GUIA DE LABORATORIO - BIOQUIMICA - AÑO 2010 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE

LABORATORIO Nº 1 AMINOACIDOS – PROTEINAS Los aminoácidos son compuestos orgánicos con un grupo ácido, carboxilo (-COOH) y un grupo básico, amina (-NH2), unido al carbono α (carbono inmediato al carboxilo), es decir son α aminoácidos. Además presentan actividad óptica, siendo los de configuración “L” los de mayor interés bioquímico. Los aminoácidos pueden establecer enlaces covalentes entre el grupo carboxilo de uno y el nitrógeno del grupo α - amina de otro. Esta unión se denomina “unión peptídica”, es de tipo amida y se produce con pérdida de agua. Los polímeros formados por más de diez aminoácidos unidos por uniones peptídicas se llaman polipéptidos o proteínas. Las proteínas son macromoléculas formadas por un gran número de aminoácidos. Poseen una estructura muy compleja, por lo que conviene describirla en distintos niveles de organización: - Estructura Primaria: es la secuencia de aminoácidos, se refiere al número e identidad de los aminoácidos que componen la molécula y al ordenamiento de estas unidades en la cadena polipeptídica. Las cadenas son lineales, no poseen ramificaciones por la naturaleza de la unión peptídica. - Estructura Secundaria: es la disposición espacial regular, repetitiva que adopta la cadena polipeptídica. Pueden formar a su vez una α - hélice o una β - lámina plegada, o bien disponer la cadena polipeptídica en una estructura irregular, en tal caso se habla de una disposición al azar. Estas estructuras se mantienen unidas por puentes de hidrógeno. - Estructura Terciaria: se refiere a la arquitectura tridimensional completa de la proteína. De acuerdo con la forma final se clasifica a las proteínas en globulares y fibrosas. Estas conformaciones se mantienen unidas por fuerzas de atracción o repulsión electrostática, enlaces de hidrógeno, presencia de cadenas hidrofóbicas e hidrofílicas, y puentes disulfuro. - Estructura Cuaternaria: es la disposición espacial de las subunidades polipeptídicas constituyentes de las proteínas formadas por más de una cadena polipeptídica (proteínas oligoméricas). Las fuerzas responsables de mantener en posición a las diferentes subunidades son las mismas que en caso anterior. La secuencia de aminoácidos de una proteína es el principal determinante de su conformación, propiedades y características funcionales. Los requerimientos estructurales para que una proteína cumpla su papel fisiológico son muy rigurosos, no solo es necesario mantener el número y tipo de aminoácidos constituyentes, además cada uno de ellos debe ocupar una posición definida en la cadena. Alteraciones en ese ordenamiento o sustituciones de aminoácidos pueden afectar la capacidad funcional de la molécula hasta tornarla inútil. Cuando las proteínas son sometidas a la acción de agentes físicos como calor, radiaciones, etc., o agentes químicos como ácidos o álcalis fuertes, pueden sufrir alteraciones en su conformación al modificarse las fuerzas que mantienen unidas las estructuras. Esta desorganización de la estructura resulta en la pérdida de las propiedades naturales y funcionalidad de la proteína. El proceso se denomina desnaturalización, se pierden las estructuras cuaternaria, terciaria y secundaria de la proteína. La estructura primaria no se ve afectada ya que los agentes desnaturalizantes no atacan la unión peptídica. 1

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Trabajo Práctico: 1) PÉPTIDOS Y PROTEÍNAS

Reacción del Biuret Los péptidos forman complejos de coordinación con el ión cúprico (Cu++). Cada Cu++ se liga a la cadena polipeptídica por 4 valencias de coordinación aportadas por pares electrónicos libres de átomos de nitrógeno. Los iones Cu++ reaccionan con N de las uniones peptídicas (color rojo) y N de grupos amino libres (color azul) lo que da por resultado un color violáceo. Esta reacción es muy utilizada para cuantificar proteínas en fluidos biológicos (orina, sangre, líquido cefalorraquídeo, etc.), ya que el complejo color formado posee un máximo de absorción a 540 nm, cuya intensidad es proporcional a la concentración de proteínas totales en la muestra.

O C

C O

HN

NH

R CH

HC R Cu2+

O C

C O

HN

NH

R CH

HC R

Materiales: - Tubos de ensayos - Pipetas Reactivos: - Reactivo EDTA/Cu: complejo EDTA/Cu 13 mmol/l en NaOH 875 mmol/l y alquil aril polieter (AAP) - Muestra: suero Procedimiento: Tubo 1: colocar 50 µl de agua destilada + 3,5 ml del reactivo EDTA/Cu. Tubo 2: colocar 50 µl de suero + 3,5 ml del reactivo EDTA/Cu. Tubo 3: colocar 50 µl de suero diluido al medio con solución fisiológica + 3,5 ml del reactivo EDTA/Cu. Mezclar por agitación e incubar durante 15 minutos a 37 °C en baño María. Observar los colores producidos en cada tubo y las intensidades. Resultado: -

Tubo 1: coloración azul del reactivo EDTA/Cu. Tubo 2: coloración violeta intenso del complejo proteína – Cu. Tubo 3: coloración violeta pálido del complejo proteína – Cu.

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Desnaturalización y coagulación: Es la ruptura de las estructuras 2ª, 3ª y 4ª, conservándose las estructuras primarias, cambiando las propiedades de la proteína nativa. Experimentalmente se comprobó que ciertas proteínas frente a un desnaturalizante mantenía solo su estructura 1ª, perdiendo sus propiedades, y al retirarle el agente desnaturalizante recuperaba sus estructuras 2ª,3ª y 4ª. Se deduce que el control genético de la síntesis de proteínas se reduce a la estructura 1ª y las restantes son consecuencia de la primera. Las proteínas desnaturalizadas (ej. la clara de huevo calentada) son menos solubles y precipitan, pierden su capacidad de cristalizar, tienen mayor reactividad química y son más fácilmente atacadas por enzimas. Son agentes desnaturalizantes: el calor, la agitación mecánica, los ácidos y bases minerales fuertes, detergentes iónicos, agentes caotropicos (urea, guanidina), solventes orgánicos, sales, metales pesados, etc.

Procedimiento para la precipitación por calor: En un tubo de ensayo se coloca 3 ml de solución proteica y en otro tubo la misma cantidad de orina previamente centrifugada, calentar los tubos flameándolos en mechero o en baño maría entre 56º a 78º C. Resultado: Se observa la precipitación de grumos blancos en el tubo con la solución proteica, pero no en el que contiene orina (en la que no debe haber proteínas).

Reacción de Rivalta: Es una técnica para la diferenciación grosera entre líquidos patológicos colectados en cavidades del organismo (peritoneal, pleural, etc.). Cuando ellos contienen una concentración de proteínas inferior al 3% se denominan TRASUDADO, y se considera que son consecuencia de un desequilibrio físico entre los líquidos del organismo (por ej. Ascitis o colecta liquida entre las hojas del peritoneo a consecuencia de trastornos circulatorios o hipoproteinemias). Si la cantidad de proteínas es mayor, se deduce que la acumulación de líquidos se origina en un proceso infeccioso con participación de microorganismos patógenos en la cavidad (por ej. Peritonitis infecciosa o inflamación de peritoneo); y la acumulación de solutos en el lugar es la que genera la presión osmótica que atrae el agua. El líquido producto de este fenómeno se denomina EXUDADO. Procedimiento: Colocar en una probeta 200 ml de agua destilada más 3 gotas de ácido acético puro. Dejar caer gota a gota con pipeta Pasteur el líquido problema. Resultado: Será positivo (exudado) si la gota al caer forma un enturbiamiento lechoso (como humo de cigarrillo) al producirse la coagulación de las proteínas.

Prueba de Heller: Se trata de otra prueba para la detección de proteínas en orina por acción del ácido nítrico. Es una prueba específica e importante por su facilidad de realización.

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Procedimiento: Colocar 4 ml de orina en un tubo, darle una inclinación de 45º y agregar lentamente por las paredes 1 ml de ácido nítrico concentrado. Resultado: Es positivo cuando existen proteínas (en condiciones patológicas) dando un anillo en la zona de separación de los líquidos. ENZIMAS OBJETIVOS: Poner de manifiesto la presencia de la enzima catalasa en tejidos animales y vegetales. Comprobar la acción de la temperatura sobre la actividad de las enzimas. Comprobar la acción hidrolítica de la amilasa. Materiales: -gradilla -tubos de ensayo -mechero -pipetas -agua oxigenada -solución de lugol -soluciones de Fehling -baño maría -hígado -almidón

RECONOCIMIENTO DE LA CATALASA: La catalasa es una enzima que se encuentra en las células de los tejidos animales y vegetales. La función de esta enzima en los tejidos es necesaria porque durante el metabolismo celular, se forma una molécula tóxica que es el peróxido de hidrógeno, H2O2 (agua oxigenada). Esta enzima, la catalasa, lo descompone en agua y oxígeno, por lo que se soluciona el problema. La reacción de la catalasa sobre el H2O2, es la siguiente:

Reacción A La existencia de catalasa en los tejidos animales, se aprovecha para utilizar el agua oxigenada como desinfectante cuando se echa sobre una herida. Como muchas de las bacterias patógenas son anaerobias (no pueden vivir con oxígeno), mueren con el desprendimiento de oxígeno que se produce cuando la catalasa de los tejidos actúa sobre el agua oxigenada.

En esta primera experiencia vamos a demostrar su existencia. Colocar en un tubo de ensayo unos trocitos de hígado. Añadir 5 ml de agua oxigenada. Se observará un intenso burbujeo debido al desprendimiento de oxígeno. Figura 1 (Observa la reacción A)

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En esta fotografía puede verse el resultado de la reacción. Se debe repetir esta experiencia con muestras de distintos tejidos animales y vegetales. Puede ser interesante ir observando la mayor o menor actividad, según el tejido con el que se realice la experiencia Foto1

DESNATURALIZACION DE LA CATALASA: Mediante esta experiencia, vamos a ver una propiedad fundamental de proteínas, que es la desnaturalización. Ya que la catalasa químicamente es una proteína, podemos desnaturalizarla al someterla a altas temperaturas. Al perder la estructura terciaria, perderá también la función y como consecuencia su función catalítica, por lo que no podrá descomponer el agua oxigenada y no se observará ningún tipo de reacción cuando hagamos la experiencia anterior con muestras de tejidos hervidos. Colocar en un tubo de ensayo varios trocitos de hígado. Añadir agua para hervir la muestra. Hervir durante unos minutos. Después de este tiempo, retirar el agua sobrante. Añadir el agua oxigenada. Observar el resultado. Figura 2

HIDRÓLISIS DEL ALMIDON: Mediante esta experiencia, vamos a ver la actividad de otra enzima, la amilasa o ptialina, presente en la saliva. Esta enzima actúa sobre el polisacárido almidón, hidrolizando el enlace Oglicosídico, por lo que el almidón se terminará por transformar en unidades de glucosa. Procedimiento: Poner en una gradilla cuatro tubos de ensayo, numerados del 1 al 4. Añadir en cada tubo 5 mililitros de una solución diluida de almidón. A los tubos 3 y 4 añadir una pequeña cantidad de saliva. Para ayudarte y formar más saliva, piensa en un limón o en algo que te guste comer... Así favorece que formes más saliva. En el tubo 1, haz la Reacción de Fehling. Figura 4 En el tubo 2, realiza la Reacción de Lugol. Figura 5 Los resultados son los esperados para un polisacárido como el almidón.

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Figura 4 Figura 3

Figura 5

Figura 6

Figura 7

Figura 8

Los tubos 3 y 4 que contienen el almidón, al que le hemos añadido la saliva, ponerlos en un vaso de precipitados al baño María, controlando la temperatura del agua para que no hierva, ya que lo que intentamos, es que la enzima de la saliva trabaje a unos 37: C. Dejarlo unos 15 ‘ .Figura 6 A continuación realizar las siguientes reacciones: En el tubo número 3, realizar la Reacción de Fehling. Figura 7. En el tubo número 4, realizar la Prueba del Lugol. Figura 8 El resultado positivo obtenido en el tubo de ensayo 3, nos dice que no hay ya almidón, porque la amilasa de la saliva ha hidrolizado el almidón transformándolo en glucosa, por eso la reacción de Fehling es ahora positiva. De una manera similar, podemos interpretar el resultado del tubo de ensayo 4, ahora nos da la reacción de polisacáridos negativa, ya que el almidón (polisacárido) se ha hidrolizado. 6

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Foto 2































Foto 3

En la fotografía número 2, vemos echando la saliva en el tubo que contenía la muestra de almidón. En la fotografía número 3, vemos el tubo después de hacerle la Prueba de Fehling. BIOSEGURIDAD La norma NFPA 704 es el código que explica el "diamante de fuego" establecido por la Asociación Nacional de Protección contra el Fuego (inglés: National Fire Protection Association), utilizado para comunicar los riesgos de los materiales peligrosos. Es importante para ayudar mantener el uso seguro de productos químicos. Significado: Las cuatro divisiones tienen colores asociados con un significado. El azul hace referencia a los riesgos para la salud, el rojo indica el peligro de inflamabilidad y el amarillo los riesgos por reactividad: es decir, la inestabilidad del producto. A estas tres divisiones se les asigna un número de 0 (sin peligro) a 4 (peligro máximo). Por su parte, en la sección blanca pueden haber indicaciones especiales para algunos materiales, indicando que son oxidantes, corrosivos, reactivos con agua o radiactivos. Azul/Salud • • • • •

4. Sustancias que, con una muy corta exposición, pueden causar la muerte o un daño permanente, incluso en caso de atención médica inmediata. Por ejemplo, el cianuro de hidrógeno 3. Materiales que bajo corta exposición pueden causar daños temporales o permanentes, aunque se preste atención médica, como el hidróxido de potasio. 2. Materiales bajo cuya exposición intensa o continua puede sufrirse incapacidad temporal o posibles daños permanentes a menos que se dé tratamiento médico rápido, como el cloroformo 1. Materiales que causan irritación, pero solo daños residuales menores aún en ausencia de tratamiento médico. Un ejemplo es la glicerina. 0. Materiales bajo cuya exposición en condiciones de incendio no existe otro peligro que el del material combustible ordinario, como el cloruro sódico

Rojo/Inflamabilidad •

• •

4. Materiales que se vaporizan rápido o completamente a la temperatura a presión atmosférica ambiental, o que se dispersan y se quemen fácilmente en el aire, como el propano. Tienen un punto de inflamabilidad por debajo de 23°C (73°F). 3. Líquidos y sólidos que pueden encenderse en casi todas las condiciones de temperatura ambiental, como la gasolina. Tienen un punto de inflamabilidad entre 23°C (73°F) y 38°C (100°F). 2. Materiales que deben calentarse moderadamente o exponerse a temperaturas altas antes de que ocurra la ignición, como el petrodiésel. Su punto de inflamabilidad oscila entre 38°C (100°F) y 93°C (200°F).

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• •































1. Materiales que deben precalentarse antes de que ocurra la ignición, cuyo punto de inflamabilidad es superior a 93°C (200°F). 0. Materiales que no se queman, como el agua.

Amarillo/Reactividad • •

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•

4. Materiales que por sí mismos son capaces de explotar, detonar o sufrir reacciones explosivas a temperatura y presión normal, como la nitroglicerina. 3. Materiales que por sí mismos son capaces de detonación o de reacción explosiva que requieren de un fuerte agente iniciador, o que debe calentarse en confinamiento antes de ignición, o que reaccionan explosivamente con agua. Un ejemplo es el flúor. 2. Materiales inestables que pueden sufrir cambios químicos violentos pero que no detonan. También debe incluir aquellos materiales que reaccionan violentamente al contacto con el agua o que pueden formar mezclas potencialmente explosivas con agua. Un ejemplo es el fósforo 1. Materiales que por sí son normalmente estables, pero que pueden llegar a ser inestables sometidos a presiones y temperaturas elevadas o que pueden reaccionar al contacto con el agua, con alguna liberación de energía, aunque no en forma violenta, como el calcio. 0. Materiales que por sí son normalmente estables aún en condiciones de incendio y que no reaccionan con el agua, como el nitrógeno.

Blanco/Especial El espacio blanco puede contener símbolos: • • •

'W' - reacciona con agua de manera inusual o peligrosa, como el cianuro de sodio o el sodio. 'OX' - oxidante, como el perclorato de potasio 'COR' - corrosivo: ácido o base fuerte, como el ácido sulfúrico o el hidróxido de potasio. Con las letras 'ACID' se puede indicar “ácido” y con 'ALK', “base”.

•

'BIO' - Riesgo biológico (

• •

Símbolo radiactivo ( 'CRYO' - Criogénico

): por ejemplo, un virus ) - el producto es radioactivo, como el plutonio.

Sólo 'W' y 'OX' se reconocen oficialmente por la norma NFPA 704, pero se usan ocasionalmente símbolos con significados obvios como los señalados. La expresión RAAD es la más importante por la razón A2 en riesgos extremos, donde fue desarrollado en 1976 por Aguilare et all.

Riesgos químicos (del laboratorio 1). EDTA: El ácido etilendiaminotetraacético1 o EDTA, es una sustancia utilizada como agente quelante que puede crear complejos con un metal que tenga una estructura de coordinación octaédrica. La principal toxicidad del EDTA es en el riñón. Las dosis repetidas puede causar anomalías en el túbulo contorneado distal. ACIDO ACETICO: El ácido acético concentrado es corrosivo y, por tanto, debe ser manejado con cuidado apropiado, dado que puede causar quemaduras en la piel, daño permanente en los ojos, e irritación a las membranas mucosas. Los guantes de látex no ofrecen protección, así que debe usarse guantes resistentes, cuando se maneja este compuesto. El ácido acético concentrado se enciende con dificultad en el laboratorio. El ácido acético diluido, en la forma de vinagre, es inocuo. Sin embargo, la ingesión de soluciones fuertes es peligrosa a la vida humana y animal en general. Puede causar daño severo al sistema digestivo, y ocasionar un cambio potencialmente letal en la acidez de la sangre.

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Riesgos: Ingestión: dolor de garganta, vómito, diarrea, dolor abdominal, sensación de quemazón en el tracto digestivo. Inhalación: Dolor de garganta, dificultad respiratoria, tos. Piel: Irritación, graves quemaduras. Ojos: irritación, visión borrosa, graves quemaduras. ACIDO NITRICO: Riesgos: Ingestión: Corrosivo. Dolor abdominal, sensación de quemazón, shock Inhalación: Sensación de quemazón, tos, dificultad respiratoria, pérdida del conocimiento Piel: Puede causar severas quemaduras Ojos: Quemaduras graves e irritación ocular. Peligrosidad: Riesgo biológico: 4 Inflamabilidad: 0 Reactividad: 0 Símbolo especial: OX. PERÓXIDO DE HIDROGENO: El peróxido de hidrógeno es tóxico, e incluso puede causar embolias al descomponerse dentro del aparato digestivo debido a liberación de burbujas de oxigeno. El peróxido de hidrógeno es muy irritante en concentraciones altas, ya que causa quemaduras temporales al desprenderse en la reacción el oxígeno. La ingestión de soluciones diluidas de peróxido de hidrógeno puede inducir vómitos, leve irritación gastrointestinal, distensión gástrica, y en raras ocasiones, erosiones o embolismo (bloqueo de los vasos sanguíneos por burbujas de aire) gastrointestinal. Ingerir soluciones de 10-20% de concentración produce síntomas similares, sin embargo, los tejidos expuestos pueden también sufrir quemaduras. Ingerir soluciones aún más concentradas, además de lo mencionado anteriormente, puede también producir rápida pérdida del conocimiento seguido de parálisis respiratoria. Peligrosidad: Riesgo biológico: 3 Inflamabilidad: 0 Reactividad: 1 Símbolo especial: OX

Riesgos Biológicos: MUESTRAS DE SUERO Y ORINA: Los agentes biológicos constituyen un factor de riesgo laboral por su capacidad de desencadenar enfermedades, tanto profesionales como del trabajo. La manipulación de agentes biológicos comporta unos riesgos, cuya prevención debe responder a unas estrictas pautas de comportamiento. Siempre que manipulemos material biológico debemos tomar ciertas precauciones como el uso de guantes, barbijos, antiparras, guardapolvos o delantales y evitar ingestión y contacto con mucosas. Riesgo fuego: En estos laboratorios trabajaremos con mecheros de Bunsen por lo que tendremos que tomar las medidas necesarias para evitar quemaduras e incendios. Riesgos Eléctricos: Recuerda que al manipular aparatos eléctricos como lo es en este caso el Baño María, se debe tener extrema precaución y controlar el funcionamiento adecuado del mismo para evitar posibles accidentes.

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Informe Laboratorio 1 COMISIÓN Nº

FECHA:

NOMBRE/S Y APELLIDO/S:

Téngase en cuenta que: “Fundamento del ensayo” hace referencia al soporte teórico de la experiencia deberá ser breve, por ej. “El Cu++ del reactivo se reduce en medio alcalino por acción de compuestos reductores como la vitamina C”. Los “Resultados observados” son las observaciones que se producen mientras se desarrolla la prueba (color, presencia de coágulos, precipitados, etc). La “Interpretación” es la justificación que Ud. le da al resultado obtenido según el fundamento argumentado (ej. prueba positiva por la presencia en la muestra de jugo de cítricos de ...) Reacción

A.A - Proteínas Nombre

1

Fundamento Resultado Nombre

2

Fundamento Resultado Nombre

3

Fundamento Resultado

10