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Volumen 11 - N" 64 Ago sto/septiembre 2001

La metodología de estudio del ADN antiguo es similar a la utilizada con el material fresco. Primero . se aplica la técn ica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que permite amplificar el material , o sea preparar numerosas copias de un determinado fragmento de ADN (véase 'La rC;"lcciólI en cadena eJe la poli merasa : ~ I mefodo y sus aplicaciones', Ciencia Hoy, 23 :52-59 , 1993). Es decir que aunque la cantidad inicial de ADN sea muy escasa , luego de la reacción de PCR se dispondrá de material suficiente como para proceder a su secuenciación, o sea la determinación del orden en que se encuentran ubicadas las bases nitrogenadas, responsables de la información genética que reside en el ADN (véase el recuadro 'De l . ;leido " " ,', I,- i' ," " 1" prol"i l1," en Ciencia Hoy, 62:40, 2001) . La secuenciación se realiza de forma automática, en va rias etapas. Un método consiste en volver a amplificar el ADN por medio de una reacción de PCR especial, la cual permite la obtención de fragmentos fluorescentes , de distintos tamaños, los que son luego separados por eleclroforesis -los fragmentos migran en un gel al que se aplica un campo eléctrico; la velocidad de migración dependerá del tamaño del fra gmento-o Durante este proceso un lector láser detecta la emisión fluorescente de cada fragm ento la cual, a su vez, depende de la última base nitrogenada que se incorporó en cada uno de ellos en la reacción de PCR; es decir que de acuerdo con la fluorescencia emitida se identifica la base . Finalmente, esta informa ción es transmitida a una computadora que transforma los datos. obtenidos en la secuencia del fragmento . Las secuencias de ADN de distintos individuos pertenecientes a la misma o diferentes especies se compa ran mediante programas de computación que permiten detectar sitios de secuencias homólogas o equiva lentes, lo cual permite elaborar los árboles filogenélicos o cladogramas. Estos diagramas expresan las relaciones de parentesco entre las unidades evolutivas analizadas (véase 'Cladismo y diversidad biológi9a ', Ciencia Hoy, 21: 26-34, 1992).

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Recordemo s que en el ADN las bases nitrogenadas están enfrentadas -apareadas-, por lo que la long itud de una molécula se expresa como mimero de pares de bases (pb) . Cuando se estudia material fresco se logra amplificar fragmentos de miles de pb de largo. En cambio, en tejidos antiguos los fragmentos por lo general no exceden los 200pb, debido a la degradación del ADN que ocurre después de la muerte del organismo. El estud io de este ADN resulta entonces mucho más laborio so que el del fresco, ya que se deben amplificar numerosos frag mentos de corta longitud que aba rqu en, en lo posible , porciones de ADN superpuestas. De este modo, se obtienen secuencias de corta longitud que constituyen algo así como las piezas de un rompecabezas. Estas secuencias se superponen unas con otras analizando sus extremos coinciden tes, de manera tal de recomponer una secuencia de ADN más larga . En el ADN antiguo suelen ocurrir daños que se van acumulando con el transcurso del tiempo. Ciertas reacciones de oxidación causan modificaciones en las bases nitrog enadas o pérdidas de las mismas, que provocan enlaces anóma los y roturas en la cadena de ADN . En consecuencia la molécula de ADN se degrada, alterándose la información ' genética . Por ejemplo, las bases nitrogenadas denominadas pirimidinas -como la citosina y la timina- se oxidan con facilidad, por lo que en material arqueológico se observan abundantes pirimidinas modificadas. Las purinas adenina y guanina- también se oxidan , y así se produce 8-hidroxiguanina , de tal forma que en la reacción de PCR no se reconocerán correctamente dichas bases modificadas y se interrumpirá la reacción. La mayor dificultad que enfrenta el investigador que analiza el ADN antiguo es la posible conta minación de la muestra problema con el ADN de hongos, bacterias, parásitos e inclusive de célu las de la piel de los investigadores o cu radores que hayan manipulado el material , o de restos de ADN de otros experimentos rea lizados en el mismo laboratorio. Para evitar este problema se deben llevar a cabo procedimientos estrictos con respecto a la sel.acción y preparación del material de estudio, la elección de , los 'cebadores' a u(¡lizar en la técnica de PCR , y la s condiciones de esterilidad del laboratorio donde se realizará el análisis. Il l lp:ll\~'ww .cicllcin-Iloy .rclin¡l .nrnloy64/adn

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De acuerdo con el investigador norteamericano Jeremy Austin, los requerimientos esenciales para demostrar la autenticidad del ADN antiguo son los siguientes: Seleccionar ejemplares y muestras de estudio en los que se observe una buena preseNación de las células y sus biomoléculas (véase el recuadro 'Co~n (:i!;llte s Jje rq~rnizªciQ!l') .

Seguir procedimientos de laboratorio estrictos que minimicen la contaminación . Reproducir el experimento, es decir, obtener el ADN supuestamente antiguo, a partir de distintas extracciones y distintos tejidos de un mismo ejemplar, de diferentes especímenes, y en última instancia, en laboratorios independientes. Realizar la comparación -u homologacióf}- de la secuencia obtenida con el universo de secuencias conocidas disponibles en las bases de datos - por ejemplo el GeneBankmediante procedimientos informáticos adecuados. Estas secuencias deberán ser analizadas en un contexto filogenético , es decir, juntamente con sllcuencias de otras especies, vivientes o extinguidas,' del mismo grupo taxonómico .

A principios de la década del ochenta, los biÓlogos ya tenían conocimiento de que en tejidos muertos -pieles de animales, huesos y c~erpos momificado5-, podían encontrarse macromoléculas proleicas e incluso ADN bien preseNado. Sin embargo, las lécnicas utilizadas para extraer dichas moléculas y para secuenciar el ADN no habian sido exitosas. El primer trabajo donde se demostró que era posible secuenciar ADN antiguo fue publicado en 1984 por los investigadores norteamericanos Russell Higuchi y Allan Wilson, de la Universidad de California, Berkeley. Ellos extrajeron ADN de músculo seco y piel de un ejemplar de cuagga (Equus quagga) , especie de équido que vivió en África del Sur y se extinguió hace aproximadamente 140 años. El material estudiado estaba guardado en el Museo de Historia Natural de Mainz, Alemania , y pertenecía a un animal -el último sobreviviente de la especiemuerto en el zoológico de Amslerdam en 1883. Los invesligadores de Berkeley log raron exlraer / ADN de sus tejidos , en una proporción 100 veces menor que la que se podía oblener a par1ir de tejidos vivos y secuenciaron un segmento corto, de 115- pares de bases. Al comparar esla secuencia con otra perteneciente a una cebra, descubrieron que presentaban muy pocas diferencias, demostrando asi la estrecha relación filogenética enlre ambas especies. En su trabajo de 1984, publicado en Nature, Higuchi y Wilson anticiparon que la confirmación de que el ADN podía sobrevivir por largos períodos de tiempo , tendría un gran impacto en la paleontología, la biología evolutiva, ' la arqueología y la medicina forense, beneficia ndo el desarrollo de estas disciplinas. Un año después de la publicación mencionada, Svante Piiiibo , de la Universidad de Munich, logró extraer ADN a partir de células de la piel de momias egipcias de más de 2000 años de antigüedad . En investigaciones previas, realizadas en la Universidad de Uppsala, el especiaJista ya había comprobado que era posible extraer ADN a partir de tejidos momificados. Para realizar el trabajo publicado en 1985, S. Piiiibo revisó 110 momias deposifad as en el Mu seo de la Universidad de Uppsala y en el Museo Estatal de Berlín, entre las cuales seleccionó las 23 que se hallaban mejor conseNadas. Solo pudo extraer ADN de dos momias, en una proporción de 20 microgramas por gramo de tejido seco . De este modo Piiiibo se convirtió en el pionero de los estudios de ADN en humanos. Gracias al advenimiento de la técnica de PCR, en 1986, se produjo un espectacular avance en el estudio de muestras arqueológicas. Otros grupos de especialistas, además de aquellos liderados por Piiiibo, analizaron material momificado de hasta 7500 años de edad, de donde se obtuvo información sobre un tipo particular de secuencias de ADN repetidas -o microsatélites-, secuencias de genes de hislocompalibilidad y. principalmente de genes milocondriales. Posteriormente S. Piiiibo se asoció con olros grupos de invesligadores, produciendo Irabajos pioneros que siNieron de modelo para los estudios de ADN antiguo en diversas especies de animales y plantas. A mediados de la década del noventa se había n secuenciado fragmentos de ADN de varias especies e.xtinguidas de vertebrados, entre ellos el lobo marsupial o tilacino, de una antigüedad de 120 años; el tigre diente de sable o Smilodon, de 14.000 años; el mamut lanudo de Siberia, de Illlp://www . CiCI1Cill~ lJ() y .rctilm.urI110y64/uch ll ,hllll

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40 .000 años; y las moas de Nueva Zelanda, de aproximadamente 3300 años. Además, se extrajo ADN de la hoja de una magnolia de 17 millones de años (Ma) y de varias especies de insectos fósi les preservados en ámbar. Entre estas últimas merecen ser citadas la abeja sin aguijón Proplebeia ' dominicana y la termite Maslolennes eleclrodominiclls del ámbar de la República Dominicana de 45·25 millones de años , así como el gorgojo Libanorhinlls succinus del ámbar del Líbano, datado en 135·120 mil lones de años. En la tabla 1 se muestra una lista de grupos taxonómicos en los cuales fue posible obtener ADN antiguo, con su datación en miles o en millones de años, así como los datos de su publicación. Comenta remos a continuación algunos dé estos ejemplos. Antip:il