METODOLOGÍA PARA LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN BOVINO CARNE José Denis Osuna Amador, Noé de Jesús Medina Córdova, Sandra Luz Velázquez Alcalá, Ricardo Ortega Pérez, José Luis Espinoza Villavicencio

Centro de Investigación Regional del Noroeste Campo Experimental Todos Santos La Paz, Baja California Sur, México. Julio de 2014 Folleto Técnico Núm. 12 ISBN: 978-607-37-0263-8

La impresión de la presente publicación y la información contenida en esta, se realizó con el apoyo otorgado al INIFAP durante el proceso de investigación por la Fundación Produce Baja California Sur, A.C.

Tiraje: 500 ejemplares

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SECRETARÍA DE AGRICULTURA, GANADERÍA, DESARROLLO RURAL, PESCA Y ALIMENTACIÓN Lic. Enrique Martínez y Martínez Secretario Lic. Jesús Aguilar Padilla Subsecretario de Agricultura y Ganadería Lic. Arturo Osornio Sánchez Subsecretario de Desarrollo Rural Lic. Ricardo Aguilar Castillo Subsecretario de Alimentación y Competitividad Lic. Marcos Bucio Mujica Oficial Mayor INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIONES FORESTALES, AGRÍCOLAS Y PECUARIAS Dr. Pedro Brajcich Gallegos Director General Dr. Manuel R. Villa Issa Coordinador de Investigación, Innovación y Vinculación M.Sc. Arturo Cruz Vázquez Coordinador de Planeación y Desarrollo Dr. Eduardo Francisco Berterame Barquín Coordinador de Administración y Sistemas

CENTRO DE INVESTIGACIÓN REGIONAL DEL NOROESTE Mtro. Jorge Alberto Sáenz Félix Director Regional Dr. Jesús Arnulfo Márquez Cervantes Director de Investigación, Innovación y Vinculación Dr. Ramón Antonio Armenta Cejudo Director de Planeación y Desarrollo Lic. José Silva Constantino Director de Administración CAMPO EXPERIMENTAL TODOS SANTOS M.C. José Denis Osuna Amador Director de Coordinación y Vinculación del INIFAP en B.C.S. Jefe del Campo Experimental Todos Santos

INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIONES FORESTALES, AGRÍCOLAS Y PECUARIAS CENTRO DE INVESTIGACIÓN REGIONAL NOROESTE CAMPO EXPERIMENTAL TODOS SANTOS

Metodología para la transferencia de embriones en ganado bovino M.C. José Denis Osuna Amador Director de Coordinación y Vinculación del INIFAP en B.C.S.

M.C. Noé de Jesús Medina Córdova Investigador del C.E. Todos Santos

Ing. Sandra Luz Velázquez Alcalá Investigador del C.E. Todos Santos

Dr. Ricardo Ortega Pérez Profesor-Investigador, Departamento Académico de Zootecnia, UABCS

Dr. José Luis Espinoza Villavicencio Profesor-Investigador, Departamento Académico de Zootecnia, UABCS

La Paz, Baja California Sur, México

Julio de 2014

Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias Progreso No. 5 Barrio de Santa Catarina Delegación Coyoacán. C.P. 04010, México, D.F. Teléfono: (55)-3871-8700

Primera edición 2014

ISBN: 978-607-37-0263-8

La presente publicación se terminó de imprimir en el mes de julio de 2014, en la imprenta Ciudad de Los Niños, calle Revolución S/N entre 5 de Febrero y Cuauhtémoc, Colonia Pueblo Nuevo. La Paz, Baja California Sur, México. C.P. 23060. Teléfono: (612) 122-0327, 122-9595. No está permitida la reproducción total o parcial de esta publicación, ni la transmisión de ninguna forma o por cualquier medio, ya sea electrónico, mecánico, fotocopia, por registro u otros medios, sin el permiso previo y por escrito de la institución.

CONTENIDO Página I. Introducción...................................................

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II. Biotecnologías reproductivas....................

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III. Selección de donantes................................ Criterios genéticos.......................................... Criterios no genéticos.....................................

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IV. Manipulación del ciclo estral...................... Superovulación de donantes..........................

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V. Transferencia de embriones........................ Técnicas de recolección................................. Identificación de los embriones...................... Estadios de desarrollo del embrión................ Calificación de los embriones......................... Técnica de transferencia................................ Conservación de embriones...........................

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VI. Manejo de las receptoras........................... Características de las receptoras.................. Sincronización de receptoras........................ Sincronía donante-receptora.........................

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VII. Resultados y recomendaciones..............

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VIII. Literatura citada.......................................

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I. Introducción El mejoramiento genético ha jugado un papel esencial en el desarrollo de la ganadería, el cual consiste en aplicar principios biológicos, económicos y matemáticos, con el fin de encontrar las estrategias óptimas para aprovechar la variación genética de los animales y con ello maximizar su calidad, siendo la identificación y el uso de registros las herramientas que más han impactado en ésta, además de la evaluación y selección de animales, y la distribución del material genético seleccionado mediante tecnologías reproductivas como la inseminación artificial y transferencia de embriones. En Baja California Sur la obtención de animales de alta calidad genética para incrementar la producción de carne y leche, se ha hecho importando animales a costos elevados, en ocasiones con limitada adaptación y con resultados en mejora genética a largo plazo. Al respecto, la transferencia de embriones permite acelerar el mejoramiento genético del ganado ya que también se aprovecha la genética del lado materno, lo cual disminuye el intervalo entre generaciones y favorece el proceso de selección obteniendo un gran número de progenie de donadoras valiosas. Por lo anterior, en el presente documento se describen las características y procedimientos básicos para desarrollar e implementar la tecnología de transferencia de embriones en forma adecuada.

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II. Biotecnologías reproductivas La transferencia de embriones (TE) y la inseminación artificial (IA) son las tecnologías reproductivas más utilizadas en los sistemas de producción, sin embargo, a pesar de sus beneficios en los programas de mejoramiento genético, la proporción de animales incluidos en ellas es aún muy bajo en América Latina. En México, en zonas especializadas en producción de leche, el porcentaje de vientres tratados con estas tecnologías no supera el 50%, esto atribuido principalmente a motivos económicos, culturales, así como la falta de capacitación de productores y técnicos, siendo la detección de celos uno de los factores más importantes que influye en su efectividad. En términos generales la TE consiste en recolectar los embriones de una hembra donante y transferirlos a una hembra receptora, la cual se encarga de servir como madre sustituta durante la preñez. Se requiere de precisión mediante el uso de gonadotropinas para inducir la superovulación en la donante, y sincronizar a las futuras receptoras para que estén en celo y ovulen al mismo tiempo que las donantes, siendo la implementación de protocolos de sincronización del celo y ovulación, herramientas necesarias para el éxito de la tecnología. Para obtener una cría por vaca por año, es obligatorio que en un periodo de no más de tres meses posparto la vaca reinicie sus ciclos reproductivos normales e inicie una nueva gestación. Es importante la correcta detección de celos para obtener buenos resultados, tomando en consideración que la duración del ciclo 5

estral en bovinos es de 18 a 23 días, y la oportunidad de servicio solo de 12 a 18 horas. Para lograr tasas de concepción aceptables, tanto el espermatozoide como el embrión deben ser depositados en el sitio y momento correcto con relación a la ovulación de la hembra, por ello es necesario el conocimiento de tres factores: 1) fisiología del ciclo estral de la vaca, 2) productos farmacológicos y sus efectos sobre el ciclo estral de la vaca, y 3) factores de manejo del hato que reduzcan el anestro e incrementen las tasas de preñez. III. Selección de donantes Es importante seleccionar de manera adecuada a los animales que serán designados como donantes, ya que esto influirá directamente en el número de embriones viables de un programa de TE. Es poco probable encontrar una vaca donante que cubra todas las necesidades de un ganadero y que además se adapte a las distintas situaciones y necesidades del mercado, por ello es necesario tomar en cuenta ciertos criterios que se pueden utilizar para mejorar la genética del hato y hacer más eficiente el proceso de TE. Criterios genéticos: Previo al tratamiento de superovulación de una donante es indispensable conocer su capacidad de transmisión. Un problema es superovular vacas que no poseen las características genéticas deseables y que aparentan un mayor valor genético del que poseen realmente. Es importante tomar en cuenta características productivas como la buena fertilidad, facilidad de parto, 6

buena habilidad materna, pesos al nacimiento, al destete, al año; además de las características morfológicas de mayor importancia, entre estas: apariencia general, miembros y aplomos, tamaño y forma de la ubre. Se recomienda crear un grupo de donantes de élite que contenga del uno al cinco por ciento de los animales presentes en el hato, para asegurar un progreso genético adecuado. Entre mayor sea la variabilidad genética de la población de animales, resultará más interesante el uso de la TE y por lo tanto se conseguirá una mayor optimización del valor del semen a utilizar. Criterios no genéticos: Al decidir el momento de la superovulación, se deben tomar en cuenta los factores relacionados con el individuo así como también los ligados al hato. Cuando se hayan seleccionado las vacas genéticamente superiores, es necesario llevar a cabo una segunda selección haciendo énfasis en las características reproductivas. Es importante seleccionar animales sin antecedentes patológicos como abortos, retenciones placentarias y quistes, debido a que estos afectan la adecuada producción de embriones, si bien es deseable que los animales propuestos para la superovulación no presenten una media superior a las tres inseminaciones por gestación, en el caso de animales de gran valor, pueden ser utilizados como donantes, ya que aunque la respuesta esperada puede reducirse al 50%; estos serán igual de fértiles que los de los animales no repetidores. Para tener la seguridad de que la función ovárica normal se ha restablecido, se recomienda detectar dos a tres ciclos estrales completos y regulares 7

posparto, lo que conlleva a un intervalo parto superovulación mínimo de 60 a 90 días, siendo el óptimo de 90 a 120 días. Se debe diagnosticar el estado ginecológico de la donante a través de una exploración rectal, para detectar la presencia de un buen cuerpo lúteo (CL), de buena conformación y el tracto genital sin apreciaciones patológicas. La selección de los machos debe ser entre aquellos de alta y probada fertilidad, que mejoren los defectos de la hembra donante y tratando de evitar el uso de animales que produzcan crías de gran tamaño, cuando se vaya a utilizar en vaquillas como receptoras. a) Factores ligados al individuo: La edad es un factor importante, siendo la óptima entre los dos y cinco años. En el caso de las vaquillas, la superovulación se puede realizar a partir de los 14-15 meses de edad, para ello es importante que los animales presenten un buen desarrollo y una condición corporal adecuada. En vacas en producción, el tiempo entre el parto y la superovulación está relacionado con el estado reproductivo de la donante, es decir cuando el aparato reproductor esté en perfectas condiciones (alrededor del día 60 posparto), además de haberse observado más de un celo a intervalos regulares; de esta manera se considera que el momento ideal para superovular está entre los 90 y 120 días posparto. b) Factores ligados al hato: La nutrición influye directamente en el tiempo transcurrido entre el parto y la superovulación de la donante, así como también 8

en el porcentaje de vacas que responden al tratamiento y en la cantidad y calidad de los embriones obtenidos. La vaca elegida como donante debe tener una óptima condición corporal, procurando que no estén ni gordas ni flacas, es decir con una condición de 5 en la escala del 1 al 9. Se debe iniciar con una adecuada alimentación de las donantes mucho antes de que se programe la superovulación, debido a que las fallas cometidas incluso siete u ocho meses antes se ven reflejadas en la respuesta. Los factores estresantes como los cambios bruscos en el manejo o la aplicación de tratamientos preventivos como vacunaciones, pueden afectar la respuesta superovulatoria; asimismo, hacerlo en los meses más calurosos. Otro componente de vital importancia es el ganadero o técnico a cargo de la explotación, puesto que está en sus manos todo el manejo de los animales y en gran medida el éxito de la TE. Debe ser eficiente en la detección de celos, ya que de esto depende el inicio de la superovulación, así como la inseminación de la donante y la posterior implantación de los embriones en las receptoras. La presencia de errores en la detección de celos, se verá reflejada en la viabilidad de los embriones el día de la colecta, así como en el número de gestaciones después de la transferencia.

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IV. Manipulación del ciclo estral Para obtener buenos resultados en la TE, es necesaria la observación de celos al menos dos veces por día, lo que dificulta la eficiencia de la tecnología. La manipulación del ciclo estral para que un grupo de hembras previamente seleccionadas presenten celo y ovulen en un determinado periodo de tiempo, ha estimulado el desarrollo de varias líneas de investigación. Actualmente existe un gran número de protocolos con características distintas que presentan ventajas y desventajas, por ello es importante conocer la fisiología reproductiva del bovino, para determinar el método que más se adapte a nuestras necesidades. Superovulación de donantes: El fundamento de los tratamientos superovulatorios es producir una gran cantidad de ovulaciones y obtener la mayor cantidad de embriones transferibles en un solo ciclo reproductivo, lo cual se traduce en altas probabilidades de preñez. No obstante la respuesta a estos tratamientos es muy variable e impredecible, lo que genera una serie de problemas que afectan tanto la eficiencia como la rentabilidad en los programas de TE. Son varios los factores que influyen en la respuesta a los tratamientos superovulatorios y la producción de embriones viables de una vaca donante, entre los que destacan los relacionados con el tipo de tratamiento superovulatorio, factores individuales y los ligados al ambiente (Cuadro 1).

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Cuadro 1. Factores que afectan la respuesta superovulatoria de una donante. Factores relacionados con el tratamiento  Momento de inicio del tratamiento en relación con el ciclo estral  Tipo de gonadotropina usada  Lotes de gonadotropinas  Relación hormona folículoestimulante (FSH) y hormona luteinizante (LH) de los preparados comerciales  Duración del tratamiento  Dosis total de gonadotropinas  Vía de administración de las gonadotropinas  Uso de hormonas adicionales

Factores inherentes al animal y su ambiente       

Estado nutricional Historia reproductiva Edad de la donante Estación del año Raza Causas genéticas o fisiológicas Repetición de tratamientos superovulatorios

El esquema tradicional de superovulación (Cuadro 2) comienza el tratamiento con gonadotropinas entre los días ocho y diez del ciclo estral, aproximadamente cuando comienza la segunda onda de crecimiento folicular. Las gonadotropinas más utilizadas son extractos de pituitaria porcina u ovina, o gonadotropina coriónica equina (eCG). Los extractos de pituitaria contienen altas cantidades de FSH y cantidades variables de LH, dependiendo del producto. Generalmente, los tratamientos consisten en dosis decrecientes o constantes durante cuatro o cinco días, y se prefieren los extractos con bajo contenido de LH porque producen embriones de mejor calidad. La eCG tiene una vida media de 40 horas en la vaca y persiste por más de 10 días en la circulación sanguínea; por ello normalmente se administra en una sola dosis intramuscular. 11

Además de la administración de gonadotropinas, la donante recibe una dosis luteolítica de prostaglandinas (PGF2α) a las 48 horas después de comenzado el tratamiento superovulatorio, y regularmente presenta celo de 36 a 48 horas pos aplicación de la PGF2α. En caso de transferir embriones frescos, las receptoras deberán ser tratadas con PGF 2α de 18 a 24 horas antes que las donantes, de manera que el estro de las receptoras coincida con el de las donantes. Cuadro 2. Esquema de tratamiento de superovulación en bovinos. Día 0

Detección de celo de la donante

Día 9 am Día 10 mediodía Día 11 am

Comienzo de la superovulación-donante Inyección de PGF2α -Receptoras Inyección de PGF2α -Donante Celo de donante y receptora Primera IA-Donante Segunda IA-Donante Recolección de embriones en la donante y congelado o transferencia en receptoras

Día 13 am Día 13 pm Día 14 am Día 20

Para optimizar los resultados, los tratamientos superovulatorios deben iniciarse al comienzo de una onda de desarrollo folicular, antes de la selección del folículo dominante, por lo que es recomendable controlar la dinámica folicular y comenzar los tratamientos en el momento más oportuno. Existen diversos métodos para controlar la dinámica folicular del bovino. La mayoría se han orientado hacia la disminución del efecto del folículo dominante (por métodos físicos u hormonales), lo que permite el comienzo de una nueva onda folicular en un determinado periodo de tiempo. Por otra parte, un método físico es la aspiración de los folículos mediante 12

ultrasonografía transvaginal, dando como resultado el comienzo de una nueva onda folicular alrededor de un día y medio después. El tratamiento superovulatorio consiste en la aspiración de todos los folículos presentes o la aspiración del folículo dominante (cuando las vacas están entre los días cinco y ocho del ciclo) dos días antes de la aplicación de las gonadotropinas. El resto del tratamiento es similar a los tratamientos convencionales. Los tratamientos hormonales más utilizados incluyen el uso de estrógenos y progestágenos, debido a que en cualquier momento del ciclo estral inducen el crecimiento sincrónico de una nueva onda folicular aproximadamente cuatro días después. El intervalo entre el tratamiento y el inicio de la superovulación es de cuatro días si utilizamos estradiol17β o benzoato de estradiol (EB) combinados con una inyección de progesterona (P4) en el momento que se coloca el dispositivo con P4. De los estrógenos disponibles en el mercado se obtienen mejores resultados con el EB que con el valerato de estradiol (EV). Este procedimiento es simple, fácil de llevar a cabo por el personal, no depende de la detección de celos, y permite producir cantidades similares o superiores de embriones de calidad que con los tratamientos tradicionales, iniciados a los nueve días del celo. El tratamiento previo tiene la ventaja de que en él es posible elegir el momento adecuado para realizar la recolección, y de esta manera programar grupos de donantes para recolectar al mismo tiempo. Esto sin duda facilita la aplicación de la técnica de transferencia de 13

embriones y disminuye los costos, ya que permite elegir el momento de la recolección y armar circuitos eficientes de trabajo. V. Transferencia de embriones La técnica de TE ha sido usada en casi todos los animales domésticos, y en muchas especies salvajes y exóticas. Fue a principios de la década de los 70’s cuando comenzó el gran interés comercial en la TE en el bovino. Las razas europeas de doble propósito eran importadas a Norteamérica, y dada su escasez eran extremadamente valiosas. Como resultado, existía gran incentivo económico para la aplicación de la TE; los criadores querían un método que aumentara el porcentaje reproductivo de sus hembras para una provechosa venta de su descendencia. En consecuencia, el uso de la técnica en animales domésticos fue desarrollada con dinero de los criadores, más que con fondos para la investigación. Después de la IA, la TE se ha convertido en la herramienta más poderosa para el mejoramiento animal. Varios países han incorporado programas de TE dentro de los programas de progenie, como ayuda para el mejoramiento genético en ganado productor de carne y leche. La técnica de TE comprende varios pasos: 1. La sincronización de donantes y receptoras, 2. La superovulación de las vacas donantes, 14

3. La doble IA de las donantes, 4. La colección de los embriones, 5. La identificación, clasificación y calificación de los embriones, 6. La transferencia del embrión a la receptora, y 7. El manejo previo y posterior de las receptoras. Técnicas de recolección: Estas consisten en el lavado interno de los cuernos uterinos. Siete días después de la IA de la donante, los embriones son recolectados con la ayuda de un catéter que es introducido en el útero por la vagina y el cérvix. Existen varias clases de catéteres para la recolección: Foley de dos vías, Foley de tres vías, el modelo Neustadt/Aisch o modificaciones de los mismos realizadas por distintos proveedores. Los catéteres más usados son los Foley de dos y tres vías. Se pueden utilizar una gran variedad de medios de recolección, pero el más popular actualmente es el Dulbecco’s Fosfato Buffer Salino (DPBS), debido a que tiene fosfato como buffer, y su pH cambia en forma mínima al ser expuesto a la atmósfera. Un medio de cultivo de embriones ideal será aquel que se asemeje física y químicamente al medio en que se encontraban los embriones al momento de ser recolectados. Los embriones mamíferos están altamente adaptados al medio uterino de la madre, por lo que se hace imprescindible mantenerlos en condiciones óptimas. El pH debería mantenerse a 7.4 + 0.5, y la osmolaridad (concentración de sales) en 285-300 miliosmoles/l. 15

En síntesis, podemos decir que siete días después de que la donante fue detectada en celo e inseminada artificialmente, estamos en el momento óptimo para recolectar los embriones. Lo ideal es trabajar con grupos de cuatro o cinco donantes por día por la variabilidad de la respuesta superovulatoria. No es recomendable trabajar con una sola donante por día. Los ovarios de la donante deben ser palpados (o examinados por ultrasonografía) para estimar la respuesta al tratamiento superovulatorio. Es mejor comenzar con las que tienen mayor respuesta para poder organizar la transferencia de los embriones frescos y el congelado, en caso de tener más embriones que receptoras. El medio de recolección es vertido al filtro especial Emm-com con una malla de 50 µm que permite el paso del medio y no de los embriones. Finalizando el filtrado se lava la malla del filtro con PBS utilizando una jeringa y agua fina; el fluido es recolectado en una caja de Petri y se procede a la búsqueda de los embriones. Identificación de los embriones: El diámetro de un ovocito es de aproximadamente 150-190 µm, incluyendo el espesor de la zona pelúcida (12-15 µm). El diámetro del ovocito permanece prácticamente sin variación desde el estado de célula hasta el estado de blastocisto expandido (Figura 1).

Figura 1. Búsqueda e identificación de embriones

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El número de células de un embrión puede ser contado sin dificultad hasta el estado de 16 células. Cuando el embrión alcanza el estado de 32 células se produce la compactación en la cual los blastómeros pierden su forma esférica y comienzan a adherirse entre ellas. En este estado el embrión recibe el nombre de mórula. Luego los blastómeros comienzan a diferenciarse, y dan origen a dos tipos de células, las células del trofoblasto y la masa de células interna o macizo celular interno (MCI). Las primeras darán origen a la placenta, y el MCI dará origen al feto. A partir de ese momento comienza a formarse una cavidad interna que se denomina blastocele y el embrión comienza a denominarse blastocisto. Es más fácil distinguir el MCI cuando el embrión se encuentra en el estado de blastocisto, que en el estado de mórula. La individualización de embriones de ocho a diez días de edad es difícil, ya que el embrión eclosiona y la zona pelúcida se pierde durante estos días. La zona pelúcida refleja la luz del microscopio y se observa como una estructura transparente que rodea la masa celular dejando un espacio vacío denominado espacio perivitelino, que es identificable hasta el estadio de blastocisto. El color de los blastómeros es más oscuro que el debris celular, lo que facilita la búsqueda. Una buena práctica es mover el debris celular y mucus que se encuentran en la placa, ya que los embriones tienden a adherirse a ella. Estadios de desarrollo del embrión: En las primeras etapas se denominan de acuerdo al número de células: dos células, seis células, ocho células, hasta 16 células, después se nombran de manera distinta. 17

Mórula (estadio tres): Su aspecto se asemeja al de una mora, los blastómeros son poco visibles, la mayor parte del espacio perivitelino la ocupa la masa de células (embrión) y la edad estimada es de cuatro a cinco días. Mórula compacta (estadio cuatro): Los blastómeros se unen y forman una masa compacta. El embrión ocupa el 60-70% del espacio perivitelino (edad estimada 5 a 6 días). Blastocisto temprano (estadio cinco): Se observa una cavidad con fluido o blastocele, aparentando un anillo de sello. El 70-80% del espacio perivitelino lo ocupa el embrión el trofoblasto y el macizo celular interno se pueden diferenciar en forma visual (edad estimada siete días). Blastocisto (estadio seis): La diferencia entre el trofoblasto externo y el macizo celular interno se vuelve más obvia (más oscuro), claramente se observa el blastocisto y el embrión ocupa casi por completo el espacio perivitelino (edad estimada siete a ocho días). Blastocisto expandido (estadio siete): El tamaño se incrementa 1.2 a 1.5 veces, la zona pelúcida se adelgaza aproximadamente una tercera parte con respecto al grosor original, en esta etapa los embriones se pueden encontrar colapsados (edad estimada ocho a nueve días). Blastocisto eclosionado (estadio ocho): Se puede observar al embrión en proceso o totalmente fuera de la zona pelúcida, los blastocistos eclosionados son 18

esféricos con el blastocele bien desarrollado (nueve a diez días). Calificación de los embriones: Se realiza para evaluar la calidad del embrión, basándose en las características morfológicas, son subjetivas y dependen principalmente de la experiencia del técnico. El mejor indicador para determinar la calidad de los embriones, es la tasa de preñez obtenida después de ser transferidos. Sin embargo las características más importantes a tomar en cuenta para otorgar una calificación a un embrión son: 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Forma del embrión. Color y textura de la masa celular. Número y compactado de los blastómeros. Diferencia de tamaño entre blastómeros. Tamaño del espacio perivitelino. Presencia de blastómeros sueltos, degenerados, o detritus celular. 7. Presencia, número y tamaño de vesículas (indican degeneración). 8. Apariencia de la zona pelúcida. De acuerdo con la Sociedad Internacional de Transferencia de Embriones (IETS), la clasificación y calificación de los embriones es la siguiente: a. Estadio de desarrollo 1= Infertilizado. 2= De 2 a 12 células. 3= Mórula temprana. 4= Mórula. 19

5= Blastocisto temprano. 6= Blastocisto. 7= Blastocisto expandido. 8= Blastocisto eclosionado. 9= Blastocisto eclosionado en expansión. b. Calidad 1= Excelentes o buenos (esférico, simétrico, células uniformes). 2= Regulares (imperfecciones ligeras, blastómeros extruidos, vesículas). 3= Malos (alteraciones más severas, vesículas, células degeneradas). 4= Muertos o degenerados. Los embriones deben ser transferidos antes de su salida de la zona pelúcida que suele ocurrir alrededor del día nueve o diez, es decir aquellos que se encuentran en estado de mórula o blastocisto. Los embriones de calidad uno resultan los mejores para congelar y son los más comercializados; los de calidad dos resultan en buenos porcentajes de preñez si se les transfiere frescos, pero los resultados de preñez son menores cuando se les congela. Los de calidad tres no deben ser congelados, y tienen índices de preñez regulares a malos si son transferidos frescos. La calidad de los embriones es una de las variables que condicionan los resultados. Si se tiene control sobre la condición corporal y la sincronía de la receptora, una buena calificación de los embriones nos permitirá predecir el porcentaje de preñez a obtener con la 20

transferencia. Se pueden obtener porcentajes de preñez de entre 40 y 60% con embriones frescos y congelados. Técnica de transferencia: El método no quirúrgico de transferencia es usado con mucho éxito por la mayoría de los técnicos. Generalmente se utilizan pajillas francesas de 0.25 ml, un pipeta desechable de plástico con punta metálica y descarga lateral (IMV, Francia), y una pistola para TE (IMV, Francia) (Figura 2).

Figura 2. Preparación de pistola para transferencia de embriones

La hembra receptora se ubica en una trampa y se procede a la palpación para ubicar el ovario que contiene el cuerpo lúteo (Figura 3). Después se administra anestesia epidural baja (xilocaína al 2%) y se limpia la región perineal y la vulva.

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Figura 3. Identificación de ovario con cuerpo lúteo

El embrión se coloca dentro de una pajilla esterilizada (0.25 ml) de la siguiente forma (Figura 4): a. Aspiración de un pequeño volumen de medio de mantenimiento. b. Aspiración de una burbuja de aire. c. Aspiración de un pequeño volumen de medio de mantenimiento. d. Aspiración de una burbuja de aire. e. Aspiración del embrión con un pequeño volumen de medio de mantenimiento. f. Aspiración de una burbuja de aire. g. Aspiración de un pequeño volumen de medio de mantenimiento. h. Aspiración de una burbuja de aire. i. Aspiración de medio de cultivo hasta llenar la pajilla.

Figura 4. Metodología para cargar el embrión en una pajilla para su posterior transferencia o conservación

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La primera columna de medio humedece el algodón y el alcohol polivinílico del extremo cerrado de la pajilla, esto para que un lado permanezca sellado y no permita la salida del embrión antes de ser transferido. La pajilla con el embrión se coloca dentro de la pistola de TE, y ésta dentro de la pipeta plástica. Para depositar el embrión en la hembra receptora se puede utilizar la técnica recto cervical, procurando realizar este procedimiento con la mayor rapidez posible, en el caso de una persona diestra se introduce la mano izquierda, el técnico sujeta el cérvix a través de la pared del recto. La pipeta se introduce en el canal cervical, y posteriormente se introduce en el cuerno ipsilateral al CL. El embrión es depositado en el tercio anterior del cuerno uterino. La pistola es removida suavemente y se retira la mano del recto (Figura 5).

Figura 5. Depósito de embrión en hembra receptora mediante la técnica recto cervical

Con la técnica se pueden obtener buenos porcentajes de preñez (60% con embriones frescos y 40 a 50% con embriones congelados), siempre y cuando las receptoras estén sanas, con ciclos reproductivos normales y con buen estado nutricional. Normalmente, una vaca promedio produce por tratamiento 23

superovulatorio entre 10 y 12 ovulaciones con 8 a 10 embriones recuperados, de los cuales cinco o seis son transferibles, lo que resulta en tres o cuatro posibles crías. Un último factor a tomar en cuenta en la TE es el factor humano, de tal manera que las tasas de fertilidad pudieran variar de un 20% a un 60% según la habilidad de cada técnico. Así pues, la experiencia del operador es fundamental no solo en la palpación, sino en la transferencia para evitar cualquier daño a la receptora y así conseguir el mayor número de gestaciones. Conservación de embriones: Una vez obtenidos los embriones, podrán ser transferidos a las hembras receptoras, debidamente preparadas con antelación, tan pronto como sea posible. Sin embargo, los embriones también pueden ser conservados a bajas temperaturas (0°C - 4°C), sin que se aprecie una pérdida de viabilidad en las primeras 24 horas, decreciendo en un 50% a las 48 horas y se pierde totalmente a las 120 horas. Por lo tanto, la congelación a -196°C es la mejor opción para la conservación y transporte de embriones, esta permite el mantenimiento de la viabilidad embrionaria por largos períodos de tiempo y contribuye a incrementar el rendimiento de un programa de superovulación al no perder embriones cuando no se dispone del número suficiente de receptoras (Figura 6). Es importante resaltar que solo los embriones de excelente calidad y con un grado de desarrollo normal serán adecuados para ser sometidos al proceso de congelación. La congelación es un proceso físico24

químico gobernado por el calor y el transporte de sustancias entre las células y su medio externo. Para controlar esto se han utilizado una serie de compuestos crioprotectores con características similares; estos compuestos protegen a las células de los efectos dañinos de las altas concentraciones de solutos, a medida que avanza la congelación. Inicialmente los crioprotectores se adicionaban y retiraban del embrión mediante su inclusión en soluciones sucesivas de concentración crecientes y decrecientes, en la actualidad este proceso se puede realizar en un solo paso, descongelando y transfiriendo los embriones de forma similar a como se realiza una inseminación artificial y con resultados de gestación semejantes. El descenso lento de la temperatura (0.3°C - 0.5°C/min) permite realizar la inmersión en nitrógeno líquido (a 196°C) desde temperaturas comprendidas entre -30°C a -40°C, posibilitando la descongelación rápida de los embriones, de manera similar a la realizada con el semen.

Figura 6. Conservación de embriones a -196°C

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VI. Manejo de las receptoras La fertilidad es el diagnóstico más fiable de la viabilidad embrionaria, además de ser el principal objetivo de cualquier técnica artificial de reproducción. Existen una serie de factores que conciernen al tipo de técnicas empleadas para la transferencia y sincronización entre donantes y receptoras, al embrión y a la receptora, que son los que determinan el éxito o el fracaso de la TE. Características de las receptoras: Diversos factores se deben tomar en cuenta a la hora de seleccionar animales para organizar un lote de futuras receptoras de embriones, entre otros los más importantes a considerar son: a) Edad: La utilización de vaquillas como receptoras frente a vacas ofrece superiores tasas de gestación (53% vs 71%), mayor facilidad de manejo por su uniformidad y menores costos. Deben ser seleccionadas aquellas vaquillas que ciclen normalmente y hayan alcanzado un 45-55% de su peso adulto, con un buen desarrollo y condición corporal. b) Nutrición: El aporte energético y una condición corporal adecuada (de 5 a 6) son los principales factores que condicionan el éxito en la consecución de la gestación. Las receptoras deben estar en un estado positivo de energía y la ración en todos sus componentes (proteína, energía, vitaminas y minerales) debe ser equilibrada. En caso contrario habrá que suplementar hasta satisfacer las necesidades de cada animal, cualquier 26

cambio deberá realizarse gradualmente, siendo recomendable mantener a las posibles receptoras con la misma dieta por lo menos desde seis semanas antes de la transferencia y mantenerla hasta los dos meses de gestación. c) Estrés: El estrés puede interferir en casi todos los aspectos de la reproducción, tales como el celo, la ovulación, el desarrollo embrionario y la gestación. En la receptora, varias pueden ser las causas de estrés, como climáticas, nutricionales y en muchas ocasiones el trato recibido por el ganadero. En el manejo de las receptoras se ha de evitar en lo posible cualquier factor estresante; así, en el hato de receptoras se debe mantener su composición y tamaño para evitar todo conflicto y trastorno de la conducta estral que impida la identificación del animal en celo. Los corrales deben disponer de condiciones apropiadas, instalaciones cómodas y elementos de sujeción seguros para su manejo. El acostumbramiento de los animales al manejo que recibirán el día de la transferencia favorecerá el incremento de las tasas de gestación. Sincronización de receptoras: Consiste en la sincronización de celos entre donante y receptora, tratando de hacer coincidir lo mejor posible el estadio de desarrollo embrionario con su correspondiente estado uterino, siendo el margen de desequilibrio aceptable de ±1 día para que no represente un efecto adverso. Para la sincronización de celos de las receptoras existen actualmente en el mercado los análogos de prostaglandina F2α (PGF2α) y los progestágenos. Las 27

receptoras a las cuales para su sincronización con la donante se les administran PGF2α (con o sin progestágenos), presentan tasas de gestación significativamente superiores en comparación con las que son utilizadas tras la observación de un celo natural. Sincronía donante-receptora: La obtención de tasas aceptables de preñez por transferencia de embriones depende parcialmente de que el celo de receptoras y donantes este dentro de una sincronía aceptable, cuyo rango puede variar si los embriones son frescos o congelados. Lo ideal con embriones congelados es no tener una asincronía mayor a 24 horas. En cambio con embriones frescos se puede llegar a transferir embriones en receptoras que están entre el día cinco y nueve del ciclo. Sin embargo hay una pequeña disminución de preñez cuando nos alejamos de las 36 horas de asincronía en relación con la donante. El estadio del ciclo de la receptora y el porcentaje de preñez también están relacionados con la calidad embrionaria. Varios experimentos han demostrado que embriones de excelente calidad soportan más el asincronismo que los embriones regulares o malos. Asimismo, se obtuvieron los mayores porcentajes de preñez con embriones regulares o malos en receptoras que entraron en celo después que la donante. Esto puede estar relacionado con el hecho de que en los embriones de calidad pobre, el desarrollo embrionario retardado es frecuente, por lo que el ambiente uterino proporcionado por una receptora en un estadio más temprano del ciclo resulta más propicio para este tipo de embrión. 28

VII. Resultados y recomendaciones El INIFAP en Baja California Sur incluyó dentro de sus programas de validación y transferencia de tecnología, la TE mediante la técnica no quirúrgica usando embriones congelados, para lo cual fueron seleccionadas 10 receptoras, en las que se implementó el siguiente protocolo de sincronización:

El diagnostico de gestación se realizó mediante palpación y ecografía transrectal a los 56 días, el porcentaje de preñez fue de 33.3%, menor a los porcentajes promedio reportados para esta tecnología, esto probablemente como resultado de la época del año en que se realizó (septiembre), donde se presentaron temperaturas elevadas en la zona.

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Ante lo expuesto, para optimizar los resultados es importante tomar en cuenta las siguientes recomendaciones:  

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Asignar técnicos experimentados, las tasas de fertilidad pudieran variar de un 20% a un 60% de acuerdo a la habilidad de cada técnico. Contar con registros reproductivos del hato, esto nos facilitará la selección de los mejores animales y con ello obtener los mayores beneficios de esta tecnología. Es importante que tanto donantes como receptoras presenten un buen desarrollo y una condición corporal adecuada (CC= 5 a 6). En verano la presencia de celos y las tasas de preñez se reducen significativamente, por lo tanto no se recomienda en esta época del año. Contar con el equipo adecuado, pajillas francesas de 0.25 ml, pipeta desechable de plástico con punta metálica y descarga lateral (IMV, Francia), y una pistola para TE (IMV, Francia), así como corrales de manejo y trampa para la correcta sujeción de los animales. Descongelar correctamente los embriones a 30°C durante 30 segundos. Es importante mantener el nivel adecuado de nitrógeno en el termo para no afectar la viabilidad de los embriones.

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VIII. Literatura citada Colazo, M. G. y Mapletoft, R. J. 2007. Estado actual y aplicaciones de la transferencia de embriones en bovinos. Ciencia veterinaria vol. 9, 1. Cutini, A., Teruel, M. y Cabodevila, J. 2000. Factores que determinan el resultado de la transferencia no quirúrgica de embriones bovinos. Revista Taurus. 7: 28-39. De la Fuente, M. J., 2009. Producción de embriones Bovinos in vivo: Manipulación embrionaria para incrementar la producción bovina. XXXII Curso Internacional de Reproducción Animal, Madrid, España. 77 - 106. Fernández, A., Díaz, T. y Muñoz, G. 2007. Producción In vitro de Embriones Bovinos. Revista de la Facultad de Ciencias Veterinarias. 48 (1): 51 - 60. Galina, C. y Valencia, J. 2008. Reproducción de animales domésticos. Edit. Limusa, S.A. de C.V. México. Pp. 543 - 569. Mapletoft, R. J. 2006. Bovine Embryo Transfer. IVIS Reviews in Veterinary Medicine, I.V.I.S. (Ed). International Veterinary Information Service, Ithaca NY. Disponible en URL www.ivis.org, última actualización 17-noviembre-2006. Mapletoft, R. J. y Hasler, J. F. 2005. Assisted reproductive technologies in cattle: a review. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 24 (1): 393 - 403. San Primitivo T., F. 2001. Livestock genetic improvement in the second half of the 20th century. Archivos de zootecnia vol. 50, 192: 517-546.

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Agradecimientos El Campo Experimental Todos Santos, a través de los autores del presente folleto, agradece a la Fundación Produce Baja California Sur, A.C., por su apoyo y financiamiento mediante el proyecto titulado “Implementación de técnicas para el mejoramiento genético en explotaciones ganaderas”. Al M.V.Z. Ramiro Estrada Bautista, presidente de la Asociación Ganadera Local Llanos de Magdalena, así como al resto de los productores y técnicos del Estado, que siempre han mostrado interés en colaborar con las actividades de validación y transferencia de tecnología propuestas por el Campo Experimental Todos Santos a través de módulos demostrativos, cursos y talleres. A Loreto Ríos Arce y David Israel Zavala Hirales, estudiantes de la carrera de Ingeniero en Producción Animal de la UABCS, por su activa participación y colaboración en los cursos de capacitación así como en las actividades de campo.

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PERSONAL INVESTIGADOR CAMPO EXPERIMENTAL TODOS SANTOS M.C. JOSÉ DENIS OSUNA AMADOR [email protected]

DICOVI EN B.C.S. y JEFE DE CAMPO DEL CETODS

DR. JESÚS NAVEJAS JIMÉNEZ [email protected]

INGENIERIA DEL RIEGO

DR. J.A. CRISTOBAL NAVARRO AINZA [email protected]

FRUTALES

M.C. RIGOBERTO MEZA SÁNCHEZ [email protected]

RECURSOS GENETICOS FORESTALES

ING. ERASMO GUTIERRES PÉREZ [email protected]

FRIJOL Y GARBANZO

La presente publicación se terminó de imprimir en el mes de julio de 2014, en la imprenta Ciudad de Los Niños, Revolución S/N entre 5 de Febrero y Cuauhtémoc, Colonia Pueblo Nuevo. La Paz, Baja California Sur, México. C.P. 23060. Teléfono: (612) 122-0327, 1229595.

Su tiraje consta de 500 ejemplares

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La serie de Folletos Técnicos está integrada por publicaciones cuyo objetivo es difundir información de utilidad práctica para los agentes de cambio, relacionada con conocimientos concretos y detallados sobre principios, procesos y procedimientos de un cultivo, especie de ganado o forestal. La información puede tener cobertura nacional, del área de influencia de un CIR, CE, o de una localidad geográfica especifica dentro del área de influencie de un CE.

COMITÉ EDITORIAL DEL CAMPO EXPERIMENTAL TODOS SANTOS Presidente M.C. José Denis Osuna Amador Secretario Dr. Jesús Navejas Jimenéz Vocales M.C. Rigoberto Meza Sánchez Ing. Erasmo Gutiérres Pérez

Diseño de portada M.C. Noé de Jesús Medina Córdova Edición y Revisión Comité Editorial del C.E. Todos Santos Fotografía M.C. Noé de Jesús Medina Córdova

Mayor información acudir al: CAMPO EXPERIMENTAL TODOS SANTOS DEL INIFAP Edificio SAGARPA. Módulo "C" Calle Agricultura s/n, Col. Emiliano Zapata La Paz, B.C.S., México. CP-23070 Tel: 01 (612) 122 90 18 Fax: 01 (612) 128 6320