Q QU UIIM MIIC CAA BBIIO OLLO OG GIIC CAA III Laboratorio Nº 5 Tema: MONITOREO DE ALTERACIONES BIOQUÍMICAS ASOCIADAS A METABOLOPATÍAS.

Contenidos conceptuales: Introducción a Errores del metabolismo congénito, su incidencia y causa de los mismos. Contenidos procedimentales: A partir de muestra de orina otorgada por la cátedra se precederá a la realización de un screening. Contenidos actitudinales: Integración en trabajo grupal. Predisposición para la resolución de problemas con espíritu crítico y rigor científico. Bioseguridad en el laboratorio. Autoconfianza. Precisión, sistematización y coherencia en los planteamientos. Responsabilidad para con las tareas encomendadas. Objetivos:  Adquirir destreza en el desarrollo del screening. 

Realizar conclusiones con autocritica.

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Aprender a manejar correctamente material biológico.

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Realizar una serie de reacciones químicas sencillas, en una muestra de fácil acceso como ser orina, que permiten, en forma cualitativa, detectar o sospechar la presencia de una enfermedad metabólica de origen genético.

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Fundamentos Teóricos Los errores congénitos del metabolismo (ECM) constituyen un conjunto de enfermedades que pueden manifestarse durante cualquier etapa de la vida, generalmente en los primeros meses de vida. Se conocen unos 4000 ECM, solamente en unos 50 de ellos se dispone de tratamiento efectivo que puede cambiar totalmente el pronóstico del paciente: del retraso mental severo y una muerte temprana a desarrollar una vida normal. Muchos de estos ECM no presentan signos y síntomas que permitan su detección precoz en el periodo neonatal por lo cual, se descubren tardíamente, muchas veces cuando los daños ya son irreversibles. Por ello, los programas apuntan a la detección precoz de ECM en los que se dispone de un tratamiento eficaz. En otros ECM (ej. distrofia muscular de Duchenne), solo se puede realizar consejo genético para prevenir nuevos niños afectados por lo cual está indicado realizar su detección en los padres y hermanos del afectado (por métodos de biología molecular que detectan mutaciones del gen afectado). Actividades 1) Características organolépticas y químicas de la orina. Las muestras de orina son evaluadas en cuanto a su color, olor y aspecto físico general. En algunos casos estos parámetros son de mucha utilidad. Se determina la densidad, el pH, las proteínas, la presencia de glucosa, las cetonas, etc., mediante el uso de una tira reactiva de tipo Multistix. 2) Determinación de cloruro férrico Fenilcetonuria La causa de la enfermedad es la carencia de la enzima fenilalanina hidroxilasa (FAOH) o de la dihidropterina reductasa (DHPR) (también llamada tirosina hidroxilasa). Ambas enzimas son responsables de la hidroxilación del aminoácido fenilalanina en la reacción que produce tirosina. El defecto o falta de alguna de ellas determina un incremento de la concentración sanguínea de fenilalanina al impedirse su transformación en tirosina. También se aumenta la transaminación de la fenilalanina como vía metabólica alternativa, y asimismo se acumulan los metabolitos fenilpiruvato, fenilactato y fenilacetato. El defecto en la síntesis de FAOH se debe a una anomalía génica localizada en el cromosoma12, y el de la DHPR en el cromosoma 4. Es una enfermedad infantil metabólica progresiva, severa, que puede producir retraso mental si no se trata a tiempo. Es una enfermedad hereditaria con carácter autosómico recesivo. Cuya incidencia es de un caso por cada 10.000–20.000 recién nacidos vivos. No hay distinción de sexos. Síntomas: Aunque los niveles de fenilalanina estén aumentados, el periodo neonatal cursa sin síntomas, pero en ausencia de tratamiento se llega un retraso mental permanente. Al año ya tienen retardo mental con irritabilidad.

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Otros hallazgos: 

Vómitos.

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Irritabilidad.



Piel seca, con frecuentes erupciones. Pelo claro.

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Orina de olor a “ratón”: los niños eliminan gran cantidad de ácido fenilpirúvico, que es un derivado del ácido acético que es el que secretan los roedores en su orina.



Convulsiones: sobre todo los más gravemente afectados.



El desarrollo físico y la estatura son normales. Pronóstico El adecuado diagnóstico y tratamiento permite un desarrollo físico e intelectual normal. Tratamiento Dieta estrictamente controlada. La dieta se debe planear con cuidado para permitir suficiente Fenilalanina para que el niño crezca normalmente, aunque no lo suficiente para producir los efectos peligrosos de la excesiva Fenilalanina. Alimentos ricos en fenilalanina

Alimentos pobres en fenilalanina

Leche materna

Vegetales

Leche de vaca

Frutas

Productos lácteos

Cereales

Carne, pescado y huevos

Legumbres

Aspartamo El bebé no puede ser amamantado ni recibir las fórmulas habituales para lactancia, pero existen fórmulas especiales que contienen los nutrientes necesarios para su desarrollo. La dieta se irá ajustando, bajo estricto control médico, a medida que crezca.

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Vías metabólicas de la fenilalanina:

Método El test de ClFe3 se utiliza para detectar ácido fenil pirúvico en orina, ya que con el Fe forma un quelato color verde. Reactivo: solución de ClFe3 al 10% en HCl 2N. Procedimiento: mezclar 1 ml de orina con 1 gota de Fe3Cl Positivo: verde intenso Interferencias: 

p-OH-fenil pirúvico: verde transiente (diferenciar con tirosinemia)



Acetoacetato: rojo amarronado



Cetoacidos de cadena ramificada: verde amarronado



Salicilatos: purpura

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Clorpromazina: gris verdoso. 3) Determinación de grupos tioles:

Cistinuria: es una enfermedad hereditaria de carácter autosómica recesiva. Esta enfermedad se produce a causa de mutaciones en genes ubicados en el brazo corto del cromosoma 2 y/o brazo largo del cromosoma 9. Como consecuencia de estas mutaciones se produce un defecto en proteínas transportadoras aminoácidos bibásicos (arginina, lisina, ornitina, cistina). En estos individuos los aminoácidos son filtrados pero no reabsorbidos a nivel tubular, por lo que se observan en orina. Aproximadamente 1 de cada 10,000 personas padece cistinuria. Se ha podido clasificar la enfermedad en tres tipos fenotípicos:

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1. Cistinuria de tipo A: causada por mutaciones en ambos alelos del gen SLC3A1 (localizado en el brazo corto del cromosoma 2). Los portadores de la enfermedad tienen unos niveles de aminoácidos en orina normales. 2. Cistinuria de tipo B: causada por mutaciones en ambos alelos del gen SLC7A9 (localizado en el brazo largo del cromosoma 9).Los portadores presentan elevación urinaria de cistina y aminoácidos básicos, pero en un 14% de los casos los aminoácidos urinarios pueden ser normales. 3. Cistinuria de tipo AB: causada por una mutación en SLC3A1 y otra mutación en SLC7A9. Este tipo es infrecuente.

Síntomas: La única manifestación clínica conocida de la cistinuria es la formación de cálculos de cistina en el riñón. El cálculo se forma por la excesiva concentración de cistina en la orina y a su gran insolubilidad sobre todo en orinas ácidas (pH urinario 5). Al ser una enfermedad hereditaria la tendencia a desarrollar cálculos en el riñón se mantiene toda la vida. Los pacientes pueden presentar crisis de dolor cólico (cólico nefrítico), obstrucción de la vía urinaria, hematuria,

infección urinaria debido a los cálculos,

pielonefritis aguda, sepsis. Al ser un tipo de litiasis que se reproduce con cierta facilidad, con el tiempo, algunos pacientes pueden desarrollar insuficiencia renal. Tratamiento: El objetivo del tratamiento es aliviar los síntomas y prevenir más cálculos. Una persona con síntomas intensos puede requerir hospitalización. El tratamiento consiste en tomar mucho líquido, particularmente agua, para producir grandes cantidades de orina. Mas 3litros/día. En algunos casos, es posible que se necesite la administración de líquidos por vía intravenosa. Se pueden prescribir medicamentos para ayudar a disolver los cristales de cistina. Asimismo, el hecho de consumir menos sal también puede disminuir la excreción de cistina y la formación de cálculos. Se pueden necesitar analgésicos para controlar el dolor en el área del riñón o la vejiga al eliminar los cálculos. Los cálculos más pequeños generalmente salen en la orina por sí solos, mientras que los cálculos grandes pueden necesitar extirpación con cirugía.

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Pronóstico La cistinuria es una afección crónica y de por vida. Los cálculos con frecuencia reaparecen. Sin embargo, esta afección rara vez ocasiona insuficiencia renal y no afecta a otros órganos. Posibles complicaciones     

Lesión vesical por cálculos Lesión renal por cálculos Infección renal Obstrucción ureteral Infección urinaria

Método: Reactivos: NH4OHcc (30% V/V) KCN 5% P/V en agua destilada (preparar en el momento de usar) Nitroprusiato de sodio al 5% P/V en agua destilada (preparar en el momento de usar) Procedimiento: 1ml de orina 2gotas de solución de NH4OH 0.5ml de la solución de KCN Agitar y dejar reposar 10 minutos a temperatura ambiente. Agregar 5gotas de nitroprusiato de sodio Atención! Respetar el orden de agregado los reactivos y NO agregar el cianuro de potasio antes del NH4OH por que se libera acido cianhídrico que es letal!!! Reacción positiva: color rojo-purpura (debido al color de los reactivos las trazas no se pueden detectar) Interferencias: cetonas Orinas normales muy concentradas (positivo débil)

4)

Azucares reductores: Test de Benedict Se detecta: glucosa, galactosa, fructosa, lactosa, manosa y xilulosa. La presencia de alguna de estas sustancias en orina pueden deberse a por

ejemplo: Compuesto

Patología

Glucosa:

Diabetes Síndrome de Fanconi

Galactosa

Galactosemia Enf. Hepática severa

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Fructosa

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Intolerancia Hereditaria Fructusuria Esencial

La galactosemia congénita es uno de los trastornos hereditarios más comunes del metabolismo de los glúcidos, en el cual se produce un aumento de los niveles en la sangre y en otros tejidos del monosacárido galactosa o de sus metabolitos. La galactosemia está asociada a las siguientes deficiencias enzimáticas: 1°) Galactocinasa (GALK), que convierte galactosa en galactosa-1-fosfato, no es un trastorno frecuente. 2°) Uridinadifosfogalactosa-4-epimerasa (GALE), convierte UDPgalactosa en UDPglucosa, tambien es infrecuente. 3°) Galactosa-1-fosfato uridiltransferasa (GALT), es responsable de la galactosemia más frecuente y grave. Esta enzima cataliza la conversion de galactosa-1-fosfato en UDPgalactosa y UDPglucosa en glucosa-1-fosfato. Galactosemia por déficit de galactocinasa (GALK) Este trastorno presenta como signos principales galactosemia y galactosuria, pero lo que lo caracteriza fundamentalmente es la formación de cataratas a muy temprana edad, los enfermos no tienen retraso mental ni aminoaciduria y son por lo demás normales. Cuando la dieta contiene galactosa, como ocurre en el lactante de pocas semanas, en el cual aproximadamente un 20 % de su ingreso energético proviene de la lactosa, tanto para el que se alimenta al pecho como el que recibe una fórmula que contenga lactosa, se empiezan a formar cataratas desde el comienzo de su alimentación. Por lo tanto el mejor tratamiento es la prevención, retirando la galactosa de su dieta. La galactocinasa produce la fosforilación de la galactosa convirtiéndola en galactosa -1- fosfato, al no tener actividad esta enzima, el exceso de galactosa se convierte en el alcohol galactitol, que es el responsable de la formación de cataratas. La herencia es autosómica recesiva, por lo tanto los padres y hermanos heterocigotos pueden tener valores intermedios en la actividad enzimática pero sin manifestaciones de la enfermedad. El locus correspondiente de la enzima galactocinasa (GALK), está situado en el brazo largo del cromosoma 17. El tratamiento consiste en establecer una dieta sin galactosa después del nacimiento, en cuanto se establezca el diagnóstico, y este tratamiento realizado precozmente, evita la formación de cataratas, el pronóstico es bueno ya que no presenta además otras alteraciones. Se puede sospechar la enfermedad en los hermanos menores del enfermo, lo que permite el diagnostico precoz. Galactosemia por déficit de uridina difosfogalactosa-4-epimerasa (GALE) Esta enzima convierte UDPgalactosa en UDPglucosa y su locus se situa en el cromosoma 1.Existen dos formas clínicas de este trastorno metabólico, según el déficit de la epimerasa sea generalizado o no. En la forma benigna el paciente no presenta manifestaciones clínicas; no hay hepatomegalia, ni cataratas, ni signos neurológicos, detectándose la enfermedad por el screening neonatal, al encontrarse niveles sanguíneos elevados de galactosa-1-fosfato en los eritrocitos, siendo normal la actividad de la uridiltransferasa y de la galactocinasa. Estos niños no tienen problemas de crecimiento y desarrollo y su evolución puede ser normal aun sin restricciones en la dieta. En la forma grave, hay un déficit generalizado en la actividad de la epimerasa, en estos casos la actividad de la enzima se mide en los fibroblastos, además de en los

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hematíes, leucocitos y linfocitos, dando por lo general valores de actividad inferiores al 10%.El cuadro clínico y su evolución son similares a los de la forma clásica por deficiencia de uridiltransferasa y entonces presentan intolerancia a la galactosa, con hepatomegalia, ictericia, retraso mental, cataratas, proteinuria y la presencia de galactosa en la orina. La deficiencia de uridina difosfogalactosa es de herencia autosomica recesiva, y la actividad de la enzima en los padres o hermanos heterocigotos portadores de los sujetos afectados, es del 50%. La diferencia entre estas 2 formas clínicas de déficit de epimerasa, se puede explicar, por la diferente afectación en la expresión en los distintos tejidos. Debe pensarse en la posibilidad de este defecto en los enfermos con síntomas y signos de la forma clásica, pero con actividad normal de la transferasa.

Galactosemia por déficit de galactosa-1-fosfato uridil transferasa En esta grave enfermedad, también llamada galactosemia clásica, los síntomas comienzan precozmente, hay un déficit en la actividad de la enzima galactosa-1fosfato uridiltransferasa, cuya función es catalizar la conversión de galactosa-1-fosfato en glucosa-1-fosfato y UDPglucosa en UDPgalactosa. Estos pacientes manifiestan una anormal tolerancia a la galactosa. Frecuencia Es la más frecuente de las galactosemias, siendo aproximadamente de 1 caso cada 70.000 en el Reino Unido, 1 caso cada 60.000 en los EE.UU, de 1 caso cada 30.000 en Irlanda, y en una etnia irlandesa conocida como The Travelers, la frecuencia de la mutación genética que origina la enfermedad es unas 60 veces mayor que la del resto de la población irlandesa. La enfermedad es mucho menos frecuente en los negros y asiáticos. Afecta por igual a ambos sexos. Clínica Normalmente la galactosa-1-fosfato producida por la fosforilación de la galactosa, mediada por la galactocinasa, es metabolizada a glucosa-1-fosfato a través de la enzima Galactosa- 1-fosfato uridiltransferasa (GALT). La enzima GALT se une en cantidades equimolares a la uridina difosfato (UDP) glucosa para formar como intermediario GALT enzima-UDPglucosa, la glucosa -1-fosfato es liberada entonces, quedando GALT-uridina monofosfato, luego galactosa- 1-fosfato se une al complejo GALT-uridina monofosfato para formar GALT-UDPgalactosa, luego UDPgalactosa es liberada y GALT queda disponible para iniciar una nueva reacción. Al faltar GALT, no se puede metabolizar la galactosa-1-fosfato, que entonces se acumula en los distintos tejidos, principalmente hígado, riñón y cerebro, como el feto afectado no posee la enzima o es inactiva, cuando la madre es heterocigota para este defecto, metaboliza con dificultad la galactosa-1-fosfato, por lo que la enfermedad puede comenzar antes de nacer. Los recién nacidos, lactantes o niños pueden presentar todos o algunos de los siguientes signos: dificultad para alimentarse, vómitos, letargia, irritabilidad, hipoglucemia, convulsiones, ictericia, hepatomegalia, esplenomegalia, ascitis, falta de aumento de peso, cataratas, aminoaciduria y retraso mental. Los síntomas comienzan típicamente alrededor del tercer día de vida, y el diagnóstico se realiza habitualmente dentro de las dos primeras semanas de vida, a través del screening neonatal. Si el diagnóstico no se hace precozmente, las lesiones hepática y cerebral se agravan cada día y se vuelven irreversibles. La ingesta de galactosa aumenta los niveles de galactosa-1-fosfato en los tejidos y ésta actúa como inhibidor competitivo de la enzima fosfoglucomutasa, que cataliza la

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conversión de glucosa-1-fosfato en glucosa-6-fosfato que es la vía de conversión del glucógeno en glucosa, produciendo por lo tanto hipoglucemia. La galactosa-1-fosfato es hepatotóxica y produce lesión cerebral por acción directa o por la hipoglucemia. Parte del exceso de galactosa remanente se transforma en galactitol y produce cataratas como en el déficit de galactocinasa (GALK). Los estudios anatomopatológicos con microscopía óptica y electrónica del hígado, revelan sucesivamente: infiltración grasa, formación de pseudoacinos y finalmente cirrosis macronodular con hipertensión portal. Esta evolución lleva a un cuadro de insuficiencia hepática con sangrado por coagulopatía, en algunos niños se han producido hemorragias del humor vítreo. Igualmente se puede detectar ascitis desde la más temprana infancia, incluso en los primeros días de vida. La galactosemia tiene una alta mortalidad en el recién nacido, sobre todo por la insuficiencia hepática y también por ser una frecuente causa de sepsis neonatal, especialmente debida a E. Coli. Siempre debe ser tenida en cuenta la galactosemia en los diagnósticos diferenciales de la sepsis del recién nacido. FRUCTOSURIA ESCENCIAL La fructosuria benigna es, como su nombre indica, un trastorno leve, sin repercusión clínica, de hallazgo casual en la determinación de cuerpos reductores en orina (por ello su incidencia es desconocida). No está indicado tratamiento médico ni dietético y su pronóstico es excelente. Método: Reactivos: reactivo de Benedict: SO4Cu 1.73% P/V, citrato de sodio 1.73% P/V, carbonato de sodio anhídrido 10%P/V. Procedimiento: 2,5 ml reactivo de Benedict 5gotas de orina Agitar y llevar a ebullición durante 5 minutos Reacción Positiva: color marrón (marrón verdoso) Interferencias: sustancias reductoras como Ac. Siálico, homogentísico, Ampicilina, cefalosporinas (color marrón oscuro)

5) Determinación de Acido MetilMalónico: La aciduria metilmalónica es una enfermedad que se debe a defectos en el fermento metilmalonil -Coenzima A- mutasa que da lugar a que se presente la reacción química que transforma el ácido metilmalónico en ácido succínico. En esta reacción química se puede detectar que está presente la vitamina B12. Es un trastorno metabólico hereditario, normalmente diagnosticado en la infancia, que ocasiona la acumulación de ácido metilmalónico en el cuerpo y que puede conducir a problemas metabólicos graves. La AMM es un error innato del metabolismo del propionato, que pertenece al grupo de las acidemias orgánicas. Esta patología junto con la acidemia propiónica, son los desórdenes más comunes del metabolismo de los ácidos orgánicos. Una característica de la AMM es que se hereda de forma autosómica recesiva. Es un defecto en la conversión de metilmalonil CoA a succinil CoA; esta reacción es catalizada por la enzima metilmalonil-CoA mutasa, la cual requiere un cofactor que es

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la vitamina desoxiadenosilcobalamina (B12). Los pacientes con AMM aislada se clasifican en tres formas: a) los que presentan un defecto que ocasiona una actividad reducida de la apoenzima (mut-); b) los que carecen totalmente de actividad (mut 0); c) los que tienen un defecto en el metabolismo de la vitamina B12 (cblA o cblB). Los pacientes con un defecto en la síntesis de B12 frecuentemente responden al tratamiento con dosis farmacológicas de hidroxicobalamina (1-2 mg/día por 2 semanas), lo que reduce la excreción de ácido metilmalónico. Los defectos del metabolismo de la cobalamina que afectan la síntesis de ambos, del desoxiadenosil y de la metilcobalamina (cblC, cblD y cblF) se caracterizan por cursar con acidemia metilmalónica y homocistinemia. Los aminoácidos de cadena ramificada como la leucina, la isoleucina y la valina así como la metionina, la treonina, la timina y los ácidos grasos de cadena impar, son precursores del propionil-CoA, que es el sustrato que origina al ácido metilmalónico, por lo cual el tratamiento fundamental de la AMM consiste en la restricción de dichos precursores en la alimentación. El ácido metilmalónico se produce dentro de la célula y es captado por difusión a nivel extracelular, por lo que el exceso se puede detectar en la sangre, el líquido cefalorraquídeo y la orina. Cuando esta enfermedad se presenta en el período neonatal suele originar un fenotipo severo, generalmente catastrófico en la primera semana de vida y en una gran proporción, en el segundo día de vida. Los síntomas más frecuentes en este período son: rechazo al alimento, retraso del desarrollo, vómito recurrente, dificultad respiratoria, hipotonía muscular, letargia, hepatomegalia y deshidratación. Entre las alteraciones bioquímicas se encuentran: hipoglucemia, acidosis metabólica, hiperamonemia, hiperglicinemia y glicinuria; en la biometría hemática, leucopenia, anemia y trombocitopenia.

Método: Reactivos: p-nitroanilina 0.1%P/V en HCl 0.16N Nitrito de sodio 0.5%P/V Buffer acetato de sodio/acido acético 1M, pH 4,3 NaOH 8N Standard de MMA 0.025M Procedimiento: 1gota de muestra 15 gotas de p-nitroanilina 5gotas de nitrito de sodio Agitar para decolorar y agregar 20gotas del buffer acetato de sodio Llevar a ebullición durante 1 min. Agregar 5gotas de NaOH 8N Hacer un blanco de H2O y control positivo con el standart de MMA. Reacción Positiva: color verde esmeralda (estable 15 min). El color de la orina normal es marrón claro.

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Informe: 1) Interpretar los resultados obtenidos con las patologías asociadas en cada caso, fundamentándose en el material dado durante las clases teoricas.

2) ¿Se confirman los resultados esperados? Analice las posibles causas de error.

Bibliografía:  Colombo M, Cornejo V, Raimann E., editoras. Errores innatos en el metabolismo del niño. Santiago: Editorial Universitaria; 2003. p.607622 INTA  RAIMANN E, CORNEJO V Espectrometría de masa en tándem, una nueva técnica para la pesquisa neonatal. Rev Pediatría (Santiago) 2002; 45: 26-29 (9 ref)  Thomson Melnes Willard : Genetics in Medicine. W. B. Saunders Company, 1991.  Asociación de Asistencia al Fenilcetonúrico, PKU Argentina.

Alumno: .......................................... Comisión Nº: ...... Grupo: ...... Fecha: ..../..../....

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