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Guía de Laboratorio de Bioquímica General
L.D. Caicedo
GUÍA DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA Primera parte (básica)
Por: Luz Dary Caicedo Bejarano
Universidad Santiago de Cali Facultad de Ciencias Básicas Programa de Química 2014
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MATERIALES QUE DEBEN TRAER Y TENER DISPONIBLES EN EL MOMENTO QUE SE NECESITEN PERSONALES: 1. Bata de laboratorio. (Sin excusa) 2. Mascarillas, para personas que sean alérgicas a los hongos 3. Guantes (opcional) 4. Cuaderno cuadriculado (hacer las anotaciones e informes del laboratorio de microbiología y para hacer la relación del material que piden)
POR GRUPO: Paños de dulce abrigo para limpiar Jabón en polvo Esponja para lavar Guantes de caucho para el lavado del material Guantes de tela para la manipulación de los medios de cultivo Cinta de enmascarar o esparadrapo 1 caja de portaobjetos 1 caja de cubreobjetos Papel aluminio Hipoclorito de sodio 1 Encendedor (sin excusa) Marcador de vidrio o lápiz vidriograf (sin excusa) 1 Paquete de toallas de papel
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MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA 1. No comer, beber o fumar en los mesones de laboratorio. 2. Usar siempre bata de laboratorio. 3. Los mesones de trabajo deben ser superficies lisas, fáciles de limpiar y desinfectar. 4. Use guantes cuando debe manipular material infeccioso. 5. Subcultivos de microorganismos patógenos deben hacerse en cabina de seguridad 6. Cada vez que se derrame material, cubra la mesa con toallas de papel, impregne esta zona con sustancias bactericidas como jabones o soluciones cloradas (hipoclorito de sodio al 10%) 7. No pipetear con la boca material contaminado. Obture las aberturas superiores de las pipetas con algodón antes de esterilizarlas. 8. Pipetas usadas deben sumergirse inmediatamente en desinfectantes y esterilizar en autoclave. 9. El material contaminado debe ser colocado en recipientes adecuados y deben ser esterilizados en autoclave. 10. Nunca humedezca etiquetas con la lengua 11. Antes y después de cada sección de trabajo limpie los mesones con sustancias desinfectantes. 12. No olvide el lavado continúo de las manos con jabones desinfectantes. 13. Las paredes, pisos y demás accesorios deben ser hechos de materiales fáciles de limpiar y que resistan el uso continúo de soluciones bactericidas. 14. De cuenta inmediatamente al instructor de cualquier accidente, tales como cortaduras, quemaduras o derrames de cultivos. Tome las precauciones posibles para evitar accidentes. 15. Las agujas de transferencia y las asas bacteriológicas deben ser esterilizadas a la llama, poniendo al rojo todo el alambre, antes y después de su uso. Cuando tenga residuos de crecimiento microbiales es necesario calentarlas inicialmente en el cono frío de la llama para evitar aerosoles. 16. No lleve materiales muy contaminados al laboratorio y elimine lo más pronto posible los cultivos que lo estén. 17. Cuando se saca parte de un producto de un recipiente y sobra algo, deséchelo luego de su uso. 18. Todos los reactivos y equipos deben dejarse organizados y en sus sitios respectivos al final de cada práctica.
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EXIGENCIAS: 1. Antes de entrar a trabajar al laboratorio, léase el texto de las prácticas que va a realizar y haga el plan de trabajo con todo cuidado. 2. Cada práctica de laboratorio debe iniciarse con una corta explicación. No empiece a trabajar hasta que haya recibido las instrucciones. Pregunte cuando no entienda. La buena técnica de laboratorio depende de que usted sepa lo que va a hacer. 3. Anote cuidadosamente todas las observaciones en el momento de hacerlas. El examen de prácticas se referirá no solo a las información proporcionada en el manual, sino también a sus propias observaciones y deducciones. 4. Los informes de laboratorio deben estar disponibles en cualquier momento, después de realizada cada práctica. 5. Al iniciar cada práctica, el estudiante debe disponer de todos los materiales necesarios. (La lista de materiales se debe pasar al menos el día anterior a la práctica) No es recomendable que lo haga el mismo día.
OTRAS RECOMENDACIONES: Según las prácticas, las bacterias se deben dejar a temperatura ambiente o en incubador durante 24 a 48 horas. Después de este tiempo se deben guardar en la nevera para su posterior estudio o identificación. Los hongos y levaduras se deben dejar a temperatura ambiente durante 5 a 8 días, al cabo de los cuales deben ser guardados en la nevera para su posterior caracterización. El no seguimiento de las anteriores recomendaciones trae consigo un crecimiento excesivo de los microorganismos que hace imposible su posterior utilización. En estos casos la práctica se deberá repetir.
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LABORATORIO No. 1 LIMPIEZA Y ESTERILIZACIÓN: El estudiante de un curso de microbiología general debe familiarizarse con el concepto y manejo de métodos de esterilización, ya que para el estudio de determinada flora microbiana se debe descartar cualquier tipo de contaminación y esto se obvia trabajando únicamente con material estéril. LIMPIEZA Y ESTERILIZACION DE MATERIALES LIMPIEZA DE VIDRIERIA La vidriería puede ser limpiada en una solución diluida o concentrada de dicrómato de potasio y Acido sulfúrico (mezcla sulfocrómica). Estas soluciones limpian y también destruyen las esporas y demás estructuras de microorganismos que pueden ocasionar problemas en el laboratorio. LIMPIEZA DE PORTA Y CUBRE OBJETOS Se hace una solución de dicrómato de potasio al 5X en agua caliente, adicionando ácido sulfúrico a bajas concentraciones en intervalos de 5 a 10 minutos. La mezcla se debe mantener caliente por lo menos 30 minutos. Se lavan luego en agua corriente por 12 horas, se enjuagan en agua destilada y se conservan en alcohol etílico de 95%, hasta que se necesiten. Agua, jabón y amoniaco son suficientes para remover la capa de grasa de los porta y cubre objetos ESTERILIZACION Consiste en la destrucción, muerte o eliminación de las diferentes formas de vida existentes en los objetos o sustancias y que para su utilización deben hallarse libres de dichas formas. Entre los procedimientos más comunes para esterilizar están los siguientes: - Flameado, incineración o combustión. - Calor seco - Calor húmedo. - Filtración. - Rayos ultravioleta. - Desinfectantes Flameado Incineración o combustión. Se utiliza para la destrucción de objetos o para la esterilización de aquellos que resisten el fuego directo tales como agujas, asas, vidriería especial, cuchillas, etc. Las agujas y cuchillas deben calentarse al rojo como prueba de esterilidad, pues aunque una exposición mucho mas breve es suficiente, puede dejar dudas. Los objetos de vidrio se dejan a la llama un tiempo prudencial procurando que la exposición a la llama llegue a toda la superficie. Este método de esterilización es seguro, de fácil aplicación aunque de uso muy limitado.
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Calor Seco o aire caliente. Este proceso se realiza en hornos de doble pared y recubiertos de aterial aislante para conservar el calor. El aire circulante se calienta por mecheros de gas o resistencias eléctricas. Estos aparatos tienen un termómetro en la parte superior de un dispositivo automático para regular la temperatura. Mediante este procedimiento suelen esterilizarse los objetos de vidrio como pipetas, cajas de Petri, tubos de ensayo, jeringas, matraces, frascos tapados con algodón, productos químicos secos como aceites, petrólatos, óxido de zinc, carbonato de calcio, y objetos do porcelana y metálicos. En general, cualquier objeto seco que no se ha dañado por temperaturas altas. Para asegurar la esterilización, los objetos deben ser calentados de 150 a 180 °C por espacio de 2 a 3 horas. La temperatura de 150 °C parece ser la mínima práctica y el limite superior, 180°, Puede ocasionar inconvenientes al carbonizar materiales como los tapones de algodón o el papel utilizado para envolver el material de vidrio. Se debe tener en cuenta que la eficacia de un horno. de esterilización depende en gran parte de la libre circulación del aire caliente en su interior. Se puede también utilizar el proceso, empleando temperaturas mas bajas (6O a 8O °C) asimilándolo al método de Tyndall. (Ver página siguiente).
Calor húmedo: a. Ebullición: Este procedimiento probablemente rara vez logra la eliminación completa de microorganismos viables, condición de la esterilización, ya que aunque pocos minutos son suficientes para matar las formas vegetativas, las esporas suelen resistir muchos minutos e incluso horas. Desde el punto de vista practico se constituye en un método satisfactorio si se descarta el problema de las bacterias esporógenas, como también la contaminación del agua con patógenos intestinales, caso que se solucionaría al hervirla durante 15 a 20 minutos. Este proceso se utiliza generalmente para "esterilizar" jeringas, agujas, pinzas, etc. La temperatura de ebullición del agua puede elevarse agregándole diversas sales, pero esto no tiene mucha aplicación porque ellas pueden deteriorar el instrumental. A continuación se dan las temperaturas de ebullición de las soluciones acuosas saturadas con algunas sales: Carbonato de sodio (NaC03) 140 °C. Cloruro de sodio (NaCI) 109 °C Nitrato de potasio (KNO3) 115 °C Carbonato de potasio (KCO3) 135 °C Cloruro de calcio (CaCI) 179 °C.
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b. Tindalización: El material a esterilizar por ese método se calienta con vapor o con agua hirviendo durante 30 minutos por tres días consecutivos. La primera exposición mata las células vegetativas; una incubación durante 24 horas, después del primer calentamiento hace germinar las esporas. El segundo calentamiento mata las células vegetativas provenientes de las esporas germinadas; en el segundo período de incubación germinaran las esporas que dejaron de hacerlo en la primera incubación y durante el tercer calentamiento morirán estas últimas formas vegetativas. Este método se utiliza cuando no pueden emplearse temperaturas mayores a la de ebullición. En algunos casos es conveniente no superar rangos o puntos precisos por ejemplo cuando es necesario esterilizar medios como el suero sanguíneo que se coagula a 65 °C. El método de Tyndalización se considera dispendioso y puede alterar la materia orgánica del medio, razón por la cual se usa en raras ocasiones. c. Vapor a presión: Es el método de esterilización más satisfactorio y más empleado en laboratorios, hospitales y en industrias como la conservación de alimentos. El autoclave, aparato empleado para este propósito consiste básicamente en un recipiente metálico de paredes resistentes con una tapa o puerta diseñada para soportar altas presiones, todo complementado con un manómetro, un termómetro, una válvula de escape y un aditamento de seguridad.
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Al emplear este aparato deben tener en mente las siguientes recomendaciones: Asegúrese que se le ha extraído todo el aire. Esto se comprueba cuando el vapor sale en forma continua por la válvula de escape que debe dejarse abierta desde el inicio de la operación. Una vez comprobado lo anterior, se cierra la citada válvula y se espera hasta alcanzar una presión de 15 libras que simultáneamente debe coincidir con una temperatura de 121 °C, en este momento se empieza a contar el tiempo de esterilización. La relación entre las temperaturas y presiones durante la utilización del autoclave esta consignada en la Tabla II. Una exposición a 1.5 libras por pulgada cuadrada durante 15 a 20 minutos es suficiente para destruir las formas microbianas más resistentes, (las esporas bacterianas). El punto anterior es suficiente si los materiales están incluidos en recipientes pequeños y dispuestos en tal forma que el vapor penetre a todas las partes del autoclave. Los recipientes de mayor tamaño que contengan líquidos o medios así como los apósitos y las batas quirúrgicas, necesitan mayor tiempo de exposición. Cuando ha terminado el tiempo de esterilización se deja bajar la presión lentamente pues de otra manera el cambio brusco hará ebullir en forma violenta los líquidos, lo que ocasionaría la expulsión de los tapones.
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TABLA II. Temperatura del vapor de agua en el autoclave a distintas presiones. Libras/pulg.2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 20 30
Kg/cm.2 0.070 0.140 0.210 0.281 0.352 0.422 0.492 0.562 0.633 0.703 0.773 0.844 0.914 0.984 1.055 1.406 2.109
T°C 102.3 104.2 105.7 107.3 I08.8 110.3 111.7 113.0 114.3 115.6 116.8 1I8.0 I19.1 120.2 121.3 126.2 134.6
T°F 216.1 219.5 222.2 225.1 227.8 230.5 233.0 235.4 237.7 240,8 242.2 244.4 246.4 248.4 250.3 259.2 274.3
Testigos de esterilización en autoclave Las pruebas de la eficiencia de esterilización se hacen necesarias cuando a esta técnica son sometidos materiales inactivos, a diferencia de los medios de cultivo en los que la falla del proceso se comprueba por crecimiento posterior de bacterias u hongos contaminantes. Estas pruebas se hacen utilizando gérmenes vivos y mezclas químicas. Gérmenes vivos: Son empleados bacilos esporulados tales como Bacillus subtilis y Bacilus mesentericus de alta resistencia al calor. Al terminar la esterilización se hacen siembras y se incuban de 24 a 48 horas, lo cual indicará la eficacia de la esterilización. Mezclas Químicas: (a) Safraninia 0.01 gramo Benzonaftol 100.00 gramos La mezcla toma. color rojo cuando es sometida a 110 °C. (b) Verde brillante 1.00 gramo Acetanilida 100.00 gramos La mezcia da color azul se torna de color verde oscuro a 115 °C. (c) Metil violeta 1.00 gramo Hidrato da terpina 100.00 gramos La mezcla de color violata pálido se torna violeta oscuro a 117 °C.
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Acido benzoico con puntos de fusión de 121 y 123°C adicionados de violeta de genciana y verde brillante.
Las mezclas testigos se colocan en tubos cerrados a la llama junto al material que se va a esterilizar. Filtración: las soluciones de medios líquidos que se deterioran o pierden sus propiedades útiles por calentamiento tales como sueros, soluciones do azúcar, soluciones para inyecciones, etc, pueden ser esterilizados por filtración. Mediante este procedimiento se hacen pasar Ios líquidos a través de filtros que detienen los microorganismos y las micelas orgánicas. La eficacia de estos filtros depende del tamaño de los poros, su carga eléctrica., de Ios microorganismos, así como de las sustancias en suspensión, coloides o grasas de los líquidos a filtrar que en muchas ocasiones hacen imposible utilizar estos métodos Los filtros se fabrican en forma do cilindros huecos abiertos solo por una extremidad, de porcelana, tierra de infusorios, o en forma de discos o cojincillos planos de asbesto. Los más corrientes son los siguientes: a. Filtros de Chamberland: Son hechos de porcelana porosa y su grado se designa con la letra L y un número que va de l a 13 como puede verse enseguida. L1 Deja pasar todos los microorganismos y actúa como un clarificador. L3 Detiene esporas de Clostridium. L5 Deja pasar partículas de 0.2 micras. L7 Detiene los P.P.L.O. L11 Detiene algunos virus. L13 Deja pasar los bacteriófagos. b. Filtros Berkefeld Son hechos de tierra de infusorios más asbesto y materiales orgánicos, vienen en los siguientes grados: N – Normal Diámetro de los poros de 8 a 12 micras. V - Mediano Diámetro de los poros de 5 a 7 micras. W - Denso Diámetro de los poros do 3 a 4 micras. c. Filtros Mandler. Son similares a los anteriores en cuanto a los materiales de fabricación y Son hechos en 3 tipos de porosidades: : Preliminar. Regular. Fina d. Filtros Seitz Son discos de pasta de asbesto prensado fabricados en 2 tipos:
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Seitz R clarificante, con dos grados K3, K5. Seitz EK esterilizante que detiene bacterias. Fuera de los anteriores están los filtros de cristal sintetizado, de colodión y los discos de celulosa-ester. Los filtros y los aditamentos complementarios utilizados en este proceso, se esterilizan inicialmente en autoclave a 121°C, 15 libras de presión y de 30 a 60 minutos. Este material previamente debe ser envuelto en papel para evitar la contaminación una vez efectuada la esterilización. En la Figura 4 se puede observar el montaje de uno de los filtros. Una vez utilizado un filtro debe ser desinfectado y luego limpiado antes de ser esterilizado para un uso posterior. Aunque el tratamiento depende de las clases de filtros, en general los de porcelana y tierra de infusorios se tratan así: 1. Se hace pasar agua limpia en dirección opuesta al proceso normal de filtración 2. Se hace pasar en la misma forma NaOH al 5% para separar materiales proteínicos. 3. Nuevamente agua destilada para lavar NaOH 4. Se seca completamente. En los filtros de vidrio se sustituye el NaOH por ácido sulfúrico concentrado caliente para evitar el efecto disolvente del álcali sobre el vidrio. Testigos de esterilización por filtración Para comprobar la eficacia de este proceso se pueden seguir dos métodos: 1. Hacer siembras del líquido filtrado, incubar y observar a las 48 horas. 2. Agregar al líquido que se filtra, bacterias, como Pasteurella multocida (0.25 a 1.25 micra.s) e investigar su presencia en el filtrado. Se puede aprovechar por ejemplo, la alta sensibilidad del conejo a P. multocida que al ser inyectado por vía subcutánea muere en pocas horas. Rayos Ultravioleta (UV) El proceso de esterilización con Luz UV se basa en la capacidad microbicida exhibida por el espectro electromagnético a nivel de los 4000 A. cuando este poder aumenta a medida que disminuye la longitud de onda alcanzando un máximo a 2750 A. En las lámparas denominadas sterilamps basadas en luz de arco de mercurio encerrado en cuarzo, se transmite una radiación de 2537 A muy próximo al optimo y superficies metálicas, de vidrio o similares donde no cuenta su poder de penetración.
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OBJETIVOS: 1. Preparar y esterilizar el material de vidrio para su uso en el laboratorio de microbiología de acuerdo a lo consultado y a la explicación del profesor. 2. Seleccionar y utilizar los diferentes métodos de esterilización de acuerdo con el tipo de material contaminado.
MATERIALES Y MÉTODOS: Por grupo de trabajo: 4
Cajas de Petri por estudiante Papel kraft
LIMPIEZA DE LAS CAJAS DE PETRI 1. Esterilizar en autoclave a 121 grados Centígrados y 15 psi durante 20 minutos o más tiempo si están muy contaminadas. 2. Quitar los desperdicios o materiales adheridos a las cajas y enjuagarlas con agua corriente. 3. Sumergir el material en una solución detergente bactericida al 2 ó 5% durante 10 minutos. 4. Lavar bien cada pieza por separado 5. Enjuagar con suficiente agua corriente, cerciorándose de que no queden restos de jabón en las paredes. 6. Enjuagar con agua destilada. 7. Secar las cajas a temperatura ambiente o en un horno. 8. Envolver las cajas de Petri con el papel Kraft de acuerdo a la orientación del profesor. 9. Esterilizar en autoclave a 121 grados centígrados y 15 psi durante 15 minutos o en un horno esterilizador a 180 grados centígrados durante 2 horas. El uso del autoclave asegura una mejor esterilización.
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10. Si utiliza el autoclave, debe secar las cajas en el horno. 11. Almacenar las cajas en un lugar limpio hasta el momento de su uso. Lo mismo se hace con las pipetas y demás material que se necesite para el laboratorio de microbiología. NOTA: Las pipetas deben llevar algodón en la parte superior. Éste se debe colocar antes de esterilizarlas. PREGUNTAS: 1. Qué métodos son utilizados en el momento para la esterilización de materiales y medios de cultivo del laboratorio de microbiología.? 2. Para que son utilizados el óxido de etíleno, las radiaciones ionizantes provenientes de Cobalto 68 y Cesio 139 y los rayos catódicos provenientes de generadores y aceleradores de electrones. 3. Qué son las membranas millipore. Para qué se utilizan.? 4. Cuál es el fundamento de la tindalización o esterilización intermitente. 5. Cuál es más eficaz como agente esterilizante, el calor seco o el calor húmedo. Porqué? 6. A qué temperatura en grados F equivalen 121 grados centígrados.
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LABORATORIO No. 2 MEDIOS DE CULTIVO: (TEORÍA) Son sustancias naturales o artificiales que los microorganismos pueden utilizar como nutrientes. 1.
1.1.
1.2.
TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO Hay tres tipos principales de medios de cultivo: Naturales, sintéticos y vivos. Varián en su forma y composición dependiendo de las especies de microorganismos que se vayan a cultivar y los propósitos del cultivo. Medios de cultivos naturales: Son los medios empleados tal y como se encuentran en la naturaleza para el cultivo de los microorganismos, como la leche, sangre diluida, jugos vegetales, etc. Medios de cultivos sintéticos: Tienen una composición definida. Ejemplo de éstos son los medios deshidratados que se consiguen en el comercio en forma d polvos o granulados; son los más usados hoy en día en los laboratorios. Aunque para trabajos de investigación se recomiendan los medios de cultivo que sean químicamente definidos y se puedan reproducir en cualquier parte del mundo.
1.3.
Medios vivos: Son aquellos que contienen células u organismos vivos: Células de riñón de mono, huevos embrionados, etc.
2. 2.1
CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO: Medios de cultivo simples: Tienen los requerimientos de cultivos mínimos y son utilizados para bacterias que son poco exigentes. Medios enriquecidos: Contienen elementos altamente nutritivos a veces en forma natural como sangre,suero, huevo, etc o enriquecidos con sustancias químicas. Medios diferenciales: Son utilizados cuando se desea poner de manifiesto una propiedad especial de una bacteria. Medios selectivos: Se utiliza cuando se desea suprimir el crecimiento de unos microorganismos y favorecer el desarrollo de otros.
2.2.
2.3.
2.4
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Los medios de cultivo pueden ser líquidos, semisólidos ó sólidos. Estos medios se obtienen mediante adicción de sustancias químicas según el caso. 3. 3.1. 3.2 3.3 3.4
PROPIEDADES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO: Humedad: Es necesaria para el crecimiento microbiano, para evitar la desecación que mata a la mayor parte de microorganismos. Fertilidad pH. Los microorganismos tienen un pH óptimo, el cual se les debe procurar en los medios de cultivo. Transparencia: Es calidad primordial para observar el crecimiento microbiano. MEDIOS DE CULTIVO (PRÁCTICA)
I.PREPARACIÓN Y ENVASE DE MEDIOS DE CULTIVO: Los medios de cultivo deben poseer todos los elementos necesarios para permitir la multiplicación de los microorganismos. Pueden ser: Líquidos: Semejantes a un caldo casero, filtrado y/o esterilizado, se envasan en tubos, frascos, matraz. Sólidos: A un medio líquido se le puede agragar una sustancia gelificante como el agar, de modo que el medio se convierte en sólido, con una consistencia como de gelatina. Por calentamiento se funde y se puede verter en diversos recipientes como tubos, frascos, y cajas de Petri. OBJETIVOS: 1.Diferenciar los medios de cultivo utilizados en el laboratorio de microbiología. 2.Utilizar las técnicas necesarias para la buena preparación y conservación de un medio de cultivo. MATERIALES Y MÉTODOS: 3 Erlenmeyer de 250 ml 1 Probetas de 250 ml 2 Agitador magnético 1 Espátula 2 Mecheros 1 Plancha de calentamiento con agitación 1 Balanza Marcador o lápiz vidriograft (debe traerla el grupo) Papel aluminio (debe traerlo el grupo) Cinta de enmascarar (Debe traerla el grupo) 1 Encendedor (Debe traerlo el grupo) 1 Dulceabrigo o toalla para limpiar (Debe traerla el grupo)
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Guantes de cocina (Debe traerlo el grupo)
MATERIALES SOLICITADOS POR EL PROFESOR: 20 Cajas de Petri estériles por grupo Papel kraft Agua destilada Agar nutritivo D + glucosa Peptona Agar Cloranfenicol Algodón Cloruro de sodio PROCEDIMIENTOS: 1. Preparar 200 ml de agar nutritivo 2. Preparar 200 ml de agar Saboraud ** 3. Preparar 200 ml de agar Sabouraud + sal **
Agar Saboraud:
20 20 10 50 50 1000
g de D+ glucosa g de Agar bacteriológico ó agar agar g de peptona bacteriológica mg de cloranfenicol g de cloruro de sodio mL de agua destilada
Preparación de los medios de cultivo sólidos: 1.Pesar en erlenmeyer o pesasales la cantidad de medio de cultivo que va a necesitar. 2.Agregar el agua destilada y dejar en reposo 5 minutos 3.Al cabo de este tiempo se hierve esta solución teniendo cuidado que no se vaya a derramar. 4.Dejar reposar un poco, taponar con algodón y sellar con papel aluminio o papel kraft. 5.Colocar el erlenmeyer dentro del autoclave y esterilizar a 121 grados centígrados y 15 psi. 6.Una vez esterilizados los medios se envasan en las cajas de Petri, siguiendo las indicaciones del instructor. Estos procedimientos se trabajan en un ambiente estéril.
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MICROORGANISMOS DEL AMBIENTE: La presencia de microorganismos en cualquier ambiente es de especial significado para los trabajos realizados en microbiología. El conocimiento de este hecho debe tenerse en cuenta con el propósito de mantener libre de microorganismos los materiales hasta su utilización. El aire carece de una microbiota propia, ya que todos sus gérmenes se encuentran allí accidentalmente y en forma general se hallan sobre partículas sólidas en suspensión o en pequeñas gotas de agua. Los microorganismos llegan al aire por medio del polvo, tierra seca, salpicaduras de la corriente de agua, gotitas expulsadas al toser, estornudar o hablar, hongos que crecen en las paredes, techos, suelos, alimentos, etc. Los microorganismos presentes en el aire como no alcanzan a desarrollarse sólo se mantienen ahí, persisten por lo tanto, las especies más resistentes a la desecación como las conidias y esporas de hongos, cualquier clase de bacteria (sobre partículas de polvo o gotitas de agua), predominando los cocos; también se pueden encontrar levaduras. El número de microorganismos está dado por factores como: Movimiento del aire, luz solar, humedad, situación geográfica, cantidad de agua y polvo suspendidos.
OBJETIVOS: 1. Observar el grado de contaminación de un área determinada. 2. Aislar, cuantificar y tratar de identificar los microorganismos que habitualmente se encuentran en el área de trabajo.
MATERIALES Y MÉTODOS: PROCEDIMIENTO: a) Dirijase al sitio que le corresponde analizar. b) Destape 1 caja con agar Saboraud y 1 caja con agar nutritivo. c) Dejela expuesta al aire durante 20 minutos. d) Tape la caja y sellela con cinta de enmascarar e) Dejela incubando a temperatura ambiente. Observe diariamente el crecimiento de bacterias, si tiene agar nutritivo o de hongos, si tiene agar Saboraud.
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f) g) h)
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Guárdelas en la nevera, cuando ya observe crecimiento microbiano. Se harán observaciones macro y microscópicas de estos hongos y bacterias el próximo laboratorio. Deje una caja de cada medio sin abrir (Como testigos de esterilidad)
RESULTADOS: Escribir y presentar un informe bien detallado con las diferentes observaciones realizadas. Número de Unidades formadoras de colonias (UFC) y descripción macroscópica de hongos y bacterias.
CUESTIONARIO: 1. Porqué se utiliza el agar nutritivo. 2. Que clase de microorganismos crece en agar Saboraud? Porqué? 3. Que sitios creen ustedes que deben permanecer libres de contaminación y cómo han sido tratados para obtener completa esterilidad. 4. Qué otras técnicas se utilizan para el análisis microbiológico del aire.
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Laboratorio No. 3 A: Características de las colonias de Bacterias y Hongos Después de practicada una siembra y dadas las condiciones re queridas de nutrientes, temperatura, tiempo de incubación, presencia o ausencia de Oxígeno, según el tipo de bacteria investigada, observamos la aparición macroscóspica de las bacterias en poblaciones, originadas a partir de una célula y que denominamos colonias. En los medios de cultivo sólidos las colonias se desarrollan sobre la superficie del medio presentando una morfología con características comunes y particulares según los grupos microbianos y que constituyen uno de los primeros pasos en la identificación de éstos. Estas características pueden presentar variaciones de pendiendo de la composición química del medio empleado como también de las condiciones ambientales. En los medios líquidos el crecimiento se hace aparente por turbidez en el medio. Con fines didácticos se ha escogido los siguientes criterios que se deben tener en cuenta para la descripción de las colonias:
Características macroscópicas de las colonias bacterianas en caja de petri : I. TAMAÑO 1. Grande 2. Mediana. 3. Pequeña 4. Puntiforme I.
FORMA, BORDES Y ELEVACIÓN: ( Figura 3.1)
II.
SUPERFICIE 1. Lisa 2. Rugosa
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III.
CONSISTENCIA: 1. Blanda 2. Dura 3. Mucoide
V.
ASPECTO 1. Brillante u opaco 2. Mate o translúcida
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PIGMENTO 1. Amarillo 2. Rojo 3. Verde
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HEMOLISIS 1. Parcial (alfa) 2. Total (beta) 3. No hemolítica
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Figura 3.1 Forma, bordes y elevación de las colonias bacterianas
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Figura 3.2. Colonias bacterianas en tubos de ensayo
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Características de las colonias de hongos: I.
II.
TEXTURA: (Se observa en el anverso de la caja de Petri) 1. Algodonosa 2. Afelpada 3. Granular 4. Polvosa 5. Pastosa 6. Algodonosa-granular 7. TOPOGRAFÍA: (Se observa por el reverso de la caja de petri) 1. Lisa 2. Radiada o Rugosa 3. Verrucosa
III.
CONSISTENCIA: 1. Cremosa 2. Mucosa 3. Dura- Pastosa
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COLOR: 1. Amarillo 2. Verde 3. Azul
Figura 3.3 Topografía de los hongos
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B. SIEMBRA DE BACTERIAS INTRODUCCIÓN Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseñado diversos métodos que permiten cultivarlos bajo condiciones artificiales, en los que es posible cultivarlos bajo condiciones experimentales y manejar un solo tipo de microorganismo. Una de las técnicas más usadas en el laboratorio de microbiología consiste en transferir una muestra microbiológica de un ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener cultivos microbianos. A l efectuar este procedimiento, es necesario considerar que en el área de trabajo, existen muchos otros microorganismos; debido a esto, es necesario tomar precauciones para impedir que éstos penetren y contaminen los cultivos en estudio. La aplicación de estos procedimientos ha permitido propagar a los microorganismos en cultivos mixtos, así como su aislamiento y la obtención de cultivos puros, facilitando de este modo, el estudio, caracterización, aplicación y control de los mismos. La forma de sembrarlos y cultivarlos depende del tipo de microorganismo y propósito específico del estudio. OBJETIVOS: 1 . Aplicar la técnica adecuada para preparar el área de trabajo y evitar contaminaciones. 2 . Organizar el material para su fácil manejo e identificación. 3 . Manipular adecuadamente los cultivos puros. 4 . Seleccionar y aplicar las técnicas de siembra adecuadas para alcanzar propósitos específicos. TEORÍA: Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo de éste en medios de cultivo y condiciones de laboratorio controladas. La población de microorganismos desarrollada en un medio se denomina cultivo. Cuando éste contiene una sola especie de microorganismo, se denomina cultivo puro ó axénico, cuando contiene más de una especie de microorganismos se denomina cultivo mixto. Un cultivo tipo contiene una especie conocida de microorganismos y es conservada en el laboratorio para realizar diversos ensayos y estudios. Un cultivo axénico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una sola célula. Los cultivos axénicos son muy raros en la naturaleza. En los medios naturales -por ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo humano- existen cultivos mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas y diferentes especies de forma conjunta. Un cultivo axénico se obtiene artificialmente en el laboratorio.
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A la hora de obtener un cultivo axénico se han de tomar precauciones especiales, ya que los microorganismos están por todas partes, en la naturaleza, en el laboratorio y en los instrumentos y recipientes usados en los experimentos. Estos microorganismos no deseados o contaminantes deben ser eliminados de un cultivo para que éste pueda ser axénico. El segundo paso para obtener un cultivo axénico es inocular o introducir, una sola célula de un microorganismo en un medio sólido o liquido, esterilizado previamente. De esta manera, aislamos un solo microorganismo del resto y se podrá multiplicar en condiciones favorables. Un clon está constituido por una población de células descendientes de un solo microorganismo. Una colonia es un clon lo suficientemente grande como para ser visible sobre la superficie de un medio sólido. Un cultivo microbiano que ha estado creciendo por cierto tiempo en el mismo tubo o matraz, debe ser transferido a un medio de cultivo nuevo, de otra manera el crecimiento y sobrevivencia no pueden continuar. En esta transferencia se deben considerar dos aspectos básicos referentes a: no introducir microorganismos indeseables (contaminantes) y concentración o carga microbiana de la muestra (inóculo) a sembrar. Para impedir la contaminación de los cultivos, es necesario tener plena conciencia de la ubicuidad de los microorganismos, lo que determina que el aíre y todas las superficies estén densamente pobladas por microorganismos, de este modo en la transferencia de una muestra microbiológica a otro recipiente, se deben tener una serie de cuidados que eliminen los riesgos de contaminación. Estos incluyen el área de trabajo, el lavado de las manos, la esterilización de todos los utensilios y medios de cultivo a emplear y realizar la transferencia del microorganismo en una zona estéril, la que se obtiene trabajando cerca de la flama del mechero. Al conjunto de procedimientos realizados para prevenir o evitar la contaminación se le llama técnica aséptica; el seguimiento cuidadoso y detallado de la misma evita accidentes tales como: 1. La contaminación y pérdida del cultivo en estudio 2. La salida y dispersión de microorganismos del cultivo, lo que ocasionaría la contaminación de utensilios, productos y del personal. Este último aspecto es particularmente importante cuando se trabaja con cultivos de microorganismos patógenos.
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Con relación a la concentración del inóculo, un error frecuente del principiante consiste en tomar muestras grandes, lo que es innecesario. Una colonia de bacterias del tamaño de la cabeza de un alfiler contiene varios millones de microorganismos, es obvio que con una cantidad pequeñísima (casi invisible) que se adhiera al asa, será más que suficiente para efectuar una transferencia exitosa. Dispositivos empleados en la transferencia de muestras microbianas: hisopo, pipeta (para uso microbiológico son terminales y la parte superior o boquilla debe estar protegida con filtro de algodón), pipeta pasteur, cable de Kolle o portasa con alambre de platino dispuesto en forma de: aguja, asa, espátula y/o gancho. En la transferencia de microorganismos se emplean agujas, asas de inoculación, hisopos, pipetas o pipetas pasteur que deberán esterilizarse previamente. La utilización de estos dispositivos, así como de los diferentes medios de cultivo tienen aplicaciones específicas. Por ejemplo: los medios líquidos se preparan en tubos o matraces que se cubren con tapones de algodón o tapones especiales. Un cultivo líquido puede ser transferido mediante un asa microbiológica, un hisopo, pipeta o pipeta pasteur; el inóculo se deposita dentro del caldo o medio líquido. En este tipo de cultivos los microorganismos presentan un desarrollo particular que se manifiesta en la superficie o a través de todo el líquido. Una de las ventajas que presenta este tipo de cultivo se refiere a la posibilidad de agitarlos acelerando la velocidad de microorganismos anaerobios, por otra parte, en este tipo de cultivos, las poblaciones se encuentran suspendidas y e fácil homogenizarlas, lo que permite estandarizar la concentración del inóculo. La desventaja que presentan, e que en ellos e difícil detectar contaminación a simple vista. Los medios semisólidos e preparan en tubos, se inoculan con aguja de siembra (asa recta) o pipeta pasteur; en este último caso es necesario calentar el medio y cuando se encuentra en estado líquido y a una temperatura de aproximadamente 42ºC se agrega el inóculo, se homogeniza y se deja solidificar. Estos medios se emplean para estudiar la movilidad de los microorganismos y para favorecer la separación de microorganismos con diferentes requerimientos de oxígeno. Los medios sólidos se preparan en tubos o matraces dependiendo de la cantidad o de las necesidades, después de esterilizarlos, estos se inclinan o vierten en cajas de petri. La siembra se realiza con el asa, inoculando la superficie del agar con mucha suavidad; en estos medios, los microorganismos al multiplicarse forman agregados que se hacen visibles
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a simple vista; a estos agregados se les denominan colonias, las que presentan características que varían con el tipo de microorganismo cultivado y el medio de cultivo empleado. En cualquier medio de cultivo es de primordial importancia ajustar el pH, ya que aún cuando la mayoría de los microorganismos crecen mejor en pH neutro, algunos requieren de pH alcalino o ácido, por lo que al proporcionar un pH adecuado se favorecerá el crecimiento del microorganismo de interés y la obtención del cultivo. Con este mismo propósito durante la incubación se deben proporcionar las condiciones adecuadas para el microorganismo en estudio. El crecimiento óptimo de los microorganismos se presenta a temperaturas que la mayoría de las veces están relacionadas con la de su hábitat natural. Algunos microorganismos crecen por debajo de 15ºC, otros requieren temperaturas más elevadas (30 a 45ºC) y algunos hasta 80ºC. Para alcanzar y mantener estas temperaturas se puede usar una incubadora microbiológica o un baño de agua a temperatura constante, en tanto que para lo microorganismos que presentan su crecimiento óptimo a temperaturas entre 20 y 25ºC se pueden incubar en la gaveta o cajón del laboratorio, a temperatura ambiente. En general las incubadoras microbiológicas satisfacen las necesidades en cuanto a los rangos de temperatura requeridas por los microorganismos. La desventaja que tienen es que estos aparatos funcionan con aíre seco, lo que determina la deshidratación de los medios de cultivo. Por lo tanto, el crecimiento de cualquier cultivo. En el estudio de cultivos bacterianos algunos de los criterios que se emplean para caracterizarlas incluyen: tamaño, morfología celular, forma de agrupación, reacción a la tinción de Gram, formación de esporas, movilidad, presencia de inclusiones de reserva y características culturales en medios líquidos y sólidos en los que presentan patrones de desarrollo en cuanto a la forma, tamaño, elevación y color de las colonias.
Técnicas de aislamiento El método de siembra por estría en placa: Es el método más fácil y el más usado para obtener cultivos axénicos. Para ello, con un asa de siembra se toma una muestra de la población mixta y a continuación se hacen estrías sobre la superficie de un medio sólido preparado en una placa Petri. Conforme se van haciendo estrías
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en zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio menos microorganismos. A continuación, se flamea el asa, se toca en la región donde se han realizado las últimas estrías y se continúa la siembra con la misma técnica, en la superficie de medio sin sembrar aún. Repitiendo este proceso varias veces se logra separar células individuales. A continuación, las placas se incuban en un lugar adecuado, permitiendo que las células aisladas experimenten un número suficiente de divisiones para formar colonias visibles. Aunque cada colonia posiblemente representa un clon derivado de una sola célula, no podemos asegurarlo. Quizás, dos células quedaron depositadas tan juntas que han originado una única colonia mixta. Por tanto, para asegurarnos de que hemos obtenido un cultivo axénico, conviene repetir el procedimiento a partir de una colonia bien aislada en la primera placa. Las colonias que se desarrollen la segunda vez, serán, casi con toda seguridad, cultivos axénicos. Los métodos de vertido en placa y extensión en placa: En estos métodos, las suspensiones de células microbianas se diluyenantes de su siembra en placa. Se siguen estas técnicas cuando la muestra contiene tantos microorganismos, que la dilución no se puede realizar en una sola etapa. Por ejemplo, una suspensión con mil millones de células por mililitro debe ser diluida 107 veces para obtener una suspensión con un centenar de células por mililitro, Por tanto, se realizan diluciones seriadas (en varias etapas), normalmente de diez en diez, pero a veces de cien en cien. Para realizar diluciones de diez en diez, se añade 1 ml de la suspensión bacteriana a 9 ml (le medio estéril o solución salina, igualmente estéril. Se agita vigorosamente para diluir las células y el proceso se repite cuantas veces sea necesario. A continuación, se puede proceder de dos maneras diferentes. En el método de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar fundido y se vierten en placa. Algunas colonias quedarán embebidas en el agar y otras crecerán en la superficie. Las colonias superficiales se extenderán y serán más grandes. En el segundo método (extensión en placa), las muestras diluidas se siembran directamente en la superficie de la placa de agar, extendiéndolas con avuda de un asa de Diralsky de cristal estéril. La suspensión se absorbe en el agar, dejando las células microbianas sobre la superficie. En ambas técnicas las placas se incuban hasta la aparición de las colonias. Como en el método de siembra por estría, no existe la seguridad de que las colonias que aparecen en las placas sembradas por extensión o en el agar solidificado sembrado por el método del vertido en placas sean cultivos axénicos hasta que se repita el proceso. Las dos técnicas de siembra por dilución presentan la ventaja de
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que permiten obtener un mayor número de colonias aisladas que el método de siembra por estría, por tanto se eligen cuando se ha de seleccionar una cepa a partir de una mezcla con varios tipos de microorganismos. Para obtener un cultivo axénico mediante este método: (a) Hacer diluciones seriadas de la suspensión bacteriana hasta obtener una muestra con sólo unos pocos cientos de bacterias (b) verter la muestra en un tubo con agar a sobrefusión, mezclar y verter el contenido en una placa Petri. (c) Después de la incubación, se desarrollan colonias en el agar (más pequeñas) y en su superficie (más grandes). Método de aislamiento por siembra por estría en placa: Para obtener un cultivo axénico: (a) esterilizar un asa de siembra por flameado en la llama de un mechero (b) introducirla en la suspensión bacteriana para recoger una muestra (c) sembrar haciendo estrías sobre la superficie de un medio sólido en una placa Petri. (d) volver a esterilizar el asa, tocar en la zona de la placa ya sembrada y hacer un segundo grupo de estrías en una región nueva de la placa. Repetir el proceso una tercera y una cuarta vez, hasta conseguir que los grupos de células se diluyan y se separen células aisladas. (e) Después de la incubación, se desarrollan colonias aisladas. Para estar seguro de que el cultivo es puro, repetir el proceso entero; para ello tomar una colonia aislada y sembrar por estrías una segunda placa. Conservación de los cultivos axénicos Una vez que se obtiene un cultivo axénico, hay que mantenerlo en el laboratorio para poder trabajar con él o intercambiarlo con otros científicos. Esto se puede llevar a cabo haciendo resiembras en un medio fresco, mensualmente o con otra periodicidad. Pero un cultivo puro también puede mantenerse viable durante años sin hacerlo crecer periódicamente. A los cultivos que se mantienen en el laboratorio para su estudio y como referencia se les denomina cultivos de colección. Muchos laboratorios poseen una colección de cepas que se han aislado en el mismo o que han obtenido de las denominadas colecciones de cultivos tipo, que son organizaciones que mantienen un número enorme de cultivos microbianos como un servicio a los microbiólogos. Existen muchas técnicas de mantenimiento de los cultivos puros, pero casi todas consisten en una desecación (eliminación del agua) o en un almacenamiento a baja temperatura.
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Los cultivos generalmente se desecan por liofilización (congelación y desecación). El método consiste en lo siguiente: el cultivo líquido se vierte en un pequeño vial o ampolla de vidrio y se añade leche descremada para proteger las células durante el proceso. La mezcla se congela en hielo seco y se expone al vació para su sublimación (eliminación del agua congelada). Durante el proceso de sublimación las células permanecen congeladas. Posteriormente se procede al sellado de los viales, mientras aún se mantiene el vacío. Los cultivos liofilizados se almacenan a temperatura ambiente. Para almacenar un cultivo empleando bajas temperaturas, se mezcla con sustancias protectoras, como la leche descremada, el glicerol, o el dimetilsulfóxido (DMSO). Los tubos de ensayo se sellan y se almacenan por debajo de los - 50oC, en nitrógeno líquido o en unultracongelador, capaz de alcanzar tan bajas temperaturas.
Materiales que deben traer o pedir: 2 mecheros de gas 2 Asas bacteriólogicas/ estudiante 2 Asas micológicas 1 estereoscopio 1 Lámpara de mercurio 1 marcador sharpie (estudiante) Cinta de enmascarar Lápiz Si desean colores
MÉTODOLOGÍA: 1. 2. 3. 4.
Limpiar y esterilizar el área de trabajo Identificar y organizar el material dentro del área de trabajo. Hacer observación de bacterias y hongos Describir las características de las colonias de bacterias y hongos de acuerdo con la teoría anterior. 5. Prender los mecheros, ajustar la flama hasta que esta presente un cono azul bien marcado. 6. Marcar las cajas de Petri con iniciales de la cepa a sembrar y fecha. 7. Hacer las siembras de acuerdo con las indicaciones de la profesora.
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Técnicas de estriado: a) estriado simple: estriado continuo: Esteriliza el filamento del asa de siembra y toma la parte de la caja de petri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cerca del mechero espera que se enfríe el asa y toma una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera, ahora, toma una placa con agar estéril (donde se vaya a sembrar) y con cuidado de no romper el agar, inocula la muestra en un extremo de la placa y con el asa en posición ligeramente horizontal realiza las estrías (muy juntas), oscilando el asa de siembra sobre la superficie de una porción pequeña del agar; mediante un balanceo sucesivo y rápido de la muñeca. b)estriado en cuadrantes: la mayor parte del inóculo e descarga en los cuadrantes 1y 2, lo que permite obtener colonias separadas en 3 y 4; Con un asa de siembra, previamente esterilizada, se toma una muestra del cultivo de microorganismos y se extiende sobre un área pequeña de la superficie de la placa con medio, en forma de estrías muy juntas, pero sin hacer presión para no dañar el medio. Se flamea el asa, se enfría y después de rozar la siembra realizada previamente, se extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estrías. Este proceso se repite sucesivamente, flameando y enfriando el asa al comienzo de las sucesivas siembras en estría. Se lleva la placa a incubar, a la temperatura adecuada, siempre en posición invertida. Mediante esta técnica se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que contenga un elevado número de bacterias.
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RESULTADOS 1. Cajas de Petri con Agar Nutritivo (bacterias)
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2. Cajas de Petri con Agar SABOURAUD (hongos)
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3. Cajas de Petri con Agar SABOURAUD más sal (hongos)
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Características de las colonias de bacterias en agar nutritivo
Característica
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3
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10
Forma Elevación Bordes Textura Color
Característica Forma Elevación Bordes Textura Color
Características de los hongos en agar Sabouraud Característica Textura Topografía Consistencia (levaduras) Color
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Característica
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Textura Topografía Consistencia (levaduras) Color
Características de los hongos en agar Sabouraud más sal Característica
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Textura Topografía Consistencia (levaduras) Color
Característica Textura Topografía Consistencia (levaduras) Color
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LABORATORIO 4 COLORACIÓN DE BACTERIAS Para comprender como tiñe un colorante a la célula bacteriana, hay que saber antes que es un colorante. Los colorantes son generalmente, sales en las que uno de sus iones tienen color. Una sal es un compuesto formado
por
un
ion
cargado
positivamente
y
un
ion
cargado
negativamente. El colorante simple azul de metíleno es la sal cloruro de azul de metileno, que se disocia de la siguiente manera:
CAM
CLORURO (-) + AZUL DE METILENO (+)
El color del colorante reside en el ion azul de metileno cargado positivamente. Las células bacterianas tienen una débil carga negativa cuando el pH del medio externo esta cerca de la neutralidad que es lo que generalmente ocurre. La célula bacteriana cargada negativamente se combina con el ion azul de metileno cargado positivamente, con lo cual se tiñe la bacteria. Las diferencias en las cargas dan lugar a una afinidad entre el colorante y la célula bacteriana. Los colorantes se pueden dividir en dos grupos básicos y ácidos. Si el color reside en el ion positivo,se dice que es un colorante básico, si el color reside el ion cargado negativamente se dice que es un colorante cido.
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PREPARACIÓN Y FIJACIÓN DE LAS BACTERIAS PARA LA TINCIÓN: Figura 4.1 Preparación de un frotis para colorear
1. Con un asa de siembra coloque una gota pequeña de agua o solución salina estéril y mezcle bien con un poco del crecimiento bacteriano del cultivo. 2. Extienda la gota sobre el portaobjetos formando una capa fina. 3. Seque los portaobjetos al aire. 4. Cuando se halla secado el frotis, pase el portaobjetos tres veces por la llama del bunsen con la capa hacia arriba. Un calor excesivo
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estropearía la forma normal y la estructura de los microorganismos que se van a teñir.
El propósito de fijar es matar los microorganismos, coagular el protoplasma de la célula y como se ha dicho adherirla al portaobjetos
COLORACION DE BACTERIAS: Debido a que las bacterias son en su mayoría casi incoloras o transparentes,se hace necesario teñirlas aumentando el contraste de color con el medio que las rodea y facilitar su observación al microscopio.
Objetivos: 1. Preparar extendidos o frotis en portaobjetos a partir de cultivos bacterianos del medio ambiente y de superficies. 2. Identificar los diferentes reactivos usados para la coloración de bacterias, de acuerdo con la estrcutura que se desea resaltar. 3. Utilizar las técnicas de coloración de bacterias.
Materiales: Que deben traer por grupo: Cultivos bacterianos del medio ambiente de la clase anterior 1 caja de portaobjetos 1 caja de cubreobjetos Cinta de enmascarar Marcador Encendedor Papel períodico
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Que deben pedir al almacen: 2 Mecheros Bunsen 5 Asas bacteriológicas/grupo Cubetas para coloración
Que lleva el profesor: Goteros con solución salina estéril Cristal-violeta Lugol Alcohol-acetona Safranina Palillos estériles Aceite de inmersión
COLORACIÓN DE GRAM Uno de los procedimientos más importantes y utilizados en la caracterización de las bacterias es la tinción de Gram. Esta técnica de tinción esta basada en la habilidad de las bacterias para retener el cristal violeta, después de ser sometidas a la decoloración con alcohol. Las bacterias que retienen el cristal violeta se denominan Gram positivas y aparecen de color azul oscuro o violetas y las que se decoloran y aparecen teñidas con el colorante de contraste safranina se observan de color rosado.
En la coloración de Gram se utilizan cuatro soluciones: 1. Cristal-violeta como colorante básico 2. Lugol como mordiente- fija el colorante primario 3. Alcohol-acetona. Retira el colorante básico si no ha quedado bien fijado.
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4. Safranina – colorante de contraste- colorea las células decoloradas con el alcohol-acetona.
Procedimiento Figura 4.2 Coloración de Gram
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Prepare los frotis para coloración de bacterias de acuerdo al enunciado anterior (Preparación y fijación de bacterias). 1. Tiña los frotis con el cristal violeta durante 1 minuto. 2. Lave suavemente con agua para remover el exceso de colorante 3. Aplique al frotis el lugol durante 1 minuto 4. Lave el lugol con agua (Suavemente) 5. Decolore con alcohol-acetona durante 1 minuto o hasta que no se desprenda colorante primario. 6. Lave con agua suavemente el exceso del alcohol 7. Tiña con el colorante de contraste – safranina durante 30 segundos. 8. Lave la safranina con agua (suavemente) 9. Espere que se seque al medio ambiente 10. Observe al microscopio utilizando aceite de inmersión.
OBSERVACIÓN MICROSCOPICA DE PLACA BACTERIANA: 1. Coloque una gota de solución salina sobre la lámina portaobjetos. 2. Obtenga placa dental (cada estudiante) de las siguientes áreas con palillos individuales: a) Superficie proximal b) Superficie lingual
3. Mezcle el material obtenido con la gota de agua, en forma rotatoria 4. Marque su lámina Proceda a realizar la coloración de Gram 5. Examine las láminas con aceite de inmersión
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Resultados: Nombre:______________________________Código: _______________
AREAS
COLORACION DE
BACTERIAS ó
GRAM
LEVADURAS
SUPERFICIE INTERPROXIMAL
SUPERFICIE LINGUAL
Preguntas: 1. Cuál es el tipo de microorganismo más predominante encontrado en la placa bacteriana. 2. Qué forma y coloración tienen las bacterias del medio ambiente, la suya y la de sus compañeros de grupo.
COLORACIÓN PARA HONGOS: Objetivos: 1. Identificar las diferentes estructuras somáticas y reproductivas que poseen los hongos y que son útiles para la identificación de ellos. 2. Utilizar las diferentes técnicas de montaje y coloración de hongos.
Materiales: Que deben traer por grupo: Portaobjetos y cubreobjetos Encendedor
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Marcador Tapabocas (personas alérgicas) Cinta transparente adhesiva pequeñita Hongos aislados del medio ambiente y de superficies.
Que deben pedir al almacén
:
Asas en puntas y dobladas Papel toalla Mechero Bunsen
Que trae el profesor: Azul de lactofenol (ALF) Hidróxido de potasio (KOH 20%)
Procedimiento: Colonias de hongos del medio ambiente: Existen dos técnicas de montaje: 1. La técnica de las dos agujas: a) Colocar una gota de azul de lactofenol (ALF) en el centro de un portaobjetos b) Tomar con un asa curva una porción de colonia de hongos y colocarlo encima de la gota de azul de lactofenol. c) Con ayuda de una aguja recta estéril disociar el micelio con el objeto de hacer más delgada la preparación que permita una mejor visualización de las estructuras del hongo. d) Observar
al
microscopio
primero
con
objetibo
de
posteriormente con objetivo de 40x.
2. La técnica de la cinta adhesiva transparente: a) Colocar una gota de ALF en el centro de un portaobjetos
10x
y
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b) Tomar un pequeño fragmento de cinta transparente entre los dedos pulgar e indice, con el lado adhesivo hacia afuera. c) El lado adhesivo se presiona sobre la superficie de la colonia de moho d) Colocar la cinta con el lado adhesivo hacia abajo y pegarla sobre el portaobjeto con el ALF. e) Observar al microscopio con objetivos de 10x y 40x.
Resultados: La observación microscópica de los hongos permite su identificación. Ud debe tener en cuenta: a) Tipo de hifa: septada – no septada; pigmentada o hialina. b) Forma del conidioforo c) Tipo
de
conidias
(microconidias,
macroconidias,
artroconidias,
clamidoconidias, esporangiosporas, blastoconidias).
Coloración de muestras clínicas: En muestras normalmente estériles (LCR, sangre, líquidos obtenidos por punción), la presencia de levaduras tiene relación directa con el proceso patológico. Por el contrario, su hallazgo en muestras en las cuales la levadura es microbiota normal (esputos, materia fecal, material vaginal) no les concede papel etiológico. En tal caso y siempre que se parta de material reciente y adecuadamente recolectado, el significado de estos microorganismos puede establecerse por: a) Número de estructuras observadas b) Frecuencia de su observación o aislamiento a partir de muestras seriadas. c) En el caso de levaduras del género Candida, la presencia de seudomicelios.
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Recolección de las muestras: Los especímenes clínicos en los cuales se va a investigarlas levaduras, deben ser recolectadas con iguales precauciones como si se tratara de un exámen bacteriológico. Sin embargo, no se recomienda la utilización de medios de transporte. El uso de escobillones en flujos vaginales, exudado bucal se deben colocar en un recipiente con solución salina estéril y enviar rápidamente al laboratorio. (Las muestras pueden refrigerarse por 2 o 3 horas como máximo).
Examen directo: Se puede realizar con KOH al 10 ó 20%, con colorantes de Gram o Papanicolao.
El examen directo con KOH se realiza de la siguiente manera: a) Hacer un extendido de la muestra (flujo vaginal o material de la mucosa oral) con el escobillón o palillo en un portaobjetos limpio. b) Colocar una gota de KOH 10% sobre el extendido o frotis. c) Colocar sobre la muestra el cubreobjetos d) Flamear tres veces rápidamente por debajo de la muestra (Esto acelera la digestión del KOH) e) Observar con objetivos de 10x y 40x.
De esta coloración se hará demostración con material clínico positivo.
Preguntas:
1.
Qué estructuras de hongos observa
2.
Son hongos hialinos o pigmentados
3.
Qué géneros de hongos encontró en el medio ambiente (El suyo y el de sus compañeros de grupo).
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RESULTADOS
Coloración de Gram Colonia 1
Colonia 2
Colonia 4 Colonia 3
