ENZIMAS-2005 Las enzimas son catalizadores biológicos en su mayoría de naturaleza proteica (99,99%) y las ribosimas (fragmentos de RNA) (0,1%). Las enzimas tienen tres propiedades bien definidas e inigualables que las hacen mucho más efectivas que los catalizadores no biológicos: a) EFICIENCIA: en cantidades micromoleculares aceleran la velocidad de la reacción millones de veces. b) ESPECIFICIDAD: las enzimas son capaces de distinguir entre sustancias estrechamente relacionadas como los estereoisómeros. Por ejemplo: la glucosa oxidasa reconoce la β- D- glucosa y no sobre la α- D- glucosa. c) REGULACIÓN: algunas enzimas son regulables, es decir, se puede aumentar o disminuir su actividad catalítica. Las enzimas influyen exclusivamente sobre la velocidad de la reacción, pero no modifican: 1- La dirección de la reacción. 2- La posibilidad termodinámica de que dicha reacción se produzca. Es decir, sólo catalizan reacciones que pueden producirse espontáneamente. 3- El equilibrio de la reacción, es decir, no altera las concentraciones de reactivos ni de productos en el equilibrio. CINÉTICA ENZIMÁTICA El estudio de la velocidad de la reacción catalizada y la forma en que cambia en respuesta a cambios en los parámetros experimentales se conoce como cinética. Los factores o parámetros experimentales más importantes son: a- La concentración de enzima. b- La concentración de ligandos (sustrato, productos, cofactores, inhibidores y activadores). c- El pH. d- La fuerza iónica. e- La temperatura. Uno de los factores claves que afectan a la velocidad de una reacción catalizada por una enzima “in vitro” es la cantidad de sustrato presente, [S]. Durante el transcurso de una reacción a medida que el sustrato se convierte en producto, disminuye la [S], por esta razón resulta complicado el estudio de los efectos de la concentración de sustrato. Una aproximación simplificadora consiste en medir la velocidad inicial, designada V0 cuando [S] es generalmente mucho mayor que la concentración de enzima. En estas condiciones, si transcurre poco tiempo después del inicio de la reacción, los cambios en [S] son insignificantes por lo que se puede considerar [S] constante. Se puede determinar V0 graficando la velocidad de la reacción en función del tiempo, manteniendo [S] en exceso y la concentración de enzima constante. En estas condiciones la cantidad de sustrato transformado es proporcional al tiempo y la parte lineal del gráfico corresponde a la V0. En la figura1 se muestra el efecto de la variación de [S] sobre V0 cuando se mantiene constante la concentración de enzima. Esta reacción obedece a la cinética clásica o de Michaelis- Menten. La Vmax se observará cuando toda la enzima esté como complejo ES. Esta condición se produce cuando [S] es suficientemente alta, de modo que toda la enzima libre se encuentra como ES. La Km (moles/L) es igual a la concentración de sustrato en la cual V0 es la mitad de la Vmax. El significado de Vmax y Km es único para cada enzima.

1

V0 o

V max. V max 2

Km

[S]

Figura 1- Esta curva de saturación puede ser expresada matemáticamente por la ecuación de Michaelis-Menten:

V0 = Vmax . [S] Km + [S] Debemos destacar lo siguiente: 1- El sistema involucra a un solo sustrato que da un solo producto. 2- El sistema se encuentra en estado estacionario: esto quiere decir que [ES] es constante. 3- Se trabaja en condiciones de V0 es decir cuando la [S] >> [P] o sea donde P es prácticamente nulo. PARTE PRÀCTICA En el laboratorio observaremos el efecto del tiempo, temperatura y concentración de sustrato sobre la actividad enzimática de la Ureasa. La ureasa es una enzima que tiene importancia histórica por haber sido la primera enzima cristalizada. Tiene importancia en el laboratorio bioquímico pues se la usa en la determinación de urea de los líquidos biológicos. Es una enzima de alto peso molecular (485.000 D), con un punto isoeléctrico (pI) alrededor de 5,0 que se encuentra en cantidades variables en microorganismos, en plantas leguminosas, en estómago, en hígado y otros órganos de animales superiores. La reacción que cataliza es la siguiente:

NH2 NH2

C=O + H2O

ureasa

2 NH3 + CO2

FUNDAMENTO: la ureasa descompone específicamente a la urea produciendo CO2 y NH3, éste reacciona con fenol e hipoclorito de sodio en medio alcalino produciendo azul de indofenol que se determina fotocolorimétricamente a 540 ηm.

2

EFECTO DEL TIEMPO- DETERMINACIÓN DE LA VELOCIDAD INICIAL Se determina la actividad enzimática en función del tiempo, manteniendo constantes las demás variables: [S], [E] y temperatura. Se sigue el esquema del cuadro y luego de cumplido el tiempo de incubación correspondiente se efectúan las lecturas de DO (densidad óptica), en un fotocolorímetro con filtro verde (540 ηm). La actividad enzimática se obtiene midiendo la cantidad de producto formado, que es directamente proporcional a la intensidad del color desarrollado. Se grafica en un sistema de coordenadas DO en función del tiempo

TUBO Blanco 1 2 3 4 5

H2O dest. 1 gota

Urea

Ureasa

-----0.2mL

0.2mL

Tiempo de incubación Reactivo Reactivo Incubación a (35-37ºC) 1 2 35-37ºC 20 minutos 0.5 mL 0.5 mL 5 minutos 3 minutos 5 minutos. 10 minutos 15 minutos 20 minutos

EFECTO DE LA TEMPERATURA La temperatura influye sobre la actividad enzimática. Cada enzima tiene una temperatura en donde la actividad enzimática es máxima. Se determinará para la ureasa la temperatura óptima. Se sigue la técnica indicada en el cuadro. Se efectúan las lecturas correspondientes y se grafica la actividad enzimática en función de la temperatura.

TUBO

H2O dest.

Urea

Ureasa

Blanco 1 2 3 4 5 6

1 gota

-----.2mL

0.2mL

Temperatura de Reactivo Reactivo Incubación incubación 1 2 a 35-37ºC (10 minutos) 100ºC 0.5 mL 0.5 mL 5 minutos 0ºC 20 ºC 40ºC 60 ºc 80ºC 100 ºC

EFECTO DE LA CONCENTRACION DE SUSTRATO SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA Para la determinación de Km y Vmax. se trabajará con la ecuación de LinerweaverBurk (doble recíproca). Se sigue el esquema dado en los cuadros y se lee en fotocolorímetro las densidades ópticas correspondientes. Se grafica 1/V0 en función de 1/S. El valor de V0 corresponde a la DO del P en cada tubo. Diluciones del Sustrato: la solución madre posee una concentración de 200 mM de Urea.

3

TUBO H2O DEST.

1

2

3

4

5

6

7

1 mL

-------2mL Solución madre 1 mL

Concentración de Urea mM

3.125

6.25

12.5

25

50

100

200

TECNICA

TUBO

Urea

-----Blanco 1 0.2mL de la 2 dilución 3 correspondiente 4 5 6 7

Ureasa 0.2 mL

H2 O dest

Temperatura Reactivo Reactivo Incubación de 1 2 a 35-37ºC incubación (30-35 ºC) 5 minutos 0.5 mL 0.5 mL 5 minutos

10 mL

4

5