UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS Departamento de Biología Molecular

ESPECIFICIDAD DE FUNCIÓN DE LAS SUBUNIDADES CATALÍTICAS p110 Y p110 DE PI3K DE CLASE IA EN LA PROGRESIÓN DEL CICLO CELULAR

Memoria presentada por Miriam Marqués Cabrero Madrid, Octubre de 2008

El trabajo presentado en esta memoria ha sido realizado en el Departamento de Inmunología y Oncología del Centro Nacional de Biotecnología, bajo la dirección de la Dra. Ana C. Carrera Ramírez

A Rorro. A Selu y Ara.

ÍNDICE ABREVIATURAS …………………………………………………………..………………….7 SUMMARY …………………………………………………………………………….…………..9 INTRODUCCI ÓN … …………………………………………………………………….. ……….. ….11 …. I El ciclo celular…………………………………………………….……………………...11 1. CDKs (cyclin dependent kinases): REGULADORES MOLECULARES DEL CICLO CELULAR………………………………………………………………………..11 2.REGULACIÓN DE LAS CDKS……………………………………………...12 a)Ciclinas. b)Fosforilación de las CDKs. c)CKIs (CDK kinase inhibitor). d) Degradación. e) Localización celular. cip 3.p21 ……………………………………………………………………………13 Cip1 a) Estructura de p21 …………………………….. b) Función activadora de complejos ciclina D/CDK Cip1 c) Papel proapoptótico de p21 ………………….. d) Función en transcripción………………………… Cip1 e) p21 inhibidor de la síntesis de ADN………... Cip1 f) p21 y respuesta al daño al ADN…………….. g) Función en diferenciación……………………….. 4.CONTROL DE LAS FASES G0, G1 y S DEL CICLO CELULAR………..15 a)Inicio del ciclo celular: crecimiento. b) Transición G0/G1. c) Fase S: Replicación del ADN.

II PI3K …………………………………………………………...…………………………19 1. CLASES DE PI3K……………………………………………………………..19 a)Clase I b) Clase II c) Clase III 2.ACTIVACIÓN E INACTIVACIÓN DE PI3K DE CLASE IA…………………21 3.SEÑALIZACIÓN DE PI3K DE CLASE I…………………………………….. 22 a) PDK1 y PKB b) TEC quinasas c) GEFs y GAPs 5.FUNCIONES BIOLÓGICAS DE PI3K DE CLASE IA………………………22 a) Supervivencia. b) Metabolismo c) Reorganización del citoesqueleto y migración celular d) Sistema Inmune e) Ciclo celular

III PI3K en ciclo celular………………………………..…………………………25 1. CRECIMIENTO………………………………………………………………..25 2. TRANSICIÓN G0/G1…………………………………………………………25 3.TRANSICIÓN G1/S……………………………………………………………26 4.COORDINACIÓN DE CRECIMIENTO Y DIVISIÓN……………………….26 5.FASES G2 y M…………………………………………………………………27

IV Especificidad de función de las isoformas p110α y p110β…….27 1. RATONES KNOCK OUT DE p110α y p110β 2. APROXIMACIONES MOLECULARES………………………………….27 a) Microinyección de anticuerpos b) ARN interferente y mutantes activos e inactivos de p110 3. NUEVOS MODELOS ANIMALES……………………………………….27

OBJETIV OS …………………………………………………………………………………….33 MATERIALE S Y MÉ TODOS ………………………………………………………..37 1. CULTIVO CELULAR…………………………………………………….37 a) Lineas celulares. b)Fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs). c)Generación de líneas estables. 2.TRANSFECCIONES E INFECCIONES………………………………..37 3. ANÁLISIS DEL CICLO CELULAR……………………………………..38 a) Tinción de ADN. b) Sincronización de cultivos celulares. c) Ensayos de DNA combing 4. ENSAYOS BIOQUÍMICOS…………………………………………….39 a) Lisis,fraccionamiento celular, inmunoprecipitaciones y Western Blot. b) Ensayos lípido kinasa. c) Ensayos quinasa de PKB. d) Anticuerpos y reactivos. 5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Y PROGRAMAS INFORMÁTICOS……42

RESULTADOS …………………………………………………………………………………45 I Consecuencias de interferir con la expresión y actividad de p110α y p110β…………………………………………………………......………….…45 1. ENSAYOS CON MUTANTES ACTIVOS p110αCAAX Y p110βCAAX…45 2. ENSAYOS CON MUTANTES INACTIVOS K802R-p110α y K805R-p110β ………………………………………………………………………………46 3. TRANSFECCIÓN DE ARNs DE PEQUEÑO TAMAÑO EN FIBROBLASTOS MURINOS ……………………………………………48 4.ESTUDIOS CON shARNs INDUCIBLES EN LINEAS CELULARES DE OSTEOSARCOMA HUMANO (U2OS)…………………………………49 5. ENSAYOS CON FIBROBLASTOS EMBRIONARIOS MURINOS (MEFs) ………………………………………………………………………………50

II Función de las isoformas p110α y p110β en la señalización temprana de ciclo celular……………………………………………….......……..51 1.PKB…………………………………………………………………...…51 2. p70S6K…………………………………………………………………52 3. FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN FOXO………………..………53

III Función de las isoformas p110α y p110β en la expresión de ciclinas de G1/S ….…………………………………………………………………...54

IV Función de las isoformas p110α y p110β en transición G1/S ….……………………………………………………………………………………….….…58 1. REGULACIÓN DE LOS NIVELES DE c-Myc……………………………..58 2.FOSFORILACÓN DE pRB…………………………………………..59

V Activación de p110α y p110β en ciclo celular…………………………61 1.CINÉTICAS DE ACTIVACIÓN DE p110α y p110β EN CICLO CELULAR..61 2.MECANISMOS DE ACTIVACIÓN p110α y p110β EN CICLO CELULAR...62

VI Función de p110β en la progresión de fase S …………….…………65 1. ESTUDIOS CON INHIBIDORES ESPECÍFICOS: PIK75 y TGX221……...65 2. ANÁLISIS DE LA PROGRESIÓN DE LA FASE S………………………….66 3. ENSAYOS DE DNA combing…………………………………………………67

VII Mecanismos de la replicación del ADN regulados por p110β..69 1.ANÁLISIS DEL ENSAMBLAJE DEL COMPLEJO PRE-REPLICATIVO…69 2.ANÁLISIS DEL RECLUTAMIENTO DE PCNA A LA CROMATINA Y SU UNIÓN A POLδ…………………………………………………………………...70 3. FUNCIÓN ESPECÍFICA DE LA SUBUNIDAD p110β EN LA DISOCIACIÓN CIP1 DE COMPLEJOS p21 /PCNA………………………………………………..71 CIP1 4. ANÁLISIS DE LA FOSFORILACIÓN DE p21 …………………………..72 CIP1 5. ANÁLISIS DE LA ESTABILIDAD DE p21 ……………………………….74 CIP1 6. FUNCIÓN DE LA FOSFORILACIÓN DE T145 EN p21 ……………….76 CIP1 7. MECANISMO POR EL QUE p110β MEDIA LA FOSFORILACIÓN DE p21 .77

VIII Origen de la especificidad de función de p110β durante la replicación del ADN ……………………………………………………………….78 1.LOCALIZACIÓN SUBCELULAR DE LAS ISOFORMAS p110β Y p110α..78 2.REGULACIÓN DE PKB NUCLEAR POR p110β ……………………….….78

DISCUSIÓN …………………………………………………………………………………….81 I p110α regula los eventos tempranos de fase G1……………………...81 1.LA PROGRESIÓN DE G1 REQUIERE DOS PULSOS DE SEÑAL MITOGÉNICA ……………………….……………………………………………..81 2. p110α REGULA LOS PROCESOS TEMPRANOS DE G1. ……………….81 3. ACTIVACIÓN DE AKT POR p110α Y p110β………………………………...82 4. p110α REGULA CRECIMIENTO CELULAR………………………………...82 5. SÍNTESIS DE CICLINAS DE G1/S Y FOSFORILACIÓN DE pRB………...83 6. MECANISMOS DE ACTIVACIÓN DE p110α Y p110β…………………….83 7.PI3K Y RAS………………………………………………………………………84

II p110α y p110β regulan la transición G1/S……………………..............85

III Función de p110β en la replicación del ADN……………………86 1.PI3K NUCLEAR……………………………………………………………….…86 CIP1 2. FOSFORILACIÓN DE p21 …………………………………………………87 3. REGULACIÓN DE LOS NIVELES DE P21CIP1 POR PI3K………….…….88

IV Origen de la especificidad de la función de las isoformas de PI3K ……………………............................................................................................89 1. TEJIDO Y TIPO CELULAR……………………………………………………89 2. MECANISMOS DE ACTIVACIÓN…………………………………………….89 3.FUNCIÓN ADAPTADORA…………………………………………….89 4. ACTIVIDAD LÍPIDO QUINASA Y PROTEINA QUINASA……………….90 5. LOCALIZACIÓN SUBCELULAR……………………………………….90 6.ESPECIFICIDAD DETERMINADA POR LA SUBUNIDAD REGULADORA..91

V p110α y p110β : posibles dianas terapéuticas contra el cáncer…………………………………………………………………………………........91

CONCLUSIONES ……………………………………………………………………………95 BIBLIOG RAFÍA ……………………………...………………………………………………99 ANEXO …………………………………………………………………………………………….125

ABREVIATURAS APC Quinasas AGC ARNasa ATP Bcr BrdU BSA Cdc42 CHX DTT EDTA EGTA FITC GFP GTP Hepes Lys mTOR NP40 PCR PKI PMSF PNPP PTEN rpm SDS SDS-PAGE Ser SH2 SH3 Thr Tris TSC TSC1 TSC2 TX100 Tyr

Complejo promotor de la anafase Quinasas PKA, PKC, PKG Ribonucleasa Adenosina 5’ trifosfato Breakdown cluster homology 5-Bromo-2-deoxiuridina Albúmina de suero bovino Cell division cicle 42 Cicloheximida Ditiotreitol Ácido etilendiamino- tetraacético Etilenglicol bis Isotiocianato de fluoresceína Proteína verde fluorescente Guanosina trifosfato Hidroxietil piperazina etanosulfato Lisina Sustrato de rapamicina en mamíferos Igepal CA-630 Reacción en cadena de la polimerasa Inhibidor de proteína quinasa Fluoruro de para-metilsulfato p-Nitrofenil fosfato Fosfatasa de homología a tensina seleccionada en el cromosoma 10 Revoluciones por minuto Dodecil-sulfato sódico Electroforesis en geles de poliacrilamida Serina Dominio 2 de homología con la quinasa src Dominio 3 de homología con la quinasa src Treonina Tris(hidroximetil)aminometano Esclerosis tuberosa Proteína 1 de la esclerosis tuberosa o Hamartina Proteína 2 de la esclerosis tuberosa o Tuberosa TritónX-100 Tirosina

SUMMARY

SUMMARY Phosphoinositide 3-kinase (PI3K) is an early signaling molecule that regulates cell growth and cell cycle entry. PI3K is activated immediately after stimulation of growth factor receptors, at the G0/G1 transition, and again in late G1, controlling S phase entry. There are multiple isoforms of PI3K that can be divided into 3 classes among them, class I are activated upon growth factor stimulation. Class I PI3Ks are heterodimers made up of a catalytic subunit (p110) and a regulatory subunit (p85). Mammal class IA PI3K have 7 regulatory subunits generated by alternative splicing of 3 different genes, and 3 p110 isoforms: encoded by 3 separated genes: p110α, p110β and p110δ. While p110α and p110β are widely distributed in mammalian tissues, p110δ is mainly found in leukocytes. It is presently unknown which one of the two ubiquitous isoforms is activated during cell cycle and whether or not they both control cell cycle progression. p110α and p110β nock-out mice displayed early embryonic lethality, demonstrating that both isoforms have no redundant functions during development. We show that p110α and p110β displayed distinct activation requirements resulting in differential activation kinetics during cell cycle progression. p110α is activated first in G0/G1, followed by a minor p110β activity peak. In late G1, p110α activation also precedes that of p110β, whose activity is maximal at this point. Accordingly, p110α controls early G1 phase events such as protein synthesis and FOXO transcription factors inactivation. Nevertheless inhibition of either p110α or p110β reduced cell cycle entry and both isoforms regulate S phase-entry. In addition, modulation of p110β activity altered the DNA elongation rate and S phase duration, these results reveal a unique function of p110β in the control of DNA replication. p110β, but not p110α, localized in the nucleus and associated PCNA (proliferating cell nuclear antigen). Nuclear p110β controlled PCNA function by associating and activating protein kinase (PKB), a kinase for the negative regulator of PCNA, p21Cip1. We report specific functions of p110α and p110β subunits in cell cycle progression and we identified a novel p110β function in DNA replication. Other authors and we suggest the potential use of p110α and p110β as new therapeutic targets in cancer.

INTRODUCCIÓN

INTRODUCCIÓN I EL CICLO CELULAR La división celular es un proceso por el cual una célula aumenta su tamaño, replica su ADN y lo segrega equitativamente para dar lugar a dos células hijas. Estos procesos son esenciales, durante el desarrollo, para la generación de órganos y tejidos y en el adulto, para reparación y recambio tisular. La división celular es un proceso altamente controlado y defectos en esta regulación dan lugar a graves patologías, entre las que encontramos enfermedades autoinmunes y cáncer. El ciclo celular se divide en 4 fases, durante dos de ellas se realizarán los procesos básicos de la división celular: replicación única y fiel del ADN (fase de síntesis o fase S) y el reparto de los componentes celulares en dos células hijas (mitosis o fase M). Las fases S y M del ciclo celular van precedidas por las fases de preparación (G1 y G2, gap1 y gap2) respectivamente (revisado por Malumbres y Barbacid 2001). Durante G1, la célula ha de aumentar su masa y sintetizar todas la proteínas implicadas en la replicación del ADN, por ello durante esta fase existe una alta tasa metabólica. De manera similar, durante G2 la célula lleva a cabo la síntesis proteica necesaria para los procesos de segregación del citoplasma (citoquinesis) y del material genético (mitosis) en dos células hijas, procesos que tendrán lugar en la fase M. Existe un estado de quiescencia en el que las células no dividen y mantienen niveles metabólicos bajos que se conoce como G0. Las células permanecerán en estado de quiescencia hasta ser estimuladas por factores de crecimiento (revisado por Sherr en 1994). Para asegurar una progresión adecuada a lo largo del ciclo celular, las células han desarrollado una serie de puntos de control que impiden la transición a la siguiente fase hasta que la anterior no ha sido ejecutada correctamente.

1. CDK s (c yclin de pe nde nt ki n ases ): REG ULA DORE S M OLE CULAR ES DEL CICL O CELUL AR La transición entre las diferentes fases del ciclo celular es regulada por un grupo de Ser/Thr quinasas (CDKs) que forman heterodímeros activos con sus subunidades reguladoras (ciclinas). Mientras que la expresión de las CDKs es constante a lo largo del ciclo celular, las ciclinas se expresan y degradan de forma fase dependiente. CDK4 y CDK6 forman complejos con las ciclinas tipo D (D1, D2 y D3) y regulan los eventos de G1 temprana. CDK2 es secuencialmente activada por ciclinas tipo E (E1, E2) y por ciclinas tipo A (A1, A2). La activación de estos complejos se requieren para la transición G1/S y la progresión de la fase S. El complejo regulador de mitosis es ciclina B/CDK1 (revisado por Sánchez y Dynlacht 2005) (FIG. I.1).

FIG I.1 El ciclo celular. El esquema representa las 4 fases en las que se distribuyen los procesos esenciales que tienen lugar durante la división celular y los complejos ciclina/CDK implicados en la consecución de cada una de ella

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INTRODUCCIÓN

2.REG ULA CIÓ N DE LA S CDK S a)Ciclinas Cuando una célula quiescente es estimulada por factores de crecimiento, los genes de las ciclinas D se activan en respuesta a señales mitogénicas. La síntesis de ciclina D está regulada por la vía Ras/Raf/MAPK (Won et al. 1992; Weber et al.1997). Los niveles de ciclina D se mantienen a lo largo de todo el ciclo en presencia de factores de crecimiento, aunque siempre se observa un nuevo pico de expresión cuando la célula comienza una nueva fase G1 después de mitosis (Bakiri et al. 2000). Modelos animales donde se suprime la expresión de una o dos isoformas individuales de ciclina D son viables y presentan defectos específicos de tejido (Sicinski et al. 1995; 1996; Ciemerych et al. 2002); lo que demuestra que las diferentes isoformas desarrollan funciones solapantes pero imprescindibles, ya que la ausencia de expresión de las tres isoformas de ciclina D causa letalidad embrionaria (Kozar et al. 2004). Ciclina E se sintetiza en fase G1 avanzada por acción de los factores de transcripción E2F (Botz et al. 1996; Geng et al. 1996). Esta ciclina, es esencial para entrada en ciclo desde quiescencia (Geng et al. 2003). La síntesis de ciclina A, también regulada por los factores de transcripción E2F y cMyc, sigue a la aparición de ciclina E en la transición G1/S. La actividad de los complejos ciclina A/CDK2 en necesaria para la progresión de la fase S (Fotedar et al. 1996). Ciclina B se expresa durante al final de la fase S y en G2, aunque los complejos ciclina B/CDK1 permanecerán inactivos hasta el final de G2 donde su activación será necesaria para entrada en mitosis (Pines y Hunter 1989; revisado por Smits y Medema 2001). b)Fosforilación de las CDKs Para su completa activación, los complejos ciclina/CDK han de ser fosforilados en un residuo de Thr conservado, próximo al sitio de unión del ATP. Esta fosforilación es llevada a cabo por la quinasa CAK (CDK activating kinase). El complejo CAK está formado por la ciclina H y la quinasa CDK7 (revisado por Kaldis 1999). La fosforilación activadora de CAK es suprimida por la fosfatasa KAP. Los sustratos de KAP son las subunidades monoméricas CDK resultado de la degradación de las ciclinas (Hannon et al. 1994; Poon y Hunter 1995). La actividad CDK está también sujeta a una regulación inhibitoria mediada por fosforilación en el extremo amino-Terminal de todas las CDKs, específicamente en el residuo Tyr15 de CDK2 y CDK1, y en el Tyr17 de CDK4. En el caso de CDK2 y CDK1 existe un segundo sitio de fosforilación en Thr14. Las quinasas responsables de la fosforilación en Thr14 y Tyr15 de CDK1 son respectivamente WEE1 y MYT1 (Parker y Piwnica-Worms 1992; Mueller et al. 1995). La reversión de la fosforilación inhibitoria de las CDKs es mediada por las fosfatasas de la familia CDC25 (CDC25A, CDC25B Y CDC25C) (revisado por Obaya y Sedivy 2002). Mientras que CDC25A promueve entrada en S activando complejos CDK2/ciclinas E y A, CDC25B y CDC25C actúan sobre ciclina B/CDK1 para promover entrada en mitosis (Hoffmann et al. 1993; Hoffmann et al. 1994). c)CKIs (CDK kinase inhibitor) Los CKIs son proteínas de bajo peso molecular que inhiben la actividad de los complejos ciclina/CDK por interacción directa (revisado por: Sherr y Roberts 1999; Obaya y Sedivy 2002). Basándose en su estructura y sus CDKs diana los CKIs se clasifican en dos familias, la familia INK4 y la familia Cip/Kip. INK4A INK4B INK4C INK4D Los miembros de la familia INK4 son: p16 , p15 , p18 y p19 (Serrano et al. 1993; Hannon y Beach 1994; Guan et al. 1994; Chan et al. 1995). Estas proteínas se unen a las quinasas CDK4 y CDK6 impidiendo su interacción con ciclina D (Coleman et al. 1997; revisado por Ortega et al. 2002). Kip1 Kip2 Cip1 Tres inhibidores constituyen la familia Cip/Kip: p27 , p57 y p21 (Polyak et al. 1994; Lee et al. 1995; El-Deiry et al. 1993). Los inhibidores Cip/Kip forman complejos heterotriméricos inactivos con ciclina/CDK2 y ciclina /CDK1. (Harper et al. 1993; revisado por

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INTRODUCCIÓN Kip1

Cip1

Ortega et al. 2002). p27 y p21 también unen complejos ciclina D/CDK pero en este caso, el triple complejo es activo (revisado por Sherr y Roberts 1999). d) Degradación La degradación de la mayor parte de los reguladores del ciclo celular es mediada por el proteasoma. Las proteínas son marcadas para su destrucción selectiva por la unión covalente de un péptido llamado ubiquitina. Aunque hay proteínas que son degradadas por el proteasoma Cip1 sin necesidad de ubiquitinación, como p21 (Chen et al. 2004). Existen dos grandes complejos de ubiquitinación, el complejo SCF (Skp-Cullin-F-box) y el complejo APC (anaphase-promoting complex), cada uno reconocerá sustratos específicos y actuará en momentos diferentes del ciclo celular. Mientras que SCF participa al final de G1, en S y en G2 temprana, APC se activa al final de G2 y media la transición a M (revisado por Peters 1998). La especificidad de sustrato viene mediada por multitud de factores que interaccionan con estos complejos. Para SCF estos factores constituyen una familia de skp2 proteínas que contienen en su secuencia un motivo F-box, como son FBW7, hCDC4, p45 o cullin3 (Skowyra et al. 1997). En el caso del APC, los factores que determinan la especificidad contienen repeticiones WD-40 (revisado por Peters 1998). e) Localización celular. La actividad CDK es fundamentalmente nuclear, al igual que sus proteínas activadoras CAK y CDC25 (Tassan et al. 1994; Girard et al. 1992). La ciclina D1 se localiza en el núcleo en mitad de G1 y migra al citoplasma en el inicio de fase S (Baldin et al. 1993). La fosforilación en Thr286, mediada por GSK3β, marca ciclina D1 para degradación y también actúa como señal de exportación nuclear (Diehl et al. 1997). Los complejos CDK1/Ciclina B se acumulan principalmente en el citoplasma, debido a que ciclina B posee una señal de retención citoplasmática (CRS) en su extremo aminoTerminal (Norbury et al. 1991; Pines y Hunter 1994). Su activación por CDC25B constituirá una señal de translocación nuclear y siguientes fosforilaciones en la CRS de ciclina B inducirá su migración al núcleo (Yang et al. 1998; revisado por Obaya y Sedivy 2002).

3.p2 1 cip1 Cip1

p21 se identificó originalmente como un efector de p53. En situaciones de estrés tales como daño en el ADN, privación de ribonucleótidos o hipoxia, p53 induce la síntesis de Cip1 Cip1 p21 (El-Deiry et al. 1993). Sin embargo, la inducción transcripcional de p21 está inducida también por vías independientes de p53 (Macleod et al. 1995). a) Estructura de p21

Cip1 Cip1

El dominio amino-Terminal de p21 es suficiente para la unión e inhibición de complejos ciclina/CDK. Esta región contiene un motivo de unión a ciclinas (aa 16-24) y un dominio de interacción con CDK (aa 45-65) (Luo et al. 1995). Existe un segundo motivo de unión a ciclinas en el extremo carboxi-terminal capaz de Cip1 unir e inhibir algunos complejos ciclina/CDK (Adams et al. 1996). p21 también posee una secuencia putativa de localización nuclear (aa 140-157), dos sitios de corte para caspasa 3 (Park et al. 1998) y una región de interacción con el factor de procesividad de las polimerasas δ y ε, PCNA (proliferating cell nuclear antigen) (FIG I.2).

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INTRODUCCIÓN

Cip1

FIG I.2 Inhibidor p21 . Disposición de los dominios de unión a ciclinas (Cyc1/Cyc2), PCNA, o CDK, en la estructura Cip1 de p21 (NLS: secuencia de localización nuclear).

b) Función activadora de complejos ciclina D/CDK Cip1

Kip1

p21 , al igual que p27 , ejercen su función inhibitoria sobre complejos ciclina/CDK2 en el núcleo celular, aunque también se localizan en el citoplasma donde realizan otras funciones (revisado por Coqueret en 2003). Cuando estos inhibidores se encuentran en el citoplasma, favorecen el ensamblaje de los complejos ciclina D/CDK y su importación al núcleo (Labaer et al.1997), actuando como activadores de CDKs de G1 temprana. Cip1 Kip1 La supresión de la expresión de p21 y p27 en fibroblastos murinos induce un ensamblaje defectivo de complejos ciclina D/CDK (Cheng et al. 1999; Sugimoto et al. 2002). c) Papel proapoptótico de p21

Cip1

. Cip1

La fracción citoplasmática de p21 ejerce una acción antiapoptótica a través de varios mecanismos (Bunz et al. 1998; Gorospe et al. 1996; Gorospe et al. 1997; Asada et al. 1999). Uno de ellos es la inhibición del procesamiento de procaspasa 3 (Suzuki et al. 1998). Caspasa 3 es un efector de la ruta apoptótica, presente en el citoplasma como un proenzima que se activa por proteolisis en respuesta a estimulación por ligando de Fas. Las caspasas 8 y Cip1 10 también han sido descritas como dianas de p21 (Xu y El-Deiry 2000) Cip1 En el citoplasma, p21 interacciona también con SAPK (stress-activated protein kinases ) y ASK1 (MEKK5) inhibiendo su actividad catalítica y previniendo la apoptosis (Shim et al. 1996; Asada et al. 1999). d) Función en transcripción Cip1

p21 se propone también como un regulador de la transcripción independiente de su actividad sobre complejos ciclina/CDK. Su unión directa con factores de transcripción como Myc, STAT3 y E2F indica que puede estar inhibiendo directamente la transcripción de genes promotores de ciclo (Shiyanov et al. 1996; Kiatura et al. 2000; revisado por Coqueret 2003). e) p21

Cip1

inhibidor de la síntesis de ADN

La unión de PCNA a las polimerasas procesivas δ y ε es esencial para el la replicación Cip1 del ADN. El inhibidor p21 interacciona con PCNA enmascarando los sitios de unión de las polimerasas, impidiendo su interacción con PCNA y actuando así como un eficiente inhibidor de la síntesis de ADN (Waga et al. 1994; Gulbis et al. 1996; Oku et al. 1998). f) p21

Cip1

y respuesta al daño al ADN

Existen determinados puntos de control durante la progresión del ciclo celular en los que la célula activará mecanismos de parada en respuesta a daño en el ADN. El efector Cip1 principal de estas rutas de control es p53 que induce la expresión de p21 (Brugarolas et al. 1995) . Cip1 El arresto en G1 y S mediado por p21 se produce a través de la inhibición de CDK2, impidiendo la fosforilación de pRB (Brugarolas et al. 1999). Durante G2 p53 activa otro punto Cip1 de control mediado por p21 (Waldman et al. 1996; Bunz et al. 1998). Los productos de la Cip1 acción transcripcional de p53: Gadd45, p21 y 14-3-3δ, colaboran en la inhibición de CDK1 impidiendo el inicio de la mitosis. p53 actúa además como represor transcripcional de los genes de CDK1 y ciclina B (Taylor et al. 1999).

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INTRODUCCIÓN g) Función en diferenciación Cip1

Se ha descrito una función de p21 en la diferenciación celular de la epidermis. En la capa basal de la epidermis existe un compartimento de células madre totipotentes que renuevan los queratinocitos diferenciados de capas superiores. La transición de célula madre a Cip1 Cip1 célula destinada a diferenciarse es dependiente de p21 . La expresión de p21 se induce en células postmitóticas adyacentes al compartimento proliferativo y disminuye en niveles más Cip1 diferenciados, lo que indica que p21 se inactiva al final del proceso de diferenciación (Gartel et al. 1996; Di Cunto et al. 1998). Cip1 Modelos animales deficientes en p21 muestran su implicación en la restricción del recambio epidérmico y en promover la diferenciación irreversible de células madre de queratinocitos y sistema hematopoyético (Topley et al. 1999; Cheng et al. 2000).

4.CO NTR OL DE LA S F ASES G0, G 1 y S DEL CICL O CELUL AR

a)Inicio del ciclo celular: crecimiento. La regulación del crecimiento es esencial para asegurar que el organismo y los órganos y tejidos que lo constituyen adquieran el tamaño adecuado. La división celular no puede darse sin crecimiento si bien, fisiológicamente existe aumento de la masa celular en ausencia de división (revisado por Tapon et al. 2001). Las rutas de señalización implicadas en crecimiento las detallaremos en relación con la actividad de PI3K. b) Transición G0/G1 Durante G1 se puede distinguir una fase inicial dependiente de mitógeno y una segunda fase en la que el ciclo progresará aunque los nutrientes hayan sido eliminados del medio extracelular, este momento se le conoce como el punto de restricción (Pardee 1974) y permite dividir la fase G1 en temprana o tardía. La progresión a través de la fase G1 es regulada por la proteína del retinoblastoma (pRB) y las proteínas relacionadas p107 y p130 que constituyen la familia “pocket protein” (del inglés proteínas bolsillo) (Dannenberg et al. 2000; Sage et al. 2000). Los miembros de esta familia actúan como secuestradores de varios factores de transcripción, incluyendo los de la familia E2F cuya actividad es necesaria para la transición G1/S (revisado por Cam y Dynlacht en 2003). Su actividad represora la ejercen mediante interacción directa con los factores E2F unidos al promotor de sus genes diana (Hiebert et al. 1992; Zamanian y La Thangue 1993). La fosforilación de pRB libera a los factores E2F permitiendo la transcripción de genes necesarios para la progresión de G1 y la replicación del ADN (revisado por Malumbres y Barbacid 2001; Obaya y Sedivy 2002). Para su unión al ADN los factores de transcripción E2F forman heterodímeros con proteínas de la familia DP (Helin et al. 1992). Durante G0 los dímeros E2F-DP están unidos principalmente a p130 que les mantiene inactivos. En G1 predominan los complejos pRB-E2FDP (revisado por Classon y Harlow 2002). En respuesta a las señales extracelulares, las células sintetizarán ciclina D, formándose complejos activos ciclina D/CDK4/6 que fosforilarán parcialmente a pRB unido a E2F-DP (Kato et al. 1993) (FIG I.3). Los complejos E2F-DP parcialmente activos iniciarán la transcripción de ciertos genes tempranos, entre los que se encuentra el de la ciclina E. La nueva ciclina E sintetizada unirá CDK2 y el complejo activo fosforilará pRB permitiendo su completa inactivación (Akiyama et al.1992). E2F totalmente activo podrá iniciar la síntesis de proteínas necesarias para la progresión de la replicación, entre las que se encuentra la ciclina A (Henglein et al. 1994). Los complejos activos ciclina A/CDK2 fosforilan a los factores E2F inhibiendo su actividad transcripcional (Dynlacht et al. 1994; Krek et al. 1994).

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INTRODUCCIÓN

FIG I.3 Inactivación de pRB por fosforilación mediada por los complejos ciclina/CDK. Los complejos ciclina Kip1 Kip1 E/CDK2 fosforilarán, además de pRB, p27 . La fosforilación de p27 induce su trasnlocación al citoplasma donde será degradado.

La actividad CDK asociada a ciclina D ejerce además una función no catalítica Cip1 Kip1 secuestrando a los inhibidores p21 y p27 , permitiendo la liberación de complejos ciclina E/CDK2 activos (Pérez-Roger et al. 1999). Otro evento necesario para la progresión de G1 a S es la degradación del inhibidor Kip1 p27 . Los complejos Ciclina E/CDK2 activos fosforilan este inhibidor induciendo su skp2 localización citoplasmática donde será degradado por SCF (Vlach et al. 1997; Tomoda et al. 1999; Carrano et al. 1999). Amit c) Fase S: Replicación del ADN Para mantener la integridad del genoma, la replicación del ADN debe ser regulada de manera que ocurra una única vez en cada ciclo y la nueva copia sintetizada sea exacta al ADN parental. Esto se consigue dividiendo el proceso de replicación en dos fases. Desde el final de mitosis y durante G1 los orígenes de replicación se encuentran en estado de licencia para iniciar la replicación. Durante el resto del ciclo celular y en G0, los orígenes de replicación se mantienen inactivos (Blow y Laskey 1988). El estado de licencia se establece mediante la formación controlada de un complejo multiproteico en los orígenes de replicación denominado, complejo pre-replicativo (pre-RC). La modificación del pre-RC, desde el inicio de S hasta el final de la mitosis impedirá que se inicie una nueva ronda de replicación (revisado por Nishitani y Lygerou en 2002). En células en continua proliferación el pre-RC se ensambla en telofase y G1 temprana y la licencia de inicio de síntesis de ADN se pierde una vez comienza la replicación; en condiciones de quiescencia el pre-RC no está ensamblado. c.1 Componentes del Pre-RC Uno de los integrantes del pre-RC es el complejo ORC (origin replication complex), formado por seis subunidades proteicas que actuarán como punto de ensamblaje para el resto de componentes (Cdc6, Cdt1, MCM). El reclutamiento previo de las ATPasas Cdc6 y Cdt1 al ORC permitirá el ensamblaje del complejo MCM (minichromosome maintenance proteins) en una reacción dependiente de ATP (Guillespie et al. 2001; revisado por Mendez y Stillman en 2003; Cook et al. 2004). El complejo MCM está compuesto por los productos de 6 genes diferentes (mcm2-7), conservados de levaduras a mamíferos que interaccionan entre ellos para formar un complejo hexamérico, que constituirá la helicasa replicativa (Schwacha et al. 2001). Cada proteína del MCM posee un dominio carboxi-terminal conservado donde reside una secuencia con homología a las helicasas de ADN hexaméricas y un motivo ATPasa.

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INTRODUCCIÓN c.2 Regulación de la formación del complejo pre-RC en mamíferos Aunque los componentes del pre-RC están muy conservados de levaduras a mamíferos, la regulación del establecimiento de licencia es muy diferente en metazoos y levaduras (revisado por Nishitani y Lygerou 2002; Diffley en 2004). En levaduras, la regulación de la actividad CDK constituye el principal mecanismo de control del inicio de la replicación, mientras que en metazoos la licencia se regula controlando la actividad de Cdt1 (FIG I.4). Para deshabilitar el estado de licencia de los orígenes de replicación, se promueve la degradación de Cdt1 y la activación de su inhibidor Geminin. La unión de Geminin a Cdt1 impide que éste se una al ORC en el origen de replicación (Wohlschlegel et al. 2000). Desde G2 al inicio de G1, Cdt1 se acumula en forma inactiva unido a Geminin, que le skp2 protege de su degradación por ubiquitinación vía SCF (Ballabeni et al. 2004). Al final de cdh1 mitosis, Geminin será degradado por APC permitiendo el establecimiento de licencia durante G1 (McGarry et al. 1998; Li y Blow 2004)

FIg I.4 Regulación del inicio de la replicación. En la figura, el color verde de fondo indica el periodo, dentro del ciclo celular, durante el cual se establece la licencia de inicio de la replicación y ensamblaje del pre-RC . En contraposición, en rojo se engloban los procesos que mantienen los orígenes de replicación inactivos por acumulación de complejos Geminin/Cdt1.

Aunque de menor importancia en la regulación de la licencia, también se han descrito otros mecanismos de control de la actividad CDK sobre otros componentes del pre-RC, como ORC y Cdc6. Las subunidades ORC 2-6 permanecen unidas a la cromatina durante todo el ciclo celular, pero en algunos tipos celulares ORC1 es poli-ubiquitinilada y degradada en fase S vía Skp2 SCF (Mendez et al. 2002). En otros tipos celulares, ORC1 es mono-ubiquitinilada y/o fosforilada induciendo su desensamblaje de la cromatina pero no su degradación (Li et al. 2002; Li et al. 2004). Cdc6 permanece unido a la cromatina durante todo el ciclo celular (Coverley et al. 2000). El exceso de Cdc6 en fase S es fosforilado por ciclina A/CDK2 induciendo su exportación nuclear y degradación (Saha et al.1998; Mendez y Sillman 2000), aunque no existen evidencias de la relevancia de este fenómeno en prevenir re-replicación (Alexandrow y Hamlin 2004). Una vez que el MCM se carga en el pre-RC, el DNA tiene licencia para ser replicado. El ensamblaje de MCM requiere de actividad Ciclina E/CDK2. Fibroblastos murinos embrionarios (MEFs) procedentes de ratones donde se ha suprimido la expresión de las ciclinas E1 y E2, son incapaces de entrar en S desde G0 (Geng et al. 2003). Esto no ocurre cuando el gen eliminado es el de la quinasa CDK2, sugiriendo que otra CDK asociada a ciclina E puede regular la carga de la helicasa MCM en el ORC (Berthet et al.2003).

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INTRODUCCIÓN c.3 Activación del pre-RC Los mecanismos que controlan la activación del pre-RC no han sido todavía claramente definidos, pero se sabe que requieren de la actividad de CDKs y Cdc7/Dbf4 (DDKs; Dbf4 dependent-kinases; del inglés quinasas dependientes de Dbf4) (Nougarede et al. 2000; revisado por Bell y Dutta en 2002). Estas quinasas fosforilan el complejo MCM en el pre-RC (Tsuji et al. 2006). La activación del pre-RC permite el reclutamiento de, entre otros, Mcm10, Cdc45 y RPA (replication protein A) necesarios para el reclutamiento de la primasa (Polα) que sintetiza el primer de ARN (Zou y Sillman 2000; Wolschlegel et al. 2002; Chattopadhyay y Bielinsky 2007). Tras la iniciación, MCM se desplazará con la horquilla de replicación dejando al origen de replicación sin licencia para iniciar una nueva síntesis. c.4 Elongación La elongación de la doble hebra de ADN requiere del reclutamiento de PCNA y la sustitución de Polα  por las polimerasas procesivas (δ y ε). (Waga y Stillman 1994). La unión de PCNA al extremo 3’-OH de la hebra naciente de ADN es catalizada por RFC (replication factor complex) en una reacción ATP dependiente (Maga et al. 2000). La asociación de PCNA a la subunidad catalítica de Polδ requiere la actividad ATPasa de RFC y sólo ocurre una vez que PCNA/RFC esté unido a la cromatina (Garg y Burgers 2005; FIG I.5).

FIG I.5 Reclutamiento de PCNA a la cromatina. El primer paso de este proceso es la asociación de PCNA con el complejo RFC. La presencia de ATP en el complejo RFC/PCNA induce la apertura del anillo de PCNA posibilitando su unión a la cromatina. Para el intercambio de RFC por la Polimerasa δ se requiere la hidrólisis de ATP mediada por la Cip1 actividad ATPasa de RFC. p21 interfiere en dos momentos de este proceso, impidiendo la asociación de RFC/ PCNA e inhibiendo la actividad ATPasa de RFC.

PCNA pertenece a la familia de las “β-clamps” (del inglés pinzas β). En eucariotas estos complejos están formados por homotrímeros que constituyen un anillo. El interior del anillo está formado por α-hélices con carga positiva por el que discurre el ADN (revisado por Moldovan et al. 2007). Los diferentes monómeros que componen el anillo de PCNA se Cip1 conectan por un bucle flexible donde se encuentra la región de unión p21 que interacciona simultáneamente con dos monómeros adyacentes. (Gulbis et al. 1996; Oku et al. 1998). Cip1 La unión de PCNA a Polδ y Polε está regulada por p21 que al interaccionar con PCNA impide la asociación de las polimerasas (Waga et al.1994; Podust et al. 1995; Waga y Cip1 Stillman 1998). Para la liberación de PCNA, p21 ha de ser fosforilado. Se han descritos dos Cip1 sitios de fosforilación de p21 (Thr 145 y Ser 146) que regulan su unión a PCNA, aunque la contribución relativa de cada uno no está del todo definida (Scott et al. 2000; Rössig et al. Cip1 2001). Se ha propuesto PKB como la quinasa del residuo Thr145 de p21 (Rössig et al. 2001).

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INTRODUCCIÓN

II PI3 K Todos los eventos resumidos en el apartado anterior que culminan en la generación de dos células hijas, han de ser altamente regulados por el ambiente extracelular para que la división sólo se produzca en las condiciones óptimas de nutrientes y cuando el organismo lo requiera. Para ello, las células responderán a una serie de sustancias químicas extracelulares, en su mayoría proteínas, conocidas como factores de crecimiento. La unión de estos factores a sus receptores específicos en la membrana celular estimulará la actividad quinasa del receptor o de proteínas asociadas que, a su vez, reclutarán a las proximidades del receptor a diferentes enzimas. Se inicia así una cascada de señalización, que permite la transducción de la señal extracelular para desencadenar una determinada respuesta que puede ser la división, la migración, la diferenciación o incluso, la muerte celular (revisado por Jones y Kazlaukas en 2001). PI3K (fosfatidil-inositol 3-quinasa) constituye una de las múltiples familias de quinasas activadas en respuesta a factores de crecimiento. Estas enzimas fosforilan la posición 3´-OH del anillo inositol del fosfatidil-inositol (PtdIns) y fosfoinosítidos derivados (PIs). A diferencia de otros PIs, en las células de mamífero los niveles de PtdIns (3,4,5)P3 (PIP3), PtdIns(3,5)P2 y PtdIns (3,4)P2 son muy bajos y aumentan significativa y transitoriamente en repuesta a estímulo, lo que les convierte en segundos mensajeros capaces de transducir estímulos extracelulares al interior de la célula. Todos los miembros de PI3K comparten un dominio catalítico y un dominio PIK (PI kinase homology domain). El dominio catalítico de PI3K presenta una gran homología con el de las PI4Ks, entre estas quinasas encontramos mTOR (mammalian target of rapamycin), ATM (ataxia telangiectesia mutated) y la subunidad catalítica de DNA-PK (DNA-dependent protein kinase).

1. CLA SE S DE P I3 K

Las diferentes isformas de PI3K pueden dividirse en tres clases atendiendo a su estructura y especificidad de sustrato (revisado por Vanhaesebroeck et al. 2001). a)Clase I Los miembros de la clase I de PI3K fosforilan PtdIns, PtdIns(4)P y PtdIns (4,5)P2 in vitro, aunque es este último su sustrato preferente in vivo (Hawkins et al. 1992). La activación de PI3K de clase I está asociada a estímulos extracelulares y se subdivide en clase IA y IB en función del receptor que las activa (FIG I.6). Clásicamente se considera que PI3K de clase IA es activada por Tyr-quinasas y la clase IB responde a la activación de receptores acoplados a proteína G (GPCRs), pero como veremos más adelante esta distinción no es tan estricta. Las subunidades catalíticas de clase I son también activadas por Ras.

FIG I.6 La clase I de PI3K se subdivide, a su vez, en las clases IA y IB. Los miembros de PI3K de clase I son heterodímeros constituídos por una subunidad reguladora y una subunidad catalítica. Las elipses de la parte inferior del diagrama representan las diferentes isoformas de subunidad reguladora (azul) y catalítica (verde); sobre ellas en negro se indica la nomenclatura del gen correspondiente.

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INTRODUCCIÓN

Además de su actividad lípido quinasa, PI3Ks de clase I y III pueden actuar como quinasas de proteínas (Dhand et al. 1994). a.1 Clase IA Los miembros de la clase I de PI3K son heterodímeros formados por una subunidad catalítica (p110) y una subunidad reguladora (p85). Las subunidades catalíticas p110 de clase IA cuentan en su estructura con un dominio de unión a Ras (RBD) y un dominio C2 comprendido entre el RBD y el domio PIK (FIG I.7). Los dominios C2 son dominios de entre 80 y 160 aminoácidos, que unen fosfolípidos de forma Ca2+ dependiente o independiente. Estos dominios pueden mediar interacciones proteína-proteína, aunque esto aún no se ha descrito para PI3K. En mamíferos, se han descrito 7 isoformas de la subunidad reguladora de clase I. El procesamiento alternativo del gen PIK3r1 da lugar a las isoformas: p85α, p55α, p50α y otras dos isoformas minoritarias específicas de corazón y músculo esquelético y cardiaco. Las isoformas p85β y p55γ son productos de la expresión de los genes PIK3r2 y PIK3r3 respectivamente (revisado por Funaki et al. 2000) . Las subunidades p85α y p85β, están compuestas por un dominio SH3, 2 secuencias ricas en prolina que flanquean un dominio BH (Bcr-homology) y 2 dominios SH2 (Src homology 2). La región inter-SH2 media la interacción con la subunidad catalítica y estimula la actividad lípido y proteína quinasa de p110 (Klippel et al. 1993;1994). En las subunidades p50α y p55α, los dominios SH3, BH y una de las regiones ricas en prolina son sustituídas por extensiones de 6 y 34 aminoácidos (FIG I.7).

FIG I.7 Estructura de las subunidades reguladoras y catalíticas de PI3K de clase IA. (A) Estructura compartida por las subunidades p110 de clase I: dominio de unión a p85 (p85B), dominio de unión a Ras (RBD), dominio C2, dominio PIK y el dominio catalítico (PI3Kc). (B) Estructura de las subunidades reguladoras mayoritarias de clase IA, indicando la distribución de los dominios SH2, SH3 y BH.

Se aisló un mutante de p85 en linfomas tímicos murinos donde el dominio SH2 carboxiterminal y parte de la región inter-SH2 son sustituidos por una región conservada de la familia de receptores eph. La actividad lípido quinasa asociada a este mutante es mayor que la asociada a la forma silvestre, tanto en presencia como en ausencia de estímulo (Jiménez et al.1998). Los dominios SH2 poseen una alta afinidad por residuos de Ty fosforilados en motivos YxxM de receptores de factores de crecimiento, sus sustratos o proteínas adaptadoras. PIP3 también puede unirse al dominio SH2 de p85α (Rameh et al. 1995). La unión de p85α a residuos de fosforilados de Tirosina (Tyr) disminuye a medida que se va generando PIP3 en la membrana, ésta interacción puede ser un mecanismo de autorregulación negativa de PI3K. EN la clase IA existen 3 isoformas de subunidad catalítica producto de tres genes diferentes, p110α p110β y p110δ. Mientras que p110α y β presentan una expresión ubicua en tejidos de mamíferos, p110δ se expresa mayoritariamente en tejido hematopoyético (Hiles et al. 1992; Hu et al. 1993; Vanhaesebroeck et al. 1997). Todas las células de mamífero expresan, al menos, una isoforma de PI3K de clase IA.

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INTRODUCCIÓN Un único tipo de heterodímero de clase IA se expresa en Drosophila melanogaster (Dp110/p60) y Caenorhabditis elegans (AGE-1/AAP-1). En Dictyostelium discoideum se han descrito 3 subunidades catalíticas con homología a clase I, pero no está claro cuál de estas isoformas está más relacionada con clase IA y cuál con clase IB. No se ha encontrado homólogos de clase IA ni en levaduras ni en plantas (revisado por Vanhaesebroeck et al. 2001). a.2 Clase IB Existe una única subunidad catalítica de clase IB, p110γ que asocia dos subunidades PIKAP reguladoras, p101 y p87 (Stephens et al.1997; Voigt et al. 2006) La clase IB de PI3K se activa por proteínas G heterotriméricas en respuesta a estimulación de receptores de 7 dominios transmembrana (GPCRs) (Stephens et al. 1994). La Clase IB se expresa sólo en mamíferos y mayoritariamente en sistema hematopoyético, aunque también se encuentra en bajas concentraciones en endotelio, músculo liso y cardiomiocitos. b) Clase II Los miembros de PI3K de clase II son proteínas de alto peso molecular (170KDa) asociadas a membrana. Se diferencian de otras clases de PI3K por poseer un dominio C2 en 2+ extremo carboxi-terminal, capaz de unir fosfolípidos de forma Ca -independiente y de carecer de dominios de unión a Ras. In Vitro, fosforilan preferentemente PtdIns, aunque también tienen como sustratos PtdIns(4)P y PtdIns(4,5)P2. No se ha detectado aún cuál de estos lípidos fosforila in vivo. Se desconocen las interacciones que ligan estímulos extracelulares con clase II PI3K, aunque se ha descrito que EGF (epidermal growth factor), PDGF (platelet derived growth factor), insulina o MCP-1(monocyte chemotactic protein-1) pueden inducir un aumento de actividad en inmunoprecipitados de PI3K de clase II (Arcaro et al. 2000, Zhang et al. 1998, Turner et al. 1998). En mamíferos, 3 genes codifican por 3 isoformas de clase II, PI3K-C2α, β y γ. Mientras que las dos primeras presentan una expresión ubicua, γ se expresa principalmente en hígado. En D. Melanogaster o C.elegans sólo se ha descrito una isoforma de clase II y no se han encontrado homólogos en plantas o levaduras. c) Clase III PI3K de clase III son homólogos a Vps34p (vesicular-protein-sorting-protein) de levaduras. Estas quinasas sólo usan PtdIns in Vitro y parecen ser los principales productores de PtdIns(3)P celular. La actividad de clase III PI3K está relacionada con tráfico vesicular. Sólo se ha identificado una subunidad catalítica en todas las especies eucariotas. Tanto en levaduras como en mamíferos esta subunidad existe en complejo con una Ser/Thrquinasa (p150 en mamíferos y Vpsp15p en levaduras) que presenta una miristilación en su extremo amino-terminal.

2.A CT IVA CIÓ N E IN ACT IVA CIÓ N DE P I3K DE CLA SE IA

La unión de un factor de crecimiento a su receptor inducirá la actividad Tyr-quinasa intrínseca del receptor, o de quinasas asociadas que fosforilarán residuos de Tyr en el mismo receptor o en moléculas adaptadoras. p85 unirá estos residuos de fosfo-Tyr por sus dominios SH2, reclutando a p110 a la membrana donde se encuentra su sustrato, e induciéndole un cambio conformacional que induce la activación del enzima (Panayotou et al 1992). El reclutamiento de p110 a la membrana por p85 es esencial para su activación, de hecho, la adición de un sitio de farnesilación a p110α recombinante resulta en una activación constitutiva del enzima (Jiménez et al. 1998) (FIG I.8). Existen diferentes familias de proteínas adaptadoras implicadas en el reclutamiento de PI3K como, Shc, IRS (insulin receptors substrates) Grb2 o Gab (Grb2-associated binder). Estos adaptadores unen fosfolípidos de membrana mediante sus dominios PH que median

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INTRODUCCIÓN interacciones proteína-proteína y lípido-proteína. Las diferentes familias de adaptadores poseen dominios PH selectivos para PIP3 (revisado por Wymann et al. 2003). PI3K también puede activarse por Ras, la unión a Ras induce cambios conformacionales en la subunidad p110 favoreciendo su actividad (Rodríguez-Viciana et al.1994; Pacold et al. 2000; Jiménez et al. 2002). Existen otros mecanismos de activación de PI3K, como son la activación mediada por ácido lisofosfatídico (LPA), por moléculas de adhesión y por receptores nucleares (revisado por Yart et al. 2002). También se ha descrito que las subunidades βγ de proteínas G pueden activar directamente p110β (Murga et al. 2000 ;Guillermet-Guibert et al. 2008). La señal intracelular iniciada por PI3K puede ser inactivada por el supresor de tumores, PTEN (phosphatase and tensin homolog detected on chromosome 10). PTEN es una fosfatasa que defosforila la posición 3’ OH-inositol de PtdIns (3,4)P2 y PIP3 generando PtdIns(4)P y PtdIns(4,5)P2 (Stambolic et al. 1998). Otra forma de degradar el PIP3 es por la acción de SHIP. SHIP (Src-homology-2containing inositol 5’-phosphatase) es una 5’-fosfatasa que hidroliza el PIP3 generando PtdIns (3,4)P2 finalizando ciertas rutas iniciadas por PI3K e iniciando otras diferentes (Stephens et al. 1993).

FIG I.8 Activación de PI3K por receptores de factores de crecimiento. Tras activación de un receptor Tyr-quinasa, PI3K es reclutada por la subunidad reguladora p85 a los residuos fosforilados de Tyr en el receptor, o en moléculas adaptadoras. La GTPasa RAS también es activada por su GEF SOS en respuesta a factores de crecimiento. Una vez activo, RAS contribuirá a la activación de PI3K. Las subunidades Gβγ activarán a p110β tras estimulación con agonistas de GPCRs. La fosfatasa PTEN cataboliza el PtdIns (3,4,5)P3 generado por PI3K apagando la señal.

4.SEÑAL IZ ACIÓ N DE PI3 K DE CL A SE I

El PIP3 generado en la membrana por acción de PI3K será reconocido por proteínas con dominios homólogos a pleckstrina (dominios PH). La unión de la proteína al fosfolípido modificará su localización, su conformación y su actividad. Existen ciertos dominios PH que unen preferencialmente PIP3 y PtdIns (3,4)P2 (revisado por Fruman et al. 1999). Entre las moléculas señalizadoras que unen PIP3 y PIP2 encontramos Ser/Thr-quinasas (PKB, PKC, PDK1), GEFs, GAPS, proteínas Tyr-quinasa (SRC, BTK) o fosfolipasas (PLCγ). De algunas de estas moléculas hablaremos en los apartados siguientes. a) PDK1 y PKB Una de las proteínas con dominios PH activadas por PI3K es PKB (Burgering y Coffer 1995), el homólogo celular de la oncoproteína viral v-Akt, por lo que también se le conoce como AKT. 3 genes codifican para 3 isoformas de PKB/AKT (PKB-α o AKT1, PKB-β o AKT2 y PKB-γ o AKT3). La familia PKB son Ser/Thr quinasas que fosforilan el motivo RXRXXS/T. PKB contiene un dominio PH en su extremo amino-terminal y una región reguladora en su extremo carboxi-Terminal. Para su completa activación ha de ser fosforilada en dos residuos: uno localizado en su dominio quinasa (Thr308) y otro en el dominio regulador (Ser473).

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INTRODUCCIÓN La unión de PKB a PIP3 induce un cambio conformacional en la proteína que permite la fosforilación de PKB en Thr308. La quinasa responsable de la fosforilación de Thr308 se identificó como PDK1 (3’-phosphoinositide-dependent protein kinase -1). El complejo mTOR/rictor (mTORC2) y la quinasa DNA-PK fosforilan el residuo Ser473 (revisado por Lawlor y Alessi 2001; Surucu et al. 2008). PDK1, a su vez, es activada directamente por PtdIns(3,4)P2 y PIP3. Existen también mecanismos de activación de PKB independientes de PI3K (Decaer et al. 2000) . El segmento de activación de PKB (Thr308) y el motivo hidrofóbico regulador entorno al residuo Ser473 están muy conservados en la familia de quinasas AGC . Esta familia de proteínas son Ser/Thr quinasas, muchas de ellas sustratos también de PDK1. Entre los miembro de las AGC se encuentran algunas isoformas de PKC (Le Good et al. 1998), SGK (glucocorticoid-inducible kinase) (Park et al. 1999) y p70S y p90 S6-quinasas (Pullen et al.1998, Jensen et al, 1999). b) TEC quinasas Los miembros de la familia TEC son Tyr-quinasas que tienen en común con las quinasas Src su estructura SH3/SH2/dominio quinasa, pero poseen además un dominio PH en su extremo amino-terminal sustituyendo la modificación de unión a membrana presente en la Src quinasas. Éstas ultimas fosforilan y activan a las quinasas TEC reclutadas al PIP3 de membrana por su dominio PH (revisado por Cantrell 2001). Entre los miembros de las TEC quinasas se encuentran, entre otros, BTK (Bruton’s tyrosine kinase) e ITK (inducible T-cell kinase). c) GEFs y GAPs La superfamilia de las GTPasas (guanosina trifosfatasa) comprende a un gran número de proteínas, estructuralmente relacionadas, que ejercen una gran variedad funciones biológicas. Según sus características funcionales y estructurales esta superfamilia se ha subdividido en cinco familias: RAS, RHO, RAF, ARF y RAN. Las GTPasas pequeñas ciclan entre un estado inactivo, unidas a GDP, y un estado activo cuando lo están a GTP. La transición entre ambos estados es regulada por dos tipos de proteínas, GEFs (GTP/GDP Exchange factors) y GAPs (GTPase-activating proteins). Los factores GEFs catalizan la liberación de GDP y la consecuente unión de GTP, los GAPs estimulan la actividad GTPasa de estas proteínas regulando el paso de activo a inactivo. Diferentes familias de GTPasas están reguladas por diferentes GEFs y GAPs. AQUÍ ESTABILIZA Muchos de estos intercambiadores de nucleótidos contienen dominios PH, haciéndoles susceptibles a regulación por PIP3, como es el caso del GEF de las GTPasa RAC , VAV1 (Han et al.1998).

5.F UN CIONE S B IOLÓG ICA S DE P I3K DE CLA SE IA

a) Supervivencia. PI3K promueve supervivencia a través de diferentes efectores, uno de ellos es la proteína BAD (Bcl-2/Bcl-XL-antagonist, causing cell death). La función antiapoptótica de Bcl-2 o Bcl-XL se inhibe cuando estas proteínas forman heterodímeros con BAD. La fosforilación de BAD mediada por PKB desensambla estos complejos, previniendo la muerte celular (Del Peso et al. 1997; Datta et al. 1997; revisado por Downward 1999). Otra diana de PKB esencial en el inicio de apoptosis es Caspasa 9, su fosforilación por PKB inhibe su función (Cardone et al. 1998). El factor de transcripción NF-κB regula la transcripción de proteínas antiapoptóticas y su actividad también está regulada por PI3K. Cuando NF-κB está unido a su inhibidor citosólico I-κB, permanece inactivo. Las IKKs (I-κB kinases) fosforilan I-κB promoviendo su degradación, a su vez, PKB fosforila las IKKs, activándolas (Ozes et al. 1999).

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INTRODUCCIÓN La expresión del ligando de Fas está regulada por los factores de transcripción FOXO cuya función, como veremos más adelante, se inhibe al ser fosforilados por PKB. Esta ruta constituye así, otra rama de los diferentes mecanismos utilizados por PI3K para promover supervivencia (revisado por Burgering et al. 2002). La actividad PI3K contrarresta también la acción proapoptótica y anti-proliferativa del supresor de tumores p53 a través de su inhibidor MDM2. MDM2 se une a p53 inhibiendo su función transcripcional y favoreciendo su degradación (Momand et al. 1992). PKB fosforila MDM2 induciendo su localización nuclear donde ejerce su acción inhibitoria sobre p53 (Mayo y Donner 2001). b) Metabolismo La modulación de los niveles de PIP3 es esencial para el control metabólico. IGF-1 (insulin growth factor 1) e insulina señalizan vía PI3K de clase IA (revisado por Sheperd et al. 1998). El enzima GSK3 (glycogen synthase kinase 3) fosforila e inactiva la glucógeno sintetasa, encargada de catalizar el último paso de la síntesis de glucógeno. La fosforilación de GSK3 por PKB mantiene al enzima inactivo (Cross et al. 1995). c) Reorganización del citoesqueleto y migración celular. La acción de los productos lipídicos de PI3K sobre moléculas intercambiadoras de nucleótidos repercute en la activación de las GTPasas RAC y RHO que regulan el citoesqueleto de actina de formas diferentes (Reif et al. 1996). Mientras que RHOA regula la formación de fibras de estrés y adhesiones focales, RAC1 está implicada en la formación de lamelipodios (Ridley et al. 1992; Nobes y Hall 1995). La activación de PI3K promueve reorganización del citoesqueleto y migración celular (Reif et al. 1996; Graupera et al. 2008) Independientemente su actividad lípido quinasa asociada, p85α activa Cdc42 promoviendo la formación de filopodios, el desensamblaje de las fibras de estrés y la reducción de contactos focales promoviendo la migración de fibroblastos en respuesta a PDGF (Jiménez et al. 2000). d) Sistema Inmune El enzima BTK es esencial para el desarrollo de células B (Scharenberg et al. 1998) Mutaciones en el dominio PH de BTK humana causan Agammaglobulinemia ligada al cromosoma X, lo que pone de manifiesto el papel crítico de PI3K en la homeostasis del sistema inmune (revisado por Cantrell en 2001) . Los ratones deficientes en la subunidad p85α y aquellos en los que se suprimió la expresión de las tres isoformas codificadas por el gen Pik3r1 (p85α, p55α y p50α) presentan defectos en el desarrollo y función de las células B (Suzuki et al. 1999; Fruman et al. 2000); que también se ven afectados en ratones donde se ha suprimido la expresión de p110δ o se ha sustituido por mutantes inactivos (Clayton et al. 2002; Okkenhaug et al. 2001). Okkenhaug et al. (2001) reportaron también una respuesta defectiva de las células T en los ratones que expresan la forma inactiva de p110δ. e) Ciclo celular El control de ciclo celular por PI3K será tratado con detalle en el siguiente apartado.

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INTRODUCCIÓN III PI3K EN CICLO CELULAR

1. CRE CIM IE NTO

mTOR y p70S6K son dos enzimas clave de la ruta de señalización que controla el aumento de masa celular. mTOR actúa como sensor de nutrientes dentro de la célula y su activación sólo tendrá lugar con las condiciones idóneas de oxígeno, ATP y niveles de aminoácidos. mTOR forma parte de un complejo multiproteico en el que es regulado negativamente por el complejo TSC (tuberous sclerosis complex), compuesto por TSC1 (hamartina) y TSC2 (tuberina) (revisado por Carrera en 2004). La fosforilación de TSC2 por PKB lo desestabiliza e impide su interacción con TSC1, permitiendo la liberación de mTOR (Inoki et al. 2002; Potter et al. 2002). La activación de mTOR por PI3K permitirá dos eventos esenciales para el crecimiento, la fosforilación de p70S6K y de eIF4EBP1 (eIF4E binding protein 1) (revisado por Thomas en 2002) (FIG I.9). La completa activación de p70S6K requiere de fosforilaciones seriadas, algunas de ellas dependientes de actividad PI3K, y de la formación del complejo ternario p85/p70S6K/ mTOR (Montagne et al.1999; González-García et al. 2002 ; revisado por Pullen y Thomas 1997). p70S6K activa fosforilará la proteína S6 de la subunidad 40S del ribosoma, lo que hace que se ensamblen polisomas y aumente la incorporación de ARNs mensajeros 5’-TOPs. El nombre de estos mensajeros deriva de una cola de polipirimidinas que contienen en el extremo 5’ y codifican para proteínas ribosomales y factores de elongación. Así la activación de p70S6K inicia la biogénesis de ribosomas promoviendo la síntesis de proteínas. Otra diana de mTOR es eIF4EBP1 que se une al factor de iniciación de la traducción eIF4 (eukaryotic translation initation factor 4E) manteniéndolo inactivo. eIF4 es necesario para la traducción dependiente de 5’CAP. La fosforilación del inhibidor eIF4EBP1 por mTOR, permite que éste libere al factor eIF4E (Brunn et al. 1997).

2. T RA N SICIÓN G0/G 1

Tras estimular las células con factores de crecimiento, PI3K presenta 2 picos de actividad, uno minutos después de la activación y un segundo pico menor en G1 tardía, responsable del inicio de la síntesis de ADN (Jones et al. 1999). La entrada en fase S desde quiescencia requiere de factores de crecimiento en dos momentos. El primer momento es en la transición de G0 a G1, donde se produce la activación del metabolismo y un aumento de la síntesis de proteínas que incluye ciclina D. El segundo punto en el que se necesita de la presencia de factores de crecimiento es en mitad de G1 cuando se produce la activación de las CDKs. En este punto, las funciones dependientes de factor de crecimiento son mediadas por PI3K (Jones et al. 2001). Se han descrito múltiples mecanismos por los que PI3K regula la transición G0/G1 (revisado por García et al. 2006a) (FIG I.9). PI3K induce la síntesis de ciclina D vía sus efectores Rac y Cdc42 (Olson et al.1995) e inactiva GSK-3β que media la degradación del factor de transcripción c-Myc y de las ciclinas D y E (van Weeren et al. 1998; Welcker et al. 2003; revisado por Ryves y Harwood 2003). Otro de los sustratos tempranos en ciclo celular de PI3K es la familia FOXO de los factores de transcripción Forkhead: FKHR(FOXO1), FKHR-L1(FOXO3a) y AFX (FOXO4). PKB fosforila e inactiva los factores de transcripción FOXO. Una vez fosforilado, FOXO unirá la proteína 14-3-3 lo que provoca su liberación del ADN y translocación al citoplasma (Kops et al. 1999; revisado por Arden y Biggs 2002). Los factores FOXO regulan la transcripción de los genes de los inhibidores de ciclo Kip1 p27 , ciclina G2, o la proteína p130 (Medema et al. 2000; Martínez-Gac et al. 2004; Kops et al. 2002). Además, los factores FOXO actúan como represores de la transcripción de ciclina D (Schmidt et al. 2002).

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INTRODUCCIÓN

FIG I.9 PI3K regula eventos tempranos del ciclo celular. Tras la estimulación de receptores de crecimiento, PI3K es reclutada a la membrana y activada. PDK1 y PKB se unirán al PIP3 generado en la membrana, lo que favorece su activación. PKB activa la ruta de síntesis de proteínas de mTOR /p70S6K. Entre los sustratos de PKB se encuentran también los factores de transcripción FOXO, la fosforiclación de estos factores induce su retención en el citoplasma Kip1 impidiéndose la transcripción de los genes de los inhibidores de ciclo p27 y ciclina G2. Los factores de transcripción FOXO actúan también como represores transcripcionales de ciclina D. La kinasa GSK3 también es inhibida tras fosforilación por PKB. GSK3 media la degradación de c-Myc y de las ciclinas D y E.

3.TRA N SICIÓ N G 1/ S La activación de PI3K en G1 tardía es esencial para entrada en S (Jones et al. 2001). Este segundo pico de activación es inducido por Tyr-quinasas y Ras y su función principal es inducir la estabilidad del factor de transcripción c-Myc (Kumar et al. 2006). La fosforilación del resido Ser62 de c-Myc por MAPK promueve su estabilización pero favorece la posterior fosforilación del residuo Thr58 por GSK3β que induce su degradación (Yeh et al. 2004). La activación de PKB en G1 tardía inhibe al enzima GSK3β, estabilizando cMyc (Kumar et al. 2006). Entre los genes diana de c-Myc se encuentran las ciclinas D, E y, en mayor grado, la ciclina A (revisado por Ponzielli et al. 2005). La estabilización de c-Myc en G1 tardía permite la expresión de ciclina A y la activación de los complejos ciclina/CDK2 disminuyendo su Kip1 asociación con p27 (Kumar et al. 2006; Perez- Roger et al. 1997) .

4.CO OR DIN A CIÓ N DE CR ECIM IE NTO Y DIV ISIÓ N Los procesos de crecimiento y división celular han de ser finamente regulados para asegurar que la replicación se inicia sólo cuando la célula ha alcanzado el tamaño adecuado. En mamíferos los mecanismos que coordinan ambos procesos aún no están definidos, aunque parece que la ruta de PI3K tiene un papel en mediar dicha relación. De hecho, el aumento o disminución de la activación transitoria de PI3K, aumenta o disminuye, respectivamente, la síntesis de proteínas afectando de forma inversa el tiempo de división. Este fenómeno sugiere que la magnitud de PI3K regula simultáneamente la progresión del ciclo y la síntesis de proteínas. En cambio, la expresión de una forma constitutivamente activa de PI3K altera las cinéticas de activación de p70S6K y mTOR dando lugar a células más grandes, sugiriendo que la activación de PI3K ha de ser transitoria para una correcta coordinación de crecimiento y división (Álvarez et al. 2003; revisado por García et al. 2006).

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INTRODUCCIÓN 5.FA SE S G2 y M Durante la fase G2, PI3K ha de permanecer inactiva para permitir la relocalización nuclear de los factores de transcripción FOXO que regulan la expresión de ciclina B y Plk (Polo like kinase), ambas necesarias para la mitosis (Álvarez et al. 2001). Si bien, previo a mitosis existe otro pico de activación menor de PI3K necesario para la correcta iniciación de esta fase del ciclo celular (Shtivelman et al. 2002). Al final de mitosis la actividad de PI3K es baja, pero se ha descrito una función de la subunidad reguladora p85, independiente de actividad quinasa, en citoquinesis. Durante la división del citoplasma, p85α regula el citoesqueleto de septinas a través de su efector Cdc42, evento esencial para un correcto establecimiento del plano de división celular (García et al. 2006; revisado por Silió et al. 2007).

IV Especificidad de función de las isoformas p110α y p110β

1. R ATO NE S KNO CK O UT DE p 110 α y p 110β

La supresión de la expresión de la subunidad p110α o p110β en ratones (ratones knock out), supone la muerte del embrión a día 9.5/10.5 y 3.5 del desarrollo respectivamente (Bi et al. 1999; 2002). Lo que demuestra que, al menos durante el desarrollo, ambas isoformas no ejercen funciones redundantes. Los embriones p110α-/- presentan defectos proliferativos y en angiogénesis lo que provoca hemorragias masivas. La letalidad embrionaria tan temprana en los ratones p110β-/no permite caracterizarlos.

2. APR O X IM ACIO NE S M OLE CULARE S

La dificultad de establecer modelos animales para el estudio de la especificidad de función de las isoformas p110α y p110β ha hecho que se hayan utilizado diferentes aproximaciones moleculares para interferir en la función de ambas isoformas. a) Microinyección de anticuerpos La primera técnica con la que se abordó el tema de la especificidad fue la microinyección de anticuerpos inhibidores de la actividad p110α y p110β. Estos trabajos se centraron en el estudio de las isoformas activadas en repuesta a diferentes factores de crecimiento. Pudieron concluir que la síntesis de ADN inducida por PDGF es inhibida por anticuerpos anti-p110α mientras que la inducida por LPA es mediada por p110β (Roche et al. 1994;1998; Hooshmand-Rad et al. 2000). Trabajos posteriores corroborarán que es p110β la isoforma que media la respuesta a receptores acoplados a proteínas G (GPCRs), como en el caso de LPA (Murga et al 2000; Yart et al 2002; revisado por Yart et al. 2002; Kubo et al.2005). En otros casos se vio que la función de cada isoforma en respuesta a un factor de crecimiento variaba dependiendo del tipo y respuesta celular (Roche et al.1994; Vanhaesebroeck et al. 1999). b) ARN interferente/Mutantes activos e inactivos de p110 Varios trabajos utilizando dominantes negativos y ARN interferente para p110α y p110β corroboraron los datos de que es p110β la isoforma que se activa por GPCRs (Murga et al 2000; Yart et al 2002; revisado por Yart et al. 2002; Kubo et al. 2005).

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INTRODUCCIÓN c) Inhibidores específicos El desarrollo de inhibidores químicos para las diferentes isoformas de p110 no sólo permite comprender la función individual de cada isoforma, sino que abre una ventana terapéutica para enfermedades como cáncer, hipertensión, inflamación crónica y problemas autoinmunes (Patrucco et al. 2004; Barber et al. 2005; Jackson et al. 2005; revisado por Wymann y Marone 2005). La función específica de p110β en la agregación plaquetaria sostenida hace de sus inhibidores químicos específicos, una prometedora terapia antitrombótica (Jackson et al. 2005). Mientras que p110δ se ha propuesto como diana para fenómenos de alergia (Ali et al. 2004). El trabajo de Knight et al. (2006) señala a p110α como la isoforma crítica para la respuesta celular a insulina vía IRS (insulin-receptor substrate).

3. N UEV O S M O DEL OS A N IMALE S

En los últimos años, el desarrollo de ratones knock-in y knock-out condicionales está permitiendo caracterizar la función de p110α in vivo. No ha sido hasta hace escasos meses cuando estos modelos han empezado a dar luz sobre el papel de p110β. La conclusión común que podemos extraer de estos trabajos es que, corroborando los datos obtenidos con inhibidores químicos de Knight et al. (2006), p110α es la isoforma que regula de modo más directo la respuesta a las hormonas insulina, IGF-1 (insulin-like growth factor-1), o leptina vía IRS. En los ratones knock in de p110α, la expresión de la proteína endógena se sustituyó por la de una forma catalíticamente inactiva (p110α D933A) (Foukas et al. 2006). La expresión en homocigosis de este mutante induce letalidad embrionara en estadío 9.5, igual que el knockout clásico (Bi et al. 1999). Los ratones heterocigotos para la expresión de p110α D933A son viables y fértiles, pero presentan menor crecimiento somático e intolerancia a la glucosa por defectos en la señalización de insulina, IGF1 y leptina vía IRS1. Los mismos defectos en señalización en respuesta a IGF-1 e insulina se observaron en fibroblastos extraídos de un ratón knock- out condicional de p110α (Zhao et al. 2006) En este ratón, el exón 1 del gen PIK3CA, el mismo delecionado por Bi et al. (1999), se flanqueó con dos sitios loxp y se analizó la respuesta a diferentes factores de crecimientos en fibroblastos infectados con la recombinasa Cre. Un trabajo muy reciente en donde la expresión de p110β se suprime específicamente del hígado, muestra la implicación de esta isoforma en la homeostasis del metabolismo de la glucosa ya que estos ratones presentan moderada intolerancia a la glucosa y baja sensibilidad a la insulina (Jia et al. 2008). A diferencia de en el caso de p110α, todo ello ocurre sin alterar los niveles de fosfo-PKB, por lo que esta función de p110β es independiente de su actividad lípido quinasa, lo que apoya los datos de Foukas y Knight que señalan a p110α como la actividad lípido quinasa asociada a IRS. Frente a todos estos resultados, sorprende la hipersensibilidad a la insulina que presentan los animales p85α-/-, p85α/p55/p50-/- , p85β-/- y p55/p50-/- (Terauchi et al.1999; Fruman et al. 2000; Ueki et al. 2003; Chen et al. 2004). Brachmann SM et al. (2005) postulan, utilizando su modelo donde suprimen la expresión de un alelo de cada isoforma p110α y p110β, que p85 puede ejercer una función represora en la señalización de la insulina, independiente de p110. p110α ejerce otra función fundamental durante la angiogénesis y el establecimiento del patrón vascular, los ratones deficientes en p110α y los knock-in del inactivo D933A mueren por hemorragias masivas (Bi et al. 1999; Graupera et al.2008). El defecto en angiogénesis se puso de manifiesto también, en ratones donde la expresión de p110α se suprime de tejido endotelial (Lelievre et al. 2005). Otra estrategia utilizada para abordar la función de p110α fue mutando el sitio de interacción con Ras. Estos ratones presentan defecto en el desarrollo linfático y son altamente resistentes al desarrollo de melanomas inducidos por activación de Ras (Grupta et al. 2007).

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INTRODUCCIÓN A pesar de estos datos recientes sobre el papel de p110α, todavía se desconocen sus posibles funciones específicas en la progresión del ciclo celular. Fibroblastos procedentes de los knock-out condicionales de p110α y p110β presentan defectos en proliferación (Zhao et al. 2006; Jia et al. 2008), lo que pone de manifiesto la existencia de dicha especificidad en la progresión del ciclo celular. En cuanto a p110β, aún están por definir las causas de su relevancia biológica. En este trabajo describimos funciones específicas de ambas isoformas en la división celular, lo que apunta a p110α y a p110β como posibles dianas terapéuticas para procesos oncológicos en los que están claramente implicados (Samuels et al. 2004; Samuels et al. 2005; Zhao et al. 2006; Pu et al. 2006; Jia et al. 2008).

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OBJETIVOS

OBJETIV OS 1.

Analizar las consecuencias de interferir con la expresión y actividad de p110α y p110β en la progresión del ciclo celular.

2.

Estudiar la contribución de ambas isoformas a las vías de señalización iniciadas por PI3K en la transición G0/G1 del ciclo celular.

3.

Determinar la implicación de p110α y p110β en la constitución y activación de complejos ciclina/CDK durante la transición G1/S.

4.

Estudiar las cinéticas y mecanismos de activación de p110α y p110β durante la fase G1 del ciclo celular.

5.

Caracterizar la función específica de p110β durante la progresión de la fase S.

6.

Determinar los mecanismos regulados por p110β, implicados en la síntesis de ADN, y analizar el origen de su especificidad en esta función.

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MATERIALES Y MÉTODOS

MATERIALES Y MÉTODOS 1. CULT IVO CEL ULAR

a) Lineas celulares Todas las líneas celulares se mantuvieron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), L-Glutamina 2mM, Penicilina 100U/ml, Estreptomicina 100U/ml y HEPES 10mM. Las condiciones de cultivo fueron 5% CO2 y 37ºC. Lineas celulares utilizadas: • NIH 3T3: linea de fibroblastos murinos. • COS-7: fibroblastos derivados de riñón de mono verde transformados con el antígeno T. • U2OS: línea de osteosarcoma humano. • Phoenix: se utilizaron como células productoras de partículas retrovirales para ensayos de infección se utilizaron. Esta línea celular deriva de la línea 293T (línea celular de riñón embrionario humana) y expresan los genes gag-pol y la proteína de la cubierta retroviral. Fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs). Las MEFs se obtuvieron de embriones murinos en estadío 13.5 de gestación. Se cultivan en el mismo medio que las líneas celulares añadiendo 0.25 mcg/ml fungizona. Generación de líneas estables Se prepararon líneas NIH3T3 de expresión estable del mutante activo p110β−CAAX cotransfectando pCEF2-hp110βCAAX con p-Pur (Clontech) en relación 1:3, lo que posteriormente permitió la selección de clones positivos utilizando 2µg/ml Puromicina. Se generaron líneas U2OS estables que expresan los ARNs interferentes pTERp110α7 o pTER-p110β15 bajo el control de tetraciclina siguiendo las recomendaciones de la casa comercial (Invitrogen). La expresión de los ARNs interferente se induce con tratamiento con 6µg/ml Doxiciclina durante al menos 3 días para p110α7 y 7 para pTER-p110β15 2.TRA N SFE CCIO NE S E INF ECCION ES Para la transfección de líneas celulares se utilizaron Lipofectamina Plus (Invitrogen) o Jet Pei (Genycell). Para la infección con partículas retrovirales de líneas celulares, células Phoenix se transfectaron con las construcciones deseadas. 48h post-transfección el sobrenadante del cultivo transfectado se filtra utilizando un poro de 0.45µm y se le añade polibreno a una concentración final de 5µg/ml. Para favorecer la infección, tras añadir el sobrenadante, los cultivos a infectar se centrifugan 90min a 1800rpms a 37ºC. En todos los ensayos se realizaron dos ciclos de infección espaciados 8 horas. La tabla 1 recoge las construcciones utilizadas en los diversos experimentos. Los mutantes inactivos pSG5-myc-p110α−K802R y pSG5-myc-p110β-K805R se generaron utilizando el sistema de mutagénesis dirigida (QuickChange site-directed mutagenesis) de Stratagene. Posteriormente se subclonaron en el vector pRV-IRES-GFP para infección retroviral y en pSG5.. El mismo sistema se utilizó para generar el doble mutante Cip1 pCDNA -Myc -S146A/T145A p21 . Diseñamos una amplia batería de plásmidos que codifican para ARNs de interferencia pequeños (short hairpin RNA; shARN) dirigidos a secuencias específicas de p110α y p110β humanos (h) y de ratón (m). Las secuencias diana utilizadas en los diferentes experimentos fueron: • h/m p110α1: 5’-GGCATCCACTTGATGCC • h/m p110α2: 5’-GGGAGAACCCAGACATCATGTCA • h/m p110β2: 5’-AAAGCTGGACTACTAAAGTGA • h/m p110β7: 5’-TTGCTCAGCTTCAGGCGCTGC

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MATERIALES Y MÉTODOS h p110α7: 5’-CTGTGGGGCATCCACTTGA h/m p110β15: 5’-CTGGAATTTGATATTAATAT Como controles utilizamos shARNs que no reducían la expresión de ninguna de las dos isoformas: • Control p110βΚ: 5’-GGAATGAACCACTGGAATTT • Contol p110α3: 5’-CCCAGACATCATGTCAGAG Los diferentes shARNs se subclonaron en los vectores pBluescript/U6 (h/m p110α1, h/m p110α2, h/m p110β2, h/m p110β7, h/mp110βκ) o pTER (h p110α7, h/m p110β15 y h p110α3). Obtuvimos resultados similares con los diferentes shARNs utilizados. • •

Tabla 1. Vectores utilizados

PLÁSMIDO pSG5-Myc-p110α bovino pCDNA3-His-p110β humano pAC-CMV-Myc-p110α humano pSG5-Myc-p110αCAAX bovino pCEF2-p110βCAAX humano pSG5-HA-wt PKB pcDNA-HA-K179M PKB pCDNA3-N17-Ras-YFP (proteína amarilla fluorescente) pCDNA3-v12-Ras Cip1

pCDNA3-Myc-wt p21 Cip1 pCDNA3-Myc- S146A p21 Cip1 pCDNA3-Myc- T145A p21 Cip1 pCDNA3-Myc- S146D p21 Cip1 pCDNA3-Myc- T145D p21

REFERENCIA Jiménez et al. 1998 Donado por B.Vanhaesebroeck (Ludwig Institute for Cancer Research, Londres,R.U.) Donado por M. White (Howard Hughes Medical Institute, MD,E.E.U.U) Jiménez et al. 1998 Donado por C. Murga (Centro de Biología Molecular Severo Ochoa/CSIC Madrid, España) Álvarez et al. 2001 Álvarez et al. 2001 Donado por J. Downward (London Research Institute, London R.U.) Donado por J. Downward (London Research Institute, London R.U.) Rössig et al. 2001 Rössig et al. 2001 Rössig et al. 2001 Rössig et al. 2001 Rössig et al. 2001

3. AN ÁLISIS DEL CICLO CEL ULAR a) Tinción de ADN Se utilizaron dos sistemas de tinción para cuantificar el contenido de ADN: Tinción de Ioduro de Propidio: las células se recogen en PBS y se añade 50 µl de solución de detergentes (DNA-Prep, Beckman Coulter) por millón de células. Posteriormente se tiñen con 500µl de una solución de Yoduro de Propidio con ARNasa (DNA-Prep, Beckman Coulter) por millón de células, durante 30min a 37ºC. Las muestras se analizan por citometría de flujo. Marcaje con BrdU: para este marcaje las células se incuban con 20µM 5-bromo-2'deoxiuridina (BrdU) durante el tiempo especificado en cada experimento. Las células se recogen en PBS 1% FBS y se fijan con 70% metanol a -20ºC. Las muestras se tiñen con anticuerpo anti-BrdU conjugado con fluorocromo FITC (BD Biosciences) y se analizan por citometría de flujo.

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MATERIALES Y MÉTODOS b) Sincronización de cultivos celulares. Sincronización de G0. Cultivos de NIH3T3 se sincronizaron en G0 mediante deprivación de suero durante 19 horas o bien, manteniendo el cultivo en confluencia durante al menos 48 horas. Tras estos protocolos de arresto, en torno al 80% de la población celular se encuentra en G0. Sincronización en fase S temprana. Para sincronizar un cultivo celular en fase S temprana se utilizó el doble bloqueo con Timidina. Las células se mantienen 19 horas con medio completo con Timidina 2mM, posteriormente se lava la Timidina del medio y se incuban 9 horas con medio completo para posteriormente incubar de nuevo con Timidina 2mM durante 15 horas. Sincronización en Metafase Las células se pararon en mitosis cultivándolas en presencia de 100ng/ml de colcemida (KarioMax, Colcemid, Life Technologies) durante 12 horas. Sincronización en G2 La parada en G2 de lineas celulares se indujo cultivándolas con (Sigma) durante 16 horas.

etopósido 20µM

c) Ensayos de DNA combing Para el análisis utilizando Dynamic Molecular Combing, las células se marcaron con un pulso de BrdU 20µM durante 20 min. Transcurrido este tiempo las células se recogen y se embeben en moldes de agarosa fundible a bajas temperaturas y se digieren en una solución de Proteinasa K (Tris-HCl 10 mM pH 7.5, 50mM EDTA, 1% Sarkosyl, 1mg/ml Proteinasa K). La técnica de DNA combing permite la unión de las hebras independientes de ADN extraídas de los moldes de agarosa a una superficie silanizada, en una conformación totalmente linearizada. Una vez, tenemos las moléculas adheridas a estas superficies, son susceptibles de incubarse con anticuerpos anti-BrdU y anti-ADN y analizar por fluorescencia la longitud de las colas de Brdu incorporado. Los anticuerpos utilizados fueron anti-BrdU (clon BU1/75, AbCys SA) acoplado al anticuerpo secundario Alexa 488 (Molecular Probes), y antissDNA (MAB3034, Chemicon) acoplado al anticuerpo secundario Alexa 546 (Molecular Probes). Para el “estiramiento” de las hebras de ADN, las superficie silanizada se introduce a velocidad constante en un recipiente de Teflón que contiene la solución de ADN extraído de los moldes de agarosa. Durante un periodo corto de tiempo, se mantiene la superficie en el interior del recipiente. En este tiempo, las hebras de ADN se unirán a la superficie silanizada por sus extremos. Posteriormente, se extraerá esta superficie con el ADN adherido en un movimiento vertical a velocidad constante que permitirá la linearización progresiva de las hebras de ADN adheridas.

4. E N SA YO S B IO QU ÍM ICOS a) Lisis,fraccionamiento celular, inmunoprecipitaciones y Western Blot. Los extractos celulares totales se obtuvieron en tampón de lisis RIPA: Tris-HCl 20 mM pH 8.0, NaCl 137 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 1 mM, glicerol 10%, NP-40 1%, Deoxicolato sódico 0.5% y SDS 0.1% . El tampón se suplementó con inhibidores de proteasas y fosfatasas (PMSF 1mM, Na3VO4 1mM, Leupeptina 10µg/ml, Aprotinina 10µg/ml, NaF 5mM, Ácido okadaico 10nM y EDTA 1mM).

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MATERIALES Y MÉTODOS Fraccionamiento subcelular 1. Para el análisis de los niveles de complejos MCM2 y MCM4 en cromatina, las células se fraccionaron en citosol, núcleo soluble y cromatina utilizando la siguiente secuencia de soluciones de lisis: • Extracción de la fracción citosólica: 5min de lisis con tampón A: Hepes 10mM, pH 7.9, KCl 10mM, MgCl2 1.5mM, Sacarosa 0.34M, glicerol 10%, ditiotreitol (DTT) 1mM, TX100 0.1%. Añadiendo los inhibidores de fosfatasas y proteasas (Leupeptina 5µg/ml, Aprotinina 5µg/ml, Pepstatina 0,5µg/ml, PMSF 0,1mM) Los lisados se centrifugan durante 5min a baja velocidad (3.5K) , el sobrenadante constituye la fracción citosólica. • Los pelets (núcleos celulares) se lisan 30min con tampón sin sal: EDTA 3mM y EGTA 0.2mM añadiendo los mismos inhibidores de fosfatasas y proteasas que en el paso anterios. Los lisados se centrifugan a 4K durante 5 min, el sobrenadante resultante constituye la fracción nuclear soluble y el pelet es la fracción de cromatina. • La cromatina se resuspende en tampón de carga de electroforesis Laemmli, las muestras se hierven 3 min y el ADN se disgrega sonicando. cip

2. Para analizar los complejos PCNA-p21 y PCNA-Polδ las células se fraccionaron en fracción de cromatina y libre de cromatina siguiendo la siguiente secuencia de lisis: •

•

•

Los pelets celulares se incuban 8 min en tampón hipotónico: Tris –HCl 10 mM, pH 7.4, MgCl2 2.5 mM, 0.5% NP40, DTT 1 mM, PMSF 1mM, Na3VO4 0.2 mM, 0.5 mM Ácido Okadaico y los inhibidores de proteasas y fosfatasas (PMSF 1mM, Na3VO4 1mM, Leupeptina 10µg/ml, Aprotinina 10µg/ml). Tras la lisis, las muestras se centrifugan a baja velocidad (1500xg) 3min. El sobrenadante será la fracción soluble en detergente. Los pelets se resuspende en solución de lavado: Tris – HCl 10 mM, pH 7.4, NaCl 150 mM, PMSF 1 mM e inhibidores de proteasas y se centrifugan como en el paso anterior. Los pelets se tratan posteriormente con DNAsa I (D4527 Sigma) utilizando 7 200unidades/10 células durante 30min a 37ºC en el tampón de digestión: Tris – HCl 10 mM, pH 7.4, NaCl 10 mM, MgCl2 5 mM, PMSF 0.2 mM, okadaico 0.5 µM e inhibidores de proteasas (Leupeptina 10µg/ml, Aprotinina 10µg/ml). Tras en tratamiento con DNAsa las muestras se centrifugan a 13.000xg 5min, el sobrenadante constituirá la fracción DNAsa.

3. Para extraer fracción citosólica y nuclear utilizada en la localización subcelular de p110α cip y p110β, y en el análisis de pPKB y p- p21 nuclear: • Los pelets celulares se resuspenden en tampón CHAPS: Tris-HCl 20 mM pH 8.0, NaCl 137 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 1mM con los inhibidores de fosfatasas y proteasas (Leupeptina 5µg/ml, Aprotinina 5µg/ml, Pepstatina 0,5µg/ml, PMSF 0,1mM) y se someten 3 ciclos de congelación descogelación. Tras la lisis, las muestras se centrifugan (1500xg 10min). El sobrenadante será la fracción de citoplasma. • Los pelets se resuspende en tampón RIPA y se lisan los núcleos durante 30min. El sobrenadante de la fracción nuclear se recupera tras centrifugación (10.000xg 15min) 2. Ensayos lípido kinasa. Para los ensayos kinasa células NIH-3T3 se transfectaron con vector pSG5 vacio, o con una combinación de pSG5-myc-p110α y pSG5-His-p110β. 24 horas post-transfección se arrestan en G0 por deprivación de suero y se recolectan a diferentes tiempos tras reestimulación con suero. Algunas muestras se trataron con 10µM lovastatina o 0.3µg/ml herbamicina durante 1 hora previa a su recolección. PI3K recombinante se inmunoprecipita con anticuerpos anti-Myc o anti-6His.

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MATERIALES Y MÉTODOS Para analizar la actividad lípido kinasa los inmunoprecipitados se resuspenden en 20µl de tampón Hepes 50mM, EDTA 0.1M que contiene 10µg de fosfatidil-inositol. La reacción kinasa se inicia añadiendo 5µl de tampón quinasa (Hepes 50mM, EDTA 0.1M, 100mM MgCl2, 32 200mM ATP y 10µCi de P-γ-ATP). La reacción se mantiene 5min a temperatura ambiente y se para añadiendo 100µl de HCl 1M y 200µl de una mezcla metanol/cloroformo (1:1). Los fosfolípidos se resuelven en cromatografía de capa fina, siendo la fase sólida Silica Gel pulverizada con oxalato potásico 1% y la fase líquida ácido glacial acético/ H2O/n-propil alcohol (4:70:31). 3. Ensayos quinasa de PKB. Para los ensayos quinasa de PKB, las células se lisan en tampón TX-100: Tris-HCl 50 mM pH 7.5, MgCl2 10mM, DTT 1 mM, Beta glicerol fosfato 20mM, TX-100 1%, 1mM EDTA suplementado con inhibidores de proteasas y fosfatasas (PMSF 1mM, Na3VO4 1mM, Leupeptina 10mg/ml, Aprotinina 10mg/ml, NaF 5mM, Ácido okadaico 10mM). La reacción quinasa se llevó a cabo en (Tris-HCl 50 mM pH 7.5, MgCl2 10mM, DTT 1 mM, Beta glicerol fosfato 20mM, 1µM PKI (Protein kinase Inhibitor, Sigma), 8µM PNPP10µCi 32 de P-γ-ATP) durante 7min a temperatura ambiente. 4. Anticuerpos y reactivos. La tabla 2 recoge los anticuerpos utilizados en los diferentes experimentos. Tabla 2. Anticuerpos utilizados

ANTÍGENO ciclina E (M-20) c-Myc (C-19), p110β (S-19) p70S6K (C-18) p21 (F-5) y (C-19) Polδ p21 (Ab-6) usado en inmunoprecipitación

CASA COMERCIAL Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz Biotechnology Calbiochem

fosfo-p21 (Thr 145) ciclina D3 fosfo-PKB fosfo-PKB sustrato Myc-Tag (9B11) fosfo-p70S6K (Thr-389) Histonas Ciclina A 6x-His pRB PCNA MCM2 MCM4 AKT1/PKBα Fosfo-FKHRL1 (Thr 32) (pFoxO3a) PI3K-p85 β-actina Ras p110α

Abgent Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling Chemikon (Millipore) BD Biosciences BD Biosciences BD Biosciences BD Biosciences BD Biosciences BD Biosciences Upstate Biotechnology Upstate Biotechnology Upstate Biotechnology Sigma Oncogene (Merk) Donado por la Dr.A.Klippel (Merck, Boston, E.E.U.U.)

Los inhibidores específicos PIK75 (Knight et al. 2006) y TGX221 (Jackson et al. 2005) se sintetizaron en Australian Centre for Blood Diseases (Melbourne, Australia).

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MATERIALES Y MÉTODOS 5. AN ÁLISIS E STA DÍSTICO Y PR OGRA MA S INFO R MÁT ICO S Para realizar los análisis estadísticos se utilizó el programa StatView 512+ (Calabasas). Los valores P se calcularon utilizando el test t de Student. Para realizar la estadística del ensayo de DNA combing se utilizó el programa informático GraphPad Prism 5.0 (Graduad Software Inc.) y los valores P se calcularon utilizando el test de XXXXX. La intensidad de las bandas en las autorradiografías y la intensidad de fluorescencia se cuantificó utilizando el programa informático ImageJ.

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RESULTADOS

RESULTADOS I.CONSECUENCIAS EN CICLO CELULAR DE INTERFERIR CON LA EXPRESIÓN Y ACTIVIDAD DE p110α Y p110β Como se ha visto en la introducción, la supresión de la expresión de p110α o p110β induce letalidad embrionaria temprana, lo que impide realizar estudios subsiguientes sobre la función de estas isoformas en la división celular (Bi et al. 1999;2002). Para analizar dicha función, diseñamos diferentes estrategias para interferir con su actividad y expresión y estudiar sus consecuencias en la progresión del ciclo celular. 1. Ensayos con mutantes activos p110α−CAAX y p110β−CAAX. La adición de un sitio de farnesilación CAAX a p110α permite su anclaje a la membrana, generando una forma constitutivamente activa (p110α∗) (Jiménez et al. 2000). Células que expresan establemente p110α∗ entran más rápido en fase S desde quiescencia, aunque su transición más lenta por G2/M hace que su tiempo de división sea incluso algo mayor que el de las células control (Álvarez et al. 2001; FIG 1C). Transfectamos una construcción análoga para p110β (p110β−CAAX ; p110β∗) en fibroblastos de ratón NIH3T3, y estudiamos los efectos de sus expresión. Al igual que p110α∗, la expresión del mutante p110β∗ aumentaba la actividad de PI3K, como indican los niveles de pPKB (FIG 1A). Preparamos clones de células NIH3T3 con expresión estable de p110β∗ y los clones positivos se seleccionaron analizando los niveles de activación de PKB (FIG 1B). Las células p110β∗ dividían más rápido que las control y las p110α∗. Mientras que el tiempo de división de estas últimas es de unas 24 horas, las células p110β∗ lo hacen en 18 (FIG 1C).

FIG 1: El mutante activo p110β ∗ , pero no p110α ∗ , disminuye el tiempo de duplicación. (A) Células NIH3T3 se transfectaron con vector vacío o con las construcciones p110α ∗ o p110β∗; 36 horas post-transfección las células se recogieron y los niveles de pPKB, PKB y de las isoformas α y β se analizaron en los lisados celulares por Western Blot (WB). (B) Células NIH3T3 se cotransfectaron con p110β∗ y pPur y se mantuvieron en medio de selección con Puromicina 2µg/ml. Posteriormente, se analizó la activación de PKB y los niveles de expresión de PKB y p110β en diferentes clones resistentes a Puromicina. (C) Cultivos con expresión estable de p110α ∗, p110β∗, o vector vacío, se siembran a igual densidad. El número de células de cada cultivo se determinó cada 24h durante 4 días. La gráfica muestra la media de 5 experimentos y su desviación estándar (media ±.SD n=5). (*) Valor P asociado a los resultados a día 4