puede colar la suspensión digestiva en un embudo de separación con un tamiz (de 177–180 µm). Se enjuaga bien el tamiz dentro del embudo de separación con agua del grifo y se deja reposar la suspensión durante 30 minutos (5). Luego se cuelan 125 ml dentro del embudo de separación de 500 ml, se le añaden 375 ml de agua del grifo y se deja reposar la suspensión durante 10 minutos más. Finalmente, se liberan de 22 a 27 ml de sedimento en una placa de Petri y se hace el recuento como se describió anteriormente. Este método tiene menos etapas, requiere menos tiempo y raras veces necesita fases posteriores de clarificación. Una vez separadas por digestión de la célula muscular, las larvas de la primera fase del ciclo tienen aprox. 1 mm. de largo y 0,03 mm. de ancho. El rasgo más característico de las larvas de Trichinella es el esticosoma, formado por una serie de células discoides que, dispuestas a lo largo del esófago, ocupan la mitad anterior del cuerpo de la lombriz. Las larvas de Trichinella pueden aparecer enroscadas (a baja temperatura), móviles (a temperatura templada) o en forma de una C (media luna) (cuando están muertas). En caso de duda, las lombrices deberían observarse con un mayor aumento y deberían examinarse más tejidos. Si el recuento es elevado, deberá repetirse la prueba llevando antes la muestra a una dilución apropiada. Cuando se detecten larvas en muestras de digestión agrupadas, debe aplicarse el procedimiento completo de digestión a cada una de las muestras individuales que integran la agrupación con el fin de identificar infecciones en las carcasas individuales. El uso de una trituradora de tejido con control termostático (Stomacher) reduce el tiempo de digestión a unos 12–15 minutos. Se han descrito (3) los detalles de otros métodos que utilizan el Stomacher Lab Blender 3500T (Seward Londres, Reino Unido) o los embudos separadores dobles (8), y también puede

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Capítulo 2.2.9. — Triquinelosis

recomendarse un protocolo alternativo para aplicar el método del agitador magnético para muestras agrupadas, aprobado por la Unión Europea (84/319/EEC). •

Garantía de calidad en la prueba de digestión

Los laboratorios que utilicen métodos de digestión artificial deben mantener un sistema de garantía de calidad apropiado para garantizar la sensibilidad de la prueba. Los componentes de un sistema de garantía de calidad para la prueba de digestión están descritos por la Comisión Internacional para la Triquinelosis (12) y en otros lugares, y deben incluir el uso regular de paneles de suficiencia.

c)

Reacción en cadena de la polimerasa La identificación de las especies o tipos de Trichinella recuperadas del tejido muscular puede ser útil para entender la epidemiología de los parásitos en animales y para evaluar el riesgo relativo de la exposición humana. Se han desarrollado sondas genómicas (cebadores) específico(a)s que permiten la diferenciación de todas las especies conocidas y genomas de la Trichinella por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (1, 25). La solicitud para aislar un tipo especial de la Trichinella puede hacerse a través del Laboratorio de Referencias de la OIE en Roma, Italia, y en Saskatoon, Canadá (véase cuadro en la Parte 3 del Manual Terrestre). Algunos estudios de alcance limitado han demostrado que la PCR puede usarse para detectar larvas en la musculatura de los animales infectados (26). Sin embargo, esta tecnología, en su forma actual, no es un método práctico para las pruebas rutinarias con animales destinados al consumo humano.

2.

Pruebas serológicas

El uso del enzimoinmunoensayo (ELISA) para detectar la presencia de los anticuerpos específicos de parásitos es un método rápido que puede realizarse en sangre o en suero recogido antes o después del sacrificio. Se han detectado en cerdos (11) niveles de infección muy bajos, de una larva por 100 g de tejido, mediante ensayos ELISA. Este alto nivel de sensibilidad hace de la prueba serológica mediante el ensayo ELISA un método útil para la detección de la transmisión de la infección por Trichinella en las granjas o para los programas de seguimiento más amplios. Una desventaja de la serología en la detección de la infección por Trichinella es la incidencia de una tasa baja de resultados negativos falsos en el caso de animales infectados. Tales resultados se deben a un desfase en la cinética de las respuestas de los anticuerpos en los animales ligera o moderadamente infectados por la T. spiralis o por las especies de la Trichinella silvestre. Esta baja tasa de producción de anticuerpos significa que los animales infectados no pueden detectarse hasta 3–5 semanas después de la exposición (9, 13). Por esta razón, las pruebas serológicas no son recomendables en las pruebas con carcasas individuales. Las respuestas serológicas persisten en los cerdos durante al menos 6 meses después de la infección sin interrupción o disminución (9); sin embargo, se han detectado la disminución de anticuerpos en los caballos a los pocos meses de la infección, coincidiendo con una disminución de las larvas en los músculos (20). De este modo, la evaluación serológica de la Trichinella en caballos puede no tener valor dado que los caballos que hospeden cientos de larvas por gramo de tejido muscular pueden mostrar una serología negativa. Es poco lo que conoce acerca de las respuestas de los anticuerpos a la infección por Trichinella en especies de caza. La calidad de las muestras de suero de los animales de caza es de gran importancia para evitar reacciones positivas falsas. Se han desarrollado varias preparaciones de antígenos que proporcionan un alto grado de especificidad para la infección por Trichinella en cerdos y caballos (11, 16, 24). En las pruebas de matadero, el ensayo ELISA arrojó menos de un 0.3% de resultados positivos falsos y cerca de un 100% de sensibilidad en la detección de cerdos infectados con más de 1 larva por gramo de tejido. (21). Los antígenos secretores (ES) de la T. spiralis usados en el ensayo ELISA se conservan en todos los tipos de la Trichinella (22) y, por tanto, la infección puede detectarse en cerdos o en otros animales que hospedan alguna de las ocho especies. Otras pruebas serológicas distintas al ensayo ELISA (por ejemplo, las pruebas de inmunoflorescencia) carecen de especificidad y no son adecuadas para la detección de la infección por Trichinella.

•

Enzimoinmunoensayo La diagnosis de la infección por Trichinella mediante el ensayo ELISA puede realizarse usando antígenos de esticosomas secretados que se han tomados de las larvas de T. spiralis (11). Los antígenos reconocidos en las secreciones de las lombrices constan de un grupo de glicoproteínas estructuralmente

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relacionadas con pesos moleculares de 45–55 kDa (14, 22). En el ensayo ELISA también se ha utilizado un antígeno de carbohidrato sintético (antígeno sintético carbohidratado), pero este antígeno no está disponible fácilmente y ha demostrado una sensibilidad más baja. •

Producción de antígeno

La especificidad y sensibilidad del ensayo ELISA depende en gran medida de la calidad del antígeno utilizado en la prueba. Los antígenos reconocidos por los animales infectados por Trichinella son los específicamente secretados de las células de esticocitos de las larvas vivas L1 y sostienen (soportan) el epítopo carbohidratado TSL–1. Las especies de Trichinella normalmente usadas en las preparaciones de antígeno son la T. spiralis o la T–1. A efectos de estandarización, es recomendable que estas especies sean utilizadas en los ensayos ELISA aplicados a la carne de animales destinada al consumo. Sin embargo, se ha demostrado que el antígeno preparado de cualquier otra especie de la Trichinella puede usarse para la detección de anticuerpos en animales infectados independientemente cuál sea la especie que produce la infección (18). Los parásitos que van a usarse en la preparación de antígeno deben ser mantenidos por pases en serie en ratones y ratas Para preparar el antígeno que va a ser usado en ensayos ELISA (16), se recuperan las larvas de T. spiralis (T–1) en estadio muscular de las carcasas de ratones de campo o ratas sin piel ni vísceras mediante digestión en pepsina al 1% con HCI al 1% a 37oC durante 3 horas (como se describe arriba). Se lavan las larvas (3 veces durante 20 minutos cada vez) en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con penicilina (500 units/ml) y estreptomicina (500 unidades/ml). Luego se colocan (a una densidad de 5.000 L1/ml) en DMEM suplementado con HEPES (hidroxietilpiperazina N–2, ácido etanesulfónico N–2) (10mM), glutamina (2mM), piruvato (1mM) y penicilina (250 unidades/ml) / estreptomicina (250 µg/ml) (DMEM completo) a 37°C en 10% CO2 en aire. El medio de cultivo se recupera después de 18–20 horas, se retiran las lombrices por filtración y el fluido se concentra a presión mediante una membrana de retención de un peso molecular de 5.000 Da. Los antígenos secretores (ES) así recuperados pueden almacenarse congelados por cortos períodos a –20°C o por más tiempo a –70°C; estos antígenos contienen aproximadamente 25 componentes proteicos según SDS/PAGE (sulfato dodecil de sodio / electroforesis en gel de poliacrilamida), muchos de los cuales admiten la diagnosis del epítopo de antígeno de carbohidrato TSL–1. La calidad del antígeno es fundamental para la especificidad del ensayo ELISA. Deben seguirse varios pasos para monitorizar el crecimiento de las bacterias, bien sea de forma visual con el microscopio o recubriendo una muestra de medio. Los cultivos que muestren cualquier crecimiento bacteriano deben ser desechados. Las larvas no deberían mantenerse más allá de 20 horas; el deterioro de las lombrices después de este tiempo contribuye al escape de antígenos somáticos que reducen la especificidad de la prueba. Los antígenos producidos en la forma descrita deberían tener una gama (ratio) de absorbancia 280:260 nm de >1.0. Los antígenos obtenidos a partir del mantenimiento in–vitro de las larvas de la Trichinella deben ensayarse frente a un panel de sueros positivos y negativos conocidos. •

Procedimiento de la prueba

Más adelante se da un ejemplo de un ensayo ELISA para detectar la infección por Trichinella en cerdos. Es esencial que todos los reactivos usados en el ensayo estén estandarizados para una concentración óptima con el fin de obtener resultados fiables. Los valores típicos se indican en el ejemplo.

418

i)

Se cubre la placa de microtitulación de 96 pocillos con 100 µl de antígenos ES de T. spiralis diluidos a 5 µg/ml en agua tamponada (50 mM de carbonato/bicarbonato tamponado, pH 9,6). Se realiza la cobertura durante 60 minutos a 37°C o toda la noche a 4°C.

ii)

Se lavan tres veces los pocillos cubiertos con antígeno en tampón de lavado que contenga 50 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 5% de leche en polvo desnatada y 1,0% de Triton X–100. Después de cada lavado, las placas se deben secar.

iii)

Diluir a 1/10 o 1/100 suero de cerdo en tampón de lavado. Las fuentes alternativas de anticuerpos que pueden usarse en lugar de los sueros son, entre otros, la sangre total o los fluidos de tejidos. Agregar 100 µl de suero diluido a los pocillos cubiertos con antígeno. Debe usarse en cada placa una muestra de suero positivo conocida y una muestra de suero negativo conocida con una dilución idéntica a la de los sueros de la prueba. Se incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos.

iv)

Lavar tres veces los pocillos como en el apartado ii.

v)

Añadir a cada pocillo 100 microlitros de una IgG (inmunoglobulina G) contra cerdo obtenida en conejo, purificada por afinidad y conjugada con peroxidasa a una dilución apropiada en tampón de lavado, por ejemplo, una dilución 1/1.000 de IgG de conejo contra cerdo (0,1 mg/ml) producido por Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, Maryland, EE.UU. Tras añadir el segundo anticuerpo, incubar las placas durante 30 minutos a temperatura ambiente.

vi)

Lavar tres veces los pocillos como en el apartado ii. y enjuagarlos una vez con agua destilada.

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Capítulo 2.2.9. — Triquinelosis

vii)

Añadir 100 µl de un sustrato de peroxidasa apropiado (por ejemplo, ácido aminosalicílico–5’ [0,8 mg/ml] con 0,005% de hidrógeno de peróxido, pH 5,6–6,0).

viii) Después de 5–15 minutos, leer las placas para ver la densidad del color a 450 nm en un lector de microtitulación automático. Los valores obtenidos de los ensayos ELISA, que son cuatro veces superiores a los de los controles agrupados de suero normal, se consideran positivos. Los valores tres veces mayores que los normales se consideran sospechosos. Sin embargo el valor de corte está determinado por la raza del cerdo. Existen adaptaciones comerciales del ensayo ELISA en formato más corto, necesitándose menos de una hora para su realización.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO No es práctica una vacuna para la infección por Trichinella en animales destinados al consumo. No existen productos biológicos establecidos para métodos de detección directa. Para métodos indirectos (serológicos) debe usarse antígenos TSL–1 para garantizar la especificidad de la prueba. Estos antígenos pueden obtenerse como productos secretores recuperados mediante el mantenimiento de las larvas del músculo in–vitro (las larvas del músculo se obtienen inicialmente ex vivo) o como antígenos de carbohidrato sintéticos producidos comercialmente.

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Capítulo 2.2.9. — Triquinelosis

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* * * NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Trinquinelosis (véase Cuadro en la Parte 3 de este Manual de animales terrestres o consulte la página Web de la OIE para una lista más actualizada: www.oie.int).

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CAPÍTULO 2.2.10.

FIEBRE Q

RESUMEN La fiebre Q (del inglés Query, interrogante) es una zoonosis presente en la mayoría de los países. El hombre adquiere la infección a partir de los animales, en especial de los rumiantes domésticos. La fiebre Q es una enfermedad muy infecciosa debida a la multiplicación de Coxiella burnetii, una bacteria pequeña y pleomórfica que mide 0.3-1.5 µm de largo por 0.2-0.4 µm de ancho. Como se trata de una bacteria estrictamente intracelular, C. burnetii sólo puede crecer en huevos embrionados o cultivos celulares o, cuando resulta necesario, en animales de laboratorio inoculados. Se presenta en dos formas antigénicas: la fase patógena I, que se encuentra en animales infectados o en el hombre, y la fase avirulenta II, que se obtiene por pases repetidos en huevos embrionados o en cultivos celulares. Debido a que este microorganismo es extremadamente peligroso, el manejo de C. burnetii viable debe llevarse a cabo en servicios que cumplan los requisitos de la OIE para patógenos del Grupo 3 de Contención. En el hombre, la fiebre Q se presenta como una forma aguda (episodio febril autolimitado, neumonía, hepatitis) o como una forma crónica grave (endocarditis) después de una infección inicial que puede pasar desapercibida. La forma aguda se resuelve rápidamente después de una terapia antibiótica adecuada, pero la manifestación crónica requiere una terapia antibiótica prolongada (durante 2 años o más), junto a un seguimiento serológico. En algunos países, se dispone de vacuna para grupos de población potencialmente expuestos por motivos profesionales. En el ganado, los síntomas de la fiebre Q incluyen aborto, descendencia muerta o debilitada, retención placentaria, metritis e infertilidad. En los pequeños rumiantes, la fiebre Q está a menudo asociada a abortos esporádicos o a brotes de abortos seguidos de una recuperación sin complicaciones. La infección por Coxiella burnetii persiste durante varios años, y probablemente dura toda la vida. Las ovejas, cabras y vacas son mayoritariamente portadores asintomáticos, pero pueden liberar cantidades masivas de bacterias en el parto, y de forma intermitente en varias secreciones y excreciones. Algunos animales domésticos, como gatos, conejos, pájaros, etc., también son susceptibles a la infección y deben considerarse como fuentes potenciales de infección para los animales y el hombre. Identificación del agente: Para el diagnóstico laboratorial, se pueden tomar muestras de la placenta, de descargas vaginales y del hígado, pulmones o contenido del estómago de fetos abortados, o de la leche, calostro o heces. La bacteria se puede visualizar por tinción en frotis de tejidos mediante un microscopio con objetivo de inmersión. Debido a que es alcohol-ácido resistente, se puede teñir por diversos métodos: el de Stamp, el método modificado de Ziehl-Neelsen, el de Gimenez, el método de Giemsa, o el método de Koster modificado. Esta detección constituye una evidencia presuntiva de fiebre Q, pero unida con pruebas serológicas, datos clínicos, y otros agentes infecciosos abortivos, puede ser suficiente para establecer un diagnóstico de la enfermedad a nivel del rebaño o de la explotación. En la actualidad, se considera que la demostración del agente por inmunohistología usando anticuerpos específicos o por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) resulta más específica y sensible que los métodos clásicos de tinción. Sin embargo, no existen anticuerpos específicos para inmunoquímica que estén disponibles a nivel comercial, y la técnica de PCR requiere laboratorios convenientemente equipados. La PCR constituye una prueba útil para diagnosticar gran número de muestras y varios tipos de muestras. Además, las muestras se pueden inactivar por calor, con la consiguiente seguridad para el personal de laboratorio.

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Capítulo 2.2.10. — Fiebre Q

Coxiella burnetii se puede aislar por inoculación de muestras en cultivos celulares convencionales o en le saco vitelínico de huevos embrionados o en animales de laboratorio. La inoculación en animales de laboratorio (cobaya, ratón, hámster) es útil en casos en que se requiere el aislamiento a partir de tejidos contaminados con varios microorganismos o para obtener los antígenos de Coxiella en fase I. Pruebas serológicas: A menudo el diagnóstico de la fiebre Q se apoya en la serología. Se pueden usar varias pruebas, en particular la prueba de inmunofluoresecencia indirecta, el enzimoinmunoensayo, y la prueba de fijación de complemento. Actualmente, hay pruebas comerciales disponibles que permiten la detección de anticuerpos anti-C. burnetii en fase II. La presencia de anticuerpos IgG específicos representa una evidencia de una exposición a C. burnetii reciente o pasada. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Se han vacunas inactivadas contra la fiebre Q, pero sólo aquellas que contengan C. estén preparadas a partir de ella deben considerarse protectoras. En infectadas, se recomienda una vacunación anual repetida, particularmente animales jóvenes.

desarrollado varias burnetii en fase I o áreas densamente en el caso de los

En Eslovaquia hay una vacuna inactivada de fase I que está disponible comercialmente. Un estudio reciente ha demostrado su eficacia respecto al aborto y a la diseminación de C. burnetii en cabras gestantes que fueron vacunadas experimentalmente y luego infectadas, pero no existe información sobre su seguridad.

A. INTRODUCCIÓN La fiebre Q tiene una amplia distribución por todo el mundo excepto Nueva Zelanda. Aunque la fiebre Q está prácticamente presente en todo el reino animal, incluyendo los artrópodos, la enfermedad afecta sobre todo al hombre, al ganado bovino, ovino y caprino (18, 21). El agente etiológico, Coxiella burnetii, es una bacteria gramnegativa estrictamente intracelular, adaptada para desarrollarse en el interior del fagolisosoma del fagocito. Históricamente se ha clasificado dentro de la familia Rickettsiaceae; sin embargo, investigaciones filogenéticas basadas principalmente en el análisis de la secuencia del ARN ribosomal 16S indican que el género Coxiella está distante del género Rickettsia en la subdivisión alfa de las Proteobacterias (49). Ahora Coxiella burnetii se sitúa en la familia Coxiellaceae en el orden Legionellales de la subdivisión gamma de las Proteobacterias (17). Recientemente se ha logrado la secuenciación completa del genoma de C. burnetii y se confirma su posición sistemática (38). A diferencia de las rickettsias, C. burnetii origina una forma semejante al esporo, pequeña, densa y muy resistente, que es muy estable en el medio ambiente, una característica importante para su transmisión (22). Esta capacidad se ha atribuido a la existencia de variantes en el ciclo de desarrollo de C. burnetii: variantes con células grandes (LCV), variantes con células pequeñas (SCV) y células pequeñas densas (SDC) (10,39). Las variantes SDC y SDV representan las formas de la bacteria con mayores posibilidades para sobrevivir extracelularmente como partículas infecciosas. Otra característica esencial es que C. burnetii tiene dos formas antigénicas: la fase I patógena, aislada de animales o humanos infectados, y la fase II avirulenta, obtenida in ovo o in vitro. Durante los pases en serie ocurre un cambio en el LPS (lipopolisacárido): las células en fase I, que contienen cadenas O de una longitud completa en el LPS, cambian a fases intermedias disminuyendo la longitud de las cadenas O del LPS y luego a fase II, con un LPS incompleto. La variación de fase del LPS se acompaña de una delección cromosómica permanente que hace imposible la reversión celular de fase II a fase I. La fiebre Q es una zoonosis. En humanos la infección presenta una forma aguda y una forma crónica (29). En general, las formas agudas incluyen un episodio febril autolimitado, neumonía y hepatitis granulomatosa. La manifestación clínica principal de la fiebre Q crónica es una endocarditis en pacientes con valvulopatías. Las complicaciones de la forma aguda pueden ser graves o fatales en ausencia de un tratamiento adecuado con antibióticos (6). Además, la infección por C. burnetii puede provocar inflamación de la placenta y a menudo acarrea nacimientos prematuros, limitaciones del crecimiento, aborto espontáneo o muerte fetal en las mujeres embarazadas (27). La infección es endémica en muchas áreas originando casos esporádicos o epidemias explosivas. Su incidencia es posiblemente mayor que la descrita. La epidemiología de la fiebre Q sugiere que la infección probablemente se transmite por la inhalación de partículas desecadas de aerosol, y a través del contacto con animales infectados y sus tejidos reproductores (20, 21). A menudo se ha sugerido la ingestión, en particular a través del consumo de productos lácteos derivados de leche sin procesar, e incluso posiblemente después de ser pasteurizada (9, 29, 44). La fiebre Q se transmite muy raramente de persona a persona; sin embargo, esto es posible por contagio durante el nacimiento, a través de transmisión sexual o por transfusión sanguínea (23). En los animales puede ocurrir una transmisión vertical y sexual, además de a través de las rutas respiratorias y digestivas (16,47). Los artrópodos, sobre todo garrapatas, pueden estar implicados en la transmisión de la fiebre Q.

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Capítulo 2.2.10. — Fiebre Q

En vacas, ovejas y cabras, la fiebre Q se ha asociado fundamentalmente con abortos tardíos y con desórdenes tales como nacimientos prematuros, muerte o debilidad de las crías, metritis e infertilidad (18). Sin embargo, las respuestas serológicas en una especie determinada o incluso el aislamiento de C. burnetii no se correlacionan necesariamente con la expresión de la enfermedad clínica (11, 18, 35). El agente puede persistir en los animales infectados, eliminarse intermitentemente a través de la leche, las heces y la orina, y estar presente en la sangre. Puede recuperarse en grandes cantidades en los productos del parto (placenta, líquido amniótico y feto), y los animales no grávidos representan menor riesgo. Se considera que los reservorios principales de C. burnetii son los rumiantes domésticos, pero también se ha descrito que los gatos, perros, conejos, pájaros, etc., pueden eliminar el germen involucrándose en la contaminación humana (14, 20, 21, 42). Por tanto, los animales domésticos y silvestres infectados normalmente liberan el agente sin signos visibles de enfermedad, y deberían considerarse como posibles fuentes de infección para el hombre. Con frecuencia, se ha investigado el aborto en rumiantes para determinar si se trata de fiebre Q, ya que puede afectar a la salud humana y a la de otros animales. A estos efectos, el diagnóstico de la fiebre Q, y de otras enfermedades abortivas, cuando se realiza sobre datos de microscopía de muestras clínicas, y se complementa con resultados serológicos positivos, suele ser normalmente adecuado (18, 32, 34). El diagnóstico de la fiebre Q también resulta necesario para análisis epidemiológicos de poblaciones "de riesgo" o sospechosas en áreas limitadas (después de brotes recientes en el hombre o en animales), o con fines comerciales de exportación. No obstante, en la actualidad no se lleva a cabo la identificación de eliminadores de C. burnetii ni de portadores asintomáticos (2). Cuando varios animales resultan seropositivos, se recomienda por lo general una intervención adecuada. Las medidas se pueden adaptar al contexto epidemiológico y de seroprevalencia concreto. Se debe asegurar una pasteurización correcta de los productos lácteos (44). Usando lejía al 10%, se puede reducir la cantidad de agente en el medio con una limpieza regular y la desinfección de las instalaciones animales, teniendo un cuidado particular en las áreas de parto. Los animales gestantes deben mantenerse en corrales separados, y las placentas y fetos abortados deben retirarse rápidamente y eliminarse de modo apropiado para evitar su ingestión por perros, gatos o animales silvestres. Debe evitarse la dispersión del estiércol de granjas contaminadas por áreas suburbanas y por jardines. Aunque no está evaluada la eficacia de la inactivación de C. burnetii mediante fermentación por compostaje o por descontaminación mediante tratamiento químico (como por ejemplo con 0,4% de cianamida cálcica o con cal), estos métodos son todavía recomendables. Para adquirir y mantener una población de animales libres de fiebre Q, se debe reducir la introducción de animales, el reagrupamiento de rebaños, el contacto con animales silvestres y la infestación por garrapatas. Aunque se han desarrollado vacunas contra la fiebre Q animal, en la mayoría de los países no están disponibles comercialmente. Finalmente, es importante recordar que C. burnetii es muy peligrosa para el hombre, y que las infecciones en el laboratorio son frecuentes. Debido a su baja dosis infectiva, su resistencia ambiental, y la ruta de transmisión por aerosoles, se considera a C. burnetii como un agente potencial de bioterrorismo (5). Deben tomarse precauciones adecuadas con este agente de grupo de riesgo 3. Los cultivos vivos o el material contaminado de animales infectados deben manejarse solamente en instalaciones que cumplan los requisitos para patógenos del Grupo de Contención 3 que se indican en el Apéndice I.1.6.1. del Capítulo I.1.6. Seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiología.

B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO 1.

Identificación del agente

Se puede evidenciar Coxiella burnetii de varios modos, dependiendo del tipo de muestra y el propósito del diagnóstico (6, 32, 34). Las muestras deben tomarse tan pronto como se pueda de los fetos abortados, de la placenta, y de las descargas vaginales, después del parto o del aborto. También se pueden tomar muestras de los tanques de leche, de la leche individualizada o del calostro, y de las heces.

a)

Tinción En caso de sospechar que un aborto esté causado por infección, se preparan frotis del cotiledón de la placenta sobre portas para microscopía (33). Del mismo modo puede usarse el contenido del pulmón, hígado o rumen de los fetos abortados o las descargas vaginales. Estas muestras se tiñen siguiendo métodos rápidos: el de Stamp, el método modificado de Ziehl-Neelsen, el de Gimenez, el de Giemsa, el de Machiavello y el método de Koster modificado (8, 26, 32, 33, 35). Por ejemplo, el método de tinción de Stamp, que es muy similar al de Ziehl-Neelsen modificado, se realiza con una solución de fucsina básica al 2%, seguida de una decoloración rápida con una solución de ácido acético al 0,5%, y haciendo una tinción de contraste con una solución de azul de metileno o de verde malaquita al 1%. Los frotis se examinan microscópicamente con objetivo de inmersión (x500 o más aumento). Coxiella burnetii se caracteriza por la presencia de un número muy grande de pequeñas bacterias teñidas de rosa en forma de cocobacilos

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Capítulo 2.2.10. — Fiebre Q

destacando sobre un fondo azul o verde. A veces son difíciles de detectar debido a su pequeño tamaño (0,3-1,5 µm de largo x 0,2-0,4 µm de ancho), pero esto se compensa por su gran número; a veces aparecen dentro de la célula hospedadora inclusiones como manchas rojizas en un fondo azul o verde. Se debe tener cuidado en la interpretación de los resultados, ya que se puede confundir microscópicamente C. burnetii con Chlamydophila abortus o con Brucella spp. Sin embargo, usando el mismo proceso de tinción, Chamydophila tiene perfiles más definidos, son células ovales, pequeñas y pueden parecer glóbulos. Las células de Brucella son más grandes (0,6-1,5 µm de largo x 0,5-0,7µm de ancho), más claramente definidas y se tiñen más intensamente. Se deben de usar portas con controles positivos de C. burnetii, Chlamydophila abortus y Brucella para comparación. El diagnóstico realizado por microscopía, junto a resultados serológicos positivos, suele ser adecuado a efectos rutinarios (34). Cuando la tinción biológica no resulta concluyente, se debe usar algún otro método (ver más adelante) como prueba confirmativa.

b)

Métodos de detección específica También se puede realizar la detección de C. burnetii en muestras por inmunodetección específica (enzimoinmunoensayo de captura [ELISA], inmunohistoquímica) o por amplificación del ADN (4, 6, 45). La inmunohistología se puede hacer con tejidos incluidos en parafina o en frotis fijados con acetona (28). El método consiste en una inmunofluorescencia indirecta o en un ensayo con inmunoperoxidasa usando anticuerpos policlonales frente a C. burnetii, procedentes de un antisuero bien caracterizado de origen humano o de un antisuero específico producido en animales de laboratorio (conejo o cobaya). Para visualizar la bacteria se usa luego un conjugado anti-IgG obtenido en otra especie (hombre, conejo o cobaya), que esté marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) o con peroxidasa. Se debe disponer para comparación de portas con preparaciones positivas de antígeno de C. burnetii. No existen anticuerpos específicos para inmunoquímica a nivel comercial. En la actualidad se están desarrollando varios métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y la PCR se ha usado con éxito para detectar ADN de C. burnetii en cultivos celulares y en muestras biológicas. Como es probable que el número de células de C. burnetii sea menor en la leche, en el calostro o en las heces que en el material derivado de abortos, la PCR se puede usar para analizar esta gran diversidad de muestras (2). Esta técnica puede realizarse en laboratorios con equipamiento adecuado utilizando cebadores derivados del gen IS1111, el más ampliamente usado, que codifica una transposasa (número de acceso M80806) (2). En el genoma están presentes al menos 19 copias de este gen (12). Los otros genes que pueden ser usados como diana en la PCR específica para C. burnetii son: el gen de la superóxido dismutasa (sodB) (número de acceso M74242); el gen com1, que codifica una proteína de 27 kDa de la membrana externa (número de acceso AB004712); y el operón de choque térmico que codifica dos proteínas de choque térmico (htpA y htpB) (número de acceso M20482). La PCR en tiempo real, de reciente desarrollo, supone un medio adicional de detección y cuantificación (43). Existe una necesidad urgente de desarrollar un método molecular para determinar la viabilidad bacteriana, especialmente en muestras de leche. El desarrollo de una PCR múltiple constituye otro auténtico desafío para ensayar todos los agentes infecciosos abortivos.

c)

Aislamiento del agente Para determinadas investigaciones de laboratorio, puede ser necesario aislar el agente. Cuando el examen microscópico revela un gran número de células de C. burnetii y un bajo nivel de contaminación con otras bacterias, es posible el aislamiento directo por inoculación de huevos de gallina embrionados o de cultivos celulares (11). Por ejemplo, se homogeniza una porción de la placenta en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenga antibióticos (100-200 µg/ml de estreptomicina y 50-100 µg/ml de penicilina o gentamicina). Después de centrifugar a baja velocidad, se inoculan diluciones del sobrenadante en huevos de gallina embrionados de 5 días a través del saco vitelino. Preferiblemente, los huevos deben ser de gallinas libres de patógenos específicos (SPF). Los embriones que mueren durante los primeros 5 días después de la inoculación se desechan. Los sacos vitelinos se recogen después de 10-15 días de incubación. Los frotis del saco vitelino teñidos se examinan para comprobar la ausencia de contaminación bacteriana y determinar la presencia de C. burnetii. Para confirmar la presencia de C. burnetii se puede usar un análisis por PCR. Se pueden necesitar varios pases para obtener un aislamiento en cultivo puro. Para aislar bacterias estrictamente intracelulares, o intracelulares facultativas, incluyendo a C. burnetii, se ha adaptado un sistema de microcultivo celular disponible comercialmente para el cultivo de virus, el vial cerrado de cultivo celular1.Tal método se describió en 1990 para C. burnetii (6, 30). Se inoculan suspensiones de la muestra en fibroblastos de pulmón de embrión humano (células HEL) que se cultivan sobre un cubre de 1 cm2 dentro de un vial cerrado. La centrifugación a 700 g durante 1 hora favorece la fijación y la penetración de la bacteria en las células. Para la misma muestra se usan tres viales cerrados, y los días 3, 10 y 21 se examina el efecto citopático (ECP) -es decir, las características vacuolas de C. burnetii en las células HEL- mediante un microscopio invertido. En el cubre dentro del vial cerrado se puede realizar directamente a los 10 días la detección de C. burnetii creciendo dentro de las células, por medio de un ensayo de inmunofluoresencia directa con anticuerpos policlonales anti-C. burnetii y un

1

424

Sterilin, Bibby Sterilin Ltd, Stone, Staffordshire ST15 O5A, Reino Unido.

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Capítulo 2.2.10. — Fiebre Q

anticuerpo apropiado anti-especie conjugado con FITC. Las células del último vial cerrado se recogen y se transfieren a un recipiente de cultivo de 25 cm2. Se puede incubar durante 3 meses, cambiando el medio de cultivo una vez a la semana. La infección puede seguirse por microscopía de las células centrifugadas de un sobrenadante del cultivo y teñidas por la tinción de Gimenez y mediante análisis por PCR del sobrenadante del cultivo. Cuando las observaciones de ECP y las de la tinción de Gimenez, o los resultados de la PCR, son positivos, se realiza un pase a un recipiente de cultivo de 75 cm2. El sobrenadante se inocula luego en capas confluentes de células Vero o de células L929 de fibroblastos de ratón en un recipiente de cultivo de 150 cm2 para establecer un aislamiento de C. burnetii. Este método fue desarrollado para el caso de humanos pero podría adaptarse a animales (41). Con muestras muy multi-contaminadas, como las derivadas de placentas, descargas vaginales, heces o leche, puede ser necesaria la inoculación en animales de laboratorio. Los animales más apropiados a este respecto son los ratones y cobayas (36). Se controla la temperatura corporal y el estado de anticuerpos después de la inoculación intraperitoneal de una dosis de 0,5 ml por animal. Este método debería realizarse siempre en paralelo con pruebas serológicas en otros cobayas o ratones que se hayan inoculado con las mismas muestras. Si aparece fiebre, se sacrifica el animal y se recoge el bazo para aislar el agente por inoculación en huevos de gallina embrionados o en cultivos celulares. El examen microscópico de C. burnetii se lleva a cabo usando frotis y tinciones de los bazos recogidos. Alternativamente, se puede realizar PCR en los bazos recogidos sistemáticamente a los 7-9 días después de la inoculación (4). Aunque la caracterización de los aislamientos parece necesaria para comprender la variable epidemiología de la fiebre Q en diferentes áreas geográficas, no existen en la actualidad métodos diferenciadores de tipos. A este respecto, los esfuerzos deberían ir dirigidos al desarrollo de métodos para tipificación genética.

2.

Pruebas serológicas

Entre las diversas técnicas que pueden emplearse, las tres más usadas son: la técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI), el método ELISA y la prueba de fijación de complemento (FC) (6). En el diagnóstico rutinario ya no se emplean tres pruebas serológicas más antiguas: la técnica de microaglutinación, la prueba de aglutinación capilar y la prueba de hemólisis indirecta. Se ha evaluado también una prueba de aglutinación con partículas de alta densidad (HDPA) (24). Los ensayos serológicos son adecuados para analizar poblaciones, pero la interpretación a nivel del animal individual puede resultar difícil. Los animales pueden permanecer seropositivos durante varios años después de una infección aguda, algunos pueden liberar C. burnetii y suponer un riesgo de infección antes de desarrollar anticuerpos, y otros animales infectados no parecen sufrir seroconversión (1, 3, 4). Los títulos serológicos de corte se indican más adelante; la interpretación de los resultados requiere el uso de al menos diez animales (abortados o no). Para establecer la presencia de infección se necesita tanto la respuesta serológica como la evidencia de las bacterias.

a)

Prueba de la inmunofluorescencia indirecta En medicina humana, el método de referencia para el serodiagnóstico de la fiebre Q es la prueba IFI adaptada como una técnica de microinmunofluorescencia (6, 46). El procedimiento se puede adaptar para realizar un ensayo de inmunoperoxidasa. Se dispone de algunos antígenos comerciales adecuados para uso en FC, pero son preferibles los antígenos preparados para diagnóstico en humanos (6). Se ha demostrado que este método de preparación suministra antígenos con la sensibilidad más alta para detectar anticuerpos frente a C. burnetii. En resumen, se utilizan antígenos de C. burnetii tanto de la fase I como de la fase II; el antígeno de la fase II se obtiene creciendo la cepa de referencia C. burnetii Nine Mile (ATCC VR 615) en cultivo celular, mientras que el antígeno de la fase I se obtiene del bazo de animales de laboratorio inoculados con C. burnetii en fase II en cultivos celulares. En la población en fase II aún pueden estar presentes unas cuantas células en fase I y pueden ser seleccionadas y propagadas dentro de los animales. El antígeno se diluye, se gotea en pocillos de un porta de vidrio para microscopio, se deja secar y se fija con acetona. Las dos formas de la infección, aguda y crónica, presentan perfiles serológicos distintos: durante la fiebre Q aguda, los anticuerpos IgG aumentan sólo contra la fase II, mientras que durante la fiebre Q crónica se observan niveles elevados de anticuerpos IgG contra la fase I y II de la bacteria (46). Además, se pueden comprar a suministradores portas con pocillos antigenados con antígeno de fase II2, o de fases I y II de C. burnetii3. Estos se pueden adaptar cambiando el conjugado humano por un conjugado adaptado a la especie animal. Se colocan diluciones dobles del suero a ensayar en un porta para inmunofluorescencia que contenga previamente uno o los dos antígenos. Si existen anticuerpos específicos, se fijan al antígeno en el porta. La

2 3

Coxiella burnetii-Spot IF, bioMérieux sa, Marcy-l´Etoile, Francia Q fever IFA Test Kits, MRL Diagnostics, Cypress, California, EE.UU.

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Capítulo 2.2.10. — Fiebre Q

formación de este complejo se detecta luego en un microscopio de fluorescencia después de la adición del conjugado fluorescente que reconoce las inmunoglobulinas de esa especie. •

Preparación del antígeno

El antígeno debe prepararse en dependencias que cumplan los requisitos para patógenos del Grupo de Contención 3, como se describe en el Apéndice I.1.6.1. del Capítulo I.1.6. de este Manual. C. burnetii Nine Mile (ATCC VR 615) en fase II se cultiva en monocapas confluentes de células Vero o L929 en recipientes de cultivo de 150 cm2 con medio mínimo esencial (MEM) al que se adiciona glutamina 2mM y 4% de suero fetal bovino. La infección se sigue mediante examen microscópico de las células que se recogen de la parte inferior de los recipientes después de teñirlas por el método de Gimenez. Cuando se observa una gran infección por C. burnetii, se centrifugan individualmente los sobrenadantes de 15 recipientes (5.000 g, 15 minutos), se resuspenden en 1 ml de PBS con formaldehído al 0.1% y se mantienen 24 horas a 4°C. Después de juntar los sedimentos, se lisan por sonicación las células que queden. Los restos celulares se eliminan por dos centrifugaciones sucesivas (cada una a 100 g, 10 minutos). A continuación, la suspensión de 15 ml se centrifuga en 20 ml de PBS con 25% de sacarosa (6.000 g, 30 minutos sin interrupción). El sedimento que resulta se lava tres veces en PBS (6.000 g, 10 minutos), se resuspende en el menor volumen posible de agua destilada estéril y se ajusta por espectroscopía de luz UV a 2 mg/ml. Se añade azida sódica a una concentración final de 0,1% como conservante antibacteriano. El antígeno preparado de este modo se congela a –20°C. Para obtener antígeno correspondiente a la fase I, se inoculan ratones con la cepa de C. burnetii Nine Mile crecida en células (principalmente en fase II). Nueve días después se extraen los bazos. Cada uno se disgrega en 7,5 ml de MEM y se inocula en tres recipientes de cultivo de 75 cm2 con monocapas de células L929 o Vero (2,5 ml por recipiente). La amplificación de la fase I de C. burnetii se lleva acabo durante 4 semanas, cambiando el medio de cultivo una vez por semana. Después se recogen las células infectadas y se purifican las bacterias como se describe anteriormente (principalmente en fase I). La producción de antígeno también puede hacerse cultivando C. burnetii en huevos embrionados SPF. El microorganismo se inocula en el saco vitelínico de huevos embrionados de 5-6 días de edad, y se recogen luego a los 12-15 días después de la muerte del embrión. Los sacos vitelínicos infectados tienen un color amarillento pajizo característico. Los no infectados son de color naranja y presentan una consistencia viscosa. Cualquier embrión que muera entre los 5 y 10 días de incubación se elimina. La cepa usada en la inoculación de los huevos es una dilución al 1/100 de un homogenado de saco vitelínico en PBS con penicilina (500 Unidades Internacionales/ml) y estreptomicina (0,5 mg/ml). Los sacos vitelínicos se juntan y se homogenizan con tres partes de PBS. La suspensión se inactiva durante 24 horas a 37°C con formaldehído al 1,6%. El sobrenadante lipídico se desecha. La suspensión se centrifuga luego a una velocidad moderada (unas 500 g) durante 30 minutos. Se elimina el sobrenadante, se añade más PBS y se repite la centrifugación. La suspensión final se diluye con PBS. Se añade thiomersal a una dilución final de 1/10.000 como conservante antibacteriano. En los homogenados de los sacos vitelínicos suspendidos en PBS, se comprueba la abundancia de C. burnetii y la ausencia de contaminantes bacterianos por examen microscópico de un frotis sobre un porta y tinción por el método de Stamp. Para obtener antígeno de fase I, se puede propagar C. burnetii recogida de material del bazo de animales de laboratorio infectados, ya que estos extractos se transfieren a continuación a sacos vitelinos, pues la cantidad de células en fase I es todavía alta hasta el sexto pase en el vitelo (EP6). Es suficiente realizar la titulación del antígeno con al menos tres sueros diferentes conocidos (con título alto, moderado y bajo, respectivamente) para disponer de la dilución apropiada para otros ensayos de inmunofluorescencia. •

Materiales y reactivos

Microscopio equipado con fluorescencia, incubador con humidificador, pila de lavado. Se necesitan portas adecuados para el antígeno. Éste puede prepararse en el laboratorio o comprarse a un proveedor (véase más arriba). El método descrito está adaptado de la preparación comercial de BioMérieux a título de ejemplo. Los portas preparados contienen 12 pocillos por porta, cada uno de 7 mm de diámetro, recubiertos con antígeno de fase II obtenido de cultivos en células Vero y pueden guardarse a 4°C o a –20°C. Conjugado fluorescente concentrado, para ser diluido cuando sea necesario con PBS + azul de Evans al 1%, a las diluciones recomendadas por la casa comercial. PBS, glicerina tamponada, colorante azul de Evans en solución al 1%.

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Capítulo 2.2.10. — Fiebre Q •

Procedimiento de la prueba

i)

Inactivar el suero problema durante 30 minutos a 56°C, luego diluir en PBS de 1/40 a 1/640.

ii)

Dejar que los portas recubiertos con el antígeno tomen la temperatura ambiental. No tocar los pocillos.

iii)

Añadir a los pocillos 20 µl de cada dilución de suero. Añadir sueros de control positivo y negativo. A un pocillo, añadir como control de antígeno 20 µl de PBS.

iv)

Incubar en una cámara húmeda 30 minutos a 37°C. Lavar el porta dos veces con PBS durante 10 minutos cada vez. Lavar con agua destilada y dejar secar al aire.

v)

Añadir a los pocillos, incluyendo los de los controles, 20 µl de conjugado dirigido contra la especie apropiada (por ejemplo, anticuerpos obtenidos en conejo contra IgG [H+L] de cabra u oveja marcados con FITC), diluidos en el momento en PBS + azul de Evans. Incubar en una cámara húmeda 30 minutos a 37°C. lavar con agua destilada y secar al aire. Añadir unas cuantas gotas de glicerina tamponada y tapar con un cubre. Examinar en un microscopio de fluorescencia con aumentos de x40 o más.

•

Interpretación de los resultados

Una reacción positiva se manifiesta por la presencia de pequeños puntos brillantes en un fondo oscuro. Hay que comprobar que el conjugado solo y el control de suero negativo dan un resultado negativo (ausencia de los pequeños puntos brillantes). La fluorescencia inespecífica suele tomar forma de manchas de tamaño irregular. El control positivo debe corresponder al título conocido + un orden de dilución. La reacción se considera positiva si aparece inmunofluorescencia a dilución 1/160 o mayor. En medicina humana, este método se usa para determinar anticuerpos contra las fases I y II en las fracciones de IgG, IgM e IgA, lo que permite la diferenciación entre la forma aguda y la crónica de la fiebre Q. Para eliminar las IgG antes de determinar las IgM e IgA se usa absorbente de factor reumatoide. El análisis de los sueros se realiza con antígeno de la fase II, y los sueros positivos se ensayan después para detectar la presencia de las diferentes clases de Ig dirigidas contra los antígenos de la fase I y la II. No obstante, ni las respuestas de anticuerpos a las fases I y II ni las respuestas de las clases de Ig implicadas se han estudiado con detalle en los animales domésticos.

b)

Prueba de fijación de complemento Este micrométodo de fijación en frío, de tipo semejante al desarrollado por Kolmer, se realiza en placas de microtitulación con 96 pocillos de fondo cóncavo. La prueba detecta la presencia en el suero de anticuerpos fijadores de complemento. Esta prueba FC es específica, pero menos sensible que la IFI o ELISA (6, 25). La seroconversión se detecta por la prueba FC más tarde que por la prueba IFI o ELISA, aunque los anticuerpos FC pueden persistir durante largos períodos después de la enfermedad y esta prueba da resultados excelentes para diagnóstico rutinario de enfermedades abortivas a nivel de poblaciones (32, 34). En muchos países la prueba FC es aún muy usada por muchos laboratorios. Con frecuencia en este método se utiliza antígeno en fase II preparado a partir de una mezcla de dos cepas (Nine Mile y Henzerling)4. En Francia, este método está estandarizado (AFNOR-NFU47-006). La reacción se hace en dos etapas. Primero se mezcla el antígeno con los anticuerpos fijadores de complemento, y se añaden eritrocitos de oveja que están sensibilizados por suero anti eritrocitos de oveja. Durante el primer paso, la fijación del complemento por el complejo antígeno/anticuerpo no permite la lisis de los eritrocitos; por el contrario, si no existen anticuerpos fijadores de complemento, el complemento induce entonces la lisis de los eritrocitos sensibilizados, Por consiguiente, la velocidad de hemolisis es inversamente proporcional al nivel de anticuerpos específicos que están presentes en la muestra de suero. •

Reactivos

Tampón Veronal/calcio/magnesio (VB), pH 7.2 El sistema hemolítico: una mezcla a partes iguales de una suspensión de eritrocitos de oveja al 2% en VB y de suero hemolítico diluido en VB según su título específico. Complemento: preparación comercial liofilizada de suero fresco de cobaya. Antígeno: Usar antígenos comerciales al título recomendado por el fabricante, si la titulación del antígeno se realiza por este método. Los resultados pueden variar de un antígeno a otro, y son preferibles los antígenos preparados de varias cepas (ovinas, bovinas y humanas) o de cepas autóctonas.

4

Dade Behring, Marburg, Alemania

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Capítulo 2.2.10. — Fiebre Q

Controles de suero positivo y negativo. •

Pre-titulaciones

i)

Diluir los etritrocitos de oveja a una concentración final de 2% en VB.

ii)

Titular el suero hemolítico en una microplaca: 25 µl de complemento a una concentración hemolítica conocida (por ejemplo, 1/30); 25 µl de diluciones crecientes de suero hemolítico + eritrocitos de oveja al 2%. Incluir controles sin complemento. Incubar 30 minutos a 37°C. Establecer la dilución equivalente a 2 unidades hemolíticas.

iii)

Diluir el antígeno como recomienda el fabricante. El antígeno puede también titularse: hacer diluciones crecientes de antígeno (25 µl horizontalmente) y un suero positivo de título conocido (25 µl verticalmente). Añadir 25 µl de la suspensión de eritrocitos sensibilizados e incubar 30 minutos a 37°C. El título del antígeno es la dilución más alta que produce una reacción positiva con la dilución más alta del suero. Comprobar a diferentes diluciones la ausencia de actividad anti-complementaria del antígeno.

iv)

Titular el complemento en una microplaca: hacer diluciones seriadas del complemento o del suero de cobaya en VB, por ejemplo de 1/15 a 1/200. A cada pocillo con 25 µl de esta dilución, añadir 25 µl de antígeno y 25 µl del sistema hemolítico. Incubar 30 minutos a 37°C y establecer la dilución equivalente a 2 unidades hemolíticas de complemento.

•

Procedimiento de la prueba

i)

En seis pocillos hacer diluciones dobles de 1/10 a 1/320 del suero problema inactivado (con el complemento eliminado) y en otros cuatro pocillos a diluciones de 1/10 a 1/80 para detectar actividad anti-complementaria (25 µl por pocillo) (pocillos control de suero).

ii)

Añadir 25 µl de antígeno diluido o 25 µl de VB a los pocillos de control de suero.

iii)

Añadir 25 µl de complemento a todos los pocillos. Cubrir la placa con una lámina de plástico adhesivo e incubar 18 horas a 4°C.

iv)

Sacar las placas del refrigerador, dejarlas que alcancen la temperatura ambiente, y añadir 25 µl de sistema hemolítico recién preparado. Incubar a 37°C durante 30 minutos. Centrifugar las placas a 500 g durante 5 minutos a 4°C. Examinar los controles y leer los resultados.

•

Interpretación de los resultados

Los títulos comprendidos entre 1/10 y 1/40 son característicos de una infección latente. Los títulos de 1/80 o más, en uno o más sueros de un grupo de cinco a diez animales, revelan una fase evolutiva de la infección.

c)

Enzimoinmunoensayo Esta técnica presenta una alta sensibilidad y una buena especificidad (6, 31, 48). Es fácil de realizar en laboratorios que tienen el equipo necesario (un espectrofotómetro) y reactivos. Las pruebas ELISA tienden a reemplazar a las pruebas IFI y FC como técnicas de elección porque son adecuadas para análisis a gran escala y, en particular, para los diagnósticos en Veterinaria, ya que es una técnica fiable para demostrar anticuerpos contra C. burnetii en varias especies animales (13,40). Requiere un antígeno relativamente puro. Para recubrir las placas pueden usarse los antígenos preparados para la prueba FC. Existen preparaciones comerciales disponibles que pueden detectar anticuerpos contra la fase II o contra la fase I y II5,6. Está en fase de desarrollo la obtención de preparaciones de ELISA capaces de distinguir entre los anticuerpos contra la fase I y contra la fase II. Los pocillos de la microplaca se recubren con el antígeno de células enteras de C. burnetii inactivado. Se añaden a los pocillos muestras de suero diluido que reacciona con los antígenos unidos al soporte sólido. El material no unido se elimina mediante lavado después de un período adecuado de incubación. El conjugado (Ig anti-rumiante marcada con peroxidasa de rábano) reacciona con los anticuerpos específicos unidos al antígeno. El exceso de conjugado que no reacciona se elimina mediante lavado después de un período adecuado de incubación. Se añade el substrato del enzima. La velocidad de conversión del substrato es proporcional a la cantidad de anticuerpos unidos. La reacción se termina después de un período adecuado de tiempo y el color desarrollado se mide espectrofotométricamente. •

Materiales y reactivos

Placas de microtitulación con 96 pocillos de fondo plano, recién recubiertas o recubiertas de antemano con antígeno de la fiebre Q; lector de microplacas (espectrofotómetro; filtros de 405 y/o 492 nm); incubador con 5 6

428

CHEKIT-Q-Fever EIA kit, Intervet (Bommeli Diagnostics), Liebefeld-Bern, Suiza Q fever IgG o IgM ELISA kits, PanBio Pty Ltd, Brisbane, Australia.

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Capítulo 2.2.10. — Fiebre Q

humidificador a 37°C; pipetas de 8 y 12 canales con puntas desechables de plástico; agitador de microplacas (opcional). Sueros control positivos y negativos; conjugado (inmunoglobulina anti-rumiante marcada con peroxidasa); diluyente diez veces concentrado (PBS-Tween); agua destilada; substrato o cromógeno (OPD [ortofenilén diamina], ABTS [2,2´-azino-bis-(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico] para la peroxidasa); peróxido de hidrógeno. •

Procedimiento de la prueba

i)

Diluir las muestras de suero, incluyendo los sueros control, a una dilución apropiada (normalmente 1/100) y distribuir por duplicado 0,1 ml por pocillo. Los sueros control son sueros positivos y negativos suministrados por el fabricante y un suero positivo de referencia interna del laboratorio para comparar los títulos en ensayos diferentes.

ii)

Cubrir la placa con tapa e incubar a temperatura ambiente durante 30-90 minutos. Vaciar el contenido y lavar tres veces a temperatura ambiente con solución de lavado.

iii)

Añadir a los pocillos la dilución adecuada de conjugado recién preparado (0,1 ml por pocillo).

iv)

Cubrir cada placa e incubar como en el paso ii. Lavar de nuevo tres veces.

v)

Añadir a cada pocillo 0,1 ml de substrato cromogénico recién preparado (por ejemplo: OPD [0.1 mg/ml] en ácido acético 0,1 M, PO4HNa2 0,2 M, pH 4,8, y solución de H2O2 al 30% [0,2 µl/ml]; o ABTS 0,25 mM en tampón citrato fosfato, pH 5,0, y solución de H2O2 al 30% [0,1 µl/ml]).

vi)

Agitar la placa; después de incubar, detener la reacción añadiendo a cada pocillo solución de parada, por ejemplo, 0,05 ml de ácido sulfúrico 3M para la peroxidasa o 10% de dodecilsulfato sódico para ABTS.

vii)

Leer la absorbancia de cada pocillo con el lector de microplacas a 405 nm (ABTS) o a 492 nm (OPD). Los valores de absorbancia se usan para calcular los resultados.

•

Interpretación de los resultados

En el caso de preparaciones comercializadas, las interpretaciones y los valores se suministran con la preparación. Por ejemplo: calcular la absorbancia media (Ab) de la muestra de suero y de los sueros control positivos (Abpos) y negativos (Abneg), y calcular el porcentaje para cada suero:

Ab - Ab neg x 100 Abpos - Abneg Intrepretar los resultados del siguiente modo: Ab 40% suero positivo

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO. 1.

Vacuna

La vacunación es la estrategia más lógica para evitar la fiebre Q en sujetos y en ganados expuestos. Sólo se puede preparar una vacuna contra C. burnetii cuando lo hace una plantilla entrenada y en condiciones adecuadas de protección (como mínimo en un laboratorio de nivel 3 de bioseguridad). Se recomienda obtener la vacuna de fabricantes capaces de completar y certificar pruebas sobre seguridad, inactivación y esterilidad. Las directrices para la producción de vacunas veterinarias se presentan en el Capítulo I.1.7. Principios de producción de vacunas veterinarias. Las normas dadas aquí y en el Capítulo I.1.7 intentan ser de naturaleza general y se pueden suplementar con requisitos nacionales y regionales. En algunos países, se practica la vacunación para personal sujeto a exposición ocupacional, como trabajadores de mataderos, veterinarios y personal de laboratorio. En 1989 las autoridades australianas aprobaron una vacuna inactivada con formaldehído (Q-VAX, CSL Ltd, Australia) preparada a partir de la cepa Henzerling de C.

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429

Capítulo 2.2.10. — Fiebre Q

burnetii en fase I (19). Las vacunas de fase I son más eficaces, pero está contraindicada la vacunación de individuos con seroconversión o expuestos a C. burnetii antes de la inmunización. Se han desarrollado varias vacunas contra la fiebre Q animal. Hasta la fecha, los resultados son más favorables hacia el uso de una vacuna de fase I, ya que las vacunas de fase II son 100 veces menos eficaces que las de fase I en evitar la colonización del bazo de ratón (7). En Eslovaquia existe una vacuna comercial inactivada de fase I para la vacunación del ganado. Un estudio sobre la fiebre Q en Eslovaquia sugiere que el descenso en los casos de fiebre Q en el hombre y en los animales podría deberse a la vacunación a gran escala realizada allí en el ganado durante 10 años, y a las mejoras en el control veterinario del transporte de animales dentro del país (37). La vacuna contiene un antígeno muy purificado de la cepa Nine Mile en fase I (pases de cultivo 2 a 6 en huevo) e inactivado con formaldehído. Recientemente, un estudio ha demostrado la eficacia de esta vacuna en Francia mediante vacunación y posterior infección experimental de cabras gestantes: la vacuna evitó el aborto y la liberación del agente en la leche, disminuyendo considerablemente la liberación en las secreciones vaginales y en las heces (4). En teoría, la eficacia de la vacuna se debe demostrar por pruebas en todas las especies a las que puede ir dirigida. En el caso de vacunación de animales ya infectados, no se dispone de información sobre posibles efectos adversos ni sobre la liberación del agente de la fiebre Q. Por consiguiente, algunos autores piensan que resulta preferible seleccionar para la inmunización las explotaciones o los animales seronegativos, y continuar en los animales jóvenes la vacunación durante varios años (15). Hasta ahora, no existen datos comparativos de costebeneficio de esta estrategia respecto a una estrategia no selectiva en el control de la fiebre Q.

2.

Materiales de diagnóstico

Ver Sección B.2.a. (Preparación de antígeno).

REFERENCIAS 1.

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2.

BERRI M., LAROUCAU K. & RODOLAKIS A. (2000). The detection of Coxiella burnetii from ovine genital swabs, milk and fecal samples by the use of a single touchdown polymerase chain reaction. Vet. Microbiol., 72, 285–293.

3.

BERRI M., SOURIAU A., CROSBY M., CROCHET D., LECHOPIER P. & RODOLAKIS A. (2001). Relationships between the shedding of Coxiella burnetii, clinical signs and serological responses of 34 sheep. Vet. Rec. 148, 502– 505.

4.

BOUVERY N.A., SOURIAU A., LECHOPIER P. & RODOLAKIS A. (2003). Experimental Coxiella burnetii infection in pregnant goats: excretion routes. Vet. Res., 34, 423–433.

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6.

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* * *

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CAPÍTULO 2.2.11.

LEISHMANIOSIS

RESUMEN La leishmaniosis no es una entidad única y comprende una variedad de síndromes debidos fundamentalmente a por lo menos 16 especies y subespecies de Leishmania. Los perros son afectados generalmente por L. infantum y L. chagasi (que ahora se consideran sinónimos), pero se han descrito infecciones por L. tropica, L. major y L. braziliensis. En el hombre, el espectro clínico varía desde infecciones asintomáticas a otras con elevada mortalidad, con tres formas clásicas descritas: visceral (LV), cutánea (LC) y mucocutánea (LMC). Los vectores de estas enfermedades son moscas flebotomicas que pertenecen a los géneros Phlebotomus y Lutzomyia. Identificación del agente: Cuando en el hombre y en los animales afectados se presentan los síntomas clínicos y las lesiones características, la demostración del parásito en frotis teñidos de aspirados esplénicos, de médula ósea y de nódulos linfáticos, o en raspados cutáneos y en biopsias tisulares, constituye un diagnóstico positivo. Si la infección es de un grado bajo, la detección del parásito es solo posible mediante intentos de aislamiento in vitro o in vivo o por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Como existen pocas diferencias entre las distintas especies, cualquier Leishmania aislada debe identificarse por métodos moleculares, bioquímicos e inmunológicos. Varios centros en el mundo utilizan en la actualidad la caracterización de isozimas, ADN y antígenos para identificar el agente. Pruebas serológicas: La serología es el método de diagnóstico preferido para la leishmaniosis canina y la LV, incluso durante las primeras fases de la enfermedad. En las formas subclínicas, los casos seropositivos se confirman por diagnóstico parasitológico o por PCR. La serología tiene menos valor en la LC y LMC. De entre las diversas técnicas inmunológicas disponibles, la prueba de inmunofluorescencia indirecta y el enzimoinmunoensayo son las más adecuadas. Los antígenos para serodiagnóstico deben prepararse en el laboratorio, aunque actualmente se están evaluando algunos productos comercializados. Prueba de hipersensibilidad retardada: La prueba cutánea de la leishmanina es útil para determinar la distribución de las infecciones humanas, y sirve para distinguir casos inmunes o no inmunes. La prueba es positiva en LC, LMC y LV curada, pero es negativa en la LV activa. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: No hay en la actualidad ninguna vacuna eficaz disponible para uso en humanos y perros. La leishmanina, que ya no está disponible comercialmente, precisa estandarización.

A. INTRODUCCIÓN La lesihmaniosis está causada por el protozoo parásito Leishmania, que es transmitido por vectores. Se han descrito varias formas de manifestaciones clínicas de la leishmaniosis humana (33), que se han dividido en tres entidades: leishmaniosis visceral (LV, kala azar), lesihmaniosis cutánea (LC, llaga de oriente, uta, pian bois, úlcera de chiclero) y leishmaniosis mucocutánea (LMC, espundia). En el Nuevo Mundo1, la leishmaniosis está causada por el complejo de L. braziliensis (LMC y LC), el complejo de L. mexicana (LC), L. peruviana (LC) y L. chagasi (LV y LC); en el Viejo Mundo la leishmaniosis está causada por L. donovani (LV), L. infantum (LV y LC), L. tropica (LC), L. major (LC) y L. aethiopica (LC). Leishmania infantum y L. chagasi son idénticas en 1

En este capítulo, el término "Nuevo Mundo" indica América del Norte, Central y del Sur, y el término "Viejo Mundo" se refiere a Europa, África y Asia.

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Capítulo 2.2.11.  Leishmaniosis

genotipado bioquímico y deberían considerarse como sinónimas (20). Con escasa excepciones, las enfermedades son zoonosis. La lesihmaniosis canina (CanL) es una enfermedad crónica víscero–cutánea causada por L. infantum (= L. chagasi), donde el perro actúa como reservorio. En algunos casos, los parásitos del complejo L. braziliensis, L. major y L. tropica se han aislado de este hospedador (27). Los vectores de la leishmaniosis son moscas flebotómicas que pertenecen a los géneros Lutzomyia (Nuevo Mundo) y Phlebotomus (Viejo Mundo).

B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO 1.

Identificación del agente

Los métodos de rutina disponibles para el diagnóstico de la leishmaniosis son el examen clínico de casos sospechosos, el diagnóstico parasitológico y el inmunodiagnóstico. Sin embargo, la demostración del parásito es el único medio de confirmar la enfermedad de modo concluyente (23). En LV y CanL se recomienda el aislamiento e identificación del parásito de las biopsias (nódulos linfáticos, médula ósea, y aspirados del bazo) junto a pruebas moleculares y de inmunodiagnóstico. Para la confirmación de LC (mediante raspado de las lesiones o aspiración con aguja del borde de la lesión) es necesario el diagnóstico parasitológico, ya que ni el examen clínico ni la serología resultan adecuados. Los frotis del material de las biopsias se tiñen con tinción de Giemsa y se examinan al microscopio a x600–1.000 aumentos. El material también debe cultivarse en medios apropiados a 22–26°C. Las características morfológicas de los amastigotes (en hospedadores humanos y mamíferos) y de los promastigotes (hospedadores invertebrados y en cultivo) son las siguientes: •

Amastigote: pequeño cuerpo intracelular redondeado u oval, de 1,5–3 x 2,5–6,5 µm, localizado en las vacuolas del citoplasma de los macrófagos. No existen flagelos libres. El organismo tiene un núcleo relativamente grande y un cinetoplasto que consiste en un cuerpo alargado y un cuerpo basal puntual.

•

Promastigote: organismo extracelular alargado, de 15–20 x 1,5–3,5 µm con un único flagelo de 15–28 µm de longitud, que sale de las proximidades del cinetoplasto en la parte anterior. El núcleo se sitúa centralmente.

La elección de los métodos de aislamiento y de cultivo dependerá de las circunstancias inmediatas y de la capacidad técnica y la experiencia del personal de laboratorio (34). El aislamiento in vitro presenta ciertas ventajas respecto a los métodos in vivo: los cultivos son positivos más rápidamente (5–30 días en comparación con los meses que tardan las lesiones en aparecer en un animal y los materiales son menos costosos. Sin embargo, para el aislamiento in vitro, las técnicas utilizadas deben llevarse a cabo en condiciones estériles estrictas; por tanto, no es siempre realizable en condiciones de campo. Por desgracia, no existe todavía un medio de cultivo “universal” en que crezcan con facilidad todas las leishmanias y es casi imposible predecir qué medio será el más apropiado para el crecimiento de un aislamiento particular de Leishmania. Cada laboratorio tiene que encontrar el medio más adecuado entre los medios bifásicos de agar sangre y los medios de cultivo de tejidos suplementados con suero fetal bovino (7). Cuando se intenta el aislamiento primario de organismos desconocidos, se debe utilizar un medio con agar sangre –con preferencia el medio NNN (Novy, McNeil y Nicolle) o, en su defecto, medio sólido de infusión de cerebro y corazón (BHI) o medio EMTM (medio de Tobie modificado por Evans). En la Sección B.1.a. se describen medios adecuados para el cultivo en masa de aislamientos establecidos, (ver ref. 7 para la composición de los medios). Los organismos de pacientes con LV y LMC pueden ser muy difíciles de cultivar. A veces, incluso cuando el aislamiento inicial tiene éxito, los parásitos pueden morir cuando se subcultivan. Esto parece especialmente frecuente cuando el aislamiento inicial se hace en medio rico. A menudo esto se puede superar si los subcultivos se realizan en medios nutritivos menos ricos, como el NNN, o unos de los medios semisólidos, como el “Evans mojado” o el agar sangre semisólido de Locke. El hámster (Misocricetus auratus) es el animal más utilizado para aislamientos in vivo (27). En caso de detectar parásitos dermatotrópicos, las suspensiones de tejidos o los aspirados se inoculan intradérmicamente en la nariz y/o los pies. Cuando se sospecha que el material está infectado con parásitos que causan LV, se debe hacer la inoculación preferiblemente por la ruta intraperitoneal. La infección que resulta se hace aparente semanas o meses después por el desarrollo de un nódulo o úlcera en el sitio de la inoculación, y en el caso de parásitos viscerotrópicos la infección se evidencia meses después por la infección masiva de los órganos internos. El examen de frotis de suspensiones de tejidos/aspirados de hámster mostrará amastigotes con tinción de Giemsa. Para el diagnóstico de L. major se usan generalmente ratones BALB/c. En muchos centros se están utilizando varias técnicas para identificar las diferentes especies, subespecies y cepas de Leishmania. a)

434

La caracterización de isozimas es el método más común (1, 13, 27, 34). Esta técnica requiere un gran número de parásitos (5 x 109–1 x 1010). Los principios de la electroforesis de enzimas son los siguientes: se extraen los enzimas solubles de los organismos crecidos en medio para cultivo en masa (medio BHI, medio MEM/FCS/EBLB [medio mínimo esencial/suero fetal bovino/caldo de Evans con sangre lisada], medio

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Capítulo 2.2.11.  Leishmaniosis

Drosophila de Schneider). Se coloca después una pequeña cantidad del extracto en una substancia inerte de soporte, la matriz, que contiene un tampón a un pH determinado. Generalmente la matriz es gel de almidón, pero puede ser también absorbente, acetato de celulosa, acrilamida o agarosa. Normalmente se escoge el pH del tampón de la matriz de modo que los isozimas estén cargados negativamente. A través de la matriz se pasa una corriente directa llevada por los iones del tampón. Cuando se completa la electroforesis, la mayoría de las proteínas se habrán desplazado hacia el ánodo en la matriz, dependiendo de la carga negativa. Si se tiñen en esta fase con un colorante general de proteínas, se verán muchas bandas. No obstante, la elevada especificidad de substrato y de cofactor de los enzimas hace posible teñir solo estas proteínas. Por tanto, se puede comparar la movilidad electroforética de un enzima particular en varios organismos. La matriz con el conjunto de bandas de isozimas teñidas se denomina un zimograma. Por lo general, para ayudar a la interpretación de los resultados, se incluyen en el gel uno o más extractos de organismos de referencia cuyo modelo de bandas de enzimas está bien documentado. La mayoría de los enzimas utilizados para fines de caracterización se tiñen por métodos que incorporan una reacción de deshidrogenación. Se deberían examinar por lo menos 12 enzimas. b)

La técnica del anticuerpo monoclonal (MAb) se aplica al análisis y clasificación de especies y subespecies de Leishmania tanto del Nuevo como del Viejo Mundo (13, 27, 34). Para la producción de anticuerpos, se inmunizan ratones BALB/c con preparaciones de membranas de promastigotes o amastigotes. Después se seleccionan y se clonan por diluciones limitantes los cultivos de hibridoma que secretan anticuerpo. La especificidad para las cepas de Leishmania se determina por inmunofluorescencia o por pruebas inmunoradiométricas. Estos análisis deben ser cuantitativos, pues la cantidad de un mismo antígeno superficial puede variar entre distintas especies de Leishmania. Se han utilizado también anticuerpos monoclonales en técnicas inmunohistoquímicas con aplicación a los tejidos de las biopsias.

c)

El análisis del ADN del cinetoplasto con enzimas de restricción se basa en el análisis, mediante electroforesis en gel, de los fragmentos que generan las endonucleasas en el abundante ADN mitocondrial que constituye el cinetoplasto (10, 13, 15, 27, 32). El patrón electroforético que se obtiene, conocido como “huellas” de restricción, es un marcador del orgánulo a nivel genotípico que permite la identificación y clasificación de las cepas de Leishmania en esquizodemos –poblaciones que tienen secuencias similares en el ADN del cinetoplasto. Esta técnica también requiere un gran número de parásitos (1 x 1010).

d)

Las sondas de hibridación de ADN son un instrumento prometedor cuyo principio es permitir que las secuencias marcadas del ADN nuclear o del cinetoplasto, de una sola cadena, procedentes de cepas estándar bien caracterizadas, se encuentren e hibriden con secuencias de ADN homólogas de un aislado de Leishmania desconocido (13, 33). Solo las secuencias de ADN complementario formarán ADN de cadena doble, que se puede detectar por autoradiografía si la sonda está marcada radiactivamente, o por una reacción inmunoenzimática. Estas técnicas son lo suficientemente sensibles como para identificar 102–103 organismos depositados en filtros de nylon. Se necesitan muchos menos parásitos (100 terneros lactantes) la sensibilidad de la prueba tiene menos fiabilidad. Pueden presentarse reacciones positivas falsas en animales vacunados 4 meses antes de la prueba, en muestras de leche anormal (como el calostro) o en casos de mastitis. Por tanto, no se recomienda la utilización de esta prueba en granjas muy pequeñas, donde estos problemas presentan un mayor impacto en los resultados de la prueba. •

Producción de antígeno

El antígeno para MRT se prepara de suspensiones concentradas de bacterias muertas de B. abortus S99 o S1119-3, cultivadas como se ha descrito con anterioridad. Se centrifugan a 23.000 g durante 10 minutos a 4°C y se resuspenden en solución de colorante hematoxilina. Se emplean varios métodos satisfactorios; un ejemplo es el siguiente: se añaden 100 ml de hematoxilina al 4% (p/v) (Cl No. 75290), disuelta en 95% de etanol, a una solución de sulfato amónico alumínico (5 g) en 100 ml de agua destilada y 48 ml de glicerol. A la solución se añaden 2 ml de iodato sódico al 10% (p/v) recién preparado. Después de 30 minutos a temperatura ambiente, la solución de color púrpura oscuro se añade a 940 ml de sulfato amónico alumínico al 10% (p/v) en agua destilada. El pH de la mezcla se ajusta a 3,1 y la solución se deja envejecer manteniéndola a temperatura ambiente durante 45-90 días en la oscuridad. Antes de uso, la solución de colorante se agita y se filtra por lana de algodón. Las células empaquetadas se suspenden en la solución de colorante a razón de 1 g por 30 ml de colorante y se mantienen a temperatura ambiente durante 48 horas (en vez de esto, algunos laboratorios prefieren calentar 80°C durante 10 minutos). Las células teñidas se depositan por centrifugación y se lavan tres veces con una solución de cloruro sódico (6,4 g), ácido láctico al 85% (1,5 ml) e hidróxido sódico al 10% (4,4 ml) en 1,6 litros de agua destilada, a pH final de 3,0. Las células lavadas se resuspenden a razón de 1 g en 27 ml de un diluyente que consiste en solución salina con fenol al 0,5%, ajustada a pH 4,0 por adición de ácido cítrico 0,1 M (aproximadamente 2, 5 ml) y fosfato bisódico 0,5 M (aproximadamente 1 ml), y se mantiene a 4°C durante 24 horas. La mezcla se filtra por lana de algodón, se comprueba el pH, y se determina el PCV ajustándolo aproximadamente al 4%. La sensibilidad del lote nuevo debe compararse con la de un lote previamente estandarizado utilizando un juego de muestras de varios grados de reacción preparado diluyendo un suero positivo en leche. El antígeno debe estandarizarse frente al OIEISS de modo que una dilución 1/500 sea positiva y una dilución 1/1.000 sea negativa. El antígeno se guarda a 4°C sin congelar. El pH del antígeno debe estar entre 3,3 y 3,7 y su color debe ser azul oscuro. Se permite la existencia de un poco de colorante libre en el sobrenadante de una muestra centrifugada. Cuando se diluye en leche de un animal sin brucelosis, el antígeno debe producir una coloración uniforme de la capa de leche sin formar depósitos ni coloración en la capa cremosa.

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Capítulo 2.3.1.  Brucelosis bovina •

Procedimiento de la prueba

La prueba se lleva a cabo sobre muestras del tanque de leche entera. Si es necesario, las muestras se pueden pretratar con un conservante (formalina al 0,1% o bronopol al 0,02%) durante 2-3 días a 4°C antes de uso. La prueba se lleva a cabo añadiendo 30-50 µl de antígeno a 1-2 ml de leche completa (el volumen de leche puede aumentarse para muestras de poblaciones grandes). La altura de la columna de leche en el tubo debe ser como mínimo de 25 mm. Las muestras de leche no deben haber sido congeladas, calentadas, sometidas a agitación violenta o guardadas por más de 72 horas. Normalmente, las mezclas de leche/antígeno se incuban a 37°C durante 1 hora junto con estándares de trabajo positivos y negativos. Sin embargo, la incubación durante la noche a 4°C aumenta la sensibilidad de la prueba y permite una interpretación más fácil. Una reacción fuertemente positiva se indica por la formación de un anillo azul oscuro por encima de la columna blanca de leche. Cualquier anillo azul en la interfase de leche y de crema debe considerarse positivo y podría ser significativo, especialmente en el caso de grandes poblaciones. La prueba es negativa si el color de la leche supera al de la capa cremosa.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO C1. Brucelina La brucelina INRA es un extracto libre de LPS de B. melitensis B115 rugosa. Esta preparación no provoca la formación de anticuerpos reactivos en BBAT, FC o ELISA.

1.

Control de inóculos

a)

Características del inóculo La producción de brucelina INRA se basa en un sistema de lotes de siembra como se describe para los antígenos y las vacunas. El inóculo original de la cepa B115 de B. melitensis para producción de brucelina6 debe cultivarse para producir un lote de siembra que debe conservarse por liofilización o congelación en nitrógeno líquido. Debe presentar las propiedades de un cultivo puro de una cepa rugosa de B. melitensis y no producir LPS liso de Brucella. Debe producir cantidades razonables de una mezcla de antígenos proteicos reactivos frente a antisueros contra cepas rugosas y lisas de Brucella.

b)

Método de cultivo (1) La cepa B115 de Brucella melitensis crece mejor en el medio de cultivo descrito antes para cultivo en fermentador. Puede crecer en fermentador por el método continuo o discontinuo o en matraces colocados en un agitador. Deben realizarse comprobaciones de pureza en cada recogida aislada y el organismo debe encontrase en la fase rugosa.

c)

Validación como un reactivo de diagnóstico in vivo Estudios de laboratorio y de campo realizados en Francia, han confirmado que la brucelina INRA es segura, no tóxica y de acción específica. La preparación contiene un 50-75% de proteínas, principalmente de bajo peso molecular, y un 15-30% de carbohidratos. No contiene antígenos LPS. La brucelina INRA no provoca repuestas inflamatorias en animales no sensibilizados, y no es por sí misma un agente sensibilizante. No provoca anticuerpos reactivos en las pruebas serológicas estándar para brucelosis. Más del 90% de los pequeños rumiantes infectados por B. melitensis manifiestan hipersensibilidad retardada a la brucelina INRA en alguna fase. La preparación no es recomendable como un agente de diagnóstico para animales individuales, pero puede ser útil para el análisis de poblaciones. Se suministra a los pequeños rumiantes en dosis de 100 µg por vía intradérmica e induce una reacción local de hipersensibilidad retardada que es visible a las 48-72 horas en animales sensibilizados. Tanto los animales vacunados como los infectados dan reacción positiva.

2.

Método de producción (1)

Las células de Brucella melitensis B115 se inactivan después del cultivo elevando la temperatura a 70°C durante 90 minutos, se enfrían a 4°C, y se recogen por centrifugación a 9.000 g durante 15 minutos a 4°C. Las células se lavan con agua destilada estéril y fría y se deshidratan precipitándolas con tres volúmenes de acetona a –20°C, y luego se deja reposar a –20°C durante 24-48 horas. Después de lavados repetidos con acetona fría y de un lavado final con dietil éter, las células se secan sobre cloruro cálcico y se mantienen a 4°C. Las células secas se someten a una prueba de viabilidad. Se resuspenden en cloruro sódico estéril al 2,5% hasta una concentración

6

462

Se puede obtener del Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), Laboratoire de Pathologie Infectieuse et Immunologie, 37380 Nouzilly, Francia.

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Capítulo 2.3.1.  Brucelosis bovina

final del 5% (p/v) y se agitan durante 3 días a 4°C. Las células bacterianas se eliminan por centrifugación como antes y el sobrenadante se concentra a un cuarto de su volumen por ultrafiltración con una membrana Diaflo PM10 (Amicon) y se precipita añadiendo tres volúmenes de etanol frío. La mezcla se mantiene a 4°C durante 24 horas y el precipitado se recoge por centrifugación, se redisuelve en agua destilada y se dializa para eliminar el etanol. Después de centrifugar a 105.000 g durante 6 horas a 4°C, el sobrenadante, que es la brucelina sin estandarizar, se analiza en cuanto a proteínas y carbohidratos. Puede liofilizarse como material global o después de distribuirla en sus recipientes finales.

3.

Control del proceso

El extracto crudo de brucelina debe probarse para esterilidad después de la extracción con acetona para comprobar la inactivación de las células de Brucella, y de nuevo al final del proceso para comprobar alguna posible contaminación. Deben determinarse el pH y la concentración de proteína y realizarse pruebas de identidad sobre el material global antes del llenado de los recipientes finales.

4.

Control de lotes

a)

Esterilidad Las preparaciones de alérgenos deben probarse para esterilidad como se describe en el Capítulo I.1.5.

b)

Inocuidad Las muestras de brucelina en sus recipientes finales deben someterse a la prueba estándar de esterilidad y también deben probarse las preparaciones para toxicidad anormal. Se inyectan intraperitonealmente dosis equivalentes a 20 dosis de ganado (2 ml) en un par de cobayas normales que no se hayan expuesto con anterioridad a Brucella o a sus antígenos. También se inyectan subcutáneamente cinco ratones normales con 0, 5 ml de brucelina examinada. Los animales se observan durante 7 días y no debe haber reacción local o generalizada a la inyección. La capacidad dermonecrótica se examina por inoculación intradérmica de 0,1 ml del producto examinado en el costado previamente afeitado y desinfectado de tres cobayas albinos normales que no se hayan expuesto con anterioridad a Brucella o a sus antígenos. No debe observarse reacción cutánea. La ausencia de sensibilización alérgica o serológica se comprueba por inoculación intradérmica de tres cobayas albinos normales, tres veces cada 5 días, con 0,1 ml de una dilución 1/10 de la preparación examinada. Se suministra una inyección similar 15 días después a los mismos tres animales y a un lote control de tres cobayas del mismo peso que no se han inyectado previamente. Los animales no deben convertirse en seropositivos cuando se analizan 24 horas después de la última inyección por las pruebas estándar de brucelosis (RBT, FC) ni deben desarrollar respuestas de hipersensibilidad retardada.

c)

Potencia La potencia de las preparaciones de brucelina se determina por inyección intradérmica de dosis graduales de brucelina en cobayas que se han sensibilizado por inoculación subcutánea con 0,5 ml de brucelina de referencia7 con adyuvante completo de Freund de 1 a 6 meses antes. Se determina y mide la reacción eritematosa a las 24 horas y se calcula el título por comparación con una brucelina de referencia8. Este método solo es válido para comparar preparaciones de brucelina obtenidas por el mismo protocolo que el alérgeno sensibilizante. Se ha descrito la estandarización inicial de un lote de alérgeno y la sensibilización y titulación en rumiantes (1).

d)

Duración de la sensibilidad La duración de la sensibilidad es dudosa. Los animales varían considerablemente a nivel individual en cuanto al grado de hipersensibilidad manifestado a la brucelina. Los animales en fases muy tempranas de la infección, o con infecciones de larga duración, pueden no manifestar hipersensibilidad a la inyección intradérmica.

7

8

Se ha producido por el INRA-PII (F-37380 Nouzilly, Francia) una brucelina de referencia nacional que puede obtenerse del Laboratorio de Referencia de la OIE para Brucelosis, AFSSA, 23 avenue du Général-de-Gaulle, 94706 Maisons-Alfort Cedex, France. El procedimiento estadístico puede obtenerse del Laboratorio de Referencia de la OIE para Brucelosis, AFSSA, BP67, 94706 Maisons-Alfort Cedex, France.

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Capítulo 2.3.1.  Brucelosis bovina

e)

Estabilidad La preparación liofilizada retiene una actividad completa durante varios años. La preparación comercial líquida debe retener la potencia durante la caducidad recomendada.

f)

Conservantes No se recomienda el uso de conservantes en preparaciones liofilizadas. En la forma líquida, se puede utilizar mertiolato sódico como conservante (máximo 0,1 mg/ml). Si la preparación está liofilizada no debe reconstituirse hasta inmediatamente antes de su uso.

g)

Precauciones (riesgos) La brucelina no es tóxica. Sin embargo, puede provocar reacciones graves de hipersensibilidad en individuos sensibilizados que se exponen accidentalmente a ella. Debe tenerse cuidado en evitar la inyección accidental o la contaminación por las mucosas. El equipo de inyección utilizado y los recipientes deben descontaminarse cuidadosamente o eliminarse por incineración en contenedores adecuados de desecho.

5.

Pruebas sobre el producto final

a)

Inocuidad Se debe realizar una prueba de esterilidad por el método recomendado. Las pruebas de seguridad in vivo son las descritas para el control de lotes (ver sección C1.4.b.). Estas pruebas pueden omitirse en el lote si se realiza la prueba completa en los lotes finales de llenado.

b)

Potencia Se realiza por inyección de una única dosis en cobayas según el procedimiento descrito en la sección C1.4.c.

C2. Vacunas Vacuna con la cepa 19 de Brucella abortus La vacuna más ampliamente utilizada para prevenir la brucelosis en el ganado bovino es la vacuna con Brucella abortus S19, que continúa siendo la vacuna de referencia con la que se compara el resto de vacunas. Se utiliza como una vacuna viva que por lo general se suministra a terneras entre 3 y 6 meses como una dosis única subcutánea de 5-8 x 1010 microorganismos viables. Se puede administrar al ganado adulto una dosis reducida de 3 x 108 a 3 x109 microorganismos, pero algunos animales desarrollan títulos duraderos de anticuerpos y pueden abortar y excretar la cepa vacunal por la leche. Alternativamente, se puede administrar a ganado de cualquier edad en dos dosis de 5-10 x 109 microorganismos viables por vía conjuntival; esto produce protección sin una respuesta duradera de anticuerpos y reduce los riesgos de aborto y de excreción en la leche. La vacuna con Brucella abortus S19 induce una buena inmunidad frente a desafíos moderados por microorganismos virulentos. La vacuna debe prepararse de inóculos derivados del USDA (para dirección, ver nota 2 a pie de página) y cada lote ha de probarse para pureza (ausencia de microorganismos extraños), viabilidad (bacterias vivas por dosis) y homogeneidad (determinación de la fase de disociación). Los lotes de inóculo para la producción de vacuna S19 deben comprobarse regularmente en ratones para virulencia residual e inmunogenicidad. Los procedimientos de control para esta vacuna se indican más adelante.

Vacuna con la cepa RB51 de Brucella abortus Desde 1996 la cepa RB51 de Brucella abortus es la vacuna oficial en muchos países para la prevención de la brucelosis en el ganado vacuno. Sin embargo, su eficacia e inocuidad en comparación con la S19 son motivo de controversia (38, 39, 57). Cada país utiliza métodos ligeramente diferentes de administrar la vacuna. En EE.UU. los terneros se vacunan subcutáneamente entre los 4 y 12 meses con 1-3,4 x 1010 microorganismos viables de la cepa RB51. La vacunación de ganado de mayor edad solo se hace bajo autorización de organizaciones estatales o federales de salud animal y la dosis recomendada es de 1 x 109 microorganismos viables. En otros países se recomienda la vacunación de terneros (4-12 meses) con dosis de 1-3,4 x 1010, y la revacunación de 12 meses en adelante con una dosis similar para inducir un efecto de recuerdo y aumentar la inmunidad.

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Capítulo 2.3.1.  Brucelosis bovina

Se ha descrito que cuando se administran intravenosamente al ganado dosis completas de RB51 se induce placentitis grave e infecciones placentarias en la mayoría del ganado vacunado (49) y que un número notable de éstos excreta microorganismos en la leche. Las experiencias de campo también indican que en algunos casos puede provocar aborto si se aplica a vacas grávidas. Debido a estas observaciones se debe evitar la vacunación de vacas grávidas. Un modo de reducir los efectos colaterales de RB51 es reducir la dosis. Con la dosis reducida de esta vacuna (1 x 109 unidades formadoras de colonias [CFU]) no se producen abortos ni lesiones placentarias en el ganado vacunado subcutáneamente (50), aunque un porcentaje significativo de estos animales excreta la cepa vacunal (61). Sin embargo, esta dosis reducida no protege contra B. abortus cuando se usa en la vacunación de terneros (47), aunque lo hace cuando se aplica a adultos (48). Debe destacarse que, como la S19, la cepa RB51 puede infectar a humanos (65). La cepa RB51 es muy resistente a rifampicina, uno de los antibióticos de elección en el tratamiento de la brucelosis humana. Además, el diagnóstico de la infección por RB51 requiere pruebas especiales que no están disponibles en la mayoría de los hospitales. Los Centros para el Control de Enfermedades, del Departamento de Salud y Servicios Humanos, en Atlanta, Georgia, EE.UU. (CDC), establecieron una vigilancia pasiva sobre la inoculación accidental con la vacuna RB51 en EE.UU. para determinar si la vacuna produce enfermedad en humanos. Este estudio incluyó 26 participantes expuestos a la vacuna durante la vacunación de animales. La exposición accidental originó efectos indeseables tanto locales como sistémicos; sin embargo, no ha quedado claro si la cepa vacunal RB51 puede causar brucelosis sistémica en el hombre. El número de casos descritos de pacientes en este estudio (veinte y seis) es pequeño comparado con el número de vacunaciones (varios millones de terneros vacunados) y con las predicciones estimadas de inoculaciones fortuitas con RB51 (8 por 11.000). El estudio indicaba que un uso apropiado de antibióticos protegía contra la infección pero no ha quedado determinado hasta qué punto otros componentes de la vacuna contribuyan a los efectos adversos (60). Esto contrasta con la cepa 19, donde está bien documentado que se desarrolla la fiebre ondulante por exposición accidental sin tratamiento preventivo. Los procedimientos de control para esta vacuna se indican más adelante.

Vacuna con la cepa Rev.1 de Brucella melitensis Es frecuente aislar B. melitensis en ganado vacuno en países con una elevada prevalencia de esta infección en pequeños rumiantes (64). Ha habido cierto debate sobre la eficacia protectora de S19 en infecciones por B. melitensis en el ganado vacuno y se ha supuesto que la Rev.1 debería ser una vacuna más eficaz en estas condiciones. Sin embargo solo hay un trabajo sobre esta materia que demuestra que S19 es capaz de controlar B. melitensis en condiciones de campo (27). En contraste, no se han realizado experimentos sobre la eficacia de Rev.1 en la infección del ganado por B. melitensis. Además, la seguridad de esta vacuna es prácticamente desconocida en el ganado (62). Hasta que se realicen estudios sobre la seguridad y eficacia de Rev.1 contra B. melitensis en el ganado a diferentes condiciones fisiológicas y bajo situaciones estrictamente controladas, esta vacuna no debería recomendarse para el ganado vacuno.

1.

Control de inóculos

a)

Características del inóculo El inóculo original de Brucella abortus S19 para producir vacunas debe obtenerse del USDA (para dirección, ver nota 2 a pie de página) y utilizarse para producir un lote de inóculos conservado por liofilización o por congelación en nitrógeno líquido. Las propiedades de este lote de inóculos deben ser las de un cultivo puro de B. abortus biotipo 1 no dependiente de CO2, que sea sensible a la bencilpenicilina, azul de tionina e ieritritol a las concentraciones recomendadas, y que tenga una patogenicidad mínima en cobayas. El inóculo original de Brucella abortus RB51 está comercializado9. Estas compañías tienen los derechos legales de la vacuna.

b)

Método de cultivo Para producir la vacuna, Brucella abortus S19 se cultiva en un medio libre de suero o de otros productos animales, bajo condiciones similares a las descritas antes para B. abortus S99 ó S1119-3 (1). La cepa RB51 de Brucella abortus sigue métodos similares de cultivo.

9

Colorado Serum Company, 4950 York Street, P.O. Box 16428, Denver, Colorado 80216-0428, EE.UU.; o Veterinary Technologies Corporation, 1872 Pratt Drive, Suite 1100B, Blacksburg, Virginia 24060, EE.UU.

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Capítulo 2.3.1.  Brucelosis bovina

c)

Validación como vacuna Muchos estudios independientes han confirmado el valor de S19 como vacuna que protege al ganado de la brucelosis. El microorganismo se comporta como una cepa atenuada cuando se suministra a ganado sexualmente inmaduro. En casos raros puede producir una infección localizada en el tracto genital. Con adultos, es probable que se produzca una respuesta persistente de anticuerpos durante 6 meses o más en una proporción notable del ganado vacunado subcutáneamente con la dosis estándar. Parte del ganado vacunado como terneros puede desarrollar más tarde artropatía, particularmente en las articulaciones de la tibia y el fémur (7, 13). La vacuna es segura para la mayoría de los animales si se administra a terneros entre 3 y 8 meses de edad. Puede emplearse también en animales adultos a dosis reducida. Produce una inmunidad duradera para un desafío moderado con cepas virulentas de B. abortus, pero su duración exacta es desconocida. La duración de la protección frente a B. melitensis es también desconocida. La cepa vacunal es estable y su reversión a la forma virulenta es extremadamente rara. Cuando se administra involuntariamente a animales grávidos se ha asociado con la aparición de cepas que utilizan i-eritritol. El microorganismo se comporta como una cepa atenuada para ratones, e incluso grandes inóculos desaparecen rápidamente de los tejidos. Estudios sobre desafíos experimentales y desafíos realizados en condiciones de campo destacan el valor de la cepa RB51 de B. abortus en la protección del ganado frente a la brucelosis. El microorganismo es atenuado en terneros y en adultos. Como esta cepa expresa niveles mínimos de sLPS no se produce seroconversión frente a sLPS en animales vacunados. Además, RB51 no induce anticuerpos detectables contra el antígeno OPS utilizando los procedimientos actuales de prueba (59). Produce inmunidad a desafíos moderados de cepas virulentas, pero se desconoce su duración exacta. La vacuna es estable y no revierte de fase in vivo ni in vitro. El microorganismo se comporta como una cepa atenuada en varios tipos de animales, como en ratones, y desaparece rápidamente de los tejidos. Las vacunas S19 y RB51 tienen cierta virulencia para el hombre, y pueden producirse infecciones accidentales. Se debe tener cuidado en su preparación y manejo, así como incluir un aviso de riesgo en la etiqueta de los recipientes finales. En cualquier caso, las inoculaciones accidentales deben tratarse con antibióticos apropiados (ver Sección C2.4.g.).

2.

Método de producción

Para la producción de la vacuna S19 se pueden utilizar los procedimientos descritos anteriormente, excepto que las células se recogen en PBS, pH 6,3, y se depositan por centrifugación o añadiendo carboximetil celulosa sódica a una concentración final de 1,5 g/litro. El producto obtenido de un fermentador o las células agrupadas de un lote de cultivos en botellas Roux que se hayan inoculado al mismo tiempo y con el mismo lote de inóculo constituye una cosecha individual. Se puede juntar más de una cosecha para formar la masa final que se utiliza para llenar los recipientes terminales de un lote de vacuna. Antes de mezclarlas, cada cosecha individual se prueba para pureza, concentración celular, disociación e identidad. Deben hacerse las mismas pruebas sobre la masa final, que debe tener un número de viables entre 8 y 24 x 109 CFU/ml. Los ajustes de concentración se hacen añadiendo PBS a la vacuna presentada en forma líquida o estabilizador a la forma liofilizada. Si se emplea estabilizador debe tenerse en cuenta la pérdida de viabilidad en la liofilización, y no debe superar el 50%. El producto final desecado no debe someterse a temperaturas superiores a 35°C durante el secado y el contenido en humedad residual debe ser 1-2%. Los envases deben cerrarse al vacío o en nitrógeno seco inmediatamente después del secado, y han de mantenerse a 4°C. El proceso de producción para la cepa BR51 de B. abortus es muy similar al utilizado para la S19.

3.

Control del proceso

La vacuna con Brucella abortus S19 debe probarse para pureza y estado de fase lisa durante la preparación de cada cosecha individual. También debe comprobarse la concentración celular, que puede realizarse por medidas de opacidad, pero en los lotes finales de llenado debe realizarse una determinación de viables. También debe probarse la identidad mediante pruebas de aglutinación con antisuero contra el antígeno A de Brucella. La concentración de viables en los recipientes finales no debe ser inferior a 50 x 109 por cada dosis estándar después de la liofilización y al menos el 95% de las células deben estar en la fase lisa. La vacuna con Brucella abortus RB51 debe probarse para pureza y estado de fase rugosa durante la preparación de cada cosecha individual. También debe comprobarse la concentración celular. En los lotes finales de llenado debe realizarse una determinación de viables. La concentración de viables en los recipientes finales debe ser de 1-3,4 x 1010 CFU por dosis (dosis de 2 ml aplicadas subcutáneamente) y el 100% de las células deben estar en fase rugosa. Todas las colonias deben ser negativas en pruebas puntuales con MAbs específicos para el antígeno OPS.

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Capítulo 2.3.1.  Brucelosis bovina

4.

Control de lotes

a)

Esterilidad Las pruebas para esterilidad y ausencia de contaminación en los materiales biológicos se encuentran en el Capítulo I.1.5.

b)

Inocuidad La vacuna S19 es per se un producto virulento y debe mantenerse con mínima virulencia para que sea eficaz (ver sección C2.4.c.). Sin embargo, no se realiza rutinariamente una prueba de inocuidad. Si se desea, puede realizarse en ganado cuando se inicia un nuevo proceso de fabricación o cuando se espera alguna modificación de la seguridad de la vacuna. Este control debe realizarse como sigue: la prueba utiliza 12 terneras de 4-6 meses. Seis de las hembras se inyectan con una o con tres dosis recomendadas. Cada lote de seis terneras se mantiene por separado y se observan durante 21 días. No deben producirse lesiones locales o sistémicas significativas. Si para una dosis y una ruta de administración dadas la prueba da buenos resultados para un lote representativo de vacuna, no tiene que repetirse con lotes de inóculo o de vacuna preparados con el mismo inóculo original y con el mismo proceso de fabricación. También debe realizarse una prueba de seguridad de la vacuna S19 en cobayas. A grupos de 10 animales como mínimo se inyectan por vía intramuscular dosis de vacuna diluida en PBS, pH 7,2, que contengan 5 x 109 microorganismos viables. Los animales no deben mostrar signos nocivos ni debe haber mortalidad. Normalmente, no se realizan pruebas de inocuidad con la vacuna de la cepa RB51 de B. abortus. Si se desea, se pueden inyectar intraperitonealmente ratones Balb/c hembras de 8-10 semanas con 1 x 108 CFUs y se cultivan los bazos a las 6 semanas post-inoculación. Los bazos deben estar libres de RB51 y los ratones no deben desarrollar anticuerpos anti-OPS.

c)

Potencia

•

Vacuna S19 Una vacuna S19 es eficaz si posee las características de la cepa original S19, es decir, si es satisfactoria respecto a identidad, fase lisa, inmunogenicidad y virulencia residual (6). Los lotes deben probarse también respecto al número de microorganismos viables. •

Identidad La vacuna S19 reconstituida no debe contener microorganismos exógenos. La Brucella abortus presente en la vacuna se identifica por pruebas morfológicas, serológicas y bioquímicas adecuadas y por cultivo: Brucella abortus S19 tiene las propiedades normales de una cepa de B. abortus biotipo 1 pero no requiere CO2 para crecer ni crece en presencia de bencilpenicilina (3 µg/ml = 5 UI/ml), azul de tionina (2µg/ml) o i-eritritol (1 mg/ml) (concentraciones finales).

•

Fase lisa (determinación de la fase de disociación) La vacuna S19 reconstituida en agua destilada se siembra en estría en seis placas con medio sólido (agar suero-dextrosa o agar tripticasa-soja (TSA) con 5% [v/v] de suero o 0,1% [p/v] de extracto de levadura) de modo que las colonias estén juntas en algunas áreas mientras que en otras estén semiseparadas y en otras separadas. Las pequeñas diferencias son más obvias en las colonias adyacentes que en las separadas. Las placas se incuban a 37°C durante 5 días y se examinan con luz reflejada oblicua (método de Henry) antes y después de teñir (tres placas) con cristal violeta (método de tinción de White & Wilson). Apariencia de las colonias antes de teñir: Las colonias de tipo S aparecen redondas, brillantes y de color azul a verde-azulado. Las colonias R tienen un aspecto seco, granular y son de color blanco amarillento. Las colonias mucoides (M) son transparentes y grisáceas y pueden distinguirse por su consistencia pegajosa cuando se las toca con un asa de siembra. Las colonias intermedias (I) son las más difíciles de clasificar y tienen una apariencia intermedia entre las formas S y R: son ligeramente opacas y más granulares que las colonias S. Apariencia de las colonias después de teñir con cristal violeta: Las colonias S no toman el colorante. Las colonias disociadas (I, M o R) se tiñen en varios tonos de rojizo a púrpura y su superficie puede mostrar grietas radiales. A veces se observa un film superficial teñido que se despega de una colonia disociada y aparece adyacente a ella. La fase colonial puede confirmarse por la prueba de aglutinación con acriflavina (1): Las colonias S quedan en suspensión mientras que las R aglutinan rápidamente y, si son mucoides, forman tiras. Las colonias intermedias pueden quedar en suspensión o formar una aglutinación muy fina.

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Capítulo 2.3.1.  Brucelosis bovina •

Determinación de bacterias vivas Se inoculan al menos cinco placas de agar triptosa, de agar suero-dextrosa o de cualquier otro medio sólido adecuado con 0,1 ml de diluciones apropiadas de la vacuna que se extienden con un asa de vidrio, metal o plástico. Se cuentan las CFU por unidad de volumen de la vacuna.

•

Virulencia residual (tiempo de persistencia al 50% o tiempo de recuperación al 50%) (6, 23)

i)

Preparar suspensiones adecuadas del lote de siembra o de vacuna de B. abortus S19 que se vaya a probar (vacuna problema) y del cultivo original de inóculo de S19 (como cepa de referencia). Para esto, se recoge un cultivo de 24-48 horas de cada cepa en solución salina estéril tamponada (BSS: NaCl 8,5 g; KH2PO4 1,0 g; K2HPO4 2,0 g; agua destilada 1000 ml; pH 6,8) y se ajusta la suspensión con BSS a 109 CFU/ml con un espectrofotómetro (OD = 0,170 cuando se lee a 600 nm). El número exacto de CFU/ml se determina después por siembra en placa de diluciones decimales sobre un medio adecuado (se recomienda agar sangre o TSA).

ii)

Inyectar subcutáneamente 0,1 ml (108 CFU/ratón) de la suspensión de la vacuna problema en cada una de 32 hembras de ratón CD1 de 5-6 semanas. En paralelo se realiza una inoculación similar en otros 32 ratones con la suspensión que contiene la cepa de referencia S19. La cepa S19 original de siembra, que es satisfactoria respecto a inmunogenicidad y virulencia residual, se puede obtener del USDA (para dirección ver nota 2 a pie de página).

iii)

A las 3, 6, 9 y 12 semanas, sacrificar los ratones por dislocación cervical, en grupos de ocho elegidos al azar.

iv)

Extraer los bazos y homogenizarlos aséptica e individualmente en 1 ml de BSS estéril con un desintegrador de vidrio (o con un Stomacher en bolsas estériles adecuadas).

v)

Extender en cada caso toda la suspensión completa de bazo sobre varias placas con un medio apropiado de cultivo e incubar en condiciones estándar para Brucella durante 5-7 días (límite inferior de detección: 1 bacteria por bazo). Un animal se considera infectado cuando se aísla al menos 1 CFU del bazo.

vi)

Calcular el tiempo de persistencia al 50% o el tiempo de recuperación al 50% (RT50) por el método estadístico SAS®, desarrollado específicamente para calcular RT50 (para obtener el SAS® específico, ver la dirección en la nota 5 a pie de página) (23). Para esto se determina el número de ratones curados (sin colonias aisladas del bazo) a cada punto temporal de sacrificio (ocho ratones por punto) y se calcula el porcentaje acumulado de ratones curados con el tiempo por el método de Reed y Muench (descrito en la refª. 4). La función de distribución de este porcentaje describe una curva sigmoidal que debe linearizarse para calcular los valores RT50, mediante el procedimiento computarizado PROBIT en el sistema estadístico SAS®.

vii)

Comparar estadísticamente el paralelismo (corte y pendiente) entre las líneas de distribución obtenidas para la cepa problema y para la S19 de referencia, utilizando el SAS® diseñado para este propósito. Se pueden comparar estadísticamente dos valores RT50 solo cuando derivan de líneas de distribución paralelas. Si no existe paralelismo, la virulencia residual de la cepa problema se considera inadecuada y se elimina para producción de vacunas.

viii) Si se confirma el paralelismo, comparar estadísticamente los valores RT50 obtenidos para la cepa problema y de referencia utilizando el SAS® diseñado para este propósito. Para ser aceptable para la producción de vacunas, el RT50 obtenido con la cepa problema no debe diferir significativamente del obtenido con la cepa de referencia S19 (RT50 y los límites de confidencia son normalmente 7,0 + 1,3 semanas). Las bases del procedimiento estadístico para el cálculo anterior de la virulencia residual se han descrito recientemente con detalle (52). Alternativamente, los cálculos estadísticos descritos en los pasos vi) a viii) se pueden evitar con un programa específico de fácil empleo HTML-JAVA (Rev2) recientemente desarrollado y disponible sin coste alguno en la dirección: http://www.afssa.fr/interne/Rev2.html. Si la prueba se realiza con buenos resultados en un lote representativo de inóculo o de vacuna problema, no tiene que repetirse rutinariamente con otros lotes de vacuna preparados del mismo lote de inóculo y utilizando el mismo proceso de producción. •

Inmunogenicidad en ratón (5, 6)

Esta prueba utiliza tres grupos de seis ratones CD1 hembras, de 5-7 semanas, que se eligen al azar. i)

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Preparar y ajustar espectrofotométricamente las suspensiones de vacuna como se indicó anteriormente.

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Capítulo 2.3.1.  Brucelosis bovina

ii)

Inyectar subcutáneamente una suspensión de la vacuna examinada (vacuna problema) que contenga 105 CFU (en un volumen de 0,1 ml/ratón) a cada uno de los seis ratones del primer grupo.

iii)

Inyectar subcutáneamente una suspensión de la vacuna de referencia S19 que contenga 105 CFU de bacterias vivas en cada uno de los seis ratones del segundo grupo. El tercer grupo sirve como grupo control sin vacunar y se inocula subcutáneamente con 0,1 ml de BSS.

iv)

El número exacto de CFU inoculado se comprueba después por siembra en placa de diluciones decimales sobre un medio adecuado (se recomienda agar sangre o TSA).

v)

30 días después de la vacunación (e inmediatamente después de 16 horas de ayuno) todos los ratones se someten a una inoculación intraperitoneal de desafío con una suspensión (0,1 ml/ratón) que contenga 2 x 105 CFU de la cepa 544 de B. abortus (dependiente de CO2), preparada, ajustada y comprobada como antes.

vi)

Sacrificar los ratones 15 días más tarde por dislocación cervical.

vii)

Cada bazo se corta asépticamente, se elimina la grasa, y se pesa y homogeniza. Alternativamente, los bazos pueden congelarse y mantenerse a –20°C de 24 horas a 7 semanas.

viii) Cada bazo se homogeniza asépticamente con un desintegrador de vidrio (o con un Stomacher en sacos estériles adecuados) en nueve veces su peso con BSS, pH 6,8, y de cada homogenizado se hacen tres diluciones decimales seriadas (1/10, 1/100 y 1/1.000) en el mismo diluyente. Por cuadruplicado, se extienden 0,2 ml en placas con medio sólido y se incuban dos placas a 37°C durante 5 días en atmósfera con 10% de CO2 (permite el crecimiento de la cepa vacunal y de la desafío) y otras dos placas en aire (se inhibe el crecimiento de la cepa de desafío B. abortus 544 que es dependiente de CO2). ix)

Las colonias de Brucella se cuentan en las diluciones que corresponden a placas con menos de 300 CFU. Cuando no se cuentan colonias en la placa de la dilución 1/10, se considera que el bazo está infectado con cinco bacterias. Este número de Brucella por bazo se anota como X y se expresa como Y, después de hacer la siguiente transformación: Y = log (X/log X). Se calcula la respuesta de cada grupo de seis ratones como media y desviación estándar.

x)

Las condiciones del experimento son adecuadas cuando: i) la respuesta de los ratones no vacunados (media de Y) es por lo menos 4,5; ii) la respuesta de los ratones vacunados con la vacuna S19 de referencia es menor de 2,5; y iii) la desviación estándar calculada en cada lote de seis ratones es inferior a 0,8.

xi)

Realizar comparaciones estadísticas (se recomienda la prueba de diferencias menos significativas [LSD]) de los valores de inmunogenicidad obtenidos en los ratones vacunados con la cepa S19 que se prueba respecto a los obtenidos en ratones vacunados con la vacuna de referencia y el grupo control no vacunado. La vacuna problema es satisfactoria si el valor de inmunogenicidad obtenido en ratones vacunados es notablemente inferior al obtenido en los controles sin vacunar y si, además, no difiere significativamente del obtenido en ratones vacunados con la vacuna de referencia. (Para una información detallada de este procedimiento, ver la nota 5 a pie de página con la dirección de contacto).

Si esta prueba se realiza con buenos resultados en un lote representativo de vacuna problema, no tiene que repetirse rutinariamente con otros lotes de vacuna preparados del mismo lote de inóculo y utilizando el mismo proceso de producción.

•

Vacuna RB51 No existe prueba de potencia estandarizada para la vacuna con la cepa RB51 de B. abortus y no se realiza rutinariamente. Se ha propuesto una prueba con ratones Balb/c hembras utilizando 1 x 104 microorganismos de la cepa 2308 de B. abortus como cepa de desafío, pero la utilidad de la prueba para predecir la protección en el ganado vacuno es dudosa. En EE.UU. se ha aprobado y utilizado la determinación en placa de microorganismos viables.

d)

Duración de la inmunidad Se considera que la vacunación de terneros con una dosis completa de vacuna S19 confiere inmunidad duradera, y no se recomiendan dosis posteriores. Sin embargo no existe evidencia probada de esto y en áreas endémicas puede ser aconsejable la revacunación. La vacunación de terneros con la cepa RB51 de B. abortus parece estimular una inmunidad que dura un período similar al inducido con la S19, aunque no existen estudios específicos que lo demuestren

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469

Capítulo 2.3.1.  Brucelosis bovina

e)

Estabilidad La vacuna S19 de B. abortus preparada de inóculos de orígenes apropiados muestra características estables siempre que se cumplan los requisitos descritos arriba sobre el control del proceso y de los lotes, y no tiene tendencia a revertir a virulenta. La vacuna liofilizada muestra una pérdida gradual de viables pero debe retener su potencia hasta el período de caducidad recomendado. En función de este fenómeno se establece un cierto margen de seguridad, asegurando que el número de viables antes de la liofilización esté en exceso sobre el mínimo requerido. El mantenimiento de la cadena de frío durante la distribución de la vacuna asegura su viabilidad. La cepa RB51 de B. abortus no muestra tendencia a revertir a microorganismos lisos virulentos después de muchos pases in vivo o in vitro. Esto se debe probablemente a la naturaleza y localización de las mutaciones en esta cepa. La cepa RB51 de B. abortus tiene una disrupción en el gen wboA debida a un elemento IS711 que impide la síntesis de OPS. Datos no publicados indican que también contiene una segunda mutación que afecta al transporte de OPS a la superficie externa bacteriana o al acoplamiento de OPS con el núcleo del LPS, o a ambos procesos.

f)

Conservantes En las vacunas vivas S19 o con la cepa RB51 de B. abortus no deben utilizarse conservantes antimicrobianos. Para la preparación de la vacuna liofilizada se recomienda un estabilizador que contenga 2,5% de hidrolizado de caseína, por ejemplo Triptona (Oxoid), 5% de sacarosa y 1% de glutamato sódico, disuelto en agua y esterilizado por filtración.

g)

Precauciones (riesgos) Aunque son cepas atenuadas, Brucella abortus S19 y RB51 son aún capaces de causar enfermedad en humanos. Los cultivos celulares y las suspensiones deben manejarse bajo condiciones apropiadas de contención para bioseguridad. La reconstitución y el posterior manejo de las vacunas deben hacerse con cuidado para evitar una inyección accidental o la contaminación de los ojos o la piel. Los residuos de vacuna y el equipo de inoculación deben descontaminarse con un desinfectante adecuado (de tipo fenólico, iodóforo o aldehído) a la concentración adecuada. En caso de exposición accidental debe requerirse atención médica. En humanos, no se ha establecido adecuadamente la eficacia del tratamiento antibiótico de las infecciones causadas por S19 y RB51; sin embargo, el CDC suministra recomendaciones para el tratamiento. Si se produce contaminación por S19, se recomienda un tratamiento combinado con doxiciclina y rifampicina. En caso de contaminación con RB51 (que es resistente a rifampicina) debe evitarse el tratamiento con rifampicina.

5.

Pruebas sobre el producto final

a)

Inocuidad Ver Sección C2.4.b.

b)

Potencia Para la vacuna liofilizada, la potencia debe determinarse en el producto final. El procedimiento es como el descrito en la Sección C2.4.c.

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* * *

NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Brucelosis bovina (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar la página Web de la OIE para una lista actualizada: www.oie.int).

474

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Capítulo 2.3.1.  Brucelosis bovina

Cuadro 1. Caracteres diferenciales de especies del género Brucella Lisis por fagosa

104RTD

RTD

RTD

RTD

Oxidase

Actividad ureasa

R/C

RTDc

B. abortus

Iz1

Requiere suero

Especies

Wb

Morfología colonialb

Tb

Hospedador preferido

S

–d

+

+

+

+

–

+e

+f

Vacas y otros bóvidos Biotipo 1: cerdo Biotipo 2: cerdo, liebre

B. suis

S

–

–

+

+g

+g

–

+

+h

Biotipo 3: cerdo Biotipo 4: reno Biotipo 5: roedores salvajes

B. melitensis

S

–

–

–

–i

+

–

+

+j

Ovejas y cabras

B. neotomae

S

–

–k

+

+

+

–

–

+h

Rata lanuda del desiertol

B. ovis

R

+

–

–

–

–

+

–

–

Carneros

B. canis

R

–

–

–

–

–

+

+

+h

Perros

Tomado de las refs 1, 28. a b c d e f g

Fagos: Tbilisi (Tb), Weybridge (Wb), Izatnagar1(Iz1) y R/C Fase normal de presentación : S: lisa, R: rugosa RTD: dilución rutinaria de prueba Brucella abortus biotipo 2 requiere generalmente suero para crecer en aislamiento primario Algunos aislamientos africanos de B. abortus biotipo 3 son negativos Velocidad intermedia, excepto la cepa 544 y algunas cepas de campo que son negativas Algunos aislamientos de B. suis biotipo 2 no son, o solo parcialmente, lisadas por el fago Wb o Iz1

h i j k l

Velocidad rápida Algunos aislamientos se lisan por el fago Wb Velocidad lenta, excepto algunas cepas que son rápidas Placas o calvas pequeñas Neotoma lepida

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

475

Capítulo 2.3.1.  Brucelosis bovina

Cuadro 2. Caracteres diferenciales de los biotipos de especies de Brucella Aglutinación con sueros monospecíficos

Producción de H2S

–

–

+

+

–

2

–

–

+

+

+

–

–

3

–

–

+

+

+

+

–

1

+b

+

–

+

+

–

–

2

+b

+

–

–

+

–

–

3

+b

+

+

+

+

–

–

4

+b

+

–

+c

–

+

–

5

–

–

+

+

–

+

–

6

–

–

+

+

+

–

–

9

+o–

+

+

+

–

+

–

1

–

+

+

–d

+

–

–

2

–

–

+

–

+

–

–

3

–

–

+

+

+

–

–

4

–

–

+

–e

+

+

–

5

–

–

–

–

+

–

B. neotomae

–

–

+

–f

–

+

–

–

B. ovis

–

+

–

+

–e

–

–

+

B. canis

–

–

–

+

–e

–

–

+

B. melitensis

B. abortus

B. suis

básica

Fucsina

Requiere CO2

1

Especies

Tionina

Biotipo

Crecimiento con colorantesa

A

M

R

+

–

Tomado de las refs 1, 28. a b c d e f

476

Concentración del colorante en medio de dextrosa con suero: 20 µg/ml Normalmente positivo en aislamiento primario Algunas cepas se inhiben con colorantes Se han aislado algunas cepas resistentes a la fucsina básica Negativo en la mayoría de las cepas Crecimiento a una concentración de 10 µg/ml de tionina

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

CAPÍTULO 2.3.2.

CAMPILOBACTERIOSIS GENITAL BOVINA

RESUMEN La campilobacteriosis genital bovina es una enfermedad venérea caracterizada por infertilidad, mortalidad embrionaria temprana y aborto. El agente causal de esta enfermedad de transmisión sexual es Campylobacter fetus subespecie venerealis. El reservorio natural de esta bacteria es el prepucio de toros sanos portadores. Campylobacter fetus se divide en dos subespecies: C. fetus subesp. venerealis y C. fetus subesp. fetus. La campilobacteriosis genital bovina está causada por C. fetus subes. venerealis, que es una bacteria con un tropismo pronunciado para el sistema genital del ganado bovino. La transmisión del agente causal se produce normalmente durante el apareamiento natural, pero la presencia de C. fetus subes. venerealis en el semen de toros portadores crónicos origina el riesgo de extender la enfermedad por inseminación artificial. Campylobacter fetus subesp. fetus se puede encontrar en el tracto intestinal del ganado bovino y de otras especies animales. Su papel patógeno es comparativamente menor que el de C. fetus subes. venerealis, aunque se aísla con frecuencia de fetos bovinos abortados, lo que demuestra que esta subespecie tiene importancia clínica en el ganado. Campylobacter fetus subes. fetus persiste en novillas vírgenes después de la infección experimental durante al menos varias semanas y hasta 10 o más meses. La campilobacteriosis genital bovina se diagnostica a partir de muestras obtenidas de toros, vacas o fetos abortados. El diagnóstico se lleva a cabo por demostración del microorganismo causante, o de una respuesta inmune específica contra él. En el caso de los toros, se pueden recoger muestras de semen o de secreciones del esmegma prepucial. En las vacas, las muestras de mucus se obtienen por succión, lavado vaginal o mediante el uso de tampones. Se pueden examinar los órganos internos de los fetos abortados para investigar la presencia de la bacteria mediante cultivo, y analizar preparaciones en fresco del contenido estomacal para observar al microorganismo por microscopía de campo oscuro y de contraste de fases. Identificación del agente: El microorganismo es un bacilo Gram-negativo curvado en forma de espirilo, de aproximadamente 1,5 µm de largo por 0,5 µm de ancho. Se puede cultivar por incubación microerófila a 37°C por un mínimo de 3 días. La confirmación del aislamiento y la diferenciación entre las subespecies de C. fetus se puede llevar a cabo por métodos bioquímicos o moleculares. También se puede utilizar inmunofluorescencia para identificar al microorganismo, pero esta prueba no diferencia entre subespecies. Se han descrito en la literatura pruebas específicas para C. fetus y para cada una de las dos subespecies basadas en la reacción en cadena de la polimerasa. Pruebas serológicas: La aglutinación con mucus vaginal constituyen una prueba útil para poblaciones, aunque no son adecuadas para identificar animales individuales infectados. Los animales deben ser seleccionados cuidadosamente para las pruebas, pues en manadas infectadas se ven algunos animales libres de la infección. Después de la infección, existe una fase adaptativa antes de que se desarrollen los anticuerpos. Además, las aglutininas tienden a desaparecer con el estro. El enzimoinmunoensayo es una prueba más sensible, pero debe utilizarse como prueba poblacional más bien que para probar individuos.

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Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Una vacuna puede prepararse con C. fetus subesp. venerealis o con C. fetus subesp. fetus, que comparte antígenos con C. fetus subesp. venerealis. Esta vacuna se inactiva con formalina y se puede administrar con una emulsión de aceite como adyuvante.

A. INTRODUCCIÓN El género Campylobacter (antes incluido en el género Vibrio) (38) comprende muchas especies, de las que C. fetus, C. sputorum, C. jejuni y C. coli pueden aislarse del ganado bovino. Existen dos subespecies de C. fetus: C. fetus subesp. venerealis y C. fetus subesp. fetus. La que causa la campilobacteriosis genital bovina es C. fetus subesp. venerealis (14, 42). Se han descrito y designado como C. fetus subesp. venerealis biotipo intermedius, algunas variantes de C. fetus subesp. venerealis que toleran la glicina (34). Utilizando los modelos de bandas de las proteínas de células enteras, que aparecen mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), no pueden distinguirse las dos subespecies de C. fetus (39). Mediante diferencias antigénicas, se han descrito varios serotipos de C. fetus (3, 32). Los estudios de homología de ADN no han podido revelar diferencias importantes entre las subespecies venerealis y fetus (18). Sin embargo, mediante análisis numérico de los modelos electroforéticos en gel de campo pulsante (PFGE) ha sido posible la separación de C. fetus en dos subespecies (28). Existe un acuerdo considerable entre los resultados de la PFGE y la identificación basada en métodos fenotípicos o en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El análisis del polimorfismo de los fragmentos de restricción amplificados (AFLP), recientemente desarrollado, también diferencia entre ambas subespecies (43), como lo hace un ensayo de PCR de reciente aparición (21). No obstante, según se describe en el trabajo original, por este método de PCR no se clasifican correctamente en subespecies hasta un 10% de las cepas (21), y esta observación se ha confirmado en un estudio posterior (43). La diferenciación taxonómica de C. fetus en dos subespecies está justificada debido a las diferencias clínicas y epidemiológicas entre ellas. Epidemiológicamente, C. fetus subesp. venerealis es la más importante de las dos debido a su tropismo genital. Campylobacter fetus subesp. fetus se puede recoger del tracto intestinal del ganado bovino y de otros animales. Su papel patogénico es menor comparado con el de C. fetus subesp. venerealis, aunque C. fetus subesp. fetus se aísla con frecuencia de fetos bovinos abortados indicando que esta subespecie tiene relevancia clínica en el ganado. Campylobacter fetus subesp. fetus persiste en novillas vírgenes después de infección experimental durante al menos varias semanas y hasta 10 meses o más (25, 29, 35).

B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO 1.

Aislamiento e identificación del agente (prueba prescrita para el comercio internacional)

La campilobacteriosis genital bovina se diagnostica bacteriológicamente mediante el aislamiento de C. fetus en cultivo o por inmunofluorescencia. El cultivo bacteriológico puede llevarse a cabo directamente a partir de las muestras, o después del transporte y/o enriquecimiento de las muestras. La utilización de un medio de transporte es esencial si las muestras no se procesan en el laboratorio en las 6 horas siguientes a la recogida. Para envíos al laboratorio, si las muestras no están en medio de transporte, deben colocarse en un recipiente con aislamiento (dentro de un margen de temperatura de 4-18°C) y protegidas de la luz.

a)

Toma de muestras i)

En el macho: mucus prepucial o secrecciones, y semen En los toros, el esmegma o mucus prepucial puede obtenerse por raspado (36), por succión (con una pipeta de Bartlett) (2), o por lavados prepuciales (10). También puede tomarse de una vagina artificial después de recoger el semen, lavando la vagina artificial con 20-30 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Para lavados prepuciales, se introducen en el saco prepucial 20-30 ml de PBS estéril de pH 7,2. Después de un masaje vigoroso de 15-20 segundos, el líquido se recoge en un recipiente estéril, que se cierra inmediatamente y se envía al laboratorio. El semen se recoge en condiciones tan asépticas como sea posible. Se transfiere a un tubo que se cierra inmediatamente. Las muestras de esmegma, obtenidas por raspado o succión, y las de semen, pueden diluirse con PBS o inocularse directamente en medio de cultivo, de transporte o de enriquecimiento. Las muestras en medio de transporte se cierran y se envían al laboratorio en un recipiente con aislamiento (dentro de un margen de temperatura de 4-18°C) y protegidas de la luz (13).

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ii)

En la hembra: mucus vaginal y cérvicovaginal Las muestras pueden obtenerse por frotis, succión (con pipeta de Bartlett) o por lavados de la cavidad vaginal. El uso de un espéculo estéril, preferiblemente desechable, es importante para la obtención de muestras de buena calidad (37). Después de lavar la región vulvar, la cavidad vaginal se lava con 20-30 ml de PBS estéril mediante una jeringa unida a un catéter estéril. El líquido se aspira y se reintroduce cuatro o cinco veces antes de recogerlo en un recipiente estéril, que se cierra inmediatamente y se envía al laboratorio. También se puede recoger líquido de lavado de la cavidad vaginal con un tampón de gasa estéril mantenido en la vagina durante 5-10 minutos después de introducir PBS. Las muestras de mucus vaginal obtenidas por succión pueden diluirse con PBS, o sembrarse directamente en medio de cultivo, de transporte o de enriquecimiento.

iii)

Fetos abortados, placentas Cuando se produce un aborto, las mejores muestras son la placenta, el contenido estomacal, los pulmones y el hígado del feto. Se extraen bajo condiciones lo más asépticas posibles y se envían al laboratorio en un contenedor frío y aislado (a 4-8°C).

b)

Transporte de muestras i)

Medios de transporte y de enriquecimiento Se dispone de varios medios de transporte y de enriquecimiento, como el de Clark (Australia), Lander (Inglaterra), medio SBL (Francia) o medios de Foley y de Clark (utilizados en EE.UU.) (16, 20, 24). Recientemente se ha publicado una comparación de otros medios de transporte y de cultivo (26). Algunos de los medios de transporte y enriquecimiento mencionados arriba contienen cicloheximida. Debido a su toxicidad potencial, este agente antifúngico no estará disponible pronto. El aislamiento de C. fetus subesp. fetus es posible en medios con anfotericina B (1).

•

Medio de Clark El medio de Clark es un medio excelente, pero su preparación es larga y difícil, lo que limita su uso rutinario cuando hay que procesar muchas muestras. Contiene suero bovino estéril más 5-fluorouracilo (300 µg/ml), sulfato de polimixina B (100 UI/ml), verde brillante (50µg/ml), ácido nalidíxico (3 µg/ml) y cicloheximida (100 µg/ml). La mezcla se distribuye en botellas de 10 ml con tapón de goma y una tapadera metálica con un hueco central a través del cual se puede insertar una aguja en el tapón. Las botellas llenas se colocan en un baño de agua a 100°C. Cuando el medio se solidifica se atraviesa el tapón de goma con una aguja hipodérmica y se reemplaza el aire interior por una mezcla de 5% de oxígeno, 5% de dióxido de carbono y 90% de nitrógeno. Este paso se realiza dentro de una jarra para anaerobios. El medio preparado debe mantenerse durante 1 semana en un refrigerador antes de usarlo. Su duración es de 3 meses a 4°C. Se inyecta aproximadamente 1 ml de la muestra problema en el medio empleando una jeringa, con la aguja atravesando el tapón de goma. La botella se mantiene aproximadamente a 18°C y se envía al laboratorio. El tiempo de transporte al laboratorio no debe superar las 48 horas. Cuando la botella llega al laboratorio, se incuba 4 días a 37°C y después se introducen 3 ml de solución salina normal. Después de agitar vigorosamente el medio se extrae 1 ml de líquido para pruebas posteriores de aislamiento de Campylobacter en cultivo o por inmunofluoresecencia.

•

Medio de Lander Se trata de caldo de Mueller-Hinton con 5 g de carbón vegetal bacteriológico/litro, añadido antes de la esterilización. Cuando se emplea, se añade a cada litro lo siguiente en condiciones estériles: dos botellas de "suplemento para crecimiento de Campylobacter" (Oxoid), sangre hemolizada de caballo (70 ml), vancomicina (40 mg), sulfato de polimixina B (10.00 UI), cicloheximida (100 mg), trimetoprim (20 mg) y 5-fluorouracilo (500 mg). El medio se distribuye en volúmenes de 10 ml en recipientes de 28 ml. Pueden mantenerse por lo menos durante 2 semanas a 4°C. Este medio se inocula con muestras problema después de pasar éstas por filtros de 0,65 µm de tamaño de poro. Después de incubar a 37°C durante 3 días el medio se distribuye en medios de cultivo y de aislamiento.

•

Medio SBL modificado El medio SBL, modificado por Clark (9), contiene por cada litro: agar (8 g), tioglicolato sódico (0,5 g), glicerofosfato sódico (10 g), 1% de cloruro cálcico acuoso (10 ml), hidrocloridrato de cisteína (250 mg) y solución acuosa de azul de metileno al 0,1% (2 ml). Después de esterilizar en autoclave, el medio se convierte en selectivo por adición, por cada ml, de polimixina (1 UI), novobiocina (5 µg), bacitracina (15 unidades), y cicloheximida (20 µg). El medio se distribuye a continuación en condiciones estériles en tubos anaeróbicos completamente llenos.

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Los frotis de varias muestras se colocan en este medio de transporte y se envían en un recipiente con aislamiento (a 18-30°C) para que lleguen al laboratorio en 24-48 horas.

c)

Tratamiento de muestras Cuando llegan al laboratorio, las muestras deben inocularse directamente en medio de cultivo o procesarse si se requiere (por ejemplo, mediante filtración por membrana para reducir la contaminación). i)

Muestras del tracto genital Como el mucus vaginal puede ser muy viscoso, puede ser necesario licuarlo añadiendo un volumen igual de solución de cisteína (solución acuosa de hidrocloruro de cisteína a 0,25 g/100 ml, pH 7,2, esterilizada por filtración). A los 15-20 minutos, el mucus diluido y licuado puede inocularse en el medio de aislamiento. Si el mucus no es muy viscoso, se puede inocular directamente o diluir con el mismo volumen de PBS, pH 7,2. Los lavados prepuciales pueden centrifugarse a 3.500 g para concentrar la muestra. La muestra final (reducida a 250 µl) puede inocularse en el medio de cultivo (directamente o utilizando el método de filtración).

ii)

Fetos abortados, placentas El contenido del estómago de fetos se inocula directamente en un medio de cultivo adecuado. Los órganos internos, o trozos de órganos, se flamean para esterilizar la superficie, y luego se homogenizan. El homogenado se inocula en medio de cultivo. Después de lavar las membranas placentarias con solución salina estéril o con PBS estéril para eliminar la mayoría de la contaminación superficial, se raspan las vellosidades coriónicas y el raspado se transfiere a los medios de cultivo.

d)

Aislamiento de Campylobacter fetus i)

Medio de cultivo para aislamiento Actualmente hay muchos medios en uso para el diagnóstico bacteriológico de la campilobacteriosis genital bovina (7). La mayor parte de ellos contienen cicloheximida. Debido a su toxicidad potencial, este agente antifúngico no estará disponible pronto. El aislamiento de C. fetus es posible en medios con anfotericina B (1). Los siguientes son ejemplos de medios:

•

Medio Skirrow con cicloheximida Este medio contiene como agentes selectivos: sulfato de polimixina B (2,5 UI/ml), trimetoprim (5 µg /ml), vancomicina (10 µg/ml), y cicloheximida (50 µg/ml). Contiene 5-7% de un lisado de sangre desfibrinada de caballo. Sin embargo, la adición de sangre desfibrinada de oveja al 5-7% da buenos resultados.

•

Medio selectivo de Clark Contiene peptona (10 g), cloruro sódico (5 g), extracto de carne (5 g), agar (15 g) y agua destilada (1000 ml). Disolver los ingredientes en agua, excepto el agar, con agitación si es necesaria. Ajustar el pH a 7,4-7,6, después añadir el agar y calentar a ebullición. Esterilizar en autoclave (121°C durante 15 minutos). Enfriar a 55°C y añadir 10% de sangre estéril desfibrinada de origen ovino o bovino, y después bacitracina (15 UI/ml), sulfato de polimixina B (1 UI/ml), novobiocina (sal sódica) (5 µg/ml) y cicloheximida (10 µg/ml).

•

Medios no selectivos Se puede utilizar cualquier medio basado en sangre (agar Columbia, agar sangre base No. 2) como medio no selectivo suplementado con sangre de oveja o de caballo.

ii)

Inoculación de los medios e incubación Cada muestra se inocula directamente en un medio selectivo o, después de pasar por un filtro de tamaño de poro de 0,65µ, en un medio selectivo y/o en un medio base. El material se extiende con un asa de siembra para facilitar el aislamiento de colonias individualizadas. Las placas se incuban a 37°C + 1°C. Para el crecimiento óptimo, se requieren atmósferas microaeróbicas con 5-10% de oxígeno y 5-10% de dióxido de carbono (y preferiblemente 5-9% de hidrógeno). Las condiciones microaeróbicas de crecimiento se pueden producir por diversos métodos. En algunos laboratorios se utiliza la evacuación repetida de los gases de la jarra de incubación y su sustitución por gases envasados. Los equipos generadores de gases están comercializados. Los incubadores de atmósfera variable son más adecuados si se trata de gran número de cultivos. Las condiciones de cultivo e incubación se controlan sistemáticamente utilizando cepas control de C. fetus subesp. fetus y C. fetus subesp. venerealis. Tales controles deben incluirse en cada serie de

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aislamiento. No es necesario incluir más de un control por día a menos que se utilicen diferentes lotes de medio, en cuyo caso debe probarse cada lote. iii)

Lectura de los resultados Normalmente las colonias de C. fetus aparecen después de 2-5 días en los medios recomendados. El crecimiento puede ser lento, particularmente en presencia de otras bacterias contaminantes en las muestras. Para evitar que el crecimiento de los contaminantes se superponga a colonias específicas, se recomienda examinar diariamente el medio y subcultivar las colonias que se sospechan que corresponden a C. fetus. Después de 3-5 días de incubación, las colonias miden 1-3 mm de diámetro. Son ligeramente grisáceas-rojizas, redondas, convexas, lisas y brillantes, con un borde regular. Los cultivos deben incubarse como mínimo 6 días.

e)

f)

Confirmación del microorganismo i)

Morfología microscópica: Campylobacter fetus es móvil, aunque esta propiedad puede desaparecer después de subcultivos. A menudo Campylobacter fetus presenta la forma de un bacilo curvado fino, de 0,3-0,4 µm de ancho y 0,5-8,0 µm de largo. En estado vivo se pueden observar simultáneamente formas cortas (en forma de coma), medias (en forma de S) y largas (helicoidales con varias espirales). Las bacterias siempre se presentan aisladas. Los cultivos viejos pueden contener formas cocoides.

ii)

Pruebas bioquímicas: Campylobacter fetus es oxidasa y catalasa positivo.

iii)

Campylobacter fetus no crece en condiciones aeróbicas.

Identificación de Campylobacter a nivel de especie Estas pruebas (ver Cuadro 1) deben hacerse con cultivos puros. Idealmente deben realizarse utilizando una suspensión estandarizada, con una turbidez que no sea superior a la No. 1 de McFarland, o equivalente. Cuadro 1. Caracteres diferenciales del género Campylobacter

Oxidasa

Catalasa

H2S(a)

25°C

42°C

Glicina 1%

NaCl 3.5%

Cefaloiina

Ácido nalidíxi-co

C. fetus subesp. venerealis





–



V(b)

–

–

S

V

C. fetus subesp. fetus





–



V(b)



–

S

R

C. jejuni





–

–





–

R

V

C. sputorum biotipo sputorum



–



–





V

S

V

C. sputorum biotipo faecalis







–





V

S

V

C. sputorum biotipo paraureolyticus



–



–





V

S

V

(a) = En medio de triple azúcar-hierro; (b) = Aunque C. fetus no pertenece a las especies termófilas de Campylobacter, se ha descrito el crecimiento de esta especie a 42°C (12, 41); () = reacción o crecimiento positivo; (–) = reacción negativa o ausencia de crecimiento de la cepa en medio apropiado en condiciones especificadas; V = resultados variables; S = sensible; R = resistente.

i)

Prueba de crecimiento en presencia de glicina La prueba se hace sobre cada cepa que parezca ser C. fetus (cepas sospechosas) preparando una suspensión en tampón a pH 7,2. Ésta se inocula en un medio con glicina (15 ml de medio con sangre + exactamente 1,65 ml de una solución acuosa de glicina al 10%), y en medio base con sangre. La incubación se realiza bajo las condiciones atmosféricas especificadas. En paralelo se prueban dos cepas control (de las subespecies venerealis y fetus). Como todas las cepas son "fastidiosas", pequeños cambios en el medio pueden ser importantes y la falta de crecimiento en glicina debe considerarse como una prueba preliminar de que se trata de C. fetus subes. venerealis. La reproducibilidad de la prueba es baja y se han descrito cepas intermedias (34).

ii)

Prueba de crecimiento en presencia de cloruro sódico Se inocula una suspensión en tampón pH 7,2 de la cepa sospechosa a un medio con sangre que contenga 3,5% de NaCl (15 ml de medio con sangre + 2,04 ml de una solución de cloruro sódico 5 M),

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y a un medio base con sangre. La incubación se realiza bajo las condiciones atmosféricas especificadas. En paralelo se prueban dos cepas control. iii)

Prueba de producción de sulfhídrico La prueba de sulfhídrico (H2S) se hace en medio sólido de triple azúcar-hierro (medio TSI) que contiene peptona (20 g/litro), extracto de carne (2,5 g/litro), extracto de levadura (3 g/litro), cloruro sódico (5 g/litro), citrato férrico (0,5 g/litro), tiosulfato sódico (Na2S2O3) (0,5 g/litro), lactosa (10 g/litro), sacarosa (10 g/litro), glucosa (1 g/litro), rojo fenol (0,0024 g/litro), agar (11 g/litro) y agua destilada (hasta 1.000 ml). Este medio se esteriliza en el autoclave a 115°C durante 15 minutos después de distribuir en tubos. Se puede preparar según se necesita o bien se prepara y se mantiene guardado en condiciones normales de almacenamiento durante aproximadamente 3 semanas. Antes de uso, licuar el medio en un baño de agua hirviendo e inclinar los tubos para obtener una pendiente con una profundidad de 3 cm. Este medio puede guardarse bajo condiciones normales durante 8-10 días antes de uso.

iv)

Prueba de sensibilidad a cefalotina y a ácido nalidíxico La sensibilidad a cefalotina (CN) y ácido nalidíxico (NA) se prueba por la técnica del disco (31). Se preparan en el laboratorio discos conteniendo cada uno CN (30 µg) o NA (30 µg) empapando discos de papel de filtro en soluciones de CN (3 mg/ml) y NA (3 mg/ml). Los discos se secan y se guardan hasta uso. Para la prueba, se suspenden cultivos de 72 horas de las cepas problema en PBS pH 7,2, a una concentración de 109 bacterias/ml. Porciones de 100 µl de esta suspensión se colocan como una capa uniforme sobre el medio base de sangre. Las placas de cultivo se secan antes de depositar el cultivo sobre la superficie. A continuación, se colocan encima los discos de sensibilidad, los cultivos se incuban a 37°C en atmósfera apropiada y se examinan después de 48 y 96 horas. Una zona de inhibición alrededor de un disco de al menos 3 mm indica que la cepa problema es sensible a ese antibiótico. Todas las cepas de C. fetus subesp. fetus y la mayoría de las de C. fetus subesp. venerealis son resistentes a NA (27). Todas las cepas de C. fetus son sensibles a CN (27).

g)

Inmunofluorescencia Esta prueba puede aplicarse para identificar el microorganismo por la técnica directa o para confirmar la identificación de una cepa aislada. No diferencia entre diferentes especies (30). i)

Preparación de sueros inmunes Se crecen cepas de Campylobacter, preferiblemente cepas estándar de colecciones de cultivo reconocidas (C. fetus subesp. venerealis o C. fetus subesp. fetus), durante 3 días a 37°C, por separado, en medio de agar sangre y en condiciones microaeróbicas. Los microorganismos se recogen en PBS pH 7,2, y se lavan dos veces por centrifugación. Se inoculan intramuscularmente conejos de 3 meses con 2 ml de una suspensión de 1011 microorganismos/ml de una subespecie de C. fetus en PBS y adyuvante incompleto de Freund. El inóculo se administra en cuatro sitios, con 0,5 ml en cada sitio. Los animales se sangran antes de la inoculación y después a intervalos semanales. Cuando los títulos del suero son elevados por pruebas de inmunofluorescencia o de aglutinación, se inyectan intravenosamente 0,1-1,0 ml con 1010 microorganismos viables/ml. Los conejos se sangran 7 días después y se juntan los sueros heterólogos. En un estudio reciente, se ha descrito un conjugado preparado de IgY de pollo como alternativa a los anticuerpos de conejo (8). Se han descrito anticuerpos monoclonales que pueden utilizarse para la detección inmunodiagnóstica de C. fetus (6).

ii)

Preparación de conjugados La fracción de IgG se separa por precipitación con sulfato sódico. El suero se ajusta a pH 8,0 con PBS 0,1 M y se añaden 18 g de sulfato sódico anhidro por cada 100 ml. El precipitado se recoge por centrifugación y se redisuelve en agua destilada a su volumen original. Se re-precipita añadiendo 12 g de sulfato sódico/100 ml. Se recoge el precipitado, se disuelve en agua destilada a la mitad de su volumen, y se dializa frente a PBS, pH 7,2, a 4°C hasta que esté libre de sulfato. Se determina el contenido en proteína y se ajusta la concentración con PBS a 1,0-1,5 g de proteína por 100 ml (por ejemplo, seroalbúmina bovina). Esta solución se ajusta a pH 9,0 con carbonato sódico 1M. Se añade el isómero 1 de isotiocianato de fluoresceína (FITC) en un volumen mínimo de carbonato sódico 0,1 M a una concentración final de 15 mg FITC/1,0 g de proteína. Esto se agita durante 18 horas a 4°C. La mezcla se ajusta a pH 7,0 con ácido clorhídrico 0,1 M y se dializa frente a PBS a 4°C con frecuentes cambios. Los restos de FITC libre se eliminan por filtración en gel de Sephadex G25, y el producto final se guarda a -20°C o a temperatura inferior en pequeñas alícuotas.

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La dilución de trabajo del conjugado se determina probando varias diluciones en PBS con frotis de un cultivo de C. fetus, y seleccionando el doble de la concentración más baja que produce fluorescencia brillante con estos microorganismos de ensayo. Por microscopía de alta resolución, los microorganismos fluorescentes tienen una morfología típica y frecuentemente se concentran en los bordes del frotis. iii)

Prueba de inmunofluorescencia Las muestras se fijan a portaobjetos de vidrio, se tiñen con el antisuero conjugado con FITC, y se examinan para presencia de microorganismos fluorescentes. La tinción se realiza en una cámara húmeda a 37°C durante 30 minutos. Los portaobjetos se lavan luego hasta eliminación del conjugado libre, se someten a dos lavados con PBS (10 minutos cada lavado), y se montan con glicerol tamponado (80% [v/v] de glicerol: 20% de tampón fosfato 0,1 M, pH 8,0). Los cubreobjetos se sellan para evitar el secado y los portaobjetos se examinan en un microscopio de luz ultravioleta.

h)

Identificación molecular de Campylobacter fetus Se han descrito en la literatura métodos basados en PCR para la identificación específica de C. fetus (21) y de cada una de las subespecies (21, 44).

2.

Pruebas serológicas de detección de anticuerpos

Las pruebas para anticuerpos incluyen la prueba de aglutinación del mucus vaginal y el enzimoinmunoensayo (ELISA).

a)

Prueba de aglutinación del mucus vaginal Esta prueba es útil en manadas, pero no para identificar animales individuales infectados por C. fetus. Solo se identifica alrededor del 50% de los animales infectados. La prueba se realiza mejor con mucus vaginal tomado 37-70 días después de la infección, pero la presencia de anticuerpos puede retrasarse hasta 3-4 meses. Algunas vacas permanecen positivas durante varios años mientras que otras se vuelven negativas en 2 meses. Aproximadamente el 50% de las vacas positivas son negativas a los 6 meses (15). Las muestras tomadas por lavados vaginales se consideran diluidas 1/5 con el lavado salino. Cuando las muestras se obtienen con tampones, el mucus vaginal se extrae con 7 ml de solución salina fisiológica y se deja durante la noche a 4°C. Se presiona el tampón para obtener el líquido y se utiliza como líquido problema en la prueba de aglutinación del mucus vaginal. En la prueba de aglutinación del mucus vaginal, el antígeno es un cultivo de 48 horas de C. fetus subes. venerealis en agar con 7% de sangre fresca (de menos de 2 semanas) de oveja, que contenga preferentemente 0,1% de cicloheximida. Este cultivo se sub-cultiva en 20-30 placas con agar sangre, o bien se pipetea una suspensión de la bacteria en PBS estéril en frascos Roux con agar sangre y se extiende sobre la superficie del medio por agitación suave. Los cultivos se incuban en microaerobiosis durante 2-3 días a 37°C con 85% de nitrógeno, 10% de dióxido de carbono y 5% de oxígeno. Las células se recogen y se suspenden en suspensión salina con 0,5% de formol. Si se utilizan frascos Roux, se emplean 10 ml de solución salina con formol y bolas de vidrio para extraer las células. La suspensión se filtra por una gasa para eliminar restos grandes, se lava tres veces por centrifugación a 6.000 g durante 20 minutos y el lavado final se resuspende en 0,25% de formol salino y se guarda durante 1 semana. Para titular el antígeno, se prepara una serie de diluciones en formol salino. Cada dilución se titula con diluciones dobles de un antisuero bovino adecuado contra C. fetus. Cada tubo debe contener 0,5 ml de suero y 0,5 ml de antígeno. El contenido se mezcla bien antes de incubar a 37°C durante 18 horas. El título del antígeno se determina por la dilución más alta que origina al menos un 50% de aglutinación con la muestra de suero positivo. Las muestras de mucus vaginal se homogenizan con cuatro volúmenes de PBS (o 5% de fenol salino) utilizando bolas de vidrio. Si se ha practicado un lavado vaginal, las muestras son adecuadas. Una vez homogenado, se transfieren 2 ml a un tubo de ensayo colocado en un baño de agua a 57°C. Se colocan en el mismo baño 10 ml aproximadamente de agar Oxoid No.1 fundido (20 g/litro). Cuando el contenido de los dos tubos se ha equilibrado a 57°C, se pipetean 2 ml del agar en el homogenado. La mezcla se agita vigorosamente y se vierte rápidamente en un recipiente con tapón de rosca con una boca de 45 mm de anchura. Cuando la mezcla se ha solidificado, se depositan 2 ml de fenol salino al 5% sobre el agar antes de cerrar el tapón. El recipiente se incuba después durante 18 horas a 37°C para extraer el anticuerpo. El líquido claro se aspira de la superficie del agar y se emplea como muestra de la prueba en un ensayo de aglutinación en tres tubos. El primer tubo se deja vacío, y en los otros se pipetean 0,5 ml de 0,5% de fenol

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salino. Luego se ponen 0,5 ml de la muestra problema en el primer y segundo tubo. Se mezcla el contenido del segundo tubo y se transfiere 0,5 ml al tercer tubo. Se mezcla el contenido del tercer tubo y se eliminan 0,5 ml. A continuación, se añade a cada tubo 0,5 ml de una dilución estandarizada del antígeno y se mezcla bien. Después de incubar a 37°C durante 18 horas, las pruebas se observan con luz oblicua sobre un fondo negro. Cada dilución se valora como sigue: Agua clara 75% claridad 50% claridad 25% claridad No claridad

= = = = =

++++ +++ ++ + -

Se debería realizar al mismo tiempo una titulación de un control positivo utilizando el mismo método que para determinar el título de un antígeno frente a un antisuero positivo conocido. El antígeno se utiliza a la misma dilución estandarizada frente a diluciones del suero positivo. Los resultados se pueden validar si se obtiene el título esperado utilizando las muestras de control positivo. Un resultado positivo es aquel en el que se produce el 50% de aglutinación en el tercer tubo (dilución 1/80), o después si se usan más de tres tubos. La reacción es dudosa si hay menos evidencia de aglutinación. Se considera que la prueba del mucus es útil para el diagnóstico de la campilobacteriosis genital, pero debe resaltarse que la interpretación de los resultados ha de hacerse a nivel poblacional. Para utilizar mejor la prueba es necesario seleccionar con cuidado los animales, ya que incluso en poblaciones con una extensa infección es probable que algunos animales escapen a la infección. Hay un período variable de adaptación entre la infección y el desarrollo de una prueba de aglutinación positiva, y en la fase del estro las aglutininas tienden a desaparecer del mucus parcialmente o por completo, aunque pueden presentarse a altas concentraciones en otras fases del ciclo. En cualquier caso, los títulos de aglutinación tienden a desaparecer con el tiempo.

b)

Enzimoinmunoensayo Se dispone de un ELISA para detectar anticuerpos secretorios IgA específicos de antígeno en el mucus vaginal después de el aborto debido a C. fetus subesp. venerealis (17, 19). Estos anticuerpos son duraderos, y su concentración permanece constante en el mucus vaginal durante varios meses (22). El muestreo inicial puede realizarse después del primer período involucional (normalmente 1 semana después del aborto) cuando el mucus se hace más claro. Se ha descrito recientemente un ELISA para detectar la respuesta sérica humoral de IgG después de la vacunación (33). •

Preparación de antígeno y antigenización

Se crece Campylobacter fetus subesp. venerealis en agar con 7-10% de sangre en condiciones microaeróbicas a 37°C durante 3 días. Las placas se analizan para pureza y se transfieren colonias a 0,5% de formol salino durante 1 hora, se centrifuga a 17.000 g, se lava dos veces con PBS, pH 7,5, y se resuspende a continuación en tampón carbonato 0,05 M, pH 9,6. La absorbancia final se ajusta a 0,21 a 610 nm. Se dejan durante la noche a 4°C placas de poliestireno para microtitulación de fondo plano antigenizadas con 10 µl de antígeno, que se guardan luego a -20°C. Antes de uso, las placas se lavan dos veces con agua destilada y después se elimina la humedad de ellas con cuidado.

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•

Procedimiento de la prueba

i)

Se añade a cada pocillo el mucus vaginal diluido (100µl) y la placa se incuba durante 2 horas a 37°C.

ii)

Se lavan las placas como antes y se añaden 100 µl de IgA anti-bovina de conejo.

iii)

Después de una incubación de 2 horas a 37°C, se lavan las placas y se añaden a cada pocillo 100 µl de IgG anti-conejo de cabra conjugada a peroxidasa de rábano.

iv)

Después de otras 2 horas de incubación a 37°C, se lavan las placas y se añaden 100 µl de substrato (ácido 5 amino-salicílico [0,8 mg/µl], pH 6,0, activado inmediatamente por la adición de 2% de peróxido de hidrógeno [H2O2]).

v)

Las placas se dejan a temperatura ambiente durante 30 minutos y se detiene la reacción añadiendo 50 µl de hidróxido sódico (NaOH) 3 M. La absorbancia se mide en un lector ELISA a 450 nm.

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Capítulo 2.3.2.  Campilobacterioriosis genital bovina

vi)

Interpretación de los resultados: cada muestra se prueba en duplicado, y en cada placa se incluye controles positivos y negativos. Las medidas de absorbancia de las muestras problema se corrigen para las medidas de absorbancia de los controles positivos y negativos según la fórmula siguiente: Absorbancia muestra- Absorbancia control negativo Resultado = ________________________________________________ Absorbancia control positivo - Absorbancia control negativo

‰ 100

La prueba se considera positiva si el resultado es superior a 40. Los animales vacunados no reaccionan al ELISA con IgA ya que su mucus vaginal solo contiene anticuerpos de isotipo IgG.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO Las vacunas con Campylobacter fetus subesp. fetus confieren inmunidad contra C. fetus subesp. venerealis porque ambas cepas comparten antígenos comunes (5). Se reconocen dos grupos de antígenos de C. fetus: los antígenos flagelares "H" que son termolábiles y los antígenos somáticos "O" que son termoestables. Además, está presente un antígeno capsular "K" (23). La vacuna debe incorporar estos antígenos. Se trata de vacunas en emulsión de aceite con una o más cepas que se han inactivado con formaldehído. También se han descrito otras preparaciones de vacunas (11). La adición al producto biológico de una segunda cepa de C. fetus subesp. venerealis es una práctica común. Es importante la presencia de cuatro o cinco inmunógenos proteicos sensibles al calor que son compartidos por muchas cepas de C. fetus subesp. venerealis y C. fetus subesp. fetus. Debe confirmarse la presencia de tales inmunógenos (4). En poblaciones infectadas, todos los animales para reproducción, incluyendo los toros, vacas y terneras, se vacunan después del diagnóstico de campilobacteriosis genital bovina. Al tiempo de la segunda vacunación, se recomienda un tratamiento adicional con antibióticos para toros infectados, ya que la vacuna no siempre es eficaz para acabar con infecciones establecidas. Los toros y novillas del año siguiente se vacunan, y los toros del tercer año en adelante se vacunan anualmente. En poblaciones no infectadas solo se vacunan los toros, una vez al año.

1.

Control de inóculos

a)

Características del inóculo El inóculo consiste en un lote grande y homogéneo de un cultivo de C. fetus subesp. fetus o de C. fetus subesp. venerealis que se ha caracterizado cuidadosamente e identificado en cuanto a pureza, conservado en pequeñas alícuotas.

b)

Método de cultivo El crecimiento inicial del inóculo tiene lugar en medio sólido. Éste consiste en un medio basal al que se añade 0,16% de Bacto agar. El medio basal se compone de 2,8% de caldo de Brucella, 0,5% de extracto de levadura, 1,2% de succinato sódico, y 0.001% de cloruro cálcico. El cultivo inicial se mantiene 3 días a 37°C en una atmósfera de 5% de CO2, 5% de O2 y 90% de N2. El cultivo se pasa a tubos adicionales con medio semisólido y se incuba durante 48 horas. El material resultante se utiliza para producción de vacuna.

c)

Validación como vacuna El inóculo debe estar libre de organismos contaminantes. La pureza del inóculo debe comprobarse por un método de cultivo apropiado. No resulta práctico probar la eficacia en condiciones de laboratorio. Se determina en el campo por observaciones epidemiológicas. La vacuna debe mantenerse a 4°C.

2.

Método de producción

El material de siembra se cultiva en medio líquido formado por medio basal al que se añade 0,025% de tioglicolato sódico. Estos cultivos se incuban durante 24 horas a 37°C con agitación a 80 rpm. Se recogen los líquidos y se añade formaldehído a una concentración final de 0,2%.

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Capítulo 2.3.2.  Campilobacterioriosis genital bovina

La vacuna se mezcla con un adyuvante de emulsión de aceite para alargar el período de inmunidad.

3.

Control del proceso

Se debe comprobar la identidad del microorganismo por cultivo e identificación, así como la ausencia de microorganismos contaminantes.

4.

Control de lotes

a)

Esterilidad Las pruebas para esterilidad y ausencia de contaminación del material biológico se pueden encontrar en el capítulo I.1.5.

b)

Inocuidad El proceso de inactivación debe ser completo. Esto se comprueba inoculando el equivalente de una dosis en el mismo medio y bajo las mismas condiciones que las utilizadas en el proceso de producción. Este cultivo se incuba 72 horas en las mismas condiciones, después de las cuales no debe haber evidencia de crecimiento bacteriano. El producto final debe estar libre de contaminantes bacterianos y fúngicos viables, utilizando métodos adecuados de cultivo. Se inoculan dos cobayas con 2 ml del producto, intramuscular o subcutáneamente. No debe haber una reacción adversa atribuible a la vacuna durante un período de observación de 7 días después de la inoculación.

c)

Potencia La potencia de la vacuna puede medirse por seroconversión en conejos. Se miden sus títulos séricos mediante inmunofluorescencia o por la prueba de aglutinación en tubo. Se vacunan subcutáneamente, con la mitad de la dosis utilizada en el ganado bovino, cinco conejos que sean serológicamente negativos a una dilución 1/100 del suero, en dos ocasiones separadas por 14 días. Como mínimo, el suero de cuatro de los cinco ratones, recogido 14 días después de la segunda vacunación, debe mostrar un incremento en el título de al menos cuatro veces.

5.

Pruebas sobre el producto final

a)

Inocuidad Ver Sección C.4.b.

b)

Potencia Ver Sección C.4.c.

•

Agradecimiento

Partes de este capítulo derivan del capítulo sobre campilobacteriosis genital bovina de ediciones previas de este Material o están basados en él.

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CAPÍTULO 2.3.3.

TUBERCULOSIS BOVINA

RESUMEN La tuberculosis bovina es una enfermedad bacteriana crónica, de animales y del hombre, causada por Mycobacterium bovis. En muchos países la tuberculosis bovina es una enfermedad infecciosa importante en el ganado vacuno, en otros animales domésticos y en algunas poblaciones de animales salvajes. La transmisión al hombre representa un problema de salud pública. Se considera que la ruta más frecuente de infección del ganado es la exposición a aerosoles de M. bovis, aunque también se produce la infección por ingestión de material contaminado. Tras la infección, se pueden desarrollar granulomas nodulares no vascularizados conocidos como tubérculos. Las lesiones características de la tuberculosis se presentan con más frecuencia en los pulmones y en los nódulos linfáticos retrofaríngeos, bronquiales y del mediastino. También se pueden encontrar lesiones en los ganglios linfáticos mesentéricos, en el hígado, en el bazo, sobre las membranas serosas, y en otros órganos. La infección del ganado bovino con tuberculosis bovina se diagnostica por lo general en el animal vivo mediante reacciones de hipersensibilidad retardada. Habitualmente, la infección es subclínica; cuando se presenta, los síntomas clínicos no son específicamente distintivos de esta enfermedad y pueden incluir debilidad, anorexia, extenuación, disnea, inflamación de los ganglios linfáticos y tos, particularmente en casos de tuberculosis avanzada. Tras la muerte, se diagnostica mediante examen post-mortem y por técnicas histopatológicas y bacteriológicas. También se pueden utilizar técnicas con sondas de ADN y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Éstas son técnicas exigentes y sólo se deben utilizar procedimientos validados. El cultivo bacteriano tradicional continúa siendo el método rutinario de confirmación de la infección. Identificación del agente: Los exámenes bacteriológicos pueden comprender la demostración por examen microscópico de bacilos ácido-alcohol resistentes (constituye una confirmación preliminar), y el aislamiento de micobacterias en medios de cultivo selectivos y su posterior identificación por pruebas bioquímicas y de cultivo o con sondas de ADN o técnicas de PCR. La inoculación en animales es ligeramente más sensible que el cultivo, pero solo se debería utilizar cuando las lesiones histopatológicas sean compatibles con la infección por micobacterias y resulte negativo el aislamiento en cultivo. Prueba de hipersensibilidad retardada: Esta prueba es el método estándar para la detección de la tuberculosis bovina. Supone medir el grosor de la piel, la inyección intradérmica de la tuberculina bovina en el área medida, y la determinación de cualquier inflamación en el sitio de la inyección 3 días más tarde. La prueba comparativa de la tuberculina intradérmica, con tuberculina bovina y aviar, se utiliza para diferenciar entre animales infectados con M. bovis y los sensibilizados a la tuberculina por exposición a otras micobacterias o géneros relacionados. La elección de cuál de las dos pruebas debe utilizarse depende de la prevalencia de la infección de tuberculosis y del nivel de exposición ambiental a otros microorganismos sensibilizadores. Debido a su mayor especificidad y más fácil estandarización, los derivados proteicos purificados (PPD) han reemplazado a las tuberculinas obtenidas a partir de los medios sintéticos concentradas por calor. La dosis recomendada de PPD bovina en el ganado es de al menos 2000 unidades internacionales (UI) y en la prueba comparativa de la tuberculina la dosis no debe de ser menor de 2000 UI. Las reacciones se interpretan con arreglo a esquemas apropiados.

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Capítulo 2.3.3. Tuberculosis bovina

Pruebas de laboratorio con sangre: Existen nuevas pruebas de diagnóstico con sangre, por ejemplo la prueba de proliferación de linfocitos, la del interferón gamma y el enzimoinmunoensayo. La logística y la realización de estas pruebas en el laboratorio puede ser un factor limitante. Se necesitan más estudios comparativos de estas pruebas nuevas y ensayos dérmicos en diferentes condiciones de campo. El uso de pruebas basadas en sangre presenta ventajas, en especial con ganado arisco, con animales del zoo o de tipo salvaje, aunque la interpretación de estas pruebas está limitada por la falta de datos en algunas especies. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Se están desarrollando y probando vacunas, pero en la actualidad no se administran de modo rutinario. Existen métodos estándar para la producción de tuberculinas PPD bovinas. Las PPD utilizadas para realizar las pruebas especificadas deben prepararse de acuerdo con los requisitos de la Organización Mundial de la Salud y cumplir con ellos respecto al origen de los materiales, métodos de producción y precauciones, substancias añadidas, ausencia de contaminación, identidad, seguridad, potencia, especificidad y ausencia de efectos sensibilizantes. Los bioensayos para actividad biológica son especialmente importantes, y la potencia se debe expresar en Unidades Internacionales.

A. INTRODUCCIÓN Mycobacterium bovis es un microorganismo zoonósico y, durante el examen de diagnóstico, debe ser tratado como un microorganismo del grupo III de riesgo/peligro, con las debidas precauciones, para evitar que se produzca infección en humanos. La tuberculosis bovina es una enfermedad infecciosa causada por M. bovis, y se caracteriza normalmente por la formación de granulomas nodulares conocidos como tubérculos. Aunque se suele definir como una enfermedad crónica debilitante, la tuberculosis bovina puede presentar en ocasiones un curso agudo, rápido y progresivo. Cualquier tejido del cuerpo puede resultar afectado, pero las lesiones se observan con más frecuencia en los ganglios linfáticos (sobre todo de la cabeza y tórax), pulmones, intestinos, hígado, bazo, pleura y peritoneo. En países con programas de erradicación de la tuberculosis, raramente se observa evidencia clínica de tuberculosis en el ganado, porque la prueba intradérmica de la tuberculina posibilita el diagnóstico y la eliminación de los animales infectados antes de que aparezcan los síntomas. Sin embargo, antes de las campañas nacionales de erradicación de la tuberculosis, se observaban con frecuencia los síntomas asociados con la tuberculosis (6). Estos síntomas varían según la distribución de los tubérculos en el cuerpo pero, con pocas excepciones, el curso de la enfermedad es crónico. En muchos casos faltan síntomas característicos, incluso en fases avanzadas de la enfermedad cuando están afectados muchos órganos. La implicación de los pulmones puede originar tos, que se puede inducir por cambios de temperatura o por presión manual sobre la tráquea. La disnea y otros síntomas de neumonía de grado bajo también evidencian la disfunción pulmonar. En casos avanzados, los ganglios linfáticos a menudo están muy dilatados y pueden obstruir las vías respiratorias, el tracto alimentario los vasos sanguíneos. Los ganglios linfáticos de la cabeza y del cuello pueden llegar a estar afectados a simple vista y a veces se rompen y drenan. La implicación del tracto digestivo se manifiesta por la presencia de diarreas intermitentes y, en algunos casos, por estreñimiento. En las fases terminales de la tuberculosis puede presentarse una extenuación extrema y dolor respiratorio agudo. Pueden observarse lesiones en el tracto genital femenino. Los genitales masculinos raramente están implicados. En las necropsias, los tubérculos se ven con más frecuencia en los ganglios linfáticos bronquiales, mediastínicos, craneales y portales, que pueden ser el único tejido infectado. Además se suelen ver afectados los pulmones, el hígado, el bazo y las superficies de las cavidades del cuerpo. Otros lugares anatómicos se pueden considerar como potencialmente infectables. En las necropsias, un granuloma tuberculoso suele presentar un aspecto amarillento y consistencia caseosa, caseo-calcárea o calcificada. Ocasionalmente pueden ser purulentos. Existen algunos granulomas no tuberculosos en los que el contenido purulento verdoso está reemplazado por tejido granuloso, que pueden tener similitud con los granulomas tuberculosos. Normalmente, el centro caseoso es seco, firme, y está cubierto con una cápsula fibrosa conjuntiva de grosor variable. Los tejidos fijados de un tubérculo no se extraen intactos con facilidad, como ocurre con algunos granulomas no tuberculosos. El tamaño de las lesiones varía, desde tan pequeñas que pueden pasar desapercibidas a simple vista, hasta ocupar gran parte de un órgano. El corte seriado de órganos y tejidos resulta vital para detectar las lesiones contenidas en un tejido.

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Capítulo 2.3.3. Tuberculosis bovina

En la mayor parte de los países donde se han caracterizado las micobacterias aisladas de humanos, se ha identificado a Mycobacterium bovis en el hombre. La frecuencia de la tuberculosis pulmonar causada por M. bovis es mayor en trabajadores de granjas y mataderos que en habitantes de zonas urbanas. La transmisión de M. bovis al hombre por la leche o sus productos se elimina mediante la pasteurización de la leche. Uno de los resultados de los programas de erradicación de la tuberculosis bovina ha sido un descenso en los casos de enfermedad y de muerte causados por la tuberculosis bovina en la población humana. Aunque se considera que el ganado vacuno es el verdadero hospedador de M. bovis, se ha descrito la enfermedad en muchos animales domésticos y no domésticos. El microorganismo se ha aislado de búfalos, bisontes, ovejas, cabras, équidos, camellos, palomas, cerdos, jabalíes, ciervos, antílopes, perros, gatos, zorras, visones, tejones, hurones, ratas, primates, llamas, kudus, elands, tapires, alces, elefantes, sitatungas, orixes, addaxes, rinocerontes, opossums, ardillas, nutrias, focas, liebres, topos, mapaches, coyotes y varios depredadores felinos como leones, tigres, leopardos y linces (7, 21). La tuberculosis bovina en animales salvajes se describió por primera vez en 1929 en Sudáfrica en el kudu (Tragelaphus strepsiceros) y en el duiker (Sylvicapra grimmi). Durante los 1940s se encontró que el kudu en la misma región estaba infectado endémicamente. En Uganda se detectó en 1982 una prevalencia del 10% en el búfalo africano y del 9% en el cerdo verrucoso (Phacochoerus aethiopicus). En Zambia se ha descrito infección por M. bovis del kafue lechue (Kobus leche kafuensis) y de un eland (Traurotragus oryx). En Kenia se ha descrito un brote de tuberculosis en los babuinos verdosos salvajes (Papio cycocephalus anubis). También se ha diagnosticado una infección por Mycobacterium bovis en el búfalo africano del Parque Nacional Kruger de Sudáfrica (3) y, más recientemente, se ha encontrado distribuida por otras especies como el babuino chacma (Papio ursinus), el león (Panthera leo) y el guepardo (Acynonyx jubatus), así como el kudu. La rigurosa aplicación de la prueba de la tuberculina y la selección del ganado reaccionante ha eliminado de muchos países la infección por M. bovis de la población bovina estabulada, pero esta estrategia no ha tenido un éxito general. Amplias investigaciones sobre la recurrencia esporádica de M. bovis han mostrado que existen reservorios en los animales salvajes de algunos países. La detección de la infección en una población salvaje requiere investigación bacteriológica o el uso de una prueba válida para la especie en cuestión (la prueba de la tuberculina no es eficaz en todas las especies) junto con un análisis epidemiológico de la información. El tejón (Meles) en el Reino Unido (31) y en la República de Irlanda (27), el opossum de cola de brocha (Trichosurus vulpecula) en Nueva Zelanda (2) y varias especies salvajes en África, son capaces de mantener la infección de M. bovis . El control de la transmisión de la población salvaje a las especies de las granjas es complejo y, hasta la fecha, se ha basado en la erradicación de las especies salvajes. Se espera más investigación sobre el uso de la vacunación, para controlar la enfermedad en algunas especies. Se ha aislado Mycobacterium bovis de cérvidos en granjas y en vida libre. La enfermedad puede ser subaguda o crónica, con una velocidad de progresión variable. Unos cuantos animales pueden afectarse gravemente en pocos meses, mientras que otros pueden tardar años en mostrar síntomas clínicos relacionados con las lesiones. Las lesiones que se producen pueden parecerse a las del ganado vacuno (granuloma proliferativo, caseificación, granulación y calcificación con la edad) y pueden tomar la forma de abcesos de paredes finas con escasa calcificación y que contienen material purulento. En los cérvidos, cuando se observan lesiones con abscesos de etiología desconocida se debe considerar la posibilidad de tuberculosis. Los ganglios linfáticos afectados son, por lo general, los de la cabeza y el pecho. Pueden estar afectados los ganglios linfáticos mesentéricos y encontrarse grandes abscesos en este lugar. La distribución de las lesiones depende de la dosis infectiva, de la ruta de infección y del período de incubación antes del examen. La prueba de la tuberculina se puede utilizar en granjas con ciervos. La prueba debe realizarse con mucho cuidado, con corte de pelo en el sitio de la prueba, inyección intradérmica precisa, y medida exacta de la anchura de la piel pre- y post-inoculación, utilizando calibradores para obtener resultados que sean válidos (5). Mycobacterium bovis puede originar graves pérdidas económicas por sus efectos sobre el ganado doméstico y las infecciones zoonóticas. Además, la presencia de la infección en las poblaciones salvajes supone un reto para la supervivencia de especies salvajes en peligro.

B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO 1.

Identificación del agente

En el ganado vacuno no hay evidencia clínica de la tuberculosis hasta que se han desarrollado lesiones muy extensas. Por esta razón, no fueron posibles ni su diagnóstico en animales individuales ni un programa de erradicación antes del desarrollo de la tuberculina por Koch en 1890. La tuberculina, que representa un medio de detectar la enfermedad, es un concentrado estéril de filtrados de cultivo del bacilo tuberculoso cultivados en caldo de carne con glicerina y, más recientemente, en medios sintéticos.

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Capítulo 2.3.3. Tuberculosis bovina

Se están estudiando las respuestas inmunológicas a las infecciones del ganado por M. bovis para desarrollar métodos de diagnóstico mejorados o alternativos, ya que, a veces, las pruebas cutáneas presentan inconvenientes prácticos. Sin embargo, no existe una prueba sanguínea para la tuberculosis en el ganado u otros animales que sea de aceptación universal. La presencia de M. bovis en las muestras clínicas y en las obtenidas post-mortem puede demostrarse mediante el examen de frotis teñidos, y tal presencia puede confirmarse cultivando el microorganismo en un medio para el aislamiento primario. Los recipientes de las muestras deben estar limpios y con preferencia estériles (el uso de recipientes contaminados con micobacterias ambientales puede ocasionar errores en la identificación de la infección por M. bovis debido al rápido crecimiento de las micobacterias ambientales); cuando es posible, pueden usarse recipientes de plástico de un solo uso de 50 ml de capacidad para una gran variedad de tipos de muestras. Las muestras para enviar al laboratorio deben protegerse y cerrarse para evitar pérdidas, y embalarse adecuadamente para resistir roturas o aplastamientos durante el tránsito. Para el envío de muestras sospechosas de una enfermedad zoonótica deben seguirse las Regulaciones para Productos Peligrosos (DGR) de la Asociación Internacional de Transporte Aéreo (IATA). Los requisitos se resumen en el Capítulo I.1.1. Métodos de muestreo. La entrega rápida de las muestras al laboratorio aumenta las posibilidades de recuperar M. bovis en cultivo, pero si se prevén retrasos las muestran se deben refrigerar o congelar para retrasar en crecimiento de contaminantes y conservar las micobacterias. En condiciones de ambientes cálidos, cuando no es posible la refrigeración, se puede añadir como agente bacteriostático ácido bórico (concentración final de 0,5% [p/v]), pero solo por períodos limitados, inferiores a 1 semana. Deben tomarse precauciones para evitar la infección de personal del laboratorio (ver Capítulo I.1.6. Seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiología). Todos los procedimientos que supongan cultivos deben realizarse en una cabina de seguridad biológica.

a)

Examen microscópico Mycobacterium bovis se puede demostrar microscópicamente en frotis directos de muestras clínicas y en materiales tisulares preparados. La resistencia al ácido de M. bovis se suele demostrar con la tinción clásica de Ziehl-Neelsen, aunque también puede utilizarse una tinción fluorescente de resistencia al ácido. También pueden dar resultados satisfactorios las técnicas con inmunoperoxidasa. El diagnóstico preliminar de micobacteriosis se puede hacer si el tejido muestra lesiones histológicas características (necrosis caseosa, mineralización, células epitelioides, células gigantes multinucleadas y macrófagos). La presencia en secciones histológicas de microorganismos ácido-resistentes puede no detectarse aunque M. bovis se pueda aislar del cultivo.

b)

Cultivo de Mycobacterium bovis Al procesar las muestras para cultivo, primero se homogeniza el tejido utilizando un mortero, homogenizador o batidora y después se descontamina con un ácido o un álcali, como 5% de ácido oxálico o 2-4% de hidróxido sódico. La muestra se agita 10 minutos a temperatura ambiente y, a continuación, se neutraliza. Se centrifuga la suspensión, se elimina el sobrenadante, y se utiliza el sedimento para cultivo y para examen microscópico. Para el aislamiento primario, el sedimento se inocula por lo general en varios medios sólidos con huevo como el de Lowestein-Jensen, el medio base de Coletsos o el medio de Stonebrinks; estos medios deben contener piruvato o glicerol, o ambos. También se debería utilizar un medio con agar como el de Middlebrook 7H10 ó 7H11. Los cultivos se incuban durante 8 semanas a 37°C con y sin CO2. Se deben utilizar los medios en tubos con cierre hermético, para evitar la desecación. Los cultivos se examinan a intervalos durante el período de incubación para observar el posible crecimiento macroscópico. Cuando el crecimiento es visible, se preparan frotis y se tiñen por la técnica de Ziehl-Neelsen. Generalmente, el crecimiento de M. bovis se aprecia a las 3-6 semanas de incubación. Mycobacterium bovis crece en medio de Lowenstein-Jensen sin piruvato, y crece peor cuando se añade glicerol. Los modelos característicos de crecimiento y de morfología de las colonias pueden suministrar un diagnóstico preliminar de M. bovis , que puede confirmarse por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y por técnicas de tipado molecular como el tipado por el estudio de polimorfismos de la región de repeticiones directas. Los modelos característicos de crecimiento y de morfología de las colonias pueden suministrar un diagnóstico preliminar de M. bovis; sin embargo, cada aislamiento necesita confirmarse por evaluación bioquímica (niacina y nitrato) o con la sonda de ADN Gen Probe TB complex para confirmar que el aislado pertenece al complejo tuberculosis. Si se produce una contaminación fuerte del medio de cultivo, o la muestra presenta un resultado de cultivo negativo y un resultado macroscópico e histopatológico positivo, el proceso para el cultivo debe repetirse

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Capítulo 2.3.3. Tuberculosis bovina

utilizando el inóculo con descontaminación adicional. A menudo, el factor limitante para el aislamiento es la baja calidad de las muestras y deben hacerse esfuerzos para asegurar que el laboratorio reciba muestras de buena calidad. El crecimiento que se considera debido a micobacterias se subcultiva en un medio con huevo o con agar o en caldo con Tween y albúmina, y se incuba hasta la aparición de un crecimiento visible. En algunos laboratorios se utiliza bilis de buey antes de la inoculación para facilitar la dispersión de la masa microbiana en pequeñas unidades viables. La identificación de los aislamientos se realiza normalmente determinando propiedades bioquímicas y de cultivo. En un medio sólido adecuado con piruvato, las colonias de M. bovis son lisas y de color pardusco. El microorganismo crece lentamente a 37°C, pero no crece a 22°C ni a 45°C. Mycobacterium bovis es sensible a la hidrazida del tiofen-2-ácido carboxílico (TCH) y a la hidrazida del ácido isonicotínico (INH). Esto se puede probar mediante crecimiento en medio sólido Middlebrook 7H10/7H11 con agar o en medios que contengan huevo. El medio con huevo debe prepararse sin piruvato porque inhibe al INH y podría tener un efecto similar sobre el TCH (que es un análogo del INH) y dar por tanto resultados positivos falsos (resistentes). Las cepas de Mycobacterium bovis son también sensibles al ácido para-amino salicílico y a la estreptomicina. Las concentraciones efectivas de estos compuestos son diferentes en medios con huevo y en medios con agar. La producción de niacina y la reducción de nitrato dan resultados negativos en M. bovis . En la prueba de la amidasa, M. bovis es positivo para ureasa y negativo para nicotaminidasa y pirazinaminidasa. Es una bacteria microerófila y no cromogénica. Se pueden emplear pruebas adicionales para la identificación. Varias técnicas de análisis de ADN representan un método rápido para determinar la identidad de los aislados y también pueden dar información molecular de valor epidemiológico. Es necesario distinguir M. bovis de otros miembros del "complejo tuberculosis", es decir, M. tuberculosis (la principal causa de tuberculosis en humanos), M. africanum (que ocupa una posición fenotípica intermedia entre M. tuberculosis y M. bovis ), y M. microti (el "bacilo de ratón", un micro-organismo difícil de encontrar). Las pruebas mencionadas arriba sirven para separar M. bovis de las otras especies. A veces se puede aislar M. avium de lesiones del ganado bovino similares a las de la tuberculosis. En tales casos se necesita una cuidadosa identificación y se debería excluir la posibilidad de una infección mixta con M. bovis . Mycobacterium tuberculosis puede sensibilizar al ganado para la tuberculina bovina sin causar lesiones tuberculosas. En algunos hospitales y laboratorios veterinarios se utilizan rutinariamente sistemas de cultivos líquidos como Bactec. El crecimiento se determina por métodos radiométricos o fluorométricos. Los fabricantes (BDsistemas diagnósticos) no recomiendan el sistema radiométrico.

c)

Métodos de reconocimiento de ácido nucleico La PCR se ha evaluado ampliamente para la detección del complejo de M. tuberculosis en muestras clínicas de pacientes humanos (fundamentalmente esputos) y recientemente se ha utilizado para el diagnóstico de la tuberculosis en animales. Para la detección del complejo de M. tuberculosis en tejidos frescos y fijados se han evaluado varios preparados disponibles comercialmente y diversos procedimientos "caseros". Se han utilizado varios cebadores, incluyendo los que amplifican secuencias del ARNr 16S-23S, de las secuencias de inserción IS6110 e IS1081, y de los genes que codifican las proteínas específicas del complejo de M. tuberculosis, como la MPB 70 y el antígeno b de 38 kDa. Se han analizado los productos amplificados por hibridación con sondas o por electroforesis en gel. Las preparaciones comerciales y los procedimientos caseros han mostrado resultados variables y poco satisfactorios en comparaciones entre laboratorios con tejidos frescos, congelados o conservados en ácido bórico (25). La fiabilidad de esta prueba se ha reducido por los resultados falsos positivos y negativos, sobre todo en muestras con un número bajo de bacilos. Se ha atribuido la variabilidad de los resultados a un bajo número de copias de la secuencia amplificada junto al bajo número de bacilos. También se cree que es debida a los métodos de descontaminación, a los procedimientos de extracción del ADN, a las técnicas para eliminar los inhibidores de la polimerasa, a controles internos y externos, y a los procedimientos seguidos para evitar contaminaciones cruzadas. La mejora en la fiabilidad de la PCR como prueba práctica de detección del complejo de M. tuberculosis necesita el desarrollo de procedimientos sólidos y estandarizados. La PCR no se utiliza sólo para la detección directa en la muestra o para la caracterización de la muestra o la diferenciación dentro del complejo TB, sino también como método de identificación inicial (la selección del microorganismo se lleva a cabo por morfología de la colonia y tinción AF). Existen preparaciones comerciales disponibles que son muy consistentes por ejemplo las del tipo Gen probe. Aunque el número de especies que se pueden identificar con estas preparaciones es limitado, sus cebadores para el complejo de M. tuberculosis se utilizan mucho tanto en el campo médico como en el veterinario. Los laboratorios también han desarrollado sus propios métodos "caseros". El mayor problema de este tipo de aplicaciones

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Capítulo 2.3.3. Tuberculosis bovina

es la contaminación cruzada, por lo que se deben utilizar controles adecuados en cada amplificación. Este tipo de aplicación ha sido ignorada. Normalmente se llevan a cabo algunas pruebas bioquímicas para confirmar el hallazgo. No obstante, la PCR se utiliza hoy en día de modo rutinario para detectar el grupo M. tuberculosis y distinguirlo de M. avium en tejidos fijados con formalina e incluidos en parafina (23, 24). Los mejores resultados se obtienen cuando se emplean tanto la PCR como los métodos de aislamiento. Para diferenciar M. bovis de otros miembros del complejo de M. tuberculosis, las técnicas de análisis de ADN pueden ser más rápidas y fiables que los métodos bioquímicos. Se ha encontrado una mutación específica de M. bovis en el nucleótido en posición 285 del gen OxyR en todos los aislamientos del complejo de M. tuberculosis analizados hasta la fecha (10). Tiene importancia práctica el que la sonda específica para hibridar con el gen, que se necesita para visualizar el segmento amplificado, se pueda marcar con biotina o digoxigenina en vez de con isótopos. La determinación de las huellas genéticas permite a los laboratorios distinguir entre cepas diferentes de M. bovis y harán posible establecer el origen, la transmisión y la distribución del M. bovis descrito. El método más utilizado es el del estudio de polimorfismos de la región de repeticiones directas (espoligotipado, del inglés "spacer oligotyping"), que diferencia cepas dentro de cada especie perteneciente al complejo de M. tuberculosis, que incluye M. bovis , y que puede distinguir también M. bovis de M. tuberculosis (19). Se estan desarrollando otras técnicas nuevas para diferenciar más exactamente las cepas que tienen el mismo espoligotipado. Éstas incluyen el análisis del polimorfismo de los fragmentos de restricción (RFLP) usando IS6110, la región de repetición directa (DR) y la sonda PGRS (secuencia de repetición poliG) (30), la RFLP utilizando una combinación de la DR y sondas de color (26), y la caracterización del perfil VNTR (repeticiones en tándem en número variable) (8, 9, 13, 20). En la actualidad se está secuenciando el genoma de M. bovis , y esta información permitirá la mejora de los métodos basados en las huellas genéticas.

2.

Prueba de hipersensibilidad retardada

•

Prueba de la tuberculina (prueba prescrita para el comercio internacional) Antes se utilizaba tuberculina de medio sintético concentrada por calor (HCSM), pero en la mayoría de los países la tuberculina HCSM se ha reemplazado por tuberculina derivada de proteínas purificadas (PPD). La tuberculina HCSM puede tener una buena potencia si se estandariza de modo correcto en cuanto a actividad biológica, pero su especificidad es inferior a las tuberculinas PPD. Además, se ha visto que las PPDs bovinas preparadas de la cepa AN5 de producción de M. bovis son más específicas para detectar la tuberculosis bovina que las PPDs humanas preparadas con M. tuberculosis. El método estándar para la detección de la tuberculosis bovina es la prueba de la tuberculina, que comprende la inyección intradérmica de tuberculina PPD bovina y la consiguiente detección de hinchazón (hipersensibilidad retardada) en el sitio de la inoculación 3 días después. Esto se puede llevar a cabo utilizando sólo tuberculina bovina o, en una prueba comparativa, con tuberculina aviar y bovina. Normalmente, la prueba de la tuberculina se realiza en el medio del cuello, pero también se puede realizar en el pliegue caudal de la cola. La piel del cuello es más sensible a la tuberculina que la de la cola. Para compensar esta diferencia, se pueden utilizar mayores dosis de tuberculina en la cola. No se recomienda utilizar esta prueba cuando la epidemiología sugiere que la población o el animal han estado en contacto con animales infectados, pues puede originar respuestas negativas falsas y un descenso en la sensibilidad de la prueba. Si sólo se utiliza una prueba de tuberculina, la erradicación completa resulta difícil ya que puede haber respuestas falsas negativas en la fase inicial de la enfermedad y en animales con infección grave. La prueba intradérmica comparativa de la tuberculina se utiliza para diferenciar entre animales infectados con M. bovis y aquellos sensibilizados a la tuberculina bovina por exposición a otras micobacterias. Esta sensibilización se debe a la gran reactividad cruzada existente entre especies de micobacterias y géneros relacionados. La prueba consta de la inyección intradérmica de tuberculina bovina y de tuberculina aviar en sitios diferentes, por lo general, en el mismo lado del cuello, y la medida de la respuesta 3 días después. La potencia de las tuberculinas debe estimarse por métodos biológicos mediante comparación con tuberculinas estándar y debe expresarse en unidades internacionales (UI). En varios países se considera que la tuberculina tiene una potencia adecuada si garantiza al menos 2000 UI (+ 25%) por dosis en el ganado bovino. En los animales con una sensibilidad alérgica reducida se necesita una dosis mayor de tuberculina, y en campañas nacionales de erradicación se recomiendan dosis de hasta 5.000 UI. El volumen de cada inyección no debe superar los 0,2 ml.

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3.

•

Procedimiento de la prueba

i)

Es importante una técnica de inyección correcta. Deben afeitarse y limpiarse los sitios de inyección. Dentro de cada área afeitada se mide un pliegue de la piel con calibradores y se marca el sitio antes de la inyección. Se inserta oblicuamente en las capas más profundas de la piel una aguja corta con el bisel hacia fuera y una jeringuilla graduada cargada con tuberculina. Se inyecta la dosis de tuberculina, que no debe contener menos de 2.000 UI de tuberculina bovina o aviar. Una inyección correcta se confirma palpando una pequeña hinchazón como un guisante en el lugar de la inyección. La distancia entre dos inyecciones debe ser aproximadamente de 12-15 cm. En animales jóvenes donde no hay espacio para separar suficientemente los sitios en un lado del cuello, se debe hacer una inyección a cada lado en zonas idénticas del centro del tercio medio del cuello. Setenta y dos horas después se mide el grosor de la piel doblada en cada sitio de inyección. La medida de la piel, antes de la inyección y cuando se lee la prueba, debería efectuarse por la misma persona.

ii)

La interpretación se basa en la observación y en los incrementos en el grosor de la piel anotados. En la prueba intradérmica simple (que implica una sola inyección de tuberculina bovina), se considera que la prueba es negativa si sólo se observa una inflamación limitada, con un incremento menor de 2 mm y sin síntomas clínicos, del tipo de edema difuso o extendido, exudado, necrosis, dolor o inflamación de los vasos linfáticos de esa región o de los ganglios linfáticos. La reacción no es concluyente si no se observa ninguno de estos síntomas y, si el incremento en el pliegue de la piel oscila entre 2 y 4 mm. La reacción es positiva si se observan los síntomas clínicos descritos arriba o si hay un aumento de 4 mm o más en el grosor de la piel. Sin embargo, en poblaciones infectadas por M. bovis , cualquier inflamación palpable o visible debe considerarse positiva. A veces se emplea una interpretación más rigurosa, en particular en poblaciones de alto riesgo o en animales en contacto. Los animales con resultados no concluyentes por una prueba intradérmica sencilla deben someterse a otra prueba tras un intervalo de 42 días. Los animales que no son negativos en esta segunda prueba deben ser considerados positivos. Los animales positivos en la prueba intradérmica sencilla pueden someterse a una prueba intradérmica comparativa. La repetición de las pruebas se puede realizar conforme a los programas nacionales o locales de control.

iii)

En la interpretación de la prueba intradérmica comparativa, se considera positiva la reacción, si el aumento del grosor de la piel en el sitio de la inyección bovina supera en 4 mm o más la reacción en el sitio de la inyección aviar. La reacción no es concluyente, si el incremento comparativo está entre 1 y 4 mm, y se considera negativa, si el incremento del grosor de la piel en el sitio de la inyección bovina es menor o igual que el observado en el sitio de la inyección aviar. Este esquema de interpretación se utiliza en los países de la Unión Europea (EU) y se recomienda en la Directiva del Consejo 64/432/ECC (11). A veces se utiliza una interpretación más rigurosa.

iv)

En la prueba de la cola, se inserta oblicuamente en las capas más profundas de la piel una aguja corta con el bisel hacia fuera, en la cara lateral del pliegue de la cola, a medio camino entre la línea del pelo y la cara ventral del pliegue. La interpretación estándar es que cualquier cambio palpable o visible se considera una reacción. También se emplea una interpretación modificada: una prueba positiva es cualquier inflamación palpable o visible en el sitio de la inyección que tenga un aumento diferencial de grosor de 4 mm en comparación con el pliegue caudal opuesto. Si un animal tiene sólo un pliegue caudal, se considera que la prueba es positiva si el grosor del pliegue caudal es de 8 mm o más.

Pruebas de laboratorio basadas en sangre

Además de la prueba clásica de la tuberculina intradérmica, se dispone de varias pruebas diagnósticas sanguíneas nuevas (16). Debido al coste y la naturaleza más compleja de las pruebas de laboratorio, se suelen usar como pruebas de apoyo para confirmar o negar los resultados de la prueba intradérmica. Las pruebas de proliferación de linfocitos y del interferón gamma corresponden a la inmunidad celular, mientras que el enzimoinmunoensayo (ELISA) corresponde a la inmunidad humoral.

a)

Prueba de proliferación de linfocitos Este tipo de ensayo compara la reactividad in vitro de los linfocitos de la sangre periférica a la tuberculina PPD (PPD-B) y a una tuberculina PPD de Mycobacterium avium (PPD-A). La prueba se puede realizar con sangre entera (4) o con linfocitos purificados de muestras de sangre periférica (14). Estas pruebas tratan de aumentar la especificidad de los ensayos eliminando la respuesta de los linfocitos a antígenos "inespecíficos" o con reacción cruzada asociados a especies de micobacterias no patógenas a las que el animal puede haber estado expuesto. En general, los resultados se analizan como el valor obtenido en respuesta a PPD-B menos el valor obtenido en respuesta a PPD-A. El valor B menos A debe estar por encima de un valor de corte que se puede alterar para aumentar la especificidad o sensibilidad del diagnóstico. El ensayo tiene valor científico, pero no se emplea para diagnóstico rutinario porque la prueba es lenta, y la logística y su ejecución en el laboratorio son complicadas (requiere tiempos de incubación largos y el uso de nucleótidos radioactivos). Sin embargo, la prueba puede ser útil para animales salvajes y animales de zoo. Se ha descrito en ciervos una prueba de sangre con ensayos de transformación de linfocitos y ELISA que tiene una elevada sensibilidad y especificidad para el diagnóstico de infecciones por

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Capítulo 2.3.3. Tuberculosis bovina

M. bovis (14). La prueba es relativamente cara y todavía no se ha sometido a comparaciones entre distintos laboratorios.

b)

Prueba de interferón gamma En esta prueba se mide la liberación de una linfoquina (interferón gamma) en un sistema de cultivo de sangre completa. El ensayo se basa en la liberación de interferón gamma por linfocitos sensibilizados durante un período de incubación de 16-24 horas con antígeno específico (tuberculina PPD). Esta prueba compara la producción de interferón gamma tras la estimulación con PPD bovina y aviar. La cuantificación del interferón gamma se realiza por un ELISA "en sandwhich" que utiliza dos anticuerpos monoclonales contra el interferón gamma bovino. La muestra se debe transportar al laboratorio y se debe realizar el ensayo entre 24-30 horas desde la recogida. Comparada con la prueba cutánea, la prueba posee una sensibilidad elevada pero parece menos específica en varios casos. No obstante, el uso de antígenos definidos de micobacterias promete mejorar la especificidad (4). Para animales de manejo difícil o peligroso, como el ganado excitado u otros bóvidos, presenta la ventaja sobre la prueba cutánea de que sólo necesitan ser capturados una vez.

c)

Enzimoinmunoensayo Ha habido numerosos intentos fallidos para desarrollar pruebas serodiagnósticas de utilidad clínica para la tuberculosis. Las pruebas ELISA parecen la mejor elección y pueden ser un complemento, más que una alternativa, a las pruebas basadas en la inmunidad celular. Pueden ser útiles en ganado anérgico y en ciervos. Una ventaja es su simplicidad, pero su especificidad y sensibilidad son limitadas en el ganado, debido principalmente al desarrollo tardío e irregular de la respuesta inmune humoral durante la enfermedad. Sin embargo, la respuesta de anticuerpos en el ciervo parece desarrollarse antes y de modo más previsible, y se ha descrito que la sensibilidad de un ELISA comparativo puede ser de hasta el 85% (15). Es posible su mejora utilizando diferentes antígenos, como proteínas (por ejemplo, MPB 70, que es muy específica pero carece de sensibilidad). Además, se ha descrito en animales infectados por M. bovis un incremento anamnésico, lo que origina mejores resultados en ELISA 2-8 semanas después de una prueba normal de tuberculina cutánea. También se ha demostrado que una comparación entre los niveles de anticuerpos contra PPD-B y PPD-A es útil para aumentar la especificidad en ELISA (15). El ELISA también puede resultar de utilidad para detectar infecciones por M. bovis en animales salvajes. En Nueva Zelanda se ha aprobado como una prueba de apoyo paralelo en granjas de ciervos y se realiza 13-33 días después de la prueba cutánea en la mitad del cuello.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO La única vacuna disponible en la actualidad contra las infecciones por M. bovis es el bacilo de Calmette-Guerin (BCG), que es una cepa viva atenuada de M. bovis . Ésta ha mostrado una eficacia variable con el ganado bovino, que se puede deber a varios factores, como la formulación de la vacuna, la ruta de vacunación y el grado de exposición a micobacterias ambientales (29). Se han realizado experimentos con otras vacunas, pero no se ha demostrado que alguna de ellas induzca una protección superior a la BCG. La eficacia de la BCG parece variar de modo similar a lo descrito en humanos. Varias vacunas nuevas se están probando actualmente. El ADN del microorganismo de la tuberculosis se está estudiando en detalle y se ha publicado recientemente la secuencia genómica completa. Esto puede ayudar en particular a identificar genes asociados con la virulencia y a obtener avances con una vacuna con ADN. En los países infectados donde no hay prueba ni esquemas de control por sacrificios, puede utilizarse la vacunación con BCG para reducir la extensión de la infección en el ganado. Antes de iniciar un programa de vacunación, el calendario de vacunación debe ajustarse a las condiciones locales. La dosis típica está entre 104 y 106 unidades formadoras de colonias suministradas subcutáneamente. La vacuna debe basarse en la cepa estándar de referencia, la BCG Pasteur (33). Es importante advertir que el uso de la vacuna limita las pruebas cutáneas de tuberculina y otras pruebas inmunológicas. Por tanto, la vacunación del ganado no debe efectuarse en países donde las medidas de control o de mercado se basen en tales pruebas. Las vacunas con BCG pueden emplearse también para reducir la distribución de M. bovis en los reservorios de animales salvajes. Antes de eso es esencial validar el sistema de liberación a esas especies particulares. Las directrices para la producción de vacunas veterinarias se presentan en el Capítulo I.1.7. Principios de producción de vacunas veterinarias. Las normas dadas aquí y en el Capítulo I.1.7 son de carácter general y se pueden suplementar con requisitos nacionales y regionales. Las tuberculinas eran preparaciones realizadas de los productos tratados por calor del crecimiento y lisis de M. tuberculosis o de M. bovis (conocidas respectivamente como tuberculinas humanas y bovinas). Al principio, el medio de cultivo utilizado para su producción fue caldo de glicerol. En la década de 1940, las "tuberculinas de medio sintético concentradas por calor " o tuberculinas HCSM, preparadas de cultivos en medios líquidos

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Capítulo 2.3.3. Tuberculosis bovina

sintéticos, reemplazaron a las "antiguas" tuberculinas. En la actualidad, tanto las antiguas tuberculinas como las tuberculinas HCSM se han reemplazado, casi por entero, con los derivados de proteínas purificadas o PPD.

•

Producción de tuberculina

1.

Control del inóculo

a)

Características del inóculo Las cepas de M. bovis utilizadas para preparar inóculos de siembra se deben identificar como especie por pruebas apropiadas. Se debe mantener un registro de sus orígenes e historia posterior. Los inóculos de los cultivos no deben tener más de cinco pases. Las cepas de producción de M. bovis AN5 o Vallee son las utilizadas más frecuentemente.

b)

Método de cultivo Si el inóculo del cultivo se cultivó en medio sólido, es necesario adaptar el microorganismo a crecer en cultivo de flotación (por ejemplo, incorporando un trozo de patata estéril en los cultivos con medio líquido, como el medio de Watson Reid). Cuando el cultivo se ha adaptado al medio líquido, se puede utilizar para producir el lote de inóculo primario, que se conserva en forma liofilizada. Éste se utiliza para inocular medios para la producción de lotes de inóculos secundarios, que no deben de tener más de cuatro pases en cultivo del inóculo primario. El inóculo secundario se utiliza para inocular los cultivos de producción (1, 17). El substrato del cultivo de producción debe ser capaz de originar un producto adaptado a los estándares internacionales reconocidos (Organización Mundial de la Salud [OMS], Farmacopea Europea, u otra autoridad reconocida de control). Debe estar libre de ingredientes tóxicos o que causen reacciones alérgicas.

c)

Validación

Las cepas de M. bovis utilizadas como inóculos de siembra deben estar libres de microorganismos contaminantes. Los lotes de inóculo deben ser eficaces en cuanto a producción de tuberculina con potencia suficiente. Las pruebas necesarias se describen más adelante en la Sección C.4.

2.

Método de producción

El microorganismo se cultiva en un medio sintético, la proteína del filtrado se precipita químicamente (empleando sulfato amónico o ácido tricloroacético [TCA]), se lava y se resuspende. Se recomienda tuberculina PPD, porque se puede estandarizar de modo más preciso. Se puede añadir como conservante un antimicrobiano que no origine reacciones falsas positivas, como el fenol (no más de 0,5% [p/v]). Como estabilizador se puede añadir glicerol (no más del 10% [p/v]) o glucosa (2,2% [p/v]). No se deben emplear derivados mercuriales. El producto se distribuye asépticamente en recipientes estériles de vidrio neutro, que se cierran para evitar contaminación. El producto se puede liofilizar.

3.

Control interno

Los matraces de producción, inoculados con cultivos de siembra adecuados, se incuban por un período apropiado. Cualquier matraz con contaminación o con crecimiento anormal debe eliminarse después de autoclavarlo. Cuando progresa la incubación, el crecimiento en superficie de muchos cultivos se humedece y se puede introducir en el medio o depositarse en el fondo del matraz. En las tuberculinas PPD, el pH del precipitado disuelto (la llamada tuberculina concentrada) debe ser 6,6-6,7. El nivel de proteína del concentrado de PPD se determina por el método Kjeldahl o cualquier otro método adecuado. Se suele comparar el nitrógeno total y el nitrógeno precipitable por TCA. El producto final debe someterse a bioensayos en cobayas. Se deben realizar pruebas de potencia y especificidad en comparación con una tuberculina de referencia (PPD). Según el contenido en proteína y la concentración final requerida, se hacen diluciones con un tampón, normalmente a 1,0 mg/ml (1, 17).

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Capítulo 2.3.3. Tuberculosis bovina

4.

Control de lotes

Las muestras deben cumplir los estándares reconocidos oficialmente para la producción de tuberculina tal como se indican en la Farmacopea Europea o en las normas reguladoras equivalentes.

a)

Esterilidad Generalmente, las pruebas de esterilidad se realizan conforme a directrices internacionales (ver también Capítulo I.1.5).

b)

Inocuidad Dos cobayas, con peso individual superior a 250 g, que no hayan sido tratados previamente con material que interfiera con la prueba, se inyectan subcutáneamente con 0,5 ml de la tuberculina de prueba. No deben presentarse efectos anormales en 7 días. Las pruebas sobre tuberculina para micobacterias vivas se pueden realizar sobre la tuberculina inmediatamente antes de distribuirla en los recipientes finales o en muestras tomadas de los mismos recipientes finales. Se debe tomar una muestra de por lo menos 10 ml e inyectarla intraperitonealmente en al menos dos cobayas, dividiendo la dosis entre ellos. Se aconseja tomar una muestra mayor, como por ejemplo 50 ml, y concentrar cualquier micobacteria residual por centrifugación o filtración en membrana. Se observan los cobayas durante al menos 42 días y después se examinan macroscópicamente post-mortem. Se examina cualquier lesión microscópicamente y mediante cultivo.

c)

Efecto sensibilizador Para probar el efecto sensibilizador, se toman tres cobayas que no se hayan tratado previamente con material que interfiera con la prueba y se inyectan intradérmicamente en tres ocasiones, cada vez con 0,1ml que contiene el equivalente de 500 UI de la preparación ensayada. A los 15-21 días después de la tercera inyección cada cobaya, junto con cada uno de tres cobayas control que no se han inyectado antes, se inyecta con la misma dosis de la misma tuberculina. Las reacciones en los dos grupos de cobayas no deben diferir significativamente cuando se observan 24-28 horas más tarde.

d)

Potencia La potencia se determina por comparación con una preparación de referencia de tuberculina bovina en cobayas sensibilizados con M. bovis . En la década de los 1970s, los países de la entonces denominada Comunidad Económica Europea (EEC, ahora la EU) establecieron un estándar para las tuberculinas HCSM bovinas. Este estándar de la EEC para la HCSM tiene una potencia de 65.000 unidades provisionales de tuberculina de la Comunidad por ml. En los años 1960s, la EEC reconoció un estándar de la ECC para PPD bovina, a la que se adjudicó una potencia de 50.000 unidades provisionales de tuberculina de la Comunidad por mg de PPD y que fue distribuida en estado liofilizado. Por desgracia, el número de ampollas de liófilos no fue suficiente para las necesidades de la OMS y se decidió por tanto producir una nueva preparación de PPD bovina que pudiera designarse por la OMS como el nuevo estándar internacional para las tuberculinas PPD bovinas. Este nuevo estándar de PPD bovina tuvo que calibrarse frente al estándar existente en la ECC. Mediante ensayos de colaboración internacional, con cobayas y ganado bovino, se comprobó que el nuevo estándar bovino tenía una potencia relativa de 65% frente al estándar de la ECC. Por tanto, en 1986, la OMS dio oficialmente al estándar internacional para las tuberculinas PPD bovinas un valor de 32.500 UI/mg. Esto significa que las unidades provisionales de tuberculina de la Comunidad son equivalentes con las IUs. La Farmacopea Europea también ha reconocido el estándar internacional de la OMS para PPD bovina. Para mantener el stock del estándar internacional actual, es deseable que los países productores de tuberculina PPD bovina establezcan sus propias preparaciones nacionales de referencia para PPD bovina como estándares de referencia. Estas preparaciones nacionales de referencia deben calibrarse frente al estándar oficial internacional de PPD bovina, en cobayas y en ganado bovino (22, 28, 32). •

Estandarización en cobayas

Una prueba de potencia adecuada es la siguiente: En cobayas con sensibilización homóloga, se bioensayan las tuberculinas PPD producidas frente al estándar de la tuberculina PPD bovina mediante una prueba de seis puntos, con tres diluciones seriadas de 1/5 por cada tuberculina. Las diluciones de las preparaciones de tuberculina se realizan en solución tampón isotónica que contiene 0,0005% (p/v) de

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Capítulo 2.3.3. Tuberculosis bovina

polisorbato 80 (Tween 80). Se escogen volúmenes con 0,001. 0,0002 y 0,00004 mg de tuberculoproteína, que corresponden a 32, 6,4 y 1,28 UI, respectivamente, del estándar internacional de PPD, porque estas cantidades dan buenas reacciones cutáneas, fáciles de determinar y con límites aceptables. El volumen inyectado es 0,2 ml. En una prueba, se comparan dos tuberculinas ensayadas con la tuberculina estándar en nueve cobayas, aplicando ocho inyecciones intradérmicas por animal y empleando un diseño equilibrado incompleto de cuadro latino (12). Los cobayas se sensibilizan 5-7 semanas antes del ensayo con una dosis baja de bacilos vivos (0,001 o 0,0001 mg de peso húmedo) de una cepa virulenta de M. bovis (1 mg de peso húmedo). Los bacilos se suspenden en solución salina fisiológica y se realiza una inyección intramuscular profunda de 1 ml en la parte media del muslo. Al tiempo de la prueba, los cobayas infectados con la dosis baja de M. bovis deben estar aún en buenas condiciones de salud y los resultados de numerosos exámenes post-mortem, poco después de los ensayos de estandarización, deberían mostrar que los cobayas no sufren tuberculosis y por lo tanto no excretan bacilos tuberculosos. Se puede utilizar una prueba alternativa de potencia, menos fiable, que no usa micobacterias patógenas vivas y que es más adecuada para laboratorios que carecen de áreas de aislamiento para el mantenimiento seguro de los cobayas infectados. Esta prueba de potencia de la tuberculina se realiza así: la tuberculina PPD se bioensaya, en cobayas con sensibilización homóloga, frente al estándar de la tuberculina PPD bovina mediante una prueba de ocho puntos que comprende cuatro diluciones de 20, 10, 5 y 2,5 UI. El volumen inyectado es 0,1 ml. En esta prueba, se comparan dos tuberculinas ensayadas con la tuberculina estándar en ocho cobayas, aplicando ocho inyecciones intradérmicas por animal y empleando un diseño de cuadro latino. Los cobayas se sensibilizan con bacilos inactivados de M. bovis 5-7 semanas antes del ensayo. Los bacilos se suspenden en tampón y se preparan como una emulsión con adyuvante incompleto de Freund. Se realiza una inyección intramuscular profunda en la parte media del muslo, usando una dosis de 0,5 ml. Normalmente, la lectura de las pruebas se realiza 24 horas después de la inyección de las tuberculinas, pero se puede hacer una segunda lectura adicional a las 42 horas. Se miden los diferentes diámetros de los eritremas en milímetros con calibradores, y se registran en hojas de datos. Los resultados se evalúan estadísticamente por métodos estadísticos estándar para ensayos en paralelo según Finney (12). Se calculan las potencias relativas de las dos tuberculinas ensayadas con sus límites de confianza del 95%, las pendientes de las curvas de log de la dosis versus respuesta para cada preparación (aumento medio de reacción por aumento de unidad log de la dosis) y los cocientes F para las desviaciones del paralelismo. Se acuerdo con la Farmacopea Europea, la potencia estimada para las tuberculinas bovinas debe de estar entre el 66% y el 150% de la potencia indicada en el prospecto. •

Estandarización de la tuberculina bovina en el ganado

De acuerdo con el número 384 de la Serie de Informes Técnicos de la OMS, se debe realizar la prueba de potencia en la especie animal y en las condiciones en que las tuberculinas se usarán en la práctica (32). Esto significa que las tuberculinas bovinas deben ensayarse en ganado tuberculoso infectado de forma natural. Como esto es difícil de cumplir, las pruebas de potencia se realizan en cobayas. Sin embargo, son necesarias pruebas periódicas en ganado tuberculoso y las preparaciones estándar siempre requieren su calibración en el ganado. La frecuencia de las pruebas en el ganado puede reducirse si se está seguro de que las preparaciones estándar son representativas de las tuberculinas en uso y de que los procedimientos de producción garantizan esta lógica. Una prueba adecuada de potencia para las tuberculinas bovinas en ganado se realiza del modo siguiente: Las tuberculinas de ensayo se prueban frente a un estándar de tuberculina PPD bovina mediante una prueba de cuatro puntos usando dos diluciones seriadas de 1/5 para cada tuberculina. Para el estándar se inyectan 0,1 y 0,02 mg de tuberculoproteína que se corresponden con 3.250 y 650 UI del estándar internacional de tuberculina PPD bovina. Las tuberculinas de ensayo se diluyen de modo que se apliquen las mismas cantidades de proteína. El volumen inyectado es 0,1 ml y la distancia entre los sitios de inyección en el área media cervical es de 15-20 cm. En una prueba, se comparan tres tuberculinas de ensayo con la tuberculina estándar en ocho cabezas de ganado tuberculoso, aplicando por animal ocho inyecciones intradérmicas a ambos lados del cuello y empleando un diseño equilibrado completo de cuadro latino. Antes de la inyección y 72 horas después, se mide el grosor de la piel en cada sitio inyectado con calibradores en décimas de milímetro tan exactamente como sea posible. Los resultados se analizan estadísticamente utilizando los mismos métodos estándar para ensayos en paralelo que los empleados en pruebas de potencia con cobayas.

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e)

Especificidad Un ensayo adecuado de especificidad es el siguiente: en cobayas con sensibilización heteróloga, se prueban tres tuberculinas bovinas de ensayo con el estándar de la tuberculina PPD aviar (o tres tuberculinas aviares de ensayo frente al estándar de la tuberculina PPD bovina) mediante una prueba de cuatro puntos, con dos diluciones seriadas de 1/25 de cada tuberculina. Se escogen cantidades de 0,03 y 0,0012 mg de tuberculoproteína de ensayo, que corresponden a 1500 y 60 UI, porque estas dosis dan buenas reacciones cutáneas y de fácil lectura. Las dosis de inyección del estándar son más bajas, 0,001 y 0,0004 mg. En una prueba, se comparan tres tuberculinas con la tuberculina estándar en ocho cobayas mediante ocho inyecciones intradérmicas por animal, empleando un diseño equilibrado completo de cuadro latino. La lectura de los resultados y el tratamiento estadístico es igual que en la prueba de potencia.

f)

Estabilidad Siempre que las tuberculinas cumplan con las normas legislativas en cuanto a producción y se guarden protegidas de la luz a una temperatura entre 2°C y 8°C, pueden utilizarse hasta la fecha de caducidad que se especifica en el permiso para la producción de tuberculina. Para el almacenamiento a largo plazo, se recomienda mantener la PPD en forma concentrada en vez de diluida, y el concentrado también debe mantenerse en la obscuridad.

g)

Control de pH El pH debe estar entre 6,5 y 7,5.

h)

Contenido en proteína El contenido proteico se determina como se indica en la Sección C.3. Control interno.

i)

Almacenamiento Durante el almacenamiento, la tuberculina bovina líquida debe protegerse de la luz y mantenerse a una temperatura de 5+3°C. Las preparaciones liofilizadas pueden mantenerse a temperaturas más elevadas (pero sin exceder los 25°C) y protegidas de la luz. Deben reducirse al mínimo las exposiciones a temperaturas superiores y a la luz solar directa.

j)

Conservantes Se debe demostrar que los conservantes antimicrobianos u otras substancias que pueden añadirse a las tuberculinas no afectan a la seguridad y eficacia del producto. La máxima concentración permitida para el fenol es 0,5% (p/v), y para el glicerol es 10% (v/v).

k)

Precauciones (riesgos) La experiencia con humanos y con animales ha llevado a la observación de que la tuberculina diluida de modo apropiado, inyectada intradérmicamente, origina una reacción localizada en el sitio de la inyección sin manifestaciones generalizadas. Incluso en individuos muy sensibles, las reacciones generalizadas graves son extremadamente raras. Pero la experiencia ha demostrado que un operador con hipersensibilidad puede adquirir síntomas generalizados graves por contacto intradérmico accidental (herida por picadura de aguja) con tuberculina bovina. Estos individuos no deberían realizar la prueba cutánea de la tuberculosis con la dosis alta de 2000-5000 UI de tuberculina, que es unas 1000 veces la dosis humana normal de 5 UI.

5.

Pruebas sobre el producto final

a)

Inocuidad Se debe realizar una prueba para la ausencia de propiedades tóxicas o irritantes (ver Sección C.4.b.)

b)

Potencia La potencia de la tuberculina debe determinarse por métodos biológicos. Estos métodos deben utilizarse para las tuberculinas HCSM y PPD; se basan en la comparación de las tuberculinas a ensayar con una preparación estándar de referencia de tuberculina del mismo tipo (ver también Sección C.4.d.).

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Capítulo 2.3.3. Tuberculosis bovina

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Capítulo 2.3.3. Tuberculosis bovina

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* **

NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Tuberculosis bovina (ver Cuadro en la parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar la página web de la OIE para una lista actualizada: www.oie.int)

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CAPÍTULO 2.3.4.

LEUCOSIS BOVINA ENZOÓTICA

RESUMEN La leucosis bovina enzoótica (LBE) es una enfermedad del ganado bovino adulto causada por el retrovirus de la leucemia bovina (BLV). El ganado puede infectarse a cualquier edad, incluida la fase embrionaria. La mayoría de las infecciones son subclínicas, pero un porcentaje del ganado mayor de 3 años (≈ 30%) desarrolla linfocitosis persistente y una pequeña proporción de linfosarcomas (tumores) en varios órganos internos. También se ha registrado infección natural en búfalos, ovejas y capibaras. Los síntomas clínicos, cuando se presentan, dependen de los órganos afectados. El ganado con linfosarcomas casi siempre muere súbitamente o en semanas o meses después de la aparición de los síntomas clínicos. Identificación del agente: Los virus se pueden aislar por cultivo de linfocitos periféricos y la demostración del virus se puede lograr por microscopía electrónica o por pruebas de detección del antígeno de BLV. Por la reacción en cadena de la polimerasa se puede detectar el ADN del provirus en la sangre periférica o en los tumores. Pruebas serológicas: Los métodos más utilizados son la inmunodifusión en medio sólido (IGDA) de sueros o el enzimoinmunoensayo (ELISA) para sueros o muestras de leche. En muchos países estas pruebas constituyen la base de políticas acertadas de erradicación. También pueden utilizarse otras pruebas como el radioinmunoensayo. Se han comercializado. varios kits de pruebas IGDA y ELISA. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: No existen vacunas contra el BLV.

A. INTRODUCCIÓN Pueden existir varias causas de los linfosarcomas del ganado bovino, pero la única causa conocida es el retrovirus de la leucemia bovina (BLV), que origina la leucosis bovina enzoótica (LBE). El término leucosis bovina esporádica (LBES) se reserva normalmente para los linfomas de tipo cutáneo y tímico de los terneros, que se definen por la edad del animal afectado y por la distribución de los tumores. Se desconoce la causa o causas de la LBES. También hay condiciones linfosarcomatosas que no corresponden a las categorías de la LBES o la LBE, como el caso del linfoma multicéntrico de adultos, de aparición esporádica y de etiología desconocida. Solamente deben denominarse leucosis o Leucosis enzoótica bovina a los linfomas causados por infección con BLV. Aunque los animales pueden infectarse con BLV a cualquier edad, los tumores (linfosarcomas) se observan típicamente en animales de más de 3 años. Normalmente las infecciones son subclínicas; solamente el 30-70% del ganado infectado desarrolla una linfocitosis persistente, y el 0,1-10% desarrolla tumores. Los síntomas dependen del lugar en que aparecen los tumores y pueden incluir desarreglos digestivos, inapetencia, pérdida de peso, debilidad general y, a veces, manifestaciones neurológicas. Los ganglios linfáticos superficiales pueden verse inflamados y se pueden palpar bajo la piel o por examen rectal. Los órganos implicados con más frecuencia son la cuarta cavidad del rumen, la aurícula derecha del corazón, el bazo, el intestino, el hígado, el riñón, la tercera cavidad del rumen, los pulmones y el útero. La susceptibilidad del ganado a una linfocitosis persistente está determinada genéticamente, y quizá también el desarrollo del propio tumor. Existen dudas sobre el papel del virus como causa de la deficiencia inmunológica o del aumento de pérdidas selectivas. En un estudio se demostró que las manadas infectadas con BLV presentaban menor producción láctea (2,5-3% a nivel de la manada) y un aumento en la tasa de pérdidas selectivas, así como una mayor susceptibilidad a otras enfermedades de etiología infecciosa, del tipo de la mastitis, diarrea y neumonía, pero el efecto sobre la fertilidad fue escaso (9).

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Capítulo 2.3.4.  Leucosis bovina enzoótica

B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO El virus puede detectarse por cultivo in vitro de linfocitos de la sangre periférica. En los linfocitos sanguíneos y en células tumorales el virus se presenta como un provirus integrado en el ADN de la célula. También se encuentra en la fracción celular de varios líquidos del cuerpo (fluidos nasales y bronquiales, saliva, leche). La transmisión natural depende de la transferencia de células infectadas, por ejemplo durante el parto. También se produce transmisión artificial, especialmente por agujas contaminadas con sangre, equipo quirúrgico, guantes usados en exámenes rectales, etc. La trasmisión horizontal en ausencia de estos factores suele ser baja. En regiones con muchos insectos chupadores de sangre, especialmente tábanos, éstos pueden transmitir el virus de forma mecánica. Aunque se pueden infectar varias especies animales por inoculación con el virus, la infección natural solo tiene lugar en el ganado bovino (Bos taurus y Bos indicus), en búfalos y en capibaras. Las ovejas son muy susceptibles a la inoculación experimental y a menudo desarrollan tumores a una edad más temprana que el ganado bovino. También pueden detectarse anticuerpos persistentes después de una inoculación experimental en ciervos, conejos, ratas, cobayas, gatos, ovejas, monos rhesus, chimpancés, antílopes, cerdos, cabras y búfalos. Probablemente el BLV estaba presente en Europa durante el siglo XIX, desde donde se extendió al continente americano en la primera mitad del siglo XX. Puede haber regresado a Europa y a otros países, con la importación de ganado norteamericano (11). Varios países han sido reconocidos oficialmente como libres de infección por BLV. Se han realizado diversos estudios para determinar si el BVL causa enfermedades en humanos, sobre todo por el consumo de leche de vacas infectadas. Sin embargo, no existe evidencia concluyente de transmisión, y en la actualidad se considera que el BLV no representa un peligro para el hombre.

1.

Identificación del agente

El BLV es un retrovirus exógeno relacionado desde el punto de vista estructural y funcional con los virus humanos 1 y 2 que infectan los linfocitos T (HTLV-1 y HTLV-2). Las principales células diana del BLV son los linfocitos B. Las partículas víricas constan en esencia de un ARN de cadena sencilla, la nucleoproteína p12, la proteína p24 de la cápsida, la glicoproteína transmembrana gp30, la glicoproteína de la envuelta gp51, y varias enzimas entre las que se incluye la transcriptasa inversa. El ADN del provirus, que se genera por trascripción inversa de la mayor parte del genoma vírico, se integra al azar en el ADN nuclear de la célula hospedadora, donde permanece sin dar lugar a virus libres in vivo. Cuando las células infectadas se cultivan in vitro, generalmente mediante co-cultivo de linfocitos con una línea celular indicadora, se producen virus infecciosos, lo que sucede más rápidamente si se estimulan las células con mitógenos (16).

a)

Aislamiento del virus Las células mononucleares se aíslan en un gradiente de densidad a base de ficoll/metrizoato sódico, partiendo de 1,5 ml de sangre tratada con etilén diamino tetra-acético (EDTA). Después se cultivan con 2 x 6 10 células de pulmón bovino fetal (FBL) y se cultivan durante 3-4 días en 40 ml de medio mínimo esencial (MEM) con 20% de suero bovino fetal. El virus forma sincitios en la monocapa celular. Se pueden preparar cultivos de corta duración, cultivando durante 3 días las células mononucleares en una bandeja de plástico con 24 pocillos en ausencia de las células FBL (13). Los antígenos p24 y gp51 pueden detectarse en el sobrenadante de los cultivos mediante radioinmunoensayo (RIA), enzimoinmunoensayo (ELISA), inmunotransferencia o por inmunodifusión en gel de agar (IGDA), y la presencia de partículas de BLV y de provirus se puede demostrar por microscopía y por PCR, respectivamente.

b)

Reacción en cadena de la polimerasa Varios autores han descrito la utilización de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para detectar el provirus del BLV (3-5, 19). Con diversa eficacia, se han utilizado cebadores construidos para combinarse con las regiones gag, pol y env del genoma. El método más sensible y rápido es la PCR doble (anidada) seguida por electroforesis y tinción (4, 12). El método descrito se basa en secuencias cebadoras del gen env, que codifica la gp51. Este gen está muy conservado, y tanto el gen como el antígeno están generalmente presentes en todos los animales infectados a lo largo de las fases de la infección. La técnica está limitada en su ejecución a aquellos laboratorios que dispongan de servicios de virología molecular, y deben tenerse en cuenta las precauciones normales y los procedimientos de control necesarios para asegurar la validez de los resultados de la prueba (ver Capítulos I.1.4. y I.1.8.). Se han publicado otros protocolos de PCR para la detección de secuencias del provirus del BLV (3, 4, 19).

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Capítulo 2.3.4.  Leucosis bovina enzoótica

La PCR anidada se aplica a la detección de la infección por BLV en animales individuales en las siguientes circunstancias: •

Terneros jóvenes con anticuerpos del calostro,

•

Casos de tumor, para diferenciar entre linfoma esporádico e infeccioso,

•

Tejido tumoral de casos sospechosos recogidos en mataderos,

•

Nuevas infecciones, antes del desarrollo de anticuerpos contra el BLV,

•

Casos de resultados débilmente positivos o inciertos en pruebas de tipo ELISA,

•

Análisis sistemático de ganado en centros de prueba de reproducción (antes de la introducción en centros de inseminación artificial)

•

Ganado empleado en la producción de vacunas, para comprobar que están exentos de BLV.

La prueba de PCR no es adecuada para utilización a nivel de manada, pero puede emplearse como una ayuda a la serología en pruebas confirmativas. •

Sensibilidad y fiabilidad del método

i)

Sensibilidad analítica Aunque la prueba de PCR anidada tiene una sensibilidad teórica de una molécula problema, en la práctica la sensibilidad analítica es algo más baja, alrededor de 5-10 moléculas de ADN provírico por muestra.

ii)

Muestras positivas falsas La elevada sensibilidad del método de la PCR anidada puede causar problemas de muestras falsas positivas debido a la contaminación entre las muestras. Para reducir esto, se adoptan durante el análisis varios procedimientos especiales, como la utilización de cabinas de flujo laminar, empleo de locales separados para las distintas fases del proceso, guantes nuevos en cada caso, uso de tubos de apertura especial para cada ensayo individual, controles negativos (blancos con agua), etc. Estas precauciones contra la contaminación se han descrito extensamente (5).

iii)

Muestras negativas falsas Debe advertirse que solo una pequeña proporción de los linfocitos periféricos resulta infectada, lo que limita la sensibilidad del ensayo. La presencia en algunas muestras de sustancias inhibidoras puede originar resultados falsos negativos. Para detectar esto se utiliza en cada ensayo, por lo menos, un control positivo. Además, a cada muestra se añaden controles internos (réplicas). La réplica es una molécula problema modificada que se amplifica con los mismos cebadores que la molécula problema real, pero que genera un producto más largo en PCR, y que puede visualizarse mediante electroforesis en gel de agarosa. La réplica se añade a una concentración baja y esto, junto con el mayor tamaño del producto de la PCR, favorece una amplificación del problema real (2). No obstante, es posible que la réplica compita con la verdadera molécula. Por tanto, puede ser necesario analizar cada muestra con y sin réplica.

•

Preparación de la muestra

Los linfocitos de la sangre periférica (PBL) se separan de la sangre con EDTA utilizando el método FicollPaque de separación (Pharmacia & Upjohn, Uppsala, Sweden). Alternativamente, se puede utilizar la capa leucocitaria o incluso sangre completa, por ejemplo cuando las muestras se han congelado. Los tumores y otros tejidos deben homogenizarse para formar una suspensión al 10%. •

Extracción del ADN

La purificación del ADN total es un prerequisito para alcanzar una sensibilidad óptima. Se han comercializado varios métodos de purificación, por ejemplo el NucleoSpin (Macherey-Nagel) o el tratamiento con resina quelante (BioRad).

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Capítulo 2.3.4.  Leucosis bovina enzoótica

El siguiente método se basa en estudios de Singer-Sam et al. (17) y Walsh et al. (20). Se deben adoptar precauciones especiales en todos los pasos para evitar el riesgo de contaminación (5). i)

En un tubo eppendorf de 1,5 ml para cada muestra, se añaden 100 µl de resina quelante (Sigma C7901 o Chelex de BioRad).

ii)

A los tubos con la resina quelante se añaden 100 µl de las muestras y 10 µl de la réplica. Las muestras se agitan en un vórtex.

iii)

Se cierran los tubos eppendorf y se incuban a 56ºC-60ºC durante 20 minutos.

iv)

Los tubos se agitan en un vórtex durante 10 segundos.

v)

Se incuban los tubos a 96ºC durante 8-10 minutos.

vi)

Los tubos se agitan en un vórtex durante 10 segundos y se colocan inmediatamente en hielo.

vii)

Opcional: Todas las muestras se equilibran a una cantidad estándar de ADN (500 ng/reacción) aplicando, por ejemplo, el método Beta Globin (19).

viii) Se centrifugan los tubos a 15.000 g durante 2 minutos. ix)

Se utilizan 5 µl en el ensayo de PCR.

•

Procedimiento de PCR anidada

i)

Diseño de cebadores y secuencias Se han publicados varios protocolos de PCR para la detección de secuencias del provirus del BLV (3, 4, 19). Como ejemplo, se describe con detalle un ensayo de PCR basado en el desarrollado por Ballagi-Pordany et al. (3). La región del BLV usada como diana es el gen de la gp51 (env). La secuencia empleada para el diseño de los cebadores está disponible en el banco de datos GenBank, con número de acceso K02120. Las secuencias de los cebadores son:

Oligo

Secuencia

Posición en K02120

OBLV1A

(5’-CTT-TGT-GTG-CCA-AGT-CTC-CCA-GAT-ACA-3’)

5029

OBLV6A

(5’-CCA-ACA-TAT-AGC-ACA-GTC-TGG-GAA-GGC-3’)

5442

OBLV3

(5’-CTG-TAA-ATG-GCT-ATC-CTA-AGA-TCT-ACT-GGC-3’)

5065

OBLV5

(5’-GAC-AGA-GGG-AAC-CCA-GTC-ACT-GTT-CAA-CTG-3’)

5376

Tamaño del producto de PCRI: 440 bp; tamaño del producto de PCRII: 341 bp; tamaño del producto de la réplica: 761 bp.

ii)

Mezclas de reacción Las mezclas de reacción se combinan (excepto la muestra y la réplica) antes de añadirlas a los tubos de reacción. Cada cinco muestras debe añadirse un control negativo (con agua bidestilada) y un control positivo. Los volúmenes totales de mezcla se calculan multiplicando los volúmenes indicados por el número total de muestras, incluyendo los controles, más uno. Se utiliza polimerasa Taq a una pre-dilución de 1/10. 1

Las muestras de ADN y las réplicas (2) deben añadirse en recintos separados del laboratorio: el recinto número 1 para preparaciones de ADN y para réplicas, y el recinto número 2 para productos de la PCRII a fin de minimizar la contaminación.

1

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Disponible del Dr. Belák, Department of Virology, National Veterinary Institut, Box 585, Biomedical Centre, S-751 23, Uppsala, Suecia.

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Capítulo 2.3.4.  Leucosis bovina enzoótica

a)

Reactivos añadidos en una habitación limpia del laboratorio

Esta mezcla se puede preparar por adelantado y mantener a 4ºC hasta 1 mes.

Reacción PCRI

Reacción PCRII

H2O bidestilada (estandarizada)

21 µl

21 µl

10 ‰ tampón para PCR (Perkin Elmer)

5 µl

5 µl

4 ‰ 1 µl

4 ‰ 1 µl

5 µl

5 µl

OBLV1A

1.5 µl

–

OBLV6A

1.5 µl

–

OBLV3

–

1.5 µl

OBLV5

–

1.5 µl

En total:

38 µl

38 µl

Reactivos por reacción (conc.)

dNTP (10 mM) Seroalbúmina bovina (1 mg/ml) Cebadores (10 pmol/µl):

Lo siguiente debe añadirse inmediatamente antes de comenzar la PCR Reacción PCRI

Reacción PCRII

MgCl2 (25 mM)

5 µl

5 µl

Polimerase Taq (1 unidad/reacción)

2 µl

2 µl

2 gotas

2 gotas

45 µl

45 µl

Reactivos por reacción (conc.)

Aceite mineral En total: b)

Reactivos añadidos en el recinto número 1 (ADN) ó 2 (PCRII)

Reactivos por reacción (conc.) Muestra de ADN (o de agua) Producto de PCRI En total: iii)

Reacción PCRI

Reacción PCRII

5 µl

–

–

5 µl

50 µl

50 µl

Perfiles térmicos de la PCR Para la PCRI 5‰

94°C/45 segundos, 60°C/60 segundos, 72°C/90 segundos

30 ‰

94°C/45 segundos, 55°C/60 segundos, 72°C/90 segundos

1‰

72°C/420 segundos ˆ20°C

Para la PCRII

iv)

5‰

94°C/45 segundos, 58°C/60 segundos, 72°C/90 segundos

30 ‰

94°C/45 segundos, 53°C/60 segundos, 72°C/90 segundos

1‰

72°C/420 segundos ˆ20°C

Procedimiento de laboratorio I

Mezclar los reactivos para la PCR como se describe en el paso ii. Cuando se añadan las muestras de ADN, utilizar guantes o abridores de tubos distintos para cada tubo individual. Colocar las muestras en

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Capítulo 2.3.4.  Leucosis bovina enzoótica

hielo. Ajustar el termociclador a 80ºC. Poner las muestras en el termociclador e iniciar el programa de I la PCR (paso iii). II

Mezclar los reactivos para la PCR como se describe en el paso ii. Usar guantes o abridores de tubos I distintos para cada tubo individual cuando se añada el producto de la PCR . Colocar las muestras en hielo. Ajustar el termociclador a 80ºC. Poner las muestras en el termociclador e iniciar el programa de II la PCR (paso iii). •

Electroforesis en gel de agarosa II

Llevar los productos de la PCR al laboratorio de electroforesis. Depositar aproximadamente 10-15 µl de las muestras y 23 µl de tampón de carga en un gel de agarosa al 2% que contenga bromuro de etidio al 0,01%. La electroforesis se realiza a 90 mA durante 2 horas utilizando 0,5 x tampón Tris/borato/EDTA (TBE). Para controlar el tamaño de los productos de amplificación se recomienda un patrón de 100 bp. El análisis de los productos de la PCR se realiza por iluminación con luz UV. •

Interpretación de los resultados

i)

Muestras positivas Las muestras positivas deben dar productos de PCR del tamaño esperado (341 bp), similar al producto del control positivo.

ii)

Muestras negativas Las muestras negativas no deben dar productos de PCR del tamaño esperado (341 bp), pero debe estar presente el producto de la réplica (144 bp).

iii)

Resultados dudosos El ensayo debe repetirse cuando los controles positivos (réplica o control positivo externo) son negativos o si los controles negativos con agua son positivos.

•

Prueba confirmativa

Para una identificación confirmativa, los productos de la PCR se pueden secuenciar, hibridar a una sonda o analizarse mediante análisis del polimorfismo de fragmentos de restricción (RFLP) (10).

2.

Pruebas serológicas

La infección del ganado con el virus dura toda la vida y origina una respuesta persistente de anticuerpos, los cuales se detectan por primera vez a las 3-16 semanas post-infección. Los anticuerpos derivados de la madre pueden tardar de 6-7 meses en desaparecer. No hay modo de distinguir entre los anticuerpos adquiridos por transferencia pasiva y los que resultan como consecuencia de una infección activa. Sin embargo, la infección activa se puede confirmar por la detección del provirus del BLV mediante PCR. Los anticuerpos pasivos tienden a proteger a los terneros contra la infección. Durante el período próximo al parto, las vacas pueden tener anticuerpos séricos que son indetectables por IGDA debido al paso de los anticuerpos desde el sistema circulatorio de la vaca al calostro. Por tanto, cuando se utiliza la prueba IGDA, un resultado negativo de la prueba con suero tomado a ese tiempo (2-6 semanas antes del parto y 1-2 semanas después del parto) no es concluyente y la prueba debe repetirse. No obstante, la prueba IGDA se puede realizar en esta fase con el calostro. Los anticuerpos que primero se detectan son los dirigidos contra gp51 y p24 del virus. La mayor parte de las pruebas rutinarias IGDA y ELISA detectan anticuerpos contra la glicoproteína gp51, que son de aparición temprana. Se han descrito métodos para realizar estas pruebas (6, 8). Existen sueros liofilizados para utilizar en ELISA como sueros estándar de la OIE, que son débilmente positivos y negativos, y están disponibles en el laboratorio de referencia de la OIE en Inglaterra (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual). Estos sueros pueden emplearse para establecer la sensibilidad de las pruebas ELISA. Debe advertirse que aunque el suero débilmente positivo se ha equilibrado para ser equivalente al E4 diluido 1/10, no es adecuado para utilización en la prueba IGDA. Como las disponibilidades son limitadas, se sugiere que los estándares de trabajo para ELISA sean locales y calibrados frente a sueros estándar.

a)

Enzimoinmunoensayo (prueba prescrita para el mercado internacional) Se puede utilizar un ELISA indirecto o un ELISA de bloqueo. Las pruebas basadas en estos principios están comercializadas; se pueden necesitar kits diferentes para muestras de suero o de leche. Algunos ELISAs son lo suficientemente sensibles como para utilizarse con muestras mezcladas, acumuladas en común. Las pruebas ELISA se realizan en la fase sólida de microplacas. El antígeno del BLV se emplea para recubrir las placas, bien directamente o por medio de un anticuerpo policlonal o monoclonal (MAb) de captura. El antígeno se prepara de modo similar a como se hace para la prueba IGDA y se utiliza a una dilución predeterminada (por ejemplo, 1/10) en solución salina tamponada con fosfato (PBS). En forma de kit, las

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Capítulo 2.3.4.  Leucosis bovina enzoótica

placas se adquieren a veces antigenizadas. Se pueden añadir algunos conservantes a las muestras de leche para evitar su agriamiento por fermentación. Normalmente, las muestras con conservante no se deterioran de modo significativo si se conservan hasta 6 semanas a 4ºC.

•

Enzimoinmunoensayo indirecto — ELISA para leche El siguiente método es adecuado para la detección de anticuerpos en muestras de leche de mezcla. •

Controles

En cada ensayo deben incluirse controles de leche fuertemente positiva, débilmente positiva y negativa, y controles de diluyente. Un control fuertemente positivo se prepara diluyendo a 1/25 el suero estándar positivo de la OIE (E4 1/10) en leche negativa. Un control débilmente positivo se prepara diluyendo el suero estándar positivo de la OIE (E4 1/10) 25 veces el número de muestras de leche individuales que componen el conjunto de leche problema. La leche utilizada para diluir los controles de suero estándar no debe ser pasteurizada, debe estar descremada y con conservante. •

Ejemplo de procedimiento de la prueba

i)

Las muestras de leche deben mantenerse en reposo en un refrigerador hasta que se forme una capa cremosa definida (24-48 horas), o alternativamente se centrifugan a 2.000 rpm durante 10 minutos. La capa cremosa se elimina antes de la prueba.

ii)

En columnas alternadas, se unen a la placa de titulación un antígeno de BLV y un control negativo de antígeno. Se mezclan 100 µl de la muestran problema con 100 µl de tampón de lavado para hacer una dilución 1/2 en la placa, añadiéndolo a dos pocillos de control de antígeno y a dos pocillos con antígeno BLV.

iii)

La placa se cierra y se mezcla el contenido de los pocillos en un agitador.

iv)

Se incuba la placa durante 14-18 horas a 2-8ºC.

v)

Se añaden 300 µl de diluyente de lavado por pocillo y se eliminan; a continuación se añaden otros 200 µl de diluyente de lavado, se agita durante 10 segundos, y se vuelve a eliminar. Finalmente se añaden otros 300 µl y se deja en reposo durante 3 minutos antes de eliminar.

vi)

Se añaden 200 µl por pocillo de IgG anti-bovina purificada por afinidad y conjugada con peroxidasa de rábano, y la placa se incuba durante 90 minutos a temperatura ambiente.

vii)

La placa se lava añadiendo 300 µl de diluyente de lavado por pocillo; luego se elimina y se vuelven a añadir otros 300 µl de diluyente de lavado, que se deja en reposo durante 3 minutos y se elimina. Los pasos vi y vii se repiten.

viii) Se añaden 200 µl de substrato ABTS (ácido 2,2´-azino-bis-[3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico]) (precalentado a 25ºC) y se incuba la placa durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. La reacción se detiene añadiendo 50 µl de solución de parada. •

Lectura e interpretación de los resultados

Se ajusta el lector de placas y se lee la absorbancia a 405 nm. Todos los pocillos de la microplaca deben leerse en las 2 horas siguientes a la adición de la solución de parada. La lectura de absorbancia de los pocillos que contienen antígeno negativo se resta de las lecturas de los pocillos que contienen el antígeno positivo. Para cada muestra problema, los dos valores de absorbancia neta se promedian. Lo mismo se lleva a cabo con los controles duplicados débilmente positivos. Las lecturas de los duplicados no deben diferenciarse en más de 0,1 unidades de absorbancia. Para que la prueba se considere válida, el promedio de la absorbancia neta de los controles débilmente positivos (WP) debería estar entre 0,2-0,6 unidades de absorbancia. La absorbancia neta de los controles fuertemente positivos debería ser >1,0 unidades de absorbancia. La absorbancia neta del control negativo y del control de los diluyentes debería estar por debajo del límite del valor dudoso. Teniendo en cuenta los criterios anteriores: i)

Las muestras problemas son positivas si los valores de absorbancia neta son mayores o iguales que los del control WP.

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Capítulo 2.3.4.  Leucosis bovina enzoótica

ii)

Las muestras problema son dudosas si su absorbancia neta es el 75% o menos que el valor de la absorbancia neta del control WP. Por ejemplo, si la absorbancia neta del control WP = 0,40 entonces el límite inferior del valor dudoso = 0,40 x 0,750 = 0, 30 Por tanto, en este ejemplo, el rango dudoso sería 0,30-0,39 y las muestras con valor > 0,40 se considerarían positivas.

iii)

•

Las muestras problema son negativas si el valor de su absorbancia neta está por debajo del límite inferior del rango dudoso (< 0,30 en el ejemplo).

Enzimoinmunoensayo de bloqueo — ELISA para suero El siguiente método es adecuado para la detección de anticuerpos en muestras suero. •

Procedimiento de la prueba

i)

Recubrimiento de la placa

aisladas o conjuntas de

Todos los pocillos se recubren con anticuerpo contra el BLV prediluido en tampón de recubrimiento (100 µl/pocillo); la placa se cierra y se incuba durante 18 horas a 4ºC. Se realiza un ciclo de lavado (lavado estándar), que consiste en tres lavados llenando los pocillos hasta arriba y dejando cada vez el tampón durante 3 minutos; después se seca la placa. Se añade el antígeno del BLV prediluido en tampón de lavado (100 µl/pocillo); se cierra la placa y se incuba durante 2 horas a 37ºC. Se realiza otro ciclo estándar de lavado. ii)

Preparación y adición de muestras y controles Los controles de suero positivo y negativo se prediluyen en tampón de lavado (1/2) y se añade la solución a cuatro pocillos por cada control (100 µl/pocillo). Para probar muestras de mezclas conjuntas se pueden agrupar 80 sueros diluidos (1/2) con el tampón de lavado y la solución se añade a dos pocillos (100 µl/pocillo) por cada muestra. Las muestras aisladas deben diluirse 1/100 con tampón de lavado y añadir la solución a dos pocillos (100 µl/pocillo) por cada muestra. Después de colocar las muestras, se cierra la placa y se incuba durante 18 horas a 4ºC. Se realiza un breve lavado llenando los pocillos y vaciándolos inmediatamente.

iii)

Preparación y adición de conjugados y substrato A todos los pocillos se añade (100 µl/pocillo) anticuerpo biotinilado prediluido (utilizando tampón de lavado + 10% de suero fetal bovino). Se cierra la placa y se incuba en un agitador durante 1 hora a 37ºC. Se realiza un lavado estándar como se describió anteriormente. Se prediluye avidina conjugada con peroxidasa en el tampón de lavado y se añade a todos los pocillos (100 µl/pocillo). Se cierra la placa y se incuba en un agitador durante 30 minutos a 37ºC. Se realiza un lavado estándar. Se añade a todos los pocillos 100 µl del substrato ortofenilén diamina y se cierra la placa dejándola en la oscuridad durante 9 minutos. La reacción se detiene añadiendo 0.5 M de ácido sulfúrico (100 µl/pocillo).

•

Lectura e interpretación de los resultados

Se ajusta el lector de placas y se lee la absorbancia a 490 nm. Para lectores de doble longitud de onda se utiliza un filtro de referencia entre 620 nm y 650 nm. Los resultados se leen dentro de los 60 minutos siguientes a la adición de la solución de parada. La absorbancia del control negativo debe estar próxima a 1,1 + 0,4. Si la absorbancia es menor de 0,7 el tiempo para el desarrollo del color en el paso iii antes descrito debe aumentarse (ver, preparación y adición de conjugados y substrato). A la inversa, si la absorbancia supera 1,5 el tiempo debe acortarse. La absorbancia del control positivo debe ser menor que la absorbancia del control negativo x 0,25. Una muestra es positiva cuando la absorbancia de cada uno de los dos pocillos problema es igual o menor que la absorbancia media de los cuatro pocillos negativos x 0,5. Una muestra es negativa cuando la absorbancia de cada uno de los dos pocillos problema es igual o mayor que la absorbancia media de los cuatro pocillos negativos x 0,65. Para muestras que dan valores comprendidos entre la absorbancia del control negativo x 0,50 y la absorbancia del control negativo x 0,65 se recomienda volver a probar el animal tomando una muestra un mes más tarde.

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•

Sensibilidad del enzimoinmunoensayo

Se puede determinar la sensibilidad de las pruebas ELISA para leches de mezcla utilizando los sueros estándar de la OIE que son débilmente positivos y negativos. Las pruebas deben dar resultado positivo con E4 cuando se diluye en leche negativa a una dilución de 250 veces el número de leches individuales de la mezcla (Directiva 88/406 de la Unión Europea). Por ejemplo, para mezclas de 60 leches, E4 se debe diluir 1/250 x 60 =1/15000. Utilizando el suero estándar de la OIE débilmente positivo disponible en la actualidad (E4 1/10), en la muestra anterior la dilución debería ser 1/25 x 60 =1/1500. Para muestras de leche individual, el suero estándar de la OIE débilmente positivo diluido 1/25 (E4 1/250) en leche negativa, debe ser positivo. Cuando se prueban muestras de mezclas de sueros, el suero estándar de la OIE debe dar un resultado positivo a una dilución igual al número de animales individuales de la mezcla. Por ejemplo, para un conjunto de 50 muestras individuales, el suero estándar de la OIE débilmente positivo diluido 1/50 en suero negativo debería dar un resultado positivo. En las pruebas en que las muestras de suero se ensayan individualmente, el suero estándar de la OIE débilmente positivo sin diluir debe ser positivo.

b)

Inmunodifusión en gel de agar (prueba prescrita para el comercio internacional) La prueba IGDA es específica, pero no muy sensible, para detectar anticuerpos en muestras de suero individuales. Sin embargo, no es adecuada para muestras de leche (excepto el primer calostro) debido a su escasa especificidad y sensibilidad. La prueba IGDA es sencilla y fácil de realizar y ha sido muy útil y eficaz como base en esquemas de erradicación. En los kits comerciales para pruebas IGDA se incluyen sueros de referencia, pero no hay sueros estándar de la OIE actualmente disponibles para esta prueba. Se puede obtener consejo de los laboratorios de referencia de la OIE que se indican en la Parte 3 de este Manual. i)

Gel de agar: Se prepara una solución de agar o agarosa al 0,8-1,2% en tampón Tris 0,2 M, pH 7,2, que contenga 8,5% de NaCl. Una manera de preparar el agar es disolver 24,23 g de Tris metilamina en 1 litro de agua destilada y ajustar el pH a 7,2 con HCl 2,5 M. Se disuelve cloruro sódico (85 g) en 250 ml de Tris/HCl y se lleva a 1 litro. Se añade la agarosa (8 g) y la mezcla se calienta en una olla a 2 presión o en un autoclave a 4,55 kg/cm durante 10 minutos. La mezcla se reparte en alícuotas de 15 ml que pueden mantenerse a 4ºC durante aproximadamente 6 semanas.

ii)

Antígeno: El antígeno debe contener la glicoproteína gp51 específica de BLV. El antígeno se prepara en un sistema adecuado de cultivo celular, como en monocapas de células de riñón de cordero fetal (FLK) persistentemente infectadas. Las células utilizadas para producir el antígeno del BLV deben estar libres del virus no citopático de la diarrea vírica bovina y de retrovirus bovinos, así como de virus similares al de la inmunodeficiencia bovina (lentivirus) y de virus bovinos sincitiales (espumavirus). Después de 3-4 días de cultivo a 37ºC, el medio de crecimiento se reemplaza con medio de mantenimiento. Se recogen las células 7 días después, empleando una solución estándar de tripsina/verseno y la suspensión celular obtenida se centrifuga a 500 g durante 10 minutos. A continuación, las células se resuspenden en medio de crecimiento; 30% de las células se devuelven al recipiente de cultivo y el resto se desecha. Se recoge todo el sobrenadante y se concentra 50–100 veces por métodos disponibles, bien sea por concentración del material en tubos Visking inmersos en polietilén glicol o por precipitación con sulfato amónico seguida de ultrafiltración, o mediante precipitación con polietilén glicol y posterior desalinización y separación por tamaño en una columna de poliacrilamida. El antígeno contiene fundamentalmente gp51, pero también puede contener p24. El antígeno se puede estandarizar para la glicoproteína gp51 por titulación con E4 del siguiente modo. Se preparan diluciones dobles de la preparación de antígeno. La dilución mayor que, probada contra el suero estándar E4 sin diluir, origina una línea de precipitación equidistante entre el antígeno y el suero, contiene una unidad. En la prueba se utilizan dos unidades de antígeno.

iii)

Suero control positivo: El control de suero positivo deriva de un animal infectado natural o experimentalmente (vacas u ovejas). La línea de precipitación formada entre los pocillos del antígeno y del suero control debe ser nítida y equidistante. Se debe incluir en la prueba una dilución del control de suero positivo que origine un resultado positivo débil como indicador de la sensibilidad de la prueba.

iv)

Suero control negativo: Se utiliza suero de animales no infectados (vacas u ovejas).

v)

Sueros problema: Sueros de cualquier especie animal.

•

Procedimiento de la prueba:

i)

El agar se licua calentándolo en un baño de agua hirviendo y se vierte en placas de Petri (15 ml por placa de Petri de 8,5 cm de diámetro). Las placas se dejan enfriar a 4ºC alrededor de 1 hora antes de

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Capítulo 2.3.4.  Leucosis bovina enzoótica

cortar en el agar los bloques de los pocillos. Se emplea un molde que origina una disposición hexagonal de seis pocillos alrededor de un pocillo central. Se pueden utilizar pocillos de varias dimensiones; un sistema adecuado emplea pocillos de 6,5 mm de diámetro con 3 mm de separación entre los pocillos. Para obtener mejores resultados, las placas deben usarse el mismo día que se preparan y cortan. ii)

El antígeno se coloca en el pocillo central de la disposición hexagonal y los sueros problema en los pocillos exteriores, alternados con suero control positivo. Debería preparase también un sistema control por placa con suero control positivo, suero control débilmente positivo y suero control negativo en lugar de los sueros problema.

iii)

Las placas se mantienen a temperatura ambiente (20-27ºC) en una cámara húmeda cerrada y se observan a las 24, 48 y 72 horas.

iv)

Interpretación de los resultados: Un suero problema es positivo si forma una línea de precipitación específica con el antígeno y es una línea de identidad con la del suero control. Un suero problema es negativo si no forma una línea específica con el antígeno y no refleja la línea del suero control. Pueden aparecer líneas inespecíficas que no convergen con las líneas formadas por el control positivo. Un suero problema es débilmente positivo si curva la línea del suero control hacia el pocillo del antígeno, sin formar una línea visible de precipitación con el antígeno. La reacción es dudosa si no puede interpretarse como positiva o negativa. La prueba no tiene validez si los controles no dan los resultados esperados. Los sueros que originan resultados dudosos o débilmente positivos pueden concentrarse y volverse a probar.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO En terneros jóvenes nacidos de madres infectadas con BLV, los anticuerpos maternos contra la gp51 del BLV son importantes como protección contra la infección por BLV (12). Sin embargo, varios experimentos en los que se ha utilizado BLV inactivado, células FLK fijadas e infectadas, o gp51 purificada indican que éstos antígenos solo inducen protección a corto plazo. También se ha comprobado que la vacunación del ganado con células vivas de una línea celular BL3, establecida a partir de un animal con leucosis bovina esporádica, solo provoca protección de corta duración. La naturaleza del antígeno que proporciona protección en estos casos se corresponde probablemente con un antígeno de transplante asociado al tumor (18). Las células ovinas que solo sintetizan los productos gp51 y gp30 del gen env y la principal proteína estructural p24, indujeron una respuesta serológica en el ganado bovino (1); el ganado resultó protegido después de vacunación repetida con estas células. La vacunación de ovejas con un virus vacunal recombinante que expresa la gp51 del BLV indujo protección (14). No obstante, la protección se desarrolló sin producción de niveles detectables de anticuerpos neutralizantes. Además, Portetelle et al. encontraron que los virus vacunales recombinantes protegían a las ovejas incluso en ausencia de anticuerpos anti-gp51 (15). Por consiguiente, se interpreta que la inmunidad mediada por células puede jugar un papel importante en la inmunidad protectora contra la infección por BLV. Se ha logrado la expresión de gp51 por virus recombinantes y por levaduras que contienen la secuencia del gen env del BLV. Estos sistemas provocan protección en ovejas (7). Pese a estos avances en el conocimiento, no existen todavía vacunas comercializadas para el control de la LBE.

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Capítulo 2.3.4.  Leucosis bovina enzoótica

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8.

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9.

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* * *

NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Leucosis bovina enzoótica (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar la página web de la OIE para una lista más actualizada: www.oie.int).

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CAPÍTULO 2.3.5.

RINOTRAQUEITIS BOVINA INFECCIOSA / VULVOVAGINITIS PUSTULAR INFECCIOSA

RESUMEN La rinotraqueitis bovina infecciosa/vulvovaginitis pustular infecciosa, causada por el herpesvirus 1 bovino (BHV1), es una enfermedad del ganado bovino doméstico y silvestre. El virus está distribuido por todo el mundo, pero se ha erradicado de Austria, Dinamarca, Finlandia, Suecia y Suiza, y otros países han iniciado programas de control. La enfermedad se caracteriza por síntomas clínicos del tracto respiratorio superior, como descargas nasales (muco) purulentas, y conjuntivitis. Los síntomas generales son fiebre, depresión, inapetencia, aborto y reducción de la producción de leche. El virus también puede infectar el tracto genital y originar vulvovaginitis pustular y balanopostitis. El análisis post-mortem revela rinitis, laringitis y traqueitis. La mortalidad es baja. Muchas infecciones siguen un curso subclínico. Las infecciones bacterianas secundarias pueden ocasionar una enfermedad respiratoria más grave. Identificación del agente: El virus se puede aislar de frotis nasales durante la fase aguda de la infección, y de varios órganos post-mortem. El examen post-mortem revela rinitis, laringitis y traqueitis. Para aislar el virus se utilizan varios tipos de cultivos celulares de origen bovino, como células secundarias de cultivos de pulmón o riñón, o la línea celular Madin-Darby de riñón bovino. A los 2-4 días el virus produce efecto citopático. Se identifica por métodos de neutralización o de detección de antígenos con sueros monoespecíficos o anticuerpos monoclonales. Los aislamientos de BHV1 se pueden subtipar por análisis del ADN con enzimas de restricción. Se han desarrollado métodos de detección del ADN vírico y la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa puede ser particularmente útil en estudios a partir de muestras de semen. Pruebas serológicas: Las pruebas utilizadas más ampliamente para la detección de anticuerpos son las de neutralización del virus y varios tipos de enzimoinmunoensayos (ELISAs). Los anticuerpos se pueden detectar en la leche con un método ELISA. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Se dispone de vacunas atenuadas y muertas. Las vacunas deben proteger clínicamente al ganado en caso de infección y reducir notablemente la liberación subsiguiente de virus. Las vacunas no deben producir enfermedad, aborto ni reacciones locales o sistémicas y deben ser genéticamente estables. En 1995, se consiguieron vacunas con un mutante deleccionado. El uso de una técnica gE ELISA permite distinguir entre ganado infectado y ganado vacunado con esas vacunas marcadas.

A. INTRODUCCIÓN La rinotraqueitis bovina infecciosa/ vulvovaginitis pustular infecciosa (RBI/VPI), causada por el herpesvirus bovino tipo 1(BHV1), es una enfermedad del ganado bovino doméstico y salvaje. El BHV1 es un miembro del género Varicellovirus de la subfamilia Alfaherpesvirinae, que pertenece a la familia Herpesviridae. El genoma vírico es ADN bicatenario que codifica para unas 70 proteínas, de las que se conocen 33 que son estructurales y hasta 15 que no son estructurales. Las glicoproteínas víricas, que se localizan en la envoltura superficial del virión, tienen un papel importante en la patogénesis y en la inmunidad. Por diferencias en el análisis del ADN con enzimas de restricción, el BHV1 se puede diferenciar en los subtipos 1.1 (infecciones respiratorias), 1.2

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Capítulo 2.3.5. — Rinotraqueitis bovina infecciosa/vulvovaginitis pustular infecciosa

(infecciones respiratorias y genitales) y 1.3 (infecciones neurológicas; BHV5), 2a y 2b (17). El virus del subtipo 2 parece menos virulento que el del subtipo 1 (7). Sin embargo, solo hay un tipo antigénico de BHV1. El nombre de la enfermedad indica los síntomas clínicos más destacables. Después de un período de incubación de 2-4 días, se evidencia una notable descarga nasal serosa, salivación, fiebre, inapetencia y depresión. En unos pocos días las descargas nasales y oculares cambian a mucopurulentas. Las lesiones necróticas en la nariz pueden progresar hasta formar úlceras y pústulas recubiertas por una seudomembrana que obstruye las vías respiratorias altas y conduce a una respiración bucal. La infección también puede producir aborto y una disminución de la producción de leche (10). Donde se practica la monta natural, la infección genital puede originar vulvovaginitis o balanopostitis. Éstas se caracterizan por lesiones necróticas ligeras o graves de la mucosa vaginal o prepucial. Después de la inseminación artificial con semen infectado, puede aparecer endometritis (12). En terneros infectados con HBV1, se desarrolla una enfermedad sistémica, con lesiones necróticas focales en las vísceras y posiblemente con una gastroenteritis pronunciada. Muchas infecciones siguen un curso subclínico (32). La meningoencefalitis parece ser el resultado de una infección por un herpesvirus relacionado, pero distinto, recientemente designado como BHV5 (27), aunque la infección por BHV1 también puede causar meningoencefalitis de forma esporádica. El BHV1 puede afectar a animales de cualquier edad, pero es más común en animales de edad superior a 6 meses. Los casos de enfermedad respiratoria o genital provocados por BHV1 sin complicaciones duran 5-10 días. Las infecciones bacterianas secundarias, por ejemplo con Pasteurella spp., pueden originar síntomas clínicos más graves debido a la afección de vías respiratorias más profundas. El virus penetra en el animal por la nariz y se replica con títulos altos en las membranas mucosas del tracto respiratorio superior y en las amígdalas. Después se disemina a las conjuntivas y por transporte por el axón de las neuronas alcanza el ganglio trigémino. En ocasiones se presenta un nivel bajo de viremia. En una infección genital, el BHV1 se replica en la membrana mucosa de la vagina o del prepucio, y se establece en forma latente en los ganglios sacros. El ADN del virus permanece en las neuronas de los ganglios, probablemente durante toda la vida del hospedador. El estrés, como el producido por el transporte o el parto, puede inducir la reactivación de la infección latente. El virus puede, por tanto, liberarse al medio de modo intermitente. La lesión primaria consiste en una necrosis focal de las membranas mucosas nasales, laríngeas, traqueales o genitales. Esta lesión es, probablemente, la secuela directa de la replicación del virus y su consiguiente efecto citopático (ECP). El animal reacciona con una respuesta inflamatoria intensa. Las lesiones se pueden unir formando grandes pústulas que muestran una infiltración masiva de leucocitos. Los leucocitos de la sangre periférica pueden contener BHV1 (9, 19). Una infección aguda por BHV1 produce apoptosis en las células linfoides (35). Cuando aparecen infecciones bacterianas secundarias, se puede desarrollar una neumonía. En fetos abortados, se presentan pequeños focos necróticos en diversos tejidos, particularmente en el hígado. Normalmente una infección induce una respuesta de anticuerpos y una respuesta inmune mediada por células en 7-10 días. La respuesta inmune parece durar toda la vida, aunque puede estar bajo los límites de detección de algunas pruebas. No obstante, la inmunidad protectora después de la infección no es duradera: el ganado puede reinfectarse. Los anticuerpos maternos se transfieren por el calostro a los terneros jóvenes que están, por consiguiente, protegidos contra la enfermedad ocasionada por el BHV1 (16). Estos anticuerpos maternos tienen una vida media de aproximadamente 3 semanas, pero en ocasiones se pueden detectar en animales de hasta 9 meses de edad, y raramente en animales más viejos. El virus se distribuye por todo el mundo, en paralelo con la distribución del ganado doméstico. Otros rumiantes se pueden infectar por el BHV1, pero probablemente no influyen en la extensión del BHV1 entre el ganado doméstico. No existen otros reservorios de BHV1 aparte de los rumiantes. No se conoce la dosis infectiva mínima del BHV1. Después de la infección, se detecta la liberación nasal de virus durante 10-14 días, con títulos 8 10 máximos de 10 -10 DICT50 (dosis infecciosa 50% cultivo tisular) por ml de secreción nasal. A distancias cortas es posible la transmisión aérea del BHV1 (15). El semen de un toro infectado puede contener BHV1 y el virus puede por tanto transmitirse por monta natural y por inseminación artificial (21). El control del BHV1 se basa en las medidas higiénicas normales de una granja. Idealmente, se impone al ganado de nueva adquisición un período de cuarentena de 2-3 semanas y solo el que sea seronegativo para BHV1 resulta admitido. En general, las vacunas evitan el desarrollo de síntomas clínicos graves y reducen la liberación del virus después de la infección, pero no evitan la infección. Solo se deben utilizar vacunas con eficacia y seguridad demostradas (ver Sección C). Se puede sospechar que la infección por BHV1 es la causa de la enfermedad por los síntomas clínicos, patológicos y epidemiológicos. Sin embargo, para hacer un diagnóstico definitivo, se necesita el examen de laboratorio. Un procedimiento de diagnóstico completo en el laboratorio trata de detectar el virus causante (o los componentes víricos) y los anticuerpos específicos que induce.

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Capítulo 2.3.5. —Rinotraqueitis bovina infecciosa/vulvovaginitis pustular infecciosa

B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO 1.

Identificación del agente

a)

Recogida y procesamiento de muestras Se recogen hisopos nasales de varios animales afectados (de cinco a diez) que estén en la primera fase de la infección. Este ganado todavía mostrará descargas nasales serosas en vez de mucopurulentas. En los casos de vulvovaginitis o balanopostitis toman hisopos de los genitales. Los hisopos deben frotarse vigorosamente contra las superficies mucosas. También se puede lavar el prepucio con solución salina y recoger el líquido de lavado. Las muestras se suspenden en medio de transporte (medio de cultivo de células que contenga antibióticos y 2-10% de suero fetal bovino para evitar la inactivación de los virus), se enfrían a 4ºC y se envían rápidamente al laboratorio. Durante la necropsia, se recogen para la detección del virus las membranas mucosas del tracto respiratorio y porciones de las amígdalas, pulmones y ganglios linfoides bronquiales. En casos de aborto, se examina el hígado fetal, los pulmones, el bazo, el riñón y un cotiledón placentario. Las muestras se deben enviar al laboratorio en hielo con la mayor rapidez posible. Después de su llegada al laboratorio, los hisopos se agitan en el medio de transporte para desprender el virus y se dejan a temperatura ambiente durante 30 minutos. Despues de extraer los bastoncillos se clarifica el medio de transporte por centrifugación a 1.500 g durante 10 minutos. Los tejidos se homogenizan para formar suspensiones al 10-20% (p/v) en medio de cultivo celular antes de centrifugar a 1.500 g durante 10 minutos. Los sobrenadantes de estas muestras se filtran a través de filtros de 0.45 µm y se utilizan para el aislamiento de virus. El aislamiento de virus a partir del semen requiere algunas adaptaciones particulares, porque el fluido seminal contiene enzimas y otros factores que son tóxicos para las células e inhiben la replicación vírica (ver más adelante).

b)

Aislamiento vírico Para aislar los virus, se pueden utilizar varios tipos de cultivos celulares. Resultan adecuadas las células primarias o secundarias de riñón de bovino, de pulmón o de testículos, las cepas celulares derivadas de pulmón fetal bovino, cornetes nasales o tráquea, y las líneas celulares establecidas, como la línea celular Madin-Darby de riñón bovino. Los cultivos celulares pueden cultivarse en tubos de vidrio o de plástico, en placas o discos. Cuando se utilizan placas de plástico de 24 pocillos, se inocula en estos cultivos celulares 100-200 µl de los sobrenadantes descritos anteriormente. Después de un período de absorción de 1 hora, se lavan los cultivos y se añade medio de mantenimiento. El suero empleado como suplemento del medio de mantenimiento debe estar libre de anticuerpos contra BHV1. Los cultivos celulares se observan diariamente para ECP, que normalmente aparece a los tres días de la inoculación. Se caracteriza por la agrupación de células redondeadas en forma de racimos que se juntan alrededor de un hueco en la monocapa; a veces, se pueden observar células gigantes con varios núcleos. Se requiere experiencia para reconocer esta apariencia característica. Si después de 7 días no aparece ECP, se debe realizar otro pase. El cultivo celular se congela y se descongela, se clarifica por centrifugación, y se usa el sobrenadante para inocular monocapas recién preparadas. Para identificar el virus que produce ECP como BHV1, el sobrenadante del cultivo debe neutralizarse con un antisuero monoespecífico contra BHV1 o con un anticuerpo monoclonal (MAb) neutralizante. Con este propósito, se llevan a cabo diluciones decimales del sobrenadante de prueba y se añade a cada dilución antisuero monoespecífico contra BHV1 o un suero negativo como control. Después de incubar a 37ºC durante 1 hora, se inoculan las muestras en un cultivo celular; a los 3-5 días se calcula el índice de neutralización. El índice de neutralización es el título del virus (en log10) en presencia del suero control negativo, menos el título del virus en presencia del antisuero específico. Si el índice de neutralización es mayor de 1.5, el aislado se considera BHV1. Para acortar el procedimiento de aislar el virus, se pueden inocular dos muestras en cultivo celular: una que se ha preincubado con antisuero monoespecífico y otra que se ha incubado con el suero control negativo. Si el antisuero monoespecífico inhibe el ECP, el aislado se considera BHV1. Un método alternativo de identificar el virus es la demostración directa de antígeno de BHV1 en las células próximas al ECP mediante una prueba de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa (11) con antisuero monoespecífico o con MAb conjugado.

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Capítulo 2.3.5. — Rinotraqueitis bovina infecciosa/vulvovaginitis pustular infecciosa

•

Aislamiento de virus del semen (Una prueba prescrita para el comercio internacional) Se deben probar al menos 0,05 ml de semen natural, con dos pases en cultivo celular. Para semen conservado, se debe hacer una aproximación que asegure que se examina el equivalente a 0,05 ml de semen natural. El semen fresco natural es generalmente citotóxico y debe prediluirse antes de añadirlo a los cultivos celulares. A veces surge un problema similar con el semen conservado. A continuación se expone un procedimiento adecuado de prueba. •

Procedimiento de la prueba

i)

Diluir 200 µl de semen fresco en 2 ml de suero bovino fetal (libre de anticuerpos contra BHV1) que contenga antibióticos.

ii)

Mezclar vigorosamente y mantener 30 minutos a temperatura ambiente.

iii)

Inocular 1 ml de la mezcla semen/suero en una monocapa de células susceptibles (ver arriba, aislamiento de virus) en una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos.

iv)

Incubar las placas 1 hora a 37ºC.

v)

Eliminar la muestra, lavar dos veces la monocapa con 5 ml de medio de mantenimiento, y añadir 5 ml de medio de mantenimiento a cada pocillo.

vi)

Incluir en la prueba controles negativos y positivos para BHV1. Tener mucho cuidado para evitar la contaminación de los pocillos de ensayo con el control positivo; por ejemplo, manejando siempre el control al final, y utilizando placas separadas.

vii)

Observar diariamente las placas al microscopio para aparición de ECP. Si aparece ECP, se realizan pruebas confirmativas para BHV1 por métodos de neutralización específica o de marcaje inmune (ver antes).

viii) Si después de 7 días no se observa ECP, los cultivos se congelan y se descongelan, se clarifican por centrifugación, y se utiliza el sobrenadante para inocular nuevas monocapas. ix)

c)

La muestra se considera negativa si no se evidencia ECP a los 7 días de incubación de los cultivos del nuevo pase.

Detección del antígeno vírico Los hisopos nasales, oculares o genitales se pueden extender directamente, en portaobjetos de vidrio o bien, después de centrifugar, se puede colocar en los portas el depósito celular (ver sección B.1.a.). Estos portaobjetos se someten a una prueba estándar de inmunofluorescencia directa o indirecta. En la prueba de inmunofluorescencia directa, el antisuero monoespecífico se conjuga con isotiocianato de fluoresceína, mientras que en el procedimiento indirecto es el segundo anticuerpo contra la inmunoglobulina bovina el que se conjuga al isotiocianato de fluoresceína. Para obtener los mejores resultados, se necesita muestrear varios animales procedentes de una población que presenten fiebre y una descarga nasal serosa ligera. Los frotis deben secarse al aire y se fijan con acetona dentro de las 24 horas. Los frotis de escobillones nasales del ganado bovino con descargas nasales mucopurulentas o hemorrágicas suelen ser negativos (28). La ventaja de esta técnica de detección de antígeno es que puede permitir el diagnóstico en el mismo día. Sin embargo, la sensibilidad de este procedimiento es menor que la del aislamiento del virus (5). En cada prueba se deben incluir controles positivos y negativos. El tejido recogido post-mortem se puede analizar para la presencia de antígeno de BHV1 por la prueba de inmunofluorescencia en secciones o cortes congelados. También se puede utilizar inmunohistoquímica. La ventaja es que se puede determinar la localización del antígeno. El uso de MAbs para detectar antígeno de BHV1 está creciendo, lo que conduce a un incremento de la especificidad de la prueba. Sin embargo, tales MAbs deben ser seleccionados cuidadosamente, ya que deben dirigirse contra epitopos conservados que estén presentes en todos los aislados de BHV1. Otra posibilidad para la detección rápida y directa de antígeno vírico es el uso de un enzimoinmunoensayo (ELISA). El antígeno se puede capturar por MAbs o por anticuerpos policlonales fijados a una fase sólida, generalmente el pocillo de una microplaca. Se necesitan cantidades de antígeno equivalentes a 104-105 DICT50 de BHV1 para obtener una tasa elevada de resultados positivos (4). Esto no resulta excesivamente elevado porque el ganado bovino puede excretar títulos de 108-109 DICT50/ml de fluido nasal a los 3–5 días de la infección. La sensibilidad se puede aumentar por sistemas de amplificación (ver la ref. 6 para un ejemplo). Las ventajas de los métodos de detección de antígeno frente a los de aislamiento de virus son que no se necesitan servicios de cultivos celulares y que se puede hacer un diagnóstico de laboratorio en 1 día. Las desventajas radican en la menor sensibilidad de la detección directa del antígeno y en la necesidad extra de realizar el aislamiento del virus, si se necesita el aislado para estudios posteriores.

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d)

Detección del ácido nucleico En la última década se han descrito varios métodos para demostrar la presencia del ADN del BHV1 en muestras clínicas, incluyendo la hibridación ADN-ADN y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El uso de la PCR en el diagnóstico rutinario está creciendo (18). En comparación con el aislamiento de virus, la PCR tiene la ventaja principal de que es más sensible y más rápida: puede realizarse en 1-2 días. También puede detectar ADN en ganglios sensoriales con infección latente (29). La desventaja es que es fácil de contaminar y por consiguiente hay que tomar medidas para evitar falsos resultados positivos. Hasta la fecha la PCR se ha utilizado principalmente para detectar ADN del BHV1 en muestras de semen infectado artificial (37) o naturalmente (29, 30). Los investigadores destacan que es importante optimizar cuidadosamente las condiciones de la prueba PCR, incluyendo la preparación de las muestras, la 2+ concentración de Mg , los cebadores y la polimerasa Taq, y los programas de ciclos. La región a amplificar debe estar presente en todas las cepas de BHV1 y la secuencia nucleotídica debe estar conservada. Se han utilizado los genes TK, gB, gC, gD y gE como dianas para la amplificación por PCR. Para distinguir entre el virus salvaje y el de cepas vacunales con el gen gE deleccionado se pueden utilizar PCRs basadas en la detección de las secuencias de gE (9, 26). Con la técnica de la PCR no es posible discriminar entre la infección con cepas IBR virulentas y la infección con otras cepas vivas atenuadas. Se han desarrollado PCRs que distinguen entre BHV1 y BHV5 (1, 25). Experimentalmente, la PCR resulta más sensible que el aislamiento de virus: detecta cinco veces más muestras positivas que el aislamiento de virus. Además, tiene un límite de detección de tan solo tres moléculas. Sin embargo, no se puede excluir la posibilidad de falsos resultados negativos. Para identificar posibles resultados falsos negativos se recomienda introducir un ADN molde de control interno en el tubo de reacción de la muestra del semen, que se amplifique con los mismos cebadores. Tal ADN molde de control se puede construir insertando, por ejemplo, un fragmento de 100 pares de bases en la región analizada. Este molde de control también hace posible semicuantificar la cantidad de ADN detectada (25, 29, 30). Antes de que se reconozca internacionalmente a la PCR como un instrumento de diagnóstico adecuado para el comercio internacional, deberá ser validada por una prueba comparativa entre diferentes laboratorios.

e)

Diferenciación de subtipos del herpesvirus bovino 1 Los subtipos 1 y 2b del BHV1 se pueden diferenciar por inmunofluorescencia, radioinmunoprecipitación, inmunoperoxidasa o pruebas de inmunotransferencia (24, 36). El análisis con endonucleasas de restricción permite diferenciar entre todos los subtipos reconocidos de BHV1 (17). El ADN se extrae primero de los viriones o de células infectadas, se digiere con endonucleasas de restricción, y los fragmentos que resultan se separan por electroforesis en gel de agarosa. El tamaño y el número de los fragmentos indican el subtipo del virus. Tales técnicas son de un valor diagnóstico limitado, pero pueden ser útiles en estudios epidemiológicos.

f)

Interpretación de los resultados El aislamiento del BHV1 de un animal no significa necesariamente que el virus sea la causa del brote de la enfermedad. Por ejemplo, puede ser un virus latente que se haya reactivado debido a condiciones de estrés. Se debe hacer un diagnóstico de laboratorio confirmativo con un grupo de animales, y debe estar acompañada de seroconversión de negativos a positivos o de un aumento en el título de anticuerpos contra BHV1 de cuatro veces o más. El ganado del que se recogen los frotis nasales se sangra dos veces, con 2-3 semanas de diferencia. Estas muestras de pares de sueros se examinan juntas en una prueba serológica para la presencia de anticuerpos específicos (ver Sección B.2).

2.

Pruebas serológicas

Las pruebas serológicas se pueden utilizar para diferentes fines: i)

Para diagnosticar una infección aguda: se examinan en una prueba muestras de suero de las fases agudas y de convalecencia de la infección en los mismos animales. Una seroconversión de negativos a positivos o un aumento de cuatro veces o más en el título de anticuerpos se considera que es indicativo de infección.

ii)

Para demostrar la ausencia de infección, por ejemplo, con relación al mercado internacional.

iii)

Para determinar la prevalencia de la infección en estudios seroepidemiológicos.

iv)

Para apoyar programas de erradicación y el control subsiguiente.

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v)

Para propósitos de investigación, por ejemplo, la evaluación de la respuesta de anticuerpos después de la vacunación y de una infección de desafío. Para detectar anticuerpos contra el BHV1 en el suero se emplean normalmente pruebas de neutralización vírica (NV) y varios ELISAs (13). Una prueba serológica alternativa es la inmunofluorescencia indirecta (33). Como la latencia del virus es una secuela normal de la infección por BHV1, la identificación de animales serológicamente positivos supone un indicador útil y fiable del estado infectivo. Cualquier animal con anticuerpos contra el virus se considera un portador y un potencial excretor intermitente del virus. Las únicas excepciones a esto son los terneros jóvenes que han adquirido de modo pasivo los anticuerpos por el calostro de sus madres y el ganado no infectado, vacunado con vacunas inactivadas. Los métodos ELISAs, incluyendo el gE-ELISA, se utilizan cada vez más para detectar anticuerpos en muestras de leche entera, pero presentan algunas limitaciones. Una prueba de leche negativa indica que menos del 20% de los adultos de la población lechera posee anticuerpos contra BHV1. Muchas vacas individuales seropositivas presentan un título de anticuerpos en la leche menor de 1/5. Este título puede ser variable, dependiendo del nivel de detección del ELISA utilizado. Por consiguiente, no es posible declarar que un grupo de animales o una población esté libre de infección por BHV1 basándose en pruebas con leche individual o colectiva, y una prueba de leche negativa debería continuarse con el análisis de muestras individuales de suero de todo el ganado de la explotación. A efectos de un control general, las pruebas en los tanques de leche entera pueden proporcionar una estimación de la prevalencia del BHV1 en una manada, un área o un país (20). Éstas deberían suplementarse con pruebas de suero (individual o colectivo) de explotaciones no lecheras.

a)

Neutralización de virus (una prueba prescrita para el comercio internacional) Las pruebas de NV se llevan a cabo con varias modificaciones. Las pruebas varían respecto de la cepa de virus utilizada en el protocolo de la prueba, la dilución inicial de suero, el período de incubación de la mezcla virus/suero (1-24 horas), el tipo de células utilizadas, el día de la lectura final, y la lectura de punto final (50% frente a 100%) (22). De estas variables, el período de incubación de la mezcla virus/suero posee el efecto más importante sobre el título de anticuerpos. Un período de incubación de 24 horas puede detectar títulos hasta 16 veces superiores que un período de incubación de 1 hora (2), y se recomienda cuando se requiere la máxima sensibilidad (por ejemplo, a efectos del mercado internacional). En la prueba de NV resulta adecuado utilizar varias células bovinas o líneas celulares, incluyendo células secundarias de riñón o de testículo de bovino, estirpes celulares de pulmón de bovino o de células de la tráquea, o la línea celular establecida de Madin-Darby de riñón bovino. A continuación se indica un protocolo adecuado para una prueba de NV. i)

Inactivar los sueros, incluidos los sueros control estándar, durante 30 minutos en un baño de agua a 56ºC.

ii)

Preparar diluciones dobles de los sueros de prueba en medio de cultivo celular. Comenzar con suero no diluido y continuar horizontalmente hasta la dilución 1/1024 en una placa de microtitulación de grado de cultivo celular, con 96 pocillos de fondo plano. Utilizar por lo menos dos pocillos por dilución y 50 µl por pocillo. En la prueba también se incluyen diluciones de un suero control positivo, de un positivo débil y de un control negativo. Se utiliza un pocillo adicional con suero sin diluir como control de toxicidad de los sueros.

iii)

Añadir a cada pocillo 50 µl del stock de BHV1 diluido en medio de cultivo de modo que suponga 100200 DICT50 por pocillo. En los pocillos de control de toxicidad, añadir 50 µl de medio de cultivo en lugar de virus. Añadir 100 µl de medio de cultivo a diez pocillos vacíos para control de las células.

iv)

Hacer por lo menos cuatro diluciones decimales del stock residual de virus (re-titulación) en medio de cultivo, 50 µl por pocillo y al menos cuatro pocillos por cada dilución.

v)

Incubar las placas durante 18-24 horas a 37ºC.

vi)

Añadir 100 µl por pocillo de la suspensión celular a razón de 3 x 10 células por pocillo.

vii)

Incubar las placas durante 3-5 días a 37ºC.

4

viii) Leer microscópicamente las placas para ECPs. Validar la prueba comprobando la re-titulación del virus (que debería dar un valor de 100 DICT50, con una variación permisible de 30-300 DICT50), los sueros control y los pocillos de control de células. El suero control positivo debería dar un título de + 1 dilución doble (+ 0.3 unidades logarítmicas decimales) respecto a su valor. El suero positivo débil debería ser positivo. El suero negativo no debería producir neutralización cuando se prueba sin diluir (equivalente a una dilución final de ½ en la fase de neutralización). En los pocillos de control de células, la monocapa debería estar intacta.

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ix)

b)

Los resultados de la prueba sobre el suero se expresan como el inverso de la dilución del suero que neutraliza el 50% de los pocillos. Si en el 50% de los pocillos con suero no diluido se neutralizó el virus, el título (de la dilución inicial) se considera 1 (1/2 utilizando la dilución final convencional). Si todos los pocillos con suero no diluido y el 50% de los pocillos con suero diluido a 1/2 mostraran neutralización del virus, el título (de la dilución inicial) sería 2 (dilución final 1/4). Para resultados cualitativos, cualquier neutralización de título 1 o superior (dilución inicial convencional) se considera positiva. Si se observa citotoxicidad en los pocillos de control de la toxicidad del suero, la muestra se describe como tóxica (sin resultado), a menos que se observe neutralización del virus sin citotoxicidad a diluciones más altas y se pueda establecer un título sin ambigüedad. Cuando existe citotoxicidad con un suero del que resulta crítico obtener un resultado, el cambiar el medio en los pocillos de las diluciones más bajas 16-24 horas después de añadir las células puede eliminar el efecto citotóxico con muchos sueros problema.

Enzimoinmunoensayo (una prueba prescrita para el comercio internacional) Los métodos ELISAs para detectar anticuerpos contra BHV1 parecen estar reemplazando gradualmente las pruebas NV. No se ha establecido un procedimiento ELISA estándar. Hay disponibles varios tipos de ELISA, incluyendo ELISAs indirectos y de bloqueo. Los procedimientos indirectos son los de uso más común. Existen diversas preparaciones comerciales ELISA, muchas de las cuales son también adecuadas para detectar anticuerpos en la leche. Por razones de estandarización en un país o estado, sería deseable comparar la calidad de las preparaciones comerciales y probar cada lote respecto a criterios definidos previamente en un laboratorio nacional de referencia, antes de su uso en otros laboratorios del país. Existen ciertas variaciones en los procedimientos para ELISA. Los más comunes son: las preparaciones de antígenos y los recubrimientos, la dilución de la muestra de ensayo, el período de incubación del antígeno y la muestra de ensayo, y la solución de substrato/cromógeno. Antes de su uso rutinario, un ELISA debería validarse respecto a sensibilidad, especificidad y reproducibilidad. Con este fin, se debería probar un juego de sueros bien definidos (por ejemplo, mediante la prueba NV) que fueran muy positivos, débilmente positivos y negativos. •

Enzimoinmunoensayo indirecto

A continuación se presenta un ejemplo de procedimiento para un ELISA indirecto:

520

i)

Preparar el antígeno haciendo crecer BHV1 en cultivos celulares. Cuando se observa que se ha desarrollado ECP, se congela el medio y las células a -20ºC. Después de descongelar, el lisado celular resultante se centrifuga durante 4 horas a 8.500 g. El precipitado que contiene el virus se resuspende en un pequeño volumen de solución salina tamponada con fosfato (PBS), se enfría con hielo, y se rompe en un desintegrador ultrasónico. Después, la preparación de antígeno se centrifuga 10 minutos a 800 g y el sobrenadante se utiliza a una dilución apropiada para recubrir las placas. En la literatura publicada sobre el tema se pueden encontrar muchos métodos alternativos de producción de antígeno.

ii)

Recubrir con antígeno los pocillos de la placa de microtitulación añadiendo 100 µl de antígeno diluido (en 0,05 M de tampón carbonato, pH 9.6) a cada pocillo de la microplaca. Cerrar las placas con cinta, incubar a 4ºC toda la noche o a 37ºC durante 1-2 horas, y guardar a -20ºC.

iii)

Antes de realizar la prueba, lavar las placas. Para evitar uniones inespecíficas en la prueba, que originan niveles altos de fondo, se puede necesitar un segundo recubrimiento con una proteína no relevante (por ejemplo, albúmina). Añadir tampón, la muestra de suero, y los controles de sueros positivo, débilmente positivo y negativo. Normalmente las muestras de suero se diluyen de 1/10 a 1/100 en PBS con 0,05% de Tween 20. Agitar, sellar las placas e incubar durante 1 hora a 37ºC.

iv)

Lavar las placas cuidadosamente, añadir inmunoglobulina anti-bovina conjugada con peroxidasa de rábano a una dilución predeterminada e incubar de nuevo 1 hora a 37ºC.

v)

Añadir una solución recién preparada de substrato/cromógeno (por ejemplo, tampón 0,1 M de citrato fosfato, pH 4, que contenga 2, 2´-azino-bis-[3-etilbenzotiazolina-6 ácido sulfónico]). 2NH4 [ABTS; 0,5 mg/ml] y una solución al 3% de H2O2 recién añadido [2 µl/ml], e incubar por un tiempo apropiado.

vi)

Medir la absorbancia de las placas en un fotómetro de microplacas a la longitud de onda adecuada.

vii)

Una muestra de ensayo se considera positiva si tiene un valor de absorbancia 0,2 veces mayor que el control de suero negativo. La prueba es válida si los sueros positivo y débilmente positivo son positivos y si el suero negativo tiene un valor de absorbancia menor de 0,2. Las pruebas no válidas deben repetirse. Los límites aceptables para los valores control y de corte deben determinarse para el ensayo individual.

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•

Enzimoinmunoensayo de bloqueo

El principio del ELISA de bloqueo o competitivo se basa en bloquear la unión del antígeno a un antisuero contra BHV1 o a un MAb anti-BHV1 marcado con una enzima, mediante los anticuerpos presentes en la muestra de prueba. La presencia de anticuerpos en la muestra de prueba bloqueará la unión, originando un descenso en el desarrollo del color después de añadir la solución de cromógeno/substrato. Una comparación entre ELISAs indirectos y ELISAs bloqueantes mostró que el último tipo es por lo general más sensible (22): Recientemente, se han descrito gE-ELISAs que se pueden utilizar juntamente con vacunas marcadoras para detectar el ganado infectado en poblaciones vacunadas (31, 34). En una prueba gEELISA, la leche puede reemplazar al suero (34).

c)

Estandarización En cada prueba serológica se deberían incluir controles adecuados de suero muy positivo, de suero débilmente positivo, y de suero negativo. En Europa, un grupo de científicos encabezado por el grupo de veterinarios de inseminación artificial de la Unión Europea (EU) ha acordado recientemente utilizar un suero muy positivo, uno débilmente positivo y otro negativo para la estandarización de las pruebas sobre BHV1 en los laboratorios que examinan rutinariamente muestras de centros de inseminación artificial (23). Estos sueros se han adoptado como estándares internacionales de la OIE para pruebas con BHV1 y están 1 disponibles en los Laboratorios de Referencia de la OIE para RBI/VPI . Las pruebas ordenadas con fines de mercado internacional (NV o ELISA) deben ser capaces de registrar como positivos tanto los estándares positivos fuertes como los débiles (o los estándares nacionales secundarios de potencia equivalente).

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO En la actualidad se dispone de varias vacunas con BHV1 atenuado e inactivado. Las vacunas contienen cepas de virus que por lo general han crecido durante múltiples pases en cultivo celular. Algunas de las cepas de virus vacunales tienen un fenotipo sensible a la temperatura, es decir, no se multiplican a 39ºC o a temperaturas superiores. Las vacunas atenuadas se administran intranasalmente o intramuscularmente. Las vacunas inactivadas contienen altos niveles de virus inactivados o porciones de las partículas víricas (glicoproteínas) suplementadas con un adyuvante para estimular una respuesta inmune adecuada. Las vacunas inactivadas se administran intramuscularmente o subcutáneamente. En varios países existen vacunas marcadoras. Estas vacunas marcadoras, atenuadas o inactivadas, se basan en mutantes deleccionados o en una subunidad del virión, por ejemplo, la glicoproteína D. El uso de tales vacunas marcadoras con pruebas diagnósticas paralelas permite distinguir entre el ganado infectado y el ganado vacunado suministrando así las bases para nuevos programas de erradicación del BHV1. Los programas de vacunación intensiva pueden reducir la prevalencia de animales infectados (3, 14), que puede ser analizada por pruebas diagnósticas en paralelo. En situaciones donde resulte económicamente justificable, los animales infectados restantes podrían ser eliminados si fuera necesario, lo que resultaría en una región libre de BHV1. Algunos países han apoyado recientemente tal programa de erradicación y ya no permiten la vacunación. Las directrices para la producción de vacunas veterinarias se presentan en el Capítulo I.1.7. Principios de producción de vacunas veterinarias. Las normas dadas aquí y en la Capítulo I.1.7. pretenden ser de naturaleza tipo general y se pueden suplementar con requisitos nacionales y regionales.

1.

Control de inóculos

a)

Características del inóculo La vacuna se prepara utilizando un sistema de lotes de inóculo. Se debe documentar el origen, la historia de los pases y las condiciones de mantenimiento del inóculo primario de virus (MSV). En el MSV se debe realizar una prueba de identidad del virus. El lote de inóculo contiene cepas de BHV1 que se han atenuado para originar una cepa viva vacunal. Las cepas se pueden atenuar por pases múltiples en cultivo celular, por adaptación del virus a crecer a bajas temperaturas (mutantes sensibles a la temperatura), o mediante ingeniería genética, por ejemplo seleccionando uno o más genes del virus que no sean esenciales para su replicación. Debería haber algún medio de distinguir entre el virus vivo vacunal y el virus natural (por ejemplo, mediante modelos de crecimiento específico dependientes de la temperatura, o por análisis del polimorfismo en fragmentos de restricción). Las cepas utilizadas para la preparación de las vacunas inactivadas no necesitan ser atenuadas. El lote de inóculo debe carecer de contaminantes.

1

Se pueden obtener del Central Institute for Animal Disease Control, Infectious Diseases Section, P.O. Box 2004, 8203 AA Lelystad, The Netherlands, y de AFSSA Lyon, Laboratoire de pathologie bovine, 31 avenue Tony Garnier, BP 7033, 69342 Lyon Cedex 07, Francia.

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b)

Método de cultivo Las células utilizadas para la producción de vacunas se preparan también mediante un sistema de lotes de inóculo. El virus debe cultivarse en líneas celulares establecidas que se haya comprobado que resultan adecuadas para producción de vacunas, por ejemplo la línea celular de Madin-Darby de riñón bovino. Se debe conocer la historia de la línea celular. Debe estar libre de agentes indeseables y puede probarse para capacidad oncogénica.

c)

Validación como vacuna Cualquiera que sea el método de preparación del lote de inóculo del virus vacunal, el lote de virus de siembra destinado para su incorporación a una vacuna viva debe ser eficaz, seguro y puro. i)

Eficacia Se debe demostrar en un experimento de desafío de la vacunación en condiciones de laboratorio. Se presentan varios ejemplos de normas en una monografía de la Farmacopea Europea (8). En resumen, se administra la vacuna a cinco terneros seronegativos para BHV1, de 2-3 meses de edad. Se mantienen dos terneros como control. Todos los terneros se inoculan intranasalmente 3 semanas después con una cepa virulenta de BHV1 que origina los síntomas típicos de la enfermedad. Los terneros vacunados no deben mostrar síntomas o solamente síntomas suaves. El título máximo de virus en la mucosa nasal de los terneros vacunados debe ser por lo menos 100 veces inferior al de los terneros control. El período de excreción del virus debe ser al menos 3 días más corto en los terneros vacunados que en los terneros control.

ii)

Inocuidad Una cantidad de virus equivalente a diez dosis de vacuna debería (a) no inducir reacciones localizadas o sistémicas significativas en terneros jóvenes, (b) no causar infección fetal o aborto, y (c) no revertir a la forma virulenta durante cinco pases seriados en terneros. Para una vacuna inactivada, se suele administrar generalmente una dosis doble. La prueba de reversión a la virulencia no es aplicable a las vacunas inactivadas.

iii)

Pureza El lote de inóculo se prueba para ausencia de virus extraños y para ausencia de contaminación con bacterias, hongos y micoplasmas. En las vacunas con BHV1 se deben excluir específicamente los siguientes virus indeseables: adenovirus, virus de Akabane, coronavirus bovino, herpesvirus bovino tipos 1, 2, 4 y 5, parvovirus bovino, virus respiratorio sincitial de los bóvidos, rotavirus bovino, virus vaccinia, y los virus de la enfermedad de Aujeszky, lengua azul, fiebre efímera bovina, leucemia bovina, papiloma bovino, estomatitis popular bovina, diarrea vírica bovina, viruela vacuna, fiebre aftosa o glosopeda, enfermedad nodular cutánea, fiebre catarral maligna, parainfluenza 3, rabia, peste bovina, y estomatitis vesicular. Como el virus de la diarrea vírica bovina se ha encontrado con frecuencia como contaminante de las vacunas, se debe tener especial cuidado para asegurar que está ausente.

2.

Método de fabricación

Todas las substancias utilizadas en la producción de las vacunas deben estar libres de contaminación. Se deben utilizar células que no tengan más de 20 pases a partir del inóculo inicial de células. El virus de inóculo no debería de tener más de 5 pases a partir del MSV. Las cepas de virus vacunales obtenidas por ingeniería genética se tratan del mismo modo que las cepas atenuadas por métodos convencionales. Cuando se crecen suficientes células, se produce la infección de la línea celular con el virus de la vacuna. La adición de antibióticos se reserva, por lo general, al medio líquido de cultivo. El sobrenadante se recoge cuando la producción de virus (antígeno) alcanza el máximo. Para las vacunas vivas, el sobrenadante se clarifica, se mezcla con un estabilizador, se liofiliza y se envasa. Para la producción de vacunas clásicas inactivadas, el sobrenadante se homogeniza antes de añadir el agente inactivante para asegurar una inactivación adecuada. Después del proceso de inactivación se lleva a cabo una prueba para comprobar la inactivación completa del virus. La prueba consiste en efectuar al menos dos pases en células. La suspensión de virus inactivados se mezcla después con un adyuvante y se envasa. La producción de vacunas debe seguir las directrices de Buenas Prácticas de Producción (GMP).

3.

Control interno

El inóculo de células de trabajo y el inóculo de virus de trabajo deben estar libres de contaminación. Las células deben tener su morfología normal antes de inocular el virus. Se comprueban para ECP durante el cultivo. Las células control no inoculadas deben mantener su morfología hasta el tiempo de la recogida del material. Se realiza una titulación del virus en el sobrenadante recogido. Durante la producción de vacunas inactivadas, se realizan pruebas que aseguran la inactivación. El material final debe ser probado para ausencia de contaminantes.

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4.

Control de lotes

Normalmente se realizan las siguientes pruebas en cada lote. Se pueden encontrar ejemplos de normas para realizar el control de lotes en las directrices de la EU, la Farmacopea Europea y el Código de Regulaciones Federales del Departamento de Agricultura de los EE.UU.

a)

Esterilidad No deben estar presentes bacterias, hongos, micoplasmas ni virus ajenos. Las pruebas de esterilidad y de ausencia de contaminación en los materiales biológicos se describen en el Capítulo I.1.5.

b)

Inocuidad Una dosis doble de vacuna, para el caso de vacunas inactivadas, y una dosis diez veces superior a la normal, para el caso de vacunas vivas, no debe producir efectos adversos en terneros jóvenes que sean seronegativos para BHV1.

c)

Potencia Es suficiente probar un lote representativo para eficacia, como se describe en la Sección C.1.c.i. Para vacunas vivas, se debe determinar el título de virus de cada lote y no debe ser superior a 1/10 de la dosis a la que la vacuna es segura ni inferior al título mínimo de distribución. Para vacunas inactivadas, la potencia se ensaya utilizando otro método validado, por ejemplo la determinación de la eficacia en terneros.

d)

Duración de la inmunidad Es suficiente probar este parámetro en el lote de inóculo del virus de la vacuna. Una vacuna eficaz con BHV1 debería inducir una inmunidad protectora por lo menos durante 1 año, aunque muchas vacunas existentes no han sido probadas al respecto.

e)

Estabilidad Para vacunas vivas, se deben realizar titulaciones de virus pasados 3 meses de la fecha de caducidad que se indica. Además, se realizan pruebas para determinar el contenido en humedad, concentración de conservantes y pH. Para vacunas inactivadas, también se prueba la viscosidad y la estabilidad de la emulsión.

f)

Conservantes Debe demostrarse la eficacia de los conservantes y comprobarse su concentración y persistencia durante el período de validez. La concentración debe acomodarse a los límites de conservante establecidos.

g)

Precauciones (riesgos) No se necesitan precauciones especiales. El BHV1 no es patógeno para el hombre.

5.

Pruebas sobre el producto final

a)

Inocuidad Cada producto debe ser seguro por lo menos en dos terneros susceptibles que reciban una dosis doble de vacuna (vacunas inactivadas) o diez veces superior (vacunas vivas).

b)

Potencia Ver Sección C.4.c.

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Capítulo 2.3.5. —Rinotraqueitis bovina infecciosa/vulvovaginitis pustular infecciosa

3.

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4.

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8.

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9.

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Capítulo 2.3.5. — Rinotraqueitis bovina infecciosa/vulvovaginitis pustular infecciosa

23. PERRIN B., CALVO T., CORDIOLI P., COUDERT M., EDWARDS S., ELOIT M., GUERIN B., KRAMPS J.A., LENIHAN P., PASCHALERI E., PERRIN M., SCHON J., VAN OIRSCHOT J.T., VANOPDENBOSCH E., W ELLEMANS G., W IZIGMANN G. & THIBIER M. (1994). Selection of European Union standard reference sera for use in the serological diagnosis of infectious bovine rhinotracheitis. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 13, 947–960. 24. RIJSEWIJK F.A., KAASHOEK M.J., LANGEVELD J.P., MELOEN R., JUDEK J., BIENKOWSKA-SZEWCZYK K., MARISVELDHUIS M.A. & VAN OIRSCHOT J.T. (1999). Epitopes on glycoportein C of bovine herpesvirus-1 (BHV-1) that allow differentiation between BHV-1.1 and BHV-1.2 strains. J. Gen. Virol., 80, 1477–1483. 25. ROS C., RIQUELME M.E., OHMAN FORSLUND K. & BELAK S. (1999). Improved detection of five closely related ruminant alphaherpesviruses by specific amplification of viral genome sequences. J. Virol. Methods, 83, 55–65. 26. SCHYNTS F., BARANOWSKI E., LEMAIRE M. & THIRY E. (1999). A specific PCR to differentiate between gE negative vaccine and wildtype bovine herpesvirus type 1 strains. Vet. Microbiol., 66, 187–195. 27. STUDDERT M.J. (1994). Bovine herpesvirus. En: Encyclopedia of Virology, Webster R.G. & Granoff A., eds. Academic Press, London, UK, 155–158. 28. TERPSTRA C. (1979). Diagnosis of infectious bovine rhinotracheitis by direct immunofluorescence. Vet. Q., 1, 138–144. 29. VAN ENGELENBURG F.A.C., MAES R.K., VAN OIRSCHOT J.T. & RIJSEWIJK F.A.M. (1993). Rapid and sensitive detection of bovine herpesvirus type 1 in bovine semen by a polymerase chain reaction based assay. J. Clin. Microbiol., 31, 3129–3135. 30. VAN ENGELENBURG F.A.C., VAN SCHIE F.W., RIJSEWIJK F.A.M. & VAN OIRSCHOT J.T. (1995). Excretion of bovine herpesvirus 1 in semen is detected much longer by PCR than by virus isolation. J. Clin. Microbiol., 33, 308– 312. 31. VAN OIRSCHOT J.T., KAASHOEK M.J., MARIS-VELDHUIS M.A., W EERDMEESTER K. & RIJSEWIJK F.A.M. (1997). An enzyme-linked immunosorbent assay to detect antibodies against glycoprotein gE of bovine herpesvirus 1 allows differentiation between infected and vaccinated cattle. J. Virol. Methods, 67, 23–34. 32. VAN OIRSCHOT J.T., STRAVER P.J., VAN LIESHOUT J.A.H., QUAK J., W ESTENBRINK F. & VAN EXSEL A.C.A. (1993). A subclinical infection of bulls with bovine herpesvirus type 1 at an artificial insemination centre. Vet. Rec., 132, 32–35. 33. W ELLEMANS G. & LEUNEN J. (1973). La rhinotrachéite infectieuse des bovins et sa serologie. Ann. Med. Vet., 117, 507–512. 34. W ELLENBERG G.J., VERSTRATEN E.R.A.M., MARS M.H. & VAN OIRSCHOT J.T. (1998). Detection of bovine herpesvirus 1 glycoprotein E antibodies in individual milk samples by enzyme-linked immunosorbent assays. J. Clin. Microbiol., 36, 409–413. 35. W INKLER M.T.C., DOSTER A. & JONES C. (1999). Bovine herpesvirus 1 can infect CD4+ T lymphocytes and induce programmed cell death during acute infection of cattle. J. Virol., 73, 8657–8668. 36. W YLER R., ENGELS M. & SCHWYZER M. (1989). Infectious bovine rhinotracheitis/vulvovaginitis (BHV1). En: Herpesvirus Diseases of Cattle, Horses and Pigs, Wittmann G., ed. Kluwer Academic Publishers, Boston, USA, 1–72. 37. XIA J.C., YASON C.V. & KIBENGE F.S.B. (1995). Comparison of dot blot hybridisation, polymerase chain reaction, and virus isolation for detection of bovine herpesvirus-1 (BHV-1) in artificially infected semen. Can. J. Vet. Res., 59, 102–109.

* * *

NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Rinotraqueitis bovina infecciosa/vulvovaginitis pustular infecciosa (ver Cuadro en la parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar la página web de la OIE para una lista actualizada: www.oie.int)

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CAPÍTULO 2.3.6.

TRICOMONOSIS1

RESUMEN La tricomonosis bovina venérea está causada por Trichomonas foetus, un protozoo flagelado. Presenta una distribución mundial y en cierta ocasión mostró una enorme importancia económica como causa de aborto e infertilidad, especialmente en vacas lecheras. En las áreas del mundo donde está ampliamente distribuido el uso de la inseminación artificial, la prevalencia se encuentra muy reducida, aunque todavía presenta importancia en rebaños de vacas para carne o en otras circunstancias donde no se utiliza la inseminación artificial. La transmisión de la enfermedad tiene lugar primariamente mediante el coito, aunque también puede tener lugar la transmisión mecánica mediante instrumentos de inseminación o el examen del aparato genital. El microorganismo puede sobrevivir a 5 ºC en semen completo o diluido. Los toros constituyen el reservorio principal de la enfermedad ya que tienden a ser portadores a largo plazo, mientras que la mayoría de las vacas eliminan la infección espontáneamente. Por estas razones, normalmente se prefieren las muestras procedentes de toros para llevar a cabo el diagnóstico y control de la enfermedad. Identificación del agente: Trichomonas foetus es un protozoo piriforme eucarióta, flagelado, de aproximadamente 8-18 µm de largo y 4-9 µm de ancho, con tres flagelos anteriores y uno posterior, y una membrana ondulante. Los microorganismos se desplazan con un movimiento rotatorio entrecortado y se observan en pruebas de cultivo de muestras prepuciales de toros infectados y lavados vaginales o mucus cervico vaginal de las vacas infectadas, o, a veces, en los fetos abortados. Los microorganismos pueden cultivarse in-vitro, y pueden observarse en un portaobjetos húmedo o teñido. El método de diagnóstico estándar para los toros implica la recogida, examen y cultivo del esmegma del prepucio y el pene. El esmegma se puede recoger de diferentes maneras, incluyendo el lavado prepucial o el rascado de la cavidad prepucial y el glande del pene a nivel del fórnix con una pipeta de inseminación seca. Existen una variedad de medios 2 de cultivo in-vitro, aunque, más recientemente, se ha introducido una prueba de cultivo campo disponible comercialmente que permite el crecimiento de los tricomonas y el examen microscópico directo. Pruebas alternativas: La infección también puede detectarse mediante la reacción de amplificación en cadena de la polimerasa (PCR). En el pasado se ha utilizado como prueba para rebaños una reacción de aglutinación empleando mucus recogido a partir del cervix y un antígeno preparado a partir de microorganismos cultivados. De manera similar se ha utilizado una prueba intradérmica empleando un precipitado del organismo con ácido tricloroacético. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Se encuentra disponible comercialmente una vacuna de células enteras muertas parcialmente eficaz bien como vacuna 3 monovalente, o como parte de una vacuna polivalente que contiene Campylobacter y Leptospira .

1

2 3

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Nomenclatura de las enfermedades parasitarias: ver la nota en el Capítulo 2.3.15. Tripanosomiasis (transmitida por la mosca tse-tse). Ensayo InPouchTM, BioMed Diagnostics, San José, California, Estados Unidos de América (EEUU). Trich Guard o Trich Guard V5-L, Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, Iowa, EEUU.

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Capítulo 2.3.6. — Tricomonosis

A. INTRODUCCIÓN La tricomonosis bovina venérea está causada por el protozoo flagelado Trichomonas foetus. Los hospedadores naturales de T. foetus son el ganado vacuno (Bos taurus, B. Indicus). En el intestino del ganado bovino se encuentran especies no patógenas de tricomonas; T. suis de los cerdos es indistinguible morfológicamente, serológicamente y genéticamente de T. foetus. Trichomonas foetus es piriforme, con 8-18 µm de largo y 4-9 µm de ancho, con tres flagelos anteriores y uno posterior y una membrana ondulante. Los microorganismos vivos se desplazan con un movimiento rotatorio entrecortado y pueden detectarse mediante microscopía visible. Pueden utilizarse la microscopía de contraste de fases o campo oscuro u otros métodos para observar los detalles necesarios para la identificación. Las descripciones morfológicas detalladas, incluidos los estudios de microscopía electrónica, han sido publicados por Warton & Honigberg (47). Es importante diferenciar T. foetus de otros protozoos flagelados contaminantes que pueden encontrarse presentes en el tracto reproductor bovino (3, 6, 33, 45). Una característica importante es el número de flagelos observados bajo iluminación de contraste de fases, ya que puede ayudar a diferenciar T. foetus de algunos flagelados bovinos que parecen similares. Se ha descrito una técnica de tinción que puede utilizarse para observar más claramente la morfología (25). El microorganismo se multiplica mediante fisión binaria longitudinal; no existe reproducción sexual y no se han observado estadios del parásito resistentes al medio ambiente. En unos primeros estudios se reconocieron tres serotipos basados en la aglutinación (42): la cepa “belfast”, descrita como predominante en Europa, Africa y EEUU (23); la cepa “brisbane” en Australia (12); y la cepa “manley”, que ha sido descrita solamente en algunos brotes (42). Poco trabajo más se ha realizado en este campo. Necesita realizarse más trabajo en el área de comparar las características de crecimiento, la variación genética y antigénica y la patogénesis de los aislados de T. foetus de diferentes zonas antes de que pueda realizarse la designación de “cepa” y “serotipo” con garantías. Los microorganismos pueden cultivarse in vitro, preferiblemente en medio de Diamond (10), medio de Clausen (28) o medio de Trichomonas, el cual se encuentra disponible comercialmente (40). En EEUU se ha desarrollado una prueba de cultivo de campo que permite el crecimiento de los tricomonas y el examen microscópico directo TM sin aspiración del inóculo (41, 46) (InPouch TF, ver nota al pie 2). La transmisión de la infección en condiciones naturales tiene lugar a través del coito, mediante inseminación artificial o mediante el examen del aparato genital de las vacas. El lugar de la infección en los toros es principalmente la cavidad prepucial (1, 35), y se observan pocas o ninguna manifestaciones clínicas. En los toros mayores de 3-4 años raramente tiene lugar la recuperación espontánea y el toro se convierte en una fuente permanente de infección. En los toros menores de 3-4 años la infección puede ser transitoria. Los microorganismos están presentes en número pequeño en la cavidad prepucial de los toros, con alguna concentración en el fórmix y alrededor del glande del pene (20). El toro infectado crónicamente no muestra lesiones patentes. En la vaca, la lesión inicial es una vaginitis, que puede continuar en los animales gestantes con la invasión del cervix y el útero. Pueden aparecer varias secuelas, incluyendo una placentitis que lleva a un aborto prematuro (1-16 semanas), flujo uterino y piometra. En algunos casos, la gestación no finaliza con el aborto a pesar de la infección y nace un ternero normal a término. En cuanto al rebaño, las vacas presentan estros irregulares, flujo uterino, piometra y aborto prematuro (1, 15, 42). Generalmente, la vaca se recupera y después de la infección o el aborto se hace inmune, al menos durante esa temporada de cría (1, 15, 44).

B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO 1.

Identificación del agente

a)

Identificación del agente mediante examen directo del cultivo (el ensayo prescrito para el comercio internacional ) El diagnóstico provisional de la tricomonosis se basa en la historia clínica, síntomas de aborto prematuro, revisiones repetidas, o ciclos de celo irregulares. La confirmación depende de la demostración de los microorganismos en el líquido placentario, el contenido estomacal de los fetos abortados, los lavados uterinos, el flujo piometral o el mucus vaginal. En los rebaños contaminados, el material más fiable para el diagnóstico son los lavados prepuciales o vaginales, o los raspados (24, 29, 31, 41). En Europa Occidental, las Directivas de la Unión Europea (UE) requieren la recogida de lavados prepuciales, o, en el caso de los animales hembra, una prueba de aglutinación de mucus vaginal (13).

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Capítulo 2.3.6. — Tricomonosis

El número de microorganismos varía en dependencia con diferentes situaciones. Son numerosos en los fetos abortados, en el útero se mantienen varios días después del aborto y en las vacas infectadas recientemente, son muy abundantes en el mucus vaginal 12-20 días después de la infección. A partir de entonces el número de microorganismos varía de acuerdo con la fase del ciclo del celo, siendo el más elevado 3-7 días después de la ovulación. Los microorganismos de T. foetus están presentes en el toro infectado en un número muy alto en la mucosa del prepucio del pene, aparentemente sin invadir los tejidos submucosos. Generalmente, se recomienda dejar pasar 1 semana después de la última revisión antes de tomar una muestra prepucial.

•

Recogida de muestras Se han descrito varias técnicas para recoger muestras prepuciales de los toros o muestras vaginales de las vacas. Es importante evitar la contaminación fecal, ya que se pueden introducir protozoos intestinales que pueden confundirse con T. foetus (45). La contaminación de las muestras debería minimizarse eliminando el material externo y los pelos sucios de alrededor del orificio prepucial o de la vulva; sin embargo, debe evitarse la limpieza del área, concretamente con desinfectantes, ya que puede disminuir la sensibilidad del diagnóstico. En los toros pueden recogerse las muestras raspando la mucosa prepucial y del pene con una pipeta de inseminación artificial (31, 41) o una escobilla metálica (30, 31), mediante lavado prepucial (41), o lavando la vagina artificial después de la recogida del semen (19). Esta última técnica no es recomendable ya que su sensibilidad puede ser menor (19). Las muestras de vacas se recogen mediante lavado de la vagina o raspando el cérvix con una pipeta de inseminación artificial o una escobilla metálica (24, 27). Cuando las muestras deben enviarse a un laboratorio y no pueden recogerse en 24 horas, debería emplearse un medio de transporte (por ejemplo medio de Winters, solución tamponada salina con suero bovino fetal al 5%, o leche desnatada, con o sin antibióticos [37] o en tioglicolato [5]), o la bolsa plástica de cultivo de campo (5, 46). Los microorganismos deben protegerse durante el transporte de la exposición a la luz y de las temperaturas extremas, las cuales deberían permanecer por encima de los 5ºC y por debajo de los 38ºC (5).

•

Cultivo Deberían prepararse cultivos cuando los microorganismos son demasiado escasos para una detección directa y una identificación precisa. Normalmente es necesario el cultivo de los microorganismos porque, en la mayoría de los casos, el número de microorganismos no es suficientemente grande para hacer un diagnóstico positivo mediante un examen directo. Pueden utilizarse varios medios. Los medios elegidos son el medio CPLM (cisteína/peptona/infusión de hígado y maltosa), el medio BGPS (extracto de carne/glucosa/peptona y suero), el medio de Clausen (Neopeptna-Lemco-extracto de hígado y glucosa), medio Diamond para tricomonas, medio Oxoid para Trichomonas y los sistemas de cultivo comerciales (11, 28, 32, 40). La inoculación de las muestras en los medios de cultivos debería realizarse lo antes posible después de la recogida. Es necesario procesar la muestra mediante centrifugación en las muestras recogidas mediante lavado prepucial. Entonces se examina el sedimento y se inocula en medios de cultivo. También es importante asegurarse de que los medios de cultivo se utilicen antes de la fecha establecida de caducidad, ya que muchos medios no son estables. La calidad del agua empleada es importante, y puede añadirse a los medios un antifúngico para controlar el crecimiento de los hongos. La detección inicial de los microorganismos puede realizarse mediante microscopía de campo claro, en un portaobjetos húmedo preparado directamente a partir de la muestra o el cultivo, o a través de la pared TM TM (sistema InPouch TF, ver nota al pie 2) utilizando el alfiler de plástico plástica del InPouch proporcionado especialmente, o los microorganismos pueden verse en un microscopio de campo claro estándar utilizando un aumento de 100 o superior. Puede ser útil un microscopio invertido para examinar los tubos que contienen medio de cultivo (de Diamond). Los medios de cultivo deberían examinarse microscópicamente después de la inoculación en intervalos desde el día 1 al día 7 (26). Los microorganismos pueden identificarse en base a los rasgos morfológicos característicos. Los microorganismos con forma de pera tienen tres flagelos anteriores y uno posterior, y una membrana ondulante que se extiende cerca del extremo posterior de la célula. También tienen un axostilo que normalmente se extiende más allá del extremo posterior de la célula. La microscopía de contraste de fases es muy valiosa para revelar estos rasgos, o también puede emplearse un procedimiento de tinción desarrollado recientemente (25). Ambas técnicas funcionan bien cuando se encuentran presentes un número relativamente alto de microorganismos, especialmente la técnica de tinción.

•

Procedimientos de cultivo •

Medio de Diamond modificado

El material de vidrio utilizado para el cultivo debería lavarse en agua destilada (evitando el empleo de detergentes). El medio de Diamond modificado consiste en: 2 g de tripticasa de peptona, 1 g de extracto de

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Capítulo 2.3.6. — Tricomonosis

levadura, 0,5 g de maltosa, 0,1 g de clorhidrato de L-cisteína, y 0,02 g de ácido L-ascórbico; y se lleva hasta 90 ml con agua destilada que contiene, de cada uno, 0,08 g de K2HPO4 y KH2PO4, y se ajusta hasta pH 7,2 -7,4 con hidróxido sódico o ácido clorhídrico. Después de la adición de 0,05 g de agar, el medio se autoclava durante 10 minutos a 121 ºC, se deja enfriar hasta los 49ºC, y entonces se añaden asépticamente 10 ml de suero bovino inactivado (inactivado mediante calentamiento hasta 56ºC durante 30 minutos), 100.000 unidades de penicilina G cristalizada y 0,1g de sulfato de estreptomicina. El medio se reparte asépticamente en alicuotas de 10 ml en viales estériles de 16 x 125 mm con tapón de rosca, y se refrigeran a 4ºC hasta su uso. Los medios deberían cultivarse hasta 7 días y las muestras examinarse en intervalos diarios (1, 26). La incorporación de agar en el medio limita a los microorganismos contaminantes en su mayoría a la porción superior del tubo del ensayo, mientras que ayuda a mantener las condiciones microaerófilas en el fondo del tubo, donde los tricomonas se encuentran en grandes cantidades. •

Ensayo de cultivo de campo (InPouchTM TF)

Cuando se requiere una combinación de comodidad y sensibilidad puede utilizarse una prueba de cultivo de TM campo (sistema InPouch TF) (1, 4, 32, 41, 46). Consiste en una bolsa de plástico transparente y flexible con dos cámaras. La cámara superior contiene un medio especial en el que se introduce la muestra. Las muestras de campo para la inoculación directa se recogerían normalmente mediante la técnica de raspado prepucial (1, 41). Las muestras recogidas mediante lavado prepucial requieren centrifugación antes de introducir el sedimento en la cámara superior. Después de mezclar, el medio se introduce en la cámara inferior, y entonces la bolsa se sella y se incuba a 37ºC. El examen microscópico de los tricomonas puede realizarse directamente a través de la bolsa plástica (4). Los resultados del diagnóstico con muestras de TM toros utilizando bien el medio de Diamond o el sistema InPouch TF han mostrado que los dos métodos ofrecen resultados comparables o que hay algunas ventajas (en comodidad y resultados en el ensayo) con TM el sistema InPouch TF (4, 5, 24, 32, 41). •

Sensibilidad y especificidad globales del ensayo de cultivo e identificación

Cualquier estimación de la sensibilidad y especificidad diagnóstica del ensayo de cultivo e identificación dependerá de la eficacia en la recogida de la muestra, el manejo y el procesamiento, así como la TM composición y calidad del medio de cultivo. Se ha estimado que la sensibilidad del sistema InPouch TF en los toros es de un 92% (95% de intervalo de confianza, 84-96%) (31). Para el Diamond y otros medios relacionados las estimaciones han sido variables, debido posiblemente a la variación en la composición y la preparación, aunque oscilan entre el 78% y el 99%. Hasta hace poco se ha asumido que la especificidad del ensayo de cultivo era del 100%, pero se trata probablemente de una sobreestimación. Cada muestra tomada a partir de un toro en concreto que se sabe que está infectado no dará necesariamente un resultado de cultivo positivo. Incluso con las condiciones óptimas de muestreo, transporte, cultivo e identificación, debería obtenerse más de una muestra negativa antes de que exista una certeza razonable de que el animal no está infectado. Deberían calcularse valores de predicción negativos utilizando una estimación de la sensibilidad del ensayo de diagnóstico, y la probabilidad de infección preensayo del animal (31), para estimar la probabilidad de que un animal no se encuentre infectado. Existen pocas estimaciones de la sensibilidad de diagnóstico de la muestra estándar y el método de cultivo con las muestras de las hembras. La infección en las hembras se elimina normalmente entre 90-95 días, de manera que puede ser difícil aislar microorganismos a partir de animales en fases tardías de su infección. En vacas jóvenes infectadas experimentalmente, se consiguió una sensibilidad aparente del 88% a lo largo de un periodo de TM 10 semanas después de la infección utilizando el método de cultivo InPouch TF (24). El diagnóstico de un aborto inducido por T. foetus puede ser relativamente fácil cuando se recupera un feto abortado, debido al gran número de microorganismos demostrable en el contenido abomasal del feto o en los líquidos de la placenta. Además, pueden utilizarse técnicas inmunohistoquímicas en los fetos abortados para demostrar microorganismos de T. foetus invasores de tejidos.

b)

Reacción en cadena de la polimerasa Las técnicas moleculares que utilizan la tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) han sido aprovechadas para la identificación de T. foetus (14, 21). El desarrollo de un ensayo diagnóstico de PCR ofrece varias ventajas potenciales, incluyendo una sensibilidad analítica aumentada, un tiempo de diagnóstico más rápido, y el hecho de que los microorganismos de la muestra recogida no necesitan ser viables. Investigaciones iniciales (14, 21) demostraron que los cebadores de ADN son capaces de detectar un número muy bajo de parásitos a partir de cultivos de laboratorio del organismo, sin la presencia de material prepucial. Sin embargo, en las muestras prepuciales se requiere un número más elevado de parásitos para proporcionar un resultado positivo del PCR; ello es debido probablemente a la inhibición por

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Capítulo 2.3.6. — Tricomonosis

componentes del esmegma prepucial. Se han descrito varias técnicas de extracción del ADN (14, 21, 34), y es probable que la sensibilidad del ensayo diagnóstico se encontrará influida por la eficiencia del método de extracción, y los procedimientos para superar a los inhibidores contaminantes. Se ha estimado que la TM sensibilidad diagnóstica de los ensayos de PCR es similar a la del sistema de cultivo InPouch TF (14, 21). Sin embargo, se han analizado demasiado pocas muestras a partir de una población pequeña de toros infectados como para establecer un cálculo firme de la sensibilidad. La especificidad de diagnóstico del ensayo de PCR depende de la especificidad de los cebadores. Un grupo de cebadores (21) originó productos no específicos de tamaño similar en aproximadamente un tercio de las muestras control negativo. Una pareja de cebadores basados en la secuencia 5.8s del rRNA han demostrado una buena especificidad de diagnóstico en muestras de animales negativos (14), aunque se necesita más trabajo con estos cebadores empleando diferentes poblaciones de animales. Estos cebadores rinden productos de amplificación a partir de algunos flagelados cercanos y relacionados (Trichomonas suis, T. monilensis, y un tricomonas de los gatos) que son indistinguibles de los de T. foetus (14, 18). Es posible que algunas de estas especies sean sinónimos de T. foetus. Un trabajo reciente ha demostrado que estos cebadores pueden utilizarse para distinguir entre T. foetus y tricomonas que no son T. foetus, y que a veces se encuentran en muestras prepuciales (3, 6, 33). Las técnicas basadas en el ADN tienen potencial como un ensayo primario o auxiliar (3, 6, 14, 29, 34). Aunque esta tecnología representa una esperanza en la investigación, es necesario realizar más trabajos para evaluar y validar su aplicación en el diagnóstico clínico de las infecciones por T. foetus, antes de sustituir al método de cultivo como el ensayo diagnóstico rutinario.

2.

Ensayos alternativos

En los años 40 se desarrollaron pruebas de aglutinación de mucus e intradérmicos, y todavía encuentran un uso limitado, aunque restringen su utilidad problemas de sensibilidad y especificidad. Se están desarrollando actualmente otros ensayos inmunológicos basados en el enzimoinmunoensayo (ELISA) (1, 17). Las técnicas inmunohistoquímicas que utilizan anticuerpos monoclonales han puesto de manifiesto microorganismos de T. foetus en tejidos fijados con formaldehído (38).

a)

Prueba de aglutinación de mucus En los años 40 se desarrolló una prueba de aglutinación de mucus (23, 26) que detecta aproximadamente un 60% de las vacas infectadas de forma natural, con niveles de anticuerpos que varían de acuerdo con la fase del estro. Las muestras del mucus se recogen a partir de la región cervical de la vagina, preferiblemente unos pocos días después del estro. Los anticuerpos aparecen en el mucus cervical aproximadamente 6 semanas después de la infección, y persisten durante varios meses. Los anticuerpos también se pueden encontrar en las secreciones prepuciales (39, 43). El ensayo de aglutinación del mucus es más útil como un ensayo de rebaño, siendo capaz de detectar infecciones latentes o eliminadas recientemente. Es específico y no da reacción cruzada con Campylobacter foetus o Brucella abortus, aunque carece de sensibilidad. Para tomar la muestra cervical debería utilizarse un tubo de cristal de 30 cm de longitud, 9 mm de diámetro, y doblado en un ángulo de 150ºC a aproximadamente 9 cm de un extremo, o una pipeta de inseminación artificial. No debería utilizarse aquel mucus que contenga sangre, y el animal debería muestrearse de nuevo. El suero contiene anticuerpos no específicos y hará que tenga lugar la aglutinación. El mucus se diluye 1/5 con suero fisiológico salino y se emulsiona en un tubo de Griffith. Se preparan muestras por duplicado diluidas 1/10 y 1/20, pipeteando 2 ml de mucus y 2 ml de agar fundido (56ºC en un baño con agua) en los tubos para la dilución 1/10, y 1ml de mucus, 1 ml de tampón salino y 2 ml de agar fundido para la dilución 1/20. También se preparan controles por duplicado que contienen 2 ml de tampón salino y 2 ml de agar fundido. Todos los tubos se mantienen durante la mezcla en un baño con agua a 56ºC y entonces se vierten individualmente en placas de Petri de 5 cm y se dejan enfriar. El antígeno para el ensayo se prepara añadiendo lentamente un cultivo de tricomonas a una mezcla 2/1 de tampón salino y glucosa al 1% para alcanzar una concentración de aproximadamente 100.000 microorganismos/ml (aproximadamente seis tricomonas/campo del microscopio a x400). A continuación, se añaden 1,5 ml de antígeno a cada placa de Petri, y las placas se incuban durante 1,5 horas a 37ºC, y se dejan a temperatura ambiente durante 1,5 horas más. Se considera positiva la aglutinación a una dilución de 1/10.

b)

Ensayo intradérmico “Tricin” Se ha descrito un ensayo intradérmico para el diagnóstico de tricomonosis bovina (22). El lugar de inyección es en la piel del cuello, parecido al lugar que se utiliza en la prueba de la tuberculina. Se inyecta intradérmicamente una dosis de 0,1 ml del antígeno “Tricin” y la reacción se mide 30-60 minutos más tarde. La reacción consiste en un halo superficial que se observa visualmente y muestra un incremento >2 mm en el grosor de la piel.

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Capítulo 2.3.6. — Tricomonosis

c)

Inmunohistoquímica en tejidos En el feto abortado no existen lesiones específicas macroscópicas o microscópicas, y para realizar el diagnóstico es necesaria la identificación de los microorganismos. Se ha descrito una técnica inmunohistoquímica para detectar T. foetus en la placenta y pulmones fetales de abortos bovinos fijados con formaldehído e incluidos en parafina empleando un anticuerpo monoclonal (Mab) (38). La tinción 4 inmunohistoquímica se realiza utilizando un sistema de marcaje con estreptavidina/biotina disponible comercialmente y un Mab (34.7C4.4) frente a T. foetus. En el protocolo, secciones de 4 µm desparafinadas se incuban con el anticuerpo después de bloquear con un suero de cabra no inmune. Después de tres lavados en tampón las secciones se incuban durante 30 minutos a 37ºC con inmunoglubulina biotinilada de cabra anti-ratón y anti-conejo. Después de tres lavados adicionales en tampón, la estreptavidina marcada con peroxidasa se aplica durante 30 minutos a 37ºC, y la actividad enzimática se diluye con AEC (3-amino9-etilcarbazol) al 3% en N,N dimetilformamida. Las secciones se tiñen por contraste con hematoxilina Gill II durante 3 minutos, se lavan y se aclaran en tampón durante 1 minuto. Este método se ha utilizado para diagnosticar abortos causados por T. foetus.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO Las vacunas de células completas para vacas han mostrado ofrecer protección, y se encuentran disponibles comercialmente (9) bien como una “bacterina” monovalente, o como parte de una vacuna polivalente que también contiene Campylobacter y Leptospira spp. (vacuna CL) (1) (ver nota al pie 3). Estos productos muestran eficacia en la hembra pero no en el toro (2). Este resultado contrasta con los primeros estudios en Australia en los cuales se consiguió la protección o incluso la eliminación en toros que recibieron fracciones de membrana o glicoproteína de T. foetus (7, 8). Se han puesto de manifiesto anticuerpos específicos en el suero y el mucus vaginal de vacas jóvenes inoculadas con una vacuna que contiene T. foetus (17). En este estudio, una vacuna de células muertas parcialmente efectiva no previno la infección, pero pareció permitir la desaparición de la infección en hembras vacunadas antes del momento de la gestación en que el feto se encuentra generalmente en un mayor riesgo de aborto. Se están buscando más vacunas efectivas que hagan uso de antígenos superficiales de membrana de T. foetus , y presentan el potencial de una vacuna recombinante (9, 16). La vacuna de células enteras se produce cultivando T. foetus (cultivo VMC-84) en medio modificado de Diamond (9), y congelando el cultivo a –20ºC durante 60 minutos. Después de descongelar se añade una suspensión de 5 7 x 10 microorganismos/ml en tampón salino fosfato a la vacuna CL.

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4

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* * *

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CAPÍTULO 2.3.7.

ANAPLASMOSIS BOVINA

RESUMEN La anaplasmosis bovina es consecuencia de la infección con Anaplasma marginale. Se conoce desde hace tiempo una segunda especie, A. centrale. No está claro si representa una verdadera especie separada. Anaplasma marginale es responsable de casi todos los brotes de la enfermedad clínica. El microorganismo se clasifica en el género Anaplasma, que pertenece a la familia Anaplasmataceae del orden Rickettsiales. Genéticamente, A. marginale encaja dentro del genogrupo II de las Ehrlichiae. Los signos característicos de la anaplasmosis son anemia e ictericia, pero la enfermedad clínica solo se puede confirmar por identificación del organismo. Una vez infectado, el ganado puede permanecer toda la vida como portador, y la identificación de estos animales depende de la detección de anticuerpos específicos mediante pruebas serológicas o del ADN de las rickettsias mediante técnicas de amplificación. Identificación del agente: El examen microscópico de sangre o de frotis de órganos con tinción de Giemsa es el método más común para identificar Anaplasma en animales con infección clínica. En estos frotis, A. marginale aparece dentro de los eritrocitos como cuerpos densos y redondeados de 0.3-1.0 µm de diámetro, la mayor parte de ellos situados en la zona marginal del eritrocito o en su proximidad. Anaplasma centrale es aparentemente similar, pero la mayor parte de los microorganismos se sitúan lejos del margen del eritrocito. En algunos países existen colorantes comerciales que permiten una tinción rápida de Anaplasma. Es importante que los frotis se hagan bien y estén exentos de material extraño. Los frotis de material de ganado vivo deberían prepararse, con preferencia, de sangre obtenida de la vena yugular o de algún otro gran vaso. En el caso de diagnosis post-mortem, los frotis deben proceder de órganos internos (incluyendo hígado, riñón, corazón y pulmones) y de la sangre retenida en vasos periféricos. Esto último es particularmente deseable si el estado de descomposición, después de la muerte, es avanzado. Pruebas serológicas: Las pruebas serológicas más utilizadas han sido la fijación del complemento (FC) y las pruebas de aglutinación en placa. Sin embargo, datos recientes confirman que la prueba FC presenta una sensibilidad baja (20%) que resulta inaceptable para la identificación de ganado con infección persistente. Por consiguiente la prueba FC debe considerarse como una prueba poco fiable para certificar el estado de animales individuales. Para la detección de animales portadores se ha demostrado que un enzimoinmunoensayo competitivo (C-ELISA), disponible comercialmente, presenta una sensibilidad muy mejorada (96%). También pueden utilizarse pruebas ELISA indirectas, ELISA puntuales y de inmunofluorescencia indirecta. Se han utilizado pruebas experimentales basadas en el ácido nucleico, que son capaces de detectar la presencia de una infección de bajo nivel en ganado portador y en las garrapatas que actúan como vectores. Cuando se utilizan para el diagnóstico pruebas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa está justificada una cierta precaución, ya que se necesita una reacción combinada para identificar portadores de bajo nivel y puede tener lugar una amplificación inespecífica. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: En varios países se usan vacunas vivas para proteger el ganado contra la infección por A. marginale. La vacuna que contiene A. centrale es de uso más amplio y confiere protección contra cepas virulentas de A. marginale.

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Capítulo 2.3.7. — Anaplasmosis bovina

Se dispone de vacuna contra Anaplasma centrale en forma refrigerada y congelada. El control de calidad es muy importante ya que pueden estar presentes en el ganado donador otros agentes transmisibles por la sangre que pueden contaminar las vacunas y tener una diseminación amplia. Por esta razón se recomienda la vacuna congelada que permite un control de calidad posterior a la producción, lo que limita el riesgo de contaminación con otros patógenos. Las vacunas contra Anaplasma centrale no son completamente seguras. Una recomendación práctica es limitar su uso, en la medida de lo posible, a terneros, pues la inmunidad inespecífica reducirá el riesgo de algunas reacciones vacunales que pueden requerir tratamiento con tetracicilina o imidocarb. La inmunidad parcial se desarrolla en 6-8 semanas y dura varios años después de una única vacunación.

A. INTRODUCCIÓN Los brotes de anaplasmosis bovina se deben normalmente a la infección por Anaplasma marginale. Anaplasma centrale produce una anemia moderada, pero los brotes en el campo son muy raros. En algunos aislamientos de A. marginale se han descrito estructuras adicionales asociadas con los cuerpos de Anaplasma (17); aunque este parásito se ha denominado A. caudatum, no se considera como una especie separada. Anaplasma marginale se presenta en la mayor parte de los países tropicales y subtropicales, y en algunas regiones más templadas. Anaplasma centrale se describió por vez primera vez en Sudáfrica. Desde entonces el organismo ha sido importado en otros países –incluyendo Australia y algunos países de Sudamérica, Sudeste asiático y Oriente Medio- para ser utilizado como vacuna contra A. marginale. Las especies de Anaplasma se consideraron en principio como protozoos parásitos, pero la investigación posterior reveló que no poseían atributos que justificaran esta descripción. Desde 1957 se han clasificado en la familia Anaplasmataceae del orden Rickettsiales. Recientemente se ha propuesto una reorganización de la familia, que en el pasado incluía los géneros Anaplasma, Aegyptianella, Haemobartonella y Eperythrozoon (31), basándose en una combinación del análisis de secuencias del ARN ribosómico 16 S, de groesI, y del gen de la proteína superficial (6,37). En la familia Anaplasmataceae reorganizada se incluye toda la subdivisión alfa de Proteobacterias que pertenecen a los géneros Ehrlichia, Anaplasma, Cowdria, Wolbachia y Neorickettsia, reteniendo provisionalmente a Aegyptianella. Además, el género Anaplasma se ha ampliado hasta incluir Ehrlichia phagocytophila, Ehrlichia bovis y Ehrlichia platys, con la nueva designación de Anaplasma phagocytophila que incluye tanto Ehrlichia equi como la Ehrlichia del “agente HGE”. Los géneros Haemobartonella y Eperythrozoon se consideran en la actualidad más próximos a los micoplasmas. Las especies de Anaplasma se trasmiten mecánica o biológicamente por insectos vectores. Una revisión basada en un estudio cuidadoso de experimentos de transmisión presenta una lista de 14 garrapatas diferentes que han sido descritas como capaces de transmitir experimentalmente A. marginale (13). Éstas son: Argas persicus, Ornithodoros lahorensis, Boophilus annulatus, B. decoloratus, B. microplus, Dermacentor albipictus, D. andersoni, D. occidentalis, D. variabilis, Hyalomma excavatum, Ixodes ricinus, Rhipicephalus bursa, R. sanguineus and R. simus. Los autores concluyeron que algunos de estos resultados, como los de R. bursa, H. excavatum y O. lahorensis no son muy convincentes y que las garrapatas identificadas como A. persicus eran probablemente A. sanchezi o A. radiatus. Además, Rhipicephalus e. evertsi y Hyaloma m. rufipes se han descrito como vectores experimentales en Sudáfrica (28). La transmisión intra o interespecífica es común, incluso en las especies de Boophilus de un solo hospedador. Las garrapatas macho pueden ser particularmente importantes como vectores .La demostración experimental de la implicación de un vector no implica necesariamente que tenga un papel en la transmisión en condiciones de campo. Sin embargo, las especies de Boophilus son claramente vectores importantes de la anaplasmosis en países tales como Australia o Sudáfrica, y algunas especies de Dermacentor son vectores eficaces en los Estados Unidos de América (USA). Otros artrópodos picadores muy diversos se han considerado como vectores mecánicos, particularmente en USA. Se ha demostrado la transmisión experimental con ciertas especies de Tabanus (mosca del caballo) y con mosquitos del género Psorophora (30). La importancia de los insectos picadores en la transmisión natural de la anaplasmosis no está bien documentada y parece variar mucho de una región a otra. Anaplasma marginale puede transmitirse también con facilidad durante la vacunación contra otras enfermedades, a menos que se utilice una aguja nueva o esterilizada para inyectar a cada animal. Se ha descrito una transmisión similar por medio de instrumentos quirúrgicos no esterilizados. Los principales vectores de A. centrale parecen ser garrapatas de hospedadores múltiples, propias de África, como R. rimus. No se ha demostrado que la garrapata común de los bóvidos (B. microplus) sea un vector. Esto es importante porque A. centrale se utiliza como vacuna en regiones infestadas por B. microplus.

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Capítulo 2.3.7. — Anaplasmosis bovina

B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO Los síntomas clínicos más marcados de la anaplasmosis son anemia e ictericia, la última con aparición tardía en la enfermedad. No se presenta hemoglobinemia ni hemoglobinuria, lo que puede ayudar al diagnóstico diferencial entre anaplasmosis y babesiosis, que a menudo es endémica en las mismas regiones. No obstante, la enfermedad solo se puede confirmar por identificación del microorganismo causante.

1.

Identificación del agente

Las muestras obtenidas a partir de ganado vivo deben incluir frotis finos de sangre y sangre recogida con anticoagulante. Los frotis finos de sangre, secados con aire, se mantienen de modo satisfactorio a temperatura ambiente por lo menos 1 semana. Las muestras de sangre con coagulante deberían mantenerse a 4ºC a menos que se lleve al laboratorio en unas pocas horas. Esta muestra es útil para preparar frotis frescos si los anteriores no fueran satisfactorios. Además un cierto volumen pequeño de células y/o un recuento de eritrocitos puede ayudar a poner de manifiesto la implicación de Anaplasma cuando en los frotis se detecta solo un número pequeño de parásitos, como puede ocurrir en la fase de recuperación de la enfermedad. En contraste con Babesia bovis, Anaplasma no se acumula en los capilares, de modo que es apropiada la sangre de la yugular u otro gran vaso. Debido a la morfología poco diferencial de Anaplasma, es esencial que los frotis estén bien preparados y libres de substancias extrañas, pues las partículas de restos pueden confundir la el diagnóstico. Las extensiones gruesas de sangre, que se utilizan en el diagnóstico de la babesiosis, no son apropiadas para el diagnóstico de la anaplasmosis, porque Anaplasma es difícil de identificar una vez que se separa de los eritrocitos. Las muestras obtenidas de animales muertos deben ser frotis finos, secados al aire, del hígado, riñón, corazón y pulmones y de un vaso sanguíneo periférico. Éste último se recomienda, en particular, si hay un retraso notable antes del examen post-mortem porque, en tales circunstancias, la contaminación bacteriana en los frotis de los órganos puede conducir a una identificación equívoca de Anaplasma. Los frotis de cerebro, que son útiles en el diagnostico de algunas formas de babesiosis, no tienen valor directo en el diagnóstico de la anaplasmosis (14), aunque deberían incluirse para el diagnóstico diferencial cuando sea pertinente. Para la preparación de frotis se requiere la sangre de órganos, mejor que los tejidos de los órganos per se, porque el objetivo es ser capaz de examinar microscópicamente eritrocitos intactos para la presencia de Anaplasma. Los frotis derivados de sangre de órganos se mantienen satisfactoriamente durante varios días a temperatura ambiente (14). Los frotis de sangre y de los órganos se fijan 1 minuto con metanol absoluto y se tiñen con 10% de colorante de Giemsa durante 30 minutos. Después de la tinción, los frotis se lavan tres o cuatro veces con agua de grifo para eliminar el colorante adherido y luego se secan al aire. Los frotis se examinan con aceite de inmersión a un aumento de 700-1.000 x. En los frotis teñidos con Giemsa, A. marginale aparece como cuerpos densos, redondeados y muy coloreados dentro de los eritrocitos, de aproximadamente 0,3-1,0 µm de diámetro. La mayor parte de estos cuerpos se localizan en el margen del eritrocito o en su proximidad. Esta característica diferencia A. marginale de A. centrale, presentando en este último caso los microorganismos una localización más centrada en el eritrocito. 1 En algunos países , se dispone de colorantes comerciales para tinción rápida de Anaplasma. El porcentaje de eritrocitos infectados varía según la fase y la gravedad de la enfermedad. Con A. marginale pueden presentarse parasitemias máximas que superan el 50%. Durante los períodos de alta parasitemia, son comunes las infecciones múltiples de eritrocitos individuales. La infección se hace microscópicamente visible en 2-6 semanas después de la transmisión. Durante la enfermedad clínica, la parasitemia se duplica aproximadamente cada día hasta los 10 días, y luego decrece a una velocidad similar. Puede persistir durante algunas semanas una anemia muy fuerte después de que los parásitos lleguen a ser virtualmente indetectables en los frotis. Después de la recuperación de la infección inicial, la mayor parte del ganado permanece con infección latente durante el resto de su vida. Para detectar Anaplasma en frotis realizados post-mortem se puede utilizar la tinción con anticuerpos fluorescentes como una técnica alternativa. Johnston et al. (14) han descrito un procedimiento de inmunofluorescencia directa para el diagnóstico post-mortem de anaplasmosis. Aunque parece ser más sensible que la tinción con Giemsa, la fluorescencia inespecífica es un problema importante.

1

536

Los colorantes rápidos incluyen Camco-Quick y Diff-Quick, Baxter Scientific Products, McGaw Park, Illinois, USA y Hema 3 y Hema-Quick, Curtin-Matheson, Houston, Texas, USA.

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Capítulo 2.3.7. — Anaplasmosis bovina

Un procedimiento costoso, pero en ocasiones justificable para confirmar la infección, particularmente en ganado con infección latente, consiste en inocular sangre del animal sospechoso en un ternero esplenectomizado (sin bazo). Se inocula intravenosamente una cantidad (hasta 500 ml) de la sangre del donador con anticoagulante en el ternero esplenectomizado, y luego se examinan frotis de sangre al menos cada 2-3 días. Si el donador está infectado, se observará Anaplasma en los frotis del ternero esplenectomizado, por lo general, en 4 semanas, aunque este período puede prolongarse a 8 semanas. Las pruebas basadas en los ácidos nucléicos para detectar A. marginale en ganado portador son de desarrollo reciente (8, 9, 11, 12, 33). Se ha descrito una sonda radiactiva de ARN que detectó parasitemias tan bajas como 0,000025% (8). Las garrapatas infectadas también se han identificado utilizando una sonda para ADN clonado (13). La sensibilidad analítica de métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se ha estimado en 0,0001% de eritrocitos infectados, pero a este nivel solo se detectaría una parte del ganado portador (9, 11). Recientemente se ha utilizado una técnica PCR combinada que es sensible y potencialmente específica para identificar ganado portador de A. marginale (33). Esta técnica es capaz de identificar niveles de menos de 30 eritrocitos infectados por ml de sangre, lo que equivale a una parasitemia de aproximadamente 0,000001%, que está bien por debajo de los niveles más bajos en los portadores (33). No obstante, la PCR combinada plantea serios problemas de control de calidad para un uso rutinario (33). Los laboratorios que emplean esta prueba deberían reconocer los problemas de especificidad debidos a amplificación inespecífica. Un paso adicional, como el análisis con enzimas de restricción, la hibridación tipo Southern, o la secuenciación, puede confirmar la especificidad de lo que resulte amplificado. Por lo general, excepto con animales que han sido tratados o se encuentran en una fase muy inicial de la infección ( 30%. •

Interpretación de los resultados

El porcentaje de inhibición se calcula del siguiente modo: 100 – OD de la muestra x 100/ OD media del control negativo = Porcentaje de inhibición. Las muestras con 30% de inhibición son positivas.

b)

Prueba de aglutinación en placa La ventaja de la CAT es que es una técnica sensible, que puede realizarse en el laboratorio o en el campo, y que proporciona el resultado en unos pocos minutos. Las reacciones inespecíficas pueden ser un problema. El antígeno para CAT es una suspensión de partículas de A. marginale. Se infectan terneros esplenectomizados por inoculación intravenosa con sangre que contenga eritrocitos infectados por Anaplasma. Cuando la parasitemia excede 50%, el animal se sangra, los eritrocitos infectados se lavan, se lisan, y las membranas de los eritrocitos y las partículas de Anaplasma se centrifugan. Los sedimentos se sonican, se lavan, y luego se resuspenden en una solución de colorante para producir la solución de antígeno.

2

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VMRD, Inc., 4641 Pullman_Albion Rd., P.O. Box 502, Pullman, Washington 99163, USA. Tel.: (1.509) 334.58.15; Fax: (1.509) 332.53.56; http://www.vmrd.com

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Capítulo 2.3.7. — Anaplasmosis bovina

Un procedimiento con ligeras modificaciones del descrito originalmente (1,2) es el siguiente: i)

Comprobar antes de su uso que todos los componentes de la prueba están a una temperatura de 2526ºC (esta temperatura constante es un factor crítico en la prueba).

ii)

En cada círculo de la placa de ensayo (un plástico claro tipo perspex o una placa de cristal con círculos marcados de 18 mm de diámetro), colocar juntos, pero sin tocarse, 10 µl de factor de suero 3 bovino (BSF), 10 µl del suero de ensayo, y 5 µl del antígeno CAT . En cada placa se deben probar sueros negativos y débilmente positivos.

iii)

BSF es suero de un animal seleccionado con un alto nivel de conglutinina. Si se desconoce el nivel de conglutininas, se puede utilizar suero fresco de un animal que esté libre de Anaplasma. La raza Jersey es adecuada, habitualmente. El BSF se debe guardar a –70ºC en pequeñas alícuotas, y cada vez que se realizan las pruebas se utiliza una alícuota fresca. La inclusión de BSF mejora la sensibilidad de la prueba. Mezclar bien con una varilla de vidrio. Después de mezclar cada prueba, limpiar la varilla de vidrio con un papel limpio para evitar la contaminación cruzada.

c)

iv)

Colocar la placa de prueba en una cámara húmeda y agitar a 100-110 rpm durante 7 minutos.

v)

Leer inmediatamente contra una luz. Una aglutinación característica del antígeno (valorada de +1 a +3) se considera un resultado positivo. Se considera que la prueba da un resultado negativo cuando no existe esa aglutinación característica.

Prueba de fijación de complemento Se han publicado manuales detallados para realizar tanto la versión estándar (34) como la versión en microtítulo (35) de la prueba FC para anaplasmosis. Aunque la prueba de FC se ha empleado ampliamente durante muchos años usando ambas técnicas, datos recientes confirman que carece de sensibilidad y falla en la detección de una proporción importante de ganado portador (3). Por consiguiente, la prueba FC no puede ser recomendada como ensayo fiable para detectar animales infectados.

d)

Enzimoinmunoensayo indirecto Se ha encontrado un método I-ELISA, basado en el uso de un antígeno normal de eritrocitos (antígeno negativo) y de un antígeno de eritrocitos infectados por A. marginale (antígeno positivo), que es fiable para la detección de sueros positivos frente a A. marginale (7). Aunque más lento que las pruebas que utilizan un solo antígeno, esta prueba elimina los sueros con niveles de actividad inespecífica debidos a los isoanticuerpos para los componentes de los eritrocitos normales. La prueba identificó correctamente los 100 sueros positivos conocidos tomados de ganado bovino hasta después de 3 años de la infección, mientras que el 3% de sueros negativos, el 2% de sueros de Babesia bovis y el 4% de sueros de B. bigemina dieron falsos resultados positivos. La prueba con los dos antígenos se realiza como se indica. •

Antígeno negativo

La sangre de un ternero esplenectomizado se recoge en etilén diamino tetra-acético sódico (EDTA). Las células se lavan tres veces son solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se centrifugan 10 minutos a 5.000 g a 5ºC. Después de la centrifugación, se extraen los glóbulos blancos diluyendo las células diez veces en PBS y pasándolas a través de una columna de celulosa Whatman CFI1. Después de otra centrifugación, se diluye un volumen de las células en dos volúmenes de PBS y se guardan en alícuotas de 2.5 ml en la fase de vapor de nitrógeno líquido. Cuando se necesita, se descongela una alícuota a temperatura ambiente y se sonica 30 segundos a 100 W con una pequeña sonda a 0ºC. El producto sonicado se diluye luego, según se necesite, para utilizar en la prueba ELISA. •

Antígeno positivo

Un ternero que se ha utilizado previamente para producir antígeno negativo se infecta con A. marginale por inoculación sanguínea. Cuando la parasitemia alcanza el 80-85%, se toman 500-1.000 ml de sangre, se procesan y se almacenan como se ha descrito antes. Cuando se necesitan, se sonican alícuotas, como antes, y se diluyen convenientemente.

3

En EE.UU. y México la prueba se realiza con volúmenes mayores de reactivos: antígeno (15 µl), suero (30 µl), y factor de suero bovino (30 µl) en un tiempo de reacción de 4 minutos (ver paso iv).

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Capítulo 2.3.7. — Anaplasmosis bovina

•

Procedimiento de la prueba

Se utilizan placas de micro-ELISA, con 96 pocillos, de fondo plano. Con cada lote nuevo de antígeno se realizan las titulaciones estándar del antígeno, tanto positivo como negativo, por el sistema del tablero de ajedrez, para determinar el rango de trabajo, que normalmente es 1/400 (150-200 µg de proteína/ml). A cada pocillo de la placa se añade el antígeno diluido (200 µl) , una mitad de la placa con antígeno positivo, y la otra mitad con antígeno negativo. Las placas se cierran con sus tapaderas y se incuban toda la noche a 4ºC. Después de la incubación, se extrae la solución de antígeno y las placas se lavan tres veces con PBS que contenga 0.1% de Tween 20 (PBST), y luego se bloquean con una solución de suero normal de caballo al 1% en PBS durante 60 minutos a 37ºC. Después dell bloqueo, las placas se lavan cinco veces con PBST antes de añadir 200 µl de los sueros de prueba. (Los sueros de prueba se diluyen de 1/400 a 1/800 con PBST que contenga 1% de suero de caballo). Las placas se cierran con sus tapaderas y se incuban 2 horas a 37ºC. Luego se lavan los pocillos cinco veces con PBST y se añaden 200 µl del segundo anticuerpo conjugado (IgG anti-bovina obtenida de cabra conjugada con peroxidasa de rábano), a una dilución 1/400 en PBS con 1% de suero de caballo. Las placas se cierran con sus tapaderas y se incuban 2 horas a 37ºC. Después de la incubación, se extrae el conjugado y los pocillos se lavan cinco veces con PBS antes de la adición de 200 µl de substrato, de preparación reciente. El substrato se prepara así; se disuelve ácido 5-amino salicílico recristalizado a concentración de 1 mg/ml en tampón fosfato, pH 6.8, a 32ºC; por cada ml de solución se añaden luego 2 µl de peróxido de hidrógeno al 30%. Después de la adición del substrato se cierran las placas y se agitan suavemente 30 minutos a 22ºC. A continuación, inmediatamente, se leen las placas a 492 nm con un lector de placas. La columna uno de cada placa se usa siempre como blanco. Para cada muestra las lecturas netas se calculan restando el resultado del antígeno negativo del resultado del antígeno positivo. En cada lote de ensayos, se prueba rutinariamente un grupo de 20 sueros negativos y un suero estándar positivo para A. marginale. Se calcula un “umbral” como la lectura de la absorbancia neta media (más dos desviaciones estándar) de los 20 sueros negativos estándar. La relación de todas las otras absorbancias netas se determina usando como unidad el “umbral”. El suero positivo se utiliza para determinar que cada lote de prueba se realiza con normalidad.

e)

Enzimoinmunoensayo de punto Comparado con I-ELISA, la prueba ELISA de punto tiene las ventajas potenciales de ser rápida, barata, y sencilla de realizar. Se ha descrito que el método de ELISA de punto descrito a continuación presenta una sensibilidad del 93% y una especificidad del 96% (21). •

Preparación del antígeno

i)

Recoger sangre con parasitemia elevada en EDTA.

ii)

Eliminar el plasma y lavar los eritrocitos con tampón glicina 0,1 M, pH 3,0.

iii)

Lavar los eritrocitos con PBS, pH 7,4, en presencia de inhibidores de proteasas (tetrationato sódico 3,5 mM) y 0,01% de timerosal.

iv)

Eliminar la capa de leucocitos después de cada lavado.

v)

Resuspender los eritrocitos en PBS a dilución 1/5, sonicar, someter a tres ciclos de congelación y descongelación, y volver a sonicar el lisado.

vi)

Mezclar el material con un volumen igual de Nonidet P-40 en PBS, e incubar 3 minutos a 25ºC.

vii)

Recoger los cuerpos de Anaplasma por centrifugación diferencial.

viii) Lavar el precipitado tres veces con tampón frío (cloruro de colina 155 mM, HEPES [N-2hidroxietilpiperazina, ácido N-2-etanesulfónico] 5 mM, pH 7,4). ix)

Resuspender el precipitado en PBS y medir la concentración de proteína. Depositar el antígeno (1,0 µl/disco; 25 µg de proteína/ml) sobre discos (de 6 mm de diámetro) de nitrocelulosa cortados con una taladradora de papel. Secar al aire los discos recubiertos con el antígeno. En estos discos el antígeno permanece estable durante más de 2 años si se mantienen a 20ºC o a 4ºC, y por al menos 3 meses cuando se conservan a 25ºC.

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Capítulo 2.3.7. — Anaplasmosis bovina

•

Procedimiento de la prueba

i)

Colocar los discos con el antígeno en pocillos con el fondo plano de placas de microtitulación.

ii)

Todos los procedimientos se realizan a 25ºC y utilizando reacciones de 200 µl de volumen.

iii)

Incluir sueros positivos y negativos conocidos y controles de antígeno.

iv)

Para el bloqueo, añadir PBS que contenga 0,5% de Tween 20 a cada pocillo, incubando luego 15 minutos.

v)

Probar los sueros a una concentración inicial de 1/200 en PBS que contenga 0,05% de Tween 20, e incubar 1 hora.

vi)

Lavar tres veces, 10 minutos cada vez, con PBS que contenga 0,1% de Tween 20.

vii)

Añadir el conjugado de fosfatasa alcalina/ proteína A, diluido 1/500 en PBS que contenga 0,5% de Tween 80, e incubar los pocillos 30 minutos, lavando después como antes, excepto que el último lavado se hace con PBS solo.

viii) Añadir nitroazul de tetrazolio/5-bromo-4-cloro-indoxil fosfato en tampón Tris 0,1 M, pH 9,5, y permitir que el color aparezca por 10-20 minutos. ix)

f)

La aparición de un punto de color púrpura, de intensidad variable, indica una reacción positiva; no se ve color en los discos con reacciones negativas.

Prueba de inmunofluoresencia indirecta con anticuerpo Debido al número limitado de pruebas de inmunofluorescencia indirecta con anticuerpo (IFI) que puede realizar diariamente un operador, se suelen preferir otras pruebas serológicas. La prueba IFI se realiza como se describe para la babesiosis bovina en el Capítulo 2.3.8., excepto que para la preparación de frotis de antígeno se utiliza sangre infectada por A. marginale. Un problema serio de esta prueba es la fluorescencia inespecífica. Es muy probable que el antígeno obtenido de sangre recogida tan pronto como aparezca una parasitemia adecuada (5-10%) resulte idóneo. La fluorescencia inespecífica debida a anticuerpos que se adhieren a eritrocitos infectados puede reducirse lavando los eritrocitos en un tampón glicina ácido antes de que se preparen los frotis de antígeno (22). Los eritrocitos infectados se lavan dos veces en tampón glicina 0.1 M (pH 3,0, centrifugado a 1.000 g por 15 minutos a 4ºC) y luego una vez en PBS, pH 7,4.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO Se han utilizado varios procedimientos de inmunización para proteger al ganado bovino contra la anaplasmosis en países donde la enfermedad es endémica, pero ninguno es ideal (19). El uso de la especie menos patógena A. centrale, que proporciona una protección parcial cruzada frente a A. marginale, es el método aceptado más ampliamente, aunque no se utiliza en América del Norte. Otro método implica el uso de una cepa de A. marginale atenuada por pases en hospedadores no bovinos, como el ciervo o la oveja (32). En esta sección, se describe la producción de vacuna viva de A. centrale. Incluye la infección de un ternero esplenectomizado susceptible y el uso de su sangre como vacuna. Existen descripciones detalladas del procedimiento de producción y se debe hacer referencia a estas publicaciones para detalles de los procedimientos que se resumen aquí (4, 10,25). Las directrices para la producción de vacunas se presentan en el Capítulo I.1.7. Principios de la producción de vacunas veterinarias. Las normas dadas aquí y en el Capítulo I.1.7. intentan ser de naturaleza general y pueden completarse con requisitos nacionales y regionales. La vacuna para Anaplasma centrale puede suministrarse en forma congelada o refrigerada dependiendo de la demanda, redes de transporte y la disponibilidad de servicios de nitrógeno líquido o de hielo seco. En la mayor parte de los casos se recomienda la vacuna congelada, ya que permite un control de calidad de cada lote después de la producción. Sin embargo, es más costosa de producir y más difícil de transportar que la vacuna refrigerada. El riesgo de contaminación hace que el control después de la producción sea esencial, pero puede ser prohibitivamente costoso.

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Capítulo 2.3.7. — Anaplasmosis bovina

1.

Control del inóculo

a)

Características del inóculo Anaplasma centrale se aisló por primera vez en 1911 en Sudáfrica y se ha utilizado como vacuna en Sudamérica, Australia, África, Oriente Medio, y Sudeste Asiático. Solo suministra protección parcial, pero adecuada, en regiones donde las cepas que provocan la enfermedad son de una virulencia moderada (como Australia) (10). En los trópicos húmedos, donde A. marginale parece ser un parásito muy virulento, la protección suministrada por A. centrale puede ser inadecuada para evitar la enfermedad en algunos animales. Normalmente, Anaplasma centrale causa infecciones benignas, especialmente en terneros menores de 9 meses de edad. Se han descrito reacciones graves después de la vacunación cuando se inocula ganado adulto. El pase rápido de A. centrale por terneros esplenectomizados parece reducir su virulencia (10).

b)

Preparación y conservación de los estabilizados El material infeccioso se conserva fácilmente en nitrógeno líquido o en hielo seco como estabilizados congelados de la sangre infectada. El crioconservante recomendado es dimetil sulfóxido (DMSO), ya que permite la administración intravenosa del estabilizado después de la descongelación. En otra parte (10) se describe con detalle la técnica de congelación pero, en resumen, se basa en lo siguiente: se recoge sangre infectada, se enfría a 4ºC, y se añade, lentamente y con agitación, crioconservante frío (4 M DMSO en PBS) en una proporción final sangre/conservante de 1:1, para dar una concentración final 2 M de DMSO. Todo el proceso de dilución se realiza en un baño de hielo y la sangre diluida se distribuye en recipientes adecuados (por ejemplo, en crioviales de 5 ml), que se congelan tan pronto como sea posible en la fase de vapor de un contenedor de nitrógeno líquido.

c)

Validación como vacuna La idoneidad de un aislamiento de A. centrale como vacuna se determina inoculando ganado susceptible, observando las reacciones posteriores, y estimulando luego a los animales y a controles susceptibles con una cepa virulenta local de A. marginale. Tanto la seguridad como la eficacia se pueden estimar observando las parasitemias en extensiones de sangre teñida y el descenso volumétrico de células empaquetadas de ganado vacuno durante la vacunación y durante los períodos de reacción estimulante. Se puede determinar la pureza del aislamiento, para posibles contaminantes presentes, mediante un estudio serológico de sueros en parejas del ganado bovino utilizado en la prueba de seguridad (26).

2.

Método de fabricación

a)

Producción de vacuna congelada Se descongelan las cantidades del estabilizado congelado (5-10 ml) por inmersión de los viales en agua precalentada a 40ºC. El material descongelado se mantiene en hielo y se usa tan pronto como sea posible (en 30 minutos) para infectar un ternero susceptible esplenectomizado por inoculación intravenosa. La parasitemia del ternero donante de analiza diariamente examinando extensiones de sangre teñida de la yugular, y se recoge la sangre para producción de la vacuna cuando se alcanza una parasitemia adecuada. 8 El mínimo requerido para producción de la vacuna es una parasitemia de 1 x 10 /ml (aproximadamente 2% de parasitemia en la sangre de la yugular). Si no se obtiene una parasitemia adecuada, puede ser necesario realizar un pase de la cepa mediante subinoculación de 100-200 ml de sangre a un segundo ternero esplenectomizado. La sangre del donante se recoge mediante canulación aséptica de la yugular o la carótida, utilizando heparina como anticoagulante (5 Unidades Internacionales [UI] de heparina/ml de sangre). En el laboratorio, la sangre parasitada se mezcla a 37ºC con un mismo volumen de glicerol 3M en PBS, suplementado con 5mM de glucosa (concentración final de glicerol 1,5 M). La mezcla se equilibra a 37ºC durante 30 minutos y se distribuye en recipientes adecuados (por ejemplo, en crioviales de 5 ml). Los viales se enfrían en la fase de vapor de nitrógeno líquido a una velocidad aproximada de 10ºC/minuto y, cuando están congelados, se guardan en la fase líquida (5). En lugar de glicerol se puede utilizar DMSO como crioconservante. En este caso se lleva a cabo del mismo modo que para la preparación del estabilizado (20,24).

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Capítulo 2.3.7. — Anaplasmosis bovina

Si se tiene que diluir la vacuna preparada en glicerol, el diluyente debe ser PBS con 1.5 M de glicerol y 5 mM de glucosa (15). Las vacunas crioconservadas con DMSO deben diluirse con diluyente que contenga la misma concentración de DMSO que la sangre original crioconservada (27).

b)

Producción de vacuna refrigerada El material infeccioso para vacunas refrigeradas se preparara como para las vacunas congeladas, pero debe ser procesado y utilizado tan pronto como sea posible después de su recogida. La sangre infecciosa 7 se puede diluir para lograr 1 x 10 parásitos por dosis de vacuna. Un diluyente adecuado es 10% de suero bovino estéril en una solución de glucosa/solución salina equilibrada que contenga las siguientes cantidades por litro: NaCl (7,00 g), MgCl2.6H2O (0,34 g), glucosa (1,00 g), Na2HPO4 (2,52 g), KH2PO4 (0,90 g), y NaHCO3 (0,52 g). Si no se dispone de diluyente, se debería utilizar como anticoagulante dextrosa citrato ácido (20% [v/v]) o dextrosa citrato fosfato (20% [v/v]) para suministrar la glucosa necesaria para la supervivencia de los organismos.

c)

Utilización de la vacuna En el caso de las vacunas congeladas, los viales se descongelan por inmersión en agua precalentada a 40ºC, y el contenido se mezcla con un diluyente adecuado hasta la dilución requerida. Si se preparan vacunas con glicerol, deben mantenerse frías y utilizarlas en un tiempo de 8 horas después de la preparación (5). Si se utiliza DMSO como crioconservante, las vacunas preparadas deben mantenerse en hielo y utilizarse en 15-30 minutos (24). El modo más común de administración de la vacuna es por vía subcutánea. Las vacunas refrigeradas se deben mantener en frío y utilizarse dentro de los 6 días siguientes a su preparación. La cepa de A. centrale que se usa en las vacunas es de virulencia reducida, pero no es por completo segura. En consecuencia, un consejo práctico es limitar el uso de las vacunas a terneros, en los que la inmunidad inespecífica reducirá el riesgo de reacciones debidas a la vacunación. Cuando se tienen que vacunar animales de mayor edad, existe el riesgo de reacciones graves. Estas reacciones no son frecuentes, pero la presencia de animales de reproducción valiosos o en estado de gravidez merece atención, y deberían observarse los animales entre las 4 y 6 semanas después de la vacunación. Los animales clínicamente enfermos deben tratarse con tetraciclina o imidocarb a dosis recomendadas por los fabricantes. La inmunidad de protección se desarrolla en 6-8 semanas y por lo general persiste varios años. A menudo se utilizan en paralelo las vacunas contra la anaplasmosis y la babesiosis, pero no es recomendable utilizar simultáneamente otras vacunas.

3.

Control interno

a)

Origen y mantenimiento de los donantes de vacuna Debe identificarse una fuente de terneros exentos de infección natural por Anaplasma y de otras enfermedades transmitidas por garrapatas. Si no se dispone de ellos, puede ser necesario criar los terneros bajo condiciones libres de garrapatas con el propósito específico de producción de vacunas. Los terneros deben mantenerse en condiciones que eviten su exposición a enfermedades infecciosas y a garrapatas e insectos picadores. En ausencia de servicios adecuados, debe valorarse el riesgo de contaminación con agentes de enfermedades infecciosas que estén presentes en el país concreto, y se deben comparar los beneficios derivados de la producción local de vacunas frente a las posibles consecuencias adversas de difundir enfermedades (10).

b)

Cirugía Para permitir el máximo rendimiento de obtención de organismos para producción de vacunas, los terneros donantes deben ser esplenectomizados. Esto se lleva a cabo con preferencia en terneros jóvenes con anestesia general. Los detalles de esta técnica, incluyendo los procedimientos pre- y post-operatorios, se describen en otra parte (10).

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c)

Selección de donantes para vacunas antes de la inoculación Los terneros donantes deben examinarse en cuanto a todas las infecciones sanguíneas que sean prevalentes en el país productor de la vacuna, incluyendo Babesia, Anaplasma, Cowdria, Theileria y Trypanosoma. Esto se lleva a cabo mediante examen rutinario de extensiones de sangre teñidas después de la esplenectomía, y preferiblemente también por serología. Cualquier ternero que muestre evidencias de infecciones naturales debe ser rechazado. También debe confirmarse la ausencia de otros agentes infecciosos. Estos pueden incluir a los agentes de la leucosis enzoótica bovina, enfermedad de las mucosas, rinotraqueitis bovina infecciosa, fiebre efímera, enfermedad de Akabane, lengua azul, glosopeda o fiebre aftosa y peste bovina. Las pruebas dependerán de las enfermedades prevalentes en el país y de la disponibilidad de ensayos, pero en último término deberían contemplar la serología de sueros pareados y, en algunos casos, el aislamiento del agente (5, 24, 26).

d)

Observación de parasitemias después de la inoculación Es necesario determinar la concentración de parásitos en la sangre recogida para vacunas. Existen técnicas cuidadosas para determinar el contaje de los parásitos (10), pero, en ausencia de éstas, la concentración de parásitos se puede calcular a partir del contaje de eritrocitos y de la parasitemia (porcentaje de eritrocitos infectados).

e)

Recolección de sangre para vacunas Antes del uso, debe esterilizarse todo el equipo (por ejemplo, en autoclave). Una vez alcanzada la parasitemia deseada, la sangre se recoge con heparina utilizando técnicas asépticas estrictas. Esto se realiza más fácilmente si se seda al ternero y se usa un circuito cerrado de recolección. Se pueden extraer hasta 3 litros de sangre con niveles de infección elevados de un ternero de 6 meses. Si el ternero va a permanecer vivo, es adecuada la transfusión de una cantidad similar de sangre de un donante apropiado. Alternativamente, el ternero debe ser sacrificado inmediatamente después de la extracción de la sangre.

f)

Distribución de las vacunas Todo el proceso se realiza en un ambiente apropiado, como en una cabina de flujo laminar, utilizando técnicas estériles estándar. El uso de un agitador mecánico o magnético asegura una buena mezcla de la sangre y del diluyente a través de todo el proceso de distribución.

4.

Control de lotes

En el caso de las vacunas refrigeradas, la potencia, seguridad y esterilidad de los lotes de vacuna no se puede determinar, y para las vacunas congeladas las especificaciones dependen del país concreto. Las siguientes indicaciones se aplican a las vacunas congeladas producidas en Australia.

a)

Esterilidad y ausencia de contaminantes Para cada lote de vacuna y diluyente se emplean técnicas estándar de esterilidad (ver Capítulo I.1.5). La ausencia de contaminantes se confirma inoculando ganado y observándolo serológicamente en cuanto a agentes infecciosos que potencialmente podrían contaminar la vacuna. El ganado inoculado durante la prueba de potencia (ver sección C.4.c) es adecuado para este fin. Dependiendo del país de origen de la vacuna, estos agentes incluyen los microorganismos que causan la leucosis enzoótica bovina, rinotraqueitis bovina infecciosa, enfermedad de las mucosas, fiebre efímera, enfermedad de Akabane, virus Aino, lengua azul, parainfluenza, glosopeda o fiebre aftosa, enfermedad nodular, rabia, fiebre del Valle del Rift, peste bovina, pleuroneumonía bovina contagiosa, enfermedad de Jembrana, cowdriosis, especies patógenas de Theileria y Trypanosoma, Brucella abortus, Coxiella y Leptospira (5).

b)

Seguridad Las reacciones vacunales del ganado inoculado en la prueba de potencia (ver sección C.4.c) se observan mediante la medición de la parasitemia y el descenso volumétrico en células empaquetadas. Solo se ponen en circulación para uso los lotes con niveles de patogenicidad iguales o inferiores a un estándar predeterminado.

c)

Potencia La vacuna se descongela y se diluye 1/50 con un diluyente adecuado (15). La vacuna diluida se incuba luego 8 horas a 30ºC, y se inoculan subcutáneamente cinco cabezas de ganado con dosis de 2 ml. Los

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Capítulo 2.3.7. — Anaplasmosis bovina

animales inoculados se observan para presencia de infecciones examinando frotis de sangre, teñidos. Para que un lote sea aceptable todos deberían estar infectados. Un lote que sea infeccioso al 1/50 se recomienda para uso a una dilución 1/5 con diluyente isotónico.

d)

Duración de la inmunidad Después de una inoculación se logra inmunidad parcial, pero duradera. No existe evidencia de que la vacunación repetida tenga un efecto estimulante.

e)

Estabilidad Cuando se almacena en nitrógeno líquido, la vacuna se puede mantener durante 5 años. Una vez que se descongela, pierde rápidamente su potencia. La vacuna descongelada no puede congelarse de nuevo.

f)

Conservantes No se añaden conservantes. En la fase de distribución, se añade a la vacuna penicilina (500.000 UI/litro) y estreptomicina (370.000 UI/litro).

g)

Precauciones (riesgos) La vacuna no es infecciosa para humanos. Cuando el producto se almacena en nitrógeno líquido, se aplican las precauciones normales en cuanto a conservación, transporte y manejo del material ultracongelado.

5.

Pruebas sobre el producto final

a)

Inocuidad Ver Sección C.4.b

b)

Potencia Ver Sección C.4.c

REFERENCIAS 1.

AMERAULT T.E. & ROBY T.O. (1968). A rapid card agglutination test for bovine anaplasmosis. J. Am. Vet. Med. Assoc., 153, 1828–1834.

2.

AMERAULT T.E., ROSE J.E. & ROBY T.O. (1972). Modified card agglutination test for bovine anaplasmosis: evaluation with serum and plasma from experimental and natural cases of anaplasmosis. Proc. U.S. Anim. Health Assoc., 76, 736–744.

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BRADWAY D.S., TORIONI DE ECHAIDE S., KNOWLES D.P, HENNAGER S.G., & MCELWAIN T.F. (2001). Sensitivity and specificity of the complement fixation test for detection of cattle persistently infected with Anaplasma marginale. J. Vet. Diagn. Invest., 13, 79-81.

4.

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5.

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Capítulo 2.3.7. — Anaplasmosis bovina

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* * *

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CAPÍTULO 2.3.8.

BABESIOSIS BOVINA

RESUMEN La babesiosis es una enfermedad del ganado bovino transmitida por garrapatas y causada por los parásitos protozoarios Babesia bovis, B. bigemina, B. divergens y otras especies. Boophilus spp., vectores principales de B. bovis y B. bigemina, se encuentran ampliamente distribuidos en paises tropicales y subtropicales. El vector más importante de B. divergens es Ixodes ricinus. Otros vectores importantes incluyen Haemaphysalis y Rhipicephalus spp. Identificación del agente: Es posible la demostración de los parásitos en los animales muertos mediante el examen microscópico de frotis de sangre, cerebro, riñón, hígado y bazo, con tal de que la descomposición no esté avanzada. Los frotis se fijan con metanol, se tiñen con Giemsa al 10% durante 20-30 minutos, y se examinan a 800-1000X con aceite de inmersión. En el caso de animales vivos, se deben preparar frotis finos o gruesos de sangre capilar obtenidos, por ejemplo, a partir del extremo de la cola. Se encuentran disponibles pruebas sensibles de la reacción en cadena de la polimerasa que pueden detectar y diferenciar especies de Babesia en el ganado bovino. Pruebas serológicas: El método de inmunofluorescencia indirecta (IFI) es la prueba más ampliamente utilizada para la deteccción de anticuerpos frente a B. bovis y B. divergens, aunque los enzimoinmunoensayos están ganando en popularidad. La prueba IFI ha sido utilizada para la deteccción de anticuerpos frente a B. bigemina, pero las reacciones serológicas cruzadas hacen difícil el diagnóstico de la especie. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: En varios países se preparan vacunas con cepas vivas o atenuadas de B. bovis, B. bigemina o B. divergens se producen en varios países a partir de la sangre de animales donantes infectados. Las vacunas se presentan en forma congelada o refrigerada. Se recomienda generalmente la producción de la vacuna congelada ya que permite un exhaustivo control de post-producción de cada lote. El riesgo de contaminación de esta vacuna derivada de sangre hace que sea esencial un minucioso control de calidad, aunque puede ser prohibitivamente caro. Las vacunas vivas de Babesia no son completamente seguras. Una recomendación práctica es limitar su uso a terneros, donde la inmunidad inespecífica minimizará el riesgo de reacciones frente a la vacuna. Cuando van a vacunarse animales viejos, el riesgo de reacción justifica el seguimiento riguroso y el tratamiento con un babesicida, si surgen reacciones. La inmunidad protectora se desarrolla en 3-4 semanas y dura varios años después de una sola vacunación.

A. INTRODUCCIÓN La babesiosis bovina está causada por parásitos protozoarios del género Babesia, orden Piroplasmida, phylum Apicomplexa. De las especies que afectan al ganado bovino, dos -Babesia bovis y B. bigemina- se encuentran ampliamente distribuidas y son muy importantes en Africa, Asia, Australia y América Central y del Sur. Babesia divergens es importante económicamente en algunas partes de Europa. El vector de Babesia son garrapatas (18). Boophilus microplus es el vector principal de B. bigemina y B. bovis, y se encuentra ampliamente distribuido en los trópicos y subtrópicos. El vector de B. divergens es Ixodes ricinus. Otros vectores importantes incluyen Haemaphysalis, Rhipicephalus y Boophilus spp. Babesia bigemina presenta la distribución más amplia de todas.

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Capítulo 2.3.8. — Babesiosis Bovina

Generalmente, B. bovis es más patógeno que B. bigemina y B. divergens. Las infecciones se caracterizan por fiebre alta, ataxia, anorexia, shock circulatorio generaly, a veces también síntomas nerviosos como resultado del secuestro de eritrocitos infectados en los capilares cerebrales. En casos agudos, la máxima parasitemia (porcentaje de eritrocitos infectados) en sangre circulante es menor del 1%. Esto contrasta con las infecciones por B. bigemina, donde la parasitemia a menudo excede del 10% y puede llegar a un 30%. En las infecciones por B. bigemina, los síntomas más inportantes incluyen fiebre, hemoglobinuria y anemia. En las infecciones por B. bigemina no tiene lugar el secuestro intravascular de eritrocitos infectados. La parasitemia y aspecto el clínico de las infecciones por B. divergens son algo parecidas a las infecciones por B. bigemina (20). Los animales infectados desarrollan una inmunidad de por vida frente a la reinfección con las mismas especies. También existe evidencia de un grado de protección cruzada en animales inmunes a B. bigemina frente a posteriores infecciones por B. bovis. Los terneros raramente muestran signos clínicos de enfermedad después de la infección, independientemente de la especie de Babesia implicada o el estado inmune de las madres (8, 10, 11).

B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO 1.

Identificación del agente

El método tradicional de identificación del agente en animales infectados es mediante el examen microscópico de frotis finos y gruesos de sangre teñidos, por ejemplo, con Giemsa. La sensibiliad de esta técnica es tal que puede detectar parasitemias tan bajas como un parásito por 107 glóbulos rojos (RBCs) (6). La diferenciación de especies es buena en frotis finos pero pobre en los frotis gruesos, más sensibles. Esta técnica es adecuada, normalmente, para la detección de infecciones agudas, pero no para la detección de portadores donde las parasitemias son en su mayoría muy bajas. La identificación y diferenciación del parásito puede mejorarse empleando un colorante fluorescente, como el naranja de acridina, en lugar del Giemsa (19). Se ha desarrollado un método BBC (Cuantitative Buffy Coat ®) empleando naranja de acridina para teñir parásitos en los vasos capilares para demostrar Plasmodium en sangre humana y potencialmente podría detectar también parasitemias bajas por Babesia, aunque la diferenciación es probable que resulte deficiente (6). Las muestras de animales vivos deberían recogerse preferiblemente de capilares, como los de la punta de la oreja o el extremo de la cola, ya que B. bovis es más común en la sangre capilar. Los parásitos Babesia bigemina y B. divergens se encuentran distribuidos uniformemente a lo largo del tejido vascular. Si no es posible preparar frotis frescos a partir de sangre capilar, se debería recoger sangre estéril de la yugular en presencia de un anticoagulante con ácido eitilen diamino tetra-acético (EDTA) (por ejemplo 1 mg/ml). La heparina puede afectar a las características de color de la tinción y no está recomendada. La muestra debe mantenerse fría, preferiblemente a 5°C, hasta que se transporte al laboratorio, de nuevo preferiblemente en pocas horas desde su recogida. Los frotis de sangre se secan al aire, se fijan en metanol absoluto durante 1 minuto, y se tiñen con el colorante Giemsa al 10% durante 20-30 minutos. Es preferible teñir los frotis de sangre tan pronto como sea posible después de su preparación para asegurar una definición adecuada del colorante. Los frotis gruesos se preparan depositando una gota pequeña (aproximadamente 50 µl) de sangre sobre un porta limpio. Entonces esta gota se seca al aire, se fija por calor a 80° durante 5 minutos, y se tiñe con Giemsa al 10% durante 15-20 minutos. Los frotis de sangre sin teñir no deben guardarse en soluciones con formol ya que puede afectar a la calidad de la tinción. Las muestras de animales muertos deben consistir en frotis finos de sangre, así como de (en orden preferente) cortex cerebral, riñón, hígado, bazo y médula ósea. Los frotis de órganos se preparan presionando un porta limpio sobre la superficie de un corte fresco del órgano o aplastando una pequeña muestra del tejido entre dos portas limpios colocados longitudinalmente para dejar una película de tejido sobre cada superficie. Entonces, el frotis se seca al aire (en climas húmedos ayudado mediante calentamiento suave), se fija durante 5 minutos en metanol absoluto, y se tiñe durante 20-30 minutos en Giemsa al 10%. Este método resulta especialmente adecuado para el diagnóstico de infecciones por B. bovis, pero es poco fiable si las muestras se recogen 24 o más horas después de que se haya producido la muerte. Sin embargo, los parásitos a menudo pueden ser detectados en sangre recogida de las venas de los miembros bajos uno o más días después de la muerte. Todos los frotis teñidos se observan con aceite de inmersión utilizando (como mínimo) lentes ocular de 8X y objetivo de 60X. B. bovis es un parásito pequeño, localizado normalmente en posición central en el eritrocito. Mide aproximadamente 1-1.5 µm de largo y 0.5-1.0 µm de ancho y, habitualmente, se encuentra en parejas que forman un ángulo obtuso entre ellas. Babesia divergens es también un parásito pequeño y es morfológicamente muy parecido a B. bovis. Sin embargo, las parejas que forman ángulos obtusos están localizadas normalmente en el borde del eritrocito. Babesia bigemina tiene forma típica de pera, aunque se encuentran muchas formas variadas y sencillas. Tiene 3-3.5 µm de largo y 1-1.5 µm de ancho, y las formas apareadas a menudo tienen en cada parásito dos puntos separados teñidos de rojo (B. bovis y B. divergens siempre tienen sólamente uno). En casos agudos, la parasitemia por B. bovis raramente alcanza el 1%, pero con B. bigemina y B. divergens la

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Capítulo 2.3.8. — Babesiosis Bovina

norma son parasitemias mucho más elevadas. Los frotis gruesos de sangre son especialmente útiles para el diagnóstico de infecciones por B. bovis de bajo nivel, como son los frotis de órganos (1). Se han utilizado sondas para detectar ADN de algunas especies de Babesia, pero generalmente no son más sensibles que la microscopía directa y la aplicación en diagnósticos de rutina es limitada (19). Los ensayos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) han demostrado ser muy sensibles, particularmente en la detección de B. bovis y B. bigemina en ganado portador (7, 11, 17, 35). Se han descrito niveles de detección tan bajos como tres eritrocitos parasitados en 20µl de células concentradas (36). Se han descrito varias técnicas de PCR que pueden detectar y diferenciar especies de Babesia en infecciones de portador (7, 35). Sin embargo, los ensayos de PCR no se prestan bien para pruebas a gran escala y son poco prometedores para sustituir a las pruebas serológicas como método de elección para estudios epidemiológicos. Los ensayos de PCR son útiles como pruebas confirmativas y en algunos casos como pruebas reguladoras. Se han utilizado métodos de cultivo in-vitro para demostrar la presencia de infecciones portadoras de Babesia spp. (22), y B. bovis también ha sido multiplicada en cultivo. La parasitemia mínima detectable mediante este método dependerá, en gran medida, de las infraestructuras disponibles y las habilidades del usuario (6), pero puede ser tan baja como 10–10 (19), haciendo de éste un método muy sensible para la demostración de la infección. Un beneficio añadido es que es 100% específico. La confirmación de la infección en un animal sospechoso de ser portador también puede realizarse transfundiendo intravenosamente aproximadamente 500 ml de sangre de yugular en un becerro esplenectomizado libre de Babesia, y monitorizando al ternero para la presencia de infección. Este método es incómodo y caro, y obviamente no adecuado para el uso diagnóstico rutinario. Sin embargo, los gerbos de Mongolia (Meriones unguiculatus) se pueden utilizar para demostrar la presencia de B. divergens.

2.

Pruebas serológicas

La prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFI) es utilizada ampliamente para detectar anticuerpos frente a Babesia spp., aunque el ensayo tiene una especificidad baja en B. bigemina. En la prueba IFI para B. bigemina las reacciones cruzadas con anticuerpos frente a B. bovis son un problema particular en areas donde coexisten los dos parásitos. La prueba IFI tienen las desventajas del manejo de pocas muestras y la subjetividad. Se ha desarrollado una prueba de enzimoinmunoensayo (ELISA), validada internacionalmente para el diagnóstico de infección por B. bovis (13, 29, 38), pero, a pesar de los esfuerzos de varios investigadores en diferentes laboratorios, no existe un ELISA parecido validado para B. bigemina. Los ELISAs para anticuerpos frente a B. bigemina tienen una especificidad baja. En un estudio (16), un antisuero frente a B. bigemina pareció reaccionar específicamente con fibrinógeno. Sin embargo, un ELISA desarrollado y validado recientemente en Australia (30) resulta esperanzador. En ausencia de otra prueba factible para B. bigemina, se ha incluido aquí el procedimiento para dicha prueba. También se han desarrollado ELISAs para B. divergens (9) utilizando antígeno derivado de cultivo, de gerbos (Meriones) o de ganado vacuno, pero no parece existir uno que haya sido validado internacionalmente.

a)

Enzimoinmunoensayo para Babesia bovis La preparación del antígeno está basada en una técnica descrita por Waltisbuhl et al. (38). A partir de un ternero esplenectomizado se recoge la sangre infectada (normalmente 5-10% de parasitemia) en presencia de EDTA. La sangre se lava tres veces en cinco volúmenes de tampón fosfato salino (PBS), y las células infectadas se concentran mediante lisis diferencial de las células no infectadas en solución salina hipotónica. Las células infectadas son más resistentes a la lisis en solucionas salinas hipotónicas que las células no infectadas. Se preparan series de soluciones salinas hipotónicas, oscilando entre el 0,35% hasta 0,50% de NaCl, con incrementos del 0,025%. Para encontrar la mejor concentración, se añaden cinco volúmenes de cada solución salina a un volumen de RBC concentrados, que se mezclan suavemente y se dejan reposar durante 5 minutos. Las mezclas se centrifugan y los sobrenadantes se aspiran. Se añade un volumen igual de plasma (conservado a partir de la sangre original) a cada tubo con los RBC concentrados, y los contenidos de los tubos se mezclan. Se preparan frotis finos de sangre a partir de las mezclas de células sanguíneas resuspendidas, se fijan en metanol, y se tiñen con Giemsa. Estos frotis se examinan al microscopio para determinar que solución salina lisa la mayoría de los RBC no infectados pero deja intactos a los RBC infectados. Debería ser posible conseguir una infección >95% en los RBC intactos restantes. La mayor parte de los RBC concentrados se lisa diferencialmente con la solución salina óptima y se centrifugan. El sedimento (>95% de RBC infectados) se lisa en agua destilada a 4°C, y los parásitos se precipitan a 12,000 g durante 30 minutos. El precipitado se lava tres veces en PBS mediante resuspensión y centrifugación a 4°C. Se resuspende entonces en uno a dos volúmenes de PBS a 4°C, y se sonica en volúmenes adecuados utilizando una potencia media durante 60-90 segundos. El material sonicado se ultracentrifuga, (105.000 g durante 60 minutos a 4°C) y se conserva el sobrenadante. El sobrenadante se

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Capítulo 2.3.8. — Babesiosis Bovina

mezcla con un volumen igual de glicerol y se conserva en alicuotas de 2-5 ml a –70°C. Es aceptable la conservación a corto plazo a –20°C para la alicuota de trabajo. •

Procedimiento de la prueba

i)

Se añaden 100 µl del antígeno, diluido 1/400 a 1/600 en tampón carbonato 0,1M, pH 9,6, a cada pocillo de una placa de microtitulación de poliestireno con 96 pocillos. La placa se cubre y se incuba durante la noche a 4°C.

ii)

Se elimina el antígeno y los pocillos se bloquean durante 2 horas a temperatura ambiente mediante la adición de 200 µl de una solución de caseinato sódico al 2% en tampón carbonato.

iii)

Después de bloquear, los pocillos se lavan brevemente con PBS que contiene 0,1% de Tween 20 (PBST) y se añaden 100 µl de suero bovino diluido 1/100 en PBST que contiene 5% de suero normal de caballo o 5% de leche desnatada en polvo, y las placas se incuban durante 2 horas a temperatura ambiente.

iv)

La fase de lavado consiste en un lavado suave con PBST, seguido de tres lavados de 5 minutos con el mismo tampón (durante los cuales la placa se agita vigorosamente), y finalmente las placas se someten a un lavado suave.

v)

A continuación, se añaden 100 µl de IgG anti-bovina marcada con peroxidasa y diluida adecuademente en PBST con suero de caballo o leche desnatada y las placas se agitan durante otros 30 minutos a temperatura ambiente. (NB: algunos lotes de leche desnatada en polvo pueden contener inmunoglobulinas que pueden interferir con las IgG anti-bovinas conjugadas).

vi)

Los pocillos se lavan como se describió anteriormente en la fase iv, y se añaden 100 µl de substrato de peroxidasa (ABTS [2, 2’- Azino-bis-(ácido 3-ethylbenzothiazolin-6-sulfónico)]) a cada pocillo. La reacción del substrato se deja continuar hasta que la absorbancia de un control positivo fuerte incluido en cada placa se acerca a 1. En este punto se lee la absorbancia a 414 nm en un lector de placas de microtitulación.

Para controlar la variación entre placas, se incluyen en cada placa sueros conocidos positivos y negativos (38). Los sueros problema se bareman en relación al control positivo. Los resultados del ELISA se expresan como un porcentaje de dicho control positivo (porcentaje de positividad). Los valores umbral positivo y negativo deben determinarse en cada laboratorio probando tantos sueros positivos y negativos como sea posible. Cada lote de antígeno y conjugado deben ser valorados empleando un sistema de doble entrada o método del tablero de ajedrez. El enzima más adecuado para el conjugado es la peroxidasa de rábano picante. El ABTS o la tetrametil benzidina (TMB) son substratos adecuados. Con esta prueba, es posible detectar anticuerpos hasta cuatro años después de una infección simple. Deberían producirse de un 95-100% de reacciones positivas con animales inmunes a B. bovis, 1.2% de reacciones falsos positivos con suero negativo y 292 días). Un futuro desarrollo de ratones transgénicos que sobreexpresen el gen PrP bovino podría, teóricamente, ofrecer bioensayos con períodos de incubación más cortos para la EEB. Sin embargo, los datos obtenidos de un estudio de este tipo no conducen a períodos de incubación más reducidos que los de las cepas normales de ratones (12). Existe la necesidad de una prueba para la EEB que pueda aplicarse al animal vivo y que tenga una sensibilidad capaz de detectar PrPres a niveles bajos, como ocurre en las primeras fases del periodo de incubación de la enfermedad. De vez en cuando se publican diversos enfoques potenciales, a menudo de forma preliminar, basados solo en datos limitados. Ninguno ha progresado hasta el punto de superar una revisión detallada y la evaluación crítica por otros, de modo que las pretensiones de dichos trabajos deben interpretarse con cautela. Algunas proteínas marcadoras, fundamentalmente la apolipoproteína E (Apo E), se pueden detectar por electroforesis bidimensional en el líquido cerebroespinal de casos clínicamente sospechosos e histopatológicamente confirmados de EEB (53). Sin embargo, la Apo E es un marcador inespecífico de neurodegeneración y no puede ser útil para el diagnóstico de casos preclínicos de EEB. El análisis del líquido cerebroespinal para la proteína 14-3-3 tampoco es de utilidad en el diagnóstico de la EEB (68). De modo similar, los estudios sobre las proteínas S-100 en el líquido cerebroespinal (45) y en el suero (67) no proporcionan resultados sobre los que basar pruebas útiles para el diagnóstico de EEB. La detección electroquímica de metabolitos en la orina (52) presenta una validación final que indica unos valores de especificidad y sensibilidad inferiores a los requeridos para un posible papel independiente en el diagnóstico de la EEB. Hay datos preliminares que indican que en la orina del ganado bovino infectado se puede detectar un derivado de la molécula de PrP (77), lo que ha abierto nuevas investigaciones con vistas a comercializar una prueba de diagnóstico, pero se necesita más evaluación y revisión de los datos.

2)

Pruebas serológicas

A semejanza de lo que ocurre con el prurigo lumbar, donde no se ha detectado respuesta inmune en el hospedador, parece probable que no exista respuesta inmune en el caso de la EEB.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO En la actualidad no existen productos biológicos disponibles. Como se ha comentado anteriormente, en muchos países se ha autorizado la utilización de kits comerciales para diagnóstico.

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Capítulo 2.3.13. — Encefalopatía espongiforme bovina

99. W ILL R.G., IRONSIDE J.W., ZEIDLER M., COUSENS S.N., ESTIBEIRO K., ALPEROVITCH A., POSER S., POCCHIARI M., HOFMAN A. & SMITH P.G. (1996). A new variant of Creutzfeldt-Jakob disease in the UK. Lancet, 347, 921– 925. 100. WRATHALL A.E. (1997). Risks of transmitting scrapie and bovine spongiform encephalopathy by semen and embryos. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 16, 240–264. 101. WRATHALL A.E., BROWN K.F.D., SAYERS A.R., W ELLS G.A.H., SIMMONS M.M., FARELLY S.S.J., BELLERBY P., SQUIRRELL J., SPENCER Y.I., WELLS M., STACK M.J., BASTIMAN B., PULLAR D., SCATCHERD J., HEASMAN L., PARKER J., HANNAM D.A.R., HELLIWELL D.W., CHREE A. & FRASER H. (2002). Studies of embryo transfer from cattle clinically affected by bovine spongiform encephalopathy. Vet. Rec., 150, 365–378.

* * * NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la encefalopatía espongiforme bovina (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar la página web de la OIE para una lista actualizada: www.oie.int).

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CAPÍTULO 2.3.14.

FIEBRE CATARRAL MALIGNA

RESUMEN La fiebre catarral maligna (FCM) es una enfermedad aguda, generalizada y habitualmente fatal que afecta a muchas especies de Artiodactyla. Se ha descrito que la enfermedad afecta con mayor frecuencia a especies de la subfamilia Bovinae y la familia Cervidae, pero también se ha comprobado en cerdos domésticos así como en jirafas y especies de antílopes pertenecientes a la subfamilia Tragelaphinae. La FCM se caracteriza por acumulaciones celulares linfoides características en órganos no linfoides, vasculitis e hiperplasia de linfocitos T en órganos linfoides, y puede ser causada por uno de los dos gammaherpesvirus. El herpesvirus-1 alcelafino (AIHV-1), cuyo hospedador natural, el ñu, no se ve afectado en apariencia, causa la enfermedad en bóvidos en regiones de África y en una variedad de especies rumiantes en colecciones zoológicas de todo el mundo. El herpesvirus-2 ovino (OvHV-2), que prevalece en todas las variedades de ovejas domésticas como una infección subclínica, es la causa de la FCM en la mayor parte del mundo. Esta forma de la enfermedad se calificó primeramente como FCM asociada a la oveja. En ambas formas de la enfermedad, los animales que tienen la enfermedad clínica no son fuente de infección, ya que el virus sólo lo excretan los hospedadores naturales, ñues y ovejas, respectivamente. Normalmente, la FCM aparece de forma esporádica y afecta a unos pocos animales, aunque ambos virus pueden provocar epizootias. Existe una gradación marcada en la susceptibilidad hacia la forma OvHV-2 de la FCM que varía desde la resistencia relativa de Bos taurus y B. indicus, pasando por el búfalo de agua y muchas especies de ciervos, hasta los muy susceptibles ciervos del Père David y vacas de Bali. La enfermedad puede presentar un espectro amplio de manifestaciones clínicas que varían desde la forma aguda, en la que se observan cambios mínimos previos a la muerte, hasta los casos más complejos caracterizados por fiebre alta, opacidad bilateral de la córnea, descargas catarrales profusas de ojos y nariz, necrosis del hocico y erosión del epitelio bucal. La infectividad sólo puede recuperarse a partir de los animales con la forma AIHV-1 de la FCM empleando técnicas que mantienen la viabilidad de las células hospedadoras, mientras que la forma OvHV-2 nunca se ha recuperado a partir de los animales afectados. Normalmente el diagnóstico se consigue observando los cambios histopatológicos característicos, aunque la detección del ADN vírico en cualquiera de las formas de la enfermedad se ha convertido en la opción preferida. Identificación del agente: El AIHV-1 se puede recuperar a partir de los animales afectados clínicamente utilizando leucocitos de sangre periférica o suspensiones celulares preparadas a partir de ganglios linfáticos o bazo, pero la viabilidad celular debe conservarse durante el proceso ya que la infectividad no se puede recuperar de células muertas. También se puede recuperar el virus a partir de los ñues, o de leucocitos de sangre periférica o de suspensiones celulares de otros órganos. Probablemente la mayoría de los cultivos en monocapas de origen rumiante son susceptibles y desarrollan efecto citopático (ECP), aunque se han usado extensamente los cultivos celulares de tiroides de bovino para recuperar el virus. Los aislados primarios producen de forma típica un ECP multinucleado en el cual se puede identificar el antígeno vírico mediante inmunofluorescencia o inmunocitoquímica empleando antisueros adecuados o anticuerpos monoclonales. El agente OvHV-2 nunca se ha identificado formalmente, aunque las líneas celulares linfoblásticas propagadas a partir de animales infectados contienen el ADN específico del OvHV-2.

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El ADN vírico se ha detectado en el material clínico procedente de casos de FCM causada tanto por el AIHV-1, como por el OvHV-2 mediante la reacción en cadena de la polimerasa, y éste se ha convertido en el método elegido para el diagnóstico de la forma OvHV-2 de la enfermedad. Pruebas serológicas: El ñu infectado, el hospedador natural, desarrolla de forma estable anticuerpos contra el AIHV-1, que se pueden detectar en una variedad de ensayos, entre ellos, de neutralización vírica, de inmunoelectrotransferencia, de enzimoinmunoensayo, de inmunofluorescencia y de inmunocitoquímica. Sin embargo, la respuesta de anticuerpos de los animales afectados clínicamente es limitada y no desarrollan anticuerpos neutralizantes, de modo que la detección depende del empleo de ensayos de inmunofluorescencia o de inmunoelectrotransferencia. Los anticuerpos contra el OvHV-2 sólo se han detectado empleando el AIHV-1 como fuente de antígeno. De forma invariable, las ovejas domésticas producen anticuerpos que se pueden detectar mediante inmunofluorescencia o inmunoelectrotransferencia. Frecuentemente se pueden detectar los anticuerpos en las vacas con FCM mediante inmunofluorescencia, en tanto que en animales afectados de forma más grave, tales como los ciervos, no siempre están presentes los anticuerpos. El enzimoinmunoensayo de inhibición competitiva (CI-ELISA) más recientemente desarrollado parece tener una sensibilidad y especificidad igual o mayor que otras pruebas. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: No se han desarrollado vacunas contra esta enfermedad.

A. INTRODUCCIÓN La fiebre catarral maligna (FCM) es una enfermedad generalmente fatal de vacas y muchas otras especies de Artiodactyla, que tiene lugar después de una infección, bien con el herpesvirus-1 alcelafino (AIHV-1) o bien con el herpesvirus-2 ovino (OvHV-2). El ñu (Connochaetes spp. de la subfamilia Alcelaphinae), el hospedador natural del AIHV-1, no sufre enfermedad clínica después de la infección. De la misma forma, la infección de la oveja doméstica, el hospedador natural del OvHV-2, no se asocia con ninguna reacción clínica. La enfermedad causada por el AIHV-1 se limita a aquellas áreas de África en las que están presentes los ñues y a las colecciones zoológicas en cualquier otro sitio, y en un principio se calificó como FCM derivada del ñu. La forma OvHV-2 de la enfermedad tiene lugar en cualquier parte del mundo donde se practique la cría de ovejas, y se ha descrito como FCM asociada a ovejas (SA). Ambas formas de la enfermedad pueden presentar un espectro amplio de manifestaciones clínicas, aunque los cambios histopatológicos característicos son muy similares en todos los casos.

•

Cambios clínicos y patológicos

Los signos clínicos de la FCM son muy variables y van desde una forma peraguda a una crónica en la que, en general, las manifestaciones más evidentes aparecen en los casos más prolongados. En la forma peraguda o bien no se detectan signos clínicos, o bien se puede desarrollar depresión seguida de diarrea o disentería durante 12-24 horas antes de la muerte. En general, el inicio de los signos se asocia con la aparición de fiebre, lagrimeo seroso abundante y exudado nasal, que progresa hasta descargas mucopurulentas profusas. Los animales pueden estar inapetentes y se puede reducir la producción de leche. De forma característica, desarrollan opacidad bilateral progresiva de la córnea, que comienza en la periferia. En algunos casos aparecen lesiones en la piel (caracterizadas por ulceración y exudación), que pueden formar costras endurecidas asociadas con la necrosis de la epidermis, y frecuentemente están restringidas al perineo, las ubres y pezones. La salivación asociada con la hiperemia puede ser un signo temprano, que progresa hasta provocar erosiones en la lengua, el paladar duro, las encías y, de manera característica, las porciones distales de las papilas bucales. Los ganglios linfáticos superficiales se pueden infartar y las articulaciones de los miembros se pueden inflamar. Es posible que presenten signos nerviosos tales como hiperestesia, falta de coordinación, nistagmo y presión de cabeza en ausencia de otros signos clínicos o como parte de un síndrome característico más amplio. Existe un amplio espectro de susceptibilidad a la enfermedad inducida por el OvHV-2, que varía desde Bos taurus y B. indicus, que son relativamente resistentes, pasando por muchas especies de ciervos y el búfalo de agua (Bubalus bubalis), que son más susceptibles, hasta la extremadamente susceptible vaca de Bali (Bos javanicus) y el ciervo del Père David (Elaphurus davidianus). Las especies más resistentes tienden a experimentar una infección más prolongada y lesiones complejas, mientras que en las especies más susceptibles el curso de la enfermedad tiende a ser más corto y los signos clínicos menos dramáticos.

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Recientemente se han confirmado informes de varios países, y en particular de Noruega, en el sentido de que la enfermedad afecta a los cerdos domésticos (10). Los signos son muy similares a los que se observan en vacas afectadas por la forma aguda. Una forma leve de la enfermedad descrita en 1930 se consideró con cierto escepticismo debido a que se podía confirmar sólo mediante cambios histológicos observados en el examen post mortem. Sin embargo, investigaciones recientes llevadas a cabo con métodos moleculares y serológicos, parece que confirman que unos pocos animales infectados se pueden recuperar, tanto después de reacciones clínicas leves como después de otras bastante graves (11).

•

Patología

Los cambios patológicos conjuntos reflejan la gravedad de los signos clínicos, pero, generalmente, son extensos y pueden implicar la mayoría de sistemas orgánicos. Las erosiones y las hemorragias pueden presentarse a lo largo del tracto intestinal, y, en los casos más agudos, se pueden asociar con contenidos intestinales hemorrágicos. En general, los ganglios linfáticos están hipertróficos, aunque la extensión de su participación varía en cada animal. Con frecuencia, los ganglios linfáticos aparecen firmes y blancos al diseccionarlos, mientras que en otros casos, en particular los submandibulares y retrofaríngeos, pueden estar hemorrágicos e incluso necróticos. A menudo se observan en el tracto respiratorio las acumulaciones catarrales, las erosiones y la formación de una membrana diftérica. Frecuentemente, en el tracto urinario, están presentes hemorragias equimóticas características del revestimiento epitelial de la vejiga, mientras que el córtex renal puede estar afectado con múltiples focos blancos elevados, de 1–5 mm de diámetro y a veces rodeados por una zona delgada hemorrágica. Los cambios histológicos son la base para confirmar los casos de FCM y se caracterizan por degeneración epitelial, vasculitis, hiperplasia y necrosis de los órganos linfoides, y acumulaciones intersticiales extensas de células linfoides en órganos no linfoides. Las lesiones epiteliales pueden presentarse en todas las superficies epiteliales y se caracterizan por erosión y ulceración, con infiltración frecuente de células linfoides intraepiteliales y subepiteliales, que pueden estar asociadas con vasculitis y hemorragias. Generalmente, está presente la vasculitis y puede ser notable en el cerebro, afectando a venas, arterias, arteriolas y vénulas. Se caracteriza por infiltración de células linfoides de la túnica adventicia y media, con frecuencia asociada con degeneración fibrinoide. El lumen, puede estar “pavimentado” por células linfoides y, a veces, en los casos graves, las acumulaciones subendoteliales y el daño endotelial por las células linfoides pueden conducir a la oclusión del vaso. La hiperplasia de los ganglios linfáticos se caracteriza por una expansión de las células linfoblásticas del paracórtex, mientras que las lesiones degenerativas se asocian generalmente con los folículos. Frecuentemente, el edema con inflamación linfoide afecta al tejido perinodal. Es típica la acumulación intersticial de las células linfoides en los órganos no linfoides, en particular en el córtex renal y las áreas periportales del hígado, y, en el caso del riñón, puede ser muy extensa. En el cerebro puede observarse una meningoencefalitis no supurativa acompañada de manguito perivascular linfocítico y un incremento marcado en el número de células del líquido cerebroespinal. Las lesiones macroscópicas en la córnea se reflejan histológicamente por la infiltración de células linfoides que se origina en el limbo y que progresa hacia el centro, con desarrollo de edema y erosión en los casos más avanzados. También se puede presentar vasculitis, hipopion e iridociclitis. Las características patológicas de la FCM causadas por cualquiera de los agentes son esencialmente similares. Sin embargo, además del examen histológico, los métodos disponibles para el diagnóstico de la enfermedad inducida por el AIHV-1 o el OvHV-2 son muy diferentes y por ello se consideran por separado.

B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO B1. Herpesvirus-1 alcelafino Esta forma de la enfermedad se presenta en las regiones de cría de ganado bovino del éste de África donde los pastores utilizan áreas en las que pastan ñues, y en áreas del sur de África donde pastan juntos ñues y vacas. Sin embargo, la enfermedad también puede afectar a una variedad de otras especies de rumiantes en colecciones zoológicas de todo el mundo y así, aparte del antílope de las subfamilias Alcelaphinae e Hippotraginae, es aconsejable considerar a todos los rumiantes como susceptibles. La mayoría de pruebas de laboratorio cuentan con un aislado atenuado (WC11), que se ha sometido a muchos pases de laboratorio y se emplea como fuente de antígeno vírico y de ADN (13). La publicación reciente de la secuencia nucleotídica completa del virus virulento de un número bajo de pases (C500) constituirá la base de estudios futuros de este virus (4).

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1.

Identificación del agente

•

Animales afectados clínicamente

a)

Aislamiento La característica más notable de la FCM inducida por el AIHV-1 es la falta de antígeno vírico detectable o de citología específica de herpesvirus en las lesiones. Así, la confirmación de la infección depende de la recuperación vírica. Generalmente, la infectividad está asociada estrictamente a las células y, por tanto, el aislamiento se puede conseguir sólo a partir de suspensiones celulares o bien de leucocitos de sangre periférica, de ganglios linfáticos o bien de otros tejidos afectados. Las suspensiones celulares se preparan en el sobrenadante de cultivos de tejidos, aproximadamente 5 ‰ 106 células/ml, y se inoculan en monocapas de cultivos celulares preestablecidos. Se utilizan extensamente células de tiroides de bovino, pero probablemente la mayoría de cultivos celulares en monocapa primarios o de un número bajo de pases de origen rumiante proporcionará un sustrato celular adecuado para el aislamiento vírico. Después de 36–48 horas de incubación, se debería cambiar el medio de cultivo y observar las monocapas al microscopio (40‰) para comprobar si existen signos evidentes de efectos citopáticos (ECP). Estos aparecen de modo característico como focos multinucleados en las monocapas, después se retraen progresivamente hasta formar unos cuerpos densos con procesos citoplásmicos que pueden separarlos. A este proceso le sigue el recrecimiento de las monocapas normales. Un ECP puede tardar hasta 21 días en hacerse visible y rara vez se presenta antes del día 7. La infectividad en esta fase tiende a estar muy asociada a las células y, de este modo, cualquier pase posterior o almacenamiento debe emplear métodos que aseguren el mantenimiento de la viabilidad celular. Se debería determinar la especificidad del aislado utilizando antisueros específicos o anticuerpos monoclonales (MAbs) en pruebas de fluorescencia o inmunocitoquímicas.

b)

ADN vírico De forma característica, en los tejidos afectados se puede detectar muy poco ADN vírico, por tanto, es necesario amplificar el genoma vírico mediante cultivo convencional o mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se ha publicado un mapa de restricción de la cepa de laboratorio estándar (WC11) empleando los enzimas de restricción HindIII, EcoRI, BamHI y SmaI y se ha clonado la mayoría del genoma (2). Tales clones se pueden utilizar para identificar y caracterizar otros gammaherpesvirus aislados de bovinos. Se han generado los datos de secuencia del aislado WC11 del AIHV-1 y se han identificado los cebadores adecuados para utilizarlos en la prueba de PCR (7). Sin embargo, no se considera ninguno apropiado para utilizarlo como ayuda diagnóstica. Además, se ha publicado el genoma completo del aislado virulento C500 (4).

•

Hospedadores naturales

Prácticamente todos los ñues están infectados con el AIHV-1 a los 6 meses de vida, lo que provoca la extensión del virus como una epizootia intensa durante el periodo perinatal. Se asume que las especies Connochaetes taurinus taurinus, C.t. albojubatus y C. gnu están infectadas por el mismo virus. La infección parece persistir también en la mayoría de grupos de ñues de colecciones zoológicas. Sin embargo, es posible que la infección pueda estar ausente en animales que se hayan mantenido aislados durante la juventud o que vivan en grupos pequeños. La infección natural se ha detectado con éxito mediante ensayos de hibridación en secciones de pulmón de ñues azules jóvenes en Sudáfrica (12). En rara ocasión se contemplará el aislamiento vírico. Después de la infección existe un breve periodo de tiempo en el que se excreta el virus en una forma libre de células y se puede aislar a partir de frotis nasales. También se puede aislar el virus en ese momento a partir de leucocitos, pero en los animales mayores es menos probable el éxito a menos que el animal esté inmunodeprimido por estrés o por una intervención farmacológica. Además, se puede aislar el virus estableciendo cultivos de tejidos a partir de animales que son aparentemente normales y se ha logrado en cultivos en monocapa, tanto de riñón como de células de tiroides, procedentes de animales adultos. Otros antílopes grandes de las subfamilias Alcelaphinae y Hippotraginae también están infectados con gammaherpesvirus que están muy relacionados desde el punto de vista antigénico, pero no existe evidencia de que puedan transmitirse a otras especies y causar la FCM.

2.

Pruebas serológicas

•

Animales afectados clínicamente

La respuesta de anticuerpos de los animales afectados clínicamente es limitada, sin desarrollo de anticuerpos neutralizantes. En los casos clínicos la presencia de anticuerpos se puede demostrar de forma estable mediante

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inmunofluorescencia o la prueba de la inmunoperoxidasa (IPT) empleando como sustrato cultivos celulares infectados con el aislado vírico WC11. A pesar de que se han descrito otros métodos de detección de anticuerpos, ninguno ha demostrado ser satisfactorio. El primer método desarrollado fue un enzimoinmunoensayo de inhibición competitiva (CI-ELISA) diseñado para detectar anticuerpos dirigidos frente al OvHV-2 (9) y que utiliza un MAb (15-A) que tiene como diana un epítopo, al parecer conservado en todos los virus de la FCM.

•

Hospedadores naturales

Después de la infección de los ñues parece que se desarrollan anticuerpos de forma estable y se pueden identificar mediante pruebas de neutralización que emplean el aislado libre de células WC11, o mediante inmunofluorescencia, utilizando de nuevo el aislado WC11 e IgG anti-bovina, que se sabe que reacciona con la IgG de ñu. La cepa vírica Minnesota de la FCM, que no se distingue de la cepa WC11 del AIHV-1, se utiliza para la producción de antígeno para el CI-ELISA. Hasta ahora no ha habido intentos para estandarizar la prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFI) o la IPT, pero los dos métodos descritos a continuación se ofrecen a modo de ejemplo. La validación del CI-ELISA continúa en curso.

a)

Prueba de inmunofluorescencia indirecta La prueba IFI es menos específica que la de neutralización vírica (NV), y puede utilizarse para demostrar diversas variedades de antígenos “tempranos” y “tardíos” en las monocapas de células infectadas por el AIHV-1. Los anticuerpos que reaccionan en la prueba IFI o en la IPT se desarrollan en vacas y en conejos infectados de forma experimental durante el periodo de incubación, y más tarde en el curso clínico de la enfermedad, aunque las reacciones cruzadas con algunos otros herpesvirus bovinos, así como el OvHV-2, reducen el valor diagnóstico diferencial. Algunas veces, la detección de tales anticuerpos de reacción cruzada es útil para confirmar un diagnóstico de la SA-FCM. •

Preparación de portas fijados

Se inoculan cultivos celulares con el AIHV-1 (cepa WC11) cerca de o recién alcanzada la confluencia (véase Sección B1.2.c.). Se deberían procesar en paralelo, como control, cultivos no inoculados. Después de unos 4 días (cuando se espere que aparezcan los primeros signos de ECP, pero antes de declarar visible un ECP) se tratan los cultivos como se indica seguidamente: se elimina el medio, se extraen las células con una solución de tripsina-EDTA y se centrifugan aproximadamente a 800 g durante 5 minutos, se elimina el sobrenadante y se resuspenden las células en 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) por cada botella de plástico de cultivo celular de 800 ml. Se realiza una prueba depositando unas pequeñas cantidades de la suspensión celular en dos pocillos de un porta multiprueba recubierto de politetrafluoroetileno; se secan al aire y se fijan con acetona. Estos pequeños depósitos revelan con un suero estándar positivo y la anti-IgG conjugada para la especie apropiada. Se examina la incidencia de las células positivas y negativas bajo el microscopio de luz ultravioleta. Se ajusta la suspensión celular mediante la adición de células no infectadas y/o PBS hasta alcanzar la concentración adecuada que dará lugar a una capa única de células cuando se extiendan sobre el porta, con células positivas claramente definidas sobre un fondo de células negativas. Se deposita una pequeña cantidad de la suspensión celular positiva ajustada y de las suspensiones control negativo en portas multiprueba según el modelo deseado, y se secan al aire. Se fijan con acetona durante 10 minutos. Se lavan, se secan y se conservan con gel de sílice dentro de un contenedor hermético a –70°C. Un procedimiento alternativo, que es más fácil de evaluar, consiste en preparar monocapas de células infectadas y no infectadas en tubos de Leighton o en portas compartimentalizados. Las monocapas celulares se infectan a partir de 150 a 200 DICCT50 (dosis infectiva 50% en cultivo celular) del virus que se diluye en el medio de cultivo celular. Los portas infectados y no infectados se fijan con acetona y se conservan, como se ha indicado anteriormente, a –70°C. •

Procedimiento de la prueba

i)

Los portas se rehidratan durante 5 minutos con PBS, se lavan con agua destilada y se secan al aire.

ii)

Los sueros se diluyen 1/20 en PBS. Las muestras que den un fondo alto de tinción se pueden volver a probar a diluciones mayores. Se aplican los sueros diluidos a una pequeña cantidad de células positivas, por la presencia del virus de la FCM y a otra pequeña cantidad de células control negativo para cada muestra. Se incluyen controles de suero positivo y negativo. Lo ideal es que la prueba se valide volviendo a titular el control positivo para determinar su punto final.

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iii)

Se incuban a 37°C durante 30 minutos en una cámara húmeda.

iv)

Se eliminan los líquidos sobrantes. Los portas se lavan mediante dos cambios de PBS, durante 5 minutos cada uno.

v)

Se lavan con PBS durante 1 hora con agitación y, seguidamente, los portas se secan al aire.

vi)

Se aplica IgG anti-bovina de conejo conjugada a isotiocianato de fluoresceína (FITC) a una dilución de trabajo predeterminada.

vii)

Se incuban a 37°C durante 20 minutos, se elimina el líquido de los portas y se lavan dos veces con PBS durante 10 minutos cada vez.

viii) Se tiñen de contraste con azul de Evans 1/104 durante 30 segundos y se lavan con PBS durante 2 minutos. Se sumergen en agua destilada, se secan y se montan en PBS/glicerol (50/50). ix)

b)

Se examinan por microscopía de fluorescencia para detectar uniones específicas de anticuerpos a las células infectadas.

Prueba de inmunoperoxidasa Se prepara una dilución del AIHV-1 cultivado en células de turbinados de cornetes etmoidales bovinos (BT) que contiene aproximadamente 103 DICCT50 en una suspensión de células BT tripsinizadas en fresco y se inocula en tubos de Leighton con cubreobjetos, 1,6 ml por tubo, o en portas de cuatro cámaras, 1,0 ml por cámara. Los cultivos celulares se examinan a los 4–6 días para detectar posibles ECPs y se fijan con acetona cuando comiencen los signos de ECP. Se quitan las cámaras de plástico, pero no las gomas, a partir de las cámaras de los portas antes de la etapa de fijación y para ésta se emplea acetona (p.ej. UltimAR) que no degrada las gomas. Las células fijadas se conservan a –70°C.

•

Procedimiento de la prueba

i)

Se prepara diluyente de la IPT (21,0 g de NaCl y 0,5 ml de Tween 20 se adicionan a 1 litro de 0,01 M PBS, pH 7,2) y líquido de lavado (0,5 ml de Tween 20 se añaden a 1 litro de 0,01 M PBS, pH 7,2).

ii)

El suero problema se diluye 1/20 en el diluyente de la IPT y se extienden 150–200 µl sobre un cubreobjetos fijado infectado con el virus o una cámara de un porta.

iii)

Se incuba el cubreobjetos en una cámara húmeda a 37°C durante 30 minutos.

iv)

Se sumerge el cubreobjetos tres veces en líquido de lavado.

v)

Se extienden 150–200 µl de IgG anti-bovina marcada con peroxidasa (1/5000 en diluyente de la IPT) sobre el cubreobjetos o sobre la cámara del porta.

vi)

Se incuba el cubreobjetos o el porta a 37°C durante 30 minutos.

vii)

Se sumerge el cubreobjetos tres veces en líquido de lavado.

viii) Se diluye en sustrato AEC (3-amino-9-etilcarbazol) en agua destilada (5 ml de agua destilada, dos gotas de tampón, dos gotas de peróxido de hidrógeno y 3 gotas de AEC) y se aplica al cubreobjetos o al porta.

c)

ix)

Se incuba en una cámara húmeda a 37°C durante 8–10 minutos.

x)

Se sumerge el cubreobjetos en agua destilada, se seca al aire y se monta en un porta de cristal. Las cámaras del porta compartimentalizado se examinan una vez secas.

xi)

El porta se examina al microscopio óptico. La presencia de un color rojizo-parduzco en el núcleo de las células infectadas indica una reacción positiva.

Neutralización vírica Se han desarrollado pruebas para detectar anticuerpos dirigidos contra el AIHV-1 tanto en el reservorio infectado de forma natural como en los hospedadores indicadores. La primera de éstas es una prueba de NV que emplea el virus libre de células de la cepa WC11 y la segunda prueba utiliza un aislado de antílope (AIHV-2). AIHV-1 y AIHV-2 producen anticuerpos de reacción cruzada y, por tanto, cualquiera de las cepas puede utilizarse en los ensayos. Esta prueba es laboriosa, pero puede llevarse a cabo en placas de microtitulación con líneas celulares o células de un número bajo de pases. Las principales aplicaciones se orientan al estudio del rango y extensión de la infección natural en las especies de vida salvaje, cautivas en los zoológicos y, en menor extensión, en las poblaciones de ovejas. También es útil en los intentos dirigidos al desarrollo de vacunas que, en todos los casos, han tenido un éxito muy limitado. Se pueden inducir anticuerpos de NV de título alto, pero, evidentemente, no son protectores.

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El stock del AIHV-1 (cepa WC11) se replica en cultivos celulares primarios o secundarios de riñón bovino, tiroides bovino, testículo bovino a bajo pase u otro tipo de células permisivas. El virus se conserva en alícuotas a –70°C. El stock se titula para determinar la dilución que dé una 100 DICCT50 en 25 µl bajo las condiciones de prueba.

•

Procedimiento de la prueba

i)

Los sueros se inactivan durante 30 minutos a 56 C° en un baño de agua.

ii)

Se realizan diluciones al doble de los sueros problema en el medio de cultivo celular desde 1/2 a 1/16 en una placa de microtitulación para cultivo celular de 96 pocillos de fondo plano, utilizando cuatro pocillos por cada dilución y volúmenes de 25 µl por cada pocillo. En la prueba también se incluyen sueros control positivo y negativo. No se dispone de sueros estándares, pero deberían prepararse estándares internos positivos y titularse en un rango apropiado.

iii)

Se añaden 25 µl por pocillo del stock del virus WC11 diluido en el medio de cultivo de modo que la dilución calculada proporcione 100 DICCT50 por pocillo.

iv)

Se incuban durante una hora a 37°C. También se incuba el stock vírico residual.

v)

Se vuelve a titular el virus residual en cuatro etapas de dilución a la décima, empleando 25 µl por pocillo y al menos cuatro pocillos por cada dilución.

vi)

Se añaden 50 µl por pocillo de suspensión celular de riñón bovino a una densidad de 3 ‰ 105 células/ml.

vii)

Las placas se incuban en atmósfera humedecida y CO2 a 37°C durante 7–10 días.

viii) Las placas se examinan al microscopio para detectar posibles ECPs. Se valida la prueba comprobando de nuevo la titulación (que debería dar un valor de 100 DICCT50 con un rango permisible 30–300) y los sueros control. El suero estándar positivo debería dar un título dentro de 0,3 log10 unidades de su media predeterminada.

d)

ix)

Los resultados del suero problema se determinan por el método de Spearman–Kärber como la dilución del suero que neutraliza al virus en el 50% de los pocillos.

x)

Un suero negativo no debería dar neutralización a la menor dilución probada (1/2 equivalente a la dilución de 1/4 en la etapa de neutralización).

Enzimoinmunoensayo de inhibición competitiva (CI-ELISA) Primero se desarrolló un CI-ELISA para detectar anticuerpos frente al OvHV-2 (9) que utiliza un MAb (15-A) dirigido contra un epítopo presente en un complejo de glicoproteínas que parece estar conservado en todos los virus de la FCM. El MAb se preparó contra el aislado Minnesota del virus, que es indistinguible de la cepa WC11 del AIHV-1. La prueba se ha empleado para detectar anticuerpos en el suero de rumiantes salvajes y domésticos en Norteamérica y se han detectado anticuerpos frente a los siguientes virus patogénicos: AlHV-1, AlHV-2, OvHV-2, CpHV-2 y el herpesvirus de origen desconocido que se observó que causa la FCM clásica del ciervo de cola blanca, así como los virus del grupo de la FCM todavía no descritos como patogénicos, tales como los del antílope del género Oryx, el buey almizclero (Ovibos moschatus) y otros. Recientemente la prueba se ha remodelado para incrementar su sensibilidad (8). Este cambio puede permitir la detección de anticuerpos de corderos recién infectados y de animales en la fase aguda de la enfermedad, que a veces no se detectaban en el formato previo. El CI-ELISA tiene la ventaja de ser más rápido y presenta más rendimiento que la prueba IFI o la IPT. Se dispondrá de datos de validación adicionales cuando se extienda su uso a más laboratorios en otras partes del mundo. Se dispone comercialmente de un juego completo de reactivos para el CI-ELISA, incluyendo placas prerrecubiertas, sueros control y anticuerpos marcados. Se da el siguiente protocolo para que los laboratorios que lo deseen preparen sus propias placas antigenadas. Placas immuno 4 ELISA (Dynatech Lab, Chantilly, Virginia) se cubren a 4°C (39°F) durante 18–20 horas con 50 µl de una solución que contenga 0,2 µg de antígenos víricos semipurificados del la FCM (aislados Minnesota o WC11 del AlHV-1) en 50 mM tampón carbonato/bicarbonato (pH 9,0). Las placas recubiertas se bloquean a temperatura ambiente (21–25°C, 70–77°F) durante 2 horas con 0,05 M PBS que contiene sacarosa al 2%, 0,1 M glicina, seroalbúmina bovina al 0,5% y NaCl al 0,44% (pH 7,2). Después del bloqueo, se vacían los pocillos y seguidamente se secan las placas en un ambiente de baja humedad a 37°C durante 18 horas, se introducen en bolsas de plástico con desecante y se sellan y conservan a 4°C (39°F) (8). El MAb 15-A está conjugado con peroxidasa de rábano picante por la empresa VMRD, que emplea un método estándar con periodato.

•

Procedimiento de la prueba

i)

Los controles positivos y negativos (suero o plasma) se diluyen 1/5 con tampón de dilución (PBS que contenga Tween 20 al 0,1%, pH 7,2).

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ii)

Se añaden 50 µl de muestras diluidas control o problema a una placa antigenada (cuatro pocillos para el control negativo y dos pocillos para el control positivo). Se deja vacío el pocillo A1 como blanco para el lector de placas.

iii)

Se cubre la placa con parafilm y se incuba durante 60 minutos a temperatura ambiente (21–25°C, 70 –77°F).

iv)

Mediante un frasco lavador, se lava la placa tres veces con tampón de lavado (el mismo que el tampón de dilución: PBS que contenga Tween 20 al 0,1%, pH 7,2).

v)

Se prepara en el momento el conjugado anticuerpo-peroxidasa ‰ 1 diluyendo una parte del conjugado ‰ 100 con 99 partes del tampón de dilución.

vi)

Se adicionan 50 µl del conjugado anticuerpo-peroxidasa a cada pocillo de muestra. Se cubre la placa con parafilm y se incuba durante 60 minutos a temperatura ambiente (21–25°C, 70–77°F).

vii)

La placa se lava tres veces con tampón de lavado.

viii) A cada pocillo de muestra se adicionan 100 µl de solución de sustrato (TMB Microwell, BioFX Laboratories, Owings Mills, Maryland). Se incuba durante 60 minutos a temperatura ambiente (21– 25°C; 70–77°F). No se elimina la solución de los pocillos. ix)

Se para la reacción añadiendo 100 µl de solución de parada (0.18 M ácido sulfúrico) a cada pocillo. No se elimina la solución de los pocillos.

x)

Se leen las densidades ópticas (OD) mediante un lector de placas de ELISA a 450 nm.

xi)

Se calcula el % de inhibición: 100 –

OD de la muestra (Media) ‰ 100

= % de Inhibición

OD media del control negativo xii)

Interpretación de los resultados: Si una muestra problema provoca una inhibición igual o mayor del 25% se considerará positiva. Si una muestra problema provoca una inhibición menor del 25% se considerará negativa.

xiii) Validación de la prueba: La OD media del control negativo debe caer entre los valores 0,40 y 2,10. La media del control positivo debe producir una inhibición mayor del 25%.

B2. Herpesvirus-2 ovino Esta forma de la enfermedad, que se presenta en vacas y otras especies animales de todo el mundo, normalmente aparece de foma esporádica y afecta sólo a uno o unos pocos animales. Sin embargo, de vez en cuando, se producen incidentes en los que se ven afectados varios animales, lo que parece estar asociado con ciertos rebaños de ovejas que pueden continuar transmitiendo la enfermedad durante unos cuantos años. También se puede transmitir más fácilmente la enfermedad al ciervo rojo (Cervus elaphus) y a otras especies de ciervos, al búfalo de agua (Bubalus bubalis) e incluso con mayor facilidad al ciervo del Père David (Elaphurus davidianus) y a la vaca de Bali (Bos javanicus). El OvHV-2 también causa la FCM en colecciones zoológicas en las que la enfermedad se ha descrito en una variedad de especies entre las que se incluye la jirafa. Se ha descrito la enfermedad en cerdos procedentes de varios países, pero se reconoce con mayor frecuencia en Noruega, donde regularmente se presentan casos que implican a diversos animales. El diagnóstico no puede basarse en los signos clínicos y en el examen patológico global, ya que éstos pueden ser extremadamente variables. El examen histológico de una variedad de tejidos incluye, con frecuencia, riñón, hígado, vejiga urinaria, epitelio bucal, córnea/conjuntiva y cerebro, y ha sido el único método para conseguir un diagnóstico más acertado. Sin embargo, ahora también se puede tratar de detectar anticuerpos dirigidos frente al virus y/o ADN vírico y esto se ha convertido rápidamente en el método elegido. Se debe enfatizar que la causa vírica de la SA-FCM no se ha aislado y que las evidencias del OvHV-2 se basan en: (a) la presencia de anticuerpos en los sueros de todas las ovejas domésticas, que presentan reacción cruzada con los antígenos del AIHV-1 en la prueba IFI y en los de inmunoelectrotransferencia (5), pero no en los de neutralización; (b) el desarrollo de anticuerpos que presentan reacción cruzada con el AIHV-1 en la prueba IFI en una proporción de vacas con la SA-FCM y en todos los cricetos infectados de forma experimental; (c) la detección y clonación del ADN procedente de líneas celulares linfoblásticas derivadas de casos naturales de la SA-FCM que hibrida de modo cruzado con el ADN del AIHV-1, pero que es distinto de él.

1.

Identificación del agente

Œ

Animales afectados clínicamente

Los intentos para recuperar el virus que causa la enfermedad a partir de casos clínicos han fallado invariablemente. Sin embargo, existen varios informes sobre la recuperación de diferentes agentes víricos

622

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Capítulo 2.3.14. — Fiebre catarral maligna

procedentes de casos clínicos, ninguno de los cuales ha establecido una relación causal; su aislamiento por supuesto es fortuito o debido a contaminación de laboratorio; sin embargo, se han generado líneas celulares linfoblásticas a partir de vacas y ciervos afectados, algunos de los cuales transmiten la enfermedad después de la inoculación en animales de experimentación (14). Tales líneas celulares contienen secuencias víricas que hibridan con clones del ADN del AIHV-1 (3). Se han clonado diversos fragmentos víricos procedentes de una librería genómica de una de tales líneas que ha sido objeto de caracterización posterior. Para la secuenciación se eligió un subclón que no hibridaba con el AIHV-1 y se descubrió que codificaba una proteína muy similar a la proteína del tegumento del virus Epstein–Barr. En esta secuencia se identificaron los cebadores adecuados para ser utilizados en el ensayo de la PCR y se diseñó un protocolo sensible en el que se amplificó inicialmente un fragmento de 422 pares de bases (bp), seguido de la amplificación de un fragmento interno truncado de 238 bp. Se ha demostrado que esta prueba es capaz de detectar tan sólo 35 equivalentes del genoma vírico y que no se amplifica el producto procedente del AIHV-1 o de otros herpesvirus bovinos (1). Así, esta PCR se considera muy específica y sensible para el AIHV-2 y se emplea en todo el mundo en estudios de la enfermedad de animales afectados clínicamente y del hospedador natural. Esta prueba está emergiendo como una prueba firme que se puede emplear para detectar ADN vírico en leucocitos de sangre periférica de animales afectados clínicamente así como en tejidos frescos y muestras incluidas en parafina recogidas en examen post mortem. Se ha informado acerca del uso de partículas magnéticas para purificar el ADN antes de la amplificación lo que resulta en una mejora adicional de la prueba, pero todavía se tiene que evaluar. También se ha descrito un ensayo de PCR fluorogénico cuantitativo para el OvHV-2 (6) y es probable que en el futuro tenga valor para su aplicación.

•

Reacción en cadena de la polimerasa La extracción del ADN a partir de material clínico se lleva a cabo de acuerdo con el protocolo definido en un kit de extracción apropiado (p.ej. Quiagen DN easy Tissue Kit). Las reacciones de amplificación se realizan en volúmenes de 50 µl que contengan no más de 2 µg ADN problema en 10 mM Tris HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, gelatina al 0,01% (v/v), sulfuro de dimetilo al 10% (v/v), 200 µm de dATP, dCTP, dGTP y dTTP (Pharmacia), 1 µM de cada cebador y 2 unidades de ADN-polimerasa Taq con 50 µl de aceite mineral (Sigma) para impedir la evaporación. El programa consiste en un preciclo a 99°C durante 3 minutos, después de el cual se añade la mezcla del enzima y los dNTP. A esto le siguen 25 ciclos a 94°C durante 20 segundos, a 60°C durante 30 segundos y a 72°C durante 30 segundos. Una alícuota de 2 µl del producto primario de amplificación, especificado mediante el par cebador 556/755, se transfiere directamente a una nueva mezcla de reacción y se amplifica empleando los pares de cebadores 556/555 bajo condiciones idénticas durante unos 25 ciclos adicionales con una extensión final a 72°C durante 5 minutos. Los productos finales de la amplificación (10 µl) se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,8% y fluorescencia con bromuro de etidio. También se amplifican y analizan con cada lote de muestras problema un control positivo conocido y agua destilada.

•

Hospedadores naturales

La oveja doméstica es el hospedador natural del OvHV-2 y se ha demostrado que todos los animales estudiados son seropositivos para el AIHV-1. Es más, parece que algunos corderos se infectan en el útero, lo que hace muy difícil su identificación en los animales no infectados. Frecuentemente los corderos neonatales son la fuente de infección, aunque las ovejas de cualquier edad pueden transmitir la enfermedad. Nunca se ha recuperado el virus a partir de las ovejas, pero el ensayo de PCR desarrollado para detectar el ADN del OvHV-2 en casos clínicos de FCM también se ha empleado para detectar el virus en los leucocitos de sangre periférica de ovejas adultas normales y en secreciones nasales y orofaringe de los corderos durante los primeros meses de vida. De este modo, al igual que parece suceder en la infección de ñues debida al AIHV-1, las ovejas se infectan con el OvHV-2 cuando son jóvenes y permanecen así infectadas de forma latente de por vida. Hasta la fecha permanecen a nivel especulativo los factores que predisponen a los hospedadores susceptibles para la propagación y transmisión del virus de la FCM. Además de las ovejas, las cabras domésticas y otros miembros de la subamilia Caprinae presentan anticuerpos que reaccionan frente al AIHV-1 de forma similar al suero de oveja. Esto implica que estas especies se infectan con virus similares al OvHV-2 y se ha hallado que algunas cabras son positivas en un ensayo de PCR para el OvHV-2, aunque no se conoce su papel potencial para causar la FCM.

2.

Pruebas serológicas

Sólo se han detectado anticuerpos dirigidos frente al OvHV-2 utilizando el AIHV-1 como fuente de antígeno. Los anticuerpos frente al AIHV-1 se pueden detectar en el 70–80% de las vacas afectadas clínicamente mediante procedimientos IFI o IPT, pero en general no están presentes en ciervos afectados o animales que desarrollan la enfermedad en la modalidad aguda o peraguda. Los anticuerpos se detectan mediante una prueba IFI

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Capítulo 2.3.14. — Fiebre catarral maligna

empleando células de cultivo de tejidos infectados con el AIHV-1. Las monocapas celulares que crecen sobre los cubreobjetos exhibiendo ECPs del orden del 10–50% se recogen, se lavan, se fijan con acetona y se utilizan en el ensayo. Los cubreobjetos se montan con DPX, con el lado que contiene las células hacia arriba, sobre portas microscópicos y se tratan con suero normal de caballo al 10% antes de seguir con el procedimiento convencional de la prueba IFI. El procedimiento de la IPT puede llevarse a cabo del mismo modo que en el caso del AIHV-1. El único virus de vaca del que se ha descrito que presenta reacción cruzada con el AIHV-1 es el herpesvirus bovino tipo 4 (BHV-4). Así, el control negativo para esta prueba debería consistir en monocapas infectadas con el BHV-4 de forma similar. Sólo se considerarán positivos los sueros en el caso de que los focos muestren una distribución de antígeno intranuclear característica con poco o ninguna tinción citoplásmica detectada en las células infectadas por el AIHV-1 y ninguna reacción en las células infectadas por el BHV-4. Los sueros que reaccionen con los antígenos de ambos virus se considerarán como resultados no concluyentes. Se ha desarrollado una técnica CI-ELISA para detectar anticuerpos frente al OvHV-2 (9) que utiliza MAbs (15-A) preparados contra el llamado aislado vírico Minnesota, que es indistinguible del AIHV-1. Se ha empleado esta prueba para detectar anticuerpos en el suero de rumiantes salvajes y domésticos en Norteamérica y parece que tiene algún éxito. Sin embargo, se aprecia una escasa correlación entre el desarrollo de anticuerpos detectados en el suero de corderos y la adquisición de infección con el OvHV-2, como parece indicar la presencia de ADN vírico detectado por PCR, puesto que se detectó resultado positivo sólo en una parte de las ovejas. Esto muestra un marcado contraste con otros estudios acerca del empleo de la prueba IFI que indican que la mayoría, sino todas las ovejas domésticas, son seropositivas. En un estudio realizado sobre la reacción del suero de oveja hacia las proteínas estructurales del AIHV-1 en ensayos de inmunoelectrotransferencia, la reactividad de los diferentes sueros varió considerablemente, lo que indica que las ovejas individuales responden de modo diferente con respecto al reconocimiento, por parte de los anticuerpos, de los epítopos de reacción cruzada del AIHV.1. De modo que es probable que algunos resultados negativos obtenidos mediante un CI-ELISA se deban a la extrema especificidad de epítopo de tal prueba basada en MAbs que fallan en detectar anticuerpos en una proporción de los sueros. Por tanto, se deberían interpretar con precaución los resultados de tales ensayos. Sin embargo, recientemente se ha descrito una prueba remodelada que puede solventar el problema de la sensibilidad (8) y proporciona una mayor utilidad. La técnica CI-ELISA, como se describe en la Sección B1.2.d, se ha utilizado con éxito para detectar anticuerpos contra el OvHV-2.

B3. Control Hasta la fecha el control depende de la segregación de los hospedadores naturales de las especies susceptibles; el alcance de esa segregación depende de cuáles sean las especies implicadas. En el caso del AIHV-1, parece que los animales afectados por la FCM nunca, o raramente, transmiten la infección, puesto que sólo el hospedador natural puede actuar como fuente de infección. Aparentemente los ñues son transmisores eficaces de la infección de la mayoría de las restantes categorías de rumiantes y que, por tanto, es importante su separación en el caso de poblaciones mixtas. Igualmente, los pastores deben asegurarse de que las vacas están completamente separadas de la zona de los ñues y de los pastos recién utilizados por ellos, en particular en la época de partos de los ñues. En el caso del OvHV-2, el requisito de separar las ovejas depende de la susceptibilidad de las especies implicadas. Así, en el caso del ciervo del Père David y la vaca de Bali, se debe asegurar una estricta separación y evitar el contacto a través de los fomites. Igualmente, en el caso de los ciervos de granja se deben realizar todos los esfuerzos razonables para independizar la gestión de las ovejas y los ciervos, aunque el gamo parece ser más resistente a la FCM. Sólo en raras ocasiones las vacas desarrollan la SA-FCM, y por este motivo generalmente se manejan junto con las ovejas sin tomar precauciones que impidan la transmisión de la enfermedad. Sin embargo, si se producen casos múltiples, es esencial separar el rebaño de ovejas tan lejos como sea posible de las vacas. Como tales rebaños pueden continuar siendo fuentes de infección durante algunos años, se debería considerar la eliminación de estos rebaños mediante su sacrificio. Adicionalmente, la posibilidad de que puedan producirse periodos de incubación muy largos, por encima de 9 meses, obliga a realizar un pronóstico cauteloso en el caso de que se aconseje controlar tales brotes.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO No se ha identificado un régimen de vacunación eficaz. Sin embargo, la mayoría de las investigaciones emplean aislados del AIHV-1 que se adaptan al cultivo de tejidos y que generalmente son avirulentos. Estudios recientes de los cambios moleculares en el virus han mostrado que, en el curso de la adaptación al cultivo in vitro, se produce una deleción específica en el ADN vírico que parece ser una constante entre los diferentes aislados durante el proceso de atenuación. Así, se ha propuesto que este segmento deleccionado codifica un factor (es) virulento(s). La omisión de este producto en las vacunas probadas previamente puede haber contribuido al escaso éxito de estos experimentos. Una secuencia homóloga a esta deleción está presente también en el OvHV-2, lo que sugiere que está conservada y, de este modo, proporciona un peso adicional a la hipótesis de que puede tener un papel importante en la patogénesis de la FCM (4).

624

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Capítulo 2.3.14. — Fiebre catarral maligna

Por tanto, las estrategias de vacunación futuras deberían considerar la incorporación de estos componentes víricos que pueden proteger frente a ambas formas de la FCM.

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3.

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5.

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* * *

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CAPÍTULO 2.3.15.

TRIPANOSOMOSIS (TRANSMITIDA POR LA MOSCA TSE—TSÉ)

RESUMEN La tripanosomosis1 transmitida por la mosca tse–tsé es una enfermedad compleja producida por varias especies de protozoos parásitos del género Trypanosoma, transmitida cíclicamente por el género Glossina (mosca tse–tsé). Esta enfermedad puede afectar a varias especies de mamíferos pero, desde el punto de vista económico, la tripanosomosis trasmitida por la mosca tse–tsé, es especialmente importante en el ganado vacuno. Está producida principalmente por Trypanosoma congolense, T. vivax y, en menor medida, por T. brucei brucei. Identificación del agente: Se pueden utilizar varias técnicas de detección de parásitos, incluyendo el examen microscópico de extensiones gruesas o finas de sangre fresca y teñida. La sensibilidad diagnóstica aumenta de forma significativa concentrando los parásitos antes de examinarlos, en combinación con el uso de un microscopio de contraste de fases o de campo oscuro. Las técnicas de concentración de parásitos tienen la ventaja añadida de que el hematocrito, y por tanto el nivel de anemia, se puede determinar a nivel de animales individuales y/o a nivel de manada. Una prueba muy sensible, utilizada sobre bases más experimentales, es la reacción en cadena de la polimerasa. Pruebas serológicas: Dos pruebas de detección de anticuerpos tripanosomiales, la prueba de inmunofluorescencia indirecta y la detección de anticuerpos por enzimoinmunoensayo (ELISA), se utilizan de manera rutinaria para la detección de anticuerpos en el ganado bovino. Presentan una alta sensibilidad y especificidad pero sólo se pueden utilizar para el diagnóstico preliminar de la tripanosomosis. En particular, el ELISA para detección de anticuerpos, se presta a la automatización y permite un alto grado de estandarización cuando se han desarrollado y validado antígenos recombinantes. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: En la actualidad no se utilizan productos biológicos.

A. INTRODUCCIÓN La tripanosomosis transmitida por la mosca tse–tsé es una enfermedad compleja producida por varias especies de protozoos parásitos del género Trypanosoma, transmitida cíclicamente por el género Glossina (mosca tse–tsé). La mosca tse–tsé ocupa 10 millones de kilómetros cuadrados y afecta a 37 países, fundamentalmente en África. La enfermedad afecta a varias especies de mamíferos pero, desde el punto de vista económico, la tripanosomosis transmitida por la tse–tsé es particularmente importante en el ganado vacuno (en África del Sur se refieren a ella como nagana o enfermedad de la mosca tse–tsé). Está causada fundamentalmente por Trypanosoma congolense, T. vivax y, en menor grado, T. brucei brucei. Trypanosoma uniforme, T. simiae y T. suis son otras especies menos comunes transmitidas por la mosca tse–tsé. Trypanosoma vivax también se transmite mecánicamente por moscas picadoras, como lo pone de manifiesto su presencia en América del Sur y Central. La tripanosomosis transmitida por la mosca tse–tsé también afecta a los humanos, produciendo la enfermedad del sueño, por infección tanto por T. brucei gambiense como por T. brucei rhodesiense. 1

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Nota sobre la nomenclatura de enfermedades por parásitos: La Asociación Mundial para los avances en Parasitología Veterinaria ha recomendado una nomenclatura estandarizada en "Standardised Nomenclature of Animal Parasitic Diseases" (Kassai, T., Cordero del Campillo M., Euzeby J., Gaafar S., Hiepe Th. & Himonas C.A. [1988]. Vet Parasitol., 29, 299–326). En principio, el nombre de la enfermedad se construye añadiendo el sufijo "–osis" a la raiz del nombre de la taxonomía del parásito. En este Manual se ha seguido esta terminología, y "trypanosomosis" reemplaza por tanto al término antiguo "trypanosomiasis".

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Capítulo 2.3.15.  Tripanosomosis (transmitida por la mosca tse—tsé)

Los síntomas clínicos de la tripanosomis transmitida por tse–tsé pueden incluir fiebre intermitente, edema, aborto y extenuación. La anemia se desarrolla generalmente en animales afectados y es seguida por pérdida de peso corporal, producción reducida y a menudo mortalidad. Los síntomas post–morten incluyen adelgazamiento, infarto ganglionar, hígado y bazo inflamados, líquido excesivo en las cavidades del cuerpo, y hemorragias petequiales. En los animales muertos durante la fase crónica de la enfermedad, los órganos linfáticos generalmente ya no están inflamados y es común encontrar miocarditis grave. Ni los síntomas clínicos ni los post–morten de la tripanosomosis transmitida por la mosca tse–tsé son patognomónicos. Por tanto, el diagnóstico debe hacerse con técnicas directas que confirmen la presencia de tripanosomas bien por visualización microscópica, o por técnicas serológicas indirectas o por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO Existen una gran variedad de pruebas de diagnóstico (25) y los investigadores tratan aún de mejorar las existentes y de desarrollar nuevas pruebas. Las pruebas de diagnóstico usuales varían en sensibilidad y especificidad, comodidad de aplicación y coste (23). La elección de una prueba en particular se guiará por principios económicos y la disponibilidad de expertos, pero especialmente por las necesidades del diagnóstico. Por ejemplo, se aplican diferentes grados de sensibilidad y especificidad para la confirmación de la infección en un animal individual en comparación con la detección de la infección a nivel de manada. De forma similar, la prueba(s) de diagnóstico para establecer la prevalencia parasicológica de tripanosomosis es diferente de la requerida para establecer la presencia o ausencia de la enfermedad en la zona. Se pueden conseguir diagnósticos fiables combinando pruebas diagnósticas apropiadas. La interpretación fiable de los resultados de pruebas diagnósticas dependerá de la validez de las pruebas así como de la selección/recogida apropiada de la muestra, el tamaño de la muestra, y la forma de realizar las pruebas diagnósticas.

1.

Identificación del agente

Las técnicas de detección de parásitos son muy específicas, pero su sensibilidad es relativamente baja (es decir, la proporción de resultados negativos falsos es alta). La sensibilidad es especialmente baja cuando se consideran los resultados a nivel de animal individual más que a nivel de manada. Debido a su baja sensibilidad, la prevalencia parasitológica aparente de la tripanosomosis es generamente más baja que la prevalencia parasitológica verdadera. La baja sensibilidad diagnóstica hace que sea difícil detectar tripanosomosis cuando está presente con baja prevalencia parasitológica, y es imposible establecer la ausencia de la enfermedad con un grado alto de seguridad. Además, en las áreas donde se usan ampliamente fármacos tripanosomicidas, los parásitos no pueden ser detectados. Existen varias técnicas de detección de parásitos, cada una con una sensibilidad distinta. La elección dependerá de las instalaciones de laboratorio disponibles y del objetivo del diagnóstico.

•

Técnicas de examen directo

Las técnicas más simples son el examen de extensiones de sangre fresca, gruesas o finas, obtenidas generalmente de la vena de la oreja, vena yugular o vena de la cola. Entre las técnicas directas de examen, las extensiones finas de sangre teñida se consideran más específicas pero menos sensibles que las otras dos. La especificidad y la sensibilidad real de estas técnicas es directamente dependiente del volumen de sangre realmente examinado y de la destreza y experiencia del microscopista.

a)

Extensiones de sangre fresca Se realizan colocando una gota de sangre (alrededor de 2 µl) sobre una porta limpio de microscopio y se cubre con un cubreobjetos (22x22 mm). La sangre se examina microscópicamente a un aumento total de x400 con apertura de condensador, contraste de fase o contraste de interferencia. Se examinan aproximadamente 50–100 campos. Se puede reconocer a los tripanosomas por su movimiento entre los eritrocitos (RBCs). El método es simple, barato y da resultados inmediatos. Dependiendo del tamaño del tripanosoma y de los movimientos, se puede hacer un diagnóstico preliminar de la especie de tripanosoma. La confirmación final de la especie se hace mediante el examen de la preparación teñida. La sensibilidad diagnóstica del método es generalmente baja, pero depende de la experiencia del examinador y del nivel de parasitemia. Se puede mejorar la sensibilidad de forma notable lisando los RBCs antes del examen utilizando un agente hemolítico como dodecil sulfato sódico (SDS).

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Capítulo 2.3.15.  Tripanosomosis (transmitida por la mosca tse—tsé)

b)

Extensiones gruesas de sangre Se hacen colocando una gota de sangre (5–10µl) sobre una porta limpio de microscopio y extendiéndola sobre un área de 2 cm de diámetro, aproximadamente, utilizando el borde de otro porta. El grosor de la gota resultante debe ser tal que, cuando se seque, se puedan leer a través de ella los números de la esfera de un reloj de pulsera. La gota se seca complemente agitándola rápidamente en el aire y, sin fijación, se deshemoglobiniza por inmersión en agua destilada durante unos pocos segundos y se seca antes de teñirla. Se debería guardar el frotis, seco y protegido del polvo, calor, moscas y otros insectos. Se tiñe durante 30 minutos con colorante Giemsa diluido al 4% en solución salina tamponada con fosfato, pH 7.2. El tiempo de tinción y la dilución del colorante pueden variar según el colorante y la técnica individual. Por consiguiente, es importante comenzar con las instrucciones del fabricante y variar el tiempo de tinción y la concentración de la tinción hasta obtener los resultados óptimos. El frotis teñido se lava con agua tamponada y se examina con un aumento total de x500 a x1000. El método es simple y relativamente barato, pero los resultados son lentos debido al proceso de tinción. Los tripanosomas se reconocen fácilmente por su morfología general, pero pueden resultar dañados durante el proceso de tinción. Esto puede hacer difícil la identificación de la especie.

c)

Extensiones finas de frotis de sangre Los frotis finos de sangre se hacen colocando una gotita de sangre (alrededor de 5 µl), por ejemplo, desde un tubo capilar para microhematocrito, sobre un porta de microscopio limpio aproximadamente a 20 mm desde un extremo (dejando espacio para aplicar el frotis grueso) y extendiéndolo con el borde de otro porta. Este porta se coloca en un ángulo de aproximadamente 30° con el primer porta y se mueve para hacer contacto con la gota de sangre. Se deja que la sangre corra a lo largo del borde del porta extensor, que se empuja hacia el otro extremo del porta con un movimiento bastante rápido pero suave. Si se utiliza la cantidad correcta de sangre, el porta debería cubrirse con una extensión de sangre uniforme antes de alcanzar el extremo del porta. Idealmente, deberían prepararse gotas finas de forma que los RBCs estén juntos pero que no se solapen. El porta se seca rápidamente agitándolo en el aire y se protege del polvo, moscas y otros insectos. El porta se fija durante 3 minutos en metanol, y se tiñe como en los frotis gruesos de sangre. Después de la tinción, el porta se lava suavemente con agua corriente y se deja secar. Una variación de este método es fijar en metanol durante 2 minutos, aplicar colorante May–Grünwald durante 2 minutos, y después añadir un volumen igual de agua tamponada, pH 7,2, dejarla 8 minutos y dejar escurrir. Se examinan aproximadamente 50–100 campos del frotis fino teñido, con una lente de objetivo de aceite de inmersión de x50 o x100, antes de considerar que la muestra es negativa. Incluso después de haber detectado un tripanosoma, se investigan aproximadamente 20 campos adicionales para determinar si está presente más de una especie. La técnica descrita anteriormente puede utilizarse para muestras de biopsia de la linfa obtenidas de ganglios linfáticos, después de una punción. Generalmente, se prepara un frotis grueso y fino de la misma muestra. Los frotis gruesos contienen más sangre que los finos y, por tanto, tienen una sensibilidad diagnóstica mayor. Los frotis finos, por otra parte, permiten la identificación de la especie de Trypanosoma. Las especies de tripanosoma se pueden identificar mediante las siguientes características morfológicas: Trypanosoma vivax: 20–27 µm de largo, membrana ondulante no evidente, flagelos libres presentes en el extremo anterior, extremo posterior redondeado, cinetoplasto grande y terminal. Trypanosoma brucei es una especie de tripanosoma polimórfico. Se pueden distinguir dos formas diferentes, es decir, una forma larga fina y una forma corta gruesa. A menudo, se observan formas intermedias con características tanto de formas finas como gruesas. El citoplasma en muestras teñidas contiene a menudo gránulos basófílos. Trypanosoma brucei (forma larga fina): 17–22 µm de largo y alrededor de 2,8 µm de ancho, membrana ondulante llamativa, flagelo libre presente en el extremo anterior, extremo posterior en punta, cinetoplasto pequeño y subterminal. Trypanosoma brucei (forma corta gruesa): 17–22 µm de largo y alrededor de 3,5 µm de ancho, membrana ondulante llamativa, sin flagelo libre, extremo posterior en punta, cinetoplasto pequeño y subterminal. Trypanosoma congolense: 8–25 µm (especie pequeña), membrana ondulante no evidente, sin flagelo libre, extremo posterior redondeado, cinetoplasto de tamaño mediano y terminal, a menudo situado lateralmente. Aunque se considera que T. congolense es monomórfico, a veces se observa un grado de variación morfológica. Dentro de T. congolense, hay diferentes tipos o subgrupos (savannah, forest, kilifi, tsavo) que tienen diferente patogenicidad (2). Sin embargo, estos tipos se pueden distinguir solamente utilizando PCR.

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Capítulo 2.3.15.  Tripanosomosis (transmitida por la mosca tse—tsé)

Trypanosoma theileri: (especie grande), típicamente 60–70 µm, pero los organismos individuales oscilan entre 19 y 120 µm (16, 20), la membrana ondulante es llamativa, tiene flagelo largo libre, extremo posterior en punta, el cinetoplasto es grande y situado cerca del núcleo y en posición marginal. Normalmente el Trypanosoma theileri no es patógeno, pero su presencia puede confundir el diagnóstico parasitológico. En Europa del Oeste T. theleiri es la única especie de tripanosoma que se presenta en el ganado vacuno.

•

Técnicas de concentración de parásitos

La probabilidad de detectar tripanosomas en una muestra de un animal infectado depende en gran medida de la cantidad de sangre examinada y del nivel de parasitemia. La cantidad de sangre examinada con técnicas de análisis directo es baja y los parásitos a menudo son muy escasos en la sangre de un animal infectado. Estos dos factores contribuyen a la baja sensibilidad de las técnicas de análisis directo. Se puede mejorar la sensibilidad aumentando el volumen examinado de sangre y mediante la concentración de tripanosomas.

a)

Técnica de centrifugación del microhematocrito (método de Woo) La técnica de centrifugación del hematocrito, o el método de Woo (28), se utiliza mucho para el diagnóstico de tripanosomosis animal. Se basa en la separación de los diferentes componentes de la muestra de sangre dependiendo de su gravedad específica. El método es de la siguiente forma: i)

Se recoge sangre fresca generalmente de la vena de la oreja (alrededor 70 µl) en tubos capilares heparinizados (75 x 1,5 mm).

ii)

Un extremo del tubo capilar se sella con pegamento o mediante calentamiento, asegurándose de que la columna de sangre no se carbonice por la llama.

iii)

Los tubos capilares sellados se colocan en una centrífuga para microhematocrito con los bordes sellados apuntando hacia el exterior. Para asegurar un buen equilibrio, los tubos se cargan simétricamente.

iv)

Se cierra la cubierta del rotor y se cierra la tapadera de la centrífuga.

v)

Los tubos capilares se centrifugan a 9.000 g durante 5 minutos.

vi)

Se prepara un tubo portador de un portaobjetos sobre el que se han fijado dos piezas de vidrio de 25 x 10 x 1,2 mm, separados 1,5 mm, para formar una ranura.

vii)

El tubo se coloca en la ranura, se pone un cubre en la parte superior y la interfase se llena de agua.

viii) Se examina la interfase celular plasma/leucocitos (capa leucocítica) girando el tubo lentamente. El movimiento del tripanosoma se puede detectar primero utilizando las lentes de objetivo x10 con una apertura reducida del condensador; los tripanosomas pueden verse más claramente utilizando las lentes objetivo x40 preferiblemente a una distancia larga de trabajo para permitir una adecuada profundidad de foco a través del tubo capilar. La técnica de centrifugación del microhematocrito es más sensible que las técnicas de examen directo (15). En el caso de las infecciones de T. vivax, la sensibilidad de los métodos Woo se acerca al 100% cuando la parasitemia es >700 tripanosomas/ml de sangre. La sensibilidad se reduce hasta 50% cuando la parasitemia varía entre 60 y 300 tripanosomas/ml de sangre. Los tripanosomas se vuelven más difíciles de detectar cuando la parasitemia es menor de 60 tripanosomas/ml de sangre (8). La identificación de las especies de tripanosomas es difícil. Como la gravedad específica de T. congolense es similar a la de los RBCs, los parásitos a menudo se encuentran bajo la capa leucocítica en la capa de RBCs. Para mejorar la separación de RBCs y parásitos, y aumentar la sensibilidad para T. congolense, se puede aumentar la gravedad específica de RBCs mediante la adición de glicerol. Una modificación del método de Woo es el método de la capa leucocítica cuantitativa (QBC) (1). El método se ha usado para el diagnóstico de las infecciones de T.b.gambiense. El método es probablemente demasiado caro para el uso rutinario a gran escala en inspecciones de tripanosomosis animal.

b)

Técnica de la capa leucocítica en campo oscuro/contraste de fase La técnica de la capa leucocítica o método de Murray (21) representa una técnica mejorada para la detección de tripanosomas y se usa ampliamente. Se lleva a cabo siguiendo los pasos i) a v) anteriores, después de los cuales se corta el tubo capilar, con un lapicero con punta de diamante, 1 mm por debajo de la capa leucocítica, para incluir la capa superior de RBCs. La capa leucocítica y la capa superior de RBCs se extraen sobre un porta limpio de microscopio y se cubren con un cubreobjetos (22 x 22 mm). Se examinan aproximadamente 200 campos de la preparación para detectar la presencia de tripanosomas

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Capítulo 2.3.15.  Tripanosomosis (transmitida por la mosca tse—tsé)

móviles con un microscopio de campo oscuro o de contraste de fase con una lente objetivo x40. Las especies de tripanosoma se pueden identificar con referencia a los siguientes criterios: Trypanosoma vivax: Grande, extremadamente activo, atraviesa el campo completo muy rápidamente, deteniéndose ocasionalmente. Trypanosoma brucei: Varios tamaños, movimiento rápido en áreas limitadas. Trypanosoma congolense: Pequeño, lento, se adhiere a los RBCs por el extremo anterior. Trypanosoma theileri: Más del doble del tamaño de los tripanosomas patógenos, tiende a rotar. Igual que con la técnica de centrifugación del microhematocrito, la técnica de la capa leucocítica es más sensible que las técnicas directas de examen. La sensibilidad del método de la capa leucocítica se puede mejorar utilizando la técnica de la centrifugación doble de la capa leucocítica (15). Se centrifuga una cantidad total de 1.500–2.000 µl de sangre, después de lo cual se aspira la capa leucocítica en un tubo capilar de microhematocrito y se centrifuga de nuevo. Se examina la capa leucocítica. Comparada con la técnica de la centrifugación del microhematocrito, la técnica de la capa leucocítica tiene la ventaja añadida de que las preparaciones se pueden fijar y teñir para una identificación más precisa de especies y mantener como un registro permanente. Tanto la centrifugación del microhematocrito como las técnicas de la capa leucocítica dan resultados directos y pueden utilizarse para investigar grandes números de animales. Requieren equipo especializado y suministro de electricidad, lo que hace la prueba más cara en comparación con el examen de la extensión de sangre fresca. Sin embargo, esto se compensa con el aumento en la sensibilidad. Ambas técnicas de detección de parásitos descansan en la detección de tripanosomas móviles y vivos. Debido a que los tripanosomas pueden perder su vigor y morir bastante rápidamente una vez que se extrae la muestra de sangre, las muestras recogidas en tubos capilares deberían enfriarse inmediatamente y no dejar que se sobrecalienten en la centrífuga para microhematocrito o en la fase de microscopio. Las muestras deberían examinarse tan pronto como se pueda después de recogerlas, preferiblemente en las dos horas siguientes. La centrifugación del microhematocrito y las técnicas de la capa leucocítica son especialmente útiles porque se puede evaluar el hematocrito (PCV) a la misma vez. Para determinar el PCV después de la centrifugación, el tubo capilar del microhematocrito (conteniendo sangre de la vena de la oreja o de la yugular) se coloca en un lector de hematocrito. La longitud de la columna del concentrado de eritrocitos se expresa como un porcentaje del volumen total de sangre. Es útil medir el PCV para determinar el grado de anemia. La anemia puede ser causada por factores diferentes de la tripanosomosis transmitida por mosca tse–tsé. Permanece, sin embargo, como uno de los indicadores más importantes de tripanosomosis en el ganado vacuno. Como la tripanosomosis es un problema de manada, el perfil de PCV de una manada está influido por el número de animales infectados con tripanosomosis y puede utilizarse para indicar diferencias en el desafío de la enfermedad. El PCV medio está también influido por la edad y el nivel de susceptibilidad genética del ganado vacuno.

c)

Intercambio de aniones La técnica de cromatografía de intercambio aniónico a microescala (m–AECT) se utiliza ampliamente para el diagnóstico en humanos de la enfermedad del sueño producida por T.b. gambiense (18). La sangre se pasa a través de una columna de dietil amino–etil (DEAE)–celulosa equilibrada con una solución salina tamponada con fosfato (PBS) de una fuerza iónica ajustada a la sangre de la especie examinada de animal. Como las RBCs están cargadas más negativamente que los tripanosomas, se mantienen en la columna y los tripanosomas pasan a través con el eluído, que se recoge, se centrifuga para concentrar los tripanosomas y se examina al microscopio. Se pueden examinar grandes volúmenes de sangre de cada animal y por tanto, el método tiene una alta sensibilidad. Sin embargo, la técnica es lenta y no es adecuada para el examen de un gran número de animales.

d)

Cultivo in—vitro Se ha descrito un procedimiento para el cultivo in–vitro de T. brucei, pero durante muchos años el éxito ha sido irregular. Además, el método necesita un equipamiento sofisticado, produce resultados después de un considerable retraso y no es ciertamente adecuado para su uso a gran escala. Un equipo (KIVI) para el aislamiento in–vitro de tripanosomas ha demostrado ser prometedor en el aislamiento y amplificación de todas las especies de T. brucei en humanos, animales domésticos y de juego (26). El valor de la prueba en el aislamiento de T.congolense y T. vivax es aún desconocido. Como se basa en el cultivo de formas procíclicas de tripanosomas, no es posible la diferenciación de especies (14).

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Capítulo 2.3.15.  Tripanosomosis (transmitida por la mosca tse—tsé)

•

Inoculación en animales

La subinoculación de sangre en roedores, generalmente ratones o ratas, es particularmente útil para revelar infecciones subclínicas. Los animales de laboratorio se inyectan intraperitonealmente con 0,2–5 ml (dependiendo del tamaño del roedor) de sangre recogida recientemente. La inmunosupresión artificial de animales receptores por irradiación o tratamiento farmacológico aumentará de forma importante las oportunidades de aislamiento del parásito. Se sangran tres veces a la semana durante al menos 2 meses. La sangre recogida se examina mediante el método de la extensión en fresco. La inoculación en animales es más sensible que el examen directo de extensiones en fresco. Sin embargo, el método no es práctico; es caro y el diagnóstico no es inmediato. El método es muy sensible para detectar las infecciones de T.b.brucei. Sin embargo, algunas cepas de T. congolense no se transmiten fácilmente y T. vivax raramente infecta a roedores de laboratorio. También debería evitarse la inoculación animal ya que perturba gravemente al bienestar animal.

•

Prueba para detectar antígeno tripanosomal

Se ha descrito un enzimoinmunoensayo (ELISA) de detección del antígeno para tripanosomosis (22). Las evaluaciones de campo de la prueba no han dando resultados repetitivos (5). Por consiguiente, se necesita trabajo adicional para descubrir y superar la causa de estas inconsistencias antes de que la prueba pueda utilizarse en el diagnóstico rutinario de tripanosomosis.

•

Pruebas de amplificación de ADN

Se ha desarrollado un método PCR como un instrumento para el diagnóstico de infecciones con tripanosomas africanos en humanos y en animales, así como en moscas tse–tsé. Se puede amplificar secuencia de ADN nuclear repetitivo y específico para T. vivax y tres tipos de T. congolense (4, 6, 19); sin embargo, los cebadores actuales para T. vivax parecen no ser capaces de amplificar algunos genotipos dentro de esta especie. Existe un conjunto de cebadores genéricos para la detección de las tres subespecies de T. brucei. Los conjuntos de cebadores disponibles para los diferentes subgéneros de tripanosoma, especies y tipos son los siguientes: T. brucei subgenus – TBR1 y TBR2; T. congolense (tipo savannah) – TCN1 y TCN2; T. congolense (tipo forest) – TCF1 y TCF2; T. congolense (tipo Kenya coast) – TCK1 y TCK2; y T. vivax – TVW1 y TVW2. Recientemente se han desarrollado pruebas de PCR de fragmentos polimórficos de restricción (RFLP) que permiten la identificación de todas las especies de Trypanosoma como infecciones simples o mixtas utilizando una única prueba (3, 7, 9). Las amplificaciones de PCR estándar se llevan a cabo en una mezcla de reacción que contiene Tris/HCl, MgCl2, KCl, cada uno de los cuatro trifosfatos de deoxyribonucleótico, cebadores, ADN molde y ADN polimerasa Taq. Las muestras se incuban durante varios ciclos a diversas temperaturas. Los productos de la PCR se someten a electroforesis en agarosa. Los geles se tiñen con bromuro de etidio. El procedimiento es extremadamente sensible, pero pueden producirse resultados positivos falsos como consecuencia de contaminación de las muestras con otro ADN. La prueba requiere equipo especializado y personal muy entrenado, de forma que no es adecuada para utilización en muchos laboratorios. Pueden producirse resultados negativos falsos cuando la parasitemia es muy baja (< 1 tripanosoma/ml de sangre), lo que sucede con frecuencia en infecciones crónicas; también pueden producirse cuando la especificidad de los cebadores es demasiado alta, de forma que no se reconozcan todos los aislados de una especie particular de tripanosoma. La recogida de muestras se ha simplificado adaptando la prueba mediante la utilización de sangre o capa leucocítica depositada sobre papel de filtro (9, 12). Se puede procesar un gran número de muestras a la vez, lo que la convierte en potencialmente adecuada para reconocimientos a gran escala. Sin embargo, por el momento, el coste de los análisis por PCR es prohibitivo para la utilización rutinaria de la prueba.

2.

Pruebas serológicas

Se han desarrollado varias técnicas de detección de anticuerpos para detectar anticuerpos tripanosomales para el diagnóstico de tripanosomosis animal, con sensibilidad y especificidad variable. Los métodos preferidos son la prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFAT) (13) y el ELISA para detección de anticuerpos tripanosomales (11, 17). La identificación de los principales antígenos de tripanosomas, y su producción como moléculas recombinantes o péptidos sintéticos, conduce actualmente al desarrollo y validación de nuevas pruebas basadas en el empleo de moléculas definidas. Por tanto, en un futuro próximo, podría mejorarse la especificidad de las pruebas serológicas hasta permitir la detección de anticuerpos específicos de especie, y alcanzar un alto nivel de estandarización que no se logra actualmente mediante la utilización de extractos totales de parásitos.

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Capítulo 2.3.15.  Tripanosomosis (transmitida por la mosca tse—tsé)

a)

Prueba de inmunofluorescencia indirecta El método original de esta prueba (27) ha sido reemplazado por una nueva técnica para la preparación de antígenos de tripanosomas (13), que implica la fijación de tripanosomas vivos utilizando una mezcla de 80% de acetona fría y 0,25% formalina en solución salina normal. •

Procedimiento de la prueba

i)

Preparar frotis finos de sangre con una gran parasitemia o de una suspensión de tripanosomas. Secar al aire y fijar en acetona durante 5 minutos.

ii)

Marcar círculos de 5 mm de diámetro sobre portas de vidrio utilizando laca de uñas.

iii)

Utilizando una pipeta, colocar un suero problema, diluido al 1/40, en cada círculo, asegurándose de que el área en cada círculo esté completamente cubierta.

iv)

Incubar la preparación de suero problema/antígeno a 37°C durante 30 minutos en cámara húmeda.

v)

Lavar la preparación tres veces en PBS durante 5 minutos cada vez a 4°C, con agitación suave. Secar los portas al aire.

vi)

Aplicar conjugado: IgG anti–bovina de conejo o de cabra conjugada con isotiocianato de fluoresceína.

vii)

Incubar y lavar como anteriormente. Escurrir en agua destilada. Secar los portas al aire.

(para pruebas con sueros bovinos)

viii) Montar los portas en PBS o glicerol tamponado y examinar la fluorescencia.

b)

Enzimoinmunoensayo de detección de anticuerpos El ELISA original para anticuerpos (17) se ha desarrollado más recientemente para su utilización en experimentos a gran escala con tripanosomosis bovina (11). Se han desarrollado ELISAs utilizando placas de microtitulación preantigenizadas con T. congolense o T. vivax que presentan la ventaja de que se utiliza un antígeno desnaturalizado estandarizado, y que se pueden almacenar durante largos periodos a temperatura ambiente (24). El antígeno estándar para las pruebas de anticuerpos de tripanosomosis se deriva de tripanosomas tomados del torrente circulatorio. Los antígenos se preparan de una fracción soluble de tripanosomas purificada por cromatografía de parásitos de sangre entera de ratas infectadas por medio de intercambio aniónico en DEAE, lisados mediante ciclos de congelación–descongelación y por centrifugación a 10.000 g durante 30 minutos. También se pueden utilizar antígenos obtenidos de formas de tripanosoma procíclico propagados in–vitro (10). Para el análisis de muestras de sangre recogidas sobre papel de filtro se han adaptado tanto el IFAT como el ELISA de detección de anticuerpos. La sangre contenida en un tubo capilar de centrifuga de microhematocrito heparinizado se deposita sobre un papel de filtro (Whatman ® No. 4). Las muestras se secan al aire protegidas de la luz solar y se colocan en una bolsa de plástico con desecador de gel de sílice con un auto indicador. La bolsa se cierra y debería mantenerse tan fría como sea posible hasta que las muestras se refrigeren o congelen. Cada microplaca ELISA se realiza con sueros de referencia fuertemente positivos, débilmente positivos y negativos, que se requieren para cumplir con los valores predeterminados para asegurar la calidad de la prueba. La absorbancia de cada muestra probada por ELISA se expresa como un porcentaje (positividad del porcentaje, PP) del estándar de referencia fuertemente positivo (29). Los resultados son, por tanto, cuantificables. El valor límite se determina utilizando muestras de campo positivas y negativas conocidas (5). Ambas pruebas de detección de anticuerpos tienen alta sensibilidad y especificidad altas. Su especificidad de especie es baja generalmente. Detectan respuestas inmunes a infecciones actuales y pasadas y pueden, consecuentemente, proporcionar solamente un diagnóstico preliminar de infección activa. El inmunodiagnóstico necesita un equipo caro y sofisticado y experiencia, lo que no está siempre disponible. Ha de llevarse a cabo en laboratorios especializados y hay un retraso sustancial entre el muestreo real y la disponibilidad de los resultados. Sin embargo, el ELISA para anticuerpos se presta a un alto grado de automatización y estandarización. La recogida y el almacenamiento de muestras se llevan a cabo fácilmente mediante el uso de papeles de filtro. Todos estos factores hacen del ELISA para anticuerpos una prueba muy útil en mediciones a gran escala para determinar la distribución de tripanosomosis transmitida por la tse–tsé.

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Capítulo 2.3.15.  Tripanosomosis (transmitida por la mosca tse—tsé)

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO En la actualidad no se utilizan productos biológicos.

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Capítulo 2.3.15.  Tripanosomosis (transmitida por la mosca tse—tsé)

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N.B. Hay un laboratorio de referencia de la OIE para Trypanosomosis (transmitida por tse–tsé) (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar el sitio Web de la OIE para una lista más actualizada: www.oie.int).

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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004