Q QU UIIM MIIC CA AB BIIO OLLO OG GIIC CA A IIII Laboratorio Nº 1 Tema: EVALUACIÓN DEL EFECTO DEL FLUORURO COMO INHIBIDOR DE LA GLUCÓLISIS ANAERÓBICA Contenidos conceptuales: Glucólisis. anaeróbicas. Inhibidores.
Etapas.
Glucólisis en condiciones
Contenidos procedimentales: Toma de muestra de sangre por venipuntura. Determinación enzimática de glucosa en suero y plasma por métodos colorimétricos, con y sin inhibidor de glucólisis a diferentes tiempos. Contenidos actitudinales: Integración en trabajo grupal. Predisposición para la resolución de problemas con espíritu crítico y rigor científico. Bioseguridad en el laboratorio. Autoconfianza. Precisión, sistematización y coherencia en los planteamientos. Responsabilidad para con las tareas encomendadas. Objetivos: Adquirir destreza en venipunturas. Verificar el efecto del inhibidor F– en la vía glucolítica.
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Fundamentos Teóricos El uso de inhibidores enzimáticos ha posibilitado el estudio de secuencias específicas y de metabolitos intermedios. Cuando una enzima es inhibida, se establece un bloqueo o interrupción de una vía metabólica, se acumula el sustrato correspondiente de esa enzima, y eventualmente otros intermediarios que preceden a la reacción bloqueada. Además, puede ocurrir con frecuencia la falta de síntesis final de compuestos vitales para las células (Ej. ATP), lo que en última instancia conduce a la muerte celular. ENZIMA
INHIBIDOR
MECANISMO DE INHIBICIÓN
Compuestos sulfhidrilos, fenilalanina
Hexoquinasa (HK)
EDTA, citrato, oxalato
Complejación
Glucoquinasa (GK)
EDTA, citrato, oxalato
Complejación
Fosfofructoquinasa I (PFK I)
ATP, ácidos grasos de cadena larga, fenilalanina
Condiciones energéticas elevadas
Citrato
Complejación
Metales pesados (arsénico, mercurio)
Proceso fosfolítico inhibido por arseniato que compite con el fosfato inorgánico
Agentes alquilantes (yodoacetato)
Bloqueo del sitio activo
Fluoruro
Formación del complejo fluorfosfato de magnesio
Calcio
Formación de un complejo inactivo por competencia 2+ 2+ con Mg y Mn
ATP, AG de cadena larga, alanina, acetilCoA
Condiciones energéticas elevadas
Citrato
Complejación
Glucagón y adrenalina
Fosforilación
Gliceraldehído-3-fosfatodeshidrogenasa (G3PD)
Enolasa
Piruvatoquinasa (PK)
PK hepática
PK muscular Lactato deshidrogenasa (LDH)
Fenilalanina Piruvato en altas concentraciones
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Esquema de la vía glucolítica:
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El uso de inhibidores naturales de tipo metabólico o artificiales con reacciones espontáneas no enzimáticas puede constituir una herramienta para el estudio de los metabolismos celulares. Nota: La glucemia disminuye un 30% por hora sino se conserva la muestra con inhibidor, debido a que los eritrocitos consumen glucosa. Materiales y métodos
Gradillas
Guantes descartables
Marcador
Jeringas de 5 ml y agujas para venipuntura de 23/8” (estériles, descartables)
Centrífuga
Baño a 37° C
Micropipeta automática de 10 μl
Pipetas de vidrio de 1 ml
Propipetas
Kit de reactivos para determinación de glucemia
Lazo de goma
Alcohol y algodón
Anticoagulante EDTA-F-
Anticoagulante Heparina
Descartador de agujas
Lavandina
Reloj o timer
Tubos de hemólisis
Espectrofotómetro
Precauciones:
Las muestras se tomarán siguiendo las normas de bioseguridad; con guantes, jeringas y agujas descartables bajo la supervisión de los docentes.
Las muestras de sangre se recogerán con anticoagulante heparina, EDTA-F– comercial y sin anticoagulante. Esta se colocará en baño a 37° C hasta retracción del coágulo; luego se centrifugará 5 minutos a 1000 rpm, y por último se separará la mitad del suero en otro tubo, dejando el resto con el paquete globular. A. Tubo 1: Suero B. Tubo 2: Suero + Paquete globular C. Tubo 3: Plasma con Heparina + Paquete globular. Proporción: 50 l de Heparina para un máximo de 5 ml de sangre D. Tubo 4: Plasma con EDTA-F– + Paquete globular. Proporción: 20 l de EDTA-F- para un máximo de 2,5 ml de sangre, o 50 l de EDTA-F- para un máximo de 7 ml de sangre.
Cada comisión realizará los pipeteos utilizando la misma micropipeta, con el mismo tipo de tip (punta de pipeta), y si es posible debe ser llevada a cabo por el mismo operador.
Cada comisión realizará las diferentes incubaciones en el mismo baño de agua.
Cada comisión llevará a cabo las lecturas en el mismo espectrofotómetro y utilizando la misma celda.
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Método Determinación de glucemia (método enzimático) Fundamento: Glucosa + O2 + H2O
GOD
2 H2O2 + 4-AF + fenol
POD
ác. glucónico + H2O2 quinonimina roja + 4 H2O
Ref.: GOD: Glucosa-oxidasa; 4-AF: 4-amino-fenazona; POD: peroxidasa
Procedimiento:
Estándar Muestra Reactivo
B 1 ml
S 10 ul 1 ml
D 10 ul 1 ml
Incubar 5 minutos en baño de agua a 37° C o 25 minutos a 15-25° C. Luego leer en espectrofotómetro a 505 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (490-530 nm), llevando el aparato a cero con el blanco. Estabilidad de la mezcla de reacción final: El color de reacción final es estable 30 minutos, por lo que la absorbancia debe ser leída dentro de este lapso. Cálculo de los resultados:
[Glc] (g/l) = AD x [S] AS
[S] = 1.00 g/l Ref.: Glc: Glucosa; D: Muestra; S: Estándar
Valores de referencia de glucemia en ayunas para el método enzimático: 0,7-1,1g/l. Experiencia:
Determinar glucemia basal en todas las muestras.
Determinar glucemia a la hora y 2 horas de realizada la extracción en todas las muestras.
Informe Basal (Hora:
:
)
1hora (Hora:
:
)
2 horas (Hora:
:
)
Absorbancia Concentración Absorbancia Concentración Absorbancia Concentración S 1 2 3 4
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Conclusiones: 1) ¿Qué diferencia espera de la absorbancia entre las muestras con y sin agregado del inhibidor? ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... 2) ¿Se confirman los resultados esperados? Analice las posibles causas de error. Tubo 1: ............................................................................................................................. Tubo 2: ............................................................................................................................. Tubo 3:.............................................................................................................................. Tubo 4:.............................................................................................................................. 3) Calcule el porcentaje de variación de la glucemia en las muestras a diferentes tiempos y complete la siguiente tabla, eligiendo la Condición de acuerdo a la validez y comparabilidad de las lecturas para los diferentes tubos en dos tiempos, p. ej. [(Basal2da hora)/Basal] x 100, o [(Basal-1ra hora)/Basal] x 100. Tubo n°
Condición
% de variación
Bibliografía: - Bioquímica de Harper. Murray R. B. 17ma edición. Editorial Manual Moderno. 2007. - Bioquímica. Roscoski. Ed. Mc. Graw Hill. 3ra edición. 2000. Capítulo 25. - Química Biológica. Blanco A. 9na edición. Editorial El Ateneo. 2011.
Alumno: .......................................... Comisión Nº: ...... Grupo: ...... Fecha: ..../..../....
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