PRÓLOGO La enfermedad diarreica es reconocida como un problema grave para la salud pública, por su alta morbi-mortalidad a nivel mundial, especialmente en los países en vías de desarrollo. Teniendo en cuenta que del 15 al 70% del total de casos de diarrea son causados por alimentos, incluyendo el agua, que sufrieron contaminación microbiológica, es necesario fortalecer la Vigilancia Integrada de las Enfermedades Transmitidas por Alimentos. El objetivo propuesto en la edición del presente Manual de Procedimientos “Detección de patógenos asociados a Enfermedad Diarreica Aguda, incluyendo Vibrio cholerae” ha sido poner a disposición de los microbiólogos los algoritmos, las técnicas, y los procedimientos diagnósticos para la detección y caracterización fenotípica y genotípica de los principales agentes bacterianos asociados a diarrea aguda. El Manual de Procedimientos contiene una revisión y actualización de los factores de virulencia, los mecanismos de patogenicidad, la epidemiología, el diagnóstico microbiológico, y el tratamiento de Salmonella spp., Shigella spp., Vibrio cholerae, Campylobacter spp. y Escherichia coli diarreigénico, incluyendo los cinco patotipos: E. coli enteropatógeno (EPEC), E. coli enterotoxigénico (ETEC), E. coli enteroinvasivo (EIEC), E. coli enteroagregativo (EAEC) y E. coli productor de toxina Shiga (STEC). Los algoritmos diagnósticos presentados han sido desarrollados y estandarizados por los Laboratorios de Referencia Nacional de Argentina, y algunas de las técnicas empleadas han sido validadas en etapa intralaboratorio. También contiene un capítulo destinado a la detección de V. cholerae en muestras ambientales. Esperamos que el presente Manual de Procedimientos constituya una herramienta valiosa para todos los laboratorios microbiológicos del país y de la región.

Marta Rivas INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” Secretaría de Políticas, Regulación e Institutos de Salud Ministerio de Salud

ÍNDICE INTRODUCCIÓN GENERAL

4

1.1.- DEFINICIÓN. TIPOS DE DIARREA

7

1.2.- EPIDEMIOLOGÍA DE LA ENFERMEDAD

8

1.3.- PATOGENIA

11

1.4.- SITUACIÓN ACTUAL DEL DIAGNÓSTICO

14

1.5.- PROCEDIMIENTOS DIAGNÓSTICOS

15

REFERENCIAS

15

DIAGNÓSTICO Y CARACTERIZACIÓN DE Salmonella spp. CAPÍTULO I - INTRODUCCIÓN

16

CAPÍTULO II - AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE Salmonella spp.

20

1.-ESPECÍMENES

20

2.-PROCESAMIENTO

21

CAPÍTULO III - MEDIOS DE CULTIVO Y SOLUCIONES

68

CAPÍTULO IV - PLANILLAS DE RESULTADOS

75

DIAGNOSTICO Y CARACTERIZACIÓN DE Shigella spp. CAPÍTULO I - INTRODUCCIÓN

83

CAPÍTULO II - AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE Shigella spp.

85

1.-ESPECÍMENES

85

2.-PROCESAMIENTO

85

CAPÍTULO III -MEDIOS DE CULTIVO Y PRUEBAS BIOQUÍMICAS

112

CAPÍTULO V - PLANILLAS DE RESULTADOS

116

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE Campylobacter spp. CAPÍTULO I - ANTECEDENTES

120

CAPÍTULO II - AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE Campylobacter spp

126

CAPÍTULO III - ANEXOS

136

AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN, CARACTERIZACIÓN Y PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A ANTIMICROBIANOS DE Vibrio cholerae spp. CAPÍTULO I - AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN, CARACTERIZACIÓN DE Vibrio cholerae spp.

163

CAPÍTULO II - DETERMINACIÓN DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS DE Vibrio cholerae spp.

207

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE Escherichia coli spp. PARTE I: AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE Escherichia coli DIARREIGÉNICO CAPÍTULO I - INTRODUCCIÓN

223

1.1.-Escherichia coli ENTEROPATÓGENO (EPEC)

223

1.2.- Escherichia coli ENTEROTOXIGÉNICO (ETEC)

235

1.3.- Escherichia coli ENTEROINVASIVO (EIEC)

241

1.4.- Escherichia coli ENTEROAGREGATIVO (EAEC)

245

1.5.- Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC)

253

CAPÍTULO II - AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE Escherichia coli DIARREICO

254

2.1.-ESPECÍMENES

254

2.2.-PROCESAMIENTO

254

CAPÍTULO III - DETECCION DE FACTORES DE VIRULENCIA

275

CAPÍTULO IV - MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

306

PARTE II: AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE Escherichia coli PRODUCTOR DE TOXINA SHIGA CAPÍTULO I - INTRODUCCIÓN

340

CAPÍTULO II - AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE Escherichia coli O157 y Escherichia coli NO-O157

370

2.1.-ESPECÍMENES

370

2.2.-PROCESAMIENTO

370

CAPÍTULO III - DETECCION DE FACTORES DE VIRULENCIA

413

CAPÍTULO IV - TECNICAS DIAGNOSTICAS EN CELULAS VERO

444

CAPÍTULO V - MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

460

MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD

486

COLABORADORES Caffer, María Inés Servicio Enterobacterias Departamento Bacteriología INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” Buenos Aires – Argentina E-mail: [email protected]

Corso, Alejandra Servicio Antimicrobianos Departamento Bacteriología INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” Buenos Aires – Argentina E-mail: [email protected]

D`Astek Beatriz Servicio Fisiopatogenia Departamento Bacteriología INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” Buenos Aires – Argentina E-mail: [email protected]

Farace, María Isabel Servicio Bacteriología Sanitaria Departamento Bacteriología INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” Buenos Aires – Argentina E-mail: [email protected]

Guerreiro, Leonor Servicio Antimicrobianos Departamento Bacteriología INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” Buenos Aires – Argentina E-mail: [email protected]

Hoffer, Alicia Servicio Bacteriología Sanitaria Departamento Bacteriología INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” Buenos Aires – Argentina E-mail: [email protected]

Lucero, Celeste Servicio Antimicrobianos Departamento Bacteriología INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” Buenos Aires – Argentina E-mail: [email protected]

Miliwebsky, Elizabeth Servicio Fisiopatogenia Departamento Bacteriología INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” Buenos Aires – Argentina E-mail: [email protected]

Moroni, Mirian Servicio Enterobacterias Departamento Bacteriología INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” Buenos Aires – Argentina E-mail: [email protected]

Pichel, Mariana Servicio Enterobacterias Departamento Bacteriología INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” Buenos Aires – Argentina E-mail: [email protected]

Rivas, Marta Servicio Fisiopatogenia Departamento Bacteriología INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” Buenos Aires – Argentina E-mail: [email protected]

Viñas, María Rosa Servicio Enterobacterias Departamento Bacteriología INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” Buenos Aires – Argentina E-mail: [email protected]

INTRODUCCIÓN GENERAL A nivel mundial, la enfermedad diarreica constituye un problema grave para la salud pública de infantes y niños, con altas tasas de morbilidad y mortalidad, especialmente en países en vías de desarrollo. Hay ciertos factores que pueden considerarse de riesgo para adquirir una diarrea, tanto inherentes a condiciones del sujeto como a condiciones socio-sanitarias. También existen factores protectores. Entre los factores de riesgo se pueden señalar condiciones socio-económicas como: a) hacinamiento; b) higiene deficiente; c) no acceso al agua potable; d) falta de posibilidades de refrigeración de los alimentos; e) sistema de eliminación de excretas ineficiente; f) falta de acceso a la información; g) dificultad de acceso a los servicios de salud; y factores del huésped como: a) edad menor a un año; b) falta de lactancia materna exclusiva durante los primeros 6 meses de vida; c) uso de biberones; d) desnutrición; e) inmunosupresión; f) factores de riesgo social como analfabetismo y desocupación. Dichos factores favorecen los procesos infecciosos que desencadenarán el cuadro clínico, muchas veces con consecuencias letales. Entre los factores protectores se encuentran: a) lactancia materna exclusiva durante un mínimo de 6 meses; b) alimentación complementaria adecuada a partir de los 6 meses; c) medidas higiénicas adecuadas. De acuerdo a datos de la Organización Mundial de la Salud (OMS), se estima que en el año 2000 se produjeron 1.500 millones de episodios de diarrea aguda que causaron entre 1,4 y 2,5 millones de muertes. Entre otras consecuencias de la diarrea infantil, en los países con recursos limitados se incluyen, desnutrición, disminución del crecimiento y alteración del desarrollo cognitivo. En los países industrializados, son relativamente pocos los pacientes que mueren por diarrea, pero sigue siendo una causa importante de morbilidad y costos en salud. En los países pobres, se ha estimado que cada niño sufre una media de tres episodios de diarrea por año. Dependiendo de los países, se considera que del 15 al 70% de esos casos son causados por alimentos, incluyendo el agua, que sufrieron contaminación microbiológica. Tanto la incidencia como el riesgo de mortalidad por patología diarreica son más frecuentes en los niños menores de cinco años, sobre todo entre los seis meses y los dos años de edad. Los lactantes y niños menores desarrollan deshidratación más rápidamente, por ello, aproximadamente el 85% de las muertes por diarrea ocurren en niños menores de un año. En los niños mayores y en los adultos, la mayoría de las infecciones entéricas son asintomáticas por el desarrollo de inmunidad activa que evita que algunas infecciones intestinales se manifiesten clínicamente. Esta portación asintomática puede durar varios días o semanas, evento de importancia epidemiológica, ya que esos pacientes eliminan en sus heces virus,

bacterias o quistes de protozoos, con la consiguiente diseminación de los mismos sino se toman las precauciones higiénicas adecuadas. A comienzos de los 80s, se realizaron enormes esfuerzos a nivel mundial para lograr una reducción sustancial de la mortalidad asociada a diarrea. Estos esfuerzos se basaron en el reconocimiento que la rehidratación oral temprana en la fase aguda juega un importante papel en la reducción de la evolución fatal de la enfermedad, implementándose la misma a través de programas nacionales de control de las diarreas. Las infecciones entéricas, tanto las de etiología comprobada como las enteritis indiferenciadas, tienen mecanismos de transmisión comunes: a) Transmisión directa: por contacto persona a persona por la ruta fecal-oral. b) Transmisión indirecta: a través de agua o alimentos contaminados. Las diarreas de origen infeccioso pueden ser de etiología bacteriana, viral o parasitaria, siendo frecuentes las asociaciones de dos o más agentes. Entre los agentes bacterianos se puede señalar a Salmonella spp., Shigella spp., Vibrio cholerae, Yersinia spp., Campylobacter spp. Clostridium difficile y Escherichia coli diarreigénico, entre otros. Con el nombre de Escherichia coli diarreigénico (DEC) se denomina a un grupo heterogéneo de cepas que poseen distintos factores de virulencia y distinta interacción con la mucosa intestinal del hospedador, causan diferentes síndromes diarreicos y tienen distinta epidemiología. Las cepas DEC son causa importante de morbi-mortalidad en los países en vías de desarrollo. Hasta el presente se reconocen cinco categorías o patotipos: E. coli enteropatógeno (EPEC), E. coli enterotoxigénico (ETEC), E. coli enteroinvasivo (EIEC), E. coli enteroagregativo (EAEC) y E. coli productor de toxina Shiga (STEC). Ha sido propuesta una sexta categoría, llamada E. coli de adherencia difusa (DAEC), aunque la capacidad patogénica y la implicancia epidemiológica de estas cepas todavía no está lo suficientemente dilucidada.

1.1.- DEFINICIÓN. TIPOS DE DIARREA La diarrea se define como un síndrome clínico de etiología diversa producido por una alteración en el transporte y absorción de electrolitos y agua, que genera el incremento en el número de deposiciones diarias y la alteración en la consistencia de las heces, acompañado de otros síntomas como vómitos, náuseas, dolor abdominal o fiebre. Su duración es variable, aunque generalmente está limitada a una semana. Las enfermedades diarreicas pueden dividirse en tres cuadros clínicos:

1. Diarrea aguda acuosa o secretora: el microorganismo después de colonizar, se multiplica en el lumen intestinal, fundamentalmente a nivel de intestino delgado superior. En ese sitio, por secreción de una enterotoxina citotóxica o bien por reducción de la superficie absortiva, se produce una alteración del flujo bidireccional de agua y electrolitos dando por resultado una diarrea acuosa, con leucocitos escasos o ausentes (0 a 5 por campo) en el extendido de materia fecal. El principal riesgo es la deshidratación. Ejemplos: V. cholerae, E. coli enterotoxigénico (ETEC), rotavirus, virus de tipo Norwalk, Giardia lamblia, Cryptosporidium spp. Los cambios en la flora intestinal provocados por antibióticos pueden ocasionar diarrea aguda por proliferación de Clostridium difficile y producción de su toxina. 2. Diarrea aguda sanguinolenta (disentería): el microorganismo, después de adherirse a nivel del intestino delgado distal o de colon, puede penetrar la línea epitelial del intestino. Su multiplicación dentro de la mucosa o la liberación de una citotoxina, causa la destrucción parcial o total de la célula. Se produce una diarrea disentérica con sangre, pus y una severa respuesta inflamatoria con abundantes leucocitos polimorfonucleares detectables en la examinación microscópica de las heces (más de 20 por campo). Los principales riesgos son el daño intestinal, septicemia y malnutrición. Pueden presentarse otras complicaciones como la deshidratación. Ejemplos: Salmonella spp., Shigella spp., Campylobacter spp., Clostridium difficile y E. coli enteroinvasivo (EIEC), y E. coli productor de toxina Shiga (STEC), entre otros. 3. Diarrea persistente o prolongada: persiste más de 14 días, El principal riesgo que entraña es la malnutrición y la infección extraintestinal grave, también puede presentarse deshidratación. Ejemplo: E. coli enteroagregativo (EAEC).

1.2.- EPIDEMIOLOGÍA DE LA ENFERMEDAD En Argentina, la notificación de los casos de diarrea aguda es obligatoria al Sistema Nacional de Vigilancia de la Salud (SNVS). La notificación clínica se realiza a través del módulo C2 y los principales patógenos bacterianos identificados son informados a través del módulo SIVILA (Sistema de Vigilancia de Laboratorio). En 2010, fueron notificados un total de 1.202.962 casos con una tasa de 296,89 casos por 10.000 habitantes. En los últimos 5 años se mantuvo la misma tendencia regional en cuanto a las tasas de notificación de diarreas (Figura 1).

Figura 1. Tasas de diarreas por 10000 habitantes por región geográfica. Años 2005 a 2010. Tasas por 10.000 hab de diarreas por región. Años 2005 a 2010. Argentina 800,00 700,00

NOA

Tasas

600,00 500,00

Sur

400,00

Cuyo

300,00

NEA

200,00

Centro

100,00 0,00 2005

2006

2007

2008

2009

2010

Años

En el año 2010, se observó una gran diferencia en las tasas de notificación de las distintas regiones, donde regiones como el NOA (615,67/10.000 habitantes) y el Sur (507,24/10.000 habitantes) tuvieron aproximadamente el doble de la tasa de regiones como el Centro (212,63/10.000 habitantes) y Cuyo (392,79/10.000 habitantes). Las tasas acumuladas más elevadas correspondieron a las provincias de Salta, Jujuy, Neuquén y Santa Cruz; las primeras dos triplicaron la tasa nacional y las otras dos la duplicaron (Figura 2).

Figura 2. Tasas de diarrea por provincia. Argentina. 2010

Durante el año 2010 se verificaron variaciones importantes en los diferentes momentos del año respecto de la mediana de los últimos 5 años. En el corredor endémico para el total país del año 2010 (Figura 3) se observó que, durante las primeras 13 semanas epidemiológicas

(SE) del año, la notificación se ubicó en zona de brote, luego se mantuvo en zona de seguridad, ascendiendo a zona de alerta entre las SE 30 y 34. Luego ingresó a la zona de seguridad hasta SE 45, y a partir de ahí a zona de éxito.

Figura 3. Corredor endémico semanal de diarreas. Argentina. 2010 Corredor Endémico Semanal de 2010 Diarreas . Argentina Históricos de 5 años: 2005 a 2009 Fuente: Area Vigilancia - SNVS- modulo C2

50000

45000

40000

35000

Casos

30000

25000

20000

15000

10000

5000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52

Semanas Exito

Seguridad

Alerta

Casos Nuevos

Los niños menores de 5 años constituyeron el grupo más vulnerable con 536.586 casos notificados y una tasa de 1569,12 casos por 10.000 habitantes (MSAL-Dirección de Epidemiología, 2011). El número de muertes atribuidas a diarrea para ese grupo etáreo fue de 99, en el año 2008 (MSAL-Dirección de Estadísticas e Información en Salud, 2010). La vigilancia basada en laboratorio se realiza a través de la Red Nacional de Diarreas y Patógenos Bacterianos de Transmisión Alimentaria con notificación al SIVILA. Dicha Red tiene como misión fortalecer el sistema de vigilancia de las diarreas y de los patógenos de transmisión alimentaria a través de la organización de los laboratorios de las áreas humana y de alimentos, integrados a un sistema multidisciplinario y trabajando bajo normas de gestión de calidad reconocidas, de manera de obtener un diagnóstico microbiológico confiable, oportuno y reproducible para ser utilizado en el mejoramiento de la atención del paciente y en la prevención de brotes. Está integrada por los Laboratorios de Referencia Nacional que funcionan en el Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas – ANLIS “Dr. Carlos G.

Malbrán”, y 544 laboratorios de distintos niveles de complejidad que integran las Redes Jurisdiccionales. Del total de pacientes estudiados por coprocultivo durante el año 2010 (n=23747), en el 18,13% se pudieron identificar microorganismos bacterianos como agentes etiológicos de la enfermedad. Los agentes identificados con mayor frecuencia fueron Shigella spp. (n=2728), con predominio de S. flexneri (n=1688), y E. coli (n=671) (Figura 4). Durante este período no se registró ningún caso de V. cholerae O1.

Figura 4. Casos positivos y porcentaje de positividad de diarreas bacterianas por agente etiológico según SE. Total País. Año 2010. 2010 - Total país. Diarreas bacterianas Agentes identificados por SE. Nestudiadas=23747 npositivas=4305 100% 90% 80% 70%

150

60% 50% 100

40% 30%

50

20% 10%

0

0% 1

3

5

7

9

11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51

Semana Epidemiológica Shigella Bacillus grupo Cereus

Salmonella spp Total Vibrio cholerae

E coli % Positivos bacterianas

Campylobacter

1.3. PATOGENIA La diarrea aguda infecciosa se produce cuando un microorganismo o en algunos casos sus toxinas preformadas, ingresan al organismos del hospedador, resisten los mecanismos de defensa y alcanzan el tracto gastrointestinal. Entre los mecanismos de defensa del hospedador se pueden señalar: 1. en boca: actividad antimicrobiana de la saliva. 2. en estómago: pH ácido.

% Positivos

Número de Muestras Positivas

200

3. en intestino: peristaltismo, secreción de mucus, producción de sustancias antimicrobianas (lactoferrinas, IgA secretoras, etc.), competencia con la flora normal.

Después que el patógeno entérico ha alcanzado la superficie de la mucosa, existen distintos mecanismos para establecer la diarrea, dependiendo de la capacidad intrínseca del microorganismo de colonizar, de invadir o de la naturaleza de las toxinas que produce. Ciertas bacterias colonizan y causan una infección extracelular, secretando enzimas y/o toxinas de acción local o sistémica. Otras bacterias pueden invadir el epitelio, multiplicarse dentro de la célula, provocar su muerte y causar una respuesta inflamatoria. También pueden pasar la barrera epitelial y establecerse en los macrófagos a nivel de mucosas, lo que representa el punto inicial de su diseminación sistémica. Los puntos estratégicos de la infección bacteriana se inician con la asociación a la mucosa intestinal, la cual consta de dos etapas: 1. Quimiotactismo: proceso por el cual la bacteria se une a proteínas de superficie que pertenecen a la matriz de la célula epitelial. Esta propiedad le permite a la bacteria establecerse en las proximidades de la célula del hospedador y algunas veces colonizar tejidos subyacentes como la membrana basal y estructuras conectivas. 2. Adherencia: interacción específica entre un ligando expresado por la bacteria (adhesina) y un receptor de superficie de la célula epitelial. La adherencia es característica de las bacterias gram-negativas, que expresan en su superficie estructuras conocidas como pili o fimbrias, o componentes de la superficie bacteriana. Las adhesinas son generalmente proteínas, capaces de reconocer residuos de azúcares en glicoproteínas o glicolípidos. El proceso de adherencia, a pesar de ser altamente eficiente, no media la internalización del patógeno a la célula del hospedador, pero afecta significativamente la respuesta inflamatoria. Esto es importante, ya que la adherencia per se no solo permite la colonización, sino que representa una etapa muy temprana de señalamiento que facilita la respuesta inflamatoria, componente principal en la enfermedad infecciosa.

Otros factores que intervienen en la patogenia son: Toxinas: pueden ser citotóxicas o citotóxicas. Las toxinas citotónicas inducen la secreción de agua y electrolitos, sin dañar la mucosa epitelial. Las toxinas citotóxicas producen daño y muerte celular.

Invasividad: está mediada por proteínas de superficie. Le permite a la bacteria invadir y multiplicarse en la célula intestinal provocando su destrucción. El epitelio intestinal es una barrera eficiente que evita la invasión bacteriana por mecanismos tales como el peristaltismo, secreción de mucus, producción de sustancias antibacterianas, las microvellosidades, estructura altamente diferenciada en el polo apical del enterocito, y las uniones estrechas entre células que sellan eficientemente la vía paracelular. En caso de falla de estas estructuras, los macrófagos ubicados en el polo basal de la capa epitelial pueden fagocitar y destruir a las bacterias que traslocan la barrera epitelial. Sin embargo, hay ciertas estructuras especializadas en el epitelio intestinal que pueden permitir la entrada de los patógenos bacterianos. Las placas de Peyer del ileón y los folículos linfoides del colon y recto son estructuras linfoides intramucosales, cubiertas por parte del epitelio intestinal, que contienen a las células M. Estas células especializadas en translocar antígenos que están presentes en reservorios formados dentro de estas células M. Los folículos adyacentes son un reservorio de células inmunocompetentes a nivel de las cuales se ejerce la inmunoprotección en mucosas, particularmente por inducción de linfocitos productores de IgA que poseen plasmocitos secretores de IgA (sIgA). Ciertos patógenos invasivos (Salmonella spp., Shigella spp., Yersinia spp.) pueden usar a las células M para cruzar la barrera epitelial. Sin embargo, algunas especies bacterianas son naturalmente invasivas per se, pudiendo penetrar, sobrevivir, y multiplicarse dentro de la célula eucariota provocándole su muerte. La presencia de uno o más de los factores señalados en los puntos anteriores es esencial para el establecimiento de la diarrea. Los microorganismos, después de adherirse a la mucosa intestinal, pueden provocar las diarreas por un mecanismo particular, en base al cual se los puede clasificar en cinco categorías: 1. Por adherencia a la mucosa intestinal y producción de una enterotoxina: la bacteria después de adherirse a la mucosa a nivel del intestino delgado superior, produce una enterotoxina que induce la secreción neta de agua y electrolitos. No hay destrucción de las microvellosidades, ni invasión, ni lesiones histopatológicas reconocibles. Ejemplos: V. cholerae, E. coli enterotoxigénico (ETEC). 2. Por adherencia a la mucosa intestinal y destrucción de las microvellosidades: la bacteria después de adherirse produce una lesión hispotatológica característica, con destrucción de las microvellosidades y reducción de la superficie absortiva provocando secreción neta, sin invasión. Ejemplos: E. coli enteropatógeno (EPEC), E. coli productor de toxina Shiga (STEC).

3. Por invasión de la mucosa y multiplicación intraepitelial: la bacteria invade el enterocito a nivel del ileón o colon, se multiplica y produce la disfunción o muerte celular. Algunos microorganismos permanecen localizados dentro de la célula epitelial, mientras que otros pasan a lámina propia pero sin diseminación. Es raro que se produzca adenitis mesentérica o bacteriemia. Ejemplos: Shigella spp., E. coli enteroinvasivo (EIEC). 4. Por translocación a nivel de mucosa y proliferación en lámina propia y nódulos mesentéricos: la bacteria invade el enterocito y alcanza la lámina propia en vesículas pinocíticas induciendo una respuesta quimiotáctica. La infección sistémica y la bacteriemia son raras, salvo en el huésped inmunocomprometido. Ejemplos: Salmonella spp., Campylobacter spp., Yersinia enterocolitica. 5. Por translocación e infección generalizada: Es un mecanismo semejante al anterior, la bacteria después de inducir una respuesta quimiotáctica es fagocitada por los macrófagos y drenada a los nódulos linfáticos mesentéricos, provocando bacteriemia al alcanzar el torrente sanguíneo. Ejemplos: Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A y B.

1.4.- SITUACIÓN ACTUAL DEL DIAGNÓSTICO En Argentina, las instituciones hospitalarias siguen diferentes protocolos para la indicación de análisis microbiológico de materia fecal (coprocultivo) ante un caso de diarrea. Sin embargo, todas

ellas

realizan

el

coprocultivo

de

las

diarreas

sanguinolentas,

siguiendo

fundamentalmente el criterio médico y las condiciones especiales del paciente (edad, existencia de enfermedad de base, desnutrición,

inmunosupresión, etc.). El diagnóstico

microbiológico a nivel de género/especie de los patógenos más frecuentemente asociados a diarrea, como Salmonella spp., Shigella spp. y Campylobacter spp. se realiza mediante técnicas de cultivo y métodos fenotípicos, utilizando pruebas bioquímicas convencionales y ensayos de seroagrupamiento o serotipificación. Los laboratorios de diagnóstico clínico a nivel local están capacitados para realizar dicha identificación. Laboratorios de mayor complejidad, a nivel de referencia provincial y nacional complementan la caracterización a través de métodos moleculares de los factores de virulencia. Sin embargo, es importante destacar que solo en el 20% aproximadamente, de los casos de diarreas bacterianas se identifican patógenos usando las técnicas microbiológicas convencionales. Este bajo porcentaje de positividad está indicando que un grupo importante de patógenos bacterianos quedan sin identificar debido a la carencia de reactivos que permitan alcanzar un diagnóstico

certero y oportuno que garantice un manejo clínico adecuado del paciente y la investigación epidemiológica correspondiente. Se debe destacar que el diagnóstico de las diferentes categorías de E. coli diarreigénico no puede ser realizado por métodos fenotípicos convencionales, ya que presentan características bioquímicas indistinguibles de cepas de E. coli comensales. Por ello, es necesario disponer de un procedimiento diagnóstico específico dirigido a la detección de los factores de virulencia utilizando métodos moleculares o métodos de inmunodiagnóstico.

1.5.- PROCEDIMIENTOS DIAGNÓSTICOS En las siguientes secciones se presentan los algoritmos y las técnicas diagnósticas para el aislamiento, detección y caracterización feno-genotípica de Salmonella spp., Shigella spp., Campylobacter spp., V. cholerae y E. coli diarreigénicos, patógenos asociados a enfermedad diarreica aguda.

REFERENCIAS 1. Ministerio de Salud de la Nación. Dirección de Epidemiología-Área de Vigilancia. Informe Vigilancia de Diarreas – 2010/2011. Marzo de 2011. 2. Organización Panamericana de la Salud – Organización Mundial de la Salud. El Control de las Enfermedades Transmisibles. 18º edición. Washington DC, EE.UU., 2005. 3. Asociación

Argentina

de

Microbiología.

Gastrointestinales, incluyendo Hepatitis. 1998.

Microbiología

Clínica:

Infecciones

DIAGNOSTICO Y CARACTERIZACIÓN DE Salmonella spp. CAPÍTULO I - INTRODUCCIÓN El género Salmonella pertenece a la tribu Salmonelleae, de la familia Enterobacteriaceae. Los miembros del género Salmonella son bacilos gram-negativos, de 0,7-1,5 x 2,0-5µm, generalmente móviles por flagelos perítricos (excepto S. Gallinarum), anaerobios facultativos, no esporulados. El género Salmonella fue objeto de sucesivas modificaciones, a través de los años, en lo que respecta a su nomenclatura y taxonomía. Sin embargo, todavía siguen vigentes las ideas desarrolladas por P.R. Edwards y H.W. Ewing, en la década del 40, cuando definieron e identificaron las primeras cepas del género Salmonella y de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae. Estudios del DNA mediante técnicas de hibridación mostraron que el género Salmonella está constituído por 2 especies: Salmonella enterica y Salmonella bongori.

Salmonella

enterica está compuesta por 6 subespecies: Salmonella enterica subespecie enterica, Salmonella enterica subespecie salamae, Salmonella enterica subespecie arizonae, Salmonella enterica subespcie diarizonae, Salmonella enterica subespespecie houtenae y Salmonella enterica subespecie indica. A su vez las subespecies de Salmonella enterica y la especie Salmonella bongori se dividen en más de 2400 serovariedades, que están definidas en función de diferentes asociaciones de factores antigénicos somáticos O y flagelares H. La mayoría de las serovariedades aisladas del hombre y de los animales de sangre caliente pertenecen a la subespecie enterica (subespecie I) y llevan un nombre por lo general relacionado con el lugar geográfico donde se la aisló por primera vez. Como las serovariedades no tienen nivel taxonómico de especie, sus nombres no siguen las reglas del “International Code of Nomenclature of Bacteria”, de manera que sus nombres se deben escribir en letras romanas (no itálicas) y con mayúscula; por ejemplo el nombre completo de Salmonella Typhimurium es Salmonella enterica subesp. enterica serovariedad Typhimurium. Como este nombre es muy largo, a los fines prácticos se usa directamente Salmonella Typhimurium Las serovariedades pertenecientes a las subespecies restantes y a Salmonella bongori, de baja incidencia en patología humana o animal, se designan con el nombre de la subespecie,

seguido de la fórmula antigénica, por ej: Salmonella subesp. IV 50: b : - (Salmonella enterica subesp. houtenae 50:b : -) Los nombres de todas las serovariedades están contenidos en el Esquema de Kauffmann-White, publicado por el “Centro Colaborador de la OMS de Referencia e Investigación de Salmonella”, del Instituto Pasteur de París (1). Los miembros del género Salmonella están ampliamente distribuidos en la naturaleza, se los encuentra como comensales y como patógenos en el tracto gastrointestinal de mamíferos domésticos y salvajes, reptiles, aves e insectos,

causando un amplio espectro de

enfermedades en el hombre y los animales. Los miembros del género se pueden clasificar en tres grupos: a) Los que no tienen preferencia por algún huésped en especial, por lo que infectan tanto al hombre como a los animales. En este grupo se encuentran la mayoría de las serovariedades responsables de las salmonelosis. b) Los que infectan sólo al hombre: Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A y Salmonella Paratyphi C c) Los que están adaptados a un huésped animal: S. Abortusovis, a los ovinos; S. Abortusequi, a los equinos y S. Gallinarum, a las aves La salmonelosis es una zoonosis de distribución mundial. La tasa de incidencia de la infección es mayor en los lactantes y en niños de corta edad. Epidemiologicamente, las infecciones por Salmonella pueden causar pequeños brotes en la población en general, sin embargo el 60 - 80% de los casos son esporádicos; a veces se producen grandes brotes en hospitales, jardines maternales, geriátricos, restaurantes. Es una enfermedad fundamentalmente de origen alimentario, la fuente más frecuente de infección son los alimentos contaminados, incluido agua. También puede ocurrir la transmisión de persona a persona. A pesar de todos los controles que se han puesto en práctica, las infecciones por Salmonella debidas al consumo de alimentos contaminados continúa siendo un problema serio con millones de casos que ocurren anualmente en todo el mundo, provocando grandes pérdidas económicas. En el 2003, se estimó que solamente en los Estados Unidos, el costo de las salmonelosis producidas por alimentos contaminados llegaba a la cifra de 3.000.000.000 dólares. La vigilancia de Salmonella spp. en todas las etapas de la cadena de procesamiento de los alimentos constituye un elemento importante en la investigación de la epidemiología de la

salmonelosis transmitida por alimentos y en el desarrollo e implementación de estrategias eficientes de control de la misma. En programas de monitoreo y control es esencial contar con métodos de laboratorio eficientes para el aislamiento, identificación y tipificación de Salmonella spp. Se debe destacar que hay muchos procedimientos distintos para el aislamiento de Salmonella. El método ideal debe tener una alta sensibilidad y especificidad, y ser al mismo tiempo simple, rápido y económico. Ningún método cumple con todos criterios y ninguno es óptimo para todas las condiciones. Por lo tanto es aconsejable consultar la literatura antes de elegir un método para un determinado propósito y es recomendable la comparación frecuente de los métodos de cada laboratorio con los nuevos métodos que surjan. Los criterios para la identificación bioquímica de Salmonella spp. están ampliamente descritos, sin embargo estas pruebas dependen de la expresión fenotípica de las características analizadas y pueden verse afectadas por variaciones en los medios de cultivo y en las condiciones de incubación. Como una alternativa se están introduciendo cada vez más los métodos moleculares; que permiten un diagnóstico más rápido y pueden ser más simples de realizar, pero tienen la desventaja que son caros. El sistema de serotipificación de Salmonella spp. es probablemente el mejor sistema de tipificación fenotípica bacteriano. Tiene un alto poder discriminatorio y provee información con significado epidemiológico, desde el punto de vista de la vigilancia basada en laboratorio. La disponibilidad y el costo de antisueros de alta calidad es un problema en algunos países y regiones. La subtipificación molecular da información adicional, de mayor discriminación sin embargo no es un sustituto de la serotipificación. Los microorganismos del género Salmonellae son bacilos gram-negativos (0.7 a 1.5 x 5 µm), no fermentadores de lactosa. Son móviles por medio de flagelos peritricos, con la excepción de Salmonella Pullorum y Salmonella Gallinarum. Fermentan glucosa con producción de ácido y gas (excepto S. Typhi). También fermentan L-arabinosa, maltosa, Dmanitol, D-manosa, L-ramnosa, D-sorbitol, trehalosa, D-xilosa y D-dulcita. Son oxidasa negativo, catalasa positivo, indol y Voges-Proskauer (VP) negativo, rojo de metilo y citrato de Simmons positivo, urea negativo y producen SH2. Los procedimientos siguientes servirán como guía para realizar los pasos necesarios para aislar adecuadamente Salmonella spp. de heces, efectuar la identificación bioquímica de Salmonella spp. y serotipificar los aislamientos utilizando antisueros somáticos y flagelares adecuados.

Recolección y transporte de muestras •

Aislamiento de Salmonella spp. de heces.

•

Identificación bioquímica de Salmonella spp.

•

Serotipificación de Salmonella spp.

BIOSEGURIDAD Los procedimientos de laboratorio se realizan de acuerdo con las recomendaciones establecidas en “Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories”, 4 th. CDC/NIH (Ver capítulo final: Medidas de Bioseguridad)

CAPÍTULO II - AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE Salmonella spp. 1.- ESPECÍMENES El diagnóstico de Salmonella spp. se puede realizar a partir de muestras de materia fecal y en caso de infecciones extra-intestinales, a partir de fluidos como sangre, orina, bilis y material de abscesos inflamatorios.

a) Materia fecal: La muestra debe obtenerse en el período agudo de la enfermedad, antes de iniciar el tratamiento con antimicrobianos. Con un hisopo estéril, se recoge una pequeña cantidad de una evacuación espontánea reciente, seleccionando las partes mucosas o sanguinolentas. En caso de no poder obtener esta muestra, se hace un hisopado rectal. Las muestras que no se pueden procesar dentro de las dos horas, se deben colocar en medio de transporte. Como medio de transporte se usa Cary – Blair, que tiene la ventaja de ser estable hasta 18 meses después de su preparación, cuando las condiciones de almacenamiento son correctas. En este medio de transporte se puede conservar la muestra hasta 5 días, siempre en refrigeración.

b) Sangre: Para casos sospechosos de fiebre tifoidea o paratifoidea: la muestra se toma en el momento del pico de fiebre. Se siembran 10 ml de sangre en un frasco de hemocultivo de 100 ml (relación 1:10). Se incuba a 35 - 37ºC, durante 7 días, haciendo un control (en medio de agar sangre) a ciegas a las 8 horas de incubación y controles periódicos de acuerdo a la turbidez observada. El hemocultivo reviste un interés especial en el caso de fiebre tifoidea y paratifoidea; pero no es constantemente positivo. Los porcentajes de positividad, en ausencia de tratamiento antibiótico, son: 90% durante la primera semana de evolución, 75% en la segunda, 40% en la tercera y 10% en la cuarta. Los hemocultivos son negativos en los síndromes de infecciones transmitidas por alimentos por serovariedades diferentes a S. Typhi y S. Paratyphi, como S. Typhimurium ó S. Enteritidis,

sin

embargo

estas

serovariedades

pueden

causar septicemia en

los

inmunocomprometidos.

c) Material de abscesos y orina: El pus y la orina se recogen en recipientes estériles y una alícuota se siembra directamente en los medios de cultivo.

2.- PROCESAMIENTO 2.1.- AISLAMIENTO Materiales y equipamiento •

Ansas descartables (10 µl)

•

Placas de Petri descartables (9 cm diámetro) estériles

•

Balanza

•

Estufas a 37oC

•

Mechero bunsen

•

Hisopos de algodón

Medios •

Caldo nutritivo

•

Caldo selenito

•

Agar hierro – tres azúcares (TSI)

•

Agar lisina – hierro (LIA)

•

Estrías de agar tripticas de soja (TSA)

•

Placas de agar Salmonella Shigella (SS)

•

Placas de agar MacConkey (MC)

Procedimiento

Comentarios

Día 1 Cultivo primario en placas de agar (Camino I) y enriquecimiento selectivo (Camino II) (Figura 1) • Resuspender el hisopo en 1 ml de caldo

• Para estas muestras se recomiendan dos

nutritivo de manera de tener una suspensión

caminos simultáneos:

homogénea de la materia fecal. • Sembrar con ansa una muestra de la

• Cultivo directo en medios sólidos,

suspensión de materia fecal, en placas de

aislamiento e identificación de las colonias

agar MC y SS (o XLD) (Camino I- Cultivo directo) • Subcultivar el hisopo en un tubo de caldo

• Enriquecimiento en caldo selectivo, se

selenito, (Camino II - Enrequicimiento para

usa para favorecer el aislamiento de los

la detección de Salmonella spp)

microorganismos cuando se encuentran en muy bajo número en la muestra. La elección del

método

depende

del

número

de

microorganismos presentes en la materia fecal, que está en relación con el proceso diarreico o el estado de portador.

• Incubar las placas del Camino I y el tubo (con el hisopo incluido) del Camino II, a 37ºC, 18-24 horas

• Si en el camino de aislamiento directo (Camino I) se identifica

y confirma

Salmonella spp., no es necesario continuar la vía del enriquecimiento (Camino II)

Día 2 Subcultivo de las colonias sospechosas de ser Salmonella • Observar la morfología y características

• En la placa de agar MC las colonias

fenotípicas de las colonias aisladas en las

típicas son lactosa negativas e incoloras, y

placas de agar MC y de agar SS (Camino I).

en las de agar SS: las colonias típicas son

• Anotar los resultados en la Planilla 1

incoloras, translúcidas con un centro negro

Registro de Resultados: Aislamiento de

debido a la producción de SH2. (Ver Tabla

Salmonella spp. Morfología en placas de

1: Características de las colonias en medios

agar selectivo (Camino I)

selectivos y diferenciales )

• Subcultivar 2 colonias sospechosas de ser

• El subcultivo de colonias sospechosas de

Salmonella de las placas de agar MC y SS

Salmonella en estrías de agar TSA al

en estrías de agar TSA, agar TSI y agar LIA

mismo tiempo que la inoculación en TSI y

(Camino I).

LIA

permite

ganar

un

día

en

la

identificación y serotipificación •

Sembrar con ansa una muestra del

caldo selenito en placas de agar MC y SS. Incubar todos los medios a 37ºC, 18-24 horas. (Camino II)

• Si se obtienen resultados por el Camino I, no continuar adelante por el Camino II.

Día

3

Confirmación

bioquímica

y

serotipificación de Salmonella (Camino I) y subcultivo de colonias sospechosas de Salmonella provenientes del camino de enriquecimiento (Camino II) • Leer las reacciones bioquímicas TSI y LIA, si son compatibles con Salmonella spp.,

realizar las

complementarias

pruebas y

la

bioquímicas

serotipificación

somática (Camino I). [Ver Procedimiento Identificación

y

caracterización

de

Salmonella spp (2.2) y Serotipificación de Salmonella spp. (2.3) ] • Subcultivar 2 colonias sospechosas de

• Si se obtienen resultados por el Camino I,

Salmonella de las placas de agar MC y SS

no continuar adelante por el Camino II

provenientes del enriquecimiento en caldo selenito (Camino II), en estrías de agar TSA, agar TSI y agar LIA. Día 4 • Leer los resultados

de las pruebas

bioquímicas complementarias y realizar la serotipificación flagelar de Salmonella spp. (Camino I) y/ o los resultados confirmación

bioquímica

de la

preliminar

y

realizar la serotipificación somática de Salmonella spp. (Camino II).

Tabla 1. Características de las colonias en medios selectivos y diferenciales Medio de cultivo

Selectividad

Aspecto de las colonias

Agar MC

Baja

Incoloras

Agar EMB

Baja

Incoloras

Agar SS

Alta

Incoloras con centro negro

Agar XLD

Alta

Rojas con centro negro

Agar HK

Alta

Verdes-azuladas con centro negro

Agar BGA

Alta

Rosadas pálidas

Ver Flujograma de aislamiento e identificación bioquímica (Figura 1)

FIGURA 1.- FLUJOGRAMA DE AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA DE Salmonella spp. A PARTIR HECES MATERIA FECAL (HISOPO)

Camino II

Camino I Suspensión en solución fisiológica

1er. día

Aislamiento en medios selectivos y diferenciales (2)

Caldo de enriquecimiento (1)

18-24 hs, 37ºC Aislamiento en medios selectivos y diferenciales (2)

Colonias típicas (3)

2do. día TSI

LIA

Estría

18-24 hs, 37ºC

3er. día Lectura (4)

Serotip. O (6)

Colonias típicas (3)

TSI

LIA

P. bioq. (5)

Caldo Flagelar

Lectura

Serotip. H

Estría 18-24 hs, 37ºC

Lectura (4)

Serotip. O (6)

4to. día P. bioq. (5)

(1) Caldo selenito (2) Agar MacConkey y agar SS, o agar Hektoen, o agar xilosa lisina desoxicolato, o agar verde brillante. (3) Se seleccionan de 2 a 3 colonias. (4) Si TSI y LIA dan resultados compatibles con Salmonella, se siembran Pruebas bioquímicas complementarias (P.bioq.) y se realiza la serotipificación O (Serotip. O) (5) Pruebas bioquímicas complementarias: RM-VP, decarboxilasas, dulcita, malonato. (6) Serotip: Serotipificación. Si la serotipificación somática O de las colonias obtenidas por ambos procedimientos de aislamiento diera igual, la serotipificación flagelar H debe hacerse en una sola de ellas.

2.2.- IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN BIOQUIMICA DE Salmonella spp. Las probables colonias de Salmonella spp. en los medios de aislamiento utilizados se confirman mediante pruebas bioquímicas recomendadas por Le Minor y Richard: desarrollo en agar hierro-tres- azúcares (TSI), utilización de urea de Christensen, determinación de lisina y ornitina decarboxilasa y de arginina dehidrolasa, prueba de la beta-galactosidasa (ONPG), prueba del rojo de metilo, reacción de Voges-Proskauer, prueba de fermentación de la dulcita y utilización del malonato. La mayoría de las serovariedades (99,8%) de Salmonella aisladas del hombre y de los animales de sangre caliente pertenecen a Salmonella enterica subesp. enterica (I) y tienen propiedades bioquímicas características (Tabla 2), siendo excepciones las serovariedades S. Typhi y S. Paratyphi A. Tabla 2. Pruebas bioquímicas de Salmonella enterica subesp. enterica (I)

Pruebas bioquímicas

Salmonella enterica subep. enterica (I)

Lactosa ***

-

ONPG

-

Producción de SH2

+

Glucosa (fermentación) ***

+/con gas

Dulcita (fermentación) ***

+

Adonita (fermentación) ***

-

Lisina decarboxilasa **

+

Ornitina decarboxilasa**

+

Arginina dihidrolasa **

+

Urea (hidrólisis)**

-

Indol

-

Rojo de Metilo *

+

Voges Proskauer *

-

Citrato de Simmons **

+

Malonato (utilización)*

-

*Lectura a los 2 días; ** Lectura hasta los 4 días; *** Lectura hasta los 7 días; **** Lectura hasta los 30 días

Las características bioquímicas que permiten diferenciar las distintas subespecies dentro de la especie S. enterica y la diferenciación con la especie S. bongori se indican en la Tabla 3.

Tabla 3. Propiedades bioquímicas diferenciales de las subespecies de Salmonella spp. S. enterica Pruebas subesp. bioquímicas Enterica (I) Dulcita +

S. enterica subesp. salamae (II) +

S. enterica subesp. arizonae (IIIa) -

S. S. S. enterica enterica enterica S. subesp. subesp. subesp. bongori diarizonae houtenae indica (V) (IIIb) (IV) (VI) d +

ONPG

-

-

+

+

-

d

+

Malonato

-

+

+

+

-

-

-

Gelatina

-

+

+

+

+

+

-

Sorbita

+

+

+

+

+

-

+

KCN

-

-

-

-

+

-

+

L(+) tartrato

+

-

-

-

-

-

-

Mucato

+

+

+

- (70%)

-

+

+

Salicina

-

-

-

-

+

-

-

Lactosa

-

-

- (75%)

+ (75%)

-

d

-

Habitat de

Animales

las cepas

de sangre

Animales de sangre fría y medio ambiente

caliente + 90% ó más de los resultados positivos; - 90% ó más de los resultados negativos; d: diferentes reacciones

Es importante tener en cuenta la posibilidad de aislar más de una serovariedad de Salmonella de un alimento ó de un material patológico. Si bien esto no ocurre con frecuencia, hay que tenerlo presente cuando se trabaja con muestras de materia fecal o de ganglios mesentéricos y sobre todo en el caso de ciertos alimentos para consumo humano o animal, como huevos a granel, embutidos, harinas de carnes o huesos. Es por ello que se recomienda estudiar varias colonias simultáneamente.

Materiales y equipamiento • Ansas descartables (1 µl) • Ansa aguja • Mechero Bunsen

• Estufa a 37oC Medios • Medio para la prueba de urea • Medio para la prueba de fenilalanina • Medio Citrato de Simmons •

Medio para la prueba de la lisina decarboxilasa (LDC)

•

Medio para la prueba de la ornitina decarboxilasa (ODC)

•

Medio para la prueba de la arginina dihidrolasa (ADH)

•

Medio control para las pruebas con aminoácidos.

•

Vaselina estéril

•

Medio base para azúcares

•

Solución madre de dulcita al 5%

•

Solución madre de salicina al 10%

•

Solución madre de sorbita al 10%

•

Solución madre de lactosa al 10%

•

Solución madre de adonita al 10%

•

Solución madre de glicerol al 10%

•

Slución madre de manita al 10%

•

Solución madre de glucosa al 10%

•

Solución madre de dulcita al 10%

•

Solución madre de ramnosa al 10%

•

Solución madre de silosa al 10%

•

Caldo Malonato

•

Discos de o-nitrofenil-β-D-galactopiranósido (ONPG) o reactivo para la prueba de la

β-galactosidasa •

Agar SIM

•

Reactivo de Erlich para la prueba de indol

•

Medio RM/VP para la prueba de Voges-Proskauer

•

Solución de KOH 40% para la prueba de Voges-Proskauer

•

Solución alcohólica de alfa-naftol para la prueba de Voges Proskauer

Cepas bacterianas •

Cepas de referencia para el control de calidad de los medios.

Procedimiento

Comentarios

Día 3 Siembra de las pruebas bioquímicas complementarias •

Inocular a partir de un cultivo en estrías de agar TSA, los medios para las siguientes pruebas: • Medio para la prueba urea. • Medio para la prueba de LDC, ADH y ODC y el medio control. Cubrir con una capa de vaselina estéril. • Medio para ONPG. • Medio RM/VP. • Agar SIM. • Dulcita • Caldo Malonato

• Incubar todas las pruebas bioquímicas a 37ºC por 18-24 horas. • Test de la β-galactosidasa: Resuspender

• La

β-galactosidasa

un ansa del cultivo proveniente del TSI en

inducible, y como la lactosa, presente en el

un tubo que contiene 0.5 ml de medio de

TSI, es uno de los inductores del operón

ONPG e incubar a 37°C. Se debe ver una

lactosa, la prueba se realiza a partir del

reacción positiva dentro de los 20 minutos

desarrollo en este medio.

es

una

enzima

pero usualmente la prueba se lee a las 3-4 horas o más. También se pueden usar discos de ONPG siguiendo las indicaciones del fabricante Día 4 Lectura de las pruebas bioquímicas

• Si

complementarias

concordantes con los esperados para la

se

presentan

resultados

no

• Prueba de urea.

identificación bioquímica de Salmonella

• Prueba de LDC, ADH y ODC.

spp. se deben realizar pruebas diferenciales.

• Prueba de ONPG.

Ver Problemas de Diagnóstico Diferencial,

• Prueba de RM/VP.

donde se presentan pruebas bioquímicas

• Prueba de SIM.

comparativas con otros géneros de la

• Fermentación de Dulcita

familia Enterobacteriaceae

• Utilización de Malonato • Agregar los reactivos correspondientes a las siguientes pruebas: • RM: agregar a 0,5 ml del caldo RM/VP 1 gota de rojo de metilo • VP: agregar a 1 ml del caldo RM/VP, 0,6 ml de la solución alcohólica de αnaftol y 0,2 ml de la solución de KOH. •

Indol: agregar 1 ml del reactivo de

Erlich al medio SIM.

Tablas 4, 5 y ver Pruebas Bioquímicas – e

Interpretación

de

los

Resultados. • Anotar los resultados en las planillas de registro.

cada reactivo

.

• Leer los resultados de acuerdo a las Propiedades

• Agitar muy bien luego de la adición de

Tabla 4. Pruebas bioquímicas: interpretación de los resultados Medio TSI

TSI TSI TSI LIA

Reacciones/enzimas Producción de ácido (si el fondo es amarillo y la estría es roja, (la producción de ácido es sólo a partir de glucosa). Producción de ácido a partir de lactosa y/o sacarosa. Producción de gas

Resultados Negativo Fondo rojo

Positivo Fondo amarillo

Estría roja

Estría amarilla

No hay burbujas en el fondo No hay color negro

Burbujas de aire en el fondo Color negro

Botón purpura/Superficie amarilla

Botón púrpura/Superficie púrpura

No hay color negro Amarillo Color amarillo/marrón

Color negro Rosa/Cereza Color púrpura y color amarillo/marrón en el medio control. Color púrpura y color amarillo/marrón en el medio control Color púrpura y amarillo/marrón en el medio control Amarillo Color rojo/rosado

LIA Urea LDC

Producción de H2S La decarboxilación de la lisina produce una reacción alcalina (color violeta) a través del medio. Los organismos que no decarboxilan la lisina producen una estría alcalina y un fondo ácido (color amarillo). Producción de H2S Ureasa Lisina decarboxilasa

ODC test

Ornitina decarboxilasa

Color amarillo/marrón

ADH test

Arginina dihidrolasa

Color amarillo/marrón

ONPG Voges Proskauer Indol SIM agar SIM agar SIM agar

β-Galactosidasa Producción de acetoína

Permanece incoloro Permanece incoloro

Producción de Indol Producción de H2S Producción de indol Movilidad

anillo amarillo No color negro Anillo amarillo Desarrollo solo a lo largo de la línea de punción

anillo rojo/rosado Color negro anillo rojo/rosado Muestra un crecimiento difuso que se disemina a partir del punto de inoculación

Tabla 5. Resultados de las pruebas bioquímicas para Salmonella spp.

TSI glucosa (ácido)

+

% de aislamientos de Salmonella que muestran la reacción2 100

TSI glucosa (gas)

+

91,93

TSI lactosa

-

99,24

TSI sacarosa

-

99,5

TSI sulfuro de hidrógeno

+

91,6

LIA agar

+

98

SIM agar (H2S)

+

97

SIM agar (indol)

-

98,9

SIM agar (movilidad)

+

97

Utilización de urea

-

99

Lisina decarboxilasa

+

94,65

Ornitina decarboxilasa

+

97

Arginina dihidrolasa

+

70

Reacción de β-galactosidasa

-

98,44

Reacción de Voges-Proskauer

-

100

Reacción de indol

-

98,9

Utilización del Malonato

-

100

Fermentación de Dulcita

+

96

Prueba

1)

1

Reacción positiva o negativa

Ewing W. H. and Ball M. M., The biochemical reactions of members of the genus Salmonella. National Communicable Disease Center, Atlanta, Georgia, USA (1966). 2) Estos porcentajes indican solo que no todas las cepas de Salmonella muestran las reacciones marcadas + o -. 3) Salmonella Typhi es anaerogénica. 4) Salmonella (subgénero) subespecie III (Arizona) da reacciones + o – para lactosa pero es siempre β-galactosidasa positiva. Salmonella (subgénero) subespecie II da una reacción negativa para lactosa y una reacción negativa para β-galactosidasa, (Antigenic Formulas of the Salmonella serovars, 2001). Para el estudio de las cepas, puede ser útil realizar pruebas bioquímicas complementarias. 5) S. Paratyphi A es negativa.

2.2.1.- PRUEBAS BIOQUÍMICAS

Agar Hierro Tres Azúcares (TSI) y Agar Kligler I. Principio El medio fue diseñado para determinar la habilidad de las bacterias de fermentar hidratos de carbono y producir sulfuro de hidrógeno (SH2). El medio contiene 1 parte (0.1%) de glucosa y 10 partes (1,0%) de lactosa y sacarosa. El indicador de pH es el rojo fenol y el sulfato ferroso pone en evidencia la formación de SH2. Si el microorganismo fermenta glucosa, tanto la punción como la estría aparecerán de color amarillo. Si el organismo fermenta lactosa y/o sacarosa, la estría permanecerá ácida (amarilla). Si no fermenta lactosa, la estría se vuelve alcalina (roja). Los organismos que no fermentan glucosa no producen cambios en el pH del medio o producirán productos alcalinos y el medio TSI permanecerá rojo. La producción de SH2 se manifiesta por un ennegrecimiento del medio. El agar de Kligler contiene dos azúcares: lactosa (1%) y glucosa (0,1%). Este medio puede reemplazar al TSI, la diferencia entre ambos es la ausencia de sacarosa. Los fundamentos bioquímicos y la interpretación de los resultados son los mismos para ambos medios.

II. Materiales El medio está disponible comercialmente. Disolver en agua destilada y dispensar volumenes de 5.0 ml en tubos con tapa a rosca; autoclavar a 121ºC por 15 minutos y enfriar inclinado dejando un fondo de 5 a 10 mm. El sustrato es estable por 3 meses. Rotular indicando fecha de preparación y de expiración. Guardar en heladera; si hay cambio de color no usar. III. Resultados A. Estría ácida/fondo ácido (amarillo/amarillo): fermentación de glucosa, sacarosa y/o lactosa (E. coli). B. Estría alcalina/fondo ácido (rojo/amarillo): fermentación de glucosa solamente (Shigella spp.). C. Estría alcalina/fondo alcalino (rojo/rojo): no fermentador (Pseudomonas aeruginosa). D. Precipitado negro en el fondo: producción de SH2 (Salmonella spp). E. Burbujas o roturas: producción de gas (E. coli, Salmonella spp.).

IV. Control de Calidad Bacteria

Punción

Estria

Sh2

Ac

Alc

+ (*)

Ac/g

Alc

-

Salmonella spp.

Ac

Alc

+

Shigella spp.

Ac

Alc

-

Enterobacter aerogenes

Ac/g

Ac

-

Enterobacter cloacae

Ac/g

Ac

-

Escherichia coli

Ac/g

Ac

-

Citrobacter

Ac/g

Ac

+

Klebsiella

Ac/g

Ac

-

Proteus vulgaris

Ac/g o Ac

Ac

+(sucio)

Proteus mirabilis

Ac/g o Ac

Alc

+ (sucio)

Klebsiella pneumoniae

Ac/g o Ac

Alc

-

Salmonella Typhi Salmonella Paratyphi A

(*) sólo en la parte superior de la punción o formación de un anillo. Para el control de calidad selecionar entre aquellos microorganismos disponibles.

Prueba de la β-galactosidasa I. Principio La fermentación de la lactosa requiere dos enzimas; mientras

la permeasa facilita la

penetración de la molécula de lactosa dentro de la célula bacteriana, la β-galactosidasa hidroliza la lactosa para formar galactosa y glucosa. Las bacterias no fermentadoras de lactosa carecen de ambas enzimas, sin embargo hay bacterias que tienen β-galactosidasa pero no permeasa.

El

o-nitrofenil-β-D-galactósido

(ONPG)

es

un

compuesto

incoloro

estructuralmente similar a la lactosa. En presencia de β-galactosidasa, ONPG se rompe en galactosa y o-nitrofenil, un compuesto color amarillo. Como la familia Enterobacteriaceae se agrupan de acuerdo a su habilidad de fermentar lactosa, este test es útil en la identificación de fermentadores de lactosa.

II. Materiales A. Solución de ONPG

Disolver 80.0 mg de ONPG en 15.0 ml de agua destilada a 37º C, agregar 5.0 ml del buffer fosfato, ajustar a pH 7.0 y esterilizar por filtración. La solución es estable por 6 meses. Guardar refrigerada (4 a 8º C), en recipientes de color caramelo o envueltos en papel de aluminio. Rotular la solución, indicando fecha de preparación y de expiración. B. Buffer fosfato de sodio 1M (pH 7.0) Disolver 6,9 gr de NaHPO4.H2O en 45.0 ml de agua destilada. Agregar 3.0 ml de una solución de NaOH al 30% (w/v) y ajustar el pH a 7.0. Llevar el volumen a 50.0 ml con agua destilada y guardar a 4º C.III. Procedimiento A. A partir de un cultivo en TSI, hacer una suspensión espesa del organismo a ensayar en 0.5 ml de solución salina. El volumen no tiene mayor importancia porque es una prueba basada en la observación de un cambio de color. B. Agregar un disco o dos gotas de solución de ONPG. C. Incubar la mezcla a 37ºC y examinar cambio de color hasta 24 horas.

III. Resultados Ensayo positivo: desarrollo de color amarillo. Ensayo negativo: no hay desarrollo de color.

IV. Control de calidad Escherichia coli (+) Salmonella (-)

V. Consideraciones A. Se puede partir de estrías de agar nutritivo con 1% de lactosa, cuando no se dispone de TSI. B. La solución de ONPG preparada debe ser incolora antes de su empleo.

Agar Lisina Hierro (LIA) I. Principio La decarboxilación de la lisina a cadaverina produce una alcalinización del medio y un viraje al violeta del indicador púrpura de bromocresol. Como la reacción tiene lugar en medio ácido, es necesaria la fermentación previa de la glucosa.

Los microorganismos que no decarboxilan lisina, pero fermentan la glucosa producen un viraje al amarillo en todo el medio. La formación de SH2 produce una coloración negra debido al sulfuro de hierro producido. Las bacterias del grupo Proteus-Providencia, con excepción de Morganella morganii, desaminan la lisina a ácido α-cetocarbónico que forma compuestos pardo-rojizos en el medio de cultivo con la sal de hierro y en aerobiosis.

II. Materiales El medio está disponible comercialmente. Disolver el polvo en agua destilada y dispensar en volúmenes de 3 ml en tubos con tapa a rosca. Esterilizar a 121ºC por 15 minutos. Enfriar de manera de tener estría y fondo. Guardar en heladera.

III. Resultados Los microorganismos que descarboxilan la lisina producen un viraje al violeta. Los microorganismos que no descarboxilan la lisina y fermentan glucosa producen un viraje al amarillo. La formación de SH2 se indica por la aparición de una coloración negra.

IV. Control de Calidad Bacteria

Punción

Estria

SH2

Salmonella spp.

Violeta

Violeta

+

Proteus mirabilis

Amarilla

Pardo-rojiza

+

Proteus vulgaris

Amarilla

Pardo-rojiza

+

Morganella morganii

Amarilla

Pardo-rojiza

-

Prov. rettgeri

Amarilla

Pardo-rojiza

-

Providencia spp.

Amarilla

Pardo-rojiza

-

Citrobacter spp.

Amarilla

Violeta

+

Escherichia coli

Amarilla

Violeta

-

Shigella spp.

Amarilla

Violeta

-

Klebsiella

Violeta

Violeta

-

Para el control de calidad seleccionar entre aquellos microorganismos disponibles.

Agar SIM I. Principio Es un medio que se usa para determinar la formación de sulfuro de hidrógeno, la producción de indol y la movilidad en el diagnóstico de Enterobacterias.

II. Materiales El medio está disponible comercialmente. Disolver en agua destilada, calentar suavemente hasta su disolución y dispensar en volumenes de 5 ml en tubos con tapa a rosca. Autoclavar a 121ºC, 15 minutos; enfriar en posición vertical y guardar en heladera.

III. Procedimiento A.Con un ansa tomar material de una colonia y sembrar por punción. B.Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas.

IV. Resultados A. Para la producción de SH2 Ensayo positivo: ennegrecimiento del medio. Ensayo negativo: no hay ennegrecimiento. B. Para la movilidad Ensayo positivo: hay una turbidez difusa del medio. Ensayo negativo: sólo hay crecimiento a lo largo de la punción. C. Para la producción de indol Ensayo positivo: aparición de color rojo cuando se agrega el reactivo de Erlich. Ensayo negativo: no hay aparición de color.

V. Control de Calidad Escherichia coli: SH2 -, indol (+), movilidad (+) Klebsiella pneumoniae: SH2 (-), indol (-), movilidad (-) Proteus vulgaris: SH2 +, indol (+), movilidad (+)

VI. Consideraciones Un organismo que produce sulfuro de hidrógeno puede mostrar ennegrecimiento en SIM pero no en TSI por la presencia de sacarosa en este último medio. La utilización de la sacarosa

puede suprimir los mecanismos enzimáticos responsables de la producción del sulfuro de hidrógeno.

Test de Utilización de Azúcares I. Principio Es un ensayo para determinar la capacidad de un microorganismo de fermentar un hidrato de carbono con producción de ácido o ácido y gas. El patrón de utilización de azúcares ayuda en la diferenciación e identificación de muchas bacterias. En este ensayo, determinados azúcares se agregan a un medio basal estéril. La producción de ácido se manifiesta por un cambio de color del indicador. La elección del medio y del indicador depende del camino metabólico del organismo y de la claridad visual del cambio de pH.

II. Materiales A. Medio base •

Peptona

10,0 g

•

Extracto de carne

1,0 g

•

Cloruro de sódio

5,0 g

•

Azul de bromotimol

10,0 ml

•

Indicador de Andrade

5,0 ml

•

Agua destilada

1000 ml

Rehidratar los ingredientes con agua destilada, calentando suavemente si es necesario; ajustar el pH a 7,1-7,2 (7,4). Autoclavar a 121ºC por 15 minutos y enfriar en baño de agua a 50ºC. Fraccionar el medio base en alícuotas y agregar los azúcares esterilizados por filtración en concentraciones de: 0,5% para dulcita y salicina y 1,0% para los otros azúcares. Dispensar en volumenes de 4-5 ml en tubos con tapa a rosca, estériles. El medio se guarda en heladera y es estable por 3 meses. Para la glucosa y glicerol el medio base se dispensa en tubos con campanita de Durham antes de autoclavar. La campanita se llenará con el medio y luego se agrega el azúcar en forma estéril después de enfriar a 50º C.

B. Indicador de Andrade Disolver 0,5 gr de fucsina ácida en 100 ml de agua destilada, agregar 15 ml de NaOH 1N (4%); mezclar bien y dejar descansar a temperatura ambiente durante 24 horas, agitando frecuentemente. El color rojo se debe transformar en un color castaño. Si no se produce una decoloración suficiente agregar 1 ml de NaOH 1N (4%).

III. Procedimiento 1) Con un ansa estéril tomar material de un cultivo en medio sólido. 2) Sumergir el ansa en cada tubo de hidrato de carbono. Para una batería de 8 a 10 azúcares, es suficiente un único inóculo, no hay necesidad de flamear el ansa entre tubo y tubo. La posibilidad de transportar el hidrato de carbono de tubo a tubo es infinitesimal y no afectará los resultados. Para una batería grande (15 a 20) de azúcares, puede ser necesario emplear 2 a 3 inóculos, flameando el ansa antes de tomar nueva muestra. Incubar a 37º C y examinar día por día por 4 a 5 días. Para algunos microorganismos puede ser necesario una incubación más prolongada (7 días), registrando los resultados día por día. 3) En laboratorios de referencia las lecturas se deben prolongar hasta 30 días.

IV. Resultados Ensayo positivo: viraje del indicador al rojo-rosado por acidificación del medio. Ensayo negativo: no hay cambio de color.

V. Control de calidad Con distintos microorganismos que fermenten los azúcares, como por ejemplo: Escherichia coli: glucosa (+) Klebsiella: lactosa (+) Yersinia enterocolitica: sacarosa (+)

VI. Consideraciones A. Inocular un medio basal sin azúcar para cada microorganismo. B. La campanita de Durham se usa en el tubo con glucosa. C. Como cualquier indicio de gas, aún una burbuja pequeña, es evidencia de producción de gas, observar cuidadosamente la campanita antes de inocular.

D. La campanita de Durham se agrega únicamente al medio con glucosa porque si el microorganismo produce gas con glucosa producirá gas con los otros azúcares. No obstante, si se sabe que el microorganismo en estudio no fermenta glucosa, es aconsejable agregar campanita a otros azúcares, pero hay que tener en cuenta que todas las Enterobacterias son fermentadoras de glucosa por definición, entonces sólo se pone campanita al medio con glucosa. E. Test de Decarboxilasa-Dehidrolasa I. Principio La descarboxilación es un proceso en el cual las decarboxilasas atacan el extremo carboxilo de los aminoácidos, formando la correspondiente amina. Los tres aminoácidos que se ensayan en la identificación de Enterobacterias son arginina, lisina y ornitina. La decarboxilación de lisina y ornitina da cadaverina y putrescina (diaminas), mientras que arginina da citrulina por acción de una dihidrolasa. El test se debe acompañar con un tubo control que contiene el medio base sin aminoácido. Como la decarboxilación es una reacción anaeróbica, se debe cubrir el medio con una capa de aceite mineral estéril. El proceso ocurre en dos etapas: por fermentación de la glucosa se produce una acidificación del medio (pH < 6), apareciendo color amarillo. La acidificación es necesaria para que ocurra la decarboxilación. Este último proceso de lugar a la formación de las aminas que elevan el pH con el consiguiente viraje del indicador al color violeta. La prueba de la lisina ayuda en la diferenciación de Edwardsiella (+), y Salmonella (+) de Citrobacter (-); de Enterobacter aerogenes (+) de Enterobacter cloacae (-) y Enterobacter agglomerans (-) La prueba de ornitina ayuda a diferenciar Klebsiella (-), Proteus mirabilis (+) de Proteus vulgaris (-); Morganella morganii (+) de Providencia rettgeri (-); Yersinia enterocolitica (+) de Yersinia pestis y Yersinia pseutuberculosis (-).

II. Materiales El medio basal más utilizado es el medio de decarboxilasa de Moeller. El medio contiene peptona 5 g, extracto de carne 5 g, glucosa 0,5 g, bromocresol púrpura 0,01 g, rojo cresol 0,005 g piridoxal 0,005 g pero está disponible comercialmente. Las concentraciones de aminoácidos a usar son: 1% para la forma L y 2% para la forma DL. Fraccionar el medio base en 4 porciones de 250 ml cada una. Agregar los aminoácidos a 3 porciones del medio. El pH de la fracción que lleva ornitina se debe reajustar después de agregar el aminoácido y antes de

esterilizar. Fraccionar en volumenes de 3 a 4 ml en tubos con tapa a rosca y autoclavar a 121ºC por 10 minutos. El sustrato es estable por 3 meses. Rotular los tubos, indicando fecha de preparación y de expiración y guardar en heladera. Al aceite mineral se le agrega 1 ml de agua por cada 100 ml de vaselina, y se autoclava a 121ºC por 45 minutos.

III. Procedimiento A. Tomar material con un ansa e inocular el tubo control y los tubos con los aminoácidos. B. Cubrir todos los tubos con una capa de vaselina estéril. C. Incubar a 37ºC D. Efectuar las lecturas día por día hasta 4 días, registrando los resultados día por día.

IV. Resultados Ensayo positivo: medio turbio y púrpura a púrpura amarillento. Ensayo negativo: color amarillo Tubo control: permanece con su color original o se vuelve amarillo si el organismo es un fermentador de glucosa (se debe ver turbidez en el tubo).

V. Control de calidad Bacteria

Arginina

Lisina

Ornitina

Proteus vulgaris

-

-

-

Morganella morganii

-

-

+

Enterobacter cloacae

+

-

+

Enterobacter

-

+

+

S. Typhimurium

+

+

+

Klebsiella

-

+

-

aerogenes

VI. Consideraciones A. Inocular siempre un tubo control. B. Debe haber desarrollo para que el resultado sea válido. C. Si se observan capas de color amarillo y violeta, agitar suavemente el tubo antes de interpretar la reacción.

D. Comparar todos los tubos positivos con el tubo control. Un color grisáceo puede indicar reducción del indicador más que formación de productos alcalinos. Se debe agregar más indicador antes de interpretar el resultado. E. Si la reacción es difícil de interpretar, comparar el tubo con un tubo sin inocular. Luego de 24 horas cualquier traza de color púrpura indica un resultado postivo. F. Si se usa el medio de Moeller, se debe incubar por lo menos 18 horas ante de interpretar los resultados. G. Si no se agrega el aceite mineral, las reacciones se deben leer sólo a las 24 horas. H. Un pequeño precipitado floculento en la ornitina no interfiere con su uso.

Prueba del Malonato I. Principio El ensayo pone en evidencia la capacidad de las bacterias de utilizar malonato como fuente de carbono. Las cantidades mínimas de glucosa del medio, permiten el desarrollo de organismos que no pueden usar malonato o sales de amonio, sin embargo esos organismos no pueden mantener un pH alcalino. La producción de ácido por la fermentación de la glucosa impide una posible alcalinización. Solamente los microorganismos que pueden usar simultáneamente malonato de sodio como fuente de carbono y sulfato de amonio como fuente de nitrógeno son capaces de ejercer una acción buffer produciendo hidróxido de sodio. El aumento de la alcalinidad resultante hace que el azul de bromotimol cambie

de verde a azul. Los

microorganismos malonato negativos que fermentan glucosa hacen que el indicador cambie de verde a amarillo. La mayoría de las especies de Enterobacter y Klebsiella utilizan malonato de sodio. El ensayo también sirve para separar Salmonella arizonae (+) de otras especies de Salmonella (-).

II. Materiales El medio contiene: extracto de lavadura 1.0g, sulfato de amonio 2.0g, fosfato dipotásico 0.6g, fosfato monopotásico 0,4g, ClNa 2 g, malonato de sodio 3 g, glucosa 0,25g, azul de brotimol (1g/500ml) 12,5g . Disolver en 1000 ml de agua destilada, dispensar 3 ml en tubos con tapa a rosca y autoclavar a 121ºC por 15 minutos. Enfriar antes de usar; el sustrato es estable por 2 a 3 meses. Rotular los tubos, indicando fecha de preparación y de expiración y guardar en heladera. Si hay cambio de color en el medio no usar.

III. Procedimiento A. Con ansa estéril tomar material e inocular el medio. B. Incubar a 37ºC por 24 a 48 horas. C. Continuar incubando los tubos negativos hasta 4 días, registrando los resultados día por día.

IV. Resultados Ensayo positivo: reacción alcalina (azul). Ensayo negativo: no hay cambio de color (verde). Ensayo negativo: reacción ácida, sólo fermentación de glucosa (amarillo).

V. Control de Calidad Enterobacter aerogenes (+) Escherichia coli (-)

VI. Consideraciones A. Algunos organismos malonato (+) producen una ligera alcalinidad, que hace la interpretación difícil. Cuando hay duda comparar con un tubo sin inocular. Cualquier vestigio de color azul denota una prueba positiva luego de una incubación de 48 horas. No se debe hacer una interpretación final negativa hasta no haber incubado los tubos durante 48 horas. B. A veces es necesario agregar extracto de levadura y glucosa para estimular el crecimiento de algunos organismos. C. Algunas cepas malonato (-) dan color amarillo por la fermentación de la glucosa solamente. Esto produce una disminución del pH y el viraje del indicador al amarillo.

Ensayo del Rojo de Metilo I. Principio El test se usa para determinar la presencia de iones hidrógeno cuando un microorganismo fermenta glucosa. Todos los miembros de la familia Enterobacteriaceae convierten glucosa en ácido pirúvico por el camino de Embden-Meyerhof. Los organismos que metabolizan ácido pirúvico producen ácido y bajan el pH a menos de 4.4. Los organismos que utilizan, en cambio, el camino del butilenglicol producen acetoína y butanodiol (diacetilo). El indicador del medio, rojo de metilo, es rojo a pH < 5 y amarillo a pH > 5,8. El test es útil para la

diferenciación de Escherichia coli (rojo metilo positivo) de Klebsiella (rojo metilo negativo). La mayoría de las Enterobacteriaceae tienen uno u otro camino metabólico, pero raramente ambos.

II. Materiales A. Preparación del medio El medio está disponible comercialmente. Disolver en agua destilada, dispensar 5 ml en tubos con tapa a rosca y autoclavar a 121ºC por 15 minutos. El sustrato es estable por 2 a 3 meses. Rotular los tubos, indicando fecha de preparación y de expiración. Guardar en heladera.

B. Preparación del reactivo Disolver 0,1 g de rojo de metilo en 300 ml de etanol y diluir con 200 ml de agua destilada, para alcanzar un volumen total de 500 ml. El reactivo es estable por 1 año. Rotular indicando fecha de preparación y de expiración. Guardar en heladera.

III. Procedimiento A. Con un ansa estéril tomar material e inocular un tubo con caldo RM/VP. B. Incubar a 35º C por un mínimo de 48 horas. C. Transferir 2,5 ml de la suspensión a un tubo. D. Agregar 5 gotas del indicador y observar si hay cambio de color.

IV. Resultados Ensayo positivo: el reactivo permanece rojo. Ensayo negativo: el reactivo se torna amarillo-naranja. Si el resultado es negativo continuar la incubación de la bacteria por 24 horas más.

V. Control de Calidad Escherichia coli (+) Enterobacter aerogenes (-)

VI. Consideraciones A. Variaciones en la cantidad de peptona del medio puede afectar el resultado. B. Aumentando la concentración de glucosa en el medio no se acelera la reacción del rojo de metilo.

C. No sobreinocular, el crecimiento bacteriano se inhibe cuando el inóculo es grande. D. Una incubación de 48 horas es suficiente para la mayoría de los cultivos; pero el ensayo no se debe realizar con cultivos que tengan menos de 48 horas de incubación.

Ensayo de Voges-Proskauer I. Principio El piruvato es un intermediario en el metabolismo de la glucosa. A partir del ácido pirúvico un microorganismo puede seguir varios caminos. Algunos lo rompen para formar como productos finales ácidos láctico, acético o fórmico. Otros metabolizan el piruvato por el camino del butilenglicol para formar como productos finales acetoína (acetilmetilcarbinol) y 2,3-butanodiol (diacetilo). El ensayo de Voges-Proskauer (VP) detecta estos productos metabólicos. En presencia de oxígeno e KOH, la acetoína se oxida a diacetilo, que da un complejo rojo. La sensibilidad del ensayo se aumenta por el agregado de α-naftol antes del agregado de KOH.

II. Materiales A. Preparación del medio El medio está disponible comercialmente. Para la preparación del caldo RM/VP, ver el procedimiento indicado para el test de rojo de metilo. B. Preparación de solución de α-naftol Disolver 5 g de α- naftol en una pequeña cantidad de alcohol absoluto y luego llevar el volumen a 100 ml. La solución debe ser incolora. El reactivo es estable por 1 año. Rotular indicando fecha de preparación y de expiración. Guardar en heladera en frascos color caramelo. C. Preparación de la solución de KOH Disolver los pelleta de KOH en agua destilada y luego llevar el volumen final a 100 ml (trabajar sobre baño de agua fría para evitar recalentamiento). El reactivo es estable por 1 año. Rotular indicando fecha de preparación y de expiración.

III. Procedimiento A. Con un ansa estéril tomar material e inocular un tubo de caldo RM/VP. B. Incubar a 37ºC por un mínimo de 48 horas.

C. Transferir 2,5 ml de la suspensión a otro tubo. D. Agregar 0,6 ml del reactivo de α-naftol. E. Agregar 0,2 ml del reactivo de KOH. F. Agitar el tubo y dejar descansar 10 a 15 minutos. G. Observar la formación de un color rosado a rojo.

IV. Resultados Ensayo positivo: desarrollo de color rojo dentro de los 15 minutos. Ensayo negativo: no hay desarrollo de color. V. Control de Calidad Klebsiella pneumoniae (-) Escherichia coli (+)

VI. Consideraciones A. Cuando hay una incubación prolongada (más de 3 días) algunos organismos VP + pueden producir un aumento de la acidez del medio, dando reacciones positivas débiles o falsas reacciones negativas. B. La mayoría de los miembros de la familia Enterobacteriaceae dan reacciones opuestas entre el rojo de metilo y VP, sin embargo algunos organismos como Hafnia alvei pueden dar ambas reacciones positivas. C. Los reactivos se deben agregar en el orden indicado. Una inversión del orden puede dar un resultado positivo débil o un falso negativo. D. No se debe agregar KOH en exceso, porque se puede enmascarar una reacción positiva débil por la formación de un color cobrizo por la reacción del KOH con el αnaftol. No leer el ensayo después de 1 hora; puede aparecer una coloración cobriza dando un resultado falso positivo. E. Prueba de la Urea I. Principio La urea es una diamida del ácido carbónico, cuya hidrólisis por acción de la ureasa da 2 moléculas de amoníaco. La ureasa es una enzima constitutiva que se sintetiza independientemente de la presencia o no de la urea. La prueba determina la capacidad de la bacteria de desdoblar la urea, con la consiguiente alcalinización del medio. Es una actividad

característica de especies de Proteus y se usa para diferenciar Klebsiella (+) de Escherichia (-) y Proteus (+ rápido) de Providencia (-); Yersinia pseudotuberculosis (+) de Yersinia pestis (-)

II. Materiales El medio base está disponible comercialmente, es el medio base de urea de Christensen, que contiene peptona 1 g, glucosa 1 g cloruro de sodio 5 g, fosfato monopotásico 5 g, solución de rojo fenol al 0,2% 6 ml. Se disuelve medio en agua destilada y esterilizar a 121ºC por 15 minutos. Enfriar a 50ºC y agregar 5 ml de una solución de urea al 40% por cada 100 ml de medio. Mezclar y fraccionar en volumenes de 2,5 ml en tubos estériles. Guardar en heladera. La urea se pesa asepticamente, se disuelve en agua y se calienta a 70ºC por 20 minutos, se guarda en frascos estériles con cloroformo (igual que para los azúcares).

III. Procedimiento A) Con un ansa estéril se toma abundante material y se inocula por punción B) Se incuba a 37ºC y se efectúan lecturas a las 2, 4, 6 y 18 horas. Los tubos negativos se observan diariamente por 4 a 7 días para detectar reacciones tardías que dan ciertos miembros de la familia, registrando los resultados día por día.

IV. Resultados Ensayo positivo: aparición de color rojo en el medio por una alcalinización del mismo. Ensayo negativo: no hay cambio de color.

V. Control de Calidad Enterobacter aerogenes (–) Escherichia coli (–) Proeus vulgaris (+)

Prueba del Indol I. Principio El indol es uno de los productos del metabolismo del aminoácido triptofano. Con un medio rico en triptofano, el indol se puede detectar por su habilidad para combinarse con ciertos aldehidos para formar un compuesto coloreado. El ensayo constituye un método rápido para detectar organismos productores de indol. Como indicador de la presencia del aldehído se usa

el reactivo de Erlich. Es especialmente útil en la identificación preliminar de Escherichia coli, y para diferenciar Edwardsiella (+) de Salmonella (-).

II. Materiales A. Caldo triptofano •

Peptona

20 g

•

Cloruro de sodio

5g

•

Agua destilada

1000 ml

A este caldo se le incorpora triptofano en una concentración del 1%. El medio se esteriliza a 121ºC durante 15 minutos y luego se ajusta el pH a 7,5. Dejar enfriar antes de su empleo y guardar a 4-10ºC para su conservación.

B. Reactivo de Erlich •

p-dimetilaminobenzaldehido

1g

•

alcohol etílico, 95%

95 ml

•

ácido clorhidríco, concentrado

20 ml

Se disuelve el aldehído en el alcohol (puede requerir un calentamiento suave), luego se agrega lentamente el ácido. El reactivo de color amarillo es estable por un año. Identificar el reactivo con una etiqueta donde conste la fecha de preparación y de expiración. Guardar refrigerado en botellas color caramelo.

III. Procedimiento 1) Con un ansa tomar material de una colonia aislada e inocular el caldo que contiene triptofano. 2) Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas. 3) Transferir 2 ml de la suspensión de caldo a un segundo tubo. 4) Agregar 5 gotas del reactivo de Erlich por la pared del tubo. 5) Agitar el tubo y observar un color rosado en la interfase entre el caldo y el reactivo. 6) Si el ensayo es negativo, el cultivo se debe reincubar otras 24 horas.

IV. Resultados Ensayo positivo: desarrollo de un color rojo en la interfase del reactivo y el caldo, segundos después de agregar el reactivo.

Ensayo negativo: no hay cambio de color o hay un color amarillo en la interfase.

V. Control de Calidad Cualquiera de los reactivos debe ser controlado con cultivos positivos y negativos conocidos, antes de su empleo general. Como controles resultan convenientes cepas de fácil obtención y que su conservación en cultivos madre no ofrezca problemas. Escherichia coli (+) Enterobacter aerogenes (-) Klebsiella pneumoniae (-)

VI. Consideraciones 1) El pH óptimo para la actividad de la triptofanasa es ligeramente alcalino (7,4-7,8). La disminución del pH provoca una reducción en la producción de indol y una reacción falsamente negativa o débilmente positiva. 2) Los cultivos a los cuales se les efectúa la prueba del indol deben ser incubados aerobicamente. El descenso en la tensión de oxígeno disminuye la producción de indol. 3) No debe emplearse un medio de peptona que contenga glucosa porque la elevada acidez producida por la fermentación del azúcar puede inhibir la actividad de la triptofanasa. El agregado de triptofano estimula la producción de indol, mientras que la glucosa la inhibe.

2.2.2.-PROBLEMAS DEL DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL A) Salmonella Typhi y Salmonella Paratyphi A, pueden diferenciarse de otras Salmonella spp, por las siguientes pruebas bioquímicas: Tabla 6. Pruebas bioquímicas diferenciales entre Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A y Salmonella spp. P. Bioquímicas

S. Typhi

S. Paratyphi A

Salmonella spp.

Trazas

-

+

Lisina decarboxilasa

+

-

+

Ornitina decarboxilasa

-

+

+

Arginina dihidrolasa

-

-

+

SH2 (TSI)

Glucosa (gas)

-

+

+

Citrato Simmons

-

-

+

+ 90% ó más de los resultados positivos; - 90% ó más de los resultados negativos

B) Algunas cepas de Salmonella spp.

se pueden confundir con otras enterobacterias

productoras de SH2 como Proteus mirabilis y Citrobacter freundii que son comensales del aparato digestivo del hombre y de los animales de sangre caliente, pero que no son enteropatógenos.

Tabla 7. Caracteres bioquímicos diferenciales entre Salmonella subesp. enterica (I) Proteus mirabilis y Citrobacter freundii Pruebas bioquímicas

Salmonella enterica subesp. enterica (I)

Citrobacter freundii

Proteus mirabilis

SH2 (TSI)

+

+

+

Urea (hidrólisis)

-

d

+

Fenilalanina deaminasa

-

-

+

Lisina decarboxilasa

+

-

-

Ornitina decarboxilasa

+

d

+

Lactosa (fermentación)

-

d

-

Dulcita (fermentación)

+

d

-

ONPG

-

+

-

+ 90% ó más de los resultados positivos; - 90% ó más de los resultados negativos; d: diferentes reacciones

C) Las cepas de Citrobacter freundii suelen ser identificadas por error como S. enterica subesp. arizonae (IIIa) (serovariedades monofásicas) y S. enterica subesp. diarizonae (IIIb) (serovariedades difásicas), (ex-género Arizona), en razón de compartir caracteres bioquímicos tales como: SH2 (TSI) +, ONPG + y un perfil de fermentación de hidratos de carbono muy parecido.

Tabla 8. Caracteres bioquímicos diferenciales entre Salmonella subesp. enterica IIIa y IIIb y Citrobacter freundii Pruebas bioquímicas

Salmonella subesp. enterica

Citrobacter freundii

IIIa y IIIb Lisina decarboxilasa

+

-

Ornitina

+

- (con excepciones)

-

+

+

-

+ (lenta)

-

decarboxilasa Glicerol (fermentación) Malonato (utilización) Gelatina (hidrólisis)

+ 90% ó más de los resultados positivos; - 90% ó más de los resultados negativos

D) Muy raramente Salmonella pueden confundirse con otras entrobacterias productoras de SH2, como E. coli SH2 + o Edwardsiella tarda Tabla 9. Caracteres bioquímicos diferenciales entre Salmonella enterica subesp. enterica (I), Edwarsiella tarda y Esherichia coli SH2 + S. enterica P. Bioquímicas

subesp. enterica

E. tarda

E. coli SH2 +

(I) Indol

-

+

+

Citrato Simmons

+

-

-

Lisina decarboxilasa

+

+

+

Arginina dihidrolasa

+

-

-/+

Manita (fermentación)

+

-

+

Dulcita (fermentación)

+

-

+/-

Ramnosa

+

-

+

Xilosa (fermentación)

+

-

+

ONPG

-

-

+

(fermentación)

+ 90% ó más de los resultados positivos; - 90% ó más de los resultados negativos

E) Puede suceder que dos o más serovares tengan la misma fórmula antigénica global, por lo que su diferenciación se hace en base a pruebas bioquímicas. Tabla 10. Caracteres diferenciales de las serovariedades S.Cholerasuis, S. Typhisuis y S. Paratyphi C.

Pruebas Bioquímicas

Cholerasuis

Paratyphi C

Typhisuis

-

+

+

Citrato deSimmons

+ o (+)

+

-

Arginina dihidrolasa

-

+o-

-

Lisina decarboxilasa

+

+

-

Ornitina decarboxilasa

+

+

+

+o-

+

-

Arabinosa

-

+

+

Dulcita

-

+

-

Sorbita

+ o (+)

+

-

SH2

Tartrato de Jordan

+ 90% o más de los resultados positivos; (+) reacciones positivas después de 3 o más días.

-

90%

o

más

de

los

resultados

negativos;

2.3.- SEROTIPIFICACIÓN DE Salmonella spp. La serotipificación constituye un importante complemento de la identificación bioquímica y desde el punto de vista epidemiológico permite determinar la prevalencia de una serovariedad en distintas zonas geográficas, como así también es de utilidad para el estudio de brotes y para conocer la fuente de infección y las vías de transmisión. El uso de reacciones antígeno – anticuerpo para la serotipificación de las bacterias se basa en que los microorganismos presentan diferencias en su constitución antigénica, aún entre grupos de microorganismos relacionados. Los microorganismos expresan una gran variedad de antígenos (Ags): componentes estructurales de la célula (pared, cápsula, fimbrias); productos de excreción (exotoxinas, enzimas extracelulares). Químicamente, los Ags pueden ser proteínas, hidratos de carbono y complejos de polipéptidos y carbohidratos. Como son moléculas complejas tienen más de una subestructura que puede servir como determinante antigénico. Debido a esto en los sueros inmunes se encuentran anticuerpos que reaccionan contra distintos determinantes antigénicos de la misma molécula.

La base de la serotipificación para todas las enterobacterias es similar: se pone en evidencia la presencia de antígenos somáticos, flagelares y capsulares. La serotipificación de cepas de Salmonella enterica involucra la identificación de antígenos somáticos de superficie (LPS, antígenos O) y antígenos flagelares (proteínas, antígenos H). La mayoría de las cepas de Salmonella expresan dos fases flagelares pero también se conocen variantes afásicas, monofásicas y trifásicas. La identificación de las serovariedades surge como consecuencia de la combinación antigénica de factores somáticos O y flagelares H, con el agregado del antigeno capsular Vi para unas pocas serovariedades y se presenta en el “Esquema de Kauffmann-White” (Popoff, M.Y., 8ª Ed, WHO Centre for Referente and Research on Salmonella, Instituto Pasteur, París, Francia, 2001).

A) Antígenos somáticos (Ags O) Están compuestos por complejos de fosfolípidos y polisacáridos; su composición es aproximadamente: 60% polisacáridos, 20-30% lípidos y 3,5-4% hexosamina. Son cadenas laterales de polisacáridos del lipopolisacárido de envoltura (LPS) que se encuentra en todos los microorganismos gram-negativos. La cadena de polisacáridos del Ag O es un polímero

de unidades repetidas de

oligosacáridos (de 3 a 5 azúcares) lineales o ramificados. La naturaleza de los grupos terminales y el orden en que se encuentran las unidades repetidas de la cadena determina la especificidad antigénica somática de la bacteria. Como esta estructura difiere ampliamente entre las distintas serovariedades, hay diferencias en la especificidad antigénica O. Estos antígenos son termoestables y resistentes a ácidos diluidos y alcohol. La estructura somática se denomina con la letra O seguida de números arábigos separados por comas, por ej. S. Typhimurium O:1,4,5,12; S. Enteritidis O:1,9,12 Los Ags O se pueden clasificar de la siguiente manera: 1) Factores mayores, que identifican el grupo antigénico O; por ej., el factor O:4, el factor O:9 2) Factores menores, que pueden ser: a) Los que tienen poco o ningún valor discriminativo porque siempre están asociados a otro factor; por ej., O:12 que siempre está asociado con O:2, O:4 y O:9, como se presenta en S. Paratyphi A O: 1,2,12; S. Typhimurium O: 1,4,5,12 y S. Enteritidis O: 1,9,12 b) Los que surgen como consecuencia de una modificación química de los Ags mayores; por ej., O:5 resulta de la acetilación de la abecuosa presente en las unidades repetidas del

polisacárido responsable de la especificidad O:4,12; O:1 resulta de la inserción de un residuo de glucosa en la galactosa de la cadena de polisacárido, como es el caso de la serovariedad S. Typhimurium O:1,4,5,12

B) Antígenos Flagelares (Ags H) El flagelo es una estructura compleja que consiste en un cuerpo basal, un segmento de unión (“hook”) y un filamento. El cuerpo basal ancla el flagelo a la envoltura de la célula y el “hook” une el cuerpo basal con el filamento. En la serotipificación flagelar de Salmonella se usa solamente la especificidad antigénica del filamento. El filamento esta constituido por flagelina, proteína de alto peso molecular. En Salmonella se han encontrado más de 60 especificidades antigénicas flagelares. Las diferencias antigénicas surgen debido a variaciones en la estructura primaria (contenido en aminoácidos y orden de ubicación) de las distintas moléculas de flagelina. Estos antígenos son sensibles al calor. Unas pocas serovariedades de Salmonella poseen una sola fase flagelar, esas cepas se llaman monofásicas, por ej. Salmonella Enteritidis (9,12:g,m:-), Salmonella Typhi (9,12 [VI]:d:-); pero la gran mayoría de las serovariedades tienen dos fases flagelares o sea son cepas difásicas; por ej., Salmonella

Typhimurium (1,4,5,12:i:1,2) y

Salmonella Hadar

(6,8:z10:e,n,x), que expresan la fase 1 (constituida en los ejemplos por los antígenos: i ó z10 ) y la fase 2 ( por los antigenos: 1,2 y e,n,x respectivamente).

C) Antígeno Capsular (Ag Vi) El antígeno capsular es un polisacárido, constituido por ácido N-acetilglucosaminourónico. Entre los antígenos capsulares de las Enterobacterias, el Vi es el más importante en el género Salmonella. Se encuentra en sólo tres serovariedades: S. Typhi, S. Paratyphi C y en algunas cepas de S. Dublin.

Descripción del Esquema de White - Kauffmann – Le Minor Sobre la base de los componentes antigénicos somáticos O y flagelares H se ha establecido lo que se denomina el Esquema de White – Kauffmann – Le Minor, que agrupa a todas las serovariedades conocidas.

El esquema está conformado por cuatro columnas: Primera columna: indica el nombre de la serovariedad, si la misma pertenece a

S. enterica subesp. enterica (I) ó las siglas S. II, S. IIIa, S. IIIb, S. IV, S. V, S. VI; indicando que la serovariedad considerada pertenece a la subespecie II ó III a, etc. Segunda columna: Antígenos somáticos (O). Los números indican el ó los factores del antígeno O y se escriben, separados por una coma. Las serovariedades son agrupadas en grupos somáticos, cada uno de ellos caracterizado por un factor O mayor. Así se determinan los grupos A, B, C, etc. Por ej. el grupo O:2 (A) está integrado por S. Paratyphi A (1,2,12:a:-) entre otras, el grupo O:4 (B) por S. Typhimurium (1,4,5,12:i:1,2); S. Agona (1,4,12:f,g,s:- ); S. Saintpaul (1,4,5,12:e,h:1,2), entre otras, etc. El Esquema de Kauffmann-White presenta 67 grupos O, desde el grupo A hasta el Z y luego continúa con números, desde el O:51 hasta el O:67 Tercera y cuarta columna: Antígenos flagelares (H). Se indican los factores de las fases 1 y 2, del antígeno H, respectivamente. Para la fase 1 los factores se denominan con letras minúsculas, seguidas algunas veces por un número que figura como subíndice y para la fase 2 se emplean en general números arábigos, aunque también se utilizan letras minúsculas. Un signo "negativo" indica que la fase considerada está ausente y por lo tanto la serovariedad es monofásica. Los símbolos para los factores somáticos determinados por conversión fágica están subrayados (por ej. 1,2,12) [ ] = los factores O ó H entre corchetes, no subrayados, pueden estar presentes o ausentes sin relación con la conversión fágica. Por ej. factor [5] del grupo O:4 (B). Cuando los factores H

están entre corchetes significa que ellos se encuentran

excepcionalmente en cepas salvajes.

Ejemplos: Salmonella Enteritidis

1, 9,12:g,m:El Ag O es 1, 9,12; el Ag H (fase 1) es g,m; El Ag H (fase 2)es -; la fase 2 está ausente, por lo tanto la serovariedad es monofásica.

Salmonella Typhimurium 1, 4,5,12:i:1,2 El Ag O es 1,4,5,12 ; el Ag H (fase 1) es i ; el Ag H (fase 2) es 1,2; las dos fases flagelares están presentes, por lo tanto la serovariedad es difásica. Salmonella Hadar

6,8:z10:e,n,x

Salmonella Typhi

1, 9,12[Vi]:d:-

ESQUEMA DE WHITE – KAUFFMANN – LE MINOR (*)

Materiales y equipamiento •

Estufa de cultivo a 37ºC

•

Heladera a 4ºC

•

Baño de agua a 50ºC

•

Ansas

•

Tubos de ensayo

•

Tubos de 13x100 mm con tapa a rosca

•

Tubos de Craigie

•

Cajas de Petri

•

Láminas de vidrio de 20x20 cm

•

Pipetas de 5 ml

•

Gradillas

•

Mecheros

•

Lámparas para leer aglutinaciones

•

Palillos de madera

Medios •

Estrías de Agar Tripticasa de Soja (TSA)

•

Caldo Tripticasa de Soja (TSB)

•

Agar Movilidad (Swarm agar)

•

Medio de Craigie

•

Agar sangre (sangre de caballo 5-10%v/v)

•

Agar Mueller-Hinton

Reactivos y Soluciones •

Antisueros diagnósticos O y H

•

Solución salina al 2%

•

Solución fisiológica formolada al 1%

Cepas bacterianas Cepas de Salmonella spp. en agar TSA, cultivos de 18 horas a 37ºC

Esquema de White - Kauffmann – Le Minor (Grimont, P.A.D. & Weill F.X., 9ª Ed, WHO Centre for Referente and Research on Salmonella, Instituto Pasteur, París, Francia, 2007).

2.3.1- SEROTIPIFICACIÓN SOMÁTICA O Procedimiento

Comentario

Dia 1 Serotipificación somática O • La determinación del antígno O de

• La detección de los antígenos somáticos

Salmonella spp. se hace en lámina a partir

se realiza por aglutinación en lámina. Los

de un cultivo en agar TSA, incubado a 37ºC

anticuerpos en el suero específico aglutinan

por 18-24 horas

con

la

bacteria

correspondiente

cuando está

el

antígeno

presente.

Es

importante que el aislamiento esté en forma lisa. • Verificar que el cultivo se encuentre en

• La aglutinación con solución salina al

forma lisa:

2% debe dar negativa

- Mezclar una ansada de cultivo puro se mezcla con una gota de solución salina al 2%, cuidadosamente con un palillo. Rotar suavemente la lámina, durante 2 minutos. Observar la presencia o ausencia de grumos: a) Si hay grumos la cepa está rugosa.

• Para revertir la rugosidad se deben realizar subcultivos de la cepa en agar sangre o en agar Mueller Hinton, de manera de recuperar la forma lisa

y poder

continuar con la serotipificación somática O. • Si no es posible la reversión de la forma rugosa a la lisa, se debe confirmar su identificación bioquímica y realizar la seropitificación flagelar H.

b) Si no presenta grumos se realiza la serotipificación somática O • Enfrentar sobre una lámina de vidrio una

• Estos polivalentes comprenden el 98%

ansada del cultivo en agar TSA, con una

de las serovariedades aisladas del hombre y

gota de los antisueros polivantes OS-A y

de los animales. Estos antisueros cumplen

OS-B. Mezclar cuidadosamente con un

la función de una primera selección en

palillo.

lámina,

grandes grupos. Si la aglutinación no ocurre

durante 2 minutos, para favorecer la

con los polivalentes OS-A y OS-B puede

reacción antígeno-anticuerpo y

ser:

Mover

suavemente

la

observar

presencia o ausencia de aglutinación, con

a) Una serovariedad no comprendida

luz indirecta.

en dichos antisueros, en tal caso remitir la cepa al Laboratorio de Referencia b) Una serovariedad que presente antígeno de envoltura Vi (S. Typhi, S. Paratyphi C y algunas cepas de S. Dublin). En este caso se debe enfrentar el cultivo con el antisuero Vi

• Si hay aglutinación con alguno de los dos antisueros polivalentes, probar los antisueros de grupo O correspondientes. • Si hay aglutinación con un antisuero de grupo O, probar los antisueros de factores O • Lectura e interpretación de resultados Registrar el grado de aglutinación de la siguiente manera: • 4+: 75 a 100% de microorganismos aglutinados • 3+: 75% aproximadamente de microorganismos aglutinados

• 2+: 50% aproximadamente de microorganismos aglutinados • 1+: menos de 2% de microorganismos aglutinados • Negativo: ausencia de aglutinación. Se observa una suspensión homogénea. • Registrar los resultados tanto negativos como positivos para los antígenos O estudiados, en la Planilla 3 - Registro de Resultados: Serotipificación Somática de Cepas de Salmonella.

2.3.2- SEROTIPIFICACIÓN FLAGELAR H Procedimiento

Comentario

Día 1 Serotipificación flagelar H • Sembrar la cepa de Salmonella spp. en 5

• La detección de los antígenos flagelares

ml de caldo flagelar e incubar a 37ºC,

H se realiza por aglutinación en tubo o en

durante 18-24 horas.

placa dependiendo de las características de los antisueros. En este protocolo se describe la aglutinación en tubo, ya que los antisueros están preparados por el productor para realizar la aglutinación en tubo.

Día 2 • Separar del caldo flagelar una alícuota de 0.5 ml en un tubo estéril de 13x100 con tapa a rosca. • Agregar al caldo flagelar restante 5 ml de solución fisiológica formolada al 1% (caldo formolado) y dejar reposar durante 1 hora a temperatura ambiente

• Colocar en 4 tubos de ensayo una gota de cada uno de los antisueros flagelares polivalentes (HS-1, HS-A, HS-B y HS-C) y agregar a cada tubo 0.5 ml del caldo formolado. • Incubar 1 hora a 50ºC en baño de agua y

• La

registrar la presencia o ausencia de flóculos

apariencia flocular, menos compacta que la

con luz indirecta.

aglutinación

aglutinación

flagelar

somática.

tiene

Su

una

estructura

tridimensional no es estable, por lo tanto no se deben agitar los tubos luego de la incubación a fin de no disgregar los flóculos. • Si hay aglutinación, con uno o dos de los

• Si la cepa de Salmonella spp., de la cual

antisueros flagelares polivalentes, enfrentar

se ha identificado el antígeno O, no

el caldo formolado, con los antisueros de

reacciona con ninguno de los antisueros

fase H correspondientes (una gota del

flagelares polivalentes, hay que tener en

antisuero más 0,5 ml del caldo formolado)

cuenta: a) La cepa puede presentar un antígeno no

• Si el antisuero de fase flagelar está

incluido en los antisueros polivalentes,

compuesto por más de un factor (por ej.

en este caso debe ser remitida al

1,2),

Laboratorio

determinar

los

factores

H

correspondientes, utilizando los antisueros de factores específicos

de

Referencia,

para

completar su serotipificación b) Se puede tratar de una cepa inmóvil, por la ausencia de flagelos c) Se puede tratar de una cepa con movilidad reducida. En este caso se debe exaltar la movilidad por pasajes sucesivos en tubos Craigie o en tubo en U con agar movilidad al 0.5%

• Si el cultivo aglutina con un solo antisuero polivalente flagelar, puede ser: a) Que se

trate

de

una serovariedad

monofásica b) Que sea una serovariedad difásica, de acuerdo al Esquema de KauffmannWhite,

por

los

resultados

de

la

aglutinación O y únicamente se expresa una sola fase H, por lo tanto hay que poner en evidencia la fase no detectada, usando el “Método de inversión de fase”. Método de Inversión de Fase

• Es un método que permite poner en

Puede realizarse de formas difrentes: en

evidencia,

placa de Agar Swarn o en Tubo de Craigie,

difásicas, la fase que no se expresó. Para

según se describe a continuación

ello

se

en

caso

inmoviliza

de

la

serovariedades

fase

flagelar

establecida previamente con el antisuero Procedimiento de inversión de fase en placa de Agar Swarm (Método Sven Gard) • Fundir 10 ml Agar Swarm o Agar

correspondiente a esa fase flagelar. Se trata

Blando y dejar enfriar a 40-45ºC.

flagelar no expresada hasta ese momento.

• Mezclar en una caja Petri de 60mm 2

• Si el cultivo no migra del lugar de

gotas (50µl) del antisuero para inversión de

inoculación después de 15 días, la segunda

fase correspondiente la fase H previamente

fase no se expresa. En este caso, varias

detectada con 10ml del Agar Swarm o Agar

colonias (3-5) del cultivo original deben ser

Blando

estudiadas.

• Homogeneizar mezclando suavemente

• Si se observa motilidad, pero la segunda

por rotación y dejar solidificar. Secar a 37ºC

fase no es detectada, es necesario duplicar la

con la tapa parcialmente abierta para

concentración del antisuero para inversión

asegurarse que no queden gotas de agua en

de fase.

la superficie • Inocular una ansada de un cultivo de 1824hs en uno de los bordes de la placa • Incubar a 37°C, 18-24 horas

de

un

método

de

selección

de

los

microorganismos que presentan la fase

Día 3 • Transferir el crecimiento del borde opuesto al sitio de inoculación a un caldo TSB para realizar la serotipificación flagelar en tubo (Ver Día 2).

Procedimiento de inversión de fase en tubo de Craigie • Fundir el medio de un tubo de Craigie y dejar enfriar y dejar enfriar a 40-45°C. • Agregar

2 gotas (50µl) del antisuero

para inversión de fase correspondiente la fase H previamente detectada. • Mezclar suavemente por rotación y dejar solidificar. • Inocular con un ansa de punción o rulo levemente por debajo de la superficie del tubo interior (0,5 cm). • Incubar a 37°C durante 18-24.

Día 3 • Transferir el crecimiento que haya migrado desde el interior del tubo hacia la superpie externa a un caldo nutritivo (TSB) y realizar la determinación de la segunda fase flagelar por aglutinación en tubo. (Ver Día 2). • Lectura e interpretación de resultados Registrar el grado de aglutinación de la siguiente manera: • 4+: 75 a 100% de microorganismos aglutinados y el sobrenadante es un líquido

claro • 3+: 75% aproximadamente de microorganismos aglutinados y el sobrenadante es un líquido ligeramente turbio • 2+: 50% aproximadamente de microorganismos aglutinados y el sobrenadante es un líquido moderamente turbio • 1+: menos de 2% de microorganismos aglutinados y el sobrenadante es turbio • Negativo: ausencia de aglutinación, caracterizada por una suspensión homogénea. • Registrar los resultados tanto negativos como positivos para los antígenos H estudiados, en la Planilla 4 - Registro de Resultados: Serotipificación Flagelar de Cepas de Salmonella spp. • Identificación de la serovariedad Combinando

los

antígenos

O

y

H

identificados se determina la serovaridad de acuerdo

con

el

Esquema

de

White-

Kauffmann- Le Minor.

Ver Procedimientos Inversión de Fase: Swarm Agar y Tubo de Craigie (Figura 2) Ver Flujograma de Serotipificación (Figura 3)

FIGURA 2.- Procedimientos de Inversión de Fase: Swarm Agar y de Tubo de Craigie

Procedimiento Agar Swarm

Siembra del inóculo

Procedimiento Tubo de Craigie

Recolección del desarrollo

Siembra del inóculo Recolección del desarrollo

FIGURA 3.- FLUJOGRAMA DE SETROTIPIFICACIÓN DE Salmonella spp. Cepa con características bioquímicas de Salmonella spp.

Serotipificación somática (aglutinación en lámina)

Estría en TSA

Serotipificación flagelar (aglutinación en tubo)

Aglutinación con solución fisiológica

Caldo Tripticasa de soja

Negativa

Aglutinación c/ antisueros poliv. flagelares H (4)

Positiva

Aglutinación c/ antisueros poliv. somáticos (1)

Cepa Rugosa (2)

Negativa (3) Positiva

Negativa (5)

Positiva

Aglutinación con antisueros de fases H / factores H (6) Inversión de Fase (Si es(Si necesario) Inversión de Fase es

Aglutinación c/ antisueros Positiva de grupo O

Positiva

Aglutinación c/ antisueros de factores O

Positiva

RESULTADO FINAL

(1) Antisueros polivalentes somáticos: OS-A y OS-B (2) Para revertir una cepa de la forma rugosa a lisa, se realizan subcultivos en agar sangre o Mueller Hinton. Si no es posible revertir la rugosidad, se debe confirmar la identificación por pruebas bioquímicas y realizar la serotipificación flagelar H. (3) Ver Consideraciones a tener en cuenta en "Serotipificación somática" (4) Antisueros polivalentes flagelares: HS-1; HS-A; HS-B; HS-C (5) Ver Consideraciones a tener en cuenta en "Serotipificación flagelar”. (6) Si la serovariedad de Salmonella es difásica y sólo expresa una fase, realizar "Método de inversión de fases"

CAPÍTULO III - MEDIOS DE CULTIVO Y SOLUCIONES Descripción y Preparación La mayoría de los medios de cultivo se encuentran disponibles comercialmente

Caldo Selenito Para el enriquecimiento selectivo de Salmonella en materia fecal, orina y tejidos infectados, incluída Salmonella Typhi, pero no sirve para Shigella. El selenito inhibe el crecimiento de coliformes intestinales y enterococos, principalmente en las primeras 6 a 12 horas de incubación. No son inhibidos Salmonella, Proteus, Pseudomonas. Los componentes del medio son: peptona o triptona 5 g, lactosa 4 g, selenito de sodio 4 g, fosfato dipotásico (K2HPO4) 3,5 g, fosfato monopotásico (KH2PO4) 6,5 g. Disolver los componentes en 1000 ml de agua destilada calentando hasta 60ºC si es necesario y esterilizar por filtración. NO AUTOCLAVAR Si se observa un color rojo ladrillo de selenito precipitado, el medio no se debe utilizar. El material sólido se inocula directamente en el caldo, el material líquido se debe mezclar en una relación 1:1 con caldo a doble concentración. Se incuba 24 horas a 37ºC. El pasaje a medios selectivos se puede hacer al cabo de 6 a 12 horas.

Caldo Tetrationato Es un caldo que se usa para el enriquecimiento selectivo de Salmonella, excepto para S. Typhi, S. Pullorum y S. Gallinarum. El tetrationato junto con el tiosulfato inhibe los coliformes, mientras que las bacterias reductoras de tetrationato como Salmonella y Proteus pueden crecer sin dificultad. Las sales biliares inhiben a todos los micoorganismos intestinales acompañantes y el verde brillante inhibe la flora gram positiva. Solución de verde brillante: se disuelve 0,1 g del colorante en 100 ml de agua destilada estéril. Solución de iodo-ioduro de potasio: se disuelven en 16 g de yodo y 20 g de yoduro de potasio en 80 ml de agua destilada estéril. Los componentes del medio son: extracto de carne 0,9g, peptona 4,5 g, extracto de levadura 1,8 g, cloruro de sodio 4,5 g, carbonato de calcio 25 g, tiosulfato de sodio 40,7 g, sales biliares 4,75 g, solución de verde brillante 1:1000 10 ml, solución de iodo-ioduro de potasio 20 ml. Se disuelven los componentes 1000 ml de agua destilada estéril con agitación.

Se agrega en forma aséptica la solución de verde brillante y luego la solución de iodo-ioduro de potasio. Se ajusta el pH a 7,4-7,8 a 25ºC. El caldo se guarda en heladera. NO AUTOCLAVAR. El caldo preparado y listo para usar debe ser utilizado el mismo día de su preparación.

Medio de Craigie Los componentes del medio son: caldo nutritivo 8 g, extracto de levadura 2 g, NaCl 5 g, KNO3 1 g, Agar-Agar 2,5 g, Disolver los componentes en 1000 ml de agua destilada con ebullición hasta disolución completa. Se fracciona en volúmenes de 6 ml de medio y se agrega un tubo de Craigie, en tubos de 16x150. Se autoclava a 121ºC por 15 minutos.

Solución Fisiológica Se disuelve 8,5 g de cloruro de sodio en 1000 ml de agua destilada, ajustar a pH 7 y autoclavar a 121ºC por 20 minutos.

Agar Movilidad (Swarm Agar) Los componentes del medio son: extracto de levadura 1 g, extracto de carne 5 g, caldo tripticasa de soja 30 g, agar-agar de 7,5 g dependiendo de la dureza deseada. Los componentes se disuelven en 1000 ml de agua destilada calentando si es necesario. Se ajusta el pH a 7,4 y se autoclava a 121ºC por 15 minutos.

Agar Nutritivo Los componentes del medio son: extracto de carne 3 g, peptona 5 g, agar 12 a 18 g. Disolver los componentes en 1000 ml de agua destilada con ebullición si es necesario, autoclavar a 121ºC por 20 minutos, ajustar el pH a 7 luego de esterilizar.

Agar Mueller-Hinton El medio contiene: extracto de carne 2 g, hidrolizado ácido de caseína 17,5 g, almidón 1,5 g, agar 17. Disolver los componentes en 1000 ml de agua destilada calentando si fuera necesario, ajustar el pH a 7,2-7,4 y autoclavar a 110ºC por 20 minutos.

Agar EMB Es un medio selectivo y diferencial para el aislamiento de bacterias patógenas intestinales gram-negativos. El contenido de lactosa y sacarosa hace posible la diferenciación

de Salmonella y Shigella lac/sac (-), de la flora acompañante lac (-)/lac (+) (Proteus vulgaris, Citrobacter, Aeromonas hydrophila). La combinación de colorantes es la que permite diferenciar entre los fermentadores y no fermentadores de lactosa. La sacarosa se incluye porque algunos coliformes la fermentan más rápido que a la lactosa. El desarrollo de las bacterias gram-positivo está inhibido por los colorantes del medio (eosina amarilla y azul de metileno). Agar EMB Levine contiene solamente lactosa. Los componentes del medio son: peptona 10 g, fosfato dipotásico (K2HPO4) 2 g, lactosa 5 g, sacarosa 5 g, eosina amarilla 0,4 g, azul de metileno 0,07 g. Disolver los componentes en 1000 ml de agua destilada y autoclavar a 121ºC por 15 minutos.

Aspecto de las colonias Salmonella, Shigella

transparentes, ámbar rosado

Escherichia

violáceas con brillo metálico y centro negro azulado

Enterobacter, Klebsiella

más grandes que las anteriores, mucosas sin brillo metálico y centro oscuro.

Bacterias lac (+)

negras o centro oscuro, halo transparente

Bacterias lac (+) o sac (-)

incoloras

Agar MacConkey Es un medio selectivo y diferencial para aislar microorganismos fermentadores y no fermentadores de lactosa. Sirve para aislar Salmonella, Shigella, y coliformes de materia fecal, orina, alimentos y aguas residuales. Es un medio de baja selectividad para usar con inóculos pequeños. Las sales biliares y el cristal violeta inhiben microorganismos gram-positivo. La presencia de lactosa permite el desarrollo de las cepas lac (+) que se manifiesta por el viraje del indicador debido a la producción de ácido; luego se absorbe el rojo neutro dando color rojo a la colonia y un halo turbio por la precipitación de las sales biliares por la acidez del medio. Las bacterias no fermentadoras de lactosa (S. Typhi, S. Paratyphi, Shigella dysentariae) no alteran el medio, dando colonias incoloras y transparentes. Para detectar S. Typhi hay que usar medio MacConkey con agar SS y agar bismuto sulfito. Los componentes del medio son: peptona 1,7 g, proteosa-peptona 3,0 g, lactosa 10 g sales biliares 1,5 g, rojo neutro 0,03 g, cristal violeta 0,001g, cloruro de sodio 5 g. Disolver

los componentes en 1000 ml de agua destilada, calentando si es necesario, ajustar a pH 7,1 y esterilizar a 121ºC, durante 15 minutos.

Aspecto de las colonias Salmonella, Shigella

incoloras, medio amarillo

Escherichia

rojas, halo turbio

Enterobacter, Klebsiella

grandes, rosadas a rojo, mucosas

Proteus

Incoloras

Agar SS Es un medio selectivo para Salmonella y Shigella a partir de materia fecal, alimentos y animales; pero no es el ideal para Sh. dysenteriae y Sh. boydii. Sirve también para Y. enterocolitica y para diferenciar fermentadores de lactosa de los no fermentadores. La presencia de verde brillante, bilis de buey, alta concentración de tiosulfato y el citrato inhiben la flora acompañante. El tiosulfato y la sal de hierro ponen en evidencia la formación de sulfuro de hierro. La degradación de la lactosa a ácido provoca el viraje del indicador rojo neutro a rojo. Los componentes del medio son: extracto de carne 5 g, proteosa-peptona 5 g, lactosa 10 g, citrato de hierro amoniacal 1 g, tiosulfato de sodio 8,5 g, sales biliares 8,5 g, verde brillante 0,003 g, rojo neutro 0,025 g, agar 13,5 g. Disolver los componentes en 1000 ml de agua destilada calentando hasta disolución de los mismos. NO AUTOCLAVAR Aspecto de las colonias Salmonella

incoloras, transparentes, centro negro

Shigella

incoloras, transparentes, medio amarillo

Proteus

transparentes, centro rojo, medio amarillo

Escherichia coli

rosadas a rojo, medio rojo

Enterobacter aerogenes

rosadas a crema, opacas, mucosas

Bacterias lactosa (+)

rojizas, mucoides, centro negro

Agar Hektoen Es un medio selectivo para bacterias intestinales, incluídas algunas shigellas. No tiene efecto inhibidor sobre Salmonella y Shigella pero si sobre flora acompañante. Debido a los dos indicadores (azul de bromotimol y fucsina), las colonias lac+ tienen una diferencia cromática

con las colonias lac-; lo mismo ocurre con bacterias fermentadoras de sacarosa y salicina. El tiosulfato con el hierro dan coloración negra a las colonias sulfídrico+. Las sales biliares inhiben a la flora acompañante. Puede agregarse novobiocina para inhibir Citrobacter y Proteus. Los componentes del medio son: peptona 15 g, extracto de levadura 3 g, sacarosa 14 g, lactosa 14 g, salicina 2 g, tiosulfato de sodio 5 g, citrato de hierro amoniacal 1,5 g, sales biliares 2 g, azul de bromotimol 0,05 g, fucsina ácida 0,08 g, agar 13,5 g. Disolver los componentes en 1000 ml de agua destilada estéril. NO AUTOCLAVAR.

Aspecto de las colonias Shigella, Providencia verdes, planas, transparentes Salmonella, Proteus

verde-azuladas, c/s centro negro

Pseudomonas

verde-azuladas, planas, borde irregular

Coliformes

salmón, halo de precipitación

Agar Verde Brillante Excelente medio de gran selectividad para el aislamiento de Salmonella a partir de materia fecal; pero no puede usarse para aislar S. Typhi. Los fermentadores de lactosa o sacarosa que pueden crecer en este medio se diferencian rápidamente debido a la formación de colonias verde-amarillentas, rodeadas de una zona de igual color. Esto se debe a la fermentación de los azúcares que produce acidez, haciendo virar el indicador (rojo fenol) a amarillo. En medio alcalino se observa un color rojo intenso. El verde brillante inhibe microorganismos gram-positivo, S. Typhi y Shigella. Para inhibir Proteus se recomienda agregar 0,2% de desoxicolato de sodio. La selectividad del medio permite usar inóculos densos. Si se exceden los 15 minutos de esterilización a 121ºC, disminuye la selectividad del medio. Los componentes del medio son: proteosa-peptona 10 g, lactosa 10 g, sacarosa 10 g extracto de levadura 3 g, rojo fenol 0,09 g, verde brillante 0,0047 g, agar 12 g. Disolver los componentes en 1000 ml de agua destilada hasta ebullición y mantener por 1 minuto; ajustar a pH 6,7-7,1. NO AUTOCLAVAR

Aspecto de las colonias Salmonella a veces Proteus y Citrobacer rosa pálido, transparentes E. coli, Enterobacter

verde-amarillo

Klebsiella, Bacterias lactosa (+)

opacas, halo verde-amarillo

Agar XLD Es un medio de selectividad moderada a alta que permite ser usado para aislamiento de Salmonella y Shigella. La degradación de xilosa, lactosa y sacarosa produce acidez que hace virar el indicador al amarillo. El tiosulfato y la sal de hierro ponen en evidencia la producción de ácido sulfídrico. La decarboxilación de la lisina a cadaverina se visualiza por la presencia de un color rojo púrpura por aumento del pH. El desoxicolato inhibe gram-positivo. La diferenciación de Salmonella/Shigella de otras enterobacterias se basa en tres reacciones: fermentación de xilosa, decarboxilación de lisina y producción de sulfídrico. La xilosa diferencia Shigella de Providencia que no fermenta xilosa o lo hace muy lentamente; la lisina diferencia Salmonella de los fermentadores de xilosa no patógenos. La lactosa y la sacarosa en exceso evitan que los coliformes lis+ reviertan la condición alcalina de los microorganismos consumidores rápidos de xilosa/lisina. La producción de sulfídrico ocurre en condiciones alcalinas dando colonias con centro negro; en condiciones ácidas la precipitación negra se inhibe. Los componentes del medio son: extracto de levadura 3 g, xilosa 3,75 g, lactosa 7,5 g, sacarosa 7,5 g, l-lisina hidrocloruro 5 g, desoxicolato de sodio 1 g, tiosulfato de sodio 6,8 g, citrato de hierro amoniacal 0,8 g, rojo fenol 0,08 g,cloruro de sodio 5 g, agar 15 g. Disolver los componentes en 1000 ml de agua destilada. Calentar hasta que comience a hervir (no sobrecalentar); llevar a baño de 50ºC siempre con agitación. Ajustar el pH a 7,4±,.2 a 25ºC. Guardar a 4ºC por 14 días, en la oscuridad. El precipitado que ocasionalmente presenta el medio no perjudica su rendimiento, puede eliminarse por filtración.

Aspecto de las colonias

E. coli, Enterobacter

amarilla, opacas, con precipitado

Aeromonas

amarilla, opacas, con precipitado

Klebsiella

amarilla, opacas, mucosas, c/precipitado

Citrobacter

amarilla, opacas, centro negro

Serrati, Hafnia

amarilla, opacas

P. vulgaris, P. mirabilis

amarilla, translúcidas, centro negro

Salmonella

igual color del medio, centro negro

Shigella, Providencia

igual color del medio, translúcidas

S. Typhi

amarilla, ligeramente opacas

CAPÍTULO IV - PLANILLA DE RESULTADOS PLANILLA 1 – REGISTRO DE RESULTADOS: AISLAMIENTO DE Salmonella spp. MORFOLOGIA EN PLACAS DE AGAR SELECTIVO Fecha: Nombre: Muestra: ____________ Color Morfología en MC

Morfología en SS

Morfología en XLD

De Selenito: Morfología en MC Morfología en SS

Resultados

Comentarios

PLANILLA 2 – REGISTRO DE REDULTADOS: AISLAMIENTO DE Salmonella spp. PRUEBAS BIOQUÍMICAS Fecha: Nombre: Muestra:

_________

Color

Resultados

TSI Botón TSI Estría TSI Gas TSI H2S LIA Botón LIA Estría LIA H2S Hidrólisis de urea Lisina decarboxilasa Ornitina decarboxilasa Arnina dehidrolasa Reacción deβ-galactosidasa Reacción de Voges-Proskauer Reacción de indol Agar SIM (H2S) Agar SIM (Indol) Agar SIM (Movilidad) Fermentación de Dulcita Utilización del Molonato

Resultado general: ______________________________________

Comentarios

PLANILLA 3 – REGISTRO DE RESULTADOS: SEROTIPIFICACIÓN SOMÁTICA DE CEPAS DE Salmonella spp.

Fecha: Nombre:

_____

Muestra: ________________

OSA

OMB

OMC

OMD

OME

OMF

OSA

1,2,12

4,5,12

9,12

9,46

3,10

3,15

1,3,19

21

OSB

6,7,8

6,7

6,8

13,22

13,23

6,14,24

6,14

8,20

11

OSC

16

17

18

28

30

OSD

35

38

39

40

41

43

44

45

OSE

47

48

50

51

52

OSF

Control

42

PLANILLA 4 – REGISTRO DE RESULTADOS: SEROTIPIFICACIÓN FLAGELAR DE CEPAS DE Salmonella spp.

Fecha: Nombre:

_________

Muestra: ______________ HSA

HSB

HSC

HS1

Control

HSA

a

B

c

d

i

z10

Z29

HSB

e,h

e,n,x

e,n,z15

f.g

g,m

g,p

m,t

HSC

k

l,v

l,w

r

y

Z

z4,z23

HS1

1,2

1,5

1,6

1,7

z6

HSA

HSB

HSC

HSD

HS1

HSA

a

b

c

d

i

z10

z29

HSB

e,h

E,n,x

e,n,z15

f.g

g,m

g,p

m,t

HSC

k

l,v

l,w

r

y

Z

z4,z23

HS1

1,2

1,5

1,6

1,7

z6

Control

PLANILLA 5 – REGISTRO DE RESULTADOS: SEROTIPIFICACIÓN DE CEPAS DE Salmonella spp. Fecha;________________ Nombre: ___ Antígeno O

Antígeno H

Muestra: ________________

A-67

A-I

Gr. A

Gr. B

Gr. C

Gr. D

Gr. A

O:1

O:2

O:12

Gr. B

O:1

O:4

Gr. C

O:6

Gr. D

Gr. E

O:5

O:12

O:27

O:7

O:8

O:14

O:20

O:1

O:9

O:12

O:46

Gr. E

O:1

O:10

O:15

O:19

H:H(az)

H:L

H:G

H: no específico

H:L

H:lv

H:v

H:w

H:z13

H:z28

H:G

H:f

H:g

H:s

H:t

H:m

H:p

H: no específico

H:2

H:5

H:6

H:7

H:z6

Gr. B

H:a

H:b

H:c

H:d

H:eh

H:i

Gr. C

H:a

H:b

H:c

H:eh

H:r

H:h

H:x

H:z15

H:z23

H:z24

H:z32

O:34

Fórmula Antigéncia: ________________________ Serovariedad: __________________

H:q

PLANILLA 6 – REGISTRO DE RESULTADOS: SEROTIPIFICACIÓN DE CEPAS DE Salmonella spp.

Fecha: Nombre:

_____

Muestra: ________________

O:5

O:9

O:10

O:15

O:19

O:27

O:34

O:46

O:7

O:8

O:20

O:22

O:23

H:h

H:x

H:z15

H:m

H:p

H:s

H:t

H:f

H:v

H:w

H:z23

H:z24

H:z32

H:z13

H:z28

H:2

H:5

H:6

H:7

H:q

H:u

Fórmula Antigéncia: _______________________ Serovariedad: ___________________

REFERENCIAS 1. Abbot, Sh. (1999). Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter and Serratia. En Manual of Clinical Microbiology. Murray, P., Baron, E.J., Pfaller, M.A., Tenover, F.C., Yolken, R.H. (ed.) 7th Edition. Chapter 29, 475 - 482. American Society for Microbiology. Washington D.C. 2. Bopp, Ch.A., Brenner, F.W., Wells, J.G., Strockbine, N.A. (1999). Eschericia, Shigella and Salmonella. En Manual of Clinical Microbiology. Murray, P., Baron, E.J., Pfaller, M.A., Tenover, F.C., Yolken, R.H. (ed.) 7th Edition. Chapter 28, 459 - 474. American Society for Microbiology. Washington D.C. 3. Ewing, W.H. (1986). Edwards and Ewing's Identification of Enterobacteriaceae, 4th. Edition. Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York. 4. Farmer, J. J. et al. (1985). Biochemical identification of new species and biogroups of Enterobacteriaceae isolated from clinical specimens. J. Clin. Microbiol. 21(1): 46-76. 5. Farmer, J. J., Wells, J. G., Griffin, P. M., Wachsmuth, I. K. (1987). Enterobacteriaceae Infections, from Diagnostic Procedures for Bacterial Infections, 7th Ed., cap. 14, 233296, Am. Public Health Assoc., Inc. Washington, D.C. 6. Farmer III, J.J. (1999) Enterobacteriaceae: Introduction and identification. En Manual of Clinical Microbiology. Murray, P., Baron, E.J., Pfaller, M.A., Tenover, F.C., Yolken, R.H. (ed.) 7th Edition. Chapter 27, 442 - 458. American Society for Microbiology. Washington D.C. 7. Holmes, B., Aucken, H.M. (1998). Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Serratia and others members of the Enterobacteriaceae. En Microbiology and Microbial Infections. 9th Edition. Ballows,A.; Duerden,I.B. (ed.) Vol. 2 Systematic Bacteriology . Chapter 42. Oxfort University Press,Inc, New York, N.Y. 8. Le Minor, L., Veron, M., Popoff, M. (1982). Proposition pour une nomenclature des Salmonella. Ann. Microbiol (Inst. Pasteur) 133B: 245-254. 9. Le Minor L., M. Popoff, B. Laurent, D. Hermant. (1986). Individualisation d'une septieme sous-espece de Salmonella: Salmonella cholerasuis subsp. indica subsp., nov. Ann. Microbiol. (Inst. Pasteur), 137B: 211-217. 10. Le Minor, L., Richard, C. (1993) Méthodes de laboratoire pour l´identificaction des Entérobacteries. Institut Pasteur, Paris, France.

11. Mac Fadin, J.F. (1980). Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica. Ed. Panamericana. 12. Manual de Laboratorio de Infecciones Entéricas Agudas (1983). Organización Panamericana de la Salud. Oficina Regional dela OMS. Ed. Española. 13. Miller, S.I., Hohmann, E.L., Pegues, D.A. (1995). Salmonella (Including Salmonella Typhi) En Principles and Practice of Infectious Diseases. Mandell, G.L., Douglas and Bennett´s (ed.) 4th Edition. Chapter 200. De. By Mandell, G.L. M.D.; Bennet,J.E. MD.; Dollin, R. M.D. 14. Peluffo, C. (1973). Salmonella: Método simplificado de diagnóstico serológico. Oficina Sanitaria Panamericana. Oficina Regional de la OMS. 15. Wray, C., Wray, A. (2000). Salmonella in domestic animals. CABI Publishing 16. Grimont, P.D.A. & Weill F.X., (2007). Antigenic formulas of the Salmonella serovars, 9th edition. World Health Organization, Centre for Reference and Research on Salmonella. Institut Pasteur, Paris.

DIAGNOSTICO Y CARACTERIZACIÓN DE Shigella spp. CAPÍTULO I – INTRODUCCIÓN Las bacterias del género Shigella, de la familia Enterobacteriaceae, son bacilos gram- negativos, de 0,3 a 1 µm de diámetro y de 1 a 6 µm de longitud, que pueden estar solos, en cadenas o de a pares. Son no móviles, no esporulados, anaerobios facultativos, oxidasa negativo, fermentan la glucosa y otros azúcares sin producción de gas, Voges-Proskauer negativo y rojo de metilo positivo. No utilizan citrato de Simmons, no producen SH2 y son lisina descarboxilasa, arginina dehidrolasa y ureasa negativos (Tabla 1). La temperatura de crecimiento óptima es 37º C. El género está formado por Shigella dysenteriae (serogrupo A); Shigella flexneri (serogrupo B); Shigella boydii (serogrupo C) y Shigella sonnei (serogrupo D). La shigellosis, infección causada por Shigella spp., está distribuida en todo el mundo, pero es endémica en países tropicales y de clima templado con mayor incidencia en verano. Es causa de infección intestinal aguda en niños pequeños. Las 2/3 partes de los casos y la mayoría de las defunciones ocurren en niños de 6 meses a 10 años. Representan también un riesgo para viajeros que se trasladan hacia áreas endémicas y son frecuentes los brotes en condiciones de hacinamiento y falta de saneamiento como cárceles, hospitales psiquiátricos, geriátricos, campamentos y a bordo de embarcaciones. Shigella tiene como únicos huéspedes al ser humano y a los primates. La enfermedad se transmite de persona a persona por la vía fecal-oral, por alimentos contaminados donde el vector de transmisión son las moscas, o por el uso de aguas contaminadas para la preparación de los mismos. La bacteria es altamente infecciosa por la ruta oral, la ingestión de tan sólo 10 a 100 organismos produce infección en voluntarios. La gravedad y la letalidad de la infección dependen de la edad de la persona, del estado nutricional, de la magnitud de la dosis infectante y del serotipo del microorganismo. Shigella dysenteriae produce la forma más severa de la enfermedad, con una tasa de letalidad del 20%. En cambio las infecciones por otras especies de Shigella se autolimitan y rara vez son fatales, excepto en huéspedes inmunocomprometidos, ancianos y niños pequeños. Shigella flexneri también puede producir disentería. Shigella sonnei puede producir brotes esporádicos por alimentos semi-cocidos o mal cocidos y aguas contaminadas. Shigella boydii se aísla con menor frecuencia que las otras tres.

Tabla 1. Propiedades Bioquímicas de Shigella spp. Ensayo o Sustrato

Resultado

Sulfuro de hidrógeno

-

Glucosa (gas)

-

Glucosa (ácido)

+

Movilidad

-

Citrato de Simmons

-

Adonitol

-

Mucato

-

Rojo de metilo

+

Voges-Proskauer

-

Arginina dihidrolasa

-

Lisine decarboxilasa

-

Ornitina decarboxilasa

Shigella sonnei (+); otras Shigella (–)

Urea (hidrólisis)

-

Fenilalanina deaminasa

-

Salicina

-

Lactosa

-

Sacarosa

-

Xilosa

-

CAPÍTULO II – AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE Shigella spp.

1.-. ESPECÍMENES Las muestras se deben obtener en el período agudo de la enfermedad, antes de iniciar el tratamiento con antimicrobianos. Para muestras humanas se puede utilizar un hisopo de algodón para recoger material mucoso o sanguinolento de la materia fecal. Las muestras que no se van a procesar en dos horas se deben mantener en medio de transporte Cary-Blair con tioglicolato que reduce la tensión de oxígeno. Este medio tiene la ventaja de ser estable hasta 18 meses después de su preparación, cuando las condiciones de almacenamiento son correctas y las muestras se pueden conservar hasta 5 días, siempre en refrigeración.

2.- PROCESAMIENTO 2.1.- AISLAMIENTO Materiales y equipamiento •

Ansas descartables (10µl)

•

Placas de Petri (9 cm diámetro) estériles

•

Balanza

•

Estufa de incubación a 37ºC

•

Mechero Bunsen

•

Pipetas para 0.1 ml (pipetas de 1 ml)

•

Hisopos de algodón

Medios •

Estrías de agar tripticasa de soja (TSA)

•

Agar hierro – tres azúcares (TSI)

•

Agar Lisina hierro (LIA)

•

Placas de agar MacConkey

•

Placas de agar E.M.B. agar

•

Placas de agar Salmonella Shigella (SS)

•

Placas de agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD)

•

Placas de agar Hektoen

Procedimiento

Comentarios

No hay un medio de enriquecimiento específico para el cultivo y aislamiento de Shigella spp. de materia fecal. Si se dispone de caldo GN de Hajna se lo puede usar para el enriquecimiento. Otra posibilidad es resuspender el hisopo con materia fecal en un caldo tioglicolato y luego estriar una placa de agar XLD.

Día 1 • Realizar la siembra en los medios SS,

• Seleccionar uno o dos de los medios

XLD, MacConkey, Hektoen, EMB, con

de aislamiento.

heces frescas suspendidas en solución salina o directamente a partir del hisopo. • Incubar las placas por 18-24 horas a 37º C

Día 2 • Seleccionar colonias convexas de 2 a 4 mm de diámetro. Leer

placas

de

SS:

colonias

translúcidas, ligeramente rosadas, a veces con un centro más oscuro. Leer

placas

de

XLD:

colonias

translúcidas con un tono rojizo. Leer placas de MacConkey: colonias translúcidas, ligeramente rosadas. Leer placas de Hektoen: colonias verdes, elevadas y húmedas.

Leer

placas

de

EMB:

colonias

translúcidas de color ambar. • Sembrar las colonias sospechosas en agar TSI, agar LIA y agar TSA. A partir de la estría en TSA se realiza la confirmación

bioquímica

serotipificación (ver día 3).

y

la

FIGURA 1.- FLUJOGRAMA DE AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA DE Shigella spp. A PARTIR HECES Camino II

Camino I MATERIA FECAL (HISOPO) Suspensión en solución fisiológica

1er. día

Aislamiento en medios selectivos y diferenciales (2)

Caldo de enriquecimiento (1)

18-24 hs, 37ºC Aislamiento en medios selectivos y diferenciales (2)

Colonias típicas (3)

2do. día TSI

Estría

LIA

18-24 hs, 37ºC

3er. día Serotip. O

Lectura (4)

Colonias típicas (3)

P. Bioq. (5) TSI

LIA

Estría 18-24 hs, 37ºC

Lectura (4)

4to. día

(7) (8)

Serotip. O

Lectura

P. Bioq. (5)

Caldo de enriquecimiento: Ver 2.1.- Aislamiento Agar MacConkey y agar SS, o agar Hektoen, o agar xilosa lisina desoxicolato, o agar eosina azul de metileno. (9) Se seleccionan de 2 a 3 colonias. (10) Si TSI y LIA dan resultados compatibles con Shigella, se siembran pruebas bioquímicas complementarias y se realiza la serotipificación somática O (Serotipo O) (11) Pruebas bioquímicas complementarias: acetato de sodio, mucato de sodio, citrato de Christensen, manita.

2.2.- IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA DE Shigella spp. Materiales y equipamiento •

Ansas descartables

•

Mechero Bunsen

•

Estufa a 37ºC

Medios •

Medio base para azúcares

•

Solución madre de Manitol 10%

•

Solución madre de Glucosa 10%

•

Solución madre de Sacarosa 10%

•

Solución madre de Salicina 10%

•

Medio base con arginina, lisina y ornitina y medio base sin agregados para control

•

Vaselina estéril

•

Discos de ONPG para ensayo de ß- galactosidasa

•

Agar SIM

•

Caldo Mucato de sodio

•

Agar Citrato de Christensen

Procedimiento

Comentarios

Día 3 • Leer los tubos de agar TSI y LIA de acuerdo a la Tabla 2 y realizar la prueba de ONPG a partir del TSI. • Del cultivo en agar TSA inocular:

• Colocar una capa de vaselina líquida

medio SIM; medios con arginina, lisina y

sobre los medios con aminoácidos y el tubo

ornitina y control; medios base con

control.

manita, glucosa, sacarosa salicina; agar acetato de sodio, caldo mucato y agar citrato de Christensen, • Incubar todas las pruebas por 18 a 24

• La

horas a 37ºC.

serotipificación se pueden realizar al

confirmación

bioquímica

y

la

• Realizar la serotipificación a partir del agar TSA (ver 2.3 Serotipificación) Dia 4 • Leer los resultados de las pruebas bioquímicas de acuerdo a la Tabla 2 y anotar los mismos en la Planilla de Resultados. • Realizar la prueba de ONPG utilizando discos de ONPG según lo indicado por el fabricante. • Realizar la prueba de indol agregando 1 ml de reactivo de Erlich al medio.

mismo tiempo.

Tabla 2. Pruebas Bioquímicas para identificación de Shigella spp. Interpretación de Resultados

Medio

Resultados

Reacciones

Negativo TSI

Producción de ácido (si la

Positivo

Base roja

Base amarilla

Estría roja

Estría amarilla

No hay burbujas

Burbujas de gas

de gas en la base

en la base

base es amarilla y la estría roja, la producción de ácido se debe a la glucosa) TSI

Producción de ácido de lactosa y/o sacarosa

TSI

Producción de gas

TSI

Producción de H2S

Sin color negro

Color negro

LIA

Producción de H2S

Sin color negro

Color negro

LIA

Reacción alcalina, color

Botón púrpura –

Botón púrpura –

violeta a través del medio.

Superficie

Superficie

Organismos que no

amarilla

púrpura

Color amarillo

Color púrpura

descarboxilan la lisina producen una estría alcalina y un fondo ácido Ensayo de

Lisina/ornitina

Aminoácidos

decarboxilasa, arginina dehidrolasa

ONPG

Β-galactosidasa

Sin color

amarillo

Medio base con

Fermentación

Azul

Rosa

Producción de indol

Anillo amarillo

Anillo rojo-

azúcares Indol

rosado

Las siguientes características pueden ayudar en la identificación de Shigella spp.: a) Los aislamientos son siempre inmóviles y lisina negativo. b) La producción de gas es rara aunque se puede observar ocasionalmente en cepas de Sh.flexneri, Sh. boydii y Sh. dysenteriae.

2.2.1.- PRUEBAS BIOQUÍMICAS DIFERENCIALES a) Entre especies de Shigella En la diferenciación de los cuatro miembros del género se deben tener en cuenta algunas propiedades bioquímicas: - Shigella dysenteriae: la mayoría de las cepas no fermentan el manitol, son

ornitina

descarboxilasa negativa y tienen propiedades bioquímicas diferenciales entre los serotipos. Particularmente, Sh dysenteriae 1 es arabinosa e indol negativo y ONPG positivo muy rápido. - Shigella flexneri: la gran mayoría de las cepas fermentan manitol y son ornitina descarboxilasa negativo. - Shigella boydii: la gran mayoría de las cepas fermentan manitol, son ornitina descarboxilasa negativo y tienen propiedades bioquímicas diferenciales entre los serotipos. - Shigella sonnei: son indol negativo, ornitina descarboxilasa positivo, ONPG positivo,y manitol positivo. Los caracteres diferenciales se resumen en Tabla 3.1 Tabla 3.1. Reacciones Bioquímicas de Shigella spp.

Sh. dysenteriae

-

-

Ornitina decarboxilasa -

Sh. flexneri

+

-

-

Sh. sonnei

+

+

+

Sh. boydii

+

-

-

Especie

D-Manitol ONPG

Tabla 3.2. Reacciones Bioquímicas de Serotipos de Shigella. Ver página 119

b) Entre Shigella spp. y Escherichia coli La diferenciación de Shigella spp. respecto a Escherichia coli es uno de los problemas con que se enfrenta el laboratorio de microbiología y refleja el hecho que E. coli y las cuatro especies de Shigella están estrechamente relacionadas sobre la base de estudios de hibridación DNA-DNA. La mejor aproximación es realizar un conjunto de pruebas bioquímicas. En “Edwards and Ewing’s Identification of Enterobacteriaceae”, 4th Ed., se sugiere realizar los ensayos que se indican en TABLA 4.

Tabla 4. Diferenciación de Shigella spp. y Escherichia coli. Ensayo Mucato Acetato Cit. Christensen Indol (producción) Lisina decarboxilasa Ornitina decarboxilasa Arginina dehidrolasa Glucosa (gas) Sacarosa Salicina Movilidad

Shigella -o+ -o+ +, (+), -, (+) -

Escherichia coli + + o (+) +, (+), + +, (+), +, (+),+, (+), + +, (+), +, (+), +ó-

+ 90% o más positivo en 1-2 días; (+) positivo tardío; - 90% o más negativo.

Las pruebas citrato de Christensen, acetato de sodio y mucato de sodio son de valor en la diferenciación de los miembros del género Shigella y Escherichia, particularmente de biotipos anaerogénicos, no móviles, porque los aislamientos que fermentan mucato o son alcalinos en agar acetato o citrato de Christensen es muy probable que sean E. coli.

2.2.2.- PRUEBAS BIOQUÍMICAS Agar Hierro Tres Azúcares (TSI) y Agar Kligler I. Principio El medio fue diseñado para determinar la habilidad de las bacterias de fermentar hidratos de carbono y producir sulfuro de hidrógeno (SH2). El medio contiene 1 parte (0,1%) de glucosa y 10 partes (1%) de lactosa y sacarosa. El indicador de pH es el rojo fenol y el sulfato ferroso pone en evidencia la formación de SH2. Si el microorganismo fermenta glucosa, tanto la punción como la estría aparecerán de color amarillo. Si el organismo fermenta lactosa y/o sacarosa, la estría permanecerá ácida (amarilla). Si no fermenta lactosa, la estría se vuelve alcalina (roja). Los organismos que no fermentan glucosa no producen cambios en el pH del medio o producirán productos alcalinos y el medio TSI permanecerá rojo. La producción de SH2 se manifiesta por un ennegrecimiento del medio.

El agar de Kligler contiene dos azúcares: lactosa (1%) y glucosa (0,1%). Este medio puede reemplazar al TSI, la diferencia entre ambos es la ausencia de sacarosa. Los fundamentos bioquímicos y la interpretación de los resultados son los mismos para ambos medios.

II. Materiales El medio está disponible comercialmente. Disolver en agua destilada y dispensar volúmenes de 5 ml en tubos con tapa a rosca; autoclavar a 121º C por 15 minutos y enfriar inclinado dejando un fondo de 5 a 10 mm. El sustrato es estable por 3 meses. Rotular indicando fecha de preparación y de expiración. Guardar en heladera; si hay cambio de color no usar.

III. Procedimiento A. Con un ansa estéril tomar material. B. Punzar el fondo en el centro. C. Retirar el ansa y estriar sobre la superficie del agar. D. Dejar la tapa floja para permitir intercambio de aire. E. Incubar a 37º C por 18 a 24 horas.

IV. Resultados A. Estría ácida/fondo ácido (amarillo/amarillo): fermentación de glucosa, sacarosa y/o lactosa (E. coli). B Estría alcalina/fondo ácido (rojo/amarillo): fermentación de glucosa solamente (Shigella spp.). C. Estría alcalina/fondo alcalino (rojo/rojo): no fermentador (Pseudomonas aeruginosa). D. Precipitado negro en el fondo: producción de SH2 (Salmonella spp). E. Burbujas o roturas: producción de gas (E. coli, Salmonella spp.).

V. Control de Calidad Bacteria Salmonella Typhi Salmonella Paratyphi A Salmonella spp. Shigella spp.

Estría

Punción

SH2

K K K K

A Ac/g A A

+ (*) + -

Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Escherichia coli Citrobacter Klebsiella Proteus vulgaris Proteus mirabilis Klebsiella pneumoniae

A A A A A A K A

Ac/g Ac/g Ac/g Ac/g Ac/g A oAc/g Ac/g o A Ac/g o A

+ +(sucio) + (sucio) -

(*) sólo en la parte superior de la punción o formación de un anillo. A: ácido; K:alcalino; c/g: cn gas

VI. Consideraciones A. Cuando se agrupan los miembros de la familia Enterobacteriaceae, las reacciones del TSI y KIA pueden variar ligeramente. Algunos no fermentadores de lactosa pueden fermentar sacarosa. B. El test se debe leer entre las 18 y 24 horas. Lecturas tempranas pueden dar falsos resultados ácido/ácido, mientras que lecturas tardías pueden dar falsos resultados alcalino/alcalino. C. Una gran producción de SH2 enmascara la reacción de la glucosa. Sin embargo la glucosa fue fermentada aunque no se vea el cambio de color. Observar si hay producción de gas. D. En el TSI, la utilización de sacarosa puede suprimir el mecanismo enzimático que resulta en la producción de SH2. Por esta razón, algunos organismos pueden demostrar producción de SH2 en KIA pero no en TSI.

Agar Lisina Hierro (LIA) I. Principio La decarboxilación de la lisina a cadaverina produce una alcalinización del medio y un viraje al violeta del indicador púrpura de bromocresol. Como la reacción tiene lugar en medio ácido, es necesaria la fermentación previa de la glucosa. Los microorganismos que no decarboxilan lisina, pero fermentan la glucosa producen un viraje al amarillo en todo el medio. La formación de SH2 produce una coloración negra debido al sulfuro de hierro producido. Las bacterias del grupo Proteus-Providencia, con excepción de Morganella morganii, desaminan la lisina a ácido α-cetocarbónico que forma compuestos pardo-rojizos en el medio de cultivo con la sal de hierro y en aerobiosis.

II. Materiales El medio está disponible comercialmente. Disolver el polvo en agua destilada y dispensar en volúmenes de 3 ml en tubos con tapa a rosca. Esterilizar a 121º C por 15 minutos. Enfriar de manera de tener estría y fondo. Guardar en heladera.

III. Procedimiento Inocular punzando el fondo y luego estriar la superficie del agar. Incubar a 37º C por 18 a 24 horas (a veces pueden ser necesarias 48 horas).

IV. Resultados Los microorganismos que descarboxilan la lisina producen un viraje al violeta. Los microorganismos que no descarboxilan la lisina y fermentan glucosa producen un viraje al amarillo. La formación de SH2 se indica por la aparición de una coloración negra.

V. Control de Calidad Bacteria

Estría

Punción

SH2

Salmonella sp.

K

K

+

Proteus mirabilis

R

A

+

Proteus vulgaris

R

A

+

Morganella morganii

K

A

-

Prov. rettgeri

R

A

-

Providencia spp.

R

A

-

Citrobacter spp.

K

A

+

Escherichia coli

K

A

-

Shigella spp.

K

A

-

Klebsiella spp.

K

A

-

A.ácido; K.alcalino; R: desaminación de la lisina Este medio no es un sustituto del método estándar de Moeller.

VI. Consideraciones Dado que decarboxilación de la lisina ocurre únicamente a pH ácido, este medio sólo puede utilizarse para diferenciar cultivos que fermenten glucosa.

Prueba Del Indol I. Principio El indol es uno de los productos del metabolismo del aminoácido triptofano. Con un medio rico en triptofano, el indol se puede detectar por su habilidad para combinarse con ciertos aldehídos para formar un compuesto coloreado. El ensayo constituye un método rápido para detectar organismos productores de indol. Como indicador de la presencia del aldehído se usa el reactivo de Erlich. Es especialmente útil en la identificación preliminar de Escherichia coli, y para diferenciar Edwardsiella (+) de Salmonella (-).

II. Materiales A. Caldo triptofano •

Peptona

20 g

•

Cloruro de sodio

5g

•

Agua destilada

1000 ml

B. Este caldo se le incorpora triptofano en una concentración del 1%. El medio se esteriliza a 121º C durante 15 minutos. Dejar enfriar antes de su empleo y guardar a 4-10ºC para su conservación. C. Reactivo de Erlich •

p-dimetilaminobenzaldehido

1g

•

alcohol etílico, 95%

95 ml

•

ácido clorhidríco, concentrado

20 ml

Se disuelve el aldehído en el alcohol (puede requerir un calentamiento suave), luego se agrega lentamente el ácido. El reactivo de color amarillo es estable por un año. Identificar el reactivo con una etiqueta y guardar refrigerado en botellas color caramelo.

III. Procedimiento A. Con un ansa tomar material de una colonia aislada e inocular el caldo que contiene triptofano. B. Incubar a 37º C por 18 a 24 horas. C. Transferir 2 ml de la suspensión de caldo a un segundo tubo. D. Agregar 5 gotas del reactivo de Erlich por la pared del tubo. E. Agitar el tubo y observar un color rosado en la interfase entre el caldo y el reactivo. F. Si el ensayo es negativo, el cultivo se debe reincubar otras 24 horas.

IV. Resultados Ensayo positivo: desarrollo de un color rojo en la interfase del reactivo y el caldo, segundos después de agregar el reactivo. Ensayo negativo: no hay cambio de color o hay un color amarillo en la interfase.

V. Control de Calidad Cualquiera de los reactivos debe ser controlado con cultivos positivos y negativos conocidos, antes de su empleo general. Como controles resultan convenientes cepas de fácil obtención y que su conservación en cultivos madre no ofrezca problemas. Escherichia coli (+); Enterobacter aerogenes (-); Klebsiella pneumoniae (-)

VI. Consideraciones A. El pH óptimo para la actividad de la triptofanasa es ligeramente alcalino (7,4-7,8). La disminución del pH provoca una reducción en la producción de indol y una reacción falsamente negativa o débilmente positiva. B. Los cultivos a los cuales se les efectúa la prueba del indol deben ser incubados aeróbicamente. El descenso en la tensión de oxígeno disminuye la producción de indol. C. No debe emplearse un medio de peptona que contenga glucosa porque la elevada acidez producida por la fermentación del azúcar puede inhibir la actividad de la triptofanasa. El agregado de triptofano estimula la producción de indol, mientras que la glucosa la inhibe.

Prueba de la β-Galactosidasa I. Principio La fermentación de la lactosa requiere dos enzimas; mientras que la permeasa facilita la penetración de la molécula de lactosa dentro de la célula bacteriana, la β-galactosidasa

hidroliza la lactosa para formar galactosa y glucosa. Las bacterias no fermentadoras de lactosa carecen de ambas enzimas; sin embargo hay bacterias que tienen β-galactosidasa pero no permeasa.

El

o-nitrofenil-β-D-galactósido

(ONPG)

es

un

compuesto

incoloro

estructuralmente similar a la lactosa. En presencia de β-galactosidasa, ONPG se rompe en galactosa y o-nitrofenil, un compuesto color amarillo. Como la familia Enterobacteriaceae se agrupa de acuerdo a su habilidad de fermentar lactosa, este test es útil en la identificación de fermentadores de lactosa.

II. Materiales A. Solución de ONPG: Disolver 80 mg de ONPG en 15 ml de agua destilada a 37º C, agregar 5 ml del buffer fosfato, ajustar a pH 7 y esterilizar por filtración. La solución es estable por 6 meses. Rotular la solución y guardar refrigerada (4 a 8º C), en recipientes de color caramelo o envueltos en papel de aluminio. B. Buffer fosfato de sodio 1M (pH 7): Disolver 6,9 g de NaHPO4.H2O en 45 ml de agua destilada. Agregar 3 ml de una solución de NaOH al 30% (w/v) y ajustar el pH a 7. Llevar el volumen a 50 ml con agua destilada y guardar a 4º C.

III. Procedimiento A. A partir de un cultivo en TSI, hacer una suspensión espesa del organismo a ensayar en 0,5 ml de solución salina. El volumen no tiene mayor importancia porque es una prueba basada en la observación de un cambio de color. B. Agregar un disco o dos gotas de solución de ONPG. C. Incubar la mezcla a 37º C y examinar cambio de color hasta 24 horas.

IV. Resultados Ensayo positivo: desarrollo de color amarillo. Ensayo negativo: no hay desarrollo de color.

V. Control de calidad Escherichia coli (+) Salmonella (-)

VI. Consideraciones A. Se puede partir de estrías de agar nutritivo con 1% de lactosa, cuando no se dispone de TSI. B. La solución de ONPG preparada debe ser incolora antes de su empleo. C. A veces se puede favorecer la liberación de la enzima agregando una gota de tolueno, se deja reposar unos minutos a 37º C y se agrega luego el ONPG.

Test de Utilización de Azúcares I. Principio Es un ensayo para determinar la capacidad de un microorganismo de fermentar un hidrato de carbono con producción de ácido o ácido y gas. El patrón de utilización de azúcares ayuda en la diferenciación e identificación de muchas bacterias. En este ensayo, determinados azúcares se agregan a un medio basal estéril. La producción de ácido se manifiesta por un cambio de color del indicador. La elección del medio y del indicador depende del camino metabólico del organismo y de la claridad visual del cambio de pH.

II. Materiales A. Medio base •

Peptona

10 g

•

Extracto de carne

1g

•

Cloruro de sodio

5g

•

Azul de bromotimol

10 ml

•

Indicador de Andrade

5 ml

•

Agua destilada

1000 ml

Rehidratar los ingredientes con agua destilada, calentando suavemente si es necesario; ajustar el pH a 7,1-7,2 (7,4). Autoclavar a 121º C por 15 minutos y enfriar en baño de agua a 50º C. Fraccionar el medio base en alícuotas y agregar los azúcares esterilizados por filtración en concentraciones de: 0,5% para dulcita y salicina y 1% para los otros azúcares. Dispensar en volúmenes de 4-5 ml en tubos con tapa a rosca, estériles. El medio se guarda en heladera y es estable por 3 meses.

Para la glucosa y glicerol, el medio base se dispensa en tubos con campanita de Durham antes de autoclavar. La campanita se llenará con el medio y luego se agrega el azúcar estérilmente después de enfriar a 50º C.

B. Indicador de Andrade Disolver 0,5 g de fucsina ácida en 100 ml de agua destilada, agregar 15 ml de NaOH 1N (4%); mezclar bien y dejar reposar a temperatura ambiente durante 24 horas, agitando frecuentemente. El color rojo se debe transformar en un color castaño. Si no se produce una decoloración suficiente agregar 1 ml de NaOH 1N (4%).

C. Solución de azul de bromotimol Mezclar 47,5 ml de agua destilada con 2,5 ml de NaOH 0,1N y luego agregar 0,1 g de indicador.

III. Procedimiento A. Con un ansa estéril tomar material de un cultivo en medio sólido. B. Sumergir el ansa en cada tubo de hidrato de carbono. Para una batería de 8 a 10 azúcares, es suficiente un único inóculo, no hay necesidad de flamear el ansa entre tubo y tubo. La posibilidad de transportar el hidrato de carbono de tubo a tubo es infinitesimal y no afectará los resultados. Para una batería grande (15 a 20) de azúcares, puede ser necesario emplear 2 a 3 inóculos, flameando el ansa antes de tomar nueva muestra. C. Incubar a 37º C y examinar día por día por 4 a 5 días. Para algunos microorganismos puede ser necesario una incubación más prolongada (7 días), registrando los resultados día por día. D. En laboratorios de referencia las lecturas se deben prolongar hasta 30 días.

IV. Resultados Ensayo positivo: viraje del indicador al rojo-rosado por acidificación del medio. Ensayo negativo: no hay cambio de color.

V. Control de calidad Con distintos microorganismos que fermenten los azúcares, como por ejemplo: Escherichia coli: glucosa (+)

Klebsiella: lactosa (+) Yersinia enterocolitica: sacarosa (+)

VI. Consideraciones A. Inocular un medio basal sin azúcar para cada microorganismo. B. La campanita de Durham se usa en el tubo con glucosa. C. Como cualquier indicio de gas, aún una burbuja pequeña, es evidencia de producción de gas, observar cuidadosamente la campanita antes de inocular. D. La campanita de Durham se agrega únicamente al medio con glucosa porque si el microorganismo produce gas con glucosa producirá gas con los otros azúcares. No obstante, si se sabe que el microorganismo en estudio no fermenta glucosa, es aconsejable agregar campanita a otros azúcares, pero hay que tener en cuenta que todas las enterobacterias son fermentadoras de glucosa por definición, entonces sólo se pone campanita al medio con glucosa.

Test de Decarboxilasa-Dehidrolasa I. Principio La decarboxilación es un proceso en el cual las decarboxilasas atacan el extremo carboxilo de los aminoácidos, formando la correspondiente amina. Los tres aminoácidos que se ensayan en la identificación de enterobacterias son arginina, lisina y ornitina. La decarboxilación de lisina y ornitina da cadaverina y putrescina (diaminas), mientras que arginina da citrulina por acción de una dehidrolasa. El test se debe acompañar con un tubo control que contiene el medio base sin aminoácido. Como la decarboxilación es una reacción anaeróbica, se debe cubrir el medio con una capa de aceite mineral estéril. El proceso ocurre en dos etapas: por fermentación de la glucosa se produce una acidificación del medio (pH < 6.0), apareciendo color amarillo. La acidificación es necesaria para que ocurra la decarboxilación. Este último proceso de lugar a la formación de las aminas que elevan el pH con el consiguiente viraje del indicador al color violeta. La prueba de la lisina ayuda en la diferenciación de Edwardsiella (+), y Salmonella (+) de Citrobacter (-); de Enterobacter aerogenes (+) de Enterobacter cloacae (-) y Enterobacter agglomerans (-)

La prueba de ornitina ayuda a diferenciar Klebsiella (-), Proteus mirabilis (+) de Proteus vulgaris (-); Morganella morganii (+) de Providencia rettgeri (-); Yersinia enterocolitica (+) de Yersinia pestis y Yersinia pseutuberculosis (-).

II. Materiales El medio base más comunmente utilizado es el medio de decarboxilasa de Moeller. El medio está disponible comercialmente. Las concentraciones de aminoácidos a usar son: 1% para la forma L y 2% para la forma D, porque los microorganismos son activos sólo frente a la forma L. Fraccionar el medio base en 4 porciones de 250 ml cada una. Agregar los aminoácidos a 3 porciones del medio. El pH se debe ajustar después de agregar el aminoácido y antes de esterilizar a 6 – 6,2. Fraccionar en volúmenes de 3 a 4 ml en tubos con tapa a rosca y autoclavar a 121º C por 10 minutos. El sustrato es estable por 3 meses. Rotular los tubos y guardar en heladera.

III. Procedimiento A. Tomar material con un ansa e inocular el tubo control y los tubos con los aminoácidos. B. Cubrir todos los tubos con una capa de vaselina estéril. C. Incubar a 37ºC D. Efectuar las lecturas día por día hasta 4 días, registrando los resultados día por día.

IV. Resultados Ensayo positivo: medio turbio y púrpura a púrpura amarillento. Ensayo negativo: color amarillo Tubo control: permanece con su color original o se vuelve amarillo si el organismo es un fermentador de glucosa (se debe ver turbidez en el tubo).

V. Control de calidad

Bacteria Proteus vulgaris Morganella morganii Enterobacter cloacae Enterobacter aerogenes Salmonella Typhimurium Klebsiella spp.

Arginina + + -

Lisina + + +

Ornitina + + + + -

VI. Consideraciones A. Inocular siempre un tubo control. B. Debe haber desarrollo para que el resultado sea válido. C. Si se observan capas de color amarillo y violeta, agitar suavemente el tubo antes de interpretar la reacción. D. Comparar todos los tubos positivos con el tubo control. Un color grisáceo puede indicar reducción del indicador más que formación de productos alcalinos. Se debe agregar más indicador antes de interpretar el resultado E. Si la reacción es difícil de interpretar, comparar el tubo con un tubo sin inocular. Luego de 24 horas cualquier traza de color púrpura indica un resultado positivo. F. Si se usa el medio de Moeller, se debe incubar por lo menos 18 horas ante de interpretar los resultados. G. Si no se agrega el aceite mineral, las reacciones se deben leer sólo a las 24 horas. H. Un pequeño precipitado floculento en la ornitina no interfiere con su uso. Prueba del Acetato I. Principio El medio permite determinar la capacidad de las bacterias de utilizar acetato como única fuente de carbono y de energía. Sirve para diferenciar Escherichia coli de Shigella.

II. Materiales El medio es igual al agar citrato de Simmons, con la diferencia que lleva 0,25 gr de acetato de sodio en lugar de citrato. Disolver en agua destilada, dispensar en volúmenes de 3 ml y autoclavar a 121º C por 15 minutos. Enfriar en forma de estría y guardar en heladera.

III. Procedimiento A. Tomar material con un ansa estéril e inocular el agar por punción. B. Incubar a 37º C durante 7 días, registrando los resultados día por día.

IV. Resultados Ensayo positivo: viraje del medio al azul. Ensayo negativo: no hay cambio de color. V. Control de Calidad Escherichia coli (+) Shigella (–)

VI. Consideraciones No hay.

Prueba del Mucato I.Principio Se utiliza para determinar la capacidad de los microorganismos de metabolizar el ácido múcico. Es útil para diferenciar Escherichia coli de Shigella.

II. Materiales Bactopeptona

1g

Acido múcico

1g

Azul de bromotimol 1/500

1,8 ml

NaOH 4N

1,2 ml

Pesar el ácido múcico y disolver en 80 ml de agua destilada Colocar el recipiente sobre un agitador magnético y agregar 1,2 ml de NaOH 4N aproximadamente (para 100 ml de solución se debe agregar 2,0-2,5 ml de NaOH 4N gota a gota), hasta virar el color amarillo de la solución al azul-verdoso; este color debe persistir durante 5 minutos de agitación. El agregado del álcali es para transformar el ácido múcico poco soluble en la sal soluble, mucato de sodio. A continuación agregar 1 g de bactopeptona, 1,8 ml de azul de bromotimol y 15 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 7,4 por medio de NaOH 0.1N o HCl 0.1N, si se ha pasado el pH.

Esterilizar por filtración y fraccionar en forma estéril en volúmenes de 3 ml por tubo. Guardar en heladera.

III. Procedimiento Tomar material con un ansa estéril e inocular un tubo con mucato. Incubar a 37º C durante 48 horas, realizando lecturas a las 24 horas.

IV. Resultados Ensayo positivo: viraje del color al amarillo o amarillo verdoso. Ensayo negativo: no hay cambio de color el medio permanece azul verdoso.

V. Control de Calidad Cepas mucato (+): E. coli, Salmonella Paratyphi B Cepas mucato (-): Proteus vulgaris, Shigella spp., Salmonella Paratyphi A

VI. Consideraciones No hay.

Citrato de Christensen I. Principio Este medio pone en evidencia la utilización del citrato en presencia de nitrógeno orgánico (monoclorhidrato de cisteína). Es igual al de citrato de Simmons con la única diferencia que la fuente de nitrógeno es orgánica. Es útil en la diferenciación entre Escherichia coli y Shigella.

II. Materiales El medio está disponible comercialmente. Se disuelve el polvo con agua destilada, se caliente suavemente y se fracciona en volúmenes de 3 ml en tubos con tapa a rosca. Se esteriliza a 121º C durante 15 minutos y se enfría en pico de flauta. El medio se guarda en heladera.

III. Procedimiento Se repite todo exactamente igual que lo indicado para el citrato de Simmons, pero las lecturas se realizan durante 7 días, registrando los resultados día por día.

IV. Resultados Ensayo positivo: color rojo rosado en el pico de flauta. Ensayo negativo: no se observa cambio de color.

V. Control de Calidad Enterobacter aerogenes (+) Escherichia coli (+) Shigella (-)

VI. Consideraciones No hay.

2.3.- SEROTIPIFICACIÓN DE Shigella spp. El uso de métodos de serotipificación con propósitos de vigilancia epidemiológica se basa en el hecho que los microorganismos muestran variaciones en su composición antigénica. Los microorganismos producen una variedad de antígenos: componentes estructurales de la célula (constituyentes de la pared celular, cápsulas, flagelos, fimbrias); productos de secreción de las células (toxinas, enzimas extracelulares) o antígenos contenidos en el interior de las células. Químicamente, los antígenos usados con este propósito pueden ser proteínas, carbohidratos, o mezclas de ambos componentes. Debido a las características del género Shigella de ser inmóviles, solamente se ponen en evidencia los antígenos (denominados somáticos) compuestos por cadenas polisacarídicas del lipopolisacárido (LPS) de la membrana externa, integrante de la pared celular. Cuando un antisuero específico se mezcla con una suspensión de un cultivo puro de Shigella se observa una reacción de aglutinación. Luego del aislamiento e identificación, se realiza la aglutinación en lámina: los anticuerpos en el suero aglutinarán con la bacteria cuando los antígenos correspondientes estén presentes.

Materiales y equipamiento •

Ansa descartable

•

Láminas de vidrio

Reactivos •

Solución salina 2%

•

Antisueros polivalentes y monovalentes de Shigella para la serotipificación de miembros del género Shigella. Se necesita el siguiente conjunto de antisueros:

A. Dos antisueros de Shigella dysenteriae. - A(I -) que aglutina los serotipos indol negativos (1, 3, 4, 5, 6, 9 y 10) - A(I +) que aglutina los serotipos indol positivos (2,7 y 8) B. Antisuero polivalente de Shigella flexneri para aglutinar los 6 serogrupos y antisueros monovalentes para diferenciar los serotipos dentro de cada serogrupo. C. Un antisuero de Shigella sonnei. D. Dos antisueros de Shigella boydii - C(I-) para aglutinar serotipos indol negativo (1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12 y 14). - C(I+) para aglutinar serotipos indol positivo (5, 7, 9, 11, 13 y 15).

La nomenclatura de los antisueros mencionados corresponde a los nombres dados por el Instituto Nacional de Producción de Biológicos - ANLIS “Carlos G. Malbrán”, Argentina. Procedimiento

Comentarios

• Mezclar cuidadosamente, con un palillo

• Si no hay aglutinación el cultivo no está

sobre una lámina de vidrio, un ansa del

rugoso y se procede al segundo paso.

cultivo en TSA y una gota de solución salina 2% (control de autoaglutinación). • Mezclar cuidadosamente, con un palillo

• La

sobre una lámina de vidrio, un ansa del

polivalentes se debe hacer en base a la

cultivo en TSA y una gota de antisuero

historia de la región o país y a las

polivalente. Mover la lámina suavemente por

pruebas

2 minutos.

indicadoras de especie

selección

de

los

bioquímicas

antisueros

diferenciales

• Una suspensión homogénea indica una reacción

negativa.

Una aglutinación

indica una reacción positiva. • La aglutinación positiva con los antisueros

• Cuando

polivalentes continúa con la aglutinación con

características bioquímicas de Shigella

algunos de los antisueros monovalentes

un

cultivo

que

presenta

correspondientes, para determinar el serotipo

aglutina pobremente o no aglutina, se

del cultivo.

puede

estar

en

presencia

de

un

aislamiento capsulado. Estos cultivos se deben calentar en un baño de agua a 100ºC por 15 a 30 minutos y luego se repite el ensayo de aglutinación.

Comentarios Situaciones atípicas que se pueden presentar: A. TSI alcalino/ácido sin gas, SIM (-v-), acetato de sodio negativo, ureasa negativa y aglutinación con el antisuero específico pobre o negativa: estos cultivos se deben calentar a 100º C. B. TSI alcalino/ácido con gas, SIM (---), acetato de sodio negativo, ureasa negativa: a estos cultivos se les debe probar aglutinación porque algunos serotipos de Sh. dysenteriae, Sh. flexneri y Sh. boydii fermentan glucosa con producción de gas.

FLUJOGRAMA PARA SEROTIPIFICACIÓN DE Shigella spp. Cultivo con propiedades bioquímicas de Shigella Aglutinación con solución salina 2%

Negativo

Positivo Cepa rugosa

Aglutinación con OSh-B

Negativo

Positivo

Sh. flexneri (probar serotipos 1a 6)

Positivo

Sh. sonnei

Aglutinación con OSh-D

Negativo

Aglutinación con OSh-C

Positivo

Sh. boydii (probar serotipos indol + y -)

Positivo

Sh. dysenteriae (probar serotipos indol + y -, y serotipo 1)

Negativo

Aglutinación con OSh-A

Negativo Calentar y repetir el procedimiento

REFERENCIAS

1. Bopp, Ch., Brenner, F., Wells, J., Strockbine N. 1999. Escherichia, Salmonella, Shigella,. In Manual of Clinical Microbiology. Murray, P. (Ed.). Cap. 28, pp. 459-474. 2. Ewing, W. 1986. Edwards and Ewing´s Identification of Enterobacteriaceae. 4th edition. Elsevier Science Publishers. 3. Le Minor, L., Richard, C. 1993. Méthodes de Laboratoire pour l´Identification des Entérobactéries. Institut Pasteur.

CAPÍTULO III - MEDIOS DE CULTIVO Caldo GN de Hajna Es un medio de enriquecimiento recomendado para el aislamiento de Shigella spp. en matria fecal y en otras muestras. La triptosa sirve como nutriente en el medio. El citrato de sodio y el desoxicolato de sodio son bactericidas para organismos gram-negativos e inhiben el desarrollo de coniformes, mientras que los fosfatos sirven de buffer. La concentración incrementada de manitol sobre dextrosa, ayuda a limitar el crecimiento de Proteus y a acelerar el de Salmonella y Shigella, capaces de fermentar el manitol. Pseudomonas aeruginosas y Proteus, crecerán en el medio, pero no enmascaran al desarrollo de Shigella y Salmonella. El medio contiene: tiptosa, dextrosa, manitol, citrato de sodio, desoxicolato de sodio, fosfato dipotásico, fosfato monopotásico y clorudo de sodio.

Agar MacConkey Es un medio selectivo y diferencial para aislar microorganismos fermentadores y no fermentadores de lactosa. Sirve para aislar Salmonella, Shigella, y coliformes de materia fecal, orina, alimentos y aguas residuales. Es un medio de baja selectividad para usar con inóculos pequeños. Las sales biliares y el cristal violeta inhiben microorganismos gram-positivos. La presencia de lactosa permite el desarrollo de las cepas lac (+) que se manifiesta por el viraje del indicador debido a la producción de ácido; luego se absorbe el rojo neutro dando color rojo a la colonia y un halo turbio por la precipitación de las sales biliares por la acidez del medio. Las bacterias no fermentadoras de lactosa (S. Typhi, S. Paratyphi, Shigella dysentariae) no alteran el medio, dando colonias incoloras y transparentes. Para detectar S. Typhi hay que usar medio MacConkey con agar SS y agar bismuto sulfito. El medio contiene: peptona, sales biliares, rojo neutro, cristal violeta, sales y lactosa.

Interpretación Salmonella, Shigella: incoloras, medio amarillo Escherichia: rojas, halo turbio Enterobacter, Klebsiella: grandes, rosadas a rojo, mucosas Proteus: incoloras

Agar EMB Es un medio selectivo y diferencial para el aislamiento de bacterias patógenas intestinales gramnegativo. El contenido de lactosa y sacarosa hace posible la diferenciación de Salmonella y Shigella lac/sac (-), de la flora acompañante lac (-)/lac(+) (Proteus vulgaris, Citrobacter, Aeromonas hydrophila). La combinación de colorantes es la que permite diferenciar entre los fermentadores y no fermentadores de lactosa. La sacarosa se incluye porque algunos coliformes la fermentan más rápido que a la lactosa. El desarrollo de las bacterias gram-positivas está inhibido por los colorantes del medio (eosina amarilla y azul de metileno). Agar EMB Levine contiene solamente lactosa. El medio contiene: peptona, sales biliares, tiosulfato, carbonato de calcio, lactosa y sacarosa.

Interpretación Salmonella, Shigella: transparentes, ámbar rosado Escherichia: violáceas con brillo metálico y centro negro azulado Enterobacter, Klebsiella: colonias grandes, mucosas sin brillo metálico y centro oscuro. Bacterias lac (+): negras o centro oscuro, halo transparente. Bacterias lac (+) o sac (-): incoloras.

Agar SS Es un medio selectivo para Salmonella y Shigella a partir de materia fecal, alimentos y animales; pero no es el ideal para Sh. dysenteriae y Sh. boydii. Sirve también para Yersinia enterocolitica y para diferenciar fermentadores de lactosa de los no fermentadores. La presencia de verde brillante, bilis de buey, alta concentración de tiosulfato y el citrato inhiben la flora acompañante. El tiosulfato y la sal de hierro ponen en evidencia la formación de sulfuro de hierro. La degradación de la lactosa a ácido provoca el viraje del indicador rojo neutro a rojo. El medio contiene: extracto de carne, peptona, lactosa, citrato de hierro amoniacal, tiosulfato, verde brillante, rojo neutro.

Interpretación Salmonella: incoloras, transparentes, centro negro Shigella: incoloras, transparentes, medio amarillo

Proteus: transparentes, centro rojo, medio amarillo Escherichia coli: rosadas a rojo, medio rojo Enterobacter aerogenes: rosadas a crema, opacas, mucosas Bacterias lac +: rojizas, mucoides, centro negro

Agar XLD Es un medio de selectividad moderada a alta que permite ser usado con Salmonella y Shigella. La degradación de xilosa, lactosa y sacarosa produce acidez que hace virar el indicador al amarillo. El tiosulfato y la sal de hierro ponen en evidencia la producción de sulfhídrico. La decarboxilación de la lisina a cadaverina se visualiza por la presencia de un color rojo púrpura por aumento del pH. El desoxicolato inhibe gram-positivo. La diferenciación de Salmonella/Shigella de otras enterobacterias se basa en tres reacciones: fermentación de xilosa, decarboxilación de lisina y producción de sulfhídrico. La xilosa diferencia Shigella de Providencia que no fermenta xilosa o lo hace muy lentamente; la lisina diferencia Salmonella de los fermentadores de xilosa no patógenos. La lactosa y la sacarosa en exceso evitan que los coliformes lis + reviertan la condición alcalina de los microorganismos consumidores rápidos de xilosa/lisina. La producción de sulfhídrico ocurre en condiciones alcalinas dando colonias con centro negro; en condiciones ácidas la precipitación negra se inhibe. El medio contiene: extracto de levadura, xilosa, lactosa, sacarosa, lisina, desoxicolato, tiosulfato, citrato de hierro amoniacal, rojo fenol, sales. El precipitado que ocasionalmente presenta el medio no perjudica su rendimiento, puede eliminarse por filtración.

Interpretación Escherichia coli, Enterobacter: amarilla, opacas, c/precipitado Aeromonas: amarilla, opacas, c/precipitado Klebsiella: amarilla, opacas, mucosas, c/precipitado Citrobacter: amarilla, opacas, centro negro Serrati, Hafnia: amarilla, opacas Proteus vulgaris, P. mirabilis: amarilla, translúcidas, centro negro Salmonella: igual color del medio, centro negro Shigella, Providencia: igual color del medio, translúcidas Salmonella Typhi: amarilla, ligeramente opacas

Agar Hektoen Es un medio selectivo para bacterias intestinales, incluidas algunas shigellas. No tiene efecto inhibidor sobre Salmonella y Shigella pero si sobre flora acompañante. Debido a los dos indicadores (azul de bromotimol y fucsina), las colonias lac + tienen una diferencia cromática con las colonias lac -; lo mismo ocurre con bacterias fermentadoras de sacarosa y salicina. El tiosulfato con el hierro dan coloración negra a las colonias sulfhídrico (+). Las sales biliares inhiben a la flora acompañante. Puede agregarse novobiocina para inhibir Citrobacter y Proteus. El medio contiene: peptona, extracto de levadura, sacarosa, lactosa, salicina, tiosulfato, citrato de hierro amoniacal, sales biliares, azul de bromotimol, fucsina.

Interpretación Shigella, Providencia: verdes, planas, transparentes Salmonella, Proteus: verde-azuladas, c/s centro negro Pseudomonas: verde-azuladas, planas, borde irregular Coliformes: salmón, halo de precipitación

CAPÍTULO IV - PLANILLA DE RESULTADOS AISLAMIENTO DE Shigella DE HECES – MORFOLOGÍA EN AGAR SELECTIVO Fecha:____________________ Nombre:__________________ Muestra:__________________ Color Morfología en MacConkey

Morfología en EMB

Morfología en SS

Morfología en XLD

Morfología en Hektoen

Resultados

Comentarios

AISLAMIENTO DE Shigella DE HECES – PRUEBAS BIOQUÍMICAS Fecha:____________________ Nombre:__________________ Muestra:__________________ Color TSI profundidad TSI estría TSI gas TSI H2S LIA profundidad LIA estría Arginina dehidrolasa Lisine decarboxilasa Ornitina decarboxilasa Mucato (fermentación) Acetato (utilización) Cit. Christensen Indol (reacción) Sacarosa (fermentación) Manitol (fermentación) Xylosa (fermentación) Dulcita (fermentación) Β-galactosidasa

Resultados

Comentarios

AISLAMIENTO DE Shigella DE HECES – SEROTIPIFICACIÓN Fecha:____________________ Nombre:__________________ Muestra:__________________

A) Antisueros polivalentes OSh - A Indol

OSh - A

(+)

Indol (-)

OSh B

OSh C - Indol

OSh C - Indol

(+)

(-)

B) Antisueros de serotipos Antisueros polivalentes OSh - A Indol (+)

OSh - A Indol (-)

OSh B

OSh C - Indol (+)

OSh C - Indol (-)

OSh D

Antisueros de serotipos

OSh D

Tabla 3.2. Reacciones Bioquímicas de Serotipos de Shigella spp. Subgrupo/Serotipo Sh. dysenteriae

Sh. flexneri

Sh. boydii

Man.

%

Dul.

%

Xil.

%

Ram.

%

Raf.

%

Glic.

Indol

%

Orn. Decarb.

1

-

0

-

0

-

0

-

0

-

0

"+/(+)"

100

-

0

-

0

2

-

0

-

0

-

0

+

98

-

0

"(+)/+"

98

+

100

-

0

3

-

0

-

0

-

0

-

0

-

0

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100

-

0

-

0

4

-

0

-

0

-

0

-

0

-

0

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100

-

0

-

0

5

-

0

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100

-

0

-

0

-

0

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100

-

0

-

0

6

-

0

-

0

-

0

-

0

-

0

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38

-

0

-

0

7

-

0

-

0

-

0

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90

-

0

-

0

+

100

-

0

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-

0

-

0

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-

0

-

0

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100

+

100

-

0

9

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0

-

0

-

0

-

0

-

0

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100

-

0

-

0

%

0

-

0

10

-

0

-

0

+

100

-

-

0

-

0

-

0

1

+

95

-

0

-

0

-

d

89

-

0

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0

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99

-

0

-

0

-

d

77

-

0

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-

0

3

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98

-

0

-

0

d

12

d

88

-

0

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88

-

0

4

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99

-

0

-

0

d

23

d

82

-

0

"+/-"

55

-

0

4

-

0

-

0

d

71

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48

-

3

-

0

+

98

-

0

5

+

99

-

0

-

0

-

5

d

72

-

0

+

95

-

0

6

+

99

d

80

-

4

-

6

-

-

d

98

-

0

-

0

1

+

100

-

1

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97

-

0

-

-

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96

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0

-

0

2

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100

-

1

-

0

-

0

-

-

"+/(+)"

100

-

0

-

0

3

+

100

d

75

d

86

-

0

-

-

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0

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0

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+

99

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28

-

0

-

0

-

-

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100

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0

-

0

5

+

100

-

0

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94

-

0

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-

d

61

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100

-

0

6 "+/(+)" 100

Sh. sonnei

%

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100

+

100

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0

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-

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100

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0

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0

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0

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0

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0

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0

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0

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0

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0

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-

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-

0

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0

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0

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0

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0

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0

+

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-

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0

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-

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+

100

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0

-

-

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0

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0

-

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-

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+

100

-

0

-

1

"+/(+)"

98

d

84

d

46

-

0

+

99

+ 90% o >; - 90% o >; +/- >> +; -/+ >>-; d diferentes reacciones

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE Campylobacter spp. CAPÍTULO I- INTRODUCCIÓN 1.- ANTECEDENTES Las diarreas infecciosas continúan siendo un gran problema en los países en desarrollo, ocupando altas tasas de morbilidad y mortalidad, especialmente en niños de corta edad. Hasta hace poco tiempo solo era posible conocer su etiología

en un porcentaje de casos

relativamente bajo. Sin embargo en los últimos años, con la aplicación de nuevas metodologías, se pudo incluir dentro del espectro de agentes microbianos a “nuevos enteropatógenos” como son los Rotavirus, Criptosporidium, Aeromonas y las especies termófilas de Campylobacter spp., con lo cual se ha podido identificar el agente causal en el 70 a 80% de los casos de diarrea.

1.1.- HISTORIA Los primeros aislamientos de especies del género Campylobacter fueron realizados en el área de la microbiología veterinaria, en 1909 y 1913. Mac Fadyean y Stockmann y posteriormente Smith en 1918 establecieron la participación de una bacteria microaerófila en el aborto del ganado bovino y ovino, de morfología similar al género Vibrio, por lo que se lo llamó Vibrio fetus. En 1931, Jones y Little aislaron a partir de bovinos con disturbios intestinales un vibrión microaerófilo, al que denominaron Vibrio jejuni. En 1944 Doyle describió un vibrión aislado del intestino de cerdos con diarrea y lo denominó Vibrio coli. La primera asociación entre vibriones microaerófilos y diarrea en el hombre fue sugerida por Levy en 1946, el que realizó un estudio en un brote de gastroenteritis sobre 357 pacientes en un penal en Illinois, observando en exámenes directos la presencia de vibrios en el 20% de las muestras. En 1957 E. King, estudiando las características de estos vibrios aislados de diferentes fuentes, estableció que no todos correspondían a Vibrio fetus, determinó dos grupos con características serológicas y bioquímicas diferentes, mientras algunos eran capaces de crecer a 25 y 37°C, otros lo hacían a 42°C. A estos últimos se los consideró relacionados y se comprobó que eran agentes causantes de diarrea aguda. En 1963, Sébald y Veron proponen la creación del género Campylobacter.

Butzler y Skirrow, Bolton y Robertson, Blaser y col, desarrollaron medios selectivos que permitieron aislar estos microorganismos con relativa facilidad y establecer su participación en diferentes cuadros infecciosos en el hombre. En 1972 Dekeyser y Butzler aislaron los microorganismos de las heces de pacientes con enteritis aguda usando una técnica de filtración que permitía el pasaje de pequeños bastones curvos a través de una membrana, pero retenía microorganismos fecales más grandes.

1.2.- CARACTERISTICAS GENERALES Las especies del género Campylobacter agrupan bacilos gram-negativos curvos, espirilados o en forma de S que presenta un flagelo único en uno o ambos extremos. En cultivos de varios días (más de tres) degeneran en formas esféricas u ovoides (cocoides) que han perdido su viabilidad. Los diferentes nombres que han recibido las diferentes especies de Campylobacter han dificultado la utilización de una nomenclatura universal. Al comienzo, estos microorganismos fueron clasificados dentro del género Vibrio. Sin embargo, mas tarde, debido a que presentan diferencias fundamentales con relación a la constitución del DNA y por su incapacidad de fermentar los hidratos de carbono, fueron agrupados en un nuevo género bacteriano denominado campylobacter (campylo = curvo) (bacter = bacteria). Actualmente se han incorporado nuevas especies y se ha creado la familia Campylobacteriaceae, la cual está compuesta por dos géneros: Campylobacter y Arcobacter; y un género de afiliación incierta Helicobacter. Las diferencias fundamentales entre los géneros de Campylobacter y Arcobacter son que Campylobacter no puede crecer a 15°C, es móvil por un solo flagelo polar en uno o sus dos extremos y en cultivos viejos degeneran a formas cocoides; Arcobacter tiene un solo flagelo, crece bien a bajas temperaturas (17°C) pero mal a 37°C y 42°C, y a 30°C pueden crecer aeróbicamente.

1.3.- ESPECIES TERMOFILAS Son aquellas capaces de crecer a 42-43°C pero no a 25°C, comprende C. jejuni (subespecies jejuni y doylei), C. coli, C. laridi (Biovar ureasa + y -) y C. upsaliensis. De este grupo, Campylobacter jejuni (subespecie jejuni) es agente causal de diarreas, siendo considerado el más virulento por su mayor resistencia a la fagocitosis; luego le sigue Campylobacter coli, pero se considera que la diarrea que produce es más benigna. Ambos se encuentran como comensales en el tracto gastrointestinal de un amplio grupo de

animales como ser: vacas, ovejas, cerdos, cabras, perros, gatos, roedores silvestres y domésticos y principalmente en todas las variedades de aves de corral, a las cuales se ha adaptado perfectamente, es por ello que su temperatura óptima de desarrollo es a 42-43°C. La dosis infectante es baja, bastan 1000 microorganismos para causar la enfermedad, lo cual evidencia su capacidad de producir brotes. Infecciones extraintestinales pueden

ocurrir raramente en huéspedes normales; en

pacientes HIV positivos e inmunocomprometidos pueden producir bacteriemias, bursitis, artritis, infecciones del tracto urinario, endocarditis, peritonitis, aborto y sepsis neonatal. Campylobacter lari ha sido aislado de intestino de gaviotas, de otros animales y también del hombre. Su rol patógeno para este último aún no está definido. La diferencia con los otros está en que es negativo para la prueba de indoxyl-acetato y positivo para la prueba de producción de SH2. Campylobacter upsaliensis raramente es aislado de diarreas, produce bacteriemias en huéspedes inmunocomprometidos. Son más resistentes al poder bactericida del suero que las otras especies termófilas, por lo que puede sobrevivir en sangre. Si bien su fuente de infección no está bien definida, se ha relacionado con animales, especialmente perros y alimentos como leche no pasteurizada y sus derivados.

1.4.- OTRAS ESPECIES NO TERMOFILAS Campylobacter fetus (subsp. fetus y veneralis) son microorganismos de gran importancia veterinaria producen aborto esporádico en el ganado bovino y ovino. Para el humano C. fetus subsp. fetus es considerado un patógenos oportunista, provocando infecciones sistémicas en pacientes debilitados o inmunosuprimidos, se aísla de intestino de ovejas, vacas y cerdos. C. fetus subsp. veneralis se encuentra frecuentemente en el aparato genital de vacas causando infertilidad. La diferencia entre ambas subespecies es la capacidad de crecer en 1% de glicina de C. fetus subsp. fetus. Campylobacter hyointestinalis se ha recuperado de hisopados rectales de hombres homosexuales con proctitis. Anteriormente solo era hallado en animales, sobre todo como causa de ileitis en cerdos. Presenta reacciones bioquímicas similares a C. fetus subsp fetus, pero a diferencia de este también puede crecer a 42°C y produce SH2 en TSI. Campylobacter consisus y Campylobacter rectus se aíslan de pacientes con enfermedad periodontal, infecciones intestinales y bacteriemia. Campylobacter sputorum biovar sputorum forma parte de la flora normal de la boca e intestino humano, ha sido aislado de forúnculos perianales y abscesos pulmonares.

Campylobacter sputorum biovar bubulus es un comensal de ovejas y vacas, se ha aislado de forúnculos y abscesos en hígado, escroto, ingle y axilas humanas en personas que trabajan en el campo. Campylobacter showae es una especie recientemente descrita, aislada de enfermedad periodontal, presenta la particularidad de tener múltiples flagelos.

1.5.- EPIDEMIOLOGÍA La campilobacteriosis es una zoonosis de distribución mundial. Campylobacter se halla habitualmente como comensal del tracto gastrointestinal de vacas, ovejas, cerdos, cabras, perros, gatos, roedores silvestres o domésticos y toda variedad de aves de corral. Muchos de los casos de enteritis humana han sido asociados al contacto con animales, agua contaminada o alimentos de origen animal. En países desarrollados, la diarrea por Campylobacter es más frecuente en los meses de verano, siendo afectados todos los grupos étnicos de ambos sexos. Se considera que un alto porcentaje de infecciones es provocado por consumo de carne de ave mal cocida. En países en vías de desarrollo la enfermedad parece ser mas frecuente en niños de corta edad. Campylobacter jejuni y Campylobacter coli son causas importantes de diarreas agudas en viajeros que visitan zonas en vías de desarrollo. No soportan durante mucho tiempo situaciones de desecación o congelamiento, característica que limita su transmisión. Sobreviven en la leche, otros alimentos o el agua a 4° C durante una semana. La desinfección con cloro y la pasteurización destruye al microorganismo. De la misma forma que con otros patógenos entéricos, es importante la transmisión fecal-oral de persona a persona sobre todo en lactantes, que no controlan esfínteres.

1.6.- FISIOPATOGENIA El microorganismo se adquiere por vía oral (ingestión de comidas y bebidas contaminadas) o por contacto con heces de animales infectados. Campylobacter jejuni es sensible al pH gástrico, por lo que debe ingerirse un inóculo de 104 para que se produzca la infección, sin embargo en algunos casos es altamente infectivo, provocando la infección con dosis del orden de 500 microorganismos. El periodo de incubación es de 1 a 7 días, afecta tanto intestino delgado como grueso.

De diferentes estudios epidemiológicos realizados en países subdesarrollados y desarrollados se desprende la existencia de cepas con distinto grado de patogenicidad y distintas respuestas del huésped a la infección. Estas variaciones en la

presentación clínica hacen pensar en la existencia de

importantes diferencias en los mecanismos de virulencia entre las cepas de distintas zonas geográficas. Muchas cepas pueden invadir las células epiteliales, provocando infiltrados inflamatorios de la lámina propia y abscesos en las criptas similares a los producidos por Shigella, apareciendo hematíes y leucocitos en las

heces (diarreas inflamatorias y

disentéricas). Pueden atravesar mucosa intestinal y proliferar en la lámina propia y ganglios, semejante a infección por Salmonella (infecciones extraintestinales),

aunque la acción

inhibitoria del suero impide bacteriemias en la mayoría de los casos. Algunas cepas producen toxinas termolábiles muy semejante a la de Vibrio cholerae y Escherichia coli enteropatógena (ETEC), se unen al gangliosido GM1 y activa la adenilciclasa, aumentando el AMP cíclico, provocando una diarrea secretora. También se ha encontrado acción citotóxica sobre células Hela y Vero.

1.7.- PRESENTACIÓN CLÍNICA La gastroenteritis aguda causada por Campylobacter se caracteriza por una rápida elevación de la temperatura, acompañada de malestar general, dolores musculares, cefaleas, nauseas, vómitos, ruidos hidroaéreos, anorexia y tenesmo. La diarrea comienza generalmente a las 24 horas posteriores al inicio de los síntomas. Las deposiciones, disgregadas o acuosas, pueden ser mucosanguinolentas, son oscuras, con mayor olor, ligeramente verdosas. Con frecuencia se ven células de inflamación y un predominio de formas curvas y espiriladas. La enfermedad se autolimita alcanzando su mayor expresión entre el 2do y 4to día, remitiendo completamente después del séptimo día. La presentación puede ser variable, desde una forma leve de corta duración a un cuadro más severo y prolongado con características similares a Shigelosis o Salmonelosis. Los casos mas leves no requieren de tratamiento antimicrobiano, la presentación más grave o recidivante se trata; la droga de elección es la eritromicina. En los neonatos puede presentarse con una o más deposiciones sanguinolentas y ningún otro síntoma. También se puede desarrollar solo una fiebre tan severa y persistente que es necesario diferenciar de fiebre tifoidea.

En pacientes inmunocomprometidos puede presentarse colecistitis aguda, pancreatitis, cistitis, artritis reactiva y otras complicaciones como síndrome urémico hemolítico, nefritis intersticial, hepatitis y síndrome de Guillén-Barré.

CAPÍTULO II- AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE Campylobacter spp.

2.- DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO Puede realizarse el diagnóstico por la demostración del microorganismo en examen directo o a través del cultivo. El uso de los métodos serológicos para el diagnóstico tiene valor para la investigación, ya que en países en vías de desarrollo los títulos en la población suelen ser altos. El examen de las muestras fecales diarreicas utilizando microscopio de campo oscuro o contraste de fase, dentro de las 2 horas de evacuación, puede permitir un diagnóstico presuntivo rápido si se observa la rápida motilidad del microorganismo, en su mayoría acompañadas por eritrocitos y neutrófilos. Para cultivo y aislamiento a partir de materia fecal se requiere de una atmósfera microaerófila, medios de cultivo selectivos para inhibir la flora acompañante, temperatura óptima de desarrollo (42-43° C), aunque pueden desarrollar a 37° C, pH óptimo de crecimiento (6,5-6,9). A partir de alimentos congelados, o de muestra de materia fecal de pacientes con tratamiento antibiótico previo, es necesario hacer un pasaje reconstituyente de la estructura celular, de por lo menos 6 horas a 37°C, por un medio en base a Caldo Brucella, succinato de sodio al 0,3%, cisteina al 0,01% y solución antibiótica (trimetroprima, vancomicina, anfotericina, cefalotina). Para las células dañadas por calor, no hace falta realizar este pasaje. Para aislar de agua es necesario filtrar un gran volumen y sembrar la membrana en un medio de enriquecimiento.

2.1- MUESTRAS Las muestras de deposiciones pueden ser tomadas con hisopo rectal o bien por evacuación espontánea, pudiendo mantenerse a temperatura ambiente, por algunas horas, evitando su desecación. La refrigeración de las muestras prolonga por varios días la sobrevida del microorganismo. Si es necesario usar un medio de transporte, debe utilizarse el medio Cary Blair modificado por la reducción de la concentración de agar en un 0,12%.

2.2.-EXÁMEN MICROSCÓPICO DIRECTO Las muestras de materia fecal pueden ser examinadas a través de una tinción simple como Gram utilizando carbolfucsina como colorante de contraste, o azul de metileno para identificar leucocitos y formas bacilares curvas. La observación en microscopio óptico o de campo oscuro de bacilos curvos y/o espirilados con gran motilidad en forma circular o de sacacorchos nos permite un diagnóstico presuntivo rápido.

2.3.-CULTIVO EN MEDIOS SELECTIVOS Las placas se siembran en forma directa con hisopo o con 2-3 gotas de deposiciones acuosas, se disemina por estría. Se incuban con una atmósfera microaerófila que tenga 5-10% de oxígeno y 3 a 10% de dióxido de carbono. Dado que en una diarrea el número de Campylobacter es alto, no es necesario realizar enriquecimiento. Se recomienda solo en caso de esperar un bajo número de microorganismos (manipuladores, convalecientes).

2.4.-MÉTODO DE FILTRACIÓN PARA HECES

LA DETECCIÓN DE Campylobacter EN

(*)

El método se basa en la separación de Campylobacter del resto de la flora microbiana presente en las heces, como por ejemplo coliformes, que quedan retenidos en la superficie de una membrana de celulosa de 0,45 o 0,66 µm; los bacilos que logran penetrar la membrana van a depositarse sobre una placa de agar

sangre que actuará como sustrato para el

crecimiento del microorganismo. De esta manera se obtiene un cultivo selectivo, situación que reemplaza a la adición de antibióticos. Este método se recomienda para el aislamiento de las especies emergentes (ej. Campylobacter upsaliensis)

Procedimiento: (ver FIGURA I) atemperar el medio de cultivo en placa de Petri, acomodar con una pinza el filtro estéril de celulosa de 0,45 µm, hasta que se adhiera al medio. Realizar una suspensión de materia fecal en solución fisiológica y con una micropipeta o pipeta Pasteur, depositar aproximadamente 100 µl sobre la membrana, tratando que no se derrame sobre el medio de cultivo. Dejar que se filtre por un tiempo mínimo de 30 minutos, agregar mas muestra y completar una hora, luego levantar el filtro con la pinza y desecharlo. (*)

Extraido de: Aplicación del Método de Filtración para la Detección de Campylobacter spp. en Heces. Pinto, A.M., Fundación de Tecnología de Alimentos, Sucre – Bolivia, 1999

Estriar

el filtrado con un anza. Acondicionar las placas en jarras para incubar en

microaerofilia a 37°C durante 24-48 horas. Se recomienda dejarlo hasta 4-5 días Si la diarrea es acuosa, no es necesario realizar una suspensión en solución fisiológica. Continuar con los métodos de identificación y tipificación.

FIGURA 1. Técnica de Filtración con Membrana de Celulosa para la Detección de Campylobacter spp. en Heces

Atmósfera de incubacion: Existen varios métodos para obtener una atmósfera adecuada para el desarrollo de estos microorganismos. A. Reemplazo de una atmósfera normal por una mezcla de gases apropiada: se retira el aire contenido en la jarra anaeróbica con bomba de vacío y se reemplaza por una mezcla conteniendo 85% de Nitrógeno, 10% de dióxido de carbono y 5% de oxigeno. Algunas especies, por ej. C. hyointestinalis, requieren de la presencia de hidrógeno para crecer. B. Sobres generadores de gases especiales para Campylobacter: son sobres que se consiguen en el comercio (BBL, Oxoid, Bio-Merieux) que aportan una atmósfera aproximada de 5-10% de oxigeno y 5-12% de dióxido de carbono. C. Sobres generadores de hidrógeno y oxígeno para anaerobiosis: se utilizan sin catalizador de paladio. D. Jarra con vela: la combustión de la vela aporta una atmósfera aproximada de 17-19% de oxígeno y de 2-4% de dióxido de carbono, mejora el aislamiento de microorganismo si se incluye al medio de cultivo el suplemento FBP que aumenta alrededor de 10 veces la aerotolerancia del mismo. Se postula que el rendimiento de este método es mayor a 42-43°C que a 37°C. E. Generadores caseros: reduce la atmósfera de oxígeno por consumo en reacción química y aumenta la de dióxido de carbono por medio de la disolución de bicarbonato en agua. Entre estos tenemos: E.1. Una pastilla de boranato de sodio (0,8 gr para una jarra jarra 3 litros) Una pastilla de Alka Seltzer o Yastá 10 ml de agua destilada. E.2. Lana de acero Solución ácida de sulfato cúprico: Sulfato de cobre

5g

Agua

100 ml

Ac. sulfúrico

0,33 ml

Tween 80

0,2 ml

Temperatura de incubación: Las especies termófilas de Campylobacter crecen mejor a 42-43°C que a 37°C. La mayor temperatura actúa como inhibidora de la flora fecal. Si no se cuenta con una estufa a esa temperatura, se puede utilizar una de 37°C, aumentando el tiempo de incubación

Tabla 1 - Temperaturas de desarrollo de las diferentes especies

C. jejuni subsp. Jejuni

25°C -

37°C +

42°C +

C. jejuni subsp. Doylei

-

+

-

C. coli

-

+

+

C. fetus subsp. Fetus

+

+

d

C. fetus subsp. Veneralis

+

+

-

C. lari

-

+

+

C. upsaliensis

-

+

+

C. hyointestinalis

d

+

d

C. sputorum

-

+

+

C. sputorum subsp. bubulus

d

+

-

C. curvus

-

+

+

C. rectus

-

+

d

C. showae

-

-

+

subsp. sputorum

2.5. EXÁMEN DE LAS PLACAS El tiempo de incubación ideal es de 48 horas, aunque si el caso lo requiere, se pueden examinar a las 18-24 horas. Las colonias sospechosas pueden observarse

planas, no hemolíticas de aspecto acuoso,

grisáceas, con bordes irregulares y con tendencia a diseminarse. Muchas veces se pueden ver incoloras. Se les debe realizar una identificación presuntiva para su posterior confirmación y tipificación.

2.6. IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA Tinción de Gram: debido a que este microorganismo no se tiñe bien con safranina, se recomienda el uso de carbolfucsina al 0,8% como coloración de contraste. Teniendo en cuenta la morfología característica, es posible realizar solo la coloración simple con este colorante. Catalasa y oxidasa: ambas pruebas son positivas, se debe utilizar un buen inóculo. Motilidad: se realiza por microscopía óptica, de contraste de fase o campo oscuro donde se observa microorganismos espiralados o con forma de S con movimientos en espiral o tirabuzón.

2.7. IDENTIFICACIÓN FINAL Crecimiento a 42-43°C y a 25°C: suspender al microorganismo en agua destilada estéril hasta una densidad óptica del 1 de la escala de Mac Farland. Solo para identificar Campylobacter fetus Sembrar 0,5 ml de la suspensión en dos tubos con caldo brucella, incubar uno a 42-43°C y el otro a 25°C (temperatura ambiente). Controlar a las 48 horas si hubo o no desarrollo. Se puede usar placas de agar sangre o medios para Campylobacter. Sensibilidad al ácido nalidíxico y cefalotina: la suspensión anterior (1 en la escala de Mac Farland) se siembra con hisopo sobre la superficie de una placa de agar sangre, agar para antibiograma u otro medio para Campylobacter, colocar un disco de ácido nalidíxico de 30 µg. y un disco de cefalotina de 30 µg. Se incuba 48 horas y se observa el halo de inhibición, sin considerar el tamaño del mismo. Hidrólisis del hipurato: suspender una ansada de la cepa en 400ul de una solución hipurato de sodio al 1%. Luego de incubar a 37°C durante 2 horas, se le agrega 200ul de solución de ninhidrina al 3,5% en acetona-butanol 1:1 por la pared del tubo, se deja en reposo a 37ºC haciendo la lectura a los 10 minutos. La aparición de una coloración azul-púrpura indica una reacción positiva que revela la presencia de glicina, producto final de la hidrólisis del hipurato. Producción de ácido sulfhídrico: se determina depositando una ansada en el centro de la columna del tubo del medio de Lior. Los tubos se mantienen por 4 horas a temperatura ambiente. La aparición de una coloración negra alrededor del inóculo indica una reacción positiva. En caso de dudas, la incubación puede prolongarse a temperatura ambiente o a 37°C. Una alternativa consiste en usar medio de cultivo TSI o Kligler incubando en microaerofilia.

Crecimiento en Glicina al 1%: sembrar 0,1 ml de suspensión en un tubo de agar brucella semisólido con 1 % de glicina y rojo neutro como indicador. Incubar durante 3-5 días a 37°C en microaerofilia. Observar si se forma una delgada línea de desarrollo por debajo de la superficie. Crecimiento en ClNa al 3,5%: sembrar una anzada de una cepa en un tubo con caldo nutritivo con 3,5% de cloruro de sodio. Incubar 3-5 días a 37°C en microaerofilia. Observar si hay desarrollo (turbidez). Hidrólisis de indoxil acetato: se puede preparar por adición de 50 µl de una solución de indoxilacetato al 10% (p/v) en acetona a un disco standard y dejando secar al aire. Luego se deben guardar a 4°C en envase con desecante (sílicagel). En estas condiciones duran 1 año. La técnica se puede realizar de dos formas: -

Se adiciona una colonia del microorganismo sobre un disco y se agrega una gota de agua. Si se produce la hidrólisis aparece un color azul entre 10 y 15 minutos después.

-

El otro método consiste en suspender una colonia en 0,3 ml de agua destilada estéril y luego agregar el disco. La lectura se realiza igual que en el punto anterior.

Hidrólisis de 2, 3, 5 cloruro trifeniltetrazoliun: Esta prueba se utiliza como complementaria cuando hay dudas con la prueba de hidrólisis del hipurato para diferenciar C. jejuni de C. coli. Se deben cortar tiras de papel de filtro de 7cm por 1 cm embebidas en una solución de la sal de tetrazolium en agua destilada al 4% (p/v). Las tiras se secan a 60°C y se guardan a 5°C en frasco oscuro, manteniéndose estables por 6 meses. Se prepara la cepa y el medio como se ha descrito para la sensibilidad al ácido nalidíxico sustituyendo el disco por la tira impregnada con la sal de tetrazolium. Después de un periodo de incubación de 24 a 48 horas a 37º en microaerofilia se observa si ha habido o no inhibición del crecimiento. En caso de producirse desarrollo bacteriano éste se observa metalizado amarillento por reducción de la sal de formazán.

Tabla 2 - Características Bioquímicas de Especies de Campylobacter Termotolerantes

C. jejuni

C. coli

C. lari

C. upsaliensis

jejuni

doyle

Hidrólisis del hipurato

+

+

-

-

-

Oxidasa

+

+

+

+

+

Producción de catalasa

+

+

+

+

-/d

Crec. Caldo Cl Na 3,5%

-

-

-

-

-

Producción de SH2

-

-

-

+

-

R. Ac. Nalidíxico

V

V

S

R

S

R. cefalotina

R

V

R

R

S

Indoxil acetato

+

+

+

-

+

S

S

+

+

TTC Glycina 1%

S/d +

+

S: sensible R: resistente d: débil V: variable TTC: cloruro trifenil tretazolium

V

Tabla 3 - Características Bioquímicas de otras Especies de Campylobacter

C. fetus

Campylobacter

C. sputorum

C.

C.

C.

fetus

veneralis

hyointestinalis

sputorum

bubulus

curvus

rectus

chowae

Hidrólisis de hipurato

-

-

-

-

-

-

-

-

Oxidasa

+

+

+

+

+

Producción catalasa

+

+

+

-

-

-

-

+

Producción de SH2

-

-

+

+

+

+

+

+

R. Ac. nalidíxico

R

d

R

S

R

S

S

R

R. cefalotina

S

S

S

S

S

Indoxil acetato

-

-

-

-

-

+

+

+

Glycina 1%

+

-

+

+

+

+

+

V

S: sensible R: resistente d: débil V: variable TTC: cloruro trifenil tretazolium

S

CAPÍTULO III: ANEXOS

ANEXO I: CONSERVACIÓN DE CEPAS Para mantener una cepa por un tiempo breve, tomar una porción importante de cultivo con un hisopo estéril, colocarlo en un tubo con 5 ml de medio de transporte Cary-Blair. Conservar a 4°C. En estas condiciones el microorganismo se mantiene viable durante una semana. Para recuperarlo, sembrar con el hisopo una placa de agar sangre o agar Brucella con 5% de sangre

CRIOCONSERVACION CMSOP 008 •

Cultivar la cepa en caldo Brucella con sangre y suplemento FBP, incubar durante 36 horas a 42°C en atmósfera microaerófila.

•

Humedecer un hisopo estéril en el caldo y sembrar la superficie de una placa agar Brucella con sangre o agar sangre, incubar durante 48 horas a 42 °C en microaerofilia.

•

Cosechar el desarrollo de la placa en caldo Brucella-sangre-FBP con 15% de glicerina. Distribuir la suspensión en alícuotas de 0,5 ml en criotubos. Congelar a una temperatura de –70°C. Las cepas se mantienen viables durante un año.

•

Para recuperarlas, transferir el contenido de un vial a un tubo con 10 ml de caldo Brucella-sangre-FBP, incubar 48 horas a 42°C en microaerofilia y a partir de ahí, aislar en placas de agar Campy-sangre, agar Brucella-sangre o agar sangre.

Dr. Horacio Terzolo - INTA, Balcarce •

Una ansada de cultivo fresco se deposita en un vial conteniendo 0,5 ml. de caldo triptosa-fosfato con 5% de suero equino inactivado estéril y 17% de glicerol tindalizado.

•

Se congela a –70°C o en nitrógeno líquido antes de los 20 minutos.

•

Para recobrar el microorganismo, se descongela a temperatura ambiente e inmediatamente se siembra una ansada en una placa de agar sangre.

•

Otro medio que se puede utilizar es: Caldo Brucella 85 ml, Glicerol 15 ml.

•

El tiempo de sobrevida es de un año a –20°C y tres años a –70°C

CONSERVACIÓN A TEMPERATURA DE REFRIGERACIÓN Medio Campy huevo (Dr. Heriberto Fernández- Univ. Austral de Chile)

•

Caldo Brucella

2,8 g

Agar- agar

1,5 g

Metabisulfito de sodio

0,05 g

Sulfato ferroso

0,05 g

Piruvato de sodio

0,05 gr

Agua destilada c.s.p

100 ml

Preparar 200 ml del medio, autoclavar y adicionar un huevo estéril (lavar bien un huevo, colocar en alcohol por 2-3 horas, cascar sobre un mortero estéril, batir y adicionar al medio)

•

Fraccionar en viales.

•

Conservar a 4°C durante tres meses.

Medio de Wang Caldo Brucella con 0,5% de agar y 10% de sangre desfibrinada de oveja u otra. Inocular el cultivo por punción. Incubar durante 24 horas a 42°C en microaerofilia. Ajustar las tapas y sellar, los cultivos. Se mantienen viables durante 3 semanas a temperatura ambiente. Mayor tiempo por refrigeración.

ANEXO II

Campylobacter EN ALIMENTOS Las especies Campylobacter jejuni y Campylobacter coli están reconocidas como causantes de gastroenteritis en el hombre. Su estudio en este aspecto comienza en 1972 y actualmente el interés radica en la identificación y el control de las principales fuentes de infección: carnes de abasto, aves, leche y agua. Las Campylobacterias forman parte de la flora intestinal normal de animales: bovinos, ovinos, cerdo, cachorros de perros y gatos, aves de corral y salvajes. Las aves constituyen el principal reservorio de C. jejuni; es posible encontrarlas en heces y carcasas de aves recién sacrificadas y es probable la contaminación en los huevos. A pesar de ser portadoras del microorganismo, no muestran signos clínicos de la enfermedad. El ganado porcino es el principal portador de Campylobacter coli, pudiendo tener además Campylobacter jejuni como comensal habitual. El ganado vacuno contiene habitualmente C. jejuni en sus heces. Durante el sacrificio y la evisceración, se contaminan las canales, aunque es mucho menor que en el caso de las aves y los cerdos. La leche puede contaminarse a partir de las heces y ser causa de gastroenteritis cuando se la consume sin pasteurizar.

LOS ALIMENTOS COMO FUENTE DE INFECCIÓN Las prácticas tecnológicas en la elaboración de los alimentos contribuyen a la dispersión de microorganismo en los productos de origen animal. En las carnes de abasto, el nivel de contaminación por Campylobacter jejuni Campylobacter coli

desciende considerablemente a partir del

siguiente

y

día de

almacenamiento en refrigeración. Esto es comprensible teniendo en cuenta que la temperatura óptima de desarrollo es alta, 42-43°C requiriendo una temperatura mínima de 30°C. La incidencia de este germen es superior en productos de origen aviario, aún en condiciones de refrigeración, ya que la tasa de contaminación es mucho mayor que en animales de abasto. Otro alimento de origen animal, vector del microorganismo es la leche cruda contaminada con heces o procedentes de vacas con mastitis por Campylobacter.

CONTROL •

Procurar la cocción completa de los alimentos, sobre todo de aves de corral.

•

Mantener la higiene personal de manipuladores de alimentos.

•

Evitar que manipulen alimentos personas enfermas sobre todo con cuadros gastrointestinales.

•

No consumir leche cruda.

•

No consumir agua sin tratar.

•

Evitar contaminación cruzada de alimentos crudos a los cocidos.

INVESTIGACIÓN DE Campylobacter spp. Las técnicas de aislamiento de Campylobacter jejun y Campylobacter coli en alimentos, necesitan de medios de enriquecimiento esenciales para conseguir su rehabilitación y asegurar su detección. Los alimentos que se van a investigar, pueden estar altamente contaminados con una flora competitiva que hace difícil el crecimiento de Campylobacter. Por otra parte, el número puede ser escaso o su vitalidad disminuída o lesionada como consecuencia de las condiciones ambientales, de almacenamiento y procesamiento (calentamiento, desecación, congelación, acidulación). Se han sugerido numerosos medios de enriquecimiento selectivos, la mayoría de las veces se trata de modificaciones de los medios utilizados para el aislamiento. En general, al caldo base de la fórmula se le incorporan antibióticos como agentes selectivos entre los cuales tenemos: vancomicina, trimetroprim, polimixina B, anfotericina, cefalotina, actidiona, colistina y rifampicina. También llevan incorporados suplementos tales como sulfato ferroso, metabisulfito de sodio, piruvato de sodio (Suplemento FBP), cisteína, hematina, sangre equina y extracto de levadura. Los medios de enriquecimiento, una vez sembrados se incuban en atmósfera microaerófila a 42°C durante 48 horas. Si el alimento ha sido refrigerado o congelado, se debe realizar una pre-incubación a 37ºC, en microaerofilia, por 6 horas evitando que los medios contengan polimixina o rifampicina ya que las células sometidas a frío sufren una alteración en sus características biológicas haciéndose sensibles a los 42ºC y a estos antimicrobianos. Ó

PREPARACIN DE LAS MUESTRAS Las muestras pueden conservarse refrigeradas y protegidas del aire durante una a tres semanas. Una vez abiertos los envases deben ser analizadas, dado que la introducción de oxigeno provoca daño celular. 1-a

Carnes de origen bovino, porcino o aviar: sembrar muestras de 25 g en caldo de enriquecimiento (Agregar suplemento A y B). Incubar en atmósfera microaerófila a 37º C durante 3-4 horas, luego incubar a 42ºC, durante 24-48 horas. Sembrar en placa de agar selectivo (Preston, Skirrow, CDC), Incubar a 42ºC durante 48 horas.(*)

1-b

Alimentos congelados: luego de descongelar, sembrar muestras de 25 g en 100 ml de caldo de enriquecimiento, agregar suplemento A, incubar a 32ºC durante 3-4 horas en microaerofília. Agregar suplemento B, incubar a 37ºC por 2 horas. Continuar la incubación a 42ºC por 24-48 h (*)

1-c

Leche: pesar 100 g de leche en botella para centrifuga. Centrifugar a 16.000 g durante 20 minutos a 4ºC. Descartar la grasa y el sobrenadante. Suspender el pellet en 100 ml de caldo de enriquecimiento. Continuar el procedimiento según 1-a. (*)

1-d

Hisopados: sembrar los hisopos en 100 ml de caldo de enriquecimiento con agregado de suplementos A y B. Continuar el procedimiento como se indica en 1-a.(*)

Suplemento antibiótico A (agregar 5 ml de solución cada 1000 ml de medio base) Vancomicina

0,1 g

Trimetroprima

0,1 g

Agua destilada

50 ml

Suplemento antibiotico B

agregar 5 ml de solución cada 100 ml de medio base

Cefoperazona

0,032 g

Cicloheximida

0,1 g (opcional)

Caldo brucilla

50 ml

1-e Agua: los métodos para aislar Campylobacter no están estandarizados y deben ser considerados como procedimientos de investigación. En aguas de escasa turbidez se deben filtrar varios litros (1 a 4) a través de filtros de 47 mm de diametro y 0,45 µm de (*)

Extraido de: Isolation of Campylobacter from food. G. Sanders. Microbiology Research Division Bureau of Microbial Hazards, Food Directorate. Otawa, Canada. 1998

poro. Se coloca el o los filtros en un medio de enriquecimiento selectivo. Se incuba durante 24-48 hs. a 42ºC en atmósfera microaerobia. Luego de la incubación se siembra el cultivo en un medio selectivo. Si el agua es clorada se requiere el agregado de 5 ml de solución de tiosulfato de sodio 1M por litro en el momento de la toma de muestra. Si se trata de agua de mar o de otra agua con alto contenido de sales, lavar el filtrado con 100-1000 ml de buffer fosfato estéril. Campylobacter es sensible a altas concentraciones de sal. Para aislar Campylobacter de ríos, el uso de la tórula o hisopo de Moore también es recomendable.(**)

(**)

Extraido de: “Standard Methods” For the Examination of Water and Wastewater. 17 edition. APHA,AWWA, WPCF, USA. 1989.

ANEXO III

CAMPYLOBACTERIOSIS EN MEDICINA VETERINARIA Los animales mamíferos y las aves domésticas y silvestres constituyen el gran reservorio de Campylobacter jejuni pero muchas veces es difícil incriminar a este agente como causa de enfermedad diarreica ya que se encuentra una alta tasa de infección en animales clínicamente sanos. Bovinos: la enteritis por Campylobacter jejuni en terneros es clínicamente similar a la del hombre. Presentan fiebre moderada y diarrea que puede durar hasta 14 días. También es posible que este agente pueda causar mastitis en las vacas, como se demuestra en forma indirecta el hecho de que el hombre puede contraer la enfermedad por consumir leche no pasteurizada. La vibriosis genital causada principalmente por C. fetus subsp. veneralis y en menor grado por C. fetus subsp. fetus, es una las principales causas de infertilidad debido a una muerte embrionaria temprana. El síntoma principal es la repetición de celo después del servicio. En un brote, una alta proporción de hembras vuelven al servicio y tan solo de un 25 al 40 % de ellas quedan preñadas después de haber sido cubierta dos veces. Las que quedan finalmente preñadas abortan después de unos 5 meses de gestación. Una proporción de hembras albergan C. fetus subsp. veneralis durante toda la gestación y se constituyen una fuente de infección para los toros en la próxima estación de monta. Luego de la infección inicial, las hembras adquieren inmunidad y recuperan su fertilidad, los embriones se desarrollan normalmente, sin embargo, esta inmunidad es parcial y los animales pueden reinfectarse. La infección se transmite por el servicio natural o por inseminación artificial, los toros son portadores

normales, de manera temporaria. El agente etiológico es sensible a los

antibióticos que se agregan al semen en la práctica de inseminación artificial. Campylobacter fetus subsp. fetus es causante de abortos esporádicos, se eliminan por la materia fecal. Ovinos: C. jejuni es una importante causa de aborto en ovinos. En la aparición de brotes se le atribuye un papel similar al de C. fetus subsp. fetus y con menor frecuencia C. fetus subsp. veneralis.

Las ovejas abortan en el último período de la gestación o dan nacimiento a corderitos muertos o débiles que pueden morir a los pocos días. La infección también origina metritis o placentitis que pueden llevar a septicemia y muerte de las madres. Es bastante común una pérdida del 10 al 20% de los corderos. Los animales que se infectan adquieren inmunidad y no vuelven a abortar por unos 3 años. La transmisión de la infección se hace por vía oral, no se ha podido comprobar la transmisión venérea. Perros y gatos: cachorros con diarrea han constituido la fuente de infección de sus dueños. La diarrea es el síntoma predominante y el vómito es frecuente. La enteritis en gatos por C. jejuni es rara. Estos han sido descritos como reservorios de C. upsaliensis. Otros mamíferos: es probable que ocurra enteritis en muchas otras especies. Se describió en monos y también en potrillos.

DIAGNÓSTICO En el hombre el diagnóstico ha sido un hecho fortuito, al encontrar Campylobacter fetus en hemocultivos. Esta especie generalmente produce infección sistémica en pacientes inmunodeprimidos o con enfermedades de base debilitantes. Durante el período febril deben tomarse repetidas muestras de sangre. En caso de meningitis se debe realizar cultivo de líquido cefalorraquídeo. En los bovinos, el diagnóstico de la infertilidad se basa en la historia del rebaño, en el cultivo de la secreción prepucial y semen del toro y de mucus vaginal de vacas y vaquillonas no preñadas, como también en el cultivo de fetos abortados. Los materiales deben cultivarse dentro de las 6 horas de recogidos

ANEXO IV

MEDIOS DE CULTIVO Y CALDOS DE ENRIQUECIMIENTO

MEDIOS DE CULTIVO Preparacion de algunas drogas antimicrobianas para adicionar a los medios de cultivo

CEFALOTINA (Puede usarse cefazolina o cefoperazona) •

Concentración final: 15 µg/ml

•

Disolver 500 mg de la droga en 50 ml de agua destilada o solución tamponada.

•

Adicionar 1,5 ml de solución madre por litro de medio.

RIFAMPICINA •

Concentración final: 10 µg/ml

•

Disolver 500 mg de rifampicina en 5 ml de dimetilformamida o metanol y adicionar 45 ml de agua destilada o solución tamponada (buffer fosfato).

•

Adicionar 1 ml de solución madre por litro de medio.

COLISTIN •

Concentración final: 1 µg/ml (10000 U.I./ml)

•

Disolver 100 mg de Alficetin son solución al 505 de glicerina.

•

Adicionar 0,1 ml de solución madre por litro de medio.

VANCOMICINA •

Concentración final: 20 µg/ml

•

Disolver 500 mg de vancomicina en 50 ml de agua destilada.

•

Adicionar 2 ml de solución madre por litro de medio.

Las soluciones se pueden fraccionar en tubos con el volumen que se va adicionar al medio de cultivo; agregar a cada tubo 5 a 6 gotas de glicerol estéril. Mantener a –20ºC hasta el momento de su uso.

MEDIO DE SKIRROW (para 1000 ml) Agar Brucella

43 g

Mezcla antibiótica: Vancomicina

10 mg

Polimixina B

2500 U.I.

Trimetropim

5 mg

MEDIO SKIRROW MODIFICADO (para 1000 ml) Agar Brucilla

43 g

Mezcla antibiótica: Vancomicina

10 mg

Polimixina B

2500 U.I.

Trimetroprim

5 mg

Cefalotina

10 mg

Suplemento FBP: Sulfato ferroso

0,5 g

Metasulfito de Na

0,5 g

Piruvato de Na

0,5 g

Sangre

50 ml

Nota: El suplemento FBP se puede agregar al medio antes de autoclavar, pesándolo en el momento (0,5 g por litro de cada componente), o bien preparar una solución madre pesando 5 g de cada componente en 100 ml de agua destilada. Se esteriliza por filtración y se guarda en frasco oscuro hasta 3 meses. Agregar 10 ml de solución por litro de medio.

MEDIO DE BUTZLER Caldo tioglicolato

30 g

Agar agar

20 g

Mezcla antibiótica: Bacitracina

25000 U.I.

Novobioncina

5 mg

Cicloheximina

50 mg

Colistin

10000 U.I.

Cefazolina

15 mg

Sangre

150 mg

MEDIO DE PRESTON Caldo nutritivo

Nº 2 (OXOID)

Agar agar

20 g

Mezcla antibiótica: Polimixina B

2500 U.I.

Trimetroprim

10 mg

Actidiona

100 mg

Rifampicina

10 mg

Sangre

50 ml

MEDIO CAMPY-BAP (BLASER) Agar Brucilla

43 g

Mezcla antibiótica: Vancomicina

10 mg

Polimixina B

2500 U.I.

Anfotericina

2 mg

Trimetroprima

5 mg

Cefalotina

15 mg

Sangre

50 ml

Otra mezcla antibiótica: Vancomicina

10 mg

Cefoperazona

32 mg

MEDIO CDC (Blood-free agar) (para 1000 ml) Caldo nutritivo Nº 2

2,5 g

Carbón

4g

Caseina hidrolizada

3g

Desoxicolato de sodio

1g

Sulfato ferroso

0,25 g

Piruvato de sodio

0,25 g

Agar

12 g

Mezcla antibiótica: Cefoperazona

0,032 g

Anfotericina B

0,010 g

MEDIO DE TRANSPORTE

CARY BLAIR Tioglicolato de sodio

1,5 g

Fosfato disódico

1,1 g

Cloruro de sodio

5g

Agar

5g

Cloruro de Calcio (sol 1%)

9 ml

Agua destilada

991 ml

Ph

8,4

MEDIOS PARA TIPIFICACIÓN

MEDIO DE LIOR PARA DETECCIÓN DE SH2 Caldo nutritivo Nº 2 (OXOID)

2,5 g

Agar agar

0,12 g

Sulfato ferroso

0,5 g

Metabisulfito de sodio

0,05 g

Piruvato de sodio

0,05 g

Agua destilada

100 ml

AGAR BRUCELLA 1% GLYCINA Caldo brucella

28 g

Citrato de sodio

0,1 g

Agar

1,8 g

Glycina

10 g

Solución 0,2 % rojo neutro

10 ml

Agua destilada

1000 ml

PH

7

CALDO BRUCELLA CON ClNa 3,5%

CALDOS DE ENRIQUECIMIENTO

CALDO PRESTON Peptona

10 g

Cloruro de sodio

5g

Piruvato de sodio

0,25 g

Metabisulfito de Na

0,25 g

Sulfato ferroso

0,25 g

Polimixina B

5000 U.I.

Trimetroprim

10 mg

Rifampicina

10 mg

Cicloheximida

100 mg

Agua destilada

1000 ml

Sangre equina

50 ml

CALDO BOLTON Peptona de carne

10 g

Lactoalbúmina

5g

Extracto de levadura

5g

Cloruro de sodio

5g

Hemina

10 mg

Ac. Alfa cetoglutámico

1g

Piruvato de sodio

0,5 g

Metabisulfito de Na

0,5 g

Carbonato de sodio

0,6 g

Cefoperazona

20 mg

Vancomicina

20 mg

Cicloheximida

50 mg

Agua destilada

1000 ml

Sangre equina

50 ml

CALDO HUNT Caldo nutritivo Nº2

25 g

Extracto de levadura

6g

Agua destilada

950 ml

Suplemento FBP

4 ml

Vancomicina

10 mg

Trimetroprima

12,5 mg

Cefoperazona

15 mg

Anfotericina

2 mg

Sangre equina

50 ml

CALDO PARK AND SANDERS Medio base: Triptona

10 g

Peptona P

10 g

Glucosa

1g

Extracto de levadura

2g

Citrato de sodio

1g

Cloruro de sodio

5g

Metabisulfito de Na

0,1 g

Agua destilada

1000 ml

Solución antibiótica A: Trimetroprima

0,1 g

Caldo brucella

50 ml

Vancomicina

0,1 g

Medio completo: Medio base

950 ml

Sangre equina

50 ml

Solución antibiótica A

5 ml

ANEXO V

APLICACIÓN DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) EN LA IDENTIFICACIÓN GENOTÍPICA DE • Campylobacter spp. • Campylobacter termotolerantes • Campylobacter jejuni/coli. • Campylobacter lari Campylobacter actualmente es considerado dentro de los patógenos emergentes (1) y el Género agrupa bacilos gram-negativos curvos, espiralados o en forma de S que presenta un flagelo único en uno o ambos extremos lo que le confiere una gran movilidad. En cultivos de varios días (más de tres) degeneran en formas esféricas u ovoides (cocoides) perdiendo su viabilidad (2). Requieren de condiciones de microaerofilia, con una atmósfera compuesta de 85% de nitrogeno, 10% de dioxido de carbono, y 5% de oxigeno, que puede obtenerse por recambio de gases o generadores de origen comercial.(2,9) En función de la temperatura de crecimiento, las especies se agrupan en termófilas y no termófilas. Especies termófilas son aquellas capaces de crecer a 42-43°C pero no a 25°C y comprenden a C. jejuni (subespecies jejuni y doylei), C. coli, C. laridi (biovar ureasa + y -) y C. upsaliensis (3). De este grupo, Campylobacter jejuni (subespecie jejuni) es agente causal de diarreas, siendo considerado el más virulento por su mayor resistencia a la fagocitosis, en contraste con C. coli que produce cuadros mas benignos. Ambas especies están relacionadas con diarrea aguda del viajero. Se encuentran como comensales en el tracto gastrointestinal de un amplio número de animales como: vacas, ovejas, cerdos, cabras, perros, gatos, roedores domésticos y silvestres y principalmente en todas las variedades de aves de corral y silvestres, a las cuales se ha adaptado perfectamente, es por ello que su temperatura óptima de desarrollo es de 42-43º C (9). En los animales de abasto, durante la evisceración se produce contaminación de la canal, que desciende considerablemente durante el almacenamiento en refrigeración. En cambio, en las carnes de origen aviario, la contaminación durante la faena es alta por su carácter de portador sano, por otro lado los pliegues de la piel del ave ofrece una atmósfera favorable para la supervivencia del microorganismo. (5, 9)

Las especies no termófilas incluyen a C. fetus, C. hyointestinalis, C. consisus, C. rectus, C. sputorum y C. showae y dentro de este grupo, C. fetus (subsp. fetus y veneralis) posee gran importancia en el área veterinaria, pues producen aborto esporádico en el ganado bovino y ovino, siendo considerado un patógeno oportunista para el hombre, donde se lo puede aislar de hemocultivos. (4). El estudio fenotípico del género Campylobacter es dificultoso por la escasa cantidad de pruebas bioquímicas disponibles y su difícil interpretación. Por otro lado es cada vez de mayor interés el tamizaje por métodos rápidos de pollos en la etapa previa al faenado, asi como de alimentos para consumo humano, siendo en este caso herramientas importantes en la salud pública. Muchas veces se encuentran en bajo recuento, respecto a la carga bacteriana acompañante y en el alimento, además, sufren una injuria durante el procesado que disminuye su viabilidad (pH, oxigeno, temperatura y deshidratación).Su detección antes del faenado permitiría eliminarlo previamente a la producción del mismo. Por ello se han desarrollado técnicas moleculares tanto para la detección del género Campylobacter (15) como para las especies termotolerantes(16), que son las de mayor interés como patógenos alimentarios. PCR para la detección del género Campylobacter spp. Permite la detección de todas las especies del género, lo que da la posibilidad detectar otras especies distintas de la termotolerantes, donde muchas veces el cultivo es dificultoso, ya sea porque se realiza a 42°C y no las detecta, o porque son sensibles a los antibióticos que se usan para barrer la flora acompañante. Se desarrolló una PCR con una secuencia del gen 16S rRNA que abarca todo el género y que amplifica un fragmento de 816 bp (15) PCR para la detección de Campylobacter termotolerantes Con la finalidad de desarrollar una PCR que abarque a las tres especies más importantes como agentes de gastroenteritis de origen alimentario del Género Campylobacter se desarrolló una PCR para las especies termotolerantes , que amplifica una secuencia de 287 bp del gen 16S rRNA (16) PCR-Múltiple para la diferenciación de Campylobacter jejuni y coli Los métodos de cultivo tradicionales para la identificación de C. jejuni y C. coli son lentos y tediosos, ya que requieren

de aproximadamente 5 días para el aislamiento y

caracterización del microorganismo desde muestras clínicas o alimentos (2,5).

Por otra parte, la diferenciación de C. jejuni de otros microorganismos del mismo género basada en la prueba de la hidrólisis del hipurato aunque no siempre permite definir con precisión la identificación (6). La reacción de PCR para la diferenciación de C. jejuni y C. coli fue desarrollada con el uso de primers según la secuencia nucleotídica de sondas monoespecíficas basadas en el gen altamente conservado glyA que codifica para una serinhidroximetiltransferasa (6, 7, 8). Una banda de 773 pb para C. jejuni .Una banda de 364 pb para C. coli. PCR para la detección de Campylobacter lari Se desarrolló una PCR para la detección específica de Campylobacter lari, que es una especie muy comúnmente encontrada como portadora en aves, por lo que es de interés su detección en las mismas asi como en alimentos derivados. Se ha demostrado que es un patógeno en el hombre. Se amplificó un gen 16 S rRNA específico obteniéndose un fragmento de 561 bp.(15)

FICHA TECNICA

OBJETIVO Detectar cepas del género Campylobacter y caracterizar especies termotolerantes de Campylobacter a partir de aislamientos procedentes de diferentes muestras o desde cepa pura.

MUESTRAS •

Materia fecal

•

Alimentos

•

Agua

•

Cepa aislada

EXTRACCIÓN DE ADN Se realiza de del mismo modo para todas las PCR A.- A partir de colonias

•

Tomar una ansada de colonias de Campylobacter desarrolladas en agar sangre a 42ºC durante 24 h o durante 48 h a 37ºC, en condiciones de microaerofilia,

•

Resuspender en un tubo eppendorff de 1,5 ml de capacidad conteniendo 0,5 ml agua destilada calidad molecular estéril.

•

Someter la suspensión a 100ºC durante 10 minutos en baño maría o bloque térmico

•

Centrifugar 10 min a 12000 rpm.

•

Mantener a -20°C hasta su utilización como templado en la reacción de PCR.

B.- A partir de hamburguesas de pollo Se adaptó en el laboratorio la técnica descripta en el Manual BAM y la norma ISO10272-1 para la investigación

desde el punto de vista bacteriológico, de Campylobacter spp en

muestras de alimentos. Para el procesamiento de cada tipo de alimento deberá aplicarse la norma específica ISO 6887. El método de extracción de DNA de las muestras y sus enriquecimientos se realizo a partir de publicaciones de científicos que están desarrollando una metodología normatizada a nível internacional.

Procesamiento de la muestra (11): pesar en forma estéril 25 g de hamburguesa y colocar en un frasco de boca ancha con tapa a rosca conteniendo 100 ml de sol. Fisiológica estéril. Agitar vigorosamente durante

5 minutos

y dejar decantar 10 minutos

a temperatura

ambiente. Filtrar con gasa estéril, recogiendo el contenido en tubo estéril, a partir de alli, pasar 10 ml a un erlenmeyer de 250 ml de capacidad, conteniendo 100 ml de caldo Bolton, con tapón de algodón. Incubar en microaerofilia 4 hs a 37ºC y luego overnigth a 42ºC

Preparación de los templados (12): Se realiza los templados desde: •

Lavado

•

Enriquecimiento

Favorece el procesamiento el uso de una resina (Chellex) que produce la extracción de las impurezas que pueda contener el alimento y/o el medio de cultivo, las que pueden ser inhibidoras de la PCR.

Realizar por duplicado Colocando 1 ml de la suspensión del lavado filtrada con gasa, y 1 ml del caldo Bolton del enriquecimiento, en tubo eppendorff. Centrifugar 5 minutos a 12.000 rpm.

A) A uno de los pellets obtenidos se le realiza un lavado con 1 ml de Solución Fisiológica estéril. Resuspender el pellet en 300 ul de agua calidad molecular y calentar 8 a 10 minutos a 100 ºC en BM o bloque térmico Enfriar y centrifugar 10 minutos a 12.000rpm. Se usa el sobrenadante como templado

B) Al otro pellet se le coloca 300 ul de suspensión de resina chellex al 6% en agua. Resuspenderlo con vortex, calentar 20 minutos a 56ºC en BM. Agitar nuevamente en vortex 10 segundos y colocar 8 minutos a 100ºC. en BM o bloque Enfriar y centrifugar a 12.000 rpm 5 minutos . Se usa el sobrenadante como templado. Se debe tener especial cuidado de no arrastrar restos de la resina al tomar el templado, ya que inhibe la reacción de PCR.

PRIMERS

Género Campylobcter spp. C412 foward

5’GGATGACACTTTTCGGAGC 3’

C 1288 reverse 5’ CATTGTAGCACGTGTGTC 3’

Campylobacter termotolerantes 16 S OT 1559 foward: 5’ CTGCTTAACACAAGTTGAGTAGG 3’ 16S 18.1 reverse:

5’ TTCCTTAGGTACCGTCAGAA 3’

Múltiple Campylobacter jejuni/coli Col 1:

5’ - AGG CAA GGG AGC CTT TAA TC - 3’

Col 2:

5 ’- TAT CCC TAT CTA CAA ATT CGC - 3’

Jun 3:

5’ - CAT CTT CCC TAG TCA AGC CT - 3’

Jun 4: 5’ - AAG ATA TGG CAC TAG CAA GAC - 3’

Campylobacter lari CL 594 foward

5’CAAGTCTCTTGTGAAATCCAAC 3’

CL 1155 reverse 5’ ATTTAGAGTGCTCACCCGAAG3’

MEZCLA DE REACCIÓN

PCR Género, termotolerantes y C. lari Volumen Reactivos

por muestra( µl )

H2O calidad molecular

11,8

Concentración en la reacción

Buffer 50 mM Tris-HCl 10X

2,5

1X

Cl2Mg 50mM

1

2 mM

dNTP (mix) 2.5 mM

2

0.2mM

primer foward 10uM

1,25

0,5 µM

primer reverse 10uM

1,25

0,5 µM

taq DNA polimerasa 5U/µl

0,2

1U/ensayo

DNA

5

aproxim. 100 ng

Vol Final

25

Múltiple Campylobacter jejuni/coli Volumen Reactivos

por muestra( µl )

H2O calidad molecular

5,75

Concentración en la reacción

Buffer 50 mM Tris-HCl 10X

2,5

1X

Cl2Mg 50mM

1

2 mM

10 mg/ml BSA

0,5

0,02g% (5 ug/25 ul)

dNTP (mix) 2.5 mM

2

0.2mM

primer Jun 3 10uM

2

0,8 µM

primer Jun 4 10uM

2

0,8 µM

primer coli 1 10uM

2

0,8 µM

primer coli 2 10uM

2

0,8 µM

taq DNA polimerasa 5U/µl

0,25

1,25U/ensayo

DNA

5

aproxim. 100 ng

Vol Final

25

PROTOCOLO DE AMPLIFICACIÓN GÉNERO Campylobacter 1 ciclo

94°C

4 min

25 ciclos

94 °C

1min

55 ºC

1min

72° C

1 min

1 ciclo final 72°C

10 min

Campylobacter termotolerantes 1 ciclo

94ºC

2 min

35 ciclos

94ºC

30 seg

58ºC

15 seg

72ºC

30 seg

1 ciclo final 72ºC

4 min

Campylobacter lari 1 ciclo

94ºC

2 min

25 ciclos

94ºC 1 min 64ºC 1 min 72ºC 1 min

1 ciclo final 72ºC 2 min

Múltiple Campylobacter jejuni/ coli Una etapa inicial de: 5 minutos a 94°C 2 ciclos de: 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 64°C, 1 minuto a 72°C 2 ciclos de: 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 62°C, 1 minuto a 72°C

2 ciclos de: 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 60°C, 1 minuto a 72°C 2 ciclos de: 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 58°C, 1 minuto a 72°C 2 ciclos de: 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 56°C, 1 minuto a 72°C 30 ciclos de: 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 54°C, 1 minuto a 72°C Un ciclo final de: 10 minuto a 72°C.

Visualización de productos de PCR Es común a todos los protocolos detallados anteriormente. Se realiza la electroforesis en gel de agarosa al 2% en buffer TAE a 100 V por 40 minutos usando como buffer de corrida TAE 1X (Tris 0.04 M, EDTA 0.001M).

Productos de amplificación

Múltiple Campylobacter jejuni/coli

Figura 1: Múltiple para diferenciación de C. jejuni y C. coli M

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

773 pb C. 364 pb C.

Figura 2: Electroforesis en gel de agarosa de la reacción de PCR- Simple y Múltiple específica de especie Campylobacter jejuni /Campylobacter coli.

Calle M: marcador de peso molecular de 100 pb, calle 1: Salmonella spp.; calle 2: Pseudomonas aeruginosa, calle 3: Enterococcus spp., calle 4: Escherichia coli, calle 5: Klebsiella spp., calle 6: Staphylococcus spp, calle 7: cepa control Campylobacter jejuni, calle 8

Se procesaron 3 hamburguesas. Se aislaron tres cepas por la técnica bacteriológica convencional. Se realizó PCR a los lavados, con y sin el uso de chellex, observándose que su uso permitió visualizar la presencia de Campylobacter en las tres hamburguesas. En la H2 se observa co- infeccion de C.jejuni y C coli. Al realizar la PCR a los aislamientos obtenidos por la técnica bacteriológica se corroboró el hallazgo. En la H3 no se obtuvo las dos bandas que se ven en el lavado, quizá por haberse aislado muy escasas colonias que resultaron ser C. coli Esto revela la utilidad del método de detección molecular directo sobre el lavado del alimento.

Género Campylobacter

Fragmento de 816bp Se realizó un control de especificidad de distintas especies de Campylobacter y, como inespecíficas, cepas de E. coli, Klebsiella pneumoniae, y Streptococcus spp.

Campylobacter Termotolerantes Cálculo de la Sensibilidad Se realizó una serie de diluciones a partir de una escala Mc Farlan N°3 desde 10-7 hasta 10-1 en sol fisiológica y en agua. Se obtuvo en ambos diluyentes una banda de 287bp hasta la dilución 10-4.

Sol fisiológica

Agua

Se realizaron diluciones de una suspensión de C. jejuni ajustada a la escala Nº3 de Mc Farland. Se obtuvo un pellet que se resuspendió en una sol de lavado de 25 g de hamburguesa

en 100 ml de sol fisiológica. A partir de ellas se realizó el templado con y sin resina chellex. Se realizó la PCR obteniéndose una banda a 287bp con una sensibilidad de 10-4 con la resina. Sin resina no se ve banda por el efecto inhibidor de la matriz sobre la polimerasa La sensibilidad con la resina es la misma que la obtenida con la suspensión en sol fisiológica y agua

C. lari

Fragmento de 561 bp. Se realizó un control de especificidad con otros Campylobacter y con distintas especies bacterianas (E. coli, Klebsiella pneumoniae y Streptococcus spp.)

REFERENCIAS 1. Fernandez H. Martin T., Thibaut J., Campylobacter jejuni y Campylobacter coli resistentes a fluoroquinolonas en animales domésticos. Arch Med. Vet. XXVIII, Nº 1, 1996 2. Fernandez H., Trabulsi L. Invasive and enterotoxic properties in Campylobacter jejuni and Canpylobacter coli strains isolated from humans and animals. Biol. Res. 28: 205210, 1995 3. Fernandez H., Thermotolerant Campylobacter species associated with human diarrhea in Latin America. J Brazilian Assoc Advanc Sci. Vol.44(1) Jan/feb,1992 4. Hubert P., Gijs J., Zwinderman A., Reijden T. Comparision of six media including a semisolid agar for isolation of various Campylobacters species from stool specimens. J. Clin Microbiol. p 1007-1010. May 1991 5. Lastovica A., Roux E. Penner J. “Campylobacter upsaliensis” isolated from blood cultures of pediatric patients. J. Clin. Microbiol. p 657-659. Apr. 1989 6. Nachamkin I., Barbagallo S. Culture confirmation of Campylobacter spp. by latex agglutination. J. Clin. Microbiol. p 817-818, 1990. 7. Pinto, A. M., Aplicación del método de filtración para la detección de Campylobacter spp en heces. Fundación Instituto de Tecnología de Alimentos, Agosto, 1999, SucreBolivia. 8. Rosef O., Gondrosen B., Kapperud G., Underdal B., Isolation and characterization of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli from domestic and wild mammals in Norway. Appl Envirom Microbiol. p. 855-859. Oct, 1983. 9. Reina J., Análisis de los mecanismos de patogenicidad y virulencia descritos en las campilobacterias. Enferm Infec. Microbiol. Clin. Vol 11. Nº 9. Nov, 1993. 10. Sanchez R., Fernandez V., Diaz M., Muñoz P. Evolution of suceptibilities of Campylobacter spp. to quinolones and macrolides. Antim Agents Chemoth. p 18791882. Sept, 1998. 11. Wempe J., Genigeorgis C., Farver T., Yusufu H. Prevalence of Campylobacter jejuni in two California chicken processing plant. Appl. Envirom. Microbiol. p. 355-359. Feb, 1983.

12. Yusufu H., Genigeorgis C., Farver T., Wempe J. Prevalence of Campylobacter jejuni at different sampling sites in two California Turkey processing plants. J. Food. Protect., Vol 46 Nº 10 p. 868-872. Oct., 1983 13. Altekruse Sean F., Stern N., Fields P., and Swedlow D. Campylobacter jejuni – An Emerging Foodborne Pathogen. Emerg. Infect. Dis. Vol. 5 Nº1, Jan-March, 1999. 14. A global Salmonella surveillance and laboratory support project of the World Health Organization. Múltiple PCR for differentiation of C. coli and C. jejuni. Laboratory Protocols, Training Course, Feb 2003. 15. D Linton, RJ Owen and J Stanley.Rapid identification by PCR of the genus Campylobacter and of five Campylobacter species enteropathogenic for man and animals. Res. Microbiol. 147:707-18-1996. 16. PS Lubeck, P Wolffs, SLW On, P Ahrens,P Rädstrom and J Hoorfar.Toward an international Standard for PCR-based detection of food-borne thermotolerant Campylobacters: assay development and analytical validation.Appl. Environm. Microbiol. 69(9): 5664-69.2003

AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN, CARACTERIZACIÓN Y PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A ANTIMICROBIANOS DE Vibrio cholerae spp. CAPÍTULO I: AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN, CARACTERIZACIÓN DE Vibrio cholerae spp. 1.1. INTRODUCCIÓN El cólera es una de las enfermedades infecciosas que se conocen de más larga data, existiendo reportes de esta patología desde 1817 (Colwell et al., 1996). El agente etiológico del cólera es Vibrio cholerae. Este bacilo gram-negativo, anaerobio facultativo y móvil, fue descripto por primera vez en 1854 por Pacini en Italia y en 1883 por Robert Koch. El cólera se ha manifestado como una enfermedad epidémica desde la antigüedad y las manifestaciones clínicas de la infección varían desde una infección asintomática hasta una diarrea severa. La patología en su forma más severa se caracteriza por una profusa diarrea acuosa (deposiciones como “agua de arroz”), vómitos y deshidratación con gran pérdida de sales y agua; si no es adecuadamente tratada podría desencadenarse un shock hipovolémico, acidosis metabólica, falla renal y la muerte. Estas manifestaciones clínicas fueron atribuidas a la presencia de la toxina de cólera (CT) en V. cholerae, que fue demostrada en 1959 por científicos de la India (De SN, 1959). En 1987 se identificó un factor de virulencia adicional, implicado en la adherencia de V. cholerae a células intestinales que se denominó “toxin coregulated pilus” (TCP) (Taylor et al., 1987). En base a diferencias en el antígeno somático “O”, V. cholerae ha sido clasificado en numerosos serogrupos, siendo reconocidos al menos 200 hasta el año 1997 (Yamai et al, 1997). De estos serogrupos, sólo el O1 y, más recientemente, el O139 (Kaper, 1995) han causado epidemias de cólera. Sin embargo, cepas pertenecientes a serogrupos no-O1, noO139, han sido aisladas de pacientes con síntomas que van desde diarrea leve hasta deshidratación severa semejante a cólera (Levine, 1988). Por otra parte, Vibrio cholerae noO1 puede causar infecciones tales como: apendicitis aguda, colecistitis aguda, otitis media, celulitis, neumonía, meningoencefalitis y septicemia (Sanyal et al, 1992) Estas lesiones indicarían que estas cepas podrían tener propiedades invasivas en adición a su enterotoxicidad.

La mayoría de los aislamientos de serogrupos O1 y O139 producen CT y han sido asociados con el cólera epidémico, aunque se han aislados cepas de estos serogrupos que no producen dicha toxina y no estuvieron involucrados en epidemias (Faruque, 1998; Pichel, 2003). Transmisión del cólera La infección por V. cholerae es adquirida por la ingestión de agua o alimentos contaminados consumidos crudos o insuficientemente cocidos. Uno de los tipos de alimento involucrados son los moluscos bivalvos que se contaminan en el medio marino. Las almejas, ostras, mejillones se suelen consumir crudos o con un tratamiento de calor mínimo, en los cuales, V. cholerae puede ser no sólo contaminante de superficie, sino estar presentes en su tracto intestinal, ya que estas especies son filtradoras y concentran el microorganismo (Costagliola, 2000). La posibilidad que se desencadene un brote de cólera en una región dada depende de varios factores: el número de individuos susceptibles, la exposición a aguas cloacales o agua no tratada y alimentos contaminados, y la presencia de un reservorio acuático de V. cholerae. La interacción de estas variables podría explicar la aparición del cólera endémico en forma estacional o el surgimiento del cólera epidémico (Fig. 1). FIGURA 1. Diagrama modelo de la dinámica de transmisión de Vibrio cholerae adaptado de Torres Codeço, 2001

Población

Población susceptible susceptible

En función de la concentración de V. cholerae en el agua contaminada o alimento de origen marino

Factores ambientales Cambios climáticos: temperatura de agua, nutrientes e interacciones

En función del grado de exposición al

Población

Población infectada Infectada

A través de la excreción incrementa la población bacteriana

Agua contaminada con Vibrio cholerae

Ecología de Vibrio cholerae Vibrio cholerae es un habitante autóctono de los ecosistemas acuáticos, tanto en ríos, como en estuarios y en ambientes marinos. Tanto en áreas endémicas como epidémicas, los brotes de cólera siguen un patrón estacional, apareciendo de forma explosiva en varios focos simultáneamente, indicando un posible rol de factores ambientales en la aparición de las epidemias. El medio acuático ha sido reconocido como reservorio y vehículo para la transmisión de V. cholerae en numerosos estudios (Colwell, 1996). Durante el curso de un brote, es posible aislar V. cholerae O1 de pacientes y de muestras ambientales. Así, se ha determinado la presencia del microorganismo en aguas superficiales, de río, estanque y pozo (Tamplin, 1991). Sin embargo, en los períodos inter-epidémicos no es posible recuperar V. cholerae O1 empleando los métodos de cultivo tradicionales. (Colwell, 2000). Rita Colwell y col han demostrado la existencia de la forma “durmiente” viable pero no cultivable (VNC) a la cual “entra” V.cholerae en respuesta a condiciones desfavorables de nutrientes y ambientales: baja concentración de nutrientes, temperatura, pH o salinidad distintos a los óptimos (Colwell ,1994). Se postula que las formas VNC explicarían la manera en que V. cholerae se mantiene en el ambiente durante los períodos inter-epidémicos. La asociación con el fito y zooplancton, en particular con copépodos, a través de la actividad quitinasa de V. cholerae, facilitaría la sobrevida del microorganismo en el ambiente acuático, asegurando su persistencia por largo tiempo en condiciones adversas. El florecimiento de las distintas especies de plancton, relacionado a su vez con cambios climáticos, explicaría la estacionalidad de los brotes de cólera. En condiciones adecuadas, las formas VNC pueden revertir al estado cultivable, manifestando plenamente su capacidad de infección, patogenicidad y transmisibilidad.

Mecanismos de patogénesis de Vibrio cholerae Los principales factores de virulencia asociados a cepas epidémicas O1 y O139, incluyen la enterotoxina de cólera (CT) y el factor de colonización “toxin co-regulated pilus” (TCP), que confiere la habilidad de colonizar el intestino delgado. Este factor de colonización esencial, actúa además como receptor para el fago ctxφ, que contiene los genes para la síntesis de CT (Waldor, 1996). La proteína estructural de la fimbria TCP está codificada en el gen tcpA, que presenta alta variabilidad según lo descripto recientemente (Nandi et al, 2000). Esta hipervariabilidad en la superficie de la bacteria le permite escapar del reconocimiento por el sistema inmune del huésped.

Además de CT y TCP, otros factores de virulencia han sido identificados en aislamientos de V. cholerae como: hemolisinas, proteína reguladora (ToxR), citotoxinas (RTX) y toxina termoestable (ST) entre otros. Por lo tanto el estudio de la distribución de los distintos genes asociados a virulencia en cepas de V. cholerae permite evaluar el potencial patogénico de las mismas. La toxina ST actúa estimulando la actividad de guanilato ciclasa, promoviendo la secreción de Cl- y/o inhibiendo la absorción de Na+ y agua (Forte et al., 1992, Vicente A., 1997). A nivel molecular, los principales genes asociados a patogenicidad de V. cholerae se encuentran en regiones del cromosoma en forma de “clusters” o islas de patogenicidad, teniendo la capacidad de ser propagados horizontalmente (Karaolis et al. 1998, Heidelberg 2000). Esto sugiere que cepas ambientales pueden volverse más virulentas para el hombre a través de la adquisición de genes de patogenicidad.

Epidemiología del cólera en América Vibrio cholerae es uno de los principales agentes etiológicos de diarrea en niños y adultos, particularmente en áreas donde el cólera es endémico. El cólera reemergió en América Latina en enero de 1991 (Levine, 1991), luego de 100 años, en forma de una explosiva epidemia que comenzó en Perú. Esta epidemia fue causada por V. cholerae O1 biotipo El Tor. En Argentina, entre 1992 y 1998 ocurrieron siete brotes de cólera, principalmente en el norte del país, y en períodos estivales. En general en el continente Latinoamericano se presentan casos de cólera asociados a brotes epidémicos y que aún no pueden considerarse endémicos. En los últimos años, se registró una disminución en el número de casos, como también zonas libres de cólera en el continente Americano. Sin embargo, es importante sostener una continua vigilancia para prevenir futuros brotes, especialmente ante la evidencia de la presencia de reservorios de V. cholerae O1 viable no cultivable, según lo observado en Argentina, en el Río de la Plata y en la plataforma marina bonaerense (Binsztein 2004).

I.2. GUIA PARA EL PROCESAMIENTO DE MUESTRAS DE MATERIA FECAL Y MUESTRAS DE AGUA Se presentan en las figuras 1 y 2 los esquemas para el aislamiento e identificación del microorganismo a partir de muestras de materia fecal y de agua. FIGURA 1- FLUJOGRAMA PARA EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Vibrio cholerae A PARTIR DE MATERIA FECAL

MUESTRA DE MATERIA FECAL EN CARY BLAIR

APA

6 a 8 hs 37º C Agar TCBS / TSA

18 a 24 hs 37º Pruebas bioquímicas mínimas Oxidasa/ estría TSA /Kliger / LIA /Indol del Triptofano

Identificación y caracterización por PCR, a partir de TSA PCR V. cholerae / ctx/ tcpA El Tor

PCR O1 / O139

18 a 24 hs 37º C Pruebas Bioquímicas complementarias* Seroagrupamiento O1, O139 a partir de estría TSA

V. cholerae O1, O139 o no-O1, no-O139 APA: Agua Peptonada Alcalina TCBS: Agar Tiosulfato Citrato sales Biliares Sacarosa TSA: Agar Tripticasa de Soja LIA: Agar Lisina Hierro * Pruebas bioquímicas complementarias: Lisina decarboxilasa, Arginina dehidrolasa Ornitina decarboxilasa Rojo de metilo/Voges Proskauer Crecimiento en caldo con NaCl al 0,1, 6, 8 y 10 %

FIGURA 2.- FLUJOGRAMA PARA EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Vibrio cholerae A PARTIR DE MUESTRA DE AGUA 5 litros de muestra de agua

Filtrado 2 ltrs a través 0,22 um

Filtrado 3 ltrs a través 0,22 um

Extracción ADN a partir de los filtros

Filtros + 50 ml APA

Incubar 36 ± 1 ºC x 6-8 horas

TCBS – TSA o T1N1 - Oxidasa

Extracción ADN por hervido

PCR Vibrio cholerae ctxA/tcpA/El Tor O1/O139

Identificación bioquímica y serotipificación Identificación de aislamientos de Vibrio cholerae por PCR Detección de Vibrio cholerae viable no cultivable y cultivable

T1N1: agar ClNa 1%, triptona 1%

RECOLECCIÓN Y TRANSPORTE DE MUESTRAS

MATERIA FECAL Equipamiento •

Hisopos

•

Recipiente estéril para recolección de material biológico

•

Refrigerador (4ºC)

Medios •

Medio de transporte Cary Blair

La muestra debe obtenerse en el período agudo de la enfermedad, antes de iniciar el tratamiento con antimicrobianos. Con un hisopo estéril, se recoge una pequeña cantidad de una evacuación espontánea reciente. En caso de no poder obtener esta muestra, se hace un hisopado rectal. Si la muestra puede ser procesada dentro de las dos horas de la extracción se debe depositar en un recipiente estéril. Las muestras que no se pueden procesar dentro de las dos horas, se deben colocar en medio de transporte Cary–Blair, que tiene la ventaja de ser estable hasta 18 meses después de su preparación, cuando las condiciones de almacenamiento son correctas. En este medio de transporte se puede conservar la muestra hasta 5 días. Deben transportarse a temperatura ambiente y si hace mucho calor se pueden utilizar refrigerantes, pero sin llegar a congelar las muestras.

MUESTRAS DE AGUA Para el análisis de muestras ambientales, deberá colectarse el volumen a analizar lejos de la descarga de la embarcación (en la proa) con un recipiente aséptico. Como se indica en el Flujograma de aislamiento (Figura 2) se recomienda filtrar 5 litros de agua a través de membrana de policarbonato de 0.22 µm. para la detección de V. cholerae viable cultivable (2 litros) y no cultivable (3 litros). Para el aislamiento, el/los filtros utilizados para la filtración de 2 litros de agua deberán colocarse en 50 ml de medio de enriquecimiento APA e incubar 6-8 hs a 37ºC; luego tomar con ansa una alícuota de la película superficial del cultivo y sembrar en placas de TCBS y agar TSA o T1N1. Luego de incubar dichas placas 18 hs a 37ºC continuar el procedimiento para el aislamiento e identificación, de la misma manera que para el aislamiento a partir de muestras de materia fecal.

PROCEDIMIENTO PARA EL AISLAMIENTO DE Vibrio cholerae

Equipamiento •

Ansas rulo

•

Placas de petri descartables (9 cm. diámetro) estériles

•

Balanza

•

Estufa a 37oC

•

Mechero Bunsen

Medios de cultivo •

Agua peptonada alcalina (APA) en tubos de 13x100 cm con 3 ml de medio o erlenmeyer de 250 ml con 50 ml de medio

•

Agar TSA (placas)

•

Agar T1N1 (placas)

•

Agar tiosulfato-citrato-sales biliares-sacarosa (TCBS) (placas)

Procedimiento Día 1: Enriquecimiento selectivo y cultivo primario

Comentarios

en placas de agar Cultivar el hisopo (materia fecal) en un tubo con 3 ml de APA o los filtros (muestras de agua) en erlenmeyer con 50 ml de APA. El APA se incuba a 37ºC durante 6 a 8 horas. Con un ansa, tomar de la película superficial y sembrar en las placas de TCBS y agar TSA.

1.3. PROTOCOLOS PARA LA IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE Vibrio cholerae POR METODOS FENOTÍPICOS Equipamiento • Ansas descartables (1 µl) • Ansa aguja • Mechero Bunsen

• Estufa a 37oC Soluciones, reactivos y medios de cultivo • Agar Kligler • Agar LIA • Caldo triptofano • Medio para la prueba LDC, ODC, ADH • Medio control para las pruebas con aminoácidos. • Vaselina estéril • Medio triptona para la prueba de indol • Reactivo de Erlich para la prueba de indol • Medio RM/VP para la prueba de Rojo de metilo • Medio RM/VP para la prueba de Voges-Proskauer • Solución de KOH 40% para la prueba de Voges-Proskauer • Solución alcohólica de alfa-naftol para la prueba de Voges Proskauer • Solución de rojo de metilo • Discos para reacción de oxidasa • Caldo nutritivo adicionado de NaCl al 0,1,6,8 y 10 % Procedimiento Día 2: I. Observar las placas de agar TSA ó T1N1

Comentarios Las colonias típicas son convexas

Observar las placas de agar TCBS

Las colonias típicas son amarillas planas o

(ver Anexo I)

ligeramente convexas.

Subcultivar dos colonias sospechosas de El subcultivo de colonias sospechosas de Vibrio Vibrio cholerae de las placas de agar TSA cholerae en estrías de agar TSA al mismo tiempo y/o TCBS en estrías de agar TSA, agar que la inoculación en Kligler o TSI y LIA permite Kligler, agar LIA y en caldo triptofano.

Día 3: Lectura de pruebas bioquímicas mínimas: Kligler, LIA e indol del triptofano, si son

ganar un día en la identificación y serotipificación

compatibles con Vibrio cholerae., realizar la prueba de la oxidasa y si esta es positiva, sembrar

las

complementarias

pruebas y

bioquímicas realizar

la

serotipificación (ver Anexo II).

Día 3: Siembra de pruebas bioquímicas complementarias De un cultivo puro en placas o estrías de agar nutritivo, inocular los siguientes medios: •

Medio para LDC, ADH y ODC y el

medio control. Cubrir con una capa de vaselina estéril. •

Medio RM/VP para la prueba de Rojo de

metilo y para la prueba de Voges-Proskauer •

Caldo nutritivo adicionado de NaCl al

0,1,6,8 y 10 % Incubar todas las pruebas bioquímicas a 37oC por 18 - 24 horas.

Día 4: Lectura de pruebas bioquímicas Agregar los reactivos correspondientes para revelar las pruebas de RM y VP. (Ver Anexo II). Leer los resultados de las pruebas bioquímicas complementarias de acuerdo a las Tablas 1 y 2.

TABLA 1. Pruebas bioquímicas de Vibrio cholerae. Interpretación de los resultados

Medio Kligler

Reacciones/enzimas Negativo Producción de ácido (si el fondo es amarillo y Fondo rojo la estría es roja, la producción de ácido es sólo a partir de glucosa).

Resultados Positivo Fondo amarillo

Kligler

Producción de ácido a partir de lactosa.

Estría roja

Estría amarilla

Kligler

Producción de gas

No hay burbujas en el fondo

Burbujas de aire en el fondo

Kligler

Producción de H2S

No hay color negro

Color negro

LIA

La decarboxilación de la lisina produce una Estría reacción alcalina (color violeta) en el medio. púrpura/Fondo Los organismos que no decarboxilan la lisina amarillo producen una estría alcalina y un fondo ácido (color amarillo).

Estría púrpura/Fondo púrpura

LIA

Producción de H2S

No hay color negro

Color negro

LDC test

Lisina decarboxilasa

Color amarillo/marrón

ODC test

Ornitina decarboxilasa

Color amarillo/marrón

ADH test

Arginina dihidrolasa

Color amarillo/marrón

Indol

Producción de Indol

Anillo amarillo

Color púrpura y color amarillo/marrón en el medio control. Color púrpura y color amarillo/marrón en el medio control Color púrpura y amarillo /marrón en el medio control Anillo rojo/rosado

Tabla 2. Resultados de las pruebas bioquímicas para Vibrio cholerae Prueba Bioquímica

Porcentaje de Positividad

Oxidasa

100

Kligler glucosa (ácido)

100

Kligler glucosa (gas)

0

Kligler lactosa (ácido)

7

Reacción del Indol

99

Lisina decarboxilasa (1% Na Cl)

99

Ornitina decarboxilasa

99

(1% Na Cl) Arginina dehidrolasa

0

(1% Na Cl) Rojo de metilo (1% NaCl)

99

Voges Proskauer

75

(1% Na Cl) Crecimiento en caldo nutritivo con 0% NaCl

100

Crecimiento en caldo nutritivo con 1% NaCl

100

Crecimiento en caldo nutritivo con 6% NaCl

53

Crecimiento en caldo nutritivo con 8% NaCl

1

Crecimiento en caldo nutritivo con 10% NaCl

0

SEROTIPIFICACIÓN DE Vibrio cholerae Equipamiento •

Estufa de cultivo a 37ºC

•

Heladera a 4ºC

•

Ansas

•

Tubos de ensayo

•

Cajas de Petri

•

Láminas de vidrio de 20x20 cm

•

Gradillas

•

Mechero

•

Lámpara para leer aglutinaciones

•

Palillos de madera

•

Frascos gotero para los antisueros

Medios de Cultivo y Reactivos •

Estrías de agar tripticasa de soja (TSA)

•

Antisueros diagnósticos

•

Solución salina al 2%

Antisueros Diagnósticos

Para este estudio se utilizan los siguientes antisueros: 1) Antisuero polivalente Vibrio cholerae O1 2) Antisuero monovalente Ogawa 3) Antisuero monovalente Inaba 4) Antisuero monovalente O139

Procedimiento

Comentarios

Día 1

La determinación del antígeno O de Vibrio

Los anticuerpos en el suero específico aglutinan

cholerae se hace en lámina, a partir de un cultivo

con

en agar TSA de 18 hs a 37ºC (Ver flujograma

correspondiente está presente. Es importante que

adjunto).

el aislamiento esté en forma lisa.

la

bacteria

cuando

el

antígeno

Verificar que el cultivo se encuentre en forma lisa: la aglutinación con solución salina al 2% debe dar negativa Una ansada de cultivo puro se mezcla con una gota de solución salina al 2%, rotando suavemente la lámina, durante 2 minutos. Se observa la presencia o ausencia de grumos. a) Si hay grumos la cepa está rugosa.

Si la cepa esta rugosa, se deben relizar subcultivos de la cepa en agar sangre o en agar Mueller Hinton, de manera de recuperar la forma lisa y poder continuar con la serotipificación somática O.

b) Si no presenta grumos se realiza la serotipificación somática O

Sobre una lámina de vidrio se enfrenta una ansada del cultivo con una gota del antisuero polivante O1. Se mezcla rotando suavemente la lámina, durante 2 minutos, para favorecer la reacción antígeno-anticuerpo y se observa presencia o ausencia de aglutinación, con luz indirecta

a) Si hay aglutinación con el antisuero polivalente O1, se prueban los antisueros monovalentes Inaba y Ogawa b) Si no hay aglutinación con el antisuero polivalente O1, se prueba el antisuero monovalente O139 Lectura e interpretación de resultados El grado de aglutinación se registra de la siguiente manera: • 4+: 75 a 100% de microorganismos aglutinados • 3+: 75% aproximadamente de microorganismos aglutinados • 2+: 50% aproximadamente de microorganismos aglutinados • 1+: menos de 25% de microorganismos aglutinados Negativo: ausencia de aglutinación. Se observa una suspensión homogénea

FLUJOGRAMA DE SEROTIPIFICACIÓN PARA Vibrio cholerae Cepa con características bioquímicas de Vibrio cholerae

Estría en TSA

Aglutinación con solución salina al 2%

Negativa

Positiva

Aglutinación con Polivalente O1

Negativa

Vibrio cholerae no O1

Cepa rugosa

Positiva

Vibrio cholerae O1

Aglutinación con O139 Aglutinación con Inaba Aglutinación con Ogawa

Negativa

Positiva

V. cholerae no O1, no O139 V. cholerae O139

Positiva

V. cholerae O1, Inaba

Positiva

V. cholerae O1, Ogawa

ANEXO I - MEDIOS DE CULTIVO 1. DESCRIPCIÓN DE Y DE AISLAMIENTO

LOS

MEDIOS

DE

CULTIVO

DE

ENRIQUECIMIENTO

MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO Agua Peptonada Alcalina La viabilidad de Vibrio spp. se mantiene intacta a pH alcalino y el uso de agua peptonada alcalina ha sido recomendado para incrementar la recuperación de Vibrio spp. de materia fecal y de otras muestras. El medio contiene peptona de carne, cloruro de sodio y el pH final es de 8.6 ± 0.2 a 25ºC. Se incuba 6 a 8 horas y se siembra en los medios de cultivo. MEDIOS DE CULTIVO DE AISLAMIENTO Agar TSA Es un medio utilizado para propósitos generales que favorece el desarrollo y el aislamiento de una gran variedad de microorganismos aerobios, anaerobios facultativos y extrictos. Se prepara según las recomendaciones del fabricante. Se autoclave 15 minutos a 121ºC

Agar TCBS Es un medio selectivo para el aislamiento de Vibrio cholerae. El medio contiene: tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa y está disponible comercialmente. Se prepara según las indicaciones del fabricante. No se debe autoclavar. Por su doble indicador (azul de timol y azul de brotimol) vira al amarillo con pequeñas variaciones de pH por la acidificación de la sacarosa. Aspecto de las colonias y crecimiento Escherichia coli Proteus Sterptococcus feacalis Vibrio cholerae Virio fluviales Vibrio parahaemolytivus Vibrio vulnficus

Translúcidas Pequeña, amarilla Pequeña amarilla

de ninguno a escaso de ninguno a escaso de ninguno a escaso

Amarillas Amarillas Azul

Bueno Bueno Bueno

Amarillas o translúcidas

Bueno

ANEXO II - PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE Vibrio cholerae PRUEBAS DE OXIDASA I. Principio La citocromo oxidasa es una enzima de la cadena respiratoria perteneciente al grupo de las hierro porfirinas. Se encuentra presente en los géneros Pseudomonas, Vibrio, Aeromonas, etc, pero no en los miembros de la familia Enterobacteriaceae. Cuando oxida el citrocromo C reducido y se reduce a una forma inactiva. La enzima reducida es reconvertida a su forma activa por la transferencia de electrones al oxígeno molecular. En presencia de oxígeno molecular los electrones pueden ser transferidos por el sistema citocromo oxidasa/citroctromo C a un gran número de compuestos orgánicos, entre ellos la p-aminodimetilanilina.

II. Materiales Se dispone de discos comerciales embebidos es una solución estabilizada de oxalato de la paminodimetilanilina. Son estable spor un año en oscuridad de 4ºC.

III. Procedimiento A. En un tubo de hemólisis preparar una suspensión espesa del microorganismo en estudio en aproximadamente 0.2 ml de agua destilada, colocar un disco del reactivo. B. Si hay escaso número de colonias sospechosas, se puede humedecer el disco con una gota de agua y luego colocar sobre el mismo material de una de las colonias en estudio.

IV. Resultados Ensayo positivo: desarrollo de color rojo Ensayo negativo: no hay desarrollo de color.

V. Control de Calidad Vibrio cholerae (+) Escherichia coli (-)

VI. Consideraciones La reacción de la oxidasa no puede ser realizada a partir de medios que contienen azucares fermentables o sangre por la posibilidad de obtener resultados falsamente negativos.

AGAR HIERRO TRES AZUCARES (TSI) y AGAR KLIGLER I. Principio El medio fue diseñado para determinar la habilidad de las bacterias de fermentar hidratos de carbono y producir sulfuro de hidrógeno (SH2). El medio contiene 1 parte (0,1%) de glucosa y 10 partes (1.0%) de lactosa y sacarosa. El indicador de pH es el rojo fenol y el sulfato ferroso pone en evidencia la formación de SH2. Si el microorganismo fermenta glucosa, tanto la punción como la estría aparecerán de color amarillo. Si el organismo fermenta lactosa y/o sacarosa, la estría permanecerá ácida (amarilla). Si no fermenta lactosa, la estría se vuelve alcalina (roja). Los organismos que no fermentan glucosa no producen cambios en el pH del medio o producirán productos alcalinos y el medio TSI permanecerá rojo. La producción de SH2 se manifiesta por un ennegrecimiento del medio. El agar de Kligler contiene dos azúcares: lactosa (1%) y glucosa (0,1%). Este medio puede reemplazar al TSI, la diferencia entre ambos es la ausencia de sacarosa. Los fundamentos bioquímicos y la interpretación de los resultados son los mismos para ambos medios.

II. Materiales El medio está disponible comercialmente. Disolver en agua destilada y dispensar volúmenes de 5 ml en tubos con tapa a rosca; autoclavar a 121ºC por 15 minutos y enfriar inclinado dejando un fondo de 5 a 10 mm. El sustrato es estable por 3 meses. Rotular indicando fecha de preparación y de expiración. Guardar en heladera; si hay cambio de color no usar.

III. Procedimiento A. Con un ansa estéril tomar material. B. Punzar el fondo en el centro. C. Retirar el ansa y estriar sobre la superficie del agar. D. Dejar la tapa floja para permitir intercambio de aire. E. Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas.

IV. Resultados Estría ácida/fondo ácido (amarillo/amarillo): fermentación de glucosa, sacarosa y/o lactosa (E. coli). Estría alcalina/fondo ácido (rojo/amarillo): fermentación de glucosa solamente (Shigella spp.). Estría alcalina/fondo alcalino (rojo/rojo): no fermentador (Pseudomonas aeruginosa). Precipitado negro en el fondo: producción de SH2 (Salmonella spp). Burbujas o roturas: producción de gas (E. coli, Salmonella spp.).

V. Control de Calidad Bacteria

Estría

Punción

SH2

Salmonella Typhi

K

A

+ (*)

Salmonella Paratyphi A

K

Ac/g

-

Salmonella spp.

K

A

+

Shigella spp.

K

A

-

Enterobacter aerogenes

A

Ac/g

-

Enterobacter cloacae

A

Ac/g

-

Escherichia coli

A

Ac/g

-

Citrobacter

A

Ac/g

+

Klebsiella

A

Ac/g

-

Proteus vulgaris

A

A oAc/g

+(sucio)

Proteus mirabilis

K

Ac/g o A

+ (sucio)

Klebsiella pneumoniae

A

Ac/g o A

-

(*) sólo en la parte superior de la punción o formación de un anillo. A: ácido; K:alcalino; c/g: cn gas

VI. Consideraciones Cuando se agrupan los miembros de la familia Enterobacteriaceae, las reacciones del TSI y KIA pueden variar ligeramente. Algunos no fermentadores de lactosa pueden fermentar sacarosa. El test se debe leer entre las 18 y 24 horas. Lecturas tempranas pueden dar falsos resultados ácido/ácido, mientras que lecturas tardías pueden dar falsos resultados alcalino/alcalino. Una gran producción de SH2 enmascara la reacción de la glucosa. Sin embargo la glucosa fue fermentada aunque no se vea el cambio de color. Observar si hay producción de gas. En el TSI, la utilización de sacarosa puede suprimir el mecanismo enzimático que resulta en la producción de SH2. Por esta razón, algunos organismos pueden demostrar producción de SH2 en KIA pero no en TSI.

AGAR LISINA HIERRO Hierro (LIA) I. Principio La decarboxilación de la lisina a cadaverina produce una alcalinización del medio y un viraje al violeta del indicador púrpura de bromocresol. Como la reacción tiene lugar en medio ácido, es necesario la fermentación previa de la glucosa.

Los microorganismos que no decarboxilan lisina, pero fermentan la glucosa producen un viraje al amarillo en todo el medio. La formación de SH2 produce una coloración negra debido al sulfuro de hierro producido. Las bacterias del grupo Proteus-Providencia, con excepción de Morganella morganii, desaminan la lisina a ácido α-cetocarbónico que forma compuestos pardo-rojizos en el medio de cultivo con la sal de hierro y en aerobiosis.

II. Materiales El medio está disponible comercialmente. Disolver el polvo en agua destilada y dispensar en volumenes de 3 ml en tubos con tapa a rosca. Esterilizar a 121ºC por 15 minutos. Enfriar de manera de tener estría y fondo. Guardar en heladera.

III. Procedimiento A) Inocular punzando el fondo y luego estriar la superficie del agar. Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas (a veces pueden ser necesarias 48 horas).

IV. Resultados Los microorganismos que descarboxilan la lisina producen un viraje al violeta. Los microorganismos que no descarboxilan la lisina y fermentan glucosa producen un viraje al amarillo. La formación de SH2 se indica por la aparición de una coloración negra.

V. Control de Calidad Bacteria

Estría

Punción

SH2

Salmonella spp.

K

K

+

Proteus mirabilis

R

A

+

Proteus vulgaris

R

A

+

Morganella morganii

K

A

-

PrProv. Rettgeri

R

A

-

Providencia spp.

R

A

-

Citrobacter spp.

K

A

+

Escherichia coli

K

A

-

Shigella spp.

K

A

-

Klebsiella spp.

K

A

-

A.ácido; K.alcalino; R: desaminación de la lisina

Este medio no es un sustituto del método standard de Moeller.

VI. Consideraciones Dado que descarboxilación de la lisina ocurre únicamente a pH ácido, este medio sólo puede utilizarse para diferenciar cultivos que fermenten glucosa.

PRUEBA DEL INDOL I. Principio El indol es uno de los productos del metabolismo del aminoácido triptofano. Con un medio rico en triptofano, el indol se puede detectar por su habilidad para combinarse con ciertos aldehidos para formar un compuesto coloreado. El ensayo constituye un método rápido para detectar organismos productores de indol. Como indicador de la presencia del aldehído se usa el reactivo de Erlich. Es especialmente útil en la identificación preliminar de Escherichia coli, y para diferenciar Edwardsiella (+) de Salmonella (-).

II. Materiales A. Caldo triptofano • Peptona

20 g

• Cloruro de sodio

5g

• Agua destilada

1000 ml

A este caldo se le incorpora triptofano en una concentración del 1%. El medio se esteriliza a 121ºC durante 15 minutos. Dejar enfriar antes de su empleo y guardar a 4-10ºC para su conservación.

B. Reactivo de Erlich • p-dimetilaminobenzaldehido

1g

• alcohol etílico, 95%

95 ml

• ácido clorhidríco, concentrado

20 ml

Se disuelve el aldehído en el alcohol (puede requerir un calentamiento suave), luego se agrega lentamente el ácido. El reactivo de color amarillo es estable por un año. Identificar el reactivo con una etiqueta y guardar refrigerado en botellas color caramelo.

III. Procedimiento 1) Con un ansa tomar material de una colonia aislada e inocular el caldo que contiene triptofano.

2) Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas. 3) Transferir 2 ml de la suspensión de caldo a un segundo tubo. 4) Agregar 5 gotas del reactivo de Erlich por la pared del tubo. 5) Agitar el tubo y observar un color rosado en la interfase entre el caldo y el reactivo. 6) Si el ensayo es negativo, el cultivo se debe reincubar otras 24 horas.

IV. Resultados Ensayo positivo: desarrollo de un color rojo en la interfase del reactivo y el caldo, segundos después de agregar el reactivo. Ensayo negativo: no hay cambio de color o hay un color amarillo en la interfase.

V. Control de Calidad Cualquiera de los reactivos debe ser controlado con cultivos positivos y negativos conocidos, antes de su empleo general. Como controles resultan convenientes cepas de fácil obtención y que su conservación en cultivos madre no ofrezca problemas. Escherichia coli (+) Enterobacter aerogenes (-) Klebsiella pneumoniae (-)

VI. Consideraciones El pH óptimo para la actividad de la triptofanasa es ligeramente alcalino (7,4-7,8). La disminución del pH provoca una reducción en la producción de indol y una reacción falsamente negativa o débilmente positiva. Los cultivos a los cuales se les efectúa la prueba del indol deben ser incubados aerobicamente. El descenso en la tensión de oxígeno disminuye la producción de indol. No debe emplearse un medio de peptona que contenga glucosa porque la elevada acidez producida por la fermentación del azúcar puede inhibir la actividad de la triptofanasa. El agregado de triptofano estimula la producción de indol, mientras que la glucosa la inhibe.

TEST DE DECARBOXILASA-DIHIDROLASA I. Principio La descarboxilación es un proceso en el cual las decarboxilasas atacan el extremo carboxilo de los aminoácidos, formando la correspondiente amina. Los tres aminoácidos que se ensayan en la

identificación de Enterobacterias son arginina, lisina y ornitina. La decarboxilación de lisina y ornitina da cadaverina y putrescina (diaminas), mientras que arginina da citrulina por acción de una dihidrolasa. El test se debe acompañar con un tubo control que contiene el medio base sin aminoácido. Como la decarboxilación es una reacción anaeróbica, se debe cubrir el medio con una capa de aceite mineral estéril. El proceso ocurre en dos etapas: por fermentación de la glucosa se produce una acidificación del medio (pH < 6), apareciendo color amarillo. La acidificación es necesaria para que ocurra la decarboxilación. Este último proceso de lugar a la formación de las aminas que elevan el pH con el consiguiente viraje del indicador al color violeta. La prueba de la lisina ayuda en la diferenciación de Edwardsiella (+), y Salmonella (+) de Citrobacter (-); de Enterobacter aerogenes (+) de Enterobacter cloacae (-) y Enterobacter agglomerans (-) La prueba de ornitina ayuda a diferenciar Klebsiella (-), Proteus mirabilis (+) de Proteus vulgaris (-); Morganella morganii (+) de Providencia rettgeri (-); Yersinia enterocolitica (+) de Yersinia pestis y Yersinia pseutuberculosis (-).

II. Materiales El medio basal más comúnmente utilizado es el medio de decarboxilasa de Moeller. El medio está disponible comercialmente. Las concentraciones de aminoácidos a usar son: 1% para la forma L y 2% para la forma DL. Fraccionar el medio base en 4 porciones de 250 ml cada una. Agregar los aminoácidos a 3 porciones del medio. El pH se debe ajustar después de agregar el aminoácido y antes de esterilizar a 6 – 6,2. Fraccionar en volúmenes de 3 a 4 ml en tubos con tapa a rosca y autoclavar a 121ºC por 10 minutos. El sustrato es estable por 3 meses. Rotular los tubos y guardar en heladera.

III. Procedimiento 1) Tomar material con un ansa e inocular el tubo control y los tubos con los aminoácidos. 2) Cubrir todos los tubos con una capa de vaselina estéril. 3) Incubar a 37ºC 4) Efectuar las lecturas día por día hasta 4 días, registrando los resultados día por día.

IV. Resultados Ensayo positivo: medio turbio y púrpura a púrpura amarillento. Ensayo negativo: color amarillo Tubo control: permanece con su color original o se vuelve amarillo si el organismo es un fermentador de glucosa (se debe ver turbidez en el tubo).V. Control de calidad

Bacteria

Arginina

Lisina

Ornitina

Proteus vulgaris

-

-

-

Morganella morganii

-

-

+

Enterobacter cloacae

+

-

+

Enterobacter aerogenes

-

+

+

Salmonella Typhimurium

+

+

+

Klebsiella spp.

-

+

-

VI. Consideraciones Inocular siempre un tubo control. Debe haber desarrollo para que el resultado sea válido. Si se observan capas de color amarillo y violeta, agitar suavemente el tubo antes de interpretar la reacción. Comparar todos los tubos positivos con el tubo control. Un color grisáceo puede indicar reducción del indicador más que formación de productos alcalinos. Se debe agregar más indicador antes de interpretar el resultado. Si la reacción es difícil de interpretar, comparar el tubo con un tubo sin inocular. Luego de 24 horas cualquier traza de color púrpura indica un resultado positivo. Si se usa el medio de Moeller, se debe incubar por lo menos 18 horas ante de interpretar los resultados. Si no se agrega el aceite mineral, las reacciones se deben leer sólo a las 24 horas. Un pequeño precipitado floculento en la ornitina no interfiere con su uso.

ENSAYO DEL ROJO DE METILO I. Principio El test se usa para determinar la presencia de iones hidrógeno cuando un microorganismo fermenta glucosa. Todos los miembros de la familia Enterobacteriaceae convierten glucosa en ácido pirúvico por el camino de Embden-Meyerhof. Los organismos que metabolizan ácido pirúvico producen ácido y bajan el pH a menos de 4.4. Los organismos que utilizan, en cambio, el camino del butilenglicol producen acetoína y butanodiol (diacetilo). El indicador del medio, rojo de metilo, es rojo a pH < 5.0 y amarillo a pH > 5.8. El test es útil para la diferenciación de Escherichia coli (rojo metilo positivo) de Klebsiella (rojo metilo negativo). La mayoría de las Enterobacteriaceae tienen uno u otro camino metabólico, pero raramente ambos.

II. Materiales A) Preparación del medio El medio está disponible comercialmente. Disolver en agua destilada, dispensar 5 ml en tubos con tapa a rosca y autoclavar a 121ºC por 15 minutos. El sustrato es estable por 2 a 3 meses. Rotular los tubos, indicando fecha de preparación y de expiración. Guardar en heladera. B) Preparación del reactivo Disolver 0,1 gr de rojo de metilo en 300 ml de etanol y diluir con 200 ml de agua destilada, para alcanzar un volumen total de 500 ml. El reactivo es estable por 1 año. Rotular y guardar en heladera.

III. Procedimiento 1) Con un ansa estéril tomar material e inocular un tubo con caldo RM/VP. 2) Incubar a 35ºC por un mínimo de 48 horas. 3) Transferir 2,5 ml de la suspensión a un tubo. 4) Agregar 5 gotas del indicador y observar si hay cambio de color.

IV. Resultados Ensayo positivo: el reactivo permanece rojo. Ensayo negativo:el reactivo se torna amarillo-naranja. Si el resultado es negativo continuar la incubación de la bacteria por 24 horas más.

V. Control de Calidad Escherichia coli (+) Enterobacter aerogenes (-)

ENSAYO DE VOGES-PROSKAMER I. Principio El piruvato es un intermediario en el metabolismo de la glucosa. A partir del ácido pirúvico un microorganismo puede seguir varios caminos. Algunos lo rompen para formar como productos finales ácidos láctico, acético o fórmico. Otros metabolizan el piruvato por el camino del butilenglicol para formar como productos finales acetoína (acetilmetilcarbinol) y 2,3-butanodiol (diacetilo). El ensayo de Voges-Proskauer (VP) detecta estos productos metabólicos. En presencia de oxígeno e KOH, la acetoína se oxida a diacetilo, que da un complejo rojo .La sensibilidad del ensayo se aumenta por el agregado de α-naftol antes del agregado de KOH.

II. Materiales 1) Preparación del medio El medio está disponible comercialmente. Para la preparación del caldo RMVP, ver el procedimiento indicado para el test de rojo de metilo. Preparación de solución de α-naftol 2) Disolver 5 g de α- naftol en una pequeña cantidad de alcohol absoluto y luego llevar el volumen a 100 ml. La solución debe ser incolora. El reactivo es estable por 1 año. Rotular indicando fecha de preparación y de expiración. Guardar en heladera en frascos color caramelo. 3) Preparación de la solución de KOH Disolver los pellets de KOH en agua destilada y luego llevar el volumen final a 100 ml (trabajar sobre baño de agua fría para evitar recalentamiento). El reactivo es estable por 1 año. Rotular indicando fecha de preparación y de expiración.

III. Procedimiento 1)

Con un ansa estéril tomar material e inocular un tubo de caldo RM/VP.

2)

Incubar a 37ºC por un mínimo de 48 horas.

3)

Transferir 2,5 ml de la suspensión a otro tubo.

4)

Agregar 0,6 ml del reactivo de α-naftol.

5)

Agregar 0,2 ml del reactivo de KOH.

6)

Agitar el tubo y dejar descansar 10 a 15 minutos.

7)

Observar la formación de un color rosado a rojo.

IV. Resultados Ensayo positivo: desarrollo de color rojo dentro de los 15 minutos. Ensayo negativo: no hay desarrollo de color.

V. Control de Calidad Klebsiella pneumoniae (-) Escherichia coli (+)

VI. Consideraciones Cuando hay una incubación prolongada (más de 3 días) algunos organismos VP + pueden producir un aumento de la acidez del medio, dando reacciones positivas débiles o falsas reacciones negativas.

La mayoría de los miembros de la familia Enterobacteriaceae dan reacciones opuestas entre el rojo de metilo y VP, sin embargo algunos organismos como Hafnia alvei pueden dar ambas reacciones positivas. Los reactivos se deben agregar en el orden indicado. Una inversión del orden puede dar un resultado positivo débil o un falso negativo. No se debe agregar KOH en exceso, porque se puede enmascarar una reacción positiva débil por la formación de un color cobrizo por la reacción del KOH con el α-naftol. No leer el ensayo después de 1 hora; puede aparecer una coloración cobriza dando un resultado falso positivo.

CRECIMIENTO EN NaCl I. Principio Es una prueba que se usa para diferenciar distintas especies del género Vibrio.

II. Materiales Peptona

20 g

Agua destilada

Completar a 100ml

Ajustar el pH a 8-8,2 con solución de NaOH al 30% Agregar NaCl al 1, 6, 8 y 10% y fraccionar 3 ml en tubos de 13x100, con tapa a rosca, esterilizar 15 minutos a 121ºC.

III. Procedimiento A) Hacer una suspensión del gérmen en un tubo de agua peptona sin NaCl. B) Con esa suspensión, se siembran los tubos con 0, 1, 6, 8, 10% de NaCl

IV. Resultados Ensayo positivo: desarrollo de turbidez por crecimiento Ensayo negativo: ausencia de turbidez por falta de crecimiento

V. Control Vibrio cholerae al 0% y 1% de NaCl (+) Vibrio cholerae al 8 y 10% de NaCl (-)

VI. Consideraciones No hay

1.4. PROTOCOLOS PARA LA CONSERVACIÓN Y TRANSPORTE DE AISLAMIENTOS DE Vibrio cholerae

CONSERVACIÓN DE AISLAMIENTOS DE Vibrio cholerae Para la conservación de aislamientos de V. cholerae, se recomienda:

Conservación a temperatura ambiente: realizar una punción a partir del cultivo puro, en agar blando (preparado con caldo tripticasa soja o caldo nutritivo con el agregado de agar 0,8% y dispensado en viales de 2 ml con tapa a rosca y “o-ring”, no más de 1 ml de medio por tubo). El inóculo para esta punción puede tomarse con ansa de punta a partir de la estría empleada para las pruebas de serotipificación. Los viales de agar blando con las conservaciones de V. cholerae deben ser correctamente cerrados, incubados a 37ºC durante 18 hs. y luego mantenerse a temperatura ambiente.

Conservación a -70ºC: a partir del cultivo puro (estría utilizada para serotipificación), inocular un caldo tripticasa soja o caldo nutritivo, utilizando un ansa de rulo; incubar 6 a 8 hs. a 37º C; tomar 1 ml del caldo luego de esta incubación y dispensar en criotubo estéril con tapa a rosca de capacidad 2 ml. Agregar 0,4 ml de glicerol estéril y mezclar vigorosamente con vortex para homogeneizar el cultivo con glicerol; inmediatamente llevar al freezer a -70º C.

1.5. PROTOCOLOS PARA LA IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE Vibrio cholerae POR PCR

FUNDAMENTOS Y VARIABLES DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

El fundamento de la técnica es imitar la replicación de ADN celular donde hay helicasas que producen la separación de las cadenas de ADN, seguida de una ARN polimerasa que sintetiza una secuencia corta de ARN o “primer”. Luego, una ADN polimerasa reconoce estos oligonucleótidos y sintetiza las cadenas complementarias de ADN. La técnica de PCR amplifica un fragmento de ADN, en forma exponencial, utilizando una enzima ADN polimerasa termoestable durante ciclos sucesivos donde se utiliza la desnaturalización por calor. El segmento de ácidos nucleicos amplificado es específico ya que sus extremos son reconocidos por oligonucleótidos sintéticos diseñados especialmente que se unen a secuencias complementarias en el extremo 5´ de cada hebra de ADN a amplificar (Persing D. 1993). Se utiliza como molde una muestra de ADN o ARN, que puede estar presente en un bajo número de copias.

A partir de la PCR se puede obtener distintos tipos de información, que básicamente se puede resumir en: 1) presencia o ausencia de las secuencias complementarias a los oligonucleótidos, y 2) distancia a la que se encuentran los cebadores o “primers” en el ADN templado.

Etapas de la PCR En primer lugar, hay una etapa de desnaturalización inicial para separar las hebras de ADN, seguida de un número variable de ciclos de PCR que consiste en tres etapas:

Desnaturalización: se produce la separación de las hebras de ADN por calentamiento a 92-96 ºC. El tiempo va a depender del tamaño del fragmento y el contenido de G+C.

Hibridación o "annealing": los “primers” se unen a los sitios complementarios en el ADN simple cadena a la temperatura óptima de hibridación (Ta). Esta depende de la composición de bases, el largo y la concentración de los “primers”. La Ta ideal se encuentra generalmente 5ºC por debajo de la verdadera temperatura de melting (Tm) de los “primers”. La Tm es la temperatura a la cual el 50% de las cadenas primers-target se encuentra separadas en solución. El uso de una Ta inapropiada modifica la especificidad y sensibilidad de la reacción. El tiempo de annealing afecta la especificidad de la hibridación.

Polimerización: luego del “annealing” de los primers se produce la extensión por acción de la polimerasa. Comenzando a partir del “primer” la enzima lee la hebra de templado e incorpora los nucleótidos complementarios. Se utiliza una ADN polimerasa termoestable que no se desnaturaliza por la alta temperatura y cuya temperatura óptima de polimerización es 72ºC. El tiempo de extensión depende de la concentración y del tamaño del fragmento a amplificar. El número de ciclos utilizados depende del grado de especificidad y del grado de amplificación que se desee obtener, aconsejándose entre 25 y 35 ciclos. Al final de los ciclos se realiza una extensión final que le da tiempo a la polimerasa para terminar todos los fragmentos para obtener bandas más definidas. En los primeros ciclos se sintetizan productos de diferentes longitudes, recién a partir del cuarto ciclo se van acumulando los productos específicos del tamaño esperado, cuya longitud estará comprendida entre los dos sitios de unión a los “primers”. Después de 30 ciclos, donde en cada uno se duplica el número de moléculas de ADN, se obtienen del orden de 108 copias del ADN blanco. Hay que tener en cuenta que éste no es un proceso ilimitado ya que los reactivos utilizados en la reacción se agotan. Por otra parte, a medida que aumenta el número de copias del fragmento específico, es más frecuente el reannealing entre

las cadenas complementarias del fragmento, que el annealing de los primers, por lo que también aumenta la hibridación no específica de éstos.

Reactivos necesarios para realizar la PCR •

Buffer de enzima: Es necesario para la adecuada actividad enzimática. En general contiene Tris-HCl 20mM y 50mM KCl pH 8.3-8.9, aunque los fabricantes pueden modificar su composición para optimizar el rendimiento de la enzima. Lo importante es que se mantenga un pH alcalino a lo largo de la reacción ya que así se favorece la amplificación.

•

Cloruro de Magnesio: es indispensable como cofactor de la enzima (Taq polimerasa) y afecta la hibridación entre cadenas de ADN tanto la interacción entre los “primers” y el templado como la estabilidad del ADN doble cadena. Por lo tanto, altas concentraciones disminuyen la especificidad y sensibilidad de la reacción y bajas concentraciones disminuyen la eficiencia de la reacción. Los rangos de concentración utilizados son de 1 -3 mM según cada protocolo.

•

Desoxirribonucléotidos trifosfato: dATP, dCTP, dGTP y dTTP. Deben ser agregados en iguales proporciones para minimizar falsas incorporaciones en la polimerización. Se debe ajustar la concentración para optimizar la especificidad y fidelidad de la reacción. Generalmente se utiliza una concentración de 200µM en el ensayo.

•

Primers: preferentemente tienen entre 15 a 30 pb de longitud. No deben ser complementarios entre sí y deben tener similar contenido de G+C. No deben contener estructuras secundarias. Altas concentraciones disminuyen la especificidad de la reacción y bajas concentraciones la eficiencia de amplificación. El rango de concentración en el ensayo varía desde 0,3 a 1 µM.

•

Enzima ADN polimerasa: Se utiliza normalmente Taq polimerasa aislada de una bacteria termófila Thermus aquaticus, cuya temperatura óptima de extensión es 72ºC. La enzima tiene una vida media de 40 minutos a 95ºC, de manera que puede soportar aproximadamente hasta 40 ciclos repetitivos de PCR. El rango habitual en cada ensayo es de 0,5 – 2,5 U de enzima. A baja concentración disminuye el rendimiento de la reacción y a altas concentraciones genera productos inespecíficos. En la preparación de la mezcla de reacción, la enzima debe agregarse al final.

•

Seroalbúmina bovina: Solamente se utiliza cuando el ADN templado corresponde a muestras con inhibidores (como agua de río, plancton). Se utiliza en concentraciones variables entre 10 y 600 ng/µl y tiene la función de favorecer la actividad de la polimerasa, y por otro lado impedir que distintos tipos de compuestos inhiban la reacción de PCR, ya que tiene alta afinidad por compuestos fenólicos, proteínas y lípidos (Kreader, 1996).

•

ADN blanco, la secuencia a amplificar debe contener desde < 0,1 a unas pocas kilobases. La cantidad total de ADN usado normalmente es de 0,05 a 1 µg. Lo que es realmente importante es la

concentración molar del ADN, por lo que la cantidad a agregar depende del tamaño de las moléculas en el templado. •

Control negativo: se utiliza un tubo de reacción solo con reactivos, sin templado.

•

Control positivo: se utiliza un templado de una cepa patrón o donde el perfil a amplificar sea conocido en ella.

Todos los reactivos deben ser conservados a -20ºC.

Precauciones a tener en cuenta en la realización de la PCR Uno de los inconvenientes más importantes de esta técnica es la contaminación, ya sea de ADN proveniente del entorno, contaminación cruzada entre muestras de una misma reacción, o por el producto amplificado y contaminación por DNasas. Existen medidas de control para minimizar estos inconvenientes, para ello es necesario contar con distintas áreas dentro del laboratorio: a) Área de preparación de la mezcla de reacción (zona limpia) b) Área de manipulación de muestras, cultivo y extracción del ADN (zona semisucia) c) Área de amplificación y análisis del producto de la reacción (área contaminada) En lo posible cada área debe tener dos entradas, circulación de aire para recontaminación de aerosoles y lámparas de luz UV. El movimiento de las muestras y del personal tiene que ser de un área libre de amplicones hacia áreas contaminadas con ellos y nunca en sentido contrario. Es necesario que los reactivos se almacenen en áreas libres de contaminación, fraccionados en pequeñas alícuotas, y preferentemente que sean reactivos grado Biología Molecular. Hay que utilizar material nuevo y descartable, y prevenir la contaminación por aerosoles usando tips con filtro. Por las mismas razones es importante asignar los juegos de pipetas para cada área, como también descontaminar frecuentemente las mesadas, pipetas y equipos.

Variantes de la PCR •

PCR simple: se utiliza un solo par de primers y se obtiene un único fragmento.

•

PCR-Múltiple: en la misma reacción de amplificación se utiliza más de 1 par de primers específicos para diferentes secuencias blanco. La coamplificación de diferentes targets sirve para diferentes propósitos: escaneo de largas regiones de DNA, para incluir controles internos de amplificación, y principalmente para buscar simultáneamente diferentes patógenos o factores de virulencia presentes en la muestra de ADN. Esta variante tiene la ventaja de disminuir los costos y el tiempo de trabajo. Lo más crítico es optimizar la reacción tal que los diferentes fragmentos puedan ser amplificados en

forma óptima en una sola reacción, principalmente los primers deben tener secuencias y Tm compatibles. •

Nested- Heminested: Se basa en amplificar con primers internos un fragmento ya amplificado para aumentar tanto la especificidad como la sensibilidad.

PROTOCOLO GENERAL DE PROCEDIMIENTOS DE PCR Se prepara la mezcla de reactivos descriptos anteriormente en la concentración óptima de cada uno, de acuerdo al número de muestras a analizar. Todos los reactivos deben permanecer en frío y mezclarse bien antes de dispensarlos. El procedimiento debe hacerse en un área limpia de amplicones o cabina de flujo laminar. Se realiza la mezcla añadiendo primero los reactivos de mayor volumen y por último la enzima Taq polimerasa. Una vez homogenizada la mezcla, se fracciona en tubos de PCR. En otra área, se añade el ADN templado en cada tubo y luego se introducen en el termociclador. Es importante mantener los tubos en frío hasta el momento de introducirlos en el ciclador.

Extracción de ADN bacteriano Para realizar PCR es necesario contar con una muestra que contenga el ADN libre en solución, lo menos degradado posible, y con la menor cantidad de inhibidores de la amplificación. Al partir de un aislamiento o cultivo puro, el ADN bacteriano se encuentra en altas concentraciones, y por lo tanto obtener ADN apto para PCR es sencillo, se deben lisar las células y separar el ADN, que es soluble en agua, de los detritos celulares. Cuando el objetivo es estudiar bacterias presentes en muestras más complejas, como por ejemplo alimentos, materia fecal, sangre y muestras ambientales, la concentración de microorganismos es mucho menor, y por lo tanto la separación de ADN de interés mucho más compleja. Cuando se quieren estudiar microorganismos que son cultivables, la estrategia más simple es diluir la muestra en un medio de enriquecimiento (selectivo o no, de acuerdo al objetivo de la PCR) e incubar en las condiciones adecuadas para aumentar la concentración de las bacterias que se desea estudiar, y luego proceder a la lisis celular. Pero existen casos en los que no se puede adoptar esta metodología: cuando los microorganismos no son cultivables; cuando se quiere estudiar la totalidad la comunidad microbiana, cuando el enriquecimiento no es posible para el microorganismo de interés. En estos casos, se debe extraer la totalidad del ADN bacteriano desde la muestra en estudio. Básicamente toda extracción de ADN se puede separar en dos estrategias: purificar las células y luego extraer el ADN, o realizar una lisis dentro de la matriz y luego realizar la purificación del ADN. Esta

última opción es la que permite la mayor recuperación, pero a su vez el templado tiene una mayor concentración de inhibidores (Miller, 1999). Para extraer el ADN total se pueden adoptar alguna o varias de las siguientes alternativas: •

disrupción física: uso de morteros, homogenizadores, sonicadores, perlas de vidrio, congelado descongelado y hervido. Todas estas alternativas sirven para la lisis celular.

•

lisis química: - uso de detergentes como SDS, laurel sarcosina, tritón X-100 para la romper la pared celular - uso de sales como NaCl para aumentar la osmolaridad - buffers Tris-ClH y PBS, y para mantener el pH entre 7 y 8. - NaOH

•

lisis enzimática: proteinasa K, lisozima, pronasa E y acromopeptidasa para lisis de la pared celular y degradación de proteínas.

•

extracción con solventes orgánicos: El uso de fenol – cloroformo- alcohol isoamílico o cloroformoisoamílico sirve para separar las proteínas presentes en la muestras, para remover las enzimas utilizadas durante la extracción.

•

purificación del ADN con resinas o reactivos que tienen afinidad por el ADN o los componentes contaminantes: columnas de sílica, sephadex, sepharosa, resinas chelex, CTAB y otras alternativas comerciales.

•

precipitación del ADN con un alcohol: etanol o isopropanol.

No es necesario que la muestra conteniendo la secuencia a amplificar esté altamente purificada, aunque ciertas impurezas presentes en la muestra como ácidos húmicos, polifenoles, heparina, grupo hemo, Mg2+, agentes quelantes, detergentes y metales pesados como el hierro inhiben la reacción de PCR.

Extracción de ADN para tamizaje a partir de medio de enriquecimiento (APA) A partir del filtrado de muestras de agua enriquecido en APA 37Cº, 6-8 hs se puede realizar una extracción de ADN, a fin de realizar una amplificación por PCR para determinar la posible presencia de V. cholerae en la muestra (tamizaje) antes de continuar el procedimiento de cultivo para el aislamiento e identificación. Para realizar la extracción de ADN, tomar 1 ml de cultivo en APA, centrifugar a 10.000 rpm por 5 min, y reconstituir el pellet en 500 ul de agua calidad molecular en un microtubo de 1.5 ml. Calentar esta suspensión a 100ºC durante 10 min. Dejar enfriar y realizar una breve centrifugación a 12.000 rpm durante 30 segundos, para precipitar los detritos celulares. Trasvasar el sobrenadante donde se

encuentra el ADN a un nuevo microtubo estéril, y utilizar esta suspensión como templado de la reacción de PCR. Los templados así preparados pueden conservarse a -20ºC.

Extracción de ADN a partir de un aislamiento bacteriano Para la extracción rápida de ADN de V. cholerae, se toma a partir de un aislamiento en una placa de TSA, 3-4 colonias y se prepara una suspensión de 500 ul en agua de calidad molecular en un microtubo de 1.5 ml. Esta suspensión es sometida a 100ºC durante 10 min. Se deja enfriar y se realiza una breve centrifugación a 12,000 rpm durante 30 segundos, para precipitar los detritos celulares. Luego se trasvasa el sobrenadante donde se encuentra el ADN a un nuevo microtubo estéril, y este se utiliza como templado de la reacción de PCR. Los templados así preparados pueden conservarse a -20ºC. El mismo procedimiento debe realizarse con las cepas de referencia a utilizar como controles positivos. Si se quisiera estandarizar el inóculo, se recomienda realizar la suspensión bacteriana en solución fisiológica, medir la densidad óptica de dicha suspensión a 610nm y ajustar a una DO= 0,3. A fin de realizar la medición en rango óptimo de lectura, se recomienda hacer una dilución 1/10 de la suspensión bacteriana (en solución fisiológica) y calcular, para volumen final de ADN templado de 500 µl: DOi x Vi = DOf x Vf DO leída x 10 (factor de dilución) x Vi = 0,3 x 500 µl El volumen inicial (Vi) determinado se debe tomar de la suspensión bacteriana sin diluir, centrifugar a 12.000 rpm por 2 min y resuspender en 500 µl de agua calidad molecular estéril, para continuar luego con los pasos de hervido y centrifugación detallados arriba.

EXTRACCIÓN DE ADN A PARTIR DE MUESTRAS AMBIENTALES PARA DETECCIÓN DIRECTA DE Vibrio cholerae La extracción de ADN total de muestras de agua, seguida de una amplificación por PCR de genes específicos es especialmente útil para detectar bacterias viables no cultivables. La baja concentración bacteriana y la complejidad de las muestras requiere un protocolo que asegure la mayor pureza y concentración de ADN. La metodología descripta a continuación se basa en la publicada por Rivera et al., 2003, con ligeras modificaciones: Para preparar las muestras de agua hay dos opciones:

• Filtrar 3 litros de agua a través de membrana de policarbonato de 0,22 µm. Se lava dos veces con agua bufferada (todavía en el portafiltro). Se corta la membrana en pequeños pedazos asépticamente y se adicionan 1,8 ml de buffer SET. ó • Filtrar 3 litros de agua a través de membrana de policarbonato de 0,22 µm. Se enjuagan con 6 ml de PBS y se recupera 1-2 ml de ese lavado. Luego se centrifuga 20 minutos este lavado a máxima velocidad y se resuspende el pellet en 1,8 ml de buffer SET.

En este punto las muestras se pueden congelar o se comienza con la lisis celular: •

Agregar 360 µl de lisozima 5 mg/ml, e incubar 45 min en baño a 37ºC con agitación.

•

Agregar 115 µl de SDS 10% y 25 µl de proteinasa K 20 mg/ml recientemente preparada, e incubar 1:30 hs en baño a 37ºC con agitación.

•

Agregar 400 ul de NaCl, vortexear la muestra y agregar 280ul de CTAB- ClNa, y volver a vortexear. Ambas soluciones deben precalentarse a 65ºC. Incubar 20 min a 65ºC. Dejar enfriar en heladera.

•

Agregar un volúmen de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (aprox 3 ml) y centrifugar 20 min a máx.velocidad.

•

Trasvasar cuidadosamente la solución acuosa a otro tubo de polipropileno de 15 ml y agregar un volumen de cloroformo-alcohol isoamílico. Volver a centrifugar 20 min a máx.velocidad.

•

Separar fase acuosa en un tubo de vidrio pequeño y precipitar el ADN con 0,6 volúmenes de isopropanol. Homogenizar levemente para formar un precipitado de ADN y transferir (si es visible) utilizando un capilar de vidrio a un tubo microtubo. Si no es posible visualizar el ADN, se recomienda centrifugar la solución a máxima velocidad durante 20 min en un microtubo de 2 ml.

•

Lavar el pellet de ADN con 300 ul de etanol 70%, centrifugando 5 min.

•

Dejar secando en la bomba de vacío.

•

Una vez que los tubos están secos se resuspende el ADN con agua tridestilada, con un volumen que depende del pellet obtenido entre 25-100ul.

•

Para medir la concentración y calidad del ADN se hace una lectura a 260, 280 y 320 nm. Se realiza con una dilución 1/100 de la muestra obtenida. La lectura a 260 nm me indica la concentración de ADN, la lectura a 280 nm refleja la concentración de proteínas. Se calcula la relación A260/A280, que debe dar entre 1 y 2 para indicar que la purificación del ADN fue eficiente. La 320 nm puede indicar una contaminación con ácidos húmicos, que por un lado interfiere con la lectura a 260 nm, pero también son inhibidores de la Taq polimerasa.

PROTOCOLOS DE PROCEDIMIENTO PARA LA DETECCIÓN DE LOS GENES ESPECÍFICOS DE ESPECIE, SEROGRUPOS O1 Y O139 Y GENES DE VIRULENCIA DE Vibrio cholerae

Se presentan en la Tabla 1 las secuencias de los primers utilizados en las reacciones de PCR: Tabla 1: PRIMERS O CEBADORES primers

Secuencia de primers (5´- 3´)

Amplicon (pb)

Referencia

VCO1-F2

5´ - CAACAGAATAGACTCAAGAA - 3´

647 ( O1 )

O1/O139

VCO1-R2

5´ - TATCTTCTGATACTTTTCTAC - 3´

VCO139-F2

5´- TTACCAGTCTACATTGCC - 3´

VCO139-R2

5´- CGTTTCGGTAGTTTTTCTGG - 3´

(Múltiple PCR 741 (O139 )

Rivera et al, 2003)

VC 16S-23S pVC-F2

5´- TTAAGCSTTTTCRCTGAGAATG - 3´

pVCm-R1

5´- AGTCACTTAACCATACAACCCG - 3´

CT 94F

5´- CGCGCAGATTCTAGACCTCCTG - 3´

300

rRNA (Chun et al, 1999)

564

ctxA (Rivera et al,

CT 614R

5´- CGATGATCTTGGAGCATTCCCAC - 3´

2003)

TCP 72F

5´- CACGATAAGAAAACCGGTCAAGAG - 3´ 451

tcpA El Tor (Rivera et al,

TCP 477R

5´- CGAAAGCACCTTCTTTCACGTTG - 3´

stn/o 67F

5´ -TCGCATTTAGCCAAACAGTAGAAA - 3´

2003)

172

stn/o (Rivera et al,

stn/o 194F

5´- GCTGGATTGCAACATATTTCGC -3´

tcpI132-F

5´- TAGCCTTAGTTCTCAGCAGGCA -3´

2001) 862

tcpI (Rivera et al,

tcpI951-R

5´- GGCAATAGTGTCGAGCTCGTTA -3´

2001)

Identificación de V. cholerae y detección de factores de virulencia: PCR múltiple especie V. cholerae / toxina de cólera (CT) / factor de colonización (TCP) alelo El Tor. Para templados de ADN preparados a partir de cultivos bacterianos puros o tamizaje de enriquecimiento en APA El fragmento específico para Vibrio cholerae pertenece a un fragmento del operón rRNA, de las regiones espaciadoras intergénicas (IRSs) localizadas entre 16S y 23S del rDNA (Chun et al, 1999). Para detectar la presencia de la toxina CT se amplifica un fragmento del gen ctxA que codifica para la subunidad A de la toxina. Por otro lado se amplifica un fragmento del gen tcpA que codifica para la proteína estructural (subunidad del pili), alelo específico del Biotipo El Tor, ya que esta proteína es polimórfica.

Tabla 2. PCR- Múltiple V. cholerae / ctxA / tcpA Reactivos

Volumen ( µl )

Concentración

H2O

9,3

Buffer Tris-HCl 10X

2,5

1X

Cl2Mg 50mM

1

2 Mm

dNTP (mix) 2.5 mM

2

0,2 mM

primer VC-F2 10uM

2

0,8 µM

primer VC-mR1 10uM

2

0,8 µM

primer CT 94-F 10uM

1

0,4 µM

primer CT 614-R 10 uM

1

0,4 µM

primer TCP 72-F

1

0,4 µM

primer TCP 477-R

1

0,4 µM

Taq DNA polimerasa 5U/µl

0,2

1U

AND

2

Vol Final (µl)

25

Condiciones de ciclado Etapa 1

94ºC

2 min

Etapa 2

94ºC

45 seg

Etapa 3

60ºC

45 seg

Etapa 4

72ºC

45 seg

Etapa 5

72ºC

10 min

Etapa 6

14 ºC

30 ciclos

Gel de agarosa al 2 % Tamaño de fragmento

300 pb

Vc-m (16S-23S)

Esperado

451 pb

tcpA ElTor

564 pb

ctxA

Identificación de V. cholerae O1 y O139: PCR múltiple. Para templados de ADN preparados a partir de cultivos bacterianos puros o tamizaje de enriquecimiento en APA. La biosíntesis del antígeno O en V. cholerae es controlado por los genes del locus rfb, de 22 kb para O1 y 35 kb para O139. La diferencia de secuencia de ADN entre los serogrupos está dada por una región específica para O139 de 13 kb., tal que con el uso de primers específicos se pueden definir claramente los diferentes serogrupos. Se implementó la reacción de PCR-múltiple para la determinación de serogrupos O1 y O139 (Rivera et al, 2003).

los

Tabla 3. PCR- Múltiple O1/O139 Reactivos

Volumen ( µl )

Concentración

H2O dest.

13,6

Buffer Tris-HCl-10X

2,5

1X

Cl2Mg 50mM

0,75

1,5 mM

dNTP (mix) 2.5 mM

2

0,2 mM

primer VCO1-F2

1

0,4 µM

primer VCO1-R2

1

0,4 µM

primer VCO139-F2

1

0,4 µM

primer VCO139-R2

1

0,4 µM

Taq DNA polimerasa 5U/µl

0,15

0,75 U

AND

2

Vol Final (µl)

25

Condiciones de ciclado Etapa 1

94ºC

2 min

Etapa 2

94ºC

1 min

Etapa 3

55ºC

1 min

Etapa 4

72ºC

2 min

Etapa 5

72ºC

10 min

Tamaño de fragmento

647 pb

O1

Esperado

741 pb

O139

30 ciclos

Gel de agarosa al 2 %

Identificación por PCR del gen regulador tcpI. Dentro del operón que lleva los genes para la síntesis de TCP, el gen regulador tcpI está sometido a menor presión de selección que el gen estructural tcpA, por lo que tiene una variabilidad mucho menor. La detección de este gen es de especial utilidad como indicador de la presencia de TCP en cepas que tienen variantes del gen tcpA diferentes al alelo “EL Tor”.

Tabla 4. PCR para detección del gen tcpI Reactivos

Volumen ( µl )

H2O dest.

13,63

Buffer Tris-HCl-10X

2,5

Concentración

1X

Cl2Mg 50mM

0,75

1,5 mM

dNTP (mix) 2.5 mM

2

0,2 mM

primer tcpI 132-F

2

0,8 µM

primer tcpI 951-R

2

0,8 µM

Taq DNA polimerasa 5U/µl

0,125

0,6 U

AND

2

Vol Final (µl)

25

Condiciones de ciclado Etapa 1

94ºC

2 min

Etapa 2

94ºC

1 min

Etapa 3

60ºC

1 min

Etapa 4

72ºC

2 min

Etapa 5

72ºC

10 min

862pb

tcpI

30 ciclos

Gel de agarosa al 1.5 % Tamaño de fragmento Esperado

PROTOCOLOS UTILIZANDO COMO TEMPLADO ADN EXTRAÍDO DE MUESTRAS DE AGUA (detección directa sin enriquecimiento) Para este tipo de muestras, la mayoría de los reactivos utilizados coincide con los de la sección anterior, pero sus concentraciones se optimizan para mejorar la sensibilidad de la reacción. También se adiciona seroalbúmina bovina (BSA) para mejorar la efectividad de la técnica y evitar la acción de inhibidores, y se cambian las condiciones de ciclado ya que se parte de una concentración mucho menor de ADN. Es particularmente importante utilizar reactivos de la mejor calidad posible, como la enzima Go Taq Polimerasa (Promega), que fue incorporada al protocolo estandarizado que se describe, ya que es la polimerasa con mayor eficiencia entre las que se evaluaron en nuestro laboratorio. Para estas muestras, se realiza primero una PCR para determinar la presencia de V. cholerae (identificación de especie). Las muestras positivas son estudiadas posteriormente para evaluar la presencia de los serogrupos O1 y O139 y de los genes de virulencia ctxA y tcpA.

PCR para identificación de Vibrio cholerae a partir de muestras de agua Durante la estandarización y validación de la PCR para la detección directa de V. cholerae en muestras ambientales, se desarrolló un Control Interno de Amplificación (CIA), que permite descartar la posible presencia de inhibidores de la PCR (González Fraga, tesis doctoral). En la Tabla 5 se presentan los componentes de la mezcla de reacción, condiciones de ciclado y tamaño de los fragmentos de ADN amplificados para la PCR a partir de muestras de agua, utilizando el CIA.

Tabla 5. PCR Vibrio cholerae a partir de muestras de agua Reactivos

Volumen (ul)

H2O dest.

8,8

Concentración

BSA 10 mg/ml

1

Buffer 5X (de enzima GoTaq)

5

Cl2Mg 25 mM

1*

2,5 mM final

Mix dNTP (2.5 mM)

2

0,2 mM

primer VC-F2 10µM

1,5

0,6 µM

primer VC-mR1 10µM

1,5

0,6 µM

GoTaq DNA pol. 5U/µl

0,2

1U

ADN

3

IAC (100 - 200 copias)

1

Vol Final (µl)

25

400 ng/ul

*sólo se agrega 1 ul de Cl2Mg debido a que el buffer comercializado con la enzima Go Taq ya tiene entre sus componentes Cl2Mg

Condiciones de ciclado Etapa 1

94ºC

2 min

Etapa 2

94ºC

1 min

Etapa 3

55ºC

1 min

Etapa 4

72ºC

1 min

Etapa 5

72ºC

10 min

Etapa 6

14 ºC

Gel de agarosa al 1.5 % Tamaño de fragmento esperado

300pb

Vc

35ciclos

Figura 6. PCR Vibrio cholerae a partir de muestras

V. cholerae

IAC 500bp bp

V. cholerae 300 bp

Marcador de PM

Control negativo

PCR para identificación de V. cholerae O1 a partir de muestras de agua (detección directa sin enriquecimiento) Esta reacción ha sido optimizada para la detección del serogrupo O1, responsable de las epidemias en América Latina. Si se desea identificar además el serogrupo O139 puede realizarse una PCR con los primers correspondientes y utilizando una temperatura de annealing de 55ºC. En la Tabla 6 se presentan los componentes de la mezcla de reacción, condiciones de ciclado y tamaño de los fragmentos de ADN amplificados.

Tabla 6. PCR para detección de genes que codifican el serogrupo O1 a partir de muestras de agua Reactivos H2O dest.

Volumen (ul)

Concentración

8.8

BSA 5mg/ml

2

Buffer 5X (de enzima GoTaq)

5

Cl2Mg 25mM*

1

2,5 mM final

Mix dNTP (2.5 mM)

2

0,2 mM

primer VCO1-F2 10µM

1.5

0,6 µM

primer VCO1-R2 10µM

1.5

0,6 µM

Go Taq DNA pol. 5U/µl

0.2

1U

ADN

3

Vol Final (µl)

22

400 ng/ul

Condiciones de ciclado Etapa 1

94ºC

2 min

Etapa 2

94ºC

1 min

Etapa 3

50ºC

1 min

Etapa 4

72ºC

1 min

Etapa 5

72ºC

10 min

Etapa 6

14 ºC

35 ciclos

Gel de agarosa al 1.5 % Tamaño de fragmento

647 pb

O1

esperado *sólo se agrega 1 ul de Cl2Mg debido a que el buffer comercializado con la enzima Go Taq ya tiene entre sus componentes Cl2Mg

Figura 7. PCR V cholerae serogrupo O1 a partir de muestras de agua

O1

PCR para identificación de ctxA (toxina CT)/ y tcpA (TCP) a partir de muestras de agua (detección directa sin enriquecimiento) En la Tabla 7 se presentan los componentes de la mezcla de reacción, condiciones de ciclado y tamaño de los fragmentos de ADN amplificados para la detección de estos genes asociados a virulencia en muestras de agua.

Tabla 7. PCR- Múltiple ctxA / tcpA con Go Taq Reactivos H2O dest.

Volumen (µl)

Concentración

7.8

BSA 5mg/ml

2

400 ng/ul

Buffer 5X (de la enzima Go Taq)

5

1X

Cl2Mg 25 mM*

1

2,5 mM

dNTP (mix) 2.5 mM

2

0,2 mM

primer CT 94-F 10uM

1

0,4 µM

primer CT 614-R 10 uM

1

0,4 µM

primer TCP 72-F

1

0,4 µM

primer TCP 477-R

1

0,4 µM

0,2

1U

Go Taq DNA pol. 5U/µl ADN

2

Vol Final (µl)

25

Condiciones de ciclado Etapa 1

94ºC

2 min

Etapa 2

94ºC

1 min

Etapa 3

60ºC

1 min

Etapa 4

72ºC

1 min

Etapa 5

72ºC

10 min

Etapa 6

14 ºC

35 ciclos

Gel de agarosa al 2 % Tamaño de fragmento

451 pb

tcpA El Tor

esperado

564 pb

ctxA

Figura 8. PCR- Múltiple ctxA / tcpA a partir de muestras de agua

ctxA

tcpA El Tor

DETECCIÓN DE LOS PRODUCTOS DE PCR •

Preparación del gel de agarosa

Se pesa la agarosa según el porcentaje y el tamaño del gel que se desea preparar, se agrega el volumen de buffer TAE 1X correspondiente y se funde en el horno microondas a 40% de potencia. La concentración de agarosa (0,7-2%) se calcula en función del tamaño de los fragmentos, tal que para fragmentos de bajo peso molecular se empleará la mayor concentración y viceversa. (En las Tablas 2 a 7 se especifica la

concentración adecuada para cada corrida electroforética). La agarosa fundida se coloca en el soporte armado con su peine, que es retirado una vez solidificado el gel. •

Electroforesis

Una vez solidificado el gel, se coloca en la cuba electroforética que contiene suficiente cantidad de buffer TAE 1X de tal modo que el gel quede cubierto. Se mezcla el buffer de siembra con la muestra en una proporción de 1 parte y 5 partes respectivamente, y se cargan 10-20µl de cada dilución por pocillo. Se siembra también el marcador de peso molecular. A la par de las muestras, se siembran el control positivo y el control negativo. Se conecta la cuba a la fuente de poder teniendo la precaución de que la línea de siembra se encuentre en el polo negativo ya que las moléculas de ADN migran hacia el polo positivo. Las condiciones de la corrida electroforética recomendadas para las PCRs descriptas son 100 voltios durante 30 minutos. •

Tinción del gel

Finalizada la corrida electroforética se procede a la tinción del gel en una solución de bromuro de etidio en una concentración de 1µg/ml durante 30 minutos. Luego se enjuaga el gel en agua destilada. •

Precaución:

El bromuro de etidio es un reactivo cancerígeno por lo cual debe manipularse con extremo cuidado y el operador debe estar protegido con guantes. Para decontaminar la solución se agregan 200 mg de carbón activado cada 100 ml de solución de bromuro de etidio. Dejar 24 hs a temperatura ambiente con agitación intermitente. Filtrar con papel de filtro Whatman Nº 1 y descartar el filtrado y eliminar el filtro y el carbón remanente en envases para residuos patológicos. •

Observación de los fragmentos

El gel teñido es colocado en el transiluminador de UV que permite la visualización de las bandas de las diferentes muestras. Comparando la distancia recorrida de los fragmentos obtenidos de las muestras con el marcador de peso molecular se puede estimar el tamaño de los fragmentos. Para documentar esta reacción puede obtenerse una fotografía con un sistema de registro de imágenes.

CAPÍTULO II - DETERMINACIÓN DE LA SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS EN Vibrio cholerae

INTRODUCCION El cólera es una infección diarreica aguda causada por la ingestión de alimentos o agua contaminada con Vibrio cholerae. Alrededor de un 75% de las personas infectadas no presentan síntomas aunque excretan vibrios en sus heces durante 7 a 14 días, siendo un elemento importante en la diseminación de la enfermedad. De las personas que desarrollan síntomas un 80% presentan síntomas leves a moderados, mientras que el 20% desarrollan una diarrea acuosa severa con deshidratación grave que puede llevar a la muerte si no se tata. El cólera es una enfermedad de fácil tratamiento. Más del 80% de los pacientes se recuperan luego de la administración de sales de rehidratación oral. Aquellos pacientes muy deshidratados requieren la administración de fluidos endovenosos y en este tipo de pacientes el tratamiento antimicrobiano puede ser útil debido a que disminuye la duración de la diarrea, disminuye la pérdida de líquidos y la duración de la eliminación del vibrio en heces. La administración en masa de antimicrobianos no es recomendada ya que no tiene efecto sobre la diseminación del cólera y puede contribuir a la aparición de resistencia a los antimicrobianos. Los antimicrobianos deben ser considerados en personas con cólera moderado a grave. Cuando se utiliza un agente antimicrobiano es crucial elegir uno para el cual el microorganismo sea susceptible. Los agentes antimicrobianos de primera línea recomendados por OPS para el tratamiento del cólera son: doxiciclina (para adultos) y azitromicina o eritromicina (para embarazadas y niños). Las drogas de segunda línea son: ciprofloxacina o azitromicina para adultos y ciprofloxacina o doxiclina para niños. Debido a que la resistencia a los antimicrobianos ha ido en aumento en muchas partes del mundo, es importante determinar la sensibilidad

a los antimicrobianos de Vibrio cholerae O1 al inicio de la

epidemia y monitorearla periódicamente. Los datos que surgen del estudio de las cepas del brote de cólera que comenzó en octubre de 2010 en Haití, muestran que el la cepa circulante es Vibrio cholerae serogrupo O1, serotipo Ogawa, biotipo el Tor. Estos aislamientos presentaron sensibilidad a tetraciclina (por lo tanto, a doxiciclina), y kanamicina, sensibilidad intermedia a cloranfenicol y ampicilina, resistencia

a

sulfametoxazol,

trimetoprima-sulfamentoxazol,

furazolidona,

ácido

nalidíxico

y

estreptomicina; y sensisibilidad disminuida a ciprofloxacina. En este manual se describe la metodología para determinar la sensibilidad de Vibrio cholerae a los antimicrobianos, mediante el método de difusión con discos.

DETERMINACION DE LA SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS POR MÉTODO DE DIFUSION

2.1. INTRODUCCIÓN La técnica que se utiliza actualmente para la determinación de la sensibilidad a los antimicrobianos es el producto de importantes esfuerzos internacionales que, desde hace más de tres décadas, están enfocados a normatizar y estandarizar el método. El comité de expertos de la OMS y grupos colaborativos internacionales dirigidos por Ericsson y Sherris a instancias del mismo organismo, sugirieron recomendaciones que fueron seguidas por la mayor parte de los países europeos. El siguiente es un resumen de la metodología referida habitualmente como “Método de la OMS” y que no difiere sustancialmente del conocido “Kirby Bauer ''. Las recomendaciones para los estudios de sensibilidad por el método de difusión por discos, están planteadas para bacterias de rápido desarrollo. Los límites para interpretar las zonas de inhibición fueron calculados a partir de curvas de correlación de concentración inhibitoria mínima (CIM) frente a los diámetros de las zonas de inhibición obtenidos sobre un gran número de ceaps de cepas bacterianas, entre las cuales normalmente no se incluía Vibrio cholerae. En el año1998, el CLSI incorporó, por primera vez en el documento M100-S8, los criterios de interpretación para la evaluación de la sensibilidad de V.cholerae, tanto por método de difusión como dilución. En agosto de 2010. el CLSI incluyó estos criterios con algunas modificaciones en la Tabla 15 Documento M45-A2. En este nuevo documento se describe la metodología y los puntos de corte a utilizarse en microorganismos infrecuentes o fastidiosos.

2.2. SELECCIÓN DE LOS AGENTES ANTIMICROBIANOS PARA LAS PRUEBAS DE SENSIBILIDAD La selección de los agentes antimicrobianos apropiados para la prueba de sensibilidad, es una decisión de cada laboratorio clínico en consulta con el cuerpo médico, el comité de farmacia y el comité de enfermedades infecciosas. A continuación se enumeran los antibióticos que deberían ensayarse para la vigilqancia de la tratamiento de infecciones por Vibrio cholerae.

TETRACICLINA (1) TRIMETOPRIMA - SULFAMETOXAZOL AMPICILINA (2) CLORANFENICOL (3) FURAZOLIDONA (4) /NITROFURANTOINA (5) ACIDO NALIDIXICO (4) CIPROFLOXACINA (6)

Si bien la técnica de difusión de discos es el método más comúnmente utilizado para determinar la sensibilidad a los antimicrobianos, los puntos de corte para interpretar las zonas de inhibición para V. cholerae

O1

fueron

establecidos

por

la

CLSI

sólo

para

ampicilina,

tetraciclina,

trimetoprima/sulfametoxazol, sulfonamidas y cloranfenicol. La interpretación de sensible, intermedio y resistente correlacionan bien con los resultados determinados por microdilución en caldo (Tabla 15, Documento M45-A2, 2010).

1) La tetraciclina es representativa de todas las tetraciclinas y el resultado se puede extrapolar a doxiciclina. No se recomienda el uso del método de difusión por discos para doxiciclina, porque se ha encontrado pobre correlación con los resultados de CIM. 2) Representativa para ampicilina y amoxicilina. 3) Usar con precaución el método de difusión para cloranfenicol (alto porcentaje de errores menores). 4) Se han propuesto puntos de corte tentativos para ác. nalidíxico y furazolidona, basados en estudios multilaboratoriales realizados por el CDC, utilizando la metodología del CLSI. Cuando se realice screening con estos discos por el método de difusión los resultados obtenidos deben interpretarse con precaución. 5) Si bien una de las opciones de tratamiento para las infecciones por V. cholerae podría ser furazolidona, en aquellos laboratorios que no cuenten con con discos de esta droga

(disco de

furazolidona 100ug), el disco de nitrofurantoina de 300 ug podría ser una opción para evaluar la sensibilidad a los nitrofuranos. Aún no se han propuesto puntos de corte para la interpretación de la sensibilidad de Vibrio cholerae a estas drogas, hasta tanto no contemos con recomendaciones específicas, parece prudente continuar utilizando para la interpretación de nitrofurantoina con los puntos de corte propuestos por el CLSI para Enterobacterias (Tabla 2A -Documento M100-S20, CLSI 2010). 6) Ciprofloxacina tampoco cuenta con puntos de corte del CLSI para V. cholerae por lo que parece prudente utilizar para la interpretación de esta droga, los límites propuestos por el CLSI para Vibrios

spp. no cholerae (Tabla 15, Documento M45-A2, 2010), que son equivalentes a los utilizados para Enterobacterias en la Tabla 2A -Documento M100-S20, CLSI 2010.

En el caso particular de los macrólidos (eritromicina y azitromicina), si bien son drogas de primera línea para el tratamiento de las infecciones por V. cholerae, no debería usarse el método de difusión por discos dado que se ha encontrado una pobre correlación con las CIMs. Esto se debe principalmente a que la CIM del antimicrobiano que separa las bacterias sensibles de las resistentes se establece en base a varios criterios, entre ellos, las concentraciones que alcanza el fármaco en suero a dosis habituales, sin tener en cuenta las concentraciones alcanzadas en otros fluidos biológicos. Esta limitación es particularmente trascendente en macrólidos frente a Vibrio cholerae. Eritromicina alcanza en intestino delgado concentraciones superiores a las séricas (alrededor de 60 mg/l). A esto efecto de se le suma, que los macrólidos poseen mayor actividad intrínseca pH alcalino (propio de intestino delgado) que a pH sérico. En nuestra experiencia, Vibrio cholerae presenta un rango de CIM de eritromicina de 2 a 4 µg/ml. Estos valores corresponden a cepas de Vibrio cholerae sensibles a macrólidos. La sensibilidad a azitromicina sólo se podría evaluar por el método concentración inhibitoria mínima (CIM) según la Tabla 15 del documento M45-A2 del CLSI.

Para evitar una mala interpretación, en el informe de rutina al médico deben incluirse únicamente las drogas de primera elección apropiadas al uso terapéutico.

2.3. PROCEDIMIENTO Materiales Equipos • Ansas para inocular tipo loop (1-10 µl) • Pinzas • Mechero tipo Bunsen • Regla o calibre • Pipetas Pasteur plásticas descartables

Soluciones, reactivos y medios de cultivo • Solución fisiológica estéril, 3 ml en tubos • Caldo apropiado (tripteina soja (soya) u otro) estéril ,4 ó 5 ml en tubos • Placas con agar Mueller Hinton (profundidad del agar de 4 mm) • Discos de antibióticos

• Estándar de turbidez equivalente al 0.5 de la escala de Mc Farland

Agar Mueller Hinton. El Agar Mueller Hinton es el único medio para estudiar la sensibilidad a los antimicrobianos validado por la CLSI. 1. Preparar el agar Mueller Hinton a partir de la base deshidratada de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. 2. Inmediatamente después de esterilizar dejar enfriar en baño de agua hasta 45-50ºC. 3. Dispensar el medio en las placas de Petri de fondo plano sobre una superficie perfectamente horizontal, para obtener una capa uniforme de aproximadamente 4mm de espesor. Esto corresponde a 60-70 ml de medio para placas de 150mm. de diámetro y 25 a 30 ml. para las de 100mm. de diámetro interno. 4. Las placas que no se usan en el día pueden mantenerse en refrigerador (2-8ºC). Las placas con más de 7 días de preparación no son adecuadas para las pruebas de sensibilidad salvo que sean envueltas en bolsas de plástico para evitar la desecación. 5. Debe controlarse la esterilidad de una muestra representativa de cada lote incubando 24 horas o más a 35°C. 6. Cada vez que se prepara un nuevo lote de medio de cultivo, debe controlarse el pH. El mismo debe estar comprendido entre 7,2 y 7,4 a temperatura ambiente y se debe determinar después de la solidificación del medio. 7. Si justo antes de usar, hay exceso de humedad en la superficie, las placas deben ser secadas en estufa a 35ºC durante 10-30 min. Las placas deberán estar húmedas pero no mostrar gotas sobre la superficie del medio.

Estándar de turbidez de Mc Farland. Para estandarizar la densidad del inóculo se utiliza una suspensión de sulfato de bario como estándar de turbidez (0.5 de la escala de Mc Farland). Una turbidez equivalente al 0.5 de Mc Farland representa aproximadamente 108 UFC/ml para bacterias de rápido crecimiento. La estandarización de inóculo es esencial ya que el tamaño de la zona de inhibición es muy dependiente de la densidad del inóculo utilizado. 1. Preparar dicho estándar agregando 0,5 ml de BaCl2 0,048M (1,175% P/V BaCl2.2H2O) a 99,5 ml de H2SO4, 0,18 M (0,36 N) (1% V/V). Verificar la densidad correcta del estándar usando un espectrofotómetro. La absorbancia a 625 nm debe ser 0,08 a 0,10, para el estándar 0,5 de Mc Farland.

2. Distribuir en 4-6 ml dentro de tubos similares a los usados para la preparación de los inóculos de las cepas clínicas y mantener guardados a temperatura ambiente y al abrigo de la luz. 3. Inmediatamente después de su preparación, los tubos se deben sellar herméticamente para evitar la evaporación y concentración de la suspensión. 4. Agitar vigorosamente con vortex o manualmente el estándar antes de su uso para lograr una turbidez homogénea. 5. Reemplazar o verificar la confiabilidad de los estándares mensualmente. Descartar los estándares, que presenten alguna evidencia de evaporación. Esto pude controlarse marcando los tubos en el momento de la preparación con una marca a la altura del menisco. Si la evaporación es evidente, descartar los tubos.

Preparación del inóculo. 1. Seleccionar 4 ó 5 colonias bien aisladas de igual morfología de la placa de cultivo. Preparar una suspensión en 4 ó 5 ml de caldo (p.ej.: tripticasa de soja) tocando la parte superior de cada colonia. 2. Incubar a 35 - 37ºC hasta que el cultivo alcance o exceda la turbidez del standard 0,5 de Mc Farland. (aproximadamente 2-4 horas). Alternativamente el inóculo puede ser obtenido directamente a partir de colonias seleccionadas de una placa de cultivo no selectivo, de no más de 18 a 24 horas de incubación para ello seleccionar 4 ó 5 colonias bien aisladas de igual morfología y preparar una suspensión en 4 o 5 ml de solución fisiológica (ClNa 0.85%). Proceder a ajustar directamente el inoculo (paso siguiente) sin incubación previa. 3. Ajustar la turbidez del inóculo hasta el 0,5 de la escala de Mc Farland, por comparación visual con el estándar. Para ello, se deben observar los tubos contra un fondo blanco con una línea negra como contraste. NOTA: Es muy importante la preparación del inóculo en solución fisiológica (ClNa 0.85%). Esto permite que la mayoría de los Vibrios spp. puedan crecer satisfactoriamente en el agar o caldo Mueller Hinton sin la necesidad de agregar ClNa a estos medios.

Inoculación de las placas. 1. Dentro de los 15 minutos después de ajustado el inóculo sembrar las placas de Mueller Hinton con un hisopo estéril. Para llevar a cabo este paso se debe introducir el hisopo en la suspensión estandarizada, retirarlo y presionarlo contra las paredes del tubo a fin de eliminar el exceso de inóculo. 2. Inocular la superficie seca del agar Mueller Hinton por estriado en varias direcciones para asegurar una completa distribución del inóculo. Las zonas de inhibición deberán ser uniformemente circulares y el desarrollo confluente. Si crecen sólo colonias aisladas el antibiograma debe repetirse. Esperar de 3 a 5

minutos, pero no más de 15 min. antes de aplicar los discos para que se absorba el exceso de humedad superficial.

Colocación de los discos. Los discos deben mantenerse refrigerados a 2-8ºC (si van a ser utilizados en los siguientes 7 días) o en congelador (freezer) a -14 ºC o menos (para conservación a largo plazo). Deben guardarse en contenedores herméticos con desecante y ser sacados del refrigerador 1 ó 2 horas antes de su uso a fin de lograr un equilibrio en la temperatura antes de ser abiertos los frascos o contenedores. Este proceso evita la condensación que podría ocurrir cuando la humedad ambiente alcanza los frascos fríos. 1. Colocar los discos sobre la superficie del agar inoculada con pinza estéril, aplicando una ligera presión y a una distancia no menor a 24 mm desde un centro al otro. Debido a que algunas drogas difunden casi instantáneamente, un disco no debe ser removido una vez que tomó contacto con la superficie del agar. No deben colocarse más de 5 discos por placa de 90 mm o 12 en placa de 150 mm, para prevenir la superposición de las zonas de inhibición y que se produzca un error de medida (Ver esquema de colocación de discos). 2. Incubar las placas invertidas a 35±2 ºC dentro de los 15 minutos posteriores a que los discos fueron aplicados, en atmósfera aeróbica.

Esquema de colocación de discos para la determinación de la sensibilidad a los antimicrobianos por el método de difusión en V. cholerae.

TMS

CIP AMP

NAL

TET

CMP

NIT

TMS: trimetoprima/sulfametoxazol, NIT: nitrofurantoína/furazolidona, AMP: ampicilina, CIP: ciprofloxacina; TET: tetraciclina; CMP: cloranfenicol, NAL: ácido nalidíxico.

Lectura e interpretación de resultados. 1. Después de 16 a 18 horas de incubación examinar cada placa. 2. Verificar la pureza del inóculo 3. Verificar que el crecimiento sea confluente. Si las placas fueron satisfactoriamente hisopadas y el inóculo fue el correcto, las zonas de inhibición serán uniformemente circulares 4. Medir los diámetros de las zonas de inhibición en milímetros. 5. Para la lectura de los halos se deberá tener en cuenta el área que no muestre desarrollo obvio a ojo desnudo, no incluyendo velo de crecimiento o colonias muy pequeñas que puedan ser detectadas sólo con mucha dificultad en el borde de la zona de inhibición. Cuando se prueban discos de trimetoprima/sulfametoxazol no considerar en la lectura un crecimiento del 20% o menos del desarrollo total. 6. Los tamaños de las zonas de inhibición serán interpretados con los puntos de corte especificados en la Tabla 1. Los organismos se informarán sensibles, intermedios o resistentes al antimicrobiano ensayado según corresponda. 7. Si aparecen colonias mayores dentro de la zona clara se deberán subcultivar, re-identificar y reevaluar en cuanto a la sensibilidad a los antimicrobianos.

TABLA 1. Puntos de corte para zonas de diámetro y su equivalente concentración inhibitoria mínima (CIM) para Vibrio cholerae.

Condiciones del test: Medio: Agar Mueller-Hinton Inóculo: Método de crecimiento previo o suspensión de colonia directa, equivalente al estándar 0.5 de Mc Farland. Preparar el inóculo en 0.85% NaCl Incubación: 35 ± 2 ºC, aire, 16-18 horas. Control de Calidad: E.coli ATCC 25922 Familia

Agente Antimicrobiano

Disco

Zona de diámetro de Inhibición (mm) R

I

S

≤13

14-16

≥17

Equivalente CIM Breakpoint (ug/mL) R S

PENICILINAS Ampicilina1

10 ug

≥32

≤8

TETRACICLINAS Tetraciclina1

30 ug

≤11

13-14

≥15

≥16

≤4

Doxiciclina1

-

-

-

-

≥16

≤4

≤10

11-15

≥16

≥4/76

≤2/38

≤12

13-16

≥17

≥512

≤256

30 ug

≤12

13-17

≥18

≥32

30 ug

≤18

-

≥19

-

-

5ug

≤15

16-20

≥21

≥4

≤1

Nitrofurantoina2

300 ug

≤14

15-16

≥17

≥128

≤32

Furazolidona3

100 ug

≤17

-

≥18

-

-

Azitromicina1

-

-

-

-

-

≤2

INHIBIDORES DE LA RUTA DEL FOLATO Trimetoprima/ sulfametoxazol1 Sulfonamidas1

1.25/ 23.75 ug 250ug or 300 ug

FENICOLES Cloranfenicol1

≤8

QUINOLONAS Ac. nalidíxico3 Ciprofloxacina1 y 2 NITROFURANOS

MACROLIDOS

1. Puntos de corte de Vibrio cholerae. Tabla 15, M45-2A. CLSI 2010. 2. Puntos de corte de Enterobacteriaceae. Tabla 2A, M100-S20. CLSI 2010 3. Criterios de interpretación propuestos basados en estudios multilaboratoriales propuestos por el CDC.

CONTROL DE CALIDAD Propósito El objetivo de un programa de control de calidad interno es el monitoreo de: • la exactitud y precisión de los procedimientos para realizar las pruebas de sensibilidad, • la calidad de los reactivos usados en las pruebas, y • el desempeño de las personas que llevan a cabo los ensayos y la lectura de los resultados. Estos objetivos son alcanzados principalmente por la utilización de cepas de referencia seleccionadas por su estabilidad genética y por su utilidad en los métodos a ser controlados. Cepas patrones para control de calidad de las pruebas de sensibilidad Para controlar la precisión y la exactitud de las pruebas de difusión, se deben obtener de una fuente confiable las siguientes cepas patrones para control de calidad: • E. coli ATCC® 25922 • P. aeruginosa ATCC® 27853 • S. aureus ATCC® 25923 • E. faecalis ATCC® 29212 • E. coli ATCC® 35218 • K. pneumoniae ATCC® 700603

E. coli ATCC® 35218 productor de ß-lactamasa se recomienda solamente para el control de calidad de los discos que contengan la combinación "ß-lactámico/Inhibidor de ß-lactamasa", entre estos inhibidores se encuentran: ácido clavulánico, sulbactam y tazobactam. Cuando se prueben rutinariamente sulfonamidas, trimetoprima ó trimetoprima-sulfametoxazol, debe controlarse, para cada lote nuevo de Mueller Hinton, los niveles de timina ó timidina. Para ello debe utilizarse E. faecalis ATCC® 29212 ó 33186.

Tabla 2. Microorganismos sugeridos para el control de calidad de las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos Cepa Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

- ß-lactámicos e inhibidores de ß-lactamasas como ampicilina/sulbactama, amoxicilina/ácido clavulánico, ticarcilina/ácido clavulánico, etc. - Mide la carga de inhibidores de ß-lactamasas de los discos paraantibiograma. Probar sólo frente a combinaciones de antibióticos - Calidad de la prueba de sensibilidad - Concentración de timidina: Este compuesto interfiere con la actividad de trimetoprima y de sulfametoxazol

Escherichia coli ATCC 25922 Escherichia coli ATCC 35218 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Enterococcus faecalis ATCC 29212 Factores a evaluar: Propiedades - Concentración de cationes: Aumento de resistencia a aminoglucósidos cuando aumenta la concentración de calcio y magnesio. - pH: Aumento de resistencia a aminoglucósidos cuando el pH del medio disminuye. • No subcultivar, se seleccionan mutantes resistentes a las penicilinas activas frente a Pseudomonas spp • Frente a un doble halo alrededor del disco de imipenem, cambiar el lote de Mueller Hinton. - Calidad de la prueba de sensibilidad

Procedimiento Para controlar la precisión y la exactitud de la prueba, se debe proceder de la siguiente manera: 1. Mantener subcultivos almacenados de las cepas de referencia. 2. Probar las cepas de referencia siguiendo el procedimiento ya descripto en el punto 3 con los mismos antibióticos que utiliza para las cepas clínicas. 3. Guardar los cultivos de trabajo en agar tripticasa - soja a 4 - 8º C. y subcultivar semanalmente. Para prolongar el tiempo de almacenamiento, se pueden mantener los cultivos en forma liofilizada ó a -20º C o menos (p.ej. Nitrógeno líquido) en medios adecuados, por ejemplo caldo al 50 % de suero fetal bovino, en sangre de oveja desfibrinada. 4. Reemplazar los cultivos de trabajo por lo menos una vez al mes.

Frecuencia de Realización de las pruebas de control de calidad con las cepas de referencia Cada vez que se utiliza un nuevo lote de Mueller Hinton o un nuevo lote de discos de antibiótico debe hacerse los controles con las cepas apropiadas. Las cepas patrón de control de calidad se deben probar semanalmente y cada vez que se cambie cualquier reactivo que intervenga en la realización de las pruebas de sensibilidad; los discos de antibiótico a ensayar deben ser los mismos que se utilizan de rutina para los aislamientos clínicos.

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PARTE I – DIAGNOSTICO Y CARACTERIZACION DE Escherichia coli DIARREIGÉNICO CAPÍTULO I - INTRODUCCIÓN: 1.- Escherichia coli DIARREIGÉNICO Con el nombre de Escherichia coli diarreigénico (DEC) se denomina a un grupo heterogéneo de cepas que poseen distintos factores de virulencia y distinta interacción con la mucosa intestinal del hospedador, causan diferentes síndromes diarreicos y tienen distinta epidemiología. Las cepas DEC son causa importante de morbi-mortalidad en los países en vías de desarrollo. Hasta el presente se reconocen cinco categorías o patotipos: E. coli enteropatógeno (EPEC), E. coli enterotoxigénico (ETEC), E. coli enteroinvasivo (EIEC), E. coli enteroagregativo (EAEC) y E. coli productor de toxina Shiga (STEC). Ha sido propuesta una sexta categoría, llamada E. coli de adherencia difusa (DAEC), aunque la capacidad patogénica y la implicancia epidemiológica de estas cepas todavía no está lo suficientemente dilucidada.

1.1- Escherichia coli enteropatógeno (EPEC) Los primeros estudios epidemiológicos que sugieren que ciertas cepas de E coli son agentes causales de diarrea severa en la infancia fueron publicados a finales del siglo 19 [Robins-Browne et al., 1987]. En los años siguientes, diversos estudios reportaron la asociación de ciertas cepas de E. coli, de serogrupos específicos, con la diarrea infantil en Europa y los Estados Unidos [Robins-Browne et al., 1987; Levine et al., 1983]. Sin embargo, el reconocimiento de E. coli como agente causal de diarrea humana, fue realizado por John Bray [Bray et al., 1945], quien describió la asociación de cepas de Escherichia antigénicamente homogéneas con brotes de diarrea infantil ("diarrea de verano") en Inglaterra. En ese mismo período, Varela et al. [Varela et al., 1946] describió la asociación de una cepa de E. coli llamada (E. coli-gomez), con un caso de diarrea mortal en un niño en México. Posteriormente, distintos estudios realizados utilizando infecciones experimentales, corroboraron el potencial papel etiológico de ciertas cepas de E. coli en las enfermedades diarreicas [Levine et al., 1987]. En 1955, Neter et al [Neter et al., 1955], crearon el término E. coli enteropatógeno (EPEC) para designar a aquellas cepas de E. coli relacionadas epidemiológicamente con la diarrea infantil y diferenciarlas de las cepas de E. coli de la flora normal. Sin embargo, a pesar que EPEC fue el primer patotipo de E. coli diarreigénico identificado, su potencial patogénico fue confirmado y ampliamente aceptado cuando se demostraron síntomas evidentes de diarrea mediante experimentos de infección oral en voluntarios [Levine et al., 1978].

Hasta la década del 70, debido a la asociación epidemiológica de cepas de E. coli de ciertos serogrupos y serotipos con diarrea, el seroagrupamiento y/o la serotipificación fue el único método disponible para la identificación de EPEC y su diferenciación de cepas de E. coli no patógenas [Levine et al., 1987]. El desarrollo de técnicas de biología molecular y los ensayos en distintas líneas celulares han aportado gran información acerca de los factores y mecanismos de virulencia de EPEC [Nataro et al., 1998]. En la actualidad, el patotipo EPEC se divide en EPEC típico (tEPEC) y EPEC atípico (aEPEC). Esta clasificación se basa en la presencia del factor de virulencia EAF, asociado a la adherencia y codificado en el plásmido pEAF, presente en tEPEC, y ausente en aEPEC [Kaper et al., 1996]. Ambos grupos producen una lesión característica en las células intestinales conocida como A/E (del inglés, attaching/effacing), de adherencia y borrado de las microvellosidades, que resulta de la acción cooperativa de proteínas codificadas en un isla de patogenicidad denominada locus LEE (del inglés, locus of enterocyte effacement). Además, las cepas tEPEC y aEPEC carecen de los genes que codifican para las toxinas Shiga (Stx) de STEC, para las toxinas termolábiles y termoestables de ETEC, y no son invasivas [Kaper et al., 1996]. Hasta la década de 1990, las cepas tEPEC fueron los principales agentes causantes de diarrea aguda en niños muy pequeños en países en desarrollo, incluidos los países de América Latina. En la actualidad hay una clara disminución de su frecuencia en muchos de estos países [Chen et al., 2005; Trabulsi et al., 2002]. Por el contrario, las cepas aEPEC, que son agentes importantes de diarrea en países desarrollados desde la década de 1960, son emergentes de diarrea aguda y persistente, afectando a niños y adultos en todo el mundo [Nataro et al., 1998; Trabulsi et al., 2002; Hernandes et al 2009]. Las principales características de tEPEC y aEPEC se presentan en la Tabla 1.

Tabla 1: Principales características de cepas EPEC típicas y atípicas Características Serotipos más comunes

Lesión A/E

EPEC típica

EPEC atípica

O55:H6, O55:NMa, O86:H34,

O26:H11, O55:H7,

O111ab:H2, O111ab:NM,

O55:H34, O86:H8,

O119:H6, O127:H6,

O111ac:H9, O111:H25,

O127:H40, O142:H6,

O119:H2, O125ac:H6,

O142:H34

O128ab:H2

Si

Si

Plásmido EAF (expresión Presente

Ausente

BFP ) Genes stx

No

No

Patrones de Adherencia

LAb

LA, LALc, AAd, DAe

Isla de Patogenicidad LEE

Presente

Presente

Regulación

per, ler, quorum sensing

ler, quorum sensing

Reservorio

Humanos

Humanos, animales

a

NM, no móvil. Patrones de Adherencia en células HeLa/HEp-2: bLA, Adherencia localizada; cLAL, Adherencia-simil localizada; d AA, Adherencia agregativa, eDA, Adherencia difusa.

1.1.1- Serotipos En 1987, la Organización Mundial de la Salud [Tikhomirov et al., 1987] definó como EPEC a las cepas de E. coli pertenecientes a 12 diferentes grupos O, también conocidos como serogrupos clásicos: O26, O55, O86, O111, O114, O119, O125, O126, O127, O128, O142, O158. Actualmente, se sabe que algunos serotipos dentro de estos serogrupos pueden comprender tanto cepas EPEC típicas y atípicas, como de otros patotipos diarreigénicos [Campos et al., 2004; Elias et al., 2002]. Entre las cepas tEPEC clásicas los serotipos más frecuentes son: O55:H6, O55:NM (no móvil), O86:H34, O111ab:H2, O111ab:NM, O119:H6, O127:H6, O127:H40, O142:H6, y O142:H34. Al estudiarse por multilocus enzimático (MLEE) y otros métodos moleculares, la mayoría de estos serotipos correspondieron a clones genéticamente relacionados [Trabulsi et al., 2002; Campos et al., 2004]. Sin embargo a lo largo de los años la frecuencia de estos serotipos ha cambiado y algunos serotipos de EPEC no-clásicos han sido identificados como tEPEC por ejemplo: O88:H25, y O145:H45 [Gomes et al., 1989]. En cuanto a las cepas aEPEC, diversos estudios epidemiológicos realizados en diferentes áreas geográficas han informado una gran diversidad antigénica, con al menos 109 serogrupos diferentes y más de 200 tipos de H diferentes [Hernandes et al., 2009]. Los serogrupos aEPEC más frecuentes son O26, O51, O55, O111, O145, y O119, mientras que los serotipos más frecuentes son O26:H11, O55:H7, O55:H34, O86:H8, O111ac:H9, O111:H25, O119: H2, O125ac:H6, y O128ab:H2 [Hernandes et al., 2009; Torres et al., 2005]. Un número considerable de cepas aEPEC son O y/o H no tipificables, y muchas son inmóviles.

1.1.2.- Patogenia Después de pasar por la barrera gástrica, las cepas EPEC se adhieren a la mucosa del intestino delgado y grueso, determinando complejas alteraciones que conducen a la diarrea. El proceso de colonización se divide en tres fases [Nataro et al., 1998]. La primera fase es superficial y no íntima, y los factores que median la adherencia inicial no han sido totalmente caracterizados, pero algunos estudios indican la posible participación de fimbrias tipo IV, llamadas BFP (del inglés, bundle forming pilus), otras estructuras fimbriales y afimbriales menos caracterizadas, como así también los flagelos, lo que indica que este fenómeno es multifactorial [Girón et al., 1993; Kaper et al., 2004]. Después de la adherencia

inicial, participa un sistema de secreción tipo III (T3SS) que codifica varias proteínas efectoras, cuyos efectos de señalización promueven diversas alteraciones en el epitelio del hospedador. Por último, existe una adherencia íntima que culmina con la lesión A/E. Morfológicamente, la lesión A/E incluye el borrado de las vellosidades intestinales y la formación de una estructura como pedestal, rica en actina sobre la cual se adhieren las bacterias EPEC (Figura 1).

Figura 1: Lesión A/E en ileo de conejo infectado con aEPEC mostrando el alargamiento de las microvellosidades y la formación de pedestales (Bar 26 µm).

1.1.3.- Mecanismos y factores de virulencia involucrados en la interacción de EPEC con la célula huésped

A.- Adherencia Las cepas tEPEC producen el llamado patrón de adherencia localizada (LA) sobre la superficie de las células HeLa/HEp-2 [Scaletsky et al., 1984], con formación de microcolonias compactas en la superficie celular mediada por el BFP [Giron 1991 et al]. La formación de microcolonias también se observa en la infección natural en niños, y en las biopsias ex vivo de humanos [Polotsky et al., 1977; Nougayrede et al., 2003]. Por el contrario, la mayoría de las cepas aEPEC producen un patrón modificado de LA denominado LAL (LA-like o simil LA) [Rodrigues et al., 1996], en el que se observa un número menor de bacterias sobre las células. Mientras que el patrón LAL es característico de la mayoría de las cepas de los serotipos aEPEC [Abe et al., 2009; Viera et al., 2001], algunas cepas aEPEC expresan modelos alternativos de adherencia in vitro, como la adherencia difusa (DA) o la adherencia agregativa (AA) [Abe et al., 2009; Dulguer et al., 2003; Viera et al., 2001; Nunes et al., 2003].

A.1.- Adhesinas El BFP, el primer factor de virulencia identificado en pEAF [Giron 1991 et al], está codificado por el operón BFP que consta de 14 genes [Stone et al.,1996; Sohel et al., 1996; Torres et al 2005] Los filamentos del BFP interconectan las bacterias EPEC dentro de las microcolonias para promover la

adherencia no-íntima de EPEC a los enterocitos en el intestino delgado y también están involucrados en la dispersión de las bacterias a través de la mucosa intestinal [Clearly et al., 2004; Tobe et al., 2001]. El BFP probablemente interviene en la adherencia inicial, mediante la unión a la N-acetillactosamina o receptores similares en la superficie la célula huésped [Hyland et al., 2008]. La contribución de BFP a la virulencia de EPEC se ha establecido por estudios realizados en voluntarios que ingirieron cepas EPEC con mutaciones en los genes del operón BFP y que tenían diarrea menos severas que las personas que recibieron la cepa de tipo salvaje [Bieber et al., 1998].

A.2.- Intimina La intimina es necesaria para la adherencia íntima de las bacterias a las células epiteliales y la reorganización del citoesqueleto [Jerse et al., 1990; Torres et al., 2005]. Se trata de una proteína de membrana externa de 94 kDa con una alta variabilidad en la composición de aminoácidos en su dominio C-terminal. El dominio altamente conservado N-terminal se inserta en la membrana externa de la bacteria, mientras que el dominio adhesivo C-terminal extracelular se expone al medio ambiente [Frankel et al., 1994]. Basándose en diferencias en la secuencia de nucleótidos de la porción C-terminal de la molécula, se han descripto más de 27 subtipos de intimina [Jores et al., 2001; Zhang et al., 2002]. Estos subtipos se nombran con letras griegas, siendo los tipos α y β los más comunes entre las tEPEC, mientras que los subtipos α, β, ζ, δ, y ε parecen ser las más frecuentes entre las cepas de los serotipos aEPEC. [Gomes et al., 2004; Blanco et al., 2006; Jenkins et al., 2006]. Por lo general, la mayoría de las cepas tEPEC de un serotipo determinado portan el mismo subtipo de intimina [Trabulsi et al., 2002], pero no todos los serotipos aEPEC tienen el mismo subtipo de intimina. La parte variable expuesta de la molécula de intimina se conecta a su proteína receptora Tir (receptor translocador de intimina), la cual es traslocada dentro del citosol de la célula eucariota blanco a través de un T3SS. Después de su translocación, el Tir es insertado en la membrana plasmática exponiendo su parte media en la superficie celular como un bucle. La intimina interactúa con esta región, induciendo el agrupamiento de moléculas Tir adyacentes, mientras que las porciones amino y carboxi del Tir son expuestas al citosol [Kenny et al., 1997]. El dominio C-terminal del Tir es fosforilado en su residuo Y474 y provoca la polimerización de actina en las cepas de tEPEC mientras que el Tir de las cepas de EHEC no es fosforilado y emplea otras proteínas efectoras para la misma función. Algunos estudios in vitro sugieren que diferentes subtipos de intimina puede determinar tropismo por diferentes sitios intestinales [Phillips et al., 2000]. Por lo tanto, los subtipos intimina pueden dar información importante sobre el tropismo tisular.

A.3.- EFA / LIF El factor inhibitorio de linfocitos (LiFa) es una proteína de superficie descripta en cepas de tEPEC, que inhibe la proliferación de linfocitos y la síntesis de citoquinas pro-inflamatorias [Klapproth et al., 2000]. El factor Efa1 (factor de adherencia 1 de EHEC) fue descripto por primera vez como posible adhesina en algunas cepas de EHEC [Nicholls et al., 2000]. Los genes lifA y efa1 son casi idénticos [Nicholls et al., 2000]. y se encuentran en una isla de patogenicidad denominada isla O 122 (OI-122). Efa1/LifA parecen contribuir a la adherencia de las cepas EPEC a las células epiteliales en ausencia de BFP. Hay evidencias que indican que efa1/lifA codifican un producto que regula la colonización bacteriana, la proliferación de células de las criptas intestinales, y la regeneración de las células epiteliales durante la colonización in vivo [Klapproth et al., 2005].

A.4.- Otras adhesinas La secuencia completa del genoma de la cepa prototipo tEPEC E2348/69, publicada recientemente, reveló la presencia de ocho operones intactos y cinco operones fimbriales incompletos, así como regiones de codificación diez adhesinas putativas nonfimbriales [Iguchi et al., 2009]. Sin embargo, entre los productos identificados del operón intacto, hasta ahora sólo se confirmó que BFP desempeña un papel en la formación de microcolonias in vitro [Giron et al., 1991] y la producción de diarrea en voluntarios humanos [Bieber et al., 1998]. Otras fimbrias codificadas por la cepa tEPEC E2348/69 incluyen las fimbrias tipo 1, fimbrias homólogas de las fimbrias polares largas (LPF, del inglés, long polar fimbriae) [Tatsuno et al., 2006]. Las LPF se identificaron originalmente en Salmonella enterica serovar Typhimurium y demostraron regular la adherencia de este organismo a las Placas de Peyer en el modelo murino in vivo [Baumler et al., 1996]. Estas fimbrias también median en la formación de microcolonias que contribuyen a la colonización por EHEC O157:H7 en algunos modelos animales [Jordan et al., 2004]. Estudios iniciales han indicado que el LPF no sería necesario para la adherencia y la formación de la lesión A/E [Tatsuno et al., 2006]. En cepas aEPEC y tEPEC, se encontraron diferentes variantes lpfA. Recientemente, se demostró que el pili común de E. coli (ECP, del inglés E. coli common pilus), que está presente en la mayoría de los aislamientos de E. coli, puede actuar en forma conjunta con BFP para estabilizar las interacciones entre EPEC y las células del hospedador [Rendon et al., 2007]. Además, se ha propuesto que el filamento EspA del T3SS es la adhesina mediadora de la adherencia inicial de las cepas EPEC que carecen de BFP [Clearly et al., 2004], pero la adherencia inicial de las cepas aEPEC probablemente pueda ser multifactorial.

A.5.- Flagelos Los flagelos contribuyen a la virulencia de las bacterias patógenas a través de la motilidad, la quimiotaxis, y la estimulación de IL-8 en células eucariotas. Además, algunas especies de flagelos, mostraron promover la adherencia y la invasión de las superficies celulares [Ramos et al., 2004]. Algunos tipos de antígenos flagelares, como el H2 y el H6 han sido identificados de forma consistente entre las cepas EPEC aisladas en diversos estudios epidemiológicos en todo el mundo.

B.- Eventos de señalización B.1.- Sistema de Secreción Tipo Tres (T3SS) La virulencia de EPEC y la producción de la lesión A/E son conferidos por la isla de patogenicidad cromosómica LEE, que codifica para el T3SS [Jarvis et al., 1995; Elliott et al., 1998]. Los T3SSs son utilizados por muchas bacterias patógenas gram-negativas para secretar proteínas efectoras directamente en las células eucariotas, alterando los diferentes procesos celulares del hospedador [Hueck et al., 1998; Cornelis et al., 2006]. T3SS constituye una estructura macromolecular compleja de más de 20 proteínas diferentes que atraviesa la envoltura celular bacteriana [Cornelis et al., 2006; Galán et al., 2006]. Se compone de una base en forma de anillo que abarca ambas membranas, y se extiende una proyección en forma de aguja que sobresale de la superficie bacteriana [Sekiya et al., 2001; Blocker et al., 2001]. Además, una proteína hidrófila forma un complejo de punta en el extremo distal de la aguja, y sirve como una plataforma para el montaje de dos proteínas hidrofóbicas, translocatoras para la formación de poros en la membrana de la célula huésped [Mueller et al., 2008; Mueller et al., 2005]. Los efectores son transportados a través de la aguja hueca directamente al citoplasma de las células diana a través del poro de translocación [Blocker et al., 2001; Mueller et al., 2008].

B.2.- LEE y efectores codificados no-LEE El análisis de la secuencia del genoma de la cepa prototipo E2348/69 reveló la existencia de 21 genes efectores del T3SS llevados como profagos lambda e integrones [Iguchi et al., 2009]. Siete de los efectores traslocados a través del T3SS están codificados dentro del PAI LEE (Tir, Map, EspB, EspF, EspH, EspZ y EspG), mientras que los demás se encuentran dispersos a lo largo del cromosoma y se denominan efectores codificados no-LEE- (NLE) [Deng et al., 2004; Dean et al., 2009]. Los efectores translocados LEE modifican las funciones normales de la célula huésped y son responsables de la formación de la lesión A/E, con la excepción de EspZ [Kanack et al., 2005]. El primer efector LEE que se caracterizó fue Tir, siendo esencial para la formación del pedestal [Kenny et al., 1997]. Además de promover la adherencia íntima, la polimerización de actina y el reordenamiento del citoesqueleto, la interacción Tir-intimina también provoca la fosforilación de una fosfolipasa de la célula hospedadora

[Kenny et al., 2002] y facilita la invasión de células no fagocíticas [Jepson et al., 2003]. Muchos de los efectores EPEC traslocados tienen múltiples funciones y capacidad de cooperar entre sí [Garmendia et al., 2005; Dean et al., 2005]. Map (Proteína asociada mitocondria) afecta a la estructura y función de las mitocondrias [Kenny et al., 2000], induce la formación de filopodios [Kenny et al., 2002], y es esencial para la disrupción de la barrera intestinal y la alteración de la estructura de unión entre células (TJ) [Dean et al., 2004]. EspF, otro efector multifuncional que también es dirigido a las mitocondrias para iniciar el proceso de muerte mitocondrial [Nougayrede et al., 2004], tiene un papel en la disrupción de la barrera intestinal [McNamara et al., 2001], la remodelación del borde en cepillo de las microvellosidades [Shaw et al., 2005], y la redistribución de las proteínas TJ [Paralta-Ramirez et al., 2008]. Además, EspF ha sido implicado en la muerte celular por apoptosis [Crane et al., 2001] y en la inhibición de la fagocitosis [Quitard et al., 2006]. EspG y su homólogo EspG2 Nle mostraron desencadenar la formación de la tensión de las fibras de actina y la destrucción de la red de microtúbulos por debajo de las bacterias adheridas [Shaw et al., 2005; Matsuzawa et al., 2004]. Más recientemente, se demostró que tanto EspG y EspG2, juegan un papel en la inhibición del transporte intestinal de cloruro en la membrana intestinal [Gill et al., 2007], y que activan la cisteína proteasa calpaína de la célula huésped durante la infección por EPEC, y que conducen a la necrosis célular [Dean et al., 2010]. El efector EspH se localiza en la membrana de la célula huésped y modula la estructura del citoesqueleto de actina [Tu et al., 2003]. EspH, Tir, y Map colaboran para organizar el montaje y desmontaje de los filopodios y pedestales de actina [Kenny et al., 2002]. EspB, es una proteína translocatora esencial para la distribución de los efectores, actúa como un modulador del citoesqueleto de la célula huésped [Tylor et al., 1998]. También participa en el borramiento de las microvellosidades y en la prevención de fagocitosis [Lizumi et al., 2007]. Los efectores no-LEE también tienen un papel en la virulencia de EPEC, aunque se conoce relativamente poco acerca de su función celular [Croxen et al., 2010]. Dado que las principales propiedades de virulencia de EPEC se han atribuido a los efectores de LEE, se propone que los efectores no-LEE actúan como factores accesorios para una infección eficiente [Dean et al., 2009]. En contraste con los efectores LEE que se conservan entre todos los agentes patógenos A/E, existe una variación considerable de proteínas efectoras entre las cepas no-LEE [Iguchi et al., 2009].

B.3.- Autotransportadores Las cepas EPEC también codifican las proteínas asociadas a la virulencia que son secretadas a través de un mecanismo de secreción de tipo V [Yen et al., 2008]. EspC es la proteína autotransportadora más estudiada en este patógeno. Cuenta con una proteasa de serina conservada similar a la de la proteasa de IgA y se ha demostrado que posee actividad enterotóxica [Mellies et al., 2001; Stein et al., 1996].

Recientemente, se ha demostrado que la internalización de EspC en la célula huésped también depende de T3SS, lo que sugiere la cooperación entre los dos sistemas de secreción [Vidal et al., 2008].

B.4.-Regulación La región LEE contiene 41 genes organizados en cinco grandes operones policistrónicos (LEE1 a LEE5) y numerosas unidades de transcripción menores que son reguladas positivamente por Ler, un regulador clave de la transcripción de la virulencia de EPEC codificado por el primer gen del operón LEE1 [Mellies et al., 2007171]. Ler regula la expresión génica por LEE al contrarrestar la represión impuesta por el regulador H-NS [Bustamante et al., 2001]. Por otra parte, en las cepas tEPEC, el plásmido EAF codifica un regulador PerC que también juega un papel en la regulación positiva de ler, vinculando la expresión de BFP con la expresión de LEE [Bustamante et al., 2001; Porte et al., 2004; Gomez-Eduardo et al., 1995]. Además, en EPEC y EHEC, Ler también regula factores, de virulencia codificados no-LEE por ejemplo, espC, nleA y lpf, por lo que se considera un regulador global de la virulencia de EPEC [Elliot et al 2000; Roe et al., 2007].

C.- Invasión Algunos estudios in vivo han demostrado la presencia de EPEC dentro de los enterocitos humanos [Polotsky et al., 1977, Pedroso 1993, Ulshen et al., 1980] y diferentes líneas celulares in vitro [Miliotis et al., 1989; Andrade et al., 1989]. Sin embargo a pesar de estas evidencias, la invasión no ha sido considerada como una característica patogénica de las cepas tEPEC in vivo, y las cepas de este patotipo han sido consideradas patógenos extracelulares [Nataro et al., 1998]. 1.1. 4- Diversidad de las propiedades de virulencia Las cepas tEPEC son en general más homogéneas en sus características de virulencia, expresadas en los genes de virulencia de LEE y del plásmido EAF [Trabulsi et al., 2002]. Por el contrario, además de los genes codificados en LEE, muchas cepas aEPEC son portadoras de genes que codifican para factores de virulencia de otros patotipos de E. coli (incluso de E. coli patógenas extra-intestinales) en diferentes combinaciones [Trabulsi et al., 2002; Abe et al., 2009; Gomes et al., 2004; Vieira et al., 2001], lo que refleja la heterogeneidad del grupo. Sin embargo, el papel de estos genes o combinaciones de genes diferentes en la patogénesis de aEPEC es desconocida. También se conoce que algunas cepas de tEPEC y EHEC pueden perder el pEAF o los fagos codificadores de stx durante la infección, respectivamente, generando cepas de E. coli desprovistas de estos genes, que serían diagnosticadas como cepas aEPEC [Levine et al., 1985; Bielaszewska et al., 2008].

1.1.5.- Reservorio y transmisión Hasta ahora, los estudios han demostrado que tEPEC rara vez se detectan en los animales y sus reservorios comprenden sólo los seres humanos [Trabulsi et al., 2002]. Muchos niños adquieren la infección en los hospitales públicos, generalmente por el contacto con otros pacientes hospitalizados con diarrea. Aunque no está completamente caracterizado, es evidente que tEPEC pueden ser transmitidas por la ingestión de alimentos y agua contaminados [Blake et al., 1993]. La sustitución de la lactancia materna por la alimentación con mamadera aumenta el riesgo de contraer diarrea [Blake et al., 1993]. En contraste, varios informes han descrito el aislamiento de cepas aEPEC de diferentes especies animales con o sin diarrea, como vacas, ovejas, cabras, cerdos y aves de corral, como así también en animales domésticos, venados y monos Tití [Hernandes et al., 2009]. Aunque no hay evidencia de transmisión directa de los animales a los humanos, algunas cepas aEPEC aisladas de animales pertenecen a los serogrupos implicados en enfermedades humanas como por ejemplo: O26, O103, O119, O128 y O142 [Hernandes et al., 2009]. Esto sugiere que estos animales podrían constituir un reservorio importante de aEPEC a partir de los cuales estas cepas podrían transmitirse a los seres humanos.

1.1.6.- Aspectos clínicos La diarrea por EPEC varía desde una infección subclínica a una infección fatal, probablemente en función de factores del huésped [Nataro et al, 1998]. Varios estudios han demostrado que las cepas tEPEC pueden inducir abundante diarrea secretora con moco pero sin sangre, con pérdidas importantes en las heces de líquidos y electrolitos. Se observan también vómitos y fiebre leve. Además, la infección por EPEC puede conducir a una severa mala absorción de nutrientes e incluso evolucionar a una intolerancia a los alimentos dando lugar al agravamiento de la desnutrición y la persistencia de la diarrea [Fagundes-Neto et al., 2000]. La dosis infectiva de EPEC necesaria para causar la enfermedad en los niños no ha sido establecida. Estudios en voluntarios indican que una alta dosis infectiva es necesaria para inducir diarrea (109 y 1010 bacterias), pero en los niños se presume que es mucho más baja [Nataro et al., 1998]. Voluntarios adultos que ingirieron grandes cantidades (109 a 1010) de EPEC presentaron períodos cortos de incubación (12 a 24 h) para desarrollar diarrea [Levine et al., 1978; Levin et al., 1985; Ferguson et al., 1952; June et al., 1953], pero el período de incubación en lactantes es desconocido [Thoren et al., 1983; Levine et al., 1984]. El examen de biopsias intestinales de niños infectados ha demostrado que EPEC se adhiere a la mucosa del intestino delgado y grueso [Tylor et al., 1986; Clausen et al., 1982]. La presencia de la lesión A/E parece estar asociada con la secreción de fluidos, y el desarreglo del sistema de enzimas digestivas de absorción, lo que conduce a la mala absorción de nutrientes. El edema, la infiltración de neutrófilos, y la reducción de la actividad enzimática en la mucosa intestinal han sido observados después de la infección por EPEC [Ulshen et al., 1980; Tylor et al., 1986; Boedeker et al., 1988].

1.1.7.- Respuesta inmune Se ha demostrado respuesta de anticuerpos contra el antígeno O de algunos serogrupos en voluntarios convalecientes de una infección experimental por EPEC y en niños mayores de 1 año de edad [Neter et al., 1955; Levine et al., 1985; Donnenberg et al., 1993]. Además, la mayoría de los factores de virulencia de EPEC, como las principales adhesinas (intimina, y BFP) y la proteínas de señalización celular, (EspA, EspB y Tir), mostraron inducir respuesta inmune en el suero (IgG e IgM), leche, calostro y saliva (IgAs) en humanos sanos y enfermos y en el calostro de bovinos [Silva et al., 1992; Palmeira et al., 2009]. En la leche materna, la IgA y otros factores mostraron contribuir a la inmunidad mediante el bloqueo de la adherencia bacteriana [Cravioto et al., 1991]. Una fuerte respuesta de anticuerpos en suero y saliva de los niños reactivos a factores de virulencia de EPEC fue desarrollada tempranamente presentando un repertorio de anticuerpos equivalente a la de un adulto en la misma zona geográfica [Carbonare et al., 2003]. En conjunto, estos hallazgos sugieren que la reducción en la frecuencia de tEPEC en niños mayores de 2 años de edad puede ser, por lo menos en parte, debido al desarrollo de anticuerpos antiEPEC.

1.1.8.- Diagnóstico En la actualidad, los ensayos moleculares son los métodos más apropiados para la identificación de EPEC. Estos métodos incluyen PCR y PCR múltiple, así como sondas genéticas para detectar pEAF (sonda EAF) [Nataro et al., 1985], bfpA (que codifica para la subunidad mayor de BFP), genes eae (u otros genes de LEE) y genes stx (que codifican para las toxinas Shiga) [Giron et al., 1993; Jerse et al., 1990; Muller et al., 2007; Aranda et al., 2007]. Las cepas EPEC han sido identificados por la presencia de la región LEE y la ausencia de los genes stx, la falta de stx distingue EPEC de STEC. Las cepas de tEPEC y aEPEC se diferencian principalmente por la presencia de la secuencia EAF y/o del gen bfpA en el primer grupo. A pesar de que todas las cepas de tEPEC llevan bfpA, algunas cepas aEPEC contienen un operón BFP defectuoso lo que resulta en reacciones positivas para este gen. Por esta razón, para diferenciar cepas atípicas de EPEC típicas, se recomienda la búsqueda de la expresión de BFP por métodos inmunológicos [Trabulsi et al., 2002; Abe et al., 2009; Nara et al., 2010]. Como las cepas aEPEC son muy heterogéneas y se pueden aislar con frecuencia en niños sin diarrea, es importante demostrar su capacidad potencial para promover lesiones A/E en las células epiteliales. Esto podría lograrse in vitro mediante la tinción fluorescente de actina descripta por Knutton et al. [Knutton et al., 1989]. Sin embargo, el uso de métodos para identificar la expresión BFP y la capacidad para promover lesiones A/E está hasta el momento limitado a los laboratorios de investigación.

1.1.9.- Tratamiento y profilaxis La terapia de rehidratación oral reduce notablemente la mortalidad temprana y es el tratamiento más eficaz contra las infecciones leves por EPEC. Sin embargo, se ha demostrado que los niños con infección por EPEC que no pueden responder a esta medida terapéutica, y que además presentan intolerancia a la leche de vaca, requieren hospitalización y desarrollan diarrea persistente [Fagundes-Neto et al., 2000]. Esto es probablemente debido a los daños causados en la mucosa intestinal, la cual puede requerir tiempo para recuperar plenamente sus funciones (digestión, absorción, y defensa) [Nataro et al., 1998]. La terapia con antibióticos sólo se recomienda para los casos más graves o en casos de diarrea persistente asociada con aEPEC [Ochoa et al., 2008; Senerwa et al., 1991]. Sin embargo, los patrones de susceptibilidad antimicrobiana de tEPEC y aEPEC varían entre las diferentes áreas geográficas estudiadas y la resistencia a los antibióticos son comunes en muchas áreas del mundo [Abe et al., 2009; Thoren et al., 1983; Senerwa et al., 1991; Gross et al., 1985]. En consecuencia, las pruebas de sensibilidad se deben realizar antes del establecimiento de la terapia. Como se mencionó la leche materna puede contener anticuerpos contra los antígenos O de EPEC y proteínas de membrana externa, los cuales inhibirían la adherencia de EPEC a las células de cultivo de tejidos. La lactancia materna tiene un efecto protector probablemente debido al efecto cooperativo de la IgA con la presencia de oligosacáridos [Cravioto et al., 1991], o por un efecto inhibidor directo de la lactoferrina [Boesman-Finkelstein et al., 1985]. Además de la lactancia materna, las medidas apropiadas de higiene y alimentación podrían prevenir la infección de los niños en los países en desarrollo [Sobel et al., 2004]. Las inmunización contra EPEC podrían ser otra probable estrategia de prevención, sin embargo actualme no hay disponible una vacuna con licencia para los seres humanos contra las infecciones por EPEC [Horne et al., 2002].

1.1.10.- Epidemiología e impacto en América Latina Durante muchas décadas, estudios realizados en todo el mundo han demostrado que los serotipos tEPEC están fuertemente asociados con diarrea en niños