Rev. Salud Anim. Vol. 28 No. 3 (2006): 158-161

Comunicación corta

EVALUACIÓN DE DIFERENTES MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE ARN PARA LA DETECCIÓN DE VIRUS DE INFLUENZA TIPO A POR RT-PCR Ana María Acevedo, Heidy Díaz de Arce, A.Vega, Julia Noda y Maritza Barrera Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria, Apartado 10, San José de las Lajas, La Habana, Cuba. Correo electrónico: [email protected]

RESUMEN: La Influenza aviar es una enfermedad viral que afecta a la industria avícola de todo el mundo. Como parte del Programa Nacional de Enfrentamiento a esta entidad se trabajó en la evaluación de tres métodos de extracción de ARN para la detección de virus de influenza aviar en muestras clínicas, con el fin de perfeccionar el sistema de diagnóstico para la detección más rápida y específica de este virus. Se detectó influenza aviar tipo A directamente de muestras clínicas sin el paso de concentración por ultracentrifugación, empleando el método de extracción del ARN viral que utiliza el reactivo Tripure, lo que permite reducir el tiempo de obtención del resultado del diagnóstico, aspecto muy importante para la toma de medidas de control rápidas para evitar la diseminación del virus. (Palabras clave: influenza aviar; RT-PCR)

EVALUATION OF DIFFERENT RNA EXTRACTION METHODS FOR DETECTION OF TYPE A AVIAN INFLUENZA BY RT-PCR ABSTRACT: Avian influenza is a viral disease affecting the poultry industry from all over the world. As part of the National Program for that disease, three RNA extraction methods were evaluated for detection of Type A avian influenza in clinical samples, with the objective to improve the diagnostic system for faster and specific identification of this virus. We detected Type A avian influenza directly from clinical samples without concentration sample by ultracentrifugation, employing RNA extraction by Tripure method. It permits to reduce the time for obtaining the diagnostic result, which is a very important aspect for taking rapid control measures to avoid virus dissemination. (Key words: avian influenza; RT-PCR)

La Influenza aviar notificable (IAN) es causada por una infección con virus de la familia Orthomyxoviridae del género influenzavirus A (4). En los últimos 5 años se han incrementado los brotes producidos por estos virus. A partir del 2003, el subtipo H5N1 ha provocado pérdidas millonarias en las aves con el agravante de su transmisión a humanos (2; 13; 7). Esta situación, que se ha presentado a nivel mundial, nos alerta sobre la amenaza que existe de una pandemia, por lo que es indispensable el desarrollo de métodos de diagnóstico rápidos, sensibles y

específicos para la detección del virus. El ensayo de la RT-PCR ha sido usado para la detección del virus en diferentes muestras (11; 6; 10) y tiene la ventaja de que es un método específico y mucho más rápido que los procedimientos de cultivo convencionales (12; 3). Además permite el diagnóstico diferencial de influenza tipo A y de los subtipos H5 y H7 (14), así como la secuenciación posterior del segmento que codifica para la hemaglutinina, lo que posibilita revelar el patotipo en un tiempo menor de 5 días, inferior a los 10 días de la prueba de patogenicidad, en pollos (8; 9; 5).

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En Cuba, no se ha presentado la IAN y actualmente se trabaja en la optimización de la metodología de la RT-PCR para la identificación rápida y más específica de este virus. El objetivo del presente trabajo es evaluar tres métodos de extracción de ARN para la detección de influenza tipo A en muestras clínicas por la RT-PCR. Los métodos que se evaluaron fueron los siguientes: (i) método que utiliza el reactivo comercial Tripure (Tripure Isolation Reagent; Boeringher Mannheim); (ii) método que utiliza un Buffer Lisis para la extracción de ácidos nucleicos virales presentes en muestras respiratorias (1) (iii) método del juego de extracción de ARN: SV total RNA Isolation System; Promega). La cepa viral utilizada fue H3N5 (aislado autóctono, sexto pase, multiplicada en embrión de pollo con título infectivo de 108.33 DIEP 50/0.25 mL y título hemoaglutinante 1:1024). Como muestras para la evaluación se utilizaron líquido alantoideo negativo (LA) y exudados cloacales de aves no infectadas, ambos fueron contaminados con LA infectado con la cepa H3N5. La RT-PCR se realizó como sigue: 5µL ARN, 1µL de random hexámeros (50 ng/µL, Promega) y 4µL de agua libre de nucleasas, se colocaron 10 minutos a 70ºC para la desnaturalización del ARN, y posteriormente se agregaron a la mezcla de reacción contentiva de tampón RT 5X, Promega), dNTP (10 mM), RNAsin 40U y RT-AMV (25 U/µL, Promega). La reacción se desarrolló en un termociclador (MJ- Research TM) programado para 25ºC, 15 minutos, 42ºC, 50 minutos y 94ºC, 5 minutos. Para la reacción de amplificación se utilizaron los cebadores IVA-M1: 5‘AGCGTAGACG CTTTGTC‘3 y IVA-M2: 5‘GACGATCAAGAATCCAC‘3 (200 ng/µL) que amplifican un segmento de 600pb de la proteína de la matriz (gen M) (Starick et al 2000). La reacción se desarrolló en un volumen de 50 mL con tampón PCR 10X, Promega; MgCl2 (25 mM, Promega); dNTPs (10 mM); 2U Taq ADN (ampliCEN) y 2 µL de ADN molde. La amplificación se realizó en un Termociclador programado para 94oC/2 minutos, 30 segundos, seguido de 30 ciclos de 94oC/30 segundos, 55oC/30 segundos, 72oC/30 segundos y 72oC/ 7 minutos. Los productos de PCR se visualizaron por electroforesis en gel de agarosa al 2%, teñido con Bromuro de Etidio (0,8µg/mL), a 100 volts durante 30 min., en tampón TBE 0.5X (Tris-Borato (Tris 50mM, ácido borato 50 mM y EDTA 10 mM, pH 8.4). Con el fin de evaluar la efectividad del método de extracción de ARN, a partir de muestras clínicas de aves infectadas con el virus de IA, se realizó la ino-

culación experimental de pollos con la cepa H3N5 (empleada en el experimento anterior). Se inocularon 21 pollos Leghorn de 8 semanas de edad, vía óculo-nasal. Las muestras de exudados cloacales se obtuvieron en medio de cultivo DMEM suplementado con Gelatina (0.5%) y antibióticos (10,000 UI de Penicilina y 10,000 µg de Estreptomicina por mL). Las muestras fueron obtenidas a los 0, 3, 5, 7 y 10 días postinoculación (p.i). Se realizó el aislamiento viral en embrión de pollo y RT-PCR a las muestras de exudados cloacales. Para la extracción del ARN viral se utilizó el método de Tripure. La reverso transcripción (RT) y el PCR se realizaron según procedimiento descrito anteriormente. Se obtuvieron resultados satisfactorios con los tres métodos de extracción evaluados a partir de muestras de LA infectado con la cepa H3N5. Con el reactivo Tripure se obtuvo una banda de 600pb tanto en LA infectado con la cepa H3N5 como en el exudado cloacal previamente contaminado (Fig. 1). Una banda de similar peso molecular fue obtenida por Starick et al. (11) usando los primer IVA-M1 e IVA-M2 en el diagnóstico de influenza tipo A (11). En la comparación del método de Tripure con respecto al Buffer lisis no se apreció incremento de intensidad de la banda del producto de PCR, mientras que en las muestras de exudados cloacales contaminados con dicha cepa aunque se apreció la banda, esta fue de menor intensidad con el Buffer lisis respecto al Tripure. 1

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FIGURA 1. RT-PCR empleando el método de extracción ARN con el reactivo Tripure, en muestra de exudado cloacal contaminado con la cepa H3N5. Línea 1: ADNc LA cepa H3N5 (control positivo), Línea 2: ADNc exudado cloacal contaminado, Línea 3: ADNc serotipo H7 (material de referencia), Línea 4: Control H2O./ RT-PCR employing RNA extraction method with Tripure reactive, in samples of contaminated cloacal swabs. Lane1: DNAc LA H3N5 strain (positive control), Lane 2: DNAc contaminated cloacal swab, Lane 3: DNAc H7 serotype (reference material), Lane 4: Control H2O. Rev. Salud Anim. Vol. 28 No. 3 (2006)

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Con el juego de reactivos comercial SV ARN total los resultados fueron similares a los obtenidos con el reactivo Tripure con LA infectado puro, no así para la muestra de exudado cloacal contaminado. Estos resultados nos señalan que los tres métodos funcionan para la extracción del ARN viral, a partir de líquido alantoideo infectado, en tanto que para exudados cloacales previamente contaminados se pueden utilizar el Tripure y el Buffer lisis. La evaluación de las muestras de exudados cloacales a diferentes tiempos post-inoculación (pi) reveló presencia de virus por aislamiento viral en embrión de pollo en un total de 9 aves, como evidencia de infección viral. Sin embargo, el comportamiento de la excreción viral fue variable ya que se detectó virus en los exudados procedentes de tres aves a los 5 y 7 días post-inoculación con títulos infectivos de 105 DIEP50, en tanto en otras tres aves se aisló el virus sólo a los 7 y en otras tres a los 10 días, con títulos de 103,59 y 101,36 DIEP50, respectivamente. Se obtuvo una amplificación de la banda esperada de 600pb en las muestras de exudados cloacales a los 5 y 7 días (Fig. 2). Se aprecia que la banda fue de menor intensidad en las muestras de exudados comparada con la obtenida de líquido alantoideo infectado (concentración viral con título 108.33 DIEP50/ 0.25 mL) y el aislamiento viral de los 5días post-infección. Esto está relacionado con la menor concentración viral en estas muestras, lo cual fue revelado por aislamiento viral en embrión de pollo, donde se detectan títulos infectivos =105 DIEP50 (Tabla 1). También se detectó mayor respuesta de anticuerpos IHA en las aves que excretaron mayor cantidad de virus. Los resultados obtenidos demuestran que se logró la detección directa a partir de muestras clínicas de Influenza aviar Tipo A con el empleo del método de extracción del ARN viral que utiliza el reactivo Tripure. Esto representa gran ventaja pues el método establecido en el laboratorio requiere el paso de concentración de la muestra por ultracentrifugación, por lo que, además de evitar la complejidad de este paso, reduce el tiempo de obtención del resultado para el diagnóstico de esta enfermedad, aspecto este de gran importancia para la toma de medidas de control rápidas encaminadas a reducir la diseminación del virus dado su carácter altamente contagioso.

REFERENCIAS 1. Casas, I.; Powell, L.; Klapper, P.E.; Cleator, G.M. (1995): Extracción de ácidos nucleicos virales presentes en las muestras respiratorias: J. Virol. Methods. 53: 25-36. Rev. Salud Anim. Vol. 28 No. 3 (2006)

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FIGURA 2. RT-PCR de las muestras clínicas (exudados cloacales) directamente de aves infectadas. Línea 1: muestra de 5 días, Línea 2 muestra de 7 días, Línea 3: Aislamiento viral 5 días pi., Línea 4: Control negativo, agua libre de nucleasas, Línea 6: Control positivo LA infectado con la cepa H3N5. Línea 7: PPM de 100 pb./ RT-PCR of clinical samples (cloacal swabs) directly from infected birds. Lane 1: samples of 5 days, Lane 2: samples of 7 days, Lane 3: viral isolation 5 days post-infection, Lane 4: negative control, nuclease free water, Lane 6: positive control LA infected with H3N5 strain, Lane 7: PPM of 100 pb.

TABLA 1. Resultados de aislamiento viral en embrión de pollo, PCR y respuesta de anticuerpos por IHA./ Chicken embryo viral isolation results, PCR and antibody response by IHA Aislamiento Muestra Tiempo PI EC-1 5 días + (105 DIEP50) EC-6 7 dias + (103,59 DIEP50 ) Control EC-1: exudado cloacal del animal 1 EC-6: exudado cloacal del animal 6

PCR + + -

IHA 1:256 1:128 -

2. CDC/WHO. Avian Influenza Response Team (2004): Outbreaks of avian influenza A (H5N1) in Asia and interim recommendations for evaluation and reporting of suspected cases – United States. Morb. Mortal Wkly Rep. 53: 97–99. 3. Labra, A.; Christian, M.B.; Alfonso, G.P.; Valentina, M.B. (2004): Diagnosis of avian influenza virus type A by real-time reverse transcriptase PCR (rRTPCR) and comparison with virus isolation by inoculation of embryonated spf eggs. Salud Animal e Inocuidad de los Alimentos. Boletín Veterinario Oficial. No.1.

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4. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Part 2. Section 2.1. Chapter 2.1.14 NB: Version Adopted May 2005. Chapter 2.7.12. Avian Influenza. 5. Munch, M.; Nielsen, L.P.; Handberg, K.J. and Jorgensen, P.H. (2001): Detection and subtyping (H5 and H7) of avian type A influenza virus by reverse transcription-PCR and PCR-ELISA. Arch. Virol. 146(1): 87-97. 6. Oxburgh, L.; Hagstrom A. (1999): A PCR based method for the identification of equine influenza virus from clinical samples. Vet. Microbiol. 67: 161-174. 7. Peiris, J.S.; Yu, W.C.; Leung, C.W.; Cheung, C.Y.; Ng, W.F.; Nicholls, J.M.; Ng, T.K.; Chan, K.H.; Lai, S.T. (2004): Re-emergence of fatal human influenza A subtype H5N1. Disease Lancet. 363: 916-917. 8. Perdue, M.L.; Brugh, M. and Latimer, J. (1991): Rapid polymerase chain reaction for detection and sequence analysis of avian influenza virus genes in allantoic fluid. Am. J. Vet. Med. Assoc. 128th Annual Meeting. P133. 9. Senne, D.A.; Panygrahy, B.; Kawaoka, Y.; Pearson, J.E.; Suss, J.; Lipkind, M.; Kida, H.; and Webster, R.G. (1996): Survey of the hemagglutinin (HA) cleavage site sequence of H5 and H7 avian influenza viruses: amino acid sequence at the HA cleavage site as a marker of pathogenicity potential. Avian Dis. 40: 425-437.

10.Spackman, E.; Senne, D.A.; Myers, T.J.; Bulaga, L.L.; Garber, L.P.; Perdue, M.L.; Lohman, K.; Suarez, D.L. (2002): Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J.Clin.Microbiol. 40: 3256-3260. 11.Starick, E.; Romer-Oberdorfer, A. and Werner, O. (2000): Type and subtype specific RT-PCR assays for avian influenza A viruses (AIV). J. Vet. Med. B, 47: 295-301. 12.Suarez, D.L.; Spackman, E.; Senne, D.A.; Bulaga, L.; Welsch, A.C. and Froberg, K. (2003): The Effect of Various Disinfectants on Detection of Avian Influenza Virus by Real Time RT-PCR. Avian Diseases. 47 (3): 1091-1095. 13.World Health Organization (2005): State of the art of vaccine research and development. Iniciative for Vaccine Research World Health Organization. www.who.int/vaccines-documents/. 14.Zhixun Xie, Yao-shan Pang, Jiabo Liu, Xianwen Deng, Xiaofei Tang, Jianhua Sun and Mazhar I. Khan (2006): A multiplex RT-PCR for detection of type A influenza virus and differentiation of avian H5, H7, and H9 hemagglutinin subtypes. Molecular and Cellular Probes. 20(3-4): 245-249.

(Recibido 23-8-2006; Aceptado 20-20-2006)

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