Tecnología del ADN recombinante.

Genética molecular procariota Principios de regulación. Ejemplos.

La célula procariótica es más sencilla

Las células de plantas y animales son diferentes

La mayoría de los genes procarióticos se encuentran en operones

Operón: Unidad de expresión y regulación de genes bacterianos

El operón lac es inducible Los operones comprenden 3 secuencias: Promotor Operador Genes estructurales La proteína represora funciona hasta que se liga al inductor Silencia la ruta hasta que aparece el sustrato adecuado

El operón trp es reprimible Este operón es reprimible. El represor está inactivo hasta que se une al correpresor (en este caso, triptofano) Regula el exceso de producción

Genética molecular eucariota Principales diferencias con procariotas.

El genoma eucariótica está empaquetado en cromosomas

Las proteínas asociadas al ADN se llaman histonas (nucleosoma)

Muchos genes eucarióticos tienen intrones, que deben eliminarse •Intrón: Segmento de DNA que es transcripto a RNA, pero es eliminado enzimáticamente de esta última molécula para dar el RNA maduro •Exón: Segmento de DNA de un gen interrumpido que está presente en el RNA maduro.

En eucariotas están implicadas tres ARN polimerasas. La ARN polimerasa II se encarga de transcribir proteínas El corte y empalme se hace por un complejo enzimàtico propio de eucariotas (spliceosoma)

Los eucariotas tienen al menos 2 (dos) genomas por célula

Los genomas de las organelas son circulares, no tienen telómeros

El ARN mensajero eucariota sufre diversos procesamientos

Se agrega una cubierta 5´ (CAP) 7-metil guanina (unión a ribosoma y protección del ARNm

Se pueden producir diferentes variantes al eliminar diferentes exones

El ARN mensajero eucariota sufre diversos procesamientos

Se agrega una cola de poli A (para la exportación al citoplasma)

La transcripción en procariotas y en eucariotas requiere de promotores

Procariota

Eucariota

Sin estas secuencias, la maquinaria no reconoce el comienzo de los genes

La transcripción en eucariotas es un proceso mucho más complejo

No existen operones. Hay 3 tipos de ARN polimerasas Se requieren muchos factores generales de transcripción Se requieren secuencias intensificadoras (enhancers)

Resumen de las principales diferencias En procariotas existen operones
El genoma eucariota está en el núcleo
Muchos genes eucariotas tienen intrones
EL ARNm eucariota sufre diversos procesamientos
Los procariotas no pueden remover intrones
La transcripción es similar, pero las secuencias reconocidas son diferentes


La tecnología del ADN recombinante Herramientas y metodologías

El ADN ¿Qué propiedades permiten el funcionamiento de la tecnología del ADN recombinante?

La complementariedad de bases es clave en la función del ADN

Surco mayor

Surco menor

El modelo explica: dirección, secuencia y transmisión de información.

La continuidad de la vida reside en la molécula de ADN

La secuencia de ADN codifica la estructura proteica

Todos los fragmentos de ADN pueden separarse por electroforesis

Las herramientas que se usan son enzimas de funciones simples

Realizan funciones químicas, pero se las puede imaginar como herramientas de procesadores de textos

Las enzimas de restricción cortan el ADN en secuencias precisas Estas enzimas son tijeras inteligentes que reconocen palíndromos y pueden cortar produciendo extremos romos o cohesivos.

La frecuencia de corte es 1cada 4n

La ADN ligasa actúa uniendo fragmentos de ADN

Los fragmentos de ADN DEBEN tener extremos cohesivos para que este enzima funcione.

La ADN polimerasa actúa copiando las secuencias que nos interesan

La polimerasa sintetiza sólo en una dirección y necesita de extremos libres para poder funcionar

La transriptasa reversa hace ARN a partir de ADN

Proviene de un retrovirus y se usa principalmente para pasa de ARNm o ARNc a ADN. Las otras enzimas trabajan con ADN.

La clonación y la transformación Técnicas básicas

Transformación La base de los transgénicos es la tecnología de transformación: Captación de genes exógenos

La transformación es la incorporación de ADN a la célula

En bacterias se da por infección con virus, conjugación, electroporación, etc

La transformación en eucariotas se hace mediante disparos, inyección o virus

En humanos se utilizan adenovirus o inyecciones mediante micromanipuladores.

En plantas, el mayor vector proviene de Agrobacterium tumefaciens. Agrobacteium produce tumores de crecimiento descontrolado en la base o tallo de muchas plantas

La bacteria infecta a la planta y parte del plásmido Ti se inserta en el genoma de la planta

Las células vegetales transformadas son convertidas en plantas completas

La clonación En tecnología de ADN recombinante es la obtención de grandes números de copias por replicaciones sucesivas

La unión de fragmentos de ADN de diferentes orígenes se denomina quimera Al introducir un gen en un genoma más pequeño, se pueden obtener múltiples copias del mismo, lo que facilita su estudio.

A este proceso se le llama clonación

Los vectores son los vehículos de la clonación

Plásmidos Son casi mini-cromosomas Suelen incluir genes de resistencia Se consiguen entre 20 y 1000 copias por célula

Bacteriófago lambda Permiten clonar fragmentos mayores La transformación es más eficiente Se consiguen entre 20 y 1000 copias por célula

Resumen de la estrategia básica de clonación en plásmidos 1) Corte con enzimas de restricción 2) Ligación (Quimera) 3) Transformación

4) Amplificación

Actualmente, la clonación casi no se usa para amplificar secuencias


La clonación actualmente se emplea en:    

El mantenimiento de secuencias largas La expresión en vectores de expresión Estudios de complementación o de ganancia de funciones Algunas estrategias de evolución dirigida

En muchos estudios, el primer paso es la construcción de bibliotecas génicas Una biblioteca es una colección de clones obtenidos de cualquier manera La complementación es la recuperación de una función perdida La ganancia de funciones es la aparición de funciones nuevas

Las proteínas también puede usarse para detectar el clon correcto Si la proteína quimérica puede expresarse, esta puede ser detectada mediante anticuerpos monoclonales.

Es necesario utilizar anticuerpos ya que las proteínas no hibridan entre sí.

Lo más complicado de los procesos de clonación es la identificación de los genes de interés y luego de los organismos transformantes.

¿Cómo se crea un transgénico?







Se busca el gen de interés (por el estudio de rutas metabólicas implicadas) Se lo aísla (mediante biblioteca) Se realiza una clonación para amplificarlo (puede incluir varias transformaciones y clonaciones) Se transforma al organismo deseado Se seleccionan aquellos transformantes útiles Se reproducen los organismos de interés