NT-proCNP (EN) ENZYME IMMUNOASSAY FOR THE QUANTITATIVE DETERMINATION OF HUMAN NT-proCNP IN PLASMA AND SERUM CAT. NO. BI-20872 12 X 8 TESTS

(DE) ENZYM IMMUNOASSAY FÜR DIE QUANTITATIVE BESTIMMUNG VON HUMAN NT-proCNP IN PLASMA UND SERUM KAT. NR. BI-20872 12 X 8 TESTE

(FR) DOSAGE IMMUNOENZYMATIQUE POUR LA DETERMINATION QUANTITATIVE DU NT-proCNP HUMAIN DANS LE PLASMA OU LE SERUM REF: BI-20872 12 X 8 TESTS

(IT) IMMUNODOSAGGIO ENZIMATICO PER LA DETERMINAZIONE QUANTITATIVA DI NT-proCNP UMANO SU CAMPIONI DI PLASMA O SIERO CAT. NO. BI-20872 12 X 8 TEST

(ES) ENZIMOINMUNOENSAYO PARA LA DETERMINACION CUANTITATIVA DE NT-proCNP HUMANA EN PLASMA Y EN SUERO CAT. NO. BI-20872 12 X 8 TESTS

FOR RESEARCH USE ONLY NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES

rev.no. 150814 (replacing 120627) Biomedica Medizinprodukte GmbH & Co KG, A-1210 Wien, Divischgasse 4 Tel. +43/1/291 07 45, Fax +43/1/291 07 85, E-mail [email protected] 1/20

CONTENT / INHALT / SOMMAIRE / CONTENUTO / CONTENIDO

1) ENGLISH ….. 3 2) DEUTSCH …. 7 3) FRANÇAIS .. 11 4) ITALIANO … 15 5) ESPANIOL .. 19

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1) INTRODUCTION

C NP belongs to a well characterised group of natriuretic peptides like atrial natriuretic (ANP) and brain natriuretic peptide (BNP), which play various important roles as regulatory mechanisms as well as bio-markers. They participate in the regulation of blood pressure and body fluid homeostasis, modify growth and development of cardiovascular tissues and bone. ANP and BNP are cardiac hormones, secreted by the atria and ventricles, respectively, in the normal adult heart. In contrast to ANP and BNP, very little CNP is produced by cardiac tissue, but is expressed primarily in the brain, pituitary gland, vascular endothelium, kidney and female reproductive tract. All natriuretic peptides are produced as propeptides, which are subsequently cleaved into the biologically active, Cterminal hormone and the N-terminal fragment (NT-proANP 1-98, NT-proBNP 1-76 and NT-proCNP, which length is still under discussion). Since those N-terminal fragments are much more stable, and circulate in higher amounts than the active hormones, they are easier and more reliable to be measured in serum or plasma. So we developed a sandwich immunoassay for NT-proCNP using antibodies directed against amino acids 1-19 and 30-50. The physiological role of CNP is not only studied in cardiac disease, but also in bone developmental biology, generally in bone research, renal diseases, embryonic developmental research and vascular diseases. Indications: • vascular disease • diabetes • skeletal development • sepsis 2) CONTENTS OF THE KIT CONT PLATE WASHBUF ASYBUF STD CTRL CONJ SUB STOP

KIT COMPONENTS Polyclonal sheep anti NT-proCNP antibody precoated microtiter strips in stripholder packed in aluminium bag with desiccant Wash buffer concentrate 20x, natural cap Assay buffer, red cap, ready to use Standards, (0; 2.5; 5; 10; 20; 40 pmol/l), white caps, ready to use Control, yellow cap, ready to use, exact concentration see label Conjugate, (anti NT-proCNP-HRPO), amber cap, ready to use Substrate (TMB solution), blue cap, ready to use STOP solution, white cap, ready to use

QUANTITY 12 x 8 tests 1 x 50 ml 1 x 10 ml 6 x 500 µ l 1 x 500 µ l 1 x 22 ml 1 x 22 ml 1 x 7 ml

3) ADDITIONAL MATERIAL ADDED TO THE KIT • 2 self-adhesive plastic film (aluminium foil) • QC protocol • Protocol sheet • Instruction manual 4) EQUIPMENT REQUIRED BUT NOT SUPPLIED • Precision pipettes calibrated to deliver 50 µ l, 200 µ l, 300 µ l and disposable tips • ELISA reader for absorbance at 450 nm (reference 630 nm) • Graph paper or software for calculation of results • Distilled or deionised water 5) REAGENTS AND SAMPLE PREPARATION

A ll reagents of the kit are stable at +4°C (2-8°C) until expiry date stated on the label of each reagent. Sample preparation: proCNP in freshly collected blood samples is stable for at least 2.5 hrs at RT. Nevertheless we recommend to perform plasma or serum separation by centrifugation as soon as possible, e.g. 20 min at 2000 x g, preferably at +4°C (2-8°C). Aliquot the acquired plasma or serum samples and store them at -25°C or lower. Samples can be subjected to 5 freeze-thaw cycles without any loss of immune reactivity. Lipemic or hemolyzed samples may give erroneous results. Samples should be 3/20

mixed well before assaying. We recommend duplicates for all values. If samples read higher than the highest STD we recommend to dilute them with ASYBUF (assay buffer) (e.g.: 1+1 and 1+3) and re-measure the samples. For further information on sample stability please contact our customer service by e-mail [email protected] or by phone +43/ 1/ 29107-45. Reconstitute as follows: WASHBUF (Wash buffer): Dilute the concentrate 1:20 (1+19), e.g. 50 ml WASHBUF + 950 ml distilled water. Crystals in the buffer concentrate will dissolve at room temperature. Undiluted WASHBUF is stable at +4°C (2-8°C) until expiry date stated on label. Diluted WASHBUF is stable at +4°C (2-8°C) for one month. Use only diluted WASHBUF to perform the assay. 6) PRINCIPLE OF THE ASSAY

T his kit is a sandwich enzyme immunoassay for the determination of NT-proCNP in human serum. In a first step, sample and conjugate (sheep anti human NT-proCNP-HRPO) are pipetted into the wells of the microtiter strips, which are pre-coated with polyclonal sheep anti NT-proCNP antibody. NT-proCNP present in the sample binds to the pre-coated antibody in the well and forms a sandwich with the detection antibody. In the washing step all non-specific unbound material is removed. In a second step, the substrate (TMB Tetramethylbenzidine) is pipetted into the wells. The enzyme catalysed colour change of the substrate is directly proportional to the amount of NT-proCNP present in the sample. This colour change is detectable with a standard microtiter plate ELISA reader.

7) ASSAY PROTOCOL All reagents and samples have to be brought to room temperature (18-26°C) before they can be used in the assay. Mark position for STD/SAMPLE/CTRL (Standard/Sample/Control) on the protocol sheet. Take microtiter strips out of the aluminium bag. Unused strips can be stored with desiccant in the aluminium bag at +4°C (2-8°C) until the expiry date. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Add 50 µ l STD/SAMPLE/CTRL (Standard/Sample/Control) in duplicate into respective wells. Add 200 µ l CONJ (anti NT-proCNP-HRPO) into each well, swirl gently. Cover tightly and incubate for 4 hours at room temperature (18-26°C) in the dark. Aspirate and wash wells 5x with 300 µ l diluted WASHBUF (Wash buffer), remove remaining WASHBUF by hitting plate against paper towel after the final washing step. Add 200 µ l SUB (Substrate) into each well, swirl gently. Incubate for 30 min at room temperature (18-26°C) in the dark. Add 50 µ l STOP (Stop solution) into each well, swirl gently. Measure absorbance immediately at 450 nm with reference 630 nm, if available.

8) CALCULATION OF RESULTS

R ead the optical density (OD) of all wells on a plate reader using 450 nm wavelength (correction wavelength 630 nm). Construct the standard curve from the OD values of the STD. Use commercially available software or graph paper. Obtain sample concentration from this standard curve. The assay was evaluated with 4PL algorithm. Different curve fitting methods need to be evaluated by the user. Respective dilution factors have to be considered. 4/20

Measured OD 450 / 630

Example typical STD-curve:

NT-proCNP BI-20872

3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0

5

10

15

20

25

30

35

40

pmol/l The quality control (QC) protocol supplied with the kit shows the results of the final release QC for each kit at production date. Data for OD obtained by customers may differ due to various influences and/or due to the normal decrease of signal intensity during shelf life. However, this does not affect validity of results as long as an OD of 1.50 or more is obtained for the STD with the highest concentration and the value of the CTRL is in range (target range see label). 9) ASSAY CHARACTERISTICS Apparently healthy individuals and hospital panel: Standard range: Conversion factor: Sample volume: Detection limit: Incubation time: Cross reactivity:

Serum, apparently healthy: 2.7 pmol/l (median, n=42) Serum, hospital panel: 2.8pmol/l (median, n=23) EDTA plasma, hospital panel: 3.0 pmol/l (median, n=25) Each laboratory should establish own normal values. 0 – 40 pmol/l 1pg/ml = 0.151 pmol/l (referring to recombinant proCNP 1-64) 50 µ l human serum or plasma (0 pmol/l + 3 SD): 0.2 pmol/l 4 hours / 30 min Not determined, homology to other species for the epitopes used in this assay: Epitope 1: rat (88%), sheep (94%), pig (94%), mouse (88%), bovine (88%) Epitope 2: rat (95%), sheep (90%), pig (95%), mouse (95%), bovine (90%)

For further information on assay characteristics please contact our customer service by e-mail [email protected] or by phone +43/ 1/ 29107-45. 10) PRECISION Intra-assay: 2 samples were tested 5 times within 1 assay lot by 1 operator. Inter-assay: 2 samples were tested 30 times in 3 different lots by 4 different operators. Intra-assay (n=5) Mean (pmol/l) SD (pmol/l) CV (%)

Sample 1 5.1 0.26 5

Sample 2 20.0 1.17 6

Inter-assay (n=30) Mean (pmol/l) SD (pmol/l) CV (%)

Sample 1 5.0 0.07 1

Sample 2 20.0 0.15 1

11) TECHNICAL HINTS • Do not mix or substitute reagents with those from other lots or sources. • Do not mix stoppers and caps from different reagents or use reagents between lots. • Do not use reagents beyond expiration date. • Protect reagents from direct sunlight. • Substrate solution should remain colorless until added to the plate. • To ensure accurate results, proper adhesion of plate sealers during incubation steps is necessary. • Avoid foaming when mixing reagents.

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12) PRECAUTIONS

All test components of human source were tested against HIV-Ab and HBsAg; and were found negative. Nevertheless, they should be handled and disposed as if they were infectious. Liquid reagents contain ≤0.1% Proclin 300 as preservative. Proclin 300 is not toxic in concentrations used in this kit. It may cause allergic skin reactions – avoid contact with skin or eyes. • Do not pipette by mouth. • Do not eat, drink, smoke or apply cosmetics where reagents are used. • Avoid all contact with the reagents by using gloves. The stop solution contains sulfuric acid, contact can lead to irritations of eyes and skin. Flush with water after contact! 13) LITERATURE 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

“Identification of amino-terminal pro-C-type natriuretic peptide in human plasma” T.C.R Prickett et al., Biochem. and Biophy. Res. Comm., 286, 513-517 (2001) “Overexpression of CNP in chondrocytes rescues achondroplasia through a MAPK- dependent pathway” Akihiro Yasoda et al., Nature Medicine, 10, 80-86 (Dez 2003) “C-type natriuretic peptide in reproduction, pregnancy, and fetal development” T. Walther et al. J. of Endo, 180,17-22 (2004) “C-type natriuretic peptide in prostate cancer” Nielsen SJ et al, APMIS, 117(1):60-67 (2009) “N-terminal C-Type Natriuretic Propeptide Is Associated with the Endosteal Apposition of Bone in Females with a Persistent Eating Disorder” Fricke O. et al, Horm res Peadiatr, 74(3): 201-206 (2010) „Circulating NT-proCNP predicts sepsis in multiple-traumatized patients without traumatic brain injury” Bahrami S et al., Crit Care Med, 38(1): 161-166 (2010). „Prognostic value of circulating amino-terminal pro-C-type natriuretic peptide in critically ill patients“ Koch A et al., Crit Care, 15(1): R45 (2011)

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1) EINLEITUNG

CNP gehört zur Familie der Natriuretischen Peptide, wie das Atrial Natriuretische (ANP) und Brain Natriuretische Peptid (BNP) welche wichtige Biomarker und Regulationsmoleküle sind. Sie regulieren den Blutdruck und Flüssigkeitshaushalt und modifizieren Wachstum und Entwicklung von Herzgewebe und Knochen. ANP und BNP sind Herzhormone, welche im Atrium bzw. im Ventrikel gebildet werden und bei erhöhter Belastung des Herzens ausgeschüttet werden. Im Gegensatz zu ANP und BNP wird CNP nur in geringem Umfang im Herzen produziert und stammt daher hauptsächlich aus Gehirn, Hypophyse, vaskulärem Endothelium, den Nieren und den weiblichen Geschlechtsorganen. Die Natriuretischen Peptide werden als Propeptide ausgeschüttet und dann in ein C-terminales Hormon (biologisch aktiv) und in ein N-terminales Fragment (diese sind NT-proANP 1-98, NT-proBNP 1-76 und NT-proCNP, bei dem die Länge noch diskutiert wird) gespalten. Die N-terminalen Fragmente sind stabiler und kommen in höheren Konzentrationen im Blut vor als die aktiven Hormone. Aus diesem Grund sind die Fragmente analytisch leichter und reproduzierbarer erfassbar als die Hormone. Daher haben wir einen Sandwich Immunoassay mit Antikörpern gegen die Epitope 1-19 und 30-50 von humanem NT-proCNP entwickelt. CNP wird nicht nur im Zusammenhang mit Herzkrankheiten sondern auch beim Längenwachstum von Knochen, Nierenerkrankungen, der Embryonalentwicklung und vaskulären Erkrankungen studiert. Indikationen: • vaskuläre Erkrankungen • Diabetes • Knochenentwicklung • Sepsis 2) INHALT DES KITS CONT PLATE WASHBUF ASYBUF STD CTRL CONJ SUB STOP

KIT KOMPONENTEN Polyklonaler Schaf anti NT-proCNP Antikörper, beschichtet auf Mikrotiterplatten-streifen im Streifenhalter, verpackt in einem Aluminiumbeutel mit Trockenmittel Waschpuffer, 20fach Konzentrat, durchsichtige Kappe Verdünnungspuffer, rote Kappe, gebrauchsfertig Standards, (0; 2,5; 5; 10; 20; 40 pmol/l), weiße Kappen, gebrauchsfertig Kontrolle, gelbe Kappe, gebrauchsfertig, exakte Konzentration siehe Etikett Konjugat, (anti NT-proCNP-HRPO), braune Kappe, gebrauchsfertig Substrat (TMB Lösung), blaue Kappe, gebrauchsfertig Stopplösung, weiße Kappe, gebrauchsfertig

MENGE 12 x 8 Teste 1 x 50 ml 1 x 10 ml 6 x 500 µ l 1 x 500 µ l 1 x 22 ml 1 x 22 ml 1 x 7 ml

3) ZUSÄTZLICHES MATERIAL IM KIT • 2 selbstklebende Abdeckfolien (Alufolie) • QC Protokoll • Protokollblatt • Arbeitsanleitung (Beipacktext) 4) ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES MATERIAL UND GERÄTE • Kalibrierte Präzisionspipetten für 50 µ l, 200 µ l, 300 µ l, inkl. Pipettenspitzen • Mikrotiterplattenphotometer mit 450 nm Filter (630 nm Referenz) • Millimeterpapier oder Software • Destilliertes oder deionisiertes Wasser 5) REAGENZIEN UND PROBENVORBEREITUNG

A lle Reagenzien des Kits sind bei +4°C (2-8°C) bis zum Ablaufdatum (siehe Etikett des Reagenz) stabil. Probenvorbereitung: ProCNP ist im Vollblut für mindestens 2,5h stabil. Dennoch empfehlen wir, die Plasma- oder Serumseparation durch Zentrifugation so bald wie möglich durchzuführen, z.B. 20 min bei 2000 x g, vorzugsweise bei +4°C (2-8°C). Die gewonnenen Plasma- oder Serumproben sollten aliquotiert und bei -25°C oder tiefer (Langzeitlagerung) aufbewahrt werden. Fünf Frier/Tau-Zyklen verursachen keine Verluste der Immunreaktivität in den Proben. Lipämische und hämolytische Proben 7/20

können falsche Ergebnisse liefern. Proben vor Verwendung gut mischen. Wir empfehlen Doppelbestimmungen. Bei Proben, deren Messwert oberhalb des Messbereiches liegt, empfehlen wir diese mit ASYBUF (Verdünnungspuffer) zu verdünnen (z.B.: 1+1 und 1+3) und erneut anzusetzen. Für weitere Informationen zur Probenstabilität kontaktieren Sie unseren Kundenservice, Email unter [email protected], Tel. unter +43/ 1/ 29107- 45. Handhabung: WASHBUF (Waschpuffer): Das mitgelieferte Konzentrat wird 1:20 verdünnt (zB. 50 ml WASHBUF + 950 ml destilliertes Wasser). Kristalle im Pufferkonzentrat lösen sich bei Raumtemperatur auf. Das Konzentrat ist bei 4°C (2-8°C) bis zum Ablaufdatum haltbar. Der verdünnte Puffer ist bei 4°C (2-8°C) bis zu einem Monat haltbar. Im Testsystem darf nur verdünnter WASHBUF (Waschpuffer) verwendet werden. 6) TESTPRINZIP

Siehe Kapitel 6) PRINCIPLE OF THE ASSAY im englischen Teil des Beipacktextes 7) TESTPROTOKOLL Im Test dürfen nur Reagenzien und Proben verwendet werden, welche Raumtemperatur (18-26°C) aufweisen. Markieren Sie die Positionen für STD/PROBE/CTRL (Standard/Probe/Kontrolle) am Protokollblatt. Nehmen Sie die benötigten Mikrotiterstreifen aus dem Aluminiumbeutel. Nicht verwendete Mikrotiterstreifen können mit Trockenmittel im Aluminiumbeutel bis zum angegebenen Ablaufdatum gelagert werden. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Pipettieren Sie 50 µ l STD/PROBE/CTRL (Standard/Probe/Kontrolle) in Doppelbestimmung in die Mikrotiterstreifen. Pipettieren Sie 200 µ l CONJ (anti NT-proCNP-HRPO) in alle Wells, gut mischen. Streifen abdecken und 4 Stunden bei Raumtemperatur (18-26°C) im Dunkeln inkubieren. Inhalt der Wells verwerfen und 5x mit 300 µ l verdünntem WASHBUF (Waschpuffer) waschen. Nach dem letzten Waschschritt Reste von Waschpuffer durch Ausklopfen auf saugfähigem Papier entfernen. Pipettieren Sie 200 µ l SUB (Substrat) in alle Wells, gut mischen. 30 Minuten bei Raumtemperatur (18-26°C) im Dunkeln inkubieren. Pipettieren Sie 50 µ l STOP (Stopplösung) in alle Wells, gut mischen. Sofort die Extinktion bei 450 nm messen, falls möglich 630 nm als Referenz verwenden.

8) BERECHNUNG DER ERGEBNISSE

M essen Sie die optische Dichte (OD) von allen Wells mit einem Mikrotiterplattenphotometer mit einem 450 nm Filter (Referenz 630 nm). Konstruieren Sie eine Standardkurve aus den OD Werten der STD unter Verwendung von kommerziell erhältlichem Millimeterpapier oder einer geeigneten Software. Das Testsystem wurde mit einem 4 Parameter Algorithmus evaluiert. Andere Auswerte Algorithmen müssen vom Verwender evaluiert werden. Die Konzentration der Proben wird aus der Standardkurve abgelesen. Eventuelle weitere Verdünnungen müssen berücksichtigt werden. Typische STD-Kurve: Siehe Kapitel 8) CALCULATION OF RESULTS im englischen Teil des Beipacktextes Auf dem beigepackten QC Protokoll sind die Resultate bei der QC Freigabe des Kits vermerkt. Vom Verwender erhaltene Daten der OD können abweichend sein, bedingt durch verschiedene Einflüsse und/oder dem normalen Signalverlust des Kits während der Laufzeit. Dieser mögliche Signalverlust hat keinen Einfluss auf die Gültigkeit der Resultate, so lange die OD des höchsten Standards den Wert 1,50 oder höher erreicht und der Wert der CTRL im gültigen Bereich ist (Bereich siehe Etikett). 9) TESTMERKMALE Werte von anscheinend gesunden Spendern bzw. Panel Krankenhaus: Standardbereich: Umrechnungsfaktor pg/ml zu pmol/l:

Serum, anscheinend gesunde Spender: 2,7 pmol/l (median, n=42) Serum, Panel Krankenhaus: 2,8 pmol/l (median, n=23) EDTA Plasma, Panel Krankenhaus: 3,0 pmol/l (median, n=25) Jeder Verwender sollte den Normalbereich seiner Proben evaluieren. 0 – 40 pmol/l 1pg/ml = 0,151 pmol/l (bezogen auf rekombinant proCNP 1-64) 8/20

Probenvolumen: Detektionsgrenze: Inkubationszeiten: Kreuzreaktivitäten

50 µ l Serum oder Plasma (0 pmol/l + 3 SD): 0,2 pmol/l 4 Stunden / 30 Min Nicht ermittelt, Homologien zu anderen Spezies bezogen auf die benutzten Epitope: Epitop 1: Ratte (88%), Schaf (94%), Schwein (94%), Maus (88%), Rind (88%) Epitop 2: Ratte (95%), Schaf (90%), Schwein (95%), Maus (95%), Rind (90%)

Für weitere Informationen zu den Testmerkmalen kontaktieren Sie unseren Kundenservice, Email unter [email protected], Tel. unter +43/ 1/ 29107-45 10) PRÄZISION Intra-assay: 2 Proben wurden 5 mal in einem Test von 1 Operator getestet. Inter-assay: 2 Proben wurden 30 mal in 3 verschiedenen Lots von 4 verschiedenen Operatoren getestet Intra-assay (n=5) Mean (pmol/l) SD (pmol/l) CV (%)

Sample 1 5,1 0,26 5

Sample 2 20,0 1,17 6

Inter-assay (n=30) Mean (pmol/l) SD (pmol/l) CV (%)

Sample 1 5,0 0,07 1

Sample 2 20,0 0,15 1

11) TECHNISCHE MERKMALE • Reagenzien von verschiedenen Lots oder Testen dürfen nicht gemischt werden. • Stöpsel oder Verschlüsse von verschiedenen Reagenzien dürfen nicht vertauscht werden. • Abgelaufene Reagenzien dürfen nicht verwendet werden. • Reagenzien sind vor direktem Sonnenlicht zu schützen. • Substratlösung muss vor Verwendung farblos sein. • Mikrotiterstreifen müssen bei den Inkubationen mit Abdeckfolie abgedeckt sein. • Vermeiden Sie Schaumbildung beim Mischen der Reagenzien. 12) VORSICHTSMASSNAHMEN

Alle Bestandteile humanen Ursprunges wurden auf HIV-Ak und HBsAg getestet und negativ gefunden. Trotzdem sollten die Reagenzien als potentiell infektiös behandelt werden. Die flüssigen Reagenzien enthalten ≤ 0,1% Proclin 300 als Konservierungsmittel. Proclin 300 ist in der verwendeten Konzentration nicht toxisch. Vermeiden Sie Kontakt mit Augen, Haut und Schleimhaut. Allergische Reaktionen sind möglich. • Nicht mit dem Mund pipettieren. • Nicht Rauchen, Essen, Trinken oder Kosmetika benutzen während der Verwendung der Testreagenzien. • Verwenden Sie Handschuhe zur Vermeidung jedes Kontaktes mit Reagenzien. • Die Stopplösung enthält Schwefelsäure, welche bei Kontakt die Augen und Haut reizen kann. Bei Berührung gründlich mit Wasser spülen. 13) LITERATUR

Siehe Kapitel 13) LTERATURE im englischen Teil des Beipacktextes.

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1) INTRODUCTION

Le CNP est membre d’un groupe bien caractérisé de peptides natriurétiques, tels que le peptide natriurétique atrial (ANP) et le peptide natriurétique cérébral (BNP), qui jouent divers rôles essentiels en tant que mécanismes de régulation et marqueurs biologiques. Ils participent à la régulation de la pression sanguine et à l’homéostasie hydrique de l’organisme et modifient la croissance et le développement des tissus cardio-vasculaires et des os. L’ANP et le BNP sont des hormones cardiaques sécrétées par les oreillettes et les ventricules, respectivement, dans le cœur normal de l’adulte. Contrairement à l’ANP et au BNP, le tissu cardiaque produit très peu de CNP, qui est principalement exprimé dans le cerveau, l’hypophyse, l’endothélium vasculaire, le rein et l’appareil reproducteur de la femme. Tous les peptides natriurétiques sont produits sous forme de propeptides, ultérieurement segmentés en hormone Cterminale biologiquement active et en fragment N-terminal (NT-proANP 1-98, NT-proBNP 1-76 et NT-proCNP, dont la séquence fait toujours l’objet de discussions). Ces fragments N-terminaux étant bien plus stables et circulant en quantités plus élevées que les hormones actives, leur mesure dans le sérum ou le plasma est plus aisée et plus fiable. Nous avons donc développé un immunodosage type sandwich pour le NT-proCNP à l’aide d’anticorps dirigés contre les acides aminés 119 et 30-50. Le rôle physiologique du CNP est non seulement étudié dans les pathologies cardiaques, mais également dans la biologie du développement osseux, généralement dans la recherche sur l’os, les maladies rénales, la recherche sur le développement embryonnaire et les pathologies vasculaires. Indications: • pathologie vasculaire • diabète • développement du squelette • sepsis 2) CONTENU DE LA TROUSSE CONT PLATE WASHBUF ASYBUF STD CTRL CONJ SUB STOP

COMPOSANTS DE LA TROUSSE barrettes de microtitrage revêtues d’anticorps polyclonal de mouton anti NT-proCNP avec portoir pour barrettes dans un sac alu avec dessiccateur Tampon de lavage, concentré 20x, bouchon neutre Tampon de dosage, bouchon rouge, prêt à l’emploi Standards, (0; 2.5; 5; 10; 20; 40 pmol/l), bouchon blanc, prêt à l’emploi Contrôle, prêt à l’emploi, bouchon jaune; voir l’étiquette pour la concentration exacte Conjugué, (anti NT-proCNP- HRPO), bouchon orange, prêt à l’emploi Substrat (solution TMB), bouchon bleu, prêt à l’emploi Solution STOP, bouchon blanc, prête à l’emploi

QUANTITE 12 x 8 tests 1 x 50 ml 1 x 10 ml 6 x 500µ l 1 x 500µ l 1 x 22 ml 1 x 22 ml 1 x 7 ml

3) AUTRE MATERIEL INCLUS DANS LA TROUSSE • 2 bandes de film plastique adhésif (feuille d’aluminium) • Protocole Qualité • Feuille de protocole • Manuel d’utilisation 4) MATERIEL ET EQUIPEMENT NECESSAIRE MAIS NON FOURNI • Pipettes de précision calibrées pour délivrer de 50 µ l, 200 µ l, 300 µ l et embouts jetables • Lecteur de microplaques ELISA pour la mesure de l’absorbance à 450 nm (référence 630 nm) • Papier millimétré pour le calcul des résultats • Eau distillée ou désionisée 5) PREPARATION DES REACTIFS ET DES ECHANTILLONS

T ous les réactifs de la trousse restent stables à +4°C (2-8°C) jusqu’à la date de péremption (voir étiquette du réactif). Préparation des échantillons: Le proCNP des échantillons de sang fraîchement collectés est stable pendant au moins 2h30 à température ambiante. Nous recommandons néanmoins d’effectuer une séparation du plasma ou du sérum par centrifugation dès que possible, par 10/20

ex., 20 min à 2 000 x g, de préférence à +4°C (2-8°C). Après les avoir aliquotés, conserver les échantillons de plasma ou de sérum acquis à moins 25°C ou plus bas. Les échantillons peuvent être soumis à 5 cycles de congélation / décongélation sans perte de réaction immunitaire. Les échantillons lipémiques ou hémolysés peuvent fournir des résultats erronés. Les échantillons doivent être bien mélangés avant le dosage. Nous recommandons de pratiquer les dosages en double pour toutes les valeurs. Si les échantillons indiquent une valeur plus élevée que le standard supérieur, nous recommandons leur dilution avec l’ASYBUF (Tampon de dilution) (par ex. : au 1+1 ou 1+3) et d’effectuer une nouvelle mesure des échantillons. Pour plus amples informations sur la stabilité des échantillons contactez notre service clientèle à l’adresse email [email protected], ou en composant le numéro de téléphone +43/1/29107-45. Manipulation: WASHBUF (Tampon de lavage): Diluer le concentré à 1:20 (1+19). Par exemple, 50 ml de WASHBUF + 950 ml d’eau distillée. Les cristaux dans le concentré de lavage se dissoudront à température ambiante. Le tampon concentré reste stable à 4°C (2-8°C) jusqu’à la date de péremption mentionnée sur l’étiquette. Le tampon dilué reste stable à 4°C (2-8°C) jusqu’à un mois. Utilisez uniquement cette solution de tampon de lavage diluée (WASHBUF) pour le dosage. 6) PRINCIPE DU DOSAGE

Voir au chapitre 6) PRINCIPLE OF THE ASSAY de la version anglaise de la notice. 7) PROTOCOLE DU DOSAGE Tous les réactifs et échantillons doivent être portés à température ambiante (18-26°C) avant leur utilisation dans le dosage. Marquer la position du STD/SAMPLE/CTRL (Standard/Echantillon/Contrôle) sur la feuille du protocole. Sortir les barrettes de microtitrage du sac alu. Conserver les barrettes non-utilisées avec le dessiccateur à +4°C (2-8°C) dans le sac alu jusqu’à la date d’expiration. 1. Ajouter 50 µ l de STD/SAMPLE/CTRL (Standard/Echantillon/Contrôle) en double dans chaque puits. 2. Ajouter 200 µ l de CONJ (anti NT-proCNP-HRPO) dans chaque puits, puis agiter doucement. 3. Couvrir hermétiquement et incuber pendant 4 heures à température ambiante (18-26 °C) à l’abri de la lumière. 4. Aspirer et laver 5 fois les puits avec 300 µ l de WASHBUF (Tampon de lavage) dilué. Après le dernier lavage, taper la plaque contre une serviette afin d’enlever les dernières gouttes de WASHBUF. 5. Ajouter 200 µ l de SUB (Substrat) dans chaque puits, agiter doucement. 6. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante (18-26 °C) dans le noir. 7. Ajouter 50 µ l de STOP (Solution stop) dans chaque puits, agiter doucement. 8. Mesurer immédiatement l’absorbance à 450 nm avec une référence à 630 nm, si possible. 8) CALCUL DES RESULTATS

M esurez la densité optique (DO) de chaque puits avec un photomètre pour microplaques à filtre de 450 nm (Référence 630 nm). Soustraire l’absorbance du blanc des valeurs STD, CTRL et des échantillons. Construire la courbe d’étalonnage à partir des valeurs des étalons, utilisant du papier millimétré vendu couramment dans le commerce ou un logiciel prévu à cet effet. Le système de dosage a été évalué avec un algorithme à quatre paramètres (4PL). Des algorithmes d’évaluation différents doivent être évalués par l’utilisateur. La concentration des échantillons devra être reportée sur la courbe d’étalonnage. Tenir compte des facteurs de dilution respectifs. Courbe STD typique: Voir au chapitre 8) CALCULATION OF RESULTS dans la version anglaise de la notice d’utilisation. Le protocole de contrôle qualité fourni avec la trousse présente les résultats du dernier contrôle qualité de chaque trousse. Les données de densité optique obtenues par les utilisateurs peuvent être différentes suite à diverses influences et/ou à la perte de signal que l’on constate pendant la durée de vie d’une trousse. Cependant, cette perte de signal éventuelle n’a pas d’incidence sur la validité des résultats, à partir du moment où la DO de l’étalon ayant la concentration la plus élevée est au moins égale à 1,50 et que la valeur de CTRL est située dans une plage acceptable (pour la plage, voir l’étiquette).

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9) CARACTERISTIQUES DU DOSAGE Gamme des valeurs prévisionnel normales, hôpital panel: Gamme standard: Facteur de conversion: Volume de l’échantillon: Limite de detection: Temps d’incubation: Réaction croisée:

Sérum, prévisionnel normales: médiane = 2.7 pmol/l (n=42) Sérum, hôpital panel: médiane = 2.8 pmol/l (n=23) EDTA-plasma, hôpital panel: médiane = 3,0 pmol/ ( n=25) Chaque laboratoire doit établir sa propre gamme de valeurs normales. 0 – 40 pmol/l 1pg/ml = 0.151 pmol/l (en référence recombinante proCNP 1-64) 50 µ l sérum ou plasma humain (0 pmol/l + 3 SD): 0.2 pmol/l 4 heures / 30 min Non déterminée, homologie avec d’autres espèces pour les épitopes utilisés dans ce dosage: Epitope 1 : rat (88 %), mouton (94 %), cochon (94 %), souris (88 %), bovin (88 %) Epitope 2 : rat (95 %), mouton (90 %), cochon (95 %), souris (95 %), bovin (90 %)

Pour plus amples informations sur la stabilité des échantillons contactez notre service clientèle à l’adresse email [email protected], ou en composant le numéro de téléphone +43/1/29107-45. 10) PRECISION Précision intra-série : 2 échantillons ont été testés 5 fois d’un opérateur d’un essai Précision inter-séries : 2 échantillons ont été testés 30 fois d’un 4 opérateur d’un 3 essai Intra-série (n=5) Moyenne (pmol/l) SD (pmol/l) CV (%)

Échantillon 1 5.1 0.26 5

Échantillon 2 20.0 1.17 6

Inter-série (n=30) Moyenne (pmol/l) SD (pmol/l) CV (%)

Échantillon 1 5.0 0.07 1

Échantillon 2 20.0 0.15 1

11) CONSEILS TECHNIQUES • Ne pas remplacer ou mélanger les réactifs qui sont fournis avec ce kit avec ceux de lots ou de sources différents. • Ne pas mélanger les embouts ou bouchons de réactifs différents, ni utiliser les réactifs d’autres lots. • Ne pas utiliser les réactifs au-delà de leur date d’expiration. • Protéger les réactifs contre la lumière. • Les solutions d’amplificateur doivent être incolores. • Pour obtenir les résultats fiables, il est essentiel de sceller correctement la microplaque pendant les étapes d’incubation. • Eviter de faire mousser les réactifs lors du mélange. 12) PRECAUTIONS

Les produits d’origine humaine utilisés dans ce test ont été testés contre le VIH-Ab et l’AgHbs et ont été trouvés négatifs. Cependant, ils doivent être manipulés comme étant susceptibles de transmettre des maladies infectieuses. Réactifs liquides contenant comme conservateur du Proclin en concentration ≤ 0,1%. Eviter tout contact avec la peau et la muqueuse. Proclin 300 n’est pas toxique dans les concentrations utilisées dans cette trousse. Cependant, il peut entraîner les réactions allergiques et tout contact avec la peau ou les yeux doit être évité. • Ne pas pipetter avec la bouche. • Ne pas manger, boire, fumer, ni appliquer les produits cosmétiques pendant la manipulation des réactifs. • Porter les gants pour éviter tout contact avec les réactifs. • L’acide sulfurique irrite les yeux et la peau. Laver avec de l’eau en cas de contact. Eviter le contact avec la peau et les muqueuses. Les irritations sont possibles. Laver avec de l’eau en cas de contact !! 13) LITERATURE

Voir au chapitre 13) LITERATURE dans la version anglaise de cette notice.

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1) INTRODUZIONE

Il CNP appartiene al ben caratterizzato gruppo dei pepidi natriuretici, quali il peptide natriuretico atriale (ANP) e il peptide natriuretico cerebrale (BNP), manifestano importanti funzioni regolatorie e come bio-marcatori. Partecipano alla regolazione della pressione sanguigna e dell’omeostasi dei fluidi corporei, modificano la crescita e lo sviluppo del tessuto cardiovascolare e dell’osso. ANP e BNP sono ormoni cardiaci, secreti rispettivamente da atrio e ventricolo nel cuore degli adulti. Diversamente da ANP e BNP, il CNP è prodotto in quantità molto piccola dal tessuto cardiaco, mentre è principalmente espresso nel cervello, ghiandola pituitaria, endotelio vascolare, rene e tratto riproduttivo femminile. Tutti i peptidi natriuretici sono prodotti come pro-peptidi, i quali sono successivamente scissi nell’ormone C-terminale, biologicamente attivo, e nel frammento N-terminale (NT-proANP 1-98, NT-proBNP 1-76 e NT-proCNP, la cui lunghezza è tutt’ora non ben definita). Poichè questi frammenti N-terminali sono nettamente più stabili e circolano nel sangue in concentrazione maggiore rispetto agli ormoni attivi, risulta più facile e pratica la loro determinazione su siero o plasma. Perciò Biomedica ha sviluppato un immunodosaggio tipo sandwich per NT-proCNP che utilizza anticorpi diretti contro gli amminoacidi 1-19 e 30-50. Il ruolo fisiologico del CNP non è argomento di studio solo per quanto riguarda le cardiopatie, ma anche per la biologia legata allo sviluppo dell’osso, specialmente nel settore ricerca sull’osso, alle nefropatie, alla ricerca sullo sviluppo embrionale e sulle malattie vascolari. Indicazioni del dosaggio • malattie vascolari • diabete • sviluppo scheletrico • Sepsi 2) CONTENUTO DEL KIT CONT PLATE WASHBUF ASYBUF STD CTRL CONJ SUB STOP

COMPONENTI DEL KIT Strip di microtitolazione pre-rivestite di anti NT-proCNP di pecora e cornice per le strip, confezionate in busta con dessiccante Tampone di lavaggio concentrato 20x, tappo non colorato Tampone di dosaggio, tappo rosso, pronto all’uso Standard, (0; 2.5; 5; 10; 20; 40 pmol/l), tappo bianco, pronto all’uso Controllo, tappo giallo, pronto all’uso, vedere l’etichetta per l’esatta concentrazione Coniugato, (anti NT-proCNP-HRPO), tappo ambrato, pronto all’uso Substrato (soluzione di TMB), tappo blu, pronto all’uso Soluzione di arresto, tappo bianco, pronta all’uso

MENGE 12 x 8 test 1 x 50 ml 1 x 10 ml 6 x 500 µ l 1 x 500 µ l 1 x 22 ml 1 x 22 ml 1 x 7 ml

3) ALTRO MATTERIALE AGGIUNTO AL KIT • 2 copripiastra auto-adesivi • Protocollo QC • Protocol sheet • Manuale di istruzioni d’uso 4) MATERIALE ED EQUIPAGGIAMENTO RICHIESTO MA NON FORNITO • Micropipette di precisione calibrate per volumi di 50 µ l, 200 µ l, 300 µ l e puntali monouso • Lettore di micropiastre ELISA con filtro a 450 nm (riferimento a 630 nm) • Carta per grafici o software per il calcolo dei risultati • Acqua distillata o deionizzata 5) PREPARAZIONE DEI CAMPIONI E DEI REATTIVI

I reattivi contenuti nel kit sono stabili a +4°C (2-8°C) fino alla data riportata sull’etichetta di ciascun flacone. Preparazione dei campioni Il proCNP nei prelievi di sangue fresco è stabile per circa 2,5 ore a temperatura ambiente. Si consiglia, quindi, di separare il plasma o il siero per centrifugazione (es. 20 min. a 2000 x g preferibilmente a +4°C (2-8°C)) nel più breve tempo possibile dopo il prelievo. Aliquotare i campioni di plasma o siero e conservarli a -25°C o temperature inferiori. I campioni possono 13/20

essere soggetti a 5 cicli di congelamento-scongelamento senza perdere la loro attività. Campioni lipemici o emolizzati possono dare risultati errati. Rendere ben omogenei i campioni prima del dosaggio. Si consiglia di eseguire i dosaggi in doppio. Se la lettura di un campione è superiore rispetto a quella dello standard a concentrazione maggiore, diluirlo con ASYBUF (tampone per diluizioni) (es. 1+1 e 1+3) e ridosarlo. Per ulteriori informazioni sulla stabilità dei campioni si prega di contattare il distributore autorizzato locale. Modalità di ricostituzione dei reattivi: WASHBUF (Tampone di lavaggio): Diluire il tampone concentrato 1:20 ad es. 50 ml WASHBUF + 950 ml acqua distillata. I cristalli eventualmente presenti nel tampone concentrato, si disciolgono a temperatura ambiente. Il tampone non diluito è stabile fino a 4°C (2-8°C) fino alla data di scadenza riportata sull'etichetta. Il tampone diluito è stabile fino a un mese a 4°C (2-8°C). Utilizzare solo il WASHBUF (Tampone di lavaggio) diluito durante l’esecuzione del dosaggio. 6) PRINCIPIO DEL DOSAGGIO:

Vedi capitolo 6) PRINCIPLE OF THE ASSAY delle istruzioni in lingua inglese. 7) PROTOCOLLO DI DOSAGGIO Portare tutti i reattivi e i campioni a temperatura ambiente (18-26°C) prima di usarli per il dosaggio. Evidenziare la posizione di STD/CAMPIONE/CTRL (Standard/Campione/Controllo) sul protocol sheet. Togliere le strip della micropiastra dalla confezione. Conservare le strip inutilizzate con il dessiccante a +4°C (2-8°C) nella canfezione fino alla data di scadenza. 1. Aggiungere 50 µ l di STD/CAMPIONE/CTRL (Standard/Campione/Controllo) in doppio nei corrispondenti pozzetti. 2. Aggiungere 200 µ l di CONJ (anti NT-proCNP-HRPO) in ciascun pozzetto, picchiettare delicatamente la micropiastra. 3. Coprire bene con il copripiastra adesivo e incubare per 4 ore a temperatura ambiente (18-26°C) al buio. 4. Aspirare e lavare i pozzetti 5x con 300 µ l di WASHBUF (Tampone di lavaggio) diluito, togliere il WASHBUF restante picchiettando la micropiastra su carta assorbente dopo l’ultimo lavaggio. 5. Aggiungere 200 µ l di SUB (Substrato) in tutti i pozzetti, picchiettare delicatamente la micropiastra. 6. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (18-26°C) al buio. 7. Aggiungere 50 µ l di STOP (soluzione di arresto) in tutti i pozzetti, picchiettare delicatamente la micropiastra. 8. Misurare subito l’assorbanza a 450 nm con riferimento a lunghezza d’onda di 630 nm, se possibile 8) CALCOLO DEI RISULTATI

L eggere la densità ottica (OD) di tutti i pozzetti con un lettore di micropiastre utilizzando la lunghezza d’onda 450 nm (correzione con lunghezza d’onda 630 nm). Sottrarre l’OD del bianco da quella di STD, CTRL e campioni. Costruire la curva standard dai valori OD degli standard. Per l’elaborazione dei dati, utilizzare un programma computerizzato o carta millimetrata. Calcolare la concentrazione dei campioni da questa curva standard. Il test è stato valutato con l’interpolazione a 4 parametri. Sistemi di interpolazione differenti devono essere convalidati dagli utilizzatori. Tenere conto dei fattori di diluizione. Esempio curva tipica: V edi capitolo 8)CALCULATION OF RESULTS in lingua inglese. Il foglio di controllo di qualità fornito insieme al kit mostra i risultati ottenuti al rilascio finale di ogni kit dal Controllo di Qualità (QC). I valori di densità ottica ottenuti dagli utilizzatori possono essere differenti a causa di vari fattori e/o alla diminuzione nell'intensità del segnale derivata dal decadimento naturale del kit. In ogni caso, questo aspetto non incide sulla validità dei risultati finché la densità ottica del calibratore con la concentrazione più alta, sia superiore a 1.50. 9) CARATTERISTICHE DEL DOSAGGIO Valori da individui apparentemente sani, ospedale panel: Range standard: Fattore di conversione:

Siero, apparentemente sani: 2,7 pmol/l (mediana, n=42) Serum, ospedale panel: 2,8pmol/l (mediana, n=23) EDTA plasma, ospedale panel: 3,0 pmol/l (mediana, n=25) Si raccomanda che ciascun laboratorio stabilisca i propri valori di normalità. 0 – 40 pmol/l 1pg/ml = 0.151 pmol/l (riferirsi a recombinante proCNP 1-64) 14/20

Volume di campione: Sensibilità: Tempo di incubazione: Cross reattività:

50 µ l di siero a plasma umani (0 pmol/l + 3 SD): 0.2 pmol/l 4 ore / 30 min Non determinata, omologie con altre specie per quanto riguarda gli epitopi utilizzati: Epitopo 1: ratto (88%), pecora (94%), maiale (94%), topo (88%), bovino (88%) Epitopo 2: ratto (95%), pecora (90%), maiale (95%), topo (95%), bovino (90%)

Per ulteriori informazioni sulla caratteristiche del dossago si prega di contattare il distributore autorizzato locale. 10) PRECISIONE Intra-Saggio: 2 campioni a sono stati dosati 5 volte per valutare la precisione intra-saggio. Inter-Saggio: 2 campioni a sono stati dosati in 30 esperimenti diversi 3 lots un 4 eteronimo operators per valutare la precisione inter-saggio. Intra-saggio (n=5) Media (pmol/l) SD (pmol/l) CV (%)

Campioni 1 5,1 0,26 5

Campioni 2 20,0 1,17 6

Inter-saggio (n=30) Media (pmol/l) SD (pmol/l) CV (%)

Campioni 1 5,0 0,07 1

Campioni 2 20,0 0,15 1

11) ACCORGIMENTI TECNICI • Non mescolare o sostituire i reattivi di lotti differenti. • Non mescolare tra loro i tappi di differenti reattivi. • Non usare reattivi oltre la loro data di scadenza. Proteggere i reattivi dalla luce solare diretta. • La soluzione di substrato deve restare incolore fino all’aggiunta nei pozzetti della micropiastra. • Per assicurare l’ottenimento di risultati accurati, far aderire bene il copripiastra adesivo durante le incubazioni. • Evitare la formazione di schiuma nel mescolare i reattivi. 12) PRECAUZIONI

Tutti i componenti del kit di origine umana sono stati testati per HIV-Ab e HBsAg e sono risultati essere negativi. Nonostante ciò, tali componenti devono essere manipolati e smaltiti come materiale potenzialmente infetto. I reagenti liquidi contengono una percentuale ≤ 0.1% di Proclin 300 come conservante. La sodio azide è tossica! Evitare il contatto con la pelle e le mucose. Il Proclin 300 non è tossico nelle concentrazioni utilizzate in questo kit. Può causare reazioni cutanee di tipo allergico – evitare il contatto con la pelle o gli occhi. • Non pipettare a bocca. • Non mangiare, bere, fumare o usare cosmetici nei luoghi dove sono manipolati i reattivi. • Evitare qualsiasi contatto con i reattivi utilizzando guanti monouso. • La soluzione di arresto contiene acido solforico. L’acido solforico è irritante per gli occhi e la pelle. Lavare con acqua in caso di contatto. Evitare il contatto con la pelle e le mucose. Possibili irritazioni. Lavare con acqua dopo il contatto! 13) BIBLIOGRAFIA

Vedi capitolo 13) LITERATURE delle istruzioni in lingua inglese.

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1) INTRODUCCION

El CNP pertenece a un grupo de péptidos natriuréticos bien caracterizados del tipo del péptido natriurético atrial (ANP) y del péptido natriurético cerebral (BNP), los cuales juegan varios importantes papeles tanto en mecanismos de regulación como actuando como biomarcadores. Participan en la regulación de la presión sanguínea y en la homeostasis de los fluidos corporales, modifican el crecimiento y el desarrollo de los tejidos cardiovasculares y el hueso. El ANP y el BNP son hormonas cardiacas secretadas por el atrio y ventrículos, respectivamente en un corazón adulto normal. A diferencia del ANp y BNP el tejido cardiaco produce muy poca cantidad de CNP, pero se expresa principalmente en el cerebro, en la glándula pituitaria, en el endotelio vascular en el riñón y en el tracto reproductivo femenino. Todos los péptidos natriuréticos se producen como propeptidos, los cuales posteriormente se fragmentan en la hormona C-terminal y en el fragmento N terminal, biológicamente activos (NT-pro ANP 1-98, NT-proBNP 1-76 y NT-proCNP cuya longitud se encuentra actualmente en discusión). Debido a que los fragmentos N terminal son mucho más estables y circulan en cantidades mucho mayores que las hormonas activas resulta más fácil y accesible realizar su cuantificación en suero o plasma. Por esta razón se ha desarrollado un inmunoensayo de tipo sándwich para la detección de NT-proCNP utilizando anticuerpo dirigidos frente a los aminoácidos 1-19 y 30-50. El papel fisiológico del CNP se estudia únicamente en las enfermedades cardiacas, sino también en la fisiología del desarrollo óseo, en general en investigaciones sobre el hueso, enfermedades renales, investigaciones sobre desarrollo embrionario y enfermedades vasculares. Indicaciones • Enfermedades vasculares. • Diabetes • Desarrollo esquelético. • Sepsis. 2) CONTENIDO DEL KIT CONT PLACA WASHBUF ASYBUF STD CTRL CONJ SUB STOP

COMPONENTES DEL KIT Tiras de micropocillos recubiertas de Anticuerpo Policlonal ovino anti-NT proCNP en un soporte, incluidas en bolsa de aluminio con desecante. Tampón de lavado, concentrado 20x, tapón transparente Tampón de ensayo, tapón rojo, listo para usar Estándares, (0; 2,5; 5; 10; 20; 40 pmol/l), tapón blanco, listo para usar Control, tapón amarillo, listo para usar, ver la etiqueta para comprobar las concentraciones exactas. Conjugado, (anti-NT proCNP - HRPO), tapón ámbar, listo para usar Substrato (solución de TMB), tapón azul, listo para usar Solución de parada, tapón blanco, lista para usar

CANTIDAD 12 x 8 tests 1 x 50 ml 1 x 10 ml 6 x 500 µ l 1 x 500 µ l 1 x 22 ml 1 x 22 ml 1 x 7 ml

3) MATERIAL ADICIONAL INCLUIDO EN EL KIT • 2 tiras adhesivas de plástico • Protocolo para el Control de calidad QC • Hoja con el esquema del protocolo • Manual de instrucciones 4) MATERIAL Y EQUIPAMIENTO REQUERIDO QUE NO SE SUMINISTRA • Pipetas de precisión calibradas de 50 µ l, 200 µ l, 300 µ l y puntas desechables. • Lector de ELISA con capacidad para leer absorbancias a 450 nm (longitud de onda de referencia 630 nm). • Papel para representación gráfica o programa informático para el cálculo de los resultados. • Agua destilada o desionizada. 5) PREPARACION DE LOS REACTIVOS Y DE LAS MUESTRAS

T odos los reactivos en el kit son estables a +4ºC (2-8ºC) hasta la fecha de caducidad establecida en la etiqueta de cada reactivo. 16/20

Preparación de las muestras: El ProCNP es estable en las muestras de sangre recién extraídas durante al menos 2.5 horas a TA. Sin embargo, se recomienda realizar una separación del plasma o del suero por centrifugación lo antes posible (ej; 20 min a 2000 xg, preferentemente a +4ºC (2-8ºC)). Una vez realizada la separación del suero o el plasma, realizar alícuotas de la muestra y almacenar a -25ºC o más bajo. Las muestras pueden someterse a 5 ciclos de congelación-descongelación sin pérdida de su reactividad inmunológica. Las muestras con elevado contenido en lípidos o muy bemolizadas pueden conducir a resultados erróneos. Las muestras deberían mezclarse correctamente antes de utilizarse en el ensayo. Se recomienda la Realización de duplicados para todos los valores. Si las muestras arrojasen un valor superior al del estándar más elevado se recomienda diluir con ASYBUF (tampón de dilución) (ej. 1+1 y 1+3) y someter nuevamente a ensayo. Para información adicional sobre estabilidad de la muestra por favor contacte con nuestro Servicio al cliente por e-mail [email protected] o por teléfono +43/1/29107-45. Reconstituir como se indica: WASHBUF (Tampón de lavado): Diluir el concentrado 1:20, ej. 50 ml WASHBUF + 950 ml de agua destilada. Los cristales en el tampón concentrado pueden disolverse a temperatura ambiente. El tampón sin diluir es estable a 4°C (2-8°C) hasta la fecha de caducidad marcada en la etiqueta. Si el WASHBUF está diluido, se mantiene estable durante un periodo de un mes, como máximo, a 4°C (2-8°C). Utilizar solo el WASHBUF diluido para el ensayo. 6) PRINCIPIO DEL ENSAYO

V er capítulo 6) PRINCIPLE OF THE ASSAY de la versión inglesa del manual de instrucciones del ensayo. 7) PROTOCOLO DEL ENSAYO Todos los reactivos y las muestras deben alcanzar la temperatura ambiente (18-26°C) antes de su utilización en el ensayo. Marcar la posición para el STD/ MUES/CTRL (Estándar/Muestras/Control) en la hoja del esquema de la placa. Sacar las tiras de la bolsa de aluminio. Las tiras de los pocillos no utilizadas pueden almacenarse en la bolsa de aluminio junto con el desecante a +4ºC (2-8ºC) hasta la fecha de caducidad. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Añadir 50 µ l de STD/SAMPLE/CTRL (estándar /muestra/control) por duplicado a los pocillos respectivos. Añadir 200 µ l del CONJ (anti NT-proCNP-HRPO) en cada pocillo, agitar suavemente. Tapar con cuidado e incubar durante 4 horas a temperatura ambiente (18-26°C) en la oscuridad. Aspirar y lavar los pocillos 5x con 300 µ l de WASHBUF diluido (Tampón de lavado), eliminar el excedente de WASHBUF golpeando la placa suavemente sobre papel absorbente después del último lavado. Añadir 200 µ l de SUB (Substrato) a cada pocillo, agitar suavemente. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente (18-26ºC) en oscuridad. Añadir 50 µ l de STOP (solución de parada) a cada pocillo, agitar suavemente. Medir la absorbancia inmediatamente a 450 nm y utilizar como referencia un filtro de 630 nm, si está disponible.

8) CALCULO DE RESULTADOS

L eer la densidad óptica (OD) de todos los pocillos en un lector de placas usando una longitud de onda de 450 nm (corrección de longitud de onda a 630 nm). Restar el valor del blanco a los valores de los STD, CTRL y muestras. Realizar una curva estándar a partir de los valores de las absorbancias de los estándares. Utilizar un programa informático o un papel de representación gráfica. Obtener el valor de la concentración de la muestra a partir de la curva estándar. El ensayo fue evaluado con un algoritmo de 4 PL. Los distintos métodos de ajuste de curvas empleados deben se evaluados por el usuario. Se deben de considerar distintos factores de dilución. Ejemplo de típica curva de calibración:

V er capítulo 8) CALCULATION OF RESULTS del ensayo de la versión inglesa del manual de instrucciones del ensayo. El certificado del control de calidad que se suministra con el kit muestra los resultados del último control de calidad para cada kit en la fecha de producción. Los datos de la densidad óptica obtenidos por los clientes pueden diferir debido a diversos factores y/o debido a una disminución normal de la intensidad de la señal lo largo de la vida media. Sin embargo, esto no afecta a la validez de los resultados siempre que se obtenga un valor de 1,5 para la densidad óptica del estándar de concentración más elevada y que el valor del CTRL se encuentre en rango (rango del valor diana se encuentra en la etiqueta). 17/20

9) CARACTERISTICAS DEL ENSAYO Valores de individuos aparentemente sanos, hospital panel: Rango estándar Factor de conversión Volumen de la muestra: Límite de Detección Tiempo de Incubación: Reacciones Cruzadas

Suero, individuos aparentemente sanos: 2,7 pmol/l (median, n=42) Suero, hospital panel: 2,8pmol/l (median, n=23) EDTA plasma, hospital panel: 3,0 pmol/l (median, n=25) Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio rango de normalidad. 0 a 40 pmol/l 1pg/ml = 0,151 pmol/l (la referencia recombinante proCNP 1-64) 50 µ l de suero o plasma humano (0 pmol/l + 3 SD): 0,2 pmol/l 4 horas / 30 min Sin determinar. Homología frente a otras especies para los epítopos utilizados en este ensayo: Epítopo 1: rata (88%), oveja (94%), cerdo (94%), ratón (88%), bovino (88%) Epítopo 2: rata (95%), oveja (90%), cerdo (95%), ratón (95%), bovino (90%)

Para más información en las características del ensayo por favor contacte con nuestro servicio de atención al cliente por e-mail [email protected] o por teléfono +43/1/29107-45. 10) PRECISION Intra-Ensayo: Para valorar la precisión intra-ensayo se analizaron 5 replicados de 2 muestras de concentraciones conocidas Inter-Ensayo: Para valorar la precisión inter-ensayo se analizaron 2 muestras de concentraciones conocidas en 30 ensayos, 3 variosa lots, 4 varios operators Intra-Ensayo (n=5) Media (pmol/l) SD (pmol/l) CV (%)

Muestra 1 5,1 0,26 5

Muestra 2 20,0 1,17 6

Inter-Ensayo (n=30) Media (pmol/l) SD (pmol/l) CV (%)

Muestra 1 5,0 0,07 1

Muestra 2 20,0 0,15 1

11) OBSERVACIONES TECNICAS • No mezclar o sustituir reactivos de diferentes lotes o fabricantes. • No mezclar los tapones de los viales de diferentes reactivos o de reactivos de diferentes lotes. • No utilizar los reactivos después de la fecha de caducidad. • Proteger los reactivos de la acción directa de la luz solar. • La solución de substrato debería permanecer incolora hasta que se añada a la placa. • Para asegurar unos resultados más exactos, tapar la placa con el papel adhesivo durante los pasos de incubación. • Evitar la formación de espuma cuando se mezclen los reactivos. 12) PRECAUCIONES

Todos los componentes de procedencia humana fueron testados con ensayos de 3ª generación frente a la presencia de anticuerpos frente a VIH y al antígeno de superficie de la Hepatitis B con resultado negativo. Sin embargo, deberían manipularse y eliminarse como si se tratara de material potencialmente infeccioso. Los reactivos líquidos contienen ≤ 0.1% de Proclin 300 como conservante. La Proclina 300 no es tóxica en las concentraciones empleadas en este kit. Puede provocar reacciones alérgicas en la piel, evitar el contacto con la piel ó los ojos. • No pipetear con la boca. • No comer o beber o aplicarse cosméticos en las zonas de manipulación de los reactivos. • Evitar el contacto con los reactivos utilizando guantes. La solución de parada contiene ácido sulfúrico, y el contacto con este componente puede producir irritación de los ojos y de la piel. Si tiene lugar un contacto, enjuagar con abundante agua. 13) LITERATURA

Ver capítulo 13) LITERATURE

de la versión inglesa del manual de instrucciones del ensayo.

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SYMBOLS Expiry date / Verfallsdatum / Date de péremption / Data di scadenza /Fecha de caducidad / Data de validade / Uiterste gebruiksdatum / Udløbsdato / Utgångsdatum / Termin Ważności / Lejárati idő / Doba exspirácie / Doba exspirace Consider instructions for use / Bitte Gebrauchsanweisung beachten / Consultez la notice d'utilisation / Consultare le istruzioni per l'uso / Consulte las instrucciones de utilización / Consulte as instruções de utilização / Raadpleeg de gebruiksaanwijzing / Se brugsanvisningen / Läs anvisningarna före användning / Proszę przeczytać instrukcję wykonania / Vegyük figyelembe a használati utasításban foglaltakat / Postupujte podľa pokynov na použitie / Postupujte dle návodu k použití In vitro Diagnostic Medical Device (for in Vitro Diagnostic Use)/ In vitro Diagnostikum (zur In-vitroDiagnostik) / Dispositif médical de diagnostic in vitro (Pour usage diagnostique in vitro) / Dispositivo medico per diagnostica in vitro (per uso diagnostico in vitro) / Dispositivo médico de diagnóstico in vitro (para uso diagnóstico in vitro) / Dispositivo médico para diagnóstico in vitro (Para utilização de diagnóstico "in vitro") / Medisch hulpmiddel voor diagnostiek in vitro (Voor diagnostisch gebruik in vitro) / Medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik (Udelukkende til in vitro diagnostisk anvendelse) / Medicinteknisk produkt avsedd för in vitro-diagnostik (För in vitrodiagnostiskt bruk) / Wyrób medyczny do Diagnostyki In Vitro / In vitro orvosdiagnosztikai termék / In vitro diagnostický zdravotnícky materiál (určené pre diagnostiku „in vitro“) / In vitro diagnostický zdravotnicky materiál (určeno pro diagnostiku „in vitro“) Lot-Batch Number / Charge-Chargennummer / Lot-Code du lot / Lotto-Numero di lotto / LoteCódigo de lote / Lote-Código do lote / Lot-Partijnummer / Lot-Batchkode / Lot-Satskod / Numer serii / Lot-Batch szám / Číslo šarže / Číslo šarže Manufactured by / Hergestellt von / Fabriqué par / Prodotto da / Fabricado por / Fabricado por / Vervaardigd door / Fabrikation af / Tillverkad av / Wyprodukowane pr / Gyártotta / Vyrobené / Vyrobeno Catalogue Number / Bestellnummer / Numéro de référence / Numero di riferimento / Número de referencia / Número de referência / Referentienummer / Referencenummer / Katalognummer / Numer katalogowy / Katalógusszám / Katalógové číslo / Katalogové číslo Store at between / Lagerung bei zwischen / Conserver à entre / Conservare a tra / Conservar a temp. entre / Armazene a entre / Bewaar bij tussen / Opbevares mellem / Förvaras vid / Przechowywać w / Tároljuk …… között / Skladujte v rozsahu / Skladujte v rozmezí Contains sufficient for x tests / Inhalt ausreichend für x Tests / Contient suffisant pour x tests / Contenuto sufficiente per x test / Contiene suficiente para x pruebas / Contém suficiente para x testes / Bevat voldoende voor x bepalingen / Indeholder tilstrækkeligt til x prøver / Innehållet räcker till x analyser / Zawartość na x testów / Tartalma X teszt elvégzésére elegendő / Obsahuje materiál pre x testov / Obsahuje materiál pro x testů

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BI-20872 NT-proCNP ASSAY PROTOCOL AND CHECKLIST PREPARATION OF REAGENTS:


Bring all reagents to room temperature (18-26°C).




Prepare reagents and samples as instructed.




Bring unused and prepared components to the storage temperature mentioned in the package insert.




Take microtiter strips out of the aluminium bag and mark positions on the protocol sheet.

TEST PROCEDURE:


1) Add 50 µ l STD/ SAMPLE/ CTRL (standard/diluted sample/diluted control) into each well.




2) Add 200 µ l CONJ (Conjugate) into each well, swirl gently.




3) Cover tightly and incubate for 4 hours at room temperature (18-26°C) in the dark.




4) Aspirate and wash wells with 300 µ l diluted WASHBUF (Wash buffer) five times. Remove remaining buffer by hitting plate against paper towel.




5) Add 200 µ l SUB (Substrate) into each well, swirl gently.




6) Incubate for 30 minutes at room temperature (18-26°C), in the dark.




7) Add 50 µ l STOP (Stop solution) into each well.




8) Read optical density at 450 nm with reference 630 nm, if available.

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