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Trabajo práctico Módulo III Dermatomicosis

DERMATOFICIAS Diagnóstico micológico Para realizar un buen diagnóstico de las dermatofitosis es fundamental: 

Tomar adecuadamente la muestra.



Transportarla correctamente.



Procesarla en forma apropiada.



Disponer de personal experimentado para poder realizar una buena interpretación del examen directo.



Usar medios de cultivos adecuados.



Poder identificar el dermatofito a nivel de especie.

Indicaciones de preparación de los pacientes Los enfermos deben concurrir para la toma de muestra luego de haber cumplido con las siguientes indicaciones: 





Lesiones en piel lampiña: no deben colocar cremas, lociones, talco, ningún tipo de cosmético al menos desde 3 días previos a la realización del examen. Si se estuvieron colocando algún tipo de medicación antifúngica, ésta debe suspenderse una semana antes. En pliegues axilares no debe usar desodorante desde 3 días antes del examen. Lesiones en cuero cabelludo: Lavar la cabeza 2-3 días previos con champú común no medicamentoso, no utilizar ningún tipo de terapéutica local (crema, loción, etc). Si recibe tratamiento antifúngico por vía oral debe suspenderlo al menos 10 días antes. Lesiones en uñas: Lavar con agua y jabón diariamente y cepillar 1-2 veces al día las uñas los 3 días previos. Retirar el esmalte de uñas al menos 3 días antes. No usar cremas, pomadas, talco, lociones, desodorantes durante la semana previa y si la lesión se localiza en las uñas de los pies, el paciente debe concurrir con calzado cerrado, medias y sin talco en el calzado. Si recibe medicaciones antifúngicas orales debe suspenderlas 15-20 días antes del examen.

Toma de muestras

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La toma de muestra debe realizarse antes de que se instaure cualquier tratamiento. Las muestras de piel y pelos se obtienen después de la preparación correcta del paciente, según las indicaciones del laboratorio. Puede además realizarse la desinfección de la zona afectada con etanol 70 °. En las lesiones descamativas se realiza un raspado del borde la lesión usando una cureta de Brocq. En las tiñas de cuero de tipo microspórico se obtienen escamas de la placa y los pelos cortos con una pinza de depilar, en las del tipo tricofítico los pelos y en los querion de Celso se toman muestras de escamas, pelos y material supurativo. Las muestras de piel glabra deben tomarse de la zona de los bordes de la lesión donde ésta es más activa. En las uñas la toma depende del tipo y localización de la lesión. Se toma del lecho subungueal en las formas distal o lateral subungueal y en las onicolisis, en las forma blanco superficiales se raspa la tabla externa, en las endonix es necesario tomar de la parte profunda de la uña con una hoja de bisturí descartable, en las formas proximales debe obtenerse material de esa zona. Ocasionalmente, las uñas presentan más de una forma clínica y es necesario tomar muestra de los diferentes tipos de lesión. Las escamas, pelos o material de raspado se depositan luego en dos portaobjetos esterilizados o en cajas de Petri de vidrio pequeñas. Para la toma de muestra de animales también pueden emplearse trozos de alfombra estéril o cepillo de dientes estéril. 

Materiales necesarios Portaobjetos estériles (puede hacerse por flameado con mechero Bunsen) se preparan de a pares. Sindesmótomos de punta curva o recta Bisturí tipo Collins Mango de bisturí y hojas N° 15 de punta redonda Cureta de Brocq Tijeras Pinzas diente de ratón Pinza de depilar Hisopos Alcohol Cinta adhesiva transparente Hojas de papel blanco para envolver portas y anotar los datos del paciente y el número de identificación en el SIL

Transporte

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Siempre es preferible que las muestras sean tomadas por el profesional que va a procesarlas, pero en caso de derivación debe realizarse teniendo en cuenta las siguientes indicaciones. Las muestras recolectadas entre 2 portaobjetos se envuelven con papel blanco y se identifica al paciente, el número de ingreso interno (SIL), se debe informar cuál es el material. Nunca deben sellarse los vidrios con ningún tipo de cinta adhesiva. En el caso de cajas de Petri, se cierran con cinta adhesiva para que no se caigan las escamas; las placas se identifican perfectamente, de igual modo que en el caso de portaobjetos. En ambos casos deben colocarse en un contenedor rígido para que no se rompan y luego en bolsas de bioseguridad. Todas las muestras deben acompañarse de la identificación correspondiente. No es necesario refrigerarlas para el mantenimiento ni para el envío al laboratorio. Preparación de las escamas para examen directo  Reactivos necesarios Solución de hidróxido de potasio (KOH) al 40% (también puede usarse al 10-20%). Droga Cantidad KOH lentejas 40 g Agua destilada 100 ml Colocar el agua en un recipiente de vidrio y agregar las lentejas de KOH, mezclar y dejar hasta disolución total. La solución preparada dura varios meses. Colocar una parte en un frasco gotero. Variantes 1. Con el agregado de glicerina 10% se obtienen preparaciones más duraderas 2. Mezclar en partes iguales la solución de KOH con tinta Quink® (Parker) azulnegro permanente (debe decir permanente en el frasco o cartucho). Esta modificación mejora la visualización de dermatofitos y permite la observación de elementos de Malassezia En la actualidad es muy difícil de conseguir en nuestro medio. 3. Mezcla de KOH con blanco de calcoflúor Preparación del blanco de calcoflúor con KOH Droga Calcofluor White MR2 Agua destilada

Cantidad 100 mg 100 ml

Calentar suavemente hasta disolución. Guardar en frasco color caramelo

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Para usar se mezclan partes iguales de KOH (10-40%) con solución de calcoflúor. Requiere microscopio de fluorescencia con rango UV (300-440 nm- lámpara de mercurio). 4. KOH con dimetilsulfóxido (DMSO) Droga KOH lentejas Agua destilada DMSO 40%

Cantidad 20 g 100 ml 100 ml

Se conserva a temperatura ambiente en frasco color caramelo. Cuando se utiliza este reactivo, los preparados no deben calentarse. Control de calidad: Colocar una gota del reactivo entre porta y cubreobjetos y observar al microscopio con objetivo de 40X. No deben aparecer hifas, esporas de hongos, levaduras ni bacterias. Procesamiento de las escamas 1. Examen directo 

   

Una porción de las escamas o pelos obtenidos se colocan sobre un portaobjetos estéril con la ayuda de un sindesmótomo. El portaobjetos debe contener la identificación de la muestra Sobre un cubreobjetos se coloca una gota de KOH o sus variantes y se cubre el material con este cubre. Se calienta suavemente hasta que comience a desprender burbujas. Si la preparación contiene DMSO, no se calienta y se deja reposar. Aplastar suavemente el material con ayuda de un papel absorbente. El material está listo para ser observado microscópicamente con óptica seca (objetivo de 10-20-40X).

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EXAMEN DIRECTO DIGESTION CON KOH

escamas

+ KOH 20-40% con o sin tinta indeleble

• Calentar suavemente o dejar reposar • Observar al microscopio óptico (100X, 400X)

2. Cultivos El resto de las escamas se siembran en 2-3 tubos con los medios de cultivo que favorecen el desarrollo de dermatofitos. La siembra se hace con gancho que se esteriliza a la llama y se enfría en el fondo del tubo de cultivo, de manera que algo del medio quede adherido al gancho. Se toman las escamas y se siembran en 3-4 puntos haciendo pequeñas incisiones en el medio a 1 cm de distancia una de la otra. Los cultivos se incuban a temperatura ambiente (25-28 °C) durante 2 semanas. En caso de sospechar que el agente causal es Trichophyton verrucosum se colocan además 2 tubos a 37 °C. Medios de cultivo  Sabouraud glucosado al 2% (modificado por Emmons) o Sabouraud miel Ingredientes Peptona Glucosa Agar Agua desionizada

Cantidad 10 g 20 g 18 g 1000 ml

Preparación  Colocar en un Erlenmeyer el agua y los distintos ingredientes, mezclar bien y hervir hasta disolución completa.  Esterilizar a 121 °C durante 15 min.

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

Añadir cloranfenicol (50 mg/l) antes de esterilizar u otra mezcla antibiótica después de autoclavar.  Distribuir en tubos de ensayo estériles, colocando 7 ml de medio por tubo y solidificar en posición inclinada (pico de flauta). También puede dispensarse en los tubos y luego esterilizar el medio ya fraccionado.  Variante: Para estabilizar el pH de este medio puede agregarse 5 g de carbonato de calcio (CaCO3) que no se disuelve y queda en el fondo como un botón blanco.  El agar miel de Sabouraud se prepara de la misma manera pero se reemplazan la glucosa por 40 g de miel y agregando 5 g de extracto de levadura. Control de calidad  Aspecto: color ambar, transparente, medio sólido  pH final: 7,0 ± 0,2  Trichophyton mentagrophytes: crece  Staphylococcus epidermidis: inhibición parcial o total en el medio con cloranfenicol  Medio de Sabouraud con cicloheximida y cloranfenicol Este medio puede obtenerse comercialmente (Mycosel, Mycobiotic, etc.) en polvo o preparado (Difco , Oxoid, bioMérieux, Remel, Sigma, Biomedics, Becton Dickinson, Bio-Rad). Esto evita la manipulación de la cicloheximida. Se utiliza para aislamiento de dermatofitos y también de otros hongos patógenos de muestras contaminadas con hongos saprófitos y bacterias. Como inhibe el desarrollo de algunos hongos que pueden ser potencialmente patógenos, es necesario siempre efectuar la siembra además en otros medios sin cicloheximida. Se prepara de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Control de calidad Aspecto: medio sólido, amarillento translúcido Trichophyton mentagrophytes: Crece Aspergillus flavus: inhibición parcial o total Staphylococcus epidermidis: inhibición parcial o completa 



Medio DTM (Dermatophyte test medium) Este es un medio que permite aislar dermatofitos de materiales muy contaminados ya que contiene rojo de fenol como indicador, cicloheximida como inhibidor del desarrollo de hongos saprófitos y mezcla antibiótica( gentamicina y clortetraciclina). Cuando el dermatofito crece alcaliniza el medio que vira del amarillo al rojo. Puede inhibir el desarrollo de hongos filamentosos no dermatofitos. Puede conseguirse comercialmente. Control de calidad Trichophyton verrucosum: crece y alcaliniza Aspergillus flavus: inhibición parcial o completa Medio lactrimel (Borelli)

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En este medio los dermatofitos desarrollan y fructifican muy bien, el pigmento difusible de T. rubrum siempre se evidencia. Ingredientes Harina de trigo Leche descremada Miel de abejas Agar Agua destilada c.s.p.

Cantidad 10 g 200 ml 40 ml 18 g 1000 ml

Preparación Incorporar los ingredientes en el agua y disolver calentando hasta ebullición. Luego autoclavar a 121 °C 15 min, fraccionar en tublos con 7 ml y enfriar en posición inclinada. Añadir mezcla antibiótica (100 mg/l), si se utiliza cloranfenicol puede agregarse antes de autoclavar. Este medio no requiere ajuste de pH. Control de calidad  Medio sólido, color ámbar ligeramente grumoso, opaco.  Trichophyton mentagrophytes: Crece  Staphylococcus epidermidis: inhibición parcial o completa. Medios para estudio de requerimientos nutricionales para identificación de especies de Trichophyton 1. Medio base (Agar Trichophyton N° 1) Componentes Hidrolizado de caseína (libre de vitaminas) Glucosa KH2PO4 MgSO4.7H2O Agar Agua desionizada

2. Agar Trichophyton N° 2  Agar Trichophyton N° 1  Inositol ……………….. 50 mg 3. Agar Trichophyton N° 3  Agar Trichophyton N° 1  Inositol……………….. 50 mg

Cantidad 2,5 g 40 g 1,8 g 0,1 g 20 g 1000 ml

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

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Tiamina.HCl……….. 0,2 mg

4. Agar Trichophyton N° 4  Agar Trichophyton N° 1  Tiamina. HCl………. 0,2 mg 5. Agar Trichophyton N° 5  Agar Trichophyton N° 1  Ácido nicotínico (Niacina)…. 10.0 mg 6. Agar Trichophyton N° 6 Ingredientes NH4NO3 Glucosa KH2PO4 Mg SO4.7H2O Agar Agua desionizada

Cantidad 1,5 g 40 g 1,8 g 0,1 g 15 g 1000 ml

7. Agar Trichophyton N° 7  Agar Trichophyton N° 6  Histidina.HCl…………. 30 mg Preparación de Agar Trichophyton 1 a 7  Mezclar todos los ingredientes y hervir hasta disolución completa  Dispensar en tubos  Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 min  Enfriar en posición inclinada Control de calidad Aspecto: Color ambar, transparente pH final a 25 °C 6,8 ± 0,2 Estos 7 medios se utilizan para la identificación de especies de Trichophyton basándose en los requerimientos nutricionales. Se valora el crecimiento desde 0 a 4  0 = No crecimiento  1 = escaso crecimiento  2-3 = parcialmente estimulado pero inferior al control  4 = crecimiento comparable con el control.

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Medio de agar urea de Christensen Este medio se utiliza en la identificación de algunos dermatofitos, en especial para diferenciar Trichophyton rubrum de Trichophyton mentagrophytes Ingredientes medio base Peptona Glucosa NaCl KH2PO4 Rojo de fenol Agar Agua desionizada

Cantidad 1g 1g 5g 2g 12 mg 20 g 900 ml

Solución de urea: Se prepara solución 20% de urea en agua destilada y se esteriliza por filtración. Preparación  Se añaden todos los componentes del medio base a los 900 ml de agua, se calienta hasta disolución total  Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 min  Enfriar a 50 °C y agregar 100 ml de la solución de urea  Dispensar en tubos de hemólisis estériles y solidificar en posición inclinada Control de calidad Aspecto: color amarillo-naranja, transparente pH final: 6,8 ± 0,2 T. mentagrophytes: ureasa + (vira el medio al rojo) T. rubrum: ureasa – (permanece amarillo-naranja) Medio de arroz Es útil para diferenciar aislamientos atípicos de M. audouinii y M. canis Ingredientes Cantidad Arroz blanco no enriquecido 8g Agua desionizada 25 ml Preparación Mezclar el arroz y el agua en un Erlenmeyer o en un tubo de 3 cm de diámetro Autoclavar a 121 °C durante 15 min Control de calidad Aspecto: granos de arroz cocido M. canis: presenta buen crecimiento, pigmento amarillo y esporulación abundante M. audouinii: no crece o presenta escaso crecimiento, color pardusco

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La siembra se realiza transfiriendo una pequeña porción del aislamiento al frasco con arroz. Producción de órganos perforadores Se utiliza principalmente para diferenciar T. rubrum de T. interdigitale Preparación Se colocan pelos de 1 cm de longitud de niños (prepúberes) en una placa de Petri y se esterilizan por autoclavado (121 °C, 10 min). Se agregan 25 ml de agua destilada estéril y 2 a 3 gotas de extracto de levadura al 10 % estéril. Se inoculan las placas con un pequeño fragmento del cultivo en medio de Sabouraud del dermatofito a identificar. Examinar la presencia de perforaciones en el pelo a intervalos de 4 semanas tomando cabellos aislados de las placas y observándolos microscópicamente con una gota de azul de lactofenol, entibiado ligeramente, entre porta y cubreobjetos. El examen con KOH permite visualizar los órganos perforadores. Técnica del anzuelo de queratina para aislar dermatofitos del suelo Tomar muestras de tierra (especialmente en zonas ricas en queratina)en recipientes estériles con la ayuda de una cuchara esterilizada. Colocar la tierra en una placa de Petri, humedecer con agua destilada estéril y añadir pelos cortados y autoclavados de caballo o de niños que servirán como anzuelo y se colonizarán con dermatofitos y otros hongos queratinofílicos. Se recomienda agregar solución de cicloheximida (0,5 mg/ml) y antibióticos antibacterianos (10.000 U penicilina y 1 mg de estreptomicina/ml). Aspectos fisiológicos de los dermatofitos y hábitat Especie T. ajelloi T. concentricum T. equinum T. interdigitale

Ureasa

Perf. pelo

+

+

-

-

Crece T-1 T-2 T-3 37 °C Género Trichophyton V + + + +

++

T-4

T-5 T-6 T-7

Hábital

+

+

+

+

Geo

+

+

-

d

Antro

++

++

Zoo Antro

-

-

++

++

++

+ ++

+

+

+

++

T. mentagrophytes

+

V

-

++

++

++

++

++

++

++

Zoo

T. rubrum T. schoenleinii T. tonsurans

-,v v v

-

+ + +

++ + +(-)

++ + +(-)

++ + +(-)

++ + +

+,+ v

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Antro Antro Antro

T. verrucosum

-

-

++

-

d

++

++ ++ +(-) + algu

-

-

-

Zoo

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T. erinacei T. violaceum

+.d -.+

+.-

Trabajo práctico Módulo III Dermatomicosis nas ++ ++

++ ++ ++ ++ + d + + Género Epidermophyton E. floccosum d -.+ + + + + + Género Microsporum M. audouinii v + + + + M. canis +.w + ++ ++ ++ ++ M. cookei + + + + + + M. fulvum + + + + + + M. gypseum + + + + + + M. nanum + + + + + + V = variable; d = débil; muy importante para su identificación.

++ +

++ +

++ +

Zoo Antro

+

d

d

Antro

+ ++ + + + ++

+ ++ + + + +

+ ++ + + + +

Antro Zoo Geo Geo Geo Zoo

Teleomorfos de las especies de dermatofitos Anamorfo

Teleomorfo

E. floccosum Desconocido M. audouinii Desconocido M. canis Arthroderma otae M. cookei Arthroderma cajetani M. fulvum Arthroderma fulva M. gypseum Arthroderma gypseum/A.incurvatum M. nanum Arthorderma obtusum T. ajelloi Arthroderma uncinata T. concentricum Desconocido T. equinum Desconocido T. interdigitale Arthroderma vanbreuseghemii T. mentagrophytes Desconocido T. rubrum Desconocido T. schoenleinii Desconocido T. tonsurans Desconocido T. verrucosum Desconocido T. violaceum Desconocido T. erinacei Arthroderma benhamiae En la actualidad, se ha demostrado que los géneros tradicionales no son monofiléticos. Se han reconocido nuevas especies y además la biología molecular ha demostrado que algunos biotipos considerados por su morfología y tipo de infección como verdaderas especies, en realidad no lo son. Así el complejo T. rubrum incluye también a T. violaceum y Trichophyton raubitschekii sería la misma especie, al igual que T. soudanense.

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El complejo A. vanbreuseghemii se asociaría con 3 anamorfos: T. tonsurans, T. equinum y T. interdigitale. Cepas zoofílicas de T. interdigitale son indistinguibles de las de las antiguas variedades de T. mentagrophytes var. granulosum y T. mentagrophytes var. mentagrophytes.(1) (1) Guarro J. Taxonomía y biología de los hongos causantes de infección en humanos. Enferm Infecc Microbiol Clin 2011.