Laboratorio Nº 3-2

Tema: METABOLISMO DE PURINAS: DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE ÁCIDO ÚRICO. Contenidos conceptuales: Catabolismo de purinas. Formación de ácido úrico. Gota. Contenidos procedimentales: Toma de muestra de sangre por venipuntura. Desarrollo del método enzimático específico para la determinación cuantitativa de ácido úrico en muestras de sangre y orina. Contenidos actitudinales: Integración en trabajo grupal. Predisposición para la resolución de problemas con espíritu crítico y rigor científico. Bioseguridad en el laboratorio. Autoconfianza. Precisión, sistematización y coherencia en los planteamientos. Responsabilidad para con las tareas encomendadas. Objetivos:  Adquirir destreza en venipunturas.  Comprender un método de determinación cuantitativa (dosaje) de ácido úrico en muestras humanas normales y en muestras de pacientes con alteraciones fisiológicas y patológicas en el metabolismo de purinas.

Fundamentos Teóricos En el hombre, el producto final del catabolismo de purinas es el ácido úrico. Un adulto normal produce unos 500 mg de ácido úrico por día. Aproximadamente 80% de esa cantidad es excretado por orina: el resto se degrada y es eliminado como CO2 y NH3 o urea. En el plasma normal, el ácido úrico alcanza una concentración de 4 a 6 mg por dl. Los varones tienen niveles 1 mg por dl más altos que las mujeres; esta diferencia desaparece después de los 45-50 años de edad. El pKa del grupo -OH unido al carbono 8 del ácido úrico tiene un valor de 5,75; al pH de la sangre normal, la mayor parte del ácido úrico libera el protón de ese grupo y se ioniza a urato. A pH 5,75 existen cantidades iguales de las formas protonada y desprotonada (ácido úrico y urato), mientras a pH menor predomina ácido úrico (no ionizado). Cuando la orina se acidifica, aumenta la proporción de ácido úrico y este tiende a precipitar; en cambio, si se alcaliniza es posible vehiculizar mayor cantidad de este compuesto en forma de urato, diecisiete veces más soluble en agua. El urato filtra en glomérulos renales y es parcialmente reabsorbido en túbulos proximal y distal. También es secretado en túbulo proximal y asa de Henle. Normalmente se eliminan, término medio, unos 400 mg cada 24 horas. Existen fármacos que bloquean la reabsorción tubular de uratos y, por lo tanto, incrementan su eliminación por orina. Entre esas drogas uricosúricas se cuentan salicilato, cincofenos y probenecid. La excreción urinaria de uratos también es aumentada por hormonas de corteza suprarrenal. Cuando se ingieren dietas ricas en ácidos nucleicos aumenta el ingreso de purinas y, en consecuencia, se incrementa la producción de ácido úrico y la excreción de uratos por orina. Son ricos en nucleoproteínas y, por lo tanto, en bases púricas: carne, vísceras, tejidos glandulares, extracto de carne, legumbres, hongos y espinaca. Café, cacao, té, mate y bebidas carbonatadas a base de cola contienen cafeínas, una purina metilada.

Química Biológica II FACENA, UNNE

Laboratorio Nº 3-2 2013

La máxima cantidad de urato que puede disolverse en plasma a 37° C es de 7 mg por dl, razón por la cual cuando se excede este nivel los uratos tienden a precipitar. La gota es una enfermedad caracterizada por niveles elevados de ácido úrico en sangre (hiperuricemia) y en orina (uricosuria). La gota primaria es un trastorno metabólico de origen genético. Hay producción excesiva o excreción urinaria deficiente de ácido úrico. Existe una gota secundaria a las hiperuricemias que acompañan a la insuficiencia renal crónica, leucemias y otros procesos con proliferación celular tratados con quimioterapia. Se produce frecuentemente en la ingesta excesiva de alcohol.

Materiales y métodos Equipamiento necesario:  Micropipetas  Espectrofotómetro  Baño termostatizado  Timers  Muestras de sueros humanos normales y patológicas. Precauciones 

Cada comisión realizará los pipeteos utilizando la misma micropipeta, con el mismo tipo de tip (punta de pipeta), y si es posible debe ser llevada a cabo por el mismo operador.



Cada comisión realizará las diferentes incubaciones en el mismo baño de agua.



Cada comisión llevará a cabo las lecturas en el mismo espectrofotómetro y utilizando la misma celda.

MUESTRA Suero, plasma u orina a) Recolección: se debe obtener suero o plasma de la manera usual. Separar el coágulo lo antes posible, dentro de las dos horas posteriores a la recolección. Si la muestra es orina, utilizar preferentemente fresca. b) Aditivos: en caso de que la muestra a emplear sea plasma, se recomienda únicamente el uso de heparina como anticoagulante para su obtención. c) Sustancias interferentes conocidas: - Medicamentos: las sustancias fuertemente reductoras, tales como el ácido ascórbico (vitamina C), la Buscapina (butilbromuro de hioscina), etc. en dosis elevadas interfieren. Por tal razón debe suspenderse la medicación, siempre que sea posible, 24 horas antes de la toma de muestra. - No se observan interferencias por bilirrubina hasta 10 mg/dl (100 mg/l), triglicéridos hasta 490 mg/dl (4,9 g/l).

2

Química Biológica II

Laboratorio Nº 3-2

FACENA, UNNE

2013

MÉTODO Determinación de ácido úrico (método enzimático)

Fundamento: ácido úrico + 2 H2O2 + O2 2 H2O2 + 4-AF + 3,5-DHS

UOD

POD

alantoína + CO2 quinonimina roja

La cantidad de ácido úrico se determina midiendo la absorbancia de este pigmento. Ref.: UOD: urato oxidasa o uricasa; POD: peroxidasa; 4-AF: 4-aminofenazona; 3,5-DHS: sal sódica de 3,5-diclorohidroxibencenosulfónico. REACTIVOS Estándar (S): solución de ácido úrico 10 mg/dl. Reactivo A: solución que contiene buffer Good pH 7,8 y sal sódica de 3,5-DHS. Reactivo B: solución que contiene buffer Good pH 7,8, 4-AF, UOD, POD y ferricianuro de potasio. Los Reactivos A y B pueden usarse separados o como Reactivo único mezclando 4 partes de Reactivo A + 1 parte de reactivo B. Procedimiento: TÉCNICA EN SUERO

Estándar o Calibrador Muestra Reactivo A Reactivo B

B -

S 20 ul

D -

800 ul 200 ul

800 ul 200 ul

20 ul 800 ul 200 ul

Ref.: B: Blanco; S: Estándar; D: Muestra o Desconocido. Mezclar suavemente e incubar 5 minutos en baño de agua a 37° C o 20 minutos a temperatura ambiente. Retirar, enfriar y leer en espectrofotómetro a 505 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (490-530 nm), llevando el aparato a cero con el blanco. TÉCNICA EN ORINA Utilizar la misma técnica diluyendo la orina 1/10 con agua o solución fisiológica. Para el cálculo de los resultados, multiplicar por el factor de dilución utilizado. Estabilidad de la mezcla de reacción final: El color de reacción final es estable 30 minutos, por lo que la absorbancia debe ser leída dentro de este lapso. Cálculo de los resultados: [ácido úrico] (mg/l) = AD x f

f = 10 mg/dl S

Ref.: D: Muestra; S: Estándar

3

Química Biológica II FACENA, UNNE

Laboratorio Nº 3-2 2013

Valores de referencia: Suero o plasma Hombres: 3,5-7,2 mg/dl Mujeres: 2,6-6,0 mg/dl

Orina: 250 a 750 mg/24 horas

INFORME Absorbancia de la/s muestra/s (D): ..................... Concentración de ácido úrico en la/s muestra/s: Ácido úrico (mg/dl): ……………………

Bibliografía: - Bioquímica Ilustrada de Harper. Murray R. 28va edición. Editorial Mc Graw-Hill. 2010. - Química Biológica. Blanco A. 9na edición. Editorial El Ateneo. 2011. - Vademecum Wiener 2013. Wiener Laboratorios. Rosario, Argentina. 2013.

Alumno: .......................................... Comisión Nº: ...... Grupo: ...... Fecha: ..../..../....

4