REVISIÓN

Modelos experimentales de la enfermedad de Alzheimer M. Sarasa EXPERIMENTAL MODELS FOR ALZHEIMER’S DISEASE RESEARCH Summary. Introduction and development. Current animal models for Alzheimer’s research include transgenic mice that express a mutant form of human beta-amiloid precursor protein (APP). However, the mutant mice with the human APP transgene also have their own endogenous APP gene, which may interfere with APP processing to generate β-amyloid peptide. Conclusion. By genetic and immunochemical analyses, our laboratory has discovered that there are animals in the nature, the chick embryo and the dog in particular, which may be better experimental models than the transgenic mice, because they contain the same machinery as humans to process APP and they are easier to access, manipulate or explore their neurology. These species may be natural experimental models to study the cell biology of Alzheimer’s APP and potential assay systems for drugs used to regulate β-amyloid production as well as for the assay of new therapeutic strategies against so devasting disease. [REV NEUROL 2006; 42: 297-301] Key words. Animal models. Alzheimer. β-amyloid. Chick embryo. Dog.

INTRODUCCIÓN Los roedores, en especial la rata y el ratón, son los animales más utilizados actualmente en los laboratorios como modelos experimentales de gran variedad de enfermedades humanas. Mamíferos como el hombre, su corto ciclo reproductivo (21 días de gestación) y alta prolificidad hace que estos animales sean fáciles de mantener y, por su reducido tamaño, relativamente fáciles de manejar. El gran desarrollo de la ingeniería genética y la biotecnología, aplicadas mayoritariamente en el ratón, ha llevado a la generación de gran cantidad de animales transgénicos (portadores de determinados genes exógenos introducidos o transgenes) o animales agénicos o knockout (aquellos a los que se les extirpa un determinado gen), lo que ha ayudado a conocer los procesos en los que puede estar implicada la proteína o proteínas producidas por el gen introducido o bien por el gen extirpado. Más importante desde un punto de vista médico es el hecho de que la ingeniería genética está permitiendo producir animales que sirven de modelo en el que investigar una determinada enfermedad. La enfermedad de Alzheimer no se ha resistido a este gran desarrollo de la biotecnología y actualmente existen gran número de animales transgénicos y knockout en los que analizar in vivo ciertos aspectos de la enfermedad. Especialmente interesantes han sido un grupo de líneas de ratones transgénicos portadores de gen humano de la APP (β-amyloid precursor protein; proteína precursora del amiloide β) con alguna de las mutaciones que dan lugar a la forma familiar o hereditaria de la enfermedad. Estos ratones llegan a desarrollar placas amiloides en su cerebro

y a recapitular algunos de los signos neurológicos de la enfermedad (véase la reciente revisión de Gómez-Isla e Irizarry [1]). Sin embargo, como mostraremos en este artículo, la rata o el ratón carecen de ciertos aspectos importantes relacionados con la enfermedad: la longevidad, por ejemplo, es un factor importantísimo, y estos animales tienen una vida corta, entre 2 y 4 años. Por otro lado, su proteína amiloide, derivada del procesamiento proteolítico de la precursora APP, es diferente a la humana. En este artículo describiremos algunos de los resultados obtenidos en nuestro laboratorio y cómo llegamos al descubrimiento de la existencia en la naturaleza de animales que pueden servir como modelos naturales en los que analizar algunos aspectos importantes de la enfermedad. Parte de esos estudios ha llevado a producir, por ejemplo, unos anticuerpos altamente específicos frente a las dos principales isoformas del péptido amiloide o a proponer un método de tratamiento.

© 2006, REVISTA DE NEUROLOGÍA

LA RATA La rata es el animal de laboratorio más usado como modelo en Neurociencia. Existen numerosos estudios sobre enfermedad de Alzheimer en los que se ha utilizado la rata como modelo. Cabe destacar, por ejemplo, los estudios que llevaron al descubrimiento de la neprilisina [2] o la IDE (insulin degrading enzyme) [3] como las principales proteasas implicadas en la degradación del péptido amiloide β. En nuestro laboratorio, la rata fue el modelo elegido en nuestras investigaciones sobre la cinética de expresión de las isoformas de la APP en respuesta a la axotomía de las neuronas motoras [4] o en el estudio de la expresión de las APP durante la embriogénesis [5]. En este estudio sobresalió el descubrimiento de la especificidad que tienen unos derivados u otros de las tres hojas de la gástrula del embrión para expresar una determinada isoforma de APP. La isoforma prototipo de 695 aminoácidos (APP695) es específica de todos los derivados neurectodérmicos, incluidos los derivados del tubo neural (encéfalo y médula espinal), de las crestas neurales (ganglios sensitivos y vegetativos) y de las placodas neurectodérmicas (algunos ganglios craneales y el epitelio olfativo). En cambio, la isoforma más larga de 770 aminoácidos (APP-770) es específica de los derivados mesodérmicos y endodérmicos (Fig. 1). La isoforma APP-751 tiene una expresión ubicua o generalizada por todas las células del embrión.

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Aceptado tras revisión externa: 26.05.05. Laboratorio de Neurobiología. Universidad de Zaragoza. Facultad de Veterinaria. Zaragoza, España. Correspondencia: Dr. Manuel Sarasa. Laboratorio de Neurobiología. Universidad de Zaragoza. Facultad de Veterinaria. Miguel Servet, 177. E-50013 Zaragoza. Fax: +34 976 761 605. E-mail: [email protected] Agradecimientos. Al Dr. J. Gazulla Abío, por su mediación y la revisión del manuscrito. Este estudio contó con el apoyo económico del gobierno español (a través del ministerio correspondiente) al proyecto SAF2003-08444, del Gobierno de Aragón al proyecto PO68/2000, y de Araclon Biotech al contrato OTRI 2004-0062 con la Universidad de Zaragoza. Estudio presentado en la Reunión Extraordinaria de los grupos de Neuroquímica, Neurofarmacología y Neurogeriatría de la SEN, celebrada en Soria.

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EL RATÓN Como ya hemos indicado en la introducción, aparte del ratón natural –cuyo papel como modelo experimental sería similar al de la rata–, los ratones knockout y los ratones transgénicos son potentes herramientas para el análisis de muchos aspectos de la enfermedad. El análisis de los ratones knockout para genes implicados en la enfermedad, como la APP, la ApoE (apolipoproteína E), la β-secretasa o la presenilina, ha dado en algunos casos muchas pistas sobre los efectos que podría Figura 1. Expresión de APP (proteína precursora del amiloide β) en un embrión de rata de 18 días de gestación. Hibridación in situ con sondas de ADN específicas para la APP-695 y la APP-770 y con una tener la utilización de fármacos que sonda que reconoce cualquier APP (total). a: adrenal; e: estómago; ge: ganglio espinal; h: hígado; i: inactúen sobre cualquiera de estas proteí- testino; m: miembro posterior; me: médula espinal; r: riñón. nas. Recientemente, por ejemplo, se ha visto que el knockout del gen de la presenilina [6] produce un fenotipo en el que se aprecian neurodegeneración, déficit de memoria y graves alteraciones en las sinapsis, lo que pone en prevención el uso de inhibidores de la γ-secretasa como tratamiento de la enfermedad. Curiosamente, el knockout de la APP [7], precursora del péptido ami- Figura 2. Comparación de la secuencia del péptido amiloide de 42 aminoácidos entre diversas espeloide β, principal molécula implicada cies. La rata y el ratón tienen tres aminoácidos diferentes, en los que se cambia una glicina (G) por una (R), una fenilalanina (F) por una tirosina (Y) y una arginina por una histidina (H). Los asteriscos en la enfermedad [8], producida tras el arginina indican residuos implicados en amiloidogénesis. procesamiento proteolítico por β-secretasa y γ-secretasa (en la que la presinilina forma parte), no tiene un fenotipo importante, lo que indica sencia de depósitos amiloides en su cerebro –dada la implicaque la función de APP puede ser poco importante para la vida del ción que se le ha dado al colesterol en la enfermedad–, y hemos ratón o bien, como se ha sugerido, que su función queda suplida observado enormes variaciones entre los hermanos transgénicos. por otra proteína (como la APLP-2 [7], de estructura parecida). Desde la presencia hasta la total ausencia de depósitos amiloiLo mismo sucede con el knockout de β-secretasa [9], que es per- des. Inesperada y sorprendentemente, también observamos algufectamente compatible con la vida del ratón. La ausencia de feno- nos depósitos amiloides en algún animal de control. tipos letales en los ratones knockout para APP o β-secretasa, los Otro ejemplo de ausencia de fenotipo o efecto inesperado en cuales no pueden generar péptido amiloide β, abre una esperanza transgénicos lo puede representar aquel doble transgénico que copara el tratamiento de la enfermedad mediante inhibidores de la sobreexpresa tau humana y PS-1 mutada humana y, sin embargo, β-secretasa o bloqueo directo del péptido amiloide β. no produce las esperadas marañas (tangles) neurofibrilares [10]. Se han creado varias líneas de ratones transgénicos que recogen, en algunos casos, aspectos de la enfermedad de Alzheimer, pues producen placas en sus cerebros y algunos ejemplares EL EMBRIÓN DE POLLO muestran deficiencias neurológicas asociadas con la edad [1]. Conocida la expresión de las isoformas de APP durante el deSin embargo, estos ratones son difíciles de explorar neurológi- sarrollo embrionario de la rata [5] y la falta de un fenotipo camente, por lo que se necesitan pruebas y aparatos bastante importante en los ratones knockout para la APP [7], elegimos en sofisticados. Por otra parte, estos animales contienen –además el laboratorio el embrión de pollo como modelo experimental del gen exógeno introducido (el transgén)– el gen endógeno en el que analizar la posible función de la APP en los múltiples propio, que puede estar interfiriendo en la biología celular (pro- procesos que suceden durante la embriogénesis. El embrión de cesamiento, acúmulo, degradación y actividad sobre las neuro- pollo es de fácil manejo y accesibilidad, y nuestro laboratorio nas) de la APP. tiene una larga experiencia en su uso. Antes de comenzar con Otro de los problemas que tienen los ratones es la enorme los experimentos de bloqueo funcional de la APP, la primera variabilidad entre unos individuos y otros, la falta de fenotipo de pregunta que nos surgió fue cómo sería el gen de la APP del pomuchos transgénicos y el elevado coste de producción y mante- llo. Para responder a esa pregunta, aislamos el ARN del emnimiento. En nuestro laboratorio produjimos animales transgéni- brión de pollo y clonamos el correspondiente ADN (gen). Al secos relacionados con otros proyectos y la variación de fenotipos cuenciarlo, nos llevamos la sorpresa de que era prácticamente entre individuos, incluso entre hermanos positivos para un trans- idéntico al humano. De hecho, la secuencia de la APP corresgén de una misma camada, es muy alta. Hemos tenido oportuni- pondiente al péptido amiloide del pollo es la misma que en la esdad de analizar ratones knockout para la ApoE, que expresan ele- pecie humana, mientras que el ratón o la rata, mamíferos como vados niveles de colesterol, con el objeto de comprobar la pre- el hombre, tienen secuencias diferentes (Fig. 2).

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b Figura 3. Placas amiloides en un cerebro afectado por la enfermedad de Alzheimer: a) Marcaje observado con el anticuerpo AB2, específico para el péptido amiloide de 40 aminoácidos; b) Marcaje observado con el anticuerpo AB3, específico para el péptido amiloide de 42 aminoácidos. Nótese que el péptido de 40 aminoácidos predomina en el núcleo de las placas y el de 42 aminoácidos está distribuido por toda la placa, aunque predomina en la periferia. Con el anticuerpo AB3 se ve también el citoplasma de las neuronas.

La siguiente pregunta que nos hicimos fue si el embrión de pollo tendría toda la maquinaria molecular para procesar la APP y generar el péptido amiloide. La respuesta ha sido afirmativa, pues el embrión de pollo expresa tanto las β-secretasas 1 y 2 como las presenilinas 1 y 2 y la nicastrina, proteínas que forman parte del complejo γ-secretasa –proteasa necesaria para la generación del péptido amiloide–. También hemos comprobado que el embrión de pollo expresa ADAM-10 y TACE, proteasas con actividad α-secretasa, que es la enzima implicada en el procesamiento no amiloidogénico de la APP por cortarla dentro de la región que da lugar al péptido amiloide. El embrión de pollo expresa, además, neprilisina, la principal proteasa implicada en la degradación del amiloide beta. El estudio de la clonación y expresión en el embrión de pollo de todos estos genes se ha publicado recientemente [11]. La pregunta que, lógicamente, uno se plantea ante estos resultados es si el embrión de pollo puede ser un buen modelo para investigar en la enfermedad de Alzheimer. Se sabe bien que la edad es un factor epigenético clave para la aparición de la enfermedad. Nos hemos preguntado si los pollos viejos desarrollarán placas amiloides en sus cerebros y si sufrirán algún tipo de demencia relacionada con el proceso de envejecimiento. No hemos podido conseguir pollos con una edad próxima a su senectud. El pollo tiene una longevidad de hasta 30 años, pero su edad comercial termina con menos de 2 meses, edad en que se destinan al consumo

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de carne, o con 14 meses, momento en que se utilizan para la producción de huevos. Hemos conseguido pollos de hasta 10 años, procedentes de granjas o corrales privados, los cuales se encuentran a finales del primer tercio de sus posibilidades de vida, y hemos analizado sus cerebros. Éstos no difieren aparentemente en nada de los cerebros de pollos de 2 o 14 meses de edad. La conclusión lógica de nuestros estudios es que el pollo joven no sirve como modelo de la enfermedad de Alzheimer, pero en su fase embrionaria puede ser útil para el ensayo de fármacos que regulen el metabolismo de la APP y para estudiar su biología celular y función durante el desarrollo embrionario. Una parte de nuestro estudio con el embrión de pollo consistió en la producción de anticuerpos frente a diferentes regiones de la molécula de APP con el fin de que nos permitiesen analizar su biología celular durante la embriogénesis. Caracterizamos estos anticuerpos y comprobamos, dada la altísima homología entre la APP aviaria y la humana, que algunos de ellos reconocían, con gran afinidad y especificidad, las placas amiloides de los cerebros de personas que han padecido la enfermedad de Alzheimer (Fig. 3). Estos anticuerpos los produce y comercializa actualmente la empresa Araclon Biotech. De las investigaciones con la producción de los anticuerpos generados frente a la APP del embrión de pollo surgió la idea de una posible terapia frente a la enfermedad. La idea consiste en que, si los animales a los que se les inocula los antígenos utilizados en las inmunizaciones generan anticuerpos altamente específicos frente a las principales isoformas de péptido amiloide, lo mismo debería suceder cuando en vez del animal se utiliza al hombre como receptor de la inmunización, de manera que neutralizasen las proteínas frente a las que se producen. Otra forma terapéutica frente a la enfermedad sería la utilización directa de los anticuerpos, producidos en animales o en células in vitro, o de sus fragmentos, como tratamiento mediante inmunidad pasiva. EL PERRO Los problemas que presentan modelos animales como la rata y el ratón (escasa longevidad y amiloide diferente al humano) o el pollo (dificultad en analizar animales viejos) quizá estén solventados en animales como el perro. El perro puede ser un modelo experimental para la enfermedad de Alzheimer especialmente interesante. Se trata de una especie muy cercana al hombre en su comportamiento y costumbres, además de convivir entre nosotros. En muchos casos, se lo considera como un miembro más de la familia con derecho al mismo nivel de asistencia médica que cualquier otro. Los perros sanos incluso son más hábiles que los primates en algunas pruebas en las que se trata de leer las indicaciones que les hace el hombre para localizar objetos ocultos [12]. El perro tiene, además, la ventaja de que disponemos de individuos de todas las edades accesibles a nuestros análisis. Al igual que los humanos, estos mamíferos desarrollan, conforme avanzan en edad, placas amiloides en sus cerebros, y algunos ejemplares (más frecuente en razas longevas, como el teckel, el caniche o el yorkshire) sufren esporádicamente, como en los casos de Alzheimer, un deterioro cognitivo relacionado con la edad, una demencia canina con trastornos similares a los de la enfermedad de Alzheimer, con pérdida de memoria a corto plazo o memoria de trabajo, cambios de comportamiento, pérdida de respuesta a ciertos estímulos, irritabilidad, incontinencia, problemas de orientación y, en los casos más graves, llegan a desconocer a las personas que conviven con ellos

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[13]. Además, la neurología canina está mucho más desarrollada, es más versátil y rica en matices y es mucho más fácil de explorar que la del ratón o el pollo. Su tamaño también permite realizar gran número de pruebas neurológicas complementarias como las que se hacen en nuestra especie, incluidas la TAC (tomografía axial computarizada) –de la que disponen ya los hospitales de algunas facultades de veterinaria españolas–, electroencefalogramas o extracciones de sangre y de líquido cefalorraquídeo en cantidad suficiente como para valorar gran número de parámetros, incluidos los péptidos amiloides. Hemos clonado y secuenciado las APP caninas y hemos visto que son prácticamente idénticas a las humanas, incluida la secuencia correspondiente al péptido amiloide (Fig. 2). Hemos empezado a analizar la presencia y distribución de placas amiloides en cerebros de perros jóvenes y viejos sanos y en cerebros de perros con disfunción cognitiva grave, con anticuerpos específicos frente a Aβ40 y Aβ42, y hemos encontrado que los animales dementes viejos tienen mayor número de placas amiloides y mucho más maduras que los perros viejos controles. La conveniencia del perro como modelo experimental de la enfermedad de Alzheimer viene por el hecho añadido de que comienza a desarrollar placas amiloides, de manera natural, aproximadamente a la misma edad (alrededor de los 12 años) que los humanos que más pronto las producen, como los individuos con síndrome de Down. OTROS MODELOS ANIMALES Los primates son sin duda un excelente modelo, dada la longevidad de algunas especies y su proximidad filogenética con el hombre. Sin embargo, son difíciles de manejar, caros de mantener y tan complicados como el hombre, o más, a la hora de obtener sus tejidos para analizar. Otro modelo lo representan los cetáceos. Disfrutan de gran longevidad (más de 100 años algunas especies), son fácilmente accesibles para nosotros y podrían servir de modelos en los que analizar algunos aspectos de la enfermedad. En el laboratorio nos hemos planteado la posibilidad de que el varamiento de los cetáceos pudiera deberse a la demencia de los animales mayores (en los casos de varamientos masivos, éstos podrían deberse a la afectación de los líderes: machos viejos que son seguidos por los demás miembros del grupo) y que estos animales varados tuvieran placas amiloides y otras lesiones similares al Alzheimer. Hemos empezado a analizar unas muestras de cerebros y hemos encontrado una enorme amiloidosis, visible ya con tinciones sencillas como rojo congo y hematoxilina-eosina, incluso en lugares tan poco frecuentes en los casos de Alzheimer (únicamente en los más afectados) como el cerebelo y el bulbo raquídeo. Por ello, tenemos interés en analizar detalladamente la distribución de placas amiloides en los cerebros de animales varados, así como la expresión de los genes que componen la maquinaria implicada en el procesamiento de la APP, previo aislamiento, clonación y secuenciación de los citados genes; ello consituye el trabajo de tesis de una bióloga marina, realizado en nuestro laboratorio.

Otro modelo animal propuesto hace algunos años y recientemente analizado por Sparks y Schreurs [14] para el estudio de la enfermedad es el conejo alimentado con una dieta rica en colesterol y cobre. Estos animales desarrollan placas amiloides en sus cerebros y deficiencias en el aprendizaje de tareas complejas. Los autores indican que, a diferencia de los ratones transgénicos –que únicamente tienen uno o dos de los signos de la enfermedad de Alzheimer–, los conejos tratados con dietas ricas en cobre y colesterol presentan hasta 12 signos de la demencia por Alzheimer. Estos signos son un aumento de la inmunorreactividad para amiloide β en las neuronas, presencia de placas extracelulares, inmunorreactividad para Aβ en las meninges, inmunorreactividad para la ApoE, la catepsina D, la superóxido dismutasa (SOD) y el antígeno murino de células endoteliales, microgliosis, apoptosis, activación vascular de SOD, roturas de la barrera hematoencefálica, elevación de los niveles cerebrales de colesterol y péptido amiloide, además de déficit en la dificultad para aprender tareas difíciles, dependientes éstas de la corteza temporal e hipocampo. Los problemas que tienen los conejos como modelo son parecidos a los de las ratas y ratones: su escasa longevidad y la dificultad para realizarles las pruebas neurológicas. Recientemente ha aparecido un trabajo [15] que describe un nuevo modelo animal. Se trata de una mosca del vinagre multitransgénica, portadora de los genes humanos de la APP, la βsecretasa y las presenilinas. Estas moscas transgénicas producen placas amiloides, sufren una neurodegeneración conforme avanza su edad y tienen una vida más corta que sus congéneres no transgénicos. De este estudio es destacable que, como indican los autores, la neurodegeneración inducida por el péptido amiloide parece ser un principio básico de la biología. CONCLUSIÓN Existe una gran variedad de animales que pueden servir como modelos experimentales de la enfermedad de Alzheimer. Además de algunas líneas de ratones transgénicos, que se han mostrado como potentes herramientas en las que ensayar nuevas estrategias terapéuticas, la naturaleza nos presenta algunas especies animales que pueden servir de modelos ‘naturales’ en los que explorar algunos aspectos de la enfermedad y que pueden servir, también, para el ensayo de nuevas terapias. Entre estos modelos naturales cabe destacar el embrión de pollo para el ensayo de fármacos que regulen el metabolismo de la APP o –muy especialmente– el perro, que puede servir de modelo en el que analizar las fases iniciales de la enfermedad y el posterior ensayo de terapias. El perro es –como el hombre– un mamífero, disfruta de cierta longevidad (entre 12 y 20 o más años según la raza), tiene un comportamiento y costumbres mucho más cercanos a los de nuestra especie que los roedores o el pollo, tiene una APP prácticamente idéntica (un 98%) a la humana y es fácil de explorar clínicamente. Además, algunos ejemplares desarrollan placas amiloides en sus cerebros y un síndrome de disfunción cognitiva de características similares a las de la enfermedad de Alzheimer.

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MODELOS EXPERIMENTALES DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER Resumen. Introducción y desarrollo. Hasta ahora, los ratones transgénicos portadores del gen humano mutado de la APP (proteína precursora del amiloide beta) han sido los mejores modelos animales establecidos en los laboratorios para investigar en la enfermedad de Alzheimer. Estos ratones transgénicos contienen, además del transgén humano introducido en su genoma, el propio gen endógeno, lo que interfiere –con toda seguridad– en la biología celular de la maquinaria utilizada para procesar la APP y generar el péptido amiloide beta. Conclusión. Mediante análisis genéticos e inmunoquímicos, nuestro laboratorio ha descubierto que en la naturaleza existen especies animales, en particular el embrión de pollo o el perro, que pueden ser mejores modelos que los ratones transgénicos para el estudio de ciertos aspectos de la enfermedad. Estos modelos naturales pueden servir para el ensayo de fármacos que regulen la producción de amiloide beta, principal molécula implicada en la enfermedad de Alzheimer, y de nuevas estrategias terapéuticas frente a tan terrible enfermedad. [REV NEUROL 2006; 42: 297-301] Palabras clave. Alzheimer. Embrión de pollo. Modelos animales. Perro. Proteína amiloide.

MODELOS EXPERIMENTAIS DA DOENÇA DE ALZHEIMER Resumo. Introdução e desenvolvimento. Até ao momento, os ratos transgénicos portadores do gene humano mutado da APP (proteína precursora do amilóide beta) têm sido os melhores modelos animais estabelecidos nos laboratórios para investigar a doença de Alzheimer. Estes ratos transgénicos contêm, para além do transgene humano introduzido no seu genoma, o próprio gene endógeno, o que interfere –com toda a segurança– na biologia celular da maquinaria utilizada para processar a APP e gerar o péptido amilóide beta. Conclusão. Mediante análises genéticas e imunoquímicas, o nosso laboratório descobriu que na natureza existem espécies animais, em particular o embrião do frango ou o do cão, que podem ser melhores modelos que os ratos transgénicos para o estudo de certos aspectos da doença. Estes modelos naturais podem servir para o ensaio de fármacos que regulem a produção de amilóide beta, a principal molécula implicada na doença de Alzheimer, e de novas estratégias terapêuticas face a tão terrível doença. [REV NEUROL 2006; 42: 297-301] Palavras chave. Alzheimer. Cão. Embrião de frango. Modelos animais. Proteína amilóide.

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