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Guía de Laboratorio de Bioquímica General

L.D. Caicedo

GUÍA DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

Por: Luz Dary Caicedo Bejarano

Universidad Santiago de Cali Facultad de Ciencias Básicas Programa de Química 2013

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INTRODUCCIÓN AL TRABAJO EN EL LABORATORIO De: RIASCOS, M. NAVIA, C.G. Prácticas de laboratorio de química general. Universidad del Valle, Departamento de Química. 2000.

NORMAS DE SEGURIDAD:

A

l llegar al laboratorio, conozca donde se localiza la fuente de agua, la ducha, los

extintores y las salidas de emergencia. Aprenda a usarlos adecuadamente y no dude en utilizar este equipo si es necesario. Es importante reiterar al iniciar la practica de laboratorio los seguros de las puertas que son acceso a las salidas de emergencia. Utilice la ducha de seguridad si su ropa se incendia o si sobre su ropa se derrama gran cantidad de un reactivo corrosivo. Quítese de inmediato la prenda afectada. El pudor no cuenta en ese momento, solo cuenta la rapidez con la cual usted enfrente el problema. 2. Antes de entrar al laboratorio además de tener presente las normas de seguridad es importante que lea muy bien la guía, realice un diagrama de flujo y consulte la peligrosidad y modo de empleo de los reactivos a utilizar. Sea consciente de los riesgos que corre al realizar determinados procedimientos en el laboratorio, sea prevenido y actué con cautela. Destine una libreta para el curso del laboratorio en la cual consignara toda la información que debe conocer y manejar antes, durante y después de las practicas de laboratorio. 3. Vístase adecuada y cómodamente el día de laboratorio. Evite ropa inflamable. Use pantalón largo y preferiblemente de algodón. No lleve anillos ni pulseras durante el tiempo que dure el laboratorio. Póngase calzado con suela antideslizante, no utilice sandalias que dejen los dedos destapados. Si su cabello es largo utilice un gancho para sujetarlo. En todo momento utilice bata de laboratorio completamente abotonada, esta puede protegerlo de algunas quemaduras y evitar que sus ropas se deterioren por salpicaduras de reactivos. Mantenga y lave su bata de laboratorio aparte de la ropa que usa normalmente. 4. Proteja siempre en forma adecuada sus ojos. El riesgo de una lesión grave en los ojos, obliga a que todos (estudiantes, profesores y visitantes) en el laboratorio lleven siempre una protección adecuada, desde el inicio hasta el final de la practica. Los ojos pueden sufrir daños irreversibles por salpicaduras de reactivos o esquirlas de vidrio que vuelan en un accidente. MANTENGA PUESTAS LAS GAFAS DE SEGURIDAD aun cuando usted no este realizando algo peligroso; sus vecinos pueden tener un accidente y afectarlo a usted. Recuerde una pequeña gotica de reactivo concentrado puede ocasionarle la perdida de la visión. En caso de que lleguen salpicaduras de reactivos lave inmediatamente con abundante agua. Si solo un ojo es afectado, proteja el sano durante el lavado. Abra bien los párpados y mueva el ojo afectado en diferentes sentidos, Avise a su instructor de inmediato y acuda al médico lo antes posible.

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Nunca use lentes de contacto ya que las sustancias químicas pueden penetrar por capilaridad debajo de ellos por lo que no será fácil de enjuagarlos. 5. Nunca trabaje solo sin supervisión en el laboratorio. No realice ningún experimento sin previa autorización.

6. Mantenga su área de trabajo limpia, seca y ordenada. Siga cuidadosamente las instrucciones para el ensamble de equipo y antes de ponerlo en funcionamiento haga que su instructor lo revise. Mantenga libros y objetos personales retirados del sitio de trabajo. Ellos pueden interferir su labor y resultar peligrosos, si usted salpica o riega un reactivo límpielo rápidamente. Provéase de un pedazo de dulce abrigo para la limpieza de las mesas de trabajo.

7. Lea los rótulos de los reactivos cuidadosamente. El uso erróneo de sustancias puede causar serios accidentes. Evite contaminar los reactivos puros. Nunca devuelva el exceso de reactivo a los frascos tome solo la cantidad que usted va a necesitar. Rotule correctamente los envases de las soluciones preparadas para las practicas y de los desechos producidos en las mismas. El rotulo debe contener en el caso de las soluciones: Nombre, formula, concentración, fecha de preparación y persona responsable. Y en el caso de los desechos: Nombre practica, fecha, composición, concentración, persona responsable. Los procedimientos para la recuperación de desechos o su eliminación previamente inocuos serán realizados en un trabajo coordinado por su instructor. 8.La mayoría de los productos químicos del laboratorio son tóxicos; algunos más tóxicos que otros como soluciones concentradas de ácidos y bases fuertes, corrosivos para la piel. En el manejo de los productos químicos, evite el contacto con la piel, ojos y mucosa en todos los casos. Si ocurren salpicaduras sobre la piel elimínelas previamente con un trapo seco y seguidamente lave inmediatamente el área afectada con bastante agua fría; en el caso de soluciones corrosivas la rapidez con que usted actué es factor importante para evitar daño en la piel. Debido al peligro de reabsorción, no use nunca solventes orgánicos en el lavado 9. Evite las chanzas, juegos y manifestaciones de cariño y visitas de sus amigos hasta que termine la practica de laboratorio. No permita bajo ningún motivo la presencia de niños en los laboratorios. 10. NUNCA INGIERA COMIDAS O BEBIDAS Y NUNCA FUME LABORATORIO. Lave sus manos antes y después de terminada la practica

EN

EL

11. Las lesiones más comunes en un laboratorio de química son las cortaduras y quemaduras. Descarte el material de vidrio que se ha resentido o quebrado y deposítelo en el lugar indicado para tal propósito. Pula con fuego las puntas cortantes de tubos y varillas de vidrio. Nunca intente forzar la entrada de un tubo de vidrio o termómetro por el agujero de un tapón. Previamente asegúrese de lubricar con glicerina o agua jabonosa, tubo y agujero. Proteja sus manos con varias capas de toalla o unos guantes resistentes mientras inserta el vidrio o el material cortante en el tapón. Nunca toque con su piel

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mallas de calentamiento, material de vidrio, aros y materiales de laboratorio que previamente hayan sido sometidos a calentamiento. Si es necesario hacerlo usted deberá ser extremadamente cuidadoso de lo contrario podría ocasionarle quemaduras muy graves. 12. Muchos químicos que usted utiliza son tóxicos y pueden ocasionarle severas quemaduras en las mucosas si usted los ingiere. Siempre utilice una pera de caucho para succionar o extraer los líquidos con una pipeta, NUNCA UTILICE LA BOCA NI PRUEBE UN REACTIVO. 13. Cualquier experimento en el cual se puedan producir humos tóxicos o irritantes, deberá realizarse dentro de la campana extractora (revisar su funcionamiento antes de iniciar el procedimiento). Para probar el olor de una sustancia, coloque la boca del recipiente alejada de su nariz, y con su mano ventilen poco los vapores hacia su nariz. No inhale profundamente, olfatee suavemente. 14. Nunca agregue agua a un ácido concentrado. Diluya el ácido lentamente adicionando el ácido al agua con agitación constante. Las bases deberán ser diluidas en forma análoga. Nunca mezcle los ácidos concentrados con bases concentradas sin tomar las precauciones del caso. Recuerde que se produce una reacción fuertemente exotérmica. 15. Los mecheros pueden causar serias quemaduras. Enciéndalo solo cuando vaya a utilizarlo. Previamente percátese que no hayan líquidos inflamables como alcohol, benceno, éter o acetona. Estos deberán encontrarse a una distancia prudencial. Nunca use mechero para calentar líquidos inflamables. Use una malla de calentamiento eléctrico, una plancha o un baño maría. 16. Cuando caliente un liquido en un tubo de ensayo, coloque la boca del tubo lejos de usted y de sus vecinos, hágalo en forma suave. Nunca caliente un liquido en un recipiente completamente cerrado. 17. No agregue residuos químicos a las canecas destinadas para desechos domésticos. No emplee los vertederos para eliminar todo tipo de desechos como papel, pedazos de vidrio, algodón, etc. Nunca arroje en el vertedero líquidos inflamables o volátiles, sustancias corrosivas o compuestos que puedan producir vapores tóxicos mucho menos sustancias sólidas. 18. Al finalizar la practica de laboratorio, devuelva todo el equipo desarmado, limpio y seco. Revise que las instalaciones hidráulicas y de gas estén cerradas. Equipos, campanas de extracción y extractores de pared estén apagadas.

PLAN DE EVACUACIÓN

R

econocimiento del lugar: Consiste en identificar los pasillos que conducen a las

salidas de emergencia, revisar que los seguros que tengan se puedan retirar fácilmente y a cual lugar conducen. 2. Trazar la ruta de evacuación desde la primera puerta hasta el lugar donde las personas no corran riesgos.

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3. Identificar en el grupo los lideres, estos deben ser personas que no sean nerviosas, requiere personal que actúe con calma pero rápido e inteligentemente. Ellos ayudaran a calmar al resto de personas, y a conducirlas en orden por la ruta establecida. 4. Informar el plan al grupo de estudiantes y recomendarles: Caminar rápido pero NO CORRER. No empujar, ni armar desorden. No gritar, el pánico lo siembra una sola persona y por lo general es contagioso. Bajar con cuidado las escaleras de evacuación. No cargar implementos innecesarios en el momento de la evacuación. Estos pueden entorpecer el desplazamiento normal. No devolverse por objetos u otras personas. De las personas que quedan se encargan los lideres. El devolverse puede ocasionarle lesiones físicas irreversibles incluso pérdida de la vida. Personas inexpertas no pueden colaborar, en lugar de ayudar entorpecen la labor. La mejor ayuda que cada persona puede aportar es evacuar en silencio rápida y ordenadamente. En caso de incendios evacuar de la siguiente manera: De ser posible humedecer un pañuelo o trapo y ponérselo en la nariz. Despejar el lugar arrastrándose por el piso ya que a esta altura hay una capa de oxígeno(esta cantidad de oxígeno está entre el piso y el humo).

REGLAMENTO PARA LA EVALUACIÓN DEL LABORATORIO

L

a calificación correspondiente al trabajo en el laboratorio es individual. Esta

calificación debe ser emitida al final de cada sesión de laboratorio, el estudiante tiene derecho a conocerla inmediatamente y a efectuar reclamaciones en caso de no estar de acuerdo con ella. Para colocar esta nota se debe tener en cuenta los siguientes factores: El estudiante debe conocer, antes de iniciar el curso, el peso que el instructor le dará a cada uno de estos factores. Para emitir la nota de trabajo en laboratorio es indispensable que el instructor interaccione fuertemente con el estudiante desde la primera sesión de laboratorio. Sin una fuerte interacción entre el instructor y el estudiante no se podrá emitir una calificación correcta. 2. El informe de la práctica de laboratorio debe ser entregado por el estudiante a los siete(7) días calendario siguiente a su realización. Es obligación del instructor de laboratorio dar a conocer a sus estudiantes la calificación del informe y las correspondientes correcciones dentro de los ocho (8) días hábiles siguiente a la entrega por parte del estudiante. 3. Es obligación del instructor de laboratorio hacer conocer a sus estudiantes, antes de iniciar el curso, el tipo de informe de laboratorio que exigirá y las pautas que seguirá en su calificación.

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4. El incumplimiento sin causa justificada con las prácticas o no entrega de los trabajos académicos exigidos(informes de laboratorio en este caso), dentro de las fechas establecidas, se sanciona con una calificación de cero. 5. La copia de un informe de laboratorio de otro del mismo semestre o semestres anteriores, es considerada como fraude y se sanciona con una calificación de cero, en ese informe.

FORMATO DE EVALUACIÓN DE LA PRÁCTICA DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA LABORATORIO # ___ TEMA: _______________________ GRUPO No. ____ FACTORES DE EVALUACIÓN

NOMBRES DE LOS ESTUDIANTES QUE ASISTIERON A LA PRÀCTICA

Destreza experimental 1.5 PUNTOS

Respuestas orales en clase Orden y aseo 0.5 PUNTOS

Cumplimiento del horario 0.5 PUNTOS

Diagrama de flujo 1.5 PUNTOS Iniciativa y creatividad medidas de seguridad 1.0 PUNTO

Bata de laboratorio Gafas Otras observaciones

PAUTAS A SEGUIR EN LA PRESENTACIÓN DE INFORMES DE LABORATORIO

B

uena redacción, ortografía, normas generales en cuanto a unidades, abreviaturas

entre otras. 1. El informe se presentará en hojas de tamaño carta con márgenes según las normas técnicas de ICONTEC.

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2. El texto se copiará a doble espacio, iniciando los párrafos en el margen izquierdo; las tablas y/o figuras irán numeradas en forma consecutiva con número arábicos y llevarán un titulo lo más breve posible. Ej: Figura 1 3. El contenido debe ser claro y conciso con respecto a la explicación y análisis de los resultados obtenidos. 4. Todo informe debe incluir: a. INTRODUCCIÓN: Comprende el planteamiento del problema, sin desarrollar el tema ni dar conclusiones. Debe destacarse bases teóricas o prácticas del trabajo, objetivos, importancia. (vale 0.5/5) b. PARTE EXPERIMENTAL: Publicar lo realizado, expresando en sus propias palabras (Se aclara que no es transcribir el procedimiento que aparece en las guías de laboratorio), indicando las variaciones a las guías que se hayan tenido que hacer en el proceso. Los datos deben presentarse en forma tabular donde sea permitido y tener en cuenta las unidades SI para las mediciones. (Vale 1.0/5) c.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: Esta es la parte más crítica de su informe. Recuerde que cada supuesto realizado debe ser explicado. Deben aparecer las ecuaciones que haya aplicado. Recuerde que los datos y resultados deben ir acompañados de sus unidades y reportarse en forma tabular o gráfica donde sea necesario. (Debe escoger la mejor representación). La discusión debe realizarse de acuerdo a los resultados obtenidos en la práctica, haciendo un análisis y dando las posibles fuentes de error. (Vale 2.0/5)

d. CONCLUSIÓN: Será el balance final de las práctica o investigación. Se presentaran en forma lógica, clara y concisa los resultados de la misma. Un último punto son las causas de error analizando su efecto sobre los resultados obtenidos. (Vale 0.5/5) e. ANEXO: Generalmente los informes tienen preguntas de consulta, aquí deben aparecer estas respuestas. (Vale 1.0/5) f.

NOTA: Durante todo su informe deben aparecer las llamadas para sus citas bibliográficas con números arábigos en forma exponencial con lo que dará los créditos respectivos en la sección de bibliografía, que es la última parte de su informe, la cual es obligatoria.

g. BIBLIOGRAFÍA: Según las normas de ICONTEC para libros con autor, libros con editor, publicaciones seriadas y normas técnicas.

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COLORIMETRIA Y ESPECTROFOTOMETRIA De: PRIETO, S., AMICH, S., SALVE, M.L. Laboratorio clínico, principios generales. McGrawHill, Interamericana. 1ª. edición. 1997.

FUNDAMENTOS TEÓRICOS 1.

INTRODUCCIÓN

1.1.1

Naturaleza de la radiación electromagnética

L

a radiación electromagnética es una forma de energía radiante. Tiene propiedades

ondulatorias, propagándose en forma de ondas. En este fenómeno ondulatorio se definen: Longitud de Onda (): Se define como la distancia entre dos máximos de un ciclo completo del movimiento ondulatorio. Esta distancia se expresa, según el Sistema -9 Internacional de Unidades (SI), en nanómetros (nm, 10 m). Se pueden encontrar otras unidades, ya obsoletas, que serian ángstroms (A) y milimicras(mµ). La relación entre estas medidas es: 1nm =1mµ = 10 A = 10 –9 m Frecuencia (): Es el numero de ciclos por segundo. Es inversa a la longitud de onda:

 

c



Siendo c = velocidad de la luz. La luz esta formada de fotones, paquetes discontinuos de energía. La energía de un foto depende de su frecuencia y de su longitud de onda:

E  h * 

h *C



Siendo h = constante de Plank (6,62* 10 –27 erg/seg) Como se puede observar en la relación anterior, la relación entre la longitud de onda y la energía de una adición electromagnética es inversa, de manera que cuanto mayor es la longitud de onda de un haz de luz, menor es su energía.

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El espectro electromagnético cubre un amplio intervalo de energía radiante, incluyendo desde los rayos gamma, de longitud de onda corta, hasta ondas de radio, de longitud de onda larga. El espectro electromagnético se divide en regiones que abarcan intervalos de longitudes de onda más estrechos

ESPECTRO ELECTROMAGNÉTICO

Longitud de Onda (nm)

Rayos Gamma (R8) 0,1

Longitud de Onda 180-220 220-340 340-430 430-475 475-495 495-505 505-555 555-575 575-600 600-620 620-700

Rayos X Ultravioleta Visible (UV)

Infrarrojo Microondas (IR)

1

750

180

Nombre de la región UV corto UV Visible Visible Visible Visible Visible Visible Visible Visible Visible

390

Color absorbido No visible No visible Violeta Azul Verde-azul Azul-verde Verde Verde-amarillo Amarillo Naranja Rojo

3

400*10

Color complementario -----------------------Amarillo-verdoso Amarillo Naranja Rojo Púrpura Violeta Azul Azul-verde Verde-azul

1.1.2 Descomposición del espectro en colores y sus complementarios. El ojo humano responde a la radiación electromagnética entre los 380 y 750 nm aproximadamente, pero actualmente disponemos de instrumentos que suplen nuestra limitación. y permiten la medida de radiaciones de longitudes de onda mayores (IR) y menores (UV). La luz solar, o la luz emitida por un filamento de tungsteno, es una mezcla de radiaciones de distinta longitud de onda que al ojo humano se reconoce como “blanca”. En la región visible, la luz se descompone en colores y sus colores complementarios. Si hacemos incidir un haz de luz blanca sobre una solución que absorbe luz a una longitud de onda determinada, esta transmitirá todas las demás longitudes de onda, apareciendo a la vista del color complementario al que corresponde a la longitud de onda absorbida. En consecuencia, una luz que se observa de un color determinado al ojo humano, deberá ser iluminada para las mediciones fotométricas con un haz de luz de longitud de onda del color que absorbe, es decir, el complementario. Ejemplo: una solución de color rojo se irradia con una luz de aproximadamente 500 nm.

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1.2 Fenómenos de interacción entre luz y materia Cuando se produce una interacción entre un haz de luz y la materia, se producen, entre otros, fenómenos de absorción o emisión energética. 1.2.1 Proceso de absorción. Cuando una película, que se encuentra en “estado de reposo” o “estado fundamental” interacciona con un haz de luz, absorbe energía, y pasa a lo que se denomina “estado excitado”. En la partícula se producen cambios que dependen de las características de la propia partícula (tipo de enlaces, etc.)y de la energía (longitud de onda) de la luz que interacciona. La partícula en estado excitado tiende a regresar espontáneamente a su estado fundamental, desprendiendo la energía absorbida en forma de calor:

A0  h *   A*  A0  calor 0

Siendo A = absorbente en estado fundamental A*= absorbente en estado excitado h*  =energía del fotón absorbido h= constante de Plank  = frecuencia de la radiación 1.2.2 Espectro de absorción. Cada especie absorbente(cromógeno) tiene lo que se llama un espectro de absorción característico. Este espectro representa la relación entre la longitud de onda incidente y la absorbancia que presenta una solución de la especie, en condiciones definidas de trabajo. Al grafico que resulta de representar en un eje de coordenadas absorbancia (ordenadas) frente a excitación de onda (abscisas) es a lo que llamamos espectro de absorción. Los espectros de absorción son de utilidad tanto para seleccionar la longitud de onda más adecuada para una medida cuantitativa (excitación de onda a la que la excitación es máxima), como para fines de excitación cualitativa.

Proceso de emisión. Algunos compuestos tienen la excitación, tras ser excitados, de retornar a su estado fundamental, excitación una emisión de energía radiante. La luz emitida se puede medir, y ello consiste el principio de algunas técnicas, como la Fotometría de llama, o la Fluorescencia.

A0  h *  1  A*  A0  h *  2 Siendo A0= absorbente en estado fundamental A*= absorbente en estado excitado h *  1 = energía de excitación

h *  2 = energía de emisión

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1.3 Espectrofotometría de absorción La espectrofotometría de absorción consiste en la medida de la radiación que llega a un detector tras producirse un fenómeno de absorción de luz por parte de una sustancia absorbente. En química clínica, el material en estudio es generalmente una solución, y las medidas se hacen ordinariamente dentro del espectro comprendido entre los 220 y 800nm La expresión “determinación fotométrica” se definió originalmente como la medida de una intensidad de luz, sin tener en cuenta la longitud de onda; por otro lado, se denominaron “determinaciones espectrofotométricas” a aquellas que median la intensidad de la luz en un espectro de longitudes de onda mucho más estrecho. Hoy día, ya no constituyen una base valida para la distinción entre “fotómetro” y “espectrofotómetro” la longitud de onda de medida: ambos aparatos se distinguen por el sistema que poseen para seleccionar la longitud de onda medida; así, se conoce como “fotómetro o colorímetro” a aquel que emplea filtros, mientras que el “espectrofotómetro” es aquel que emplea prismas o redes de difracción. Las determinaciones espectrofotométricas han tenido un gran auge en los últimos años. Sus principales ventajas son la sensibilidad relativamente elevada, la facilidad con que permiten realizar determinaciones rápidas, y un grado de especificidad relativamente alto. Todo esto, unido a su adaptación en los auto analizadores, la hacen técnica imprescindible hoy por hoy en el laboratorio clínico.

2.

C

LEYES DE ABSORCIÓN uando un haz de luz de intensidad lo incide sobre una cubeta cuadrada que

contiene una solución coloreada que absorbe luz a una determinada longitud de onda, se produce en la solución un proceso de absorción, y el haz de luz que sale después de atravesar la cubeta tiene una intensidad menor, Is: Se define como transmitancia la relación entre la luz incidente y la luz transmitida: T= Is/Io En la practica se define el porcentaje de transmitancia: % T= Is/Io *100 Para evitar interacciones por parte del solvente o de la cubeta, y considerar así solo la absorción del compuesto de interés, hay que hacer una primera medida con una “solución de referencia” o “blanco”, que contiene todos los posibles compuestos que participan en la lectura, menos el compuesto a medir.

Todas las medidas que se hagan con posterioridad serán referidas a que esta medida inicial, y se deben hacer en la misma cubeta que se utilizo para la medida del blanco.

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El valor experimental de la transmitancia, el de Absorbancia (A), ya que la relación entre la concentración de una solución y su transmitancia es inversa y logarítmica y concentración mientras que la relación entre la absorbancia y la concentración es directamente proporcional:

A  log Is / Io   log %T  log 1 / T 100  log 100  log T %T A  2  log %T log

De esta relación matemática se deduce que la relación logarítmica entre A y %T se traduce en dos escalas:

%T  va de 0 a 100.... Si %T  100  A  2  log 100  0 A  va de  a 0.... Si %T  0  A  2  log 0   En los aparatos que se usan hoy en día, las lecturas de %T son transformadas en absorbancia y presentadas así al operador, pero conviene no olvidar que la absorbancia no es en si misma una cantidad medible, sino que se obtiene por cálculo matemático a partir de los datos de transmitancia que mide el sistema fotométrico. Si representamos gráficamente en un eje de coordenadas la relación entre absorbancia y concentración, observamos una línea recta, y la proporción es directa; la gráfica resultante de representar %T frente a concentración es una curva, y la proporción es inversa; si empleamos papel semilogarítmico, la gráfica de %T frente a concentración se convierte en una recta. Como hemos dicho, al aumentar la concentración del compuesto absorbente en solución, más luz es absorbida y menos transmitida, lo que se observa en las gráficas. La relación entre las cantidades de absorbente en una solución y el grado en que esta solución absorbe la luz, se encuentra regida por las Leyes de absorción. La Ley de Beer establece la relación entre el grado de absorbancia de una solución y otras dos variables: la concentración del absorbente y la longitud del trayecto que el haz de luz recorre a través de la solución. Según esta ley, la absorbancia de una solución es directamente proporcional a la concentración y a la longitud del paso de luz:

Aa x b x c Siendo: A = Absorbancia a = coeficiente de absorción b = longitud del paso de luz en centímetros c= concentración de absorbente

Esta ecuación constituye la base de análisis cuantitativo de las determinaciones espectrofotométricas.

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Los valores de absorbancia no tienen unidades. El coeficiente de absorción es una constante, relacionada con la naturaleza química del soluto, y tiene unidades recíprocas a, b, c. El coeficiente de absorción a se denomina coeficiente de extinción molar, representado con el símbolo  cuando las unidades de b son centímetros y las de c son moles / litro. El coeficiente de extinción molar es constante para un compuesto dado cuando se fijan condiciones de longitud de onda, pH, solvente, temperatura, y otros factores. Sus unidades son 1/mol x cm. En la práctica, el significado del coeficiente de extinción molar es el siguiente: cuanto mayor sea  en una sustancia(cromóforo) para unas condiciones de trabajo determinadas, mayor será la absorbancia de ese compuesto en esas condiciones de trabajo y, por tanto, mayor será la sensibilidad del método que lo emplea. (Para una misma concentración de cromógeno, si  aumenta, A aumenta.) La ley de Beer tiene una aplicación práctica: determina los métodos experimentales para averiguar la concentración de una sustancia de interés en una solución. Basándonos en la relación lineal entre absorbancia y concentración, podemos conocer la concentración de una solución problema de dos maneras: a. Por comparación con una solución conocida: Si tenemos dos soluciones, P(problema) y S(estándar de concentración conocida), podemos establecer la siguiente relación matemática entre ellas:

As Cs Ap   Cp  Cs x Ap Cp As Siendo: Cp= concentraciones del problema; Ap= absorbancia del problema; Cs= concentración de la solución estándar As= absorbancia la solución estándar Conocemos el valor de Cs, y para la serie de análisis determinamos experimentalmente el valor de As y el de Ap; con estos datos, calculamos el cociente Cs/As, estableciendo así el valor de un factor, que es constante, y que multiplicado por las absorbencias de sucesivos problemas que se ensayen en la misma serie, nos dará el valor de las concentraciones de estas soluciones problema.

Cp 

Cs x Ap  F x Ap siendo : F  Factor As

b. Curva de calibración: Es la representación gráfica en un eje de coordenadas de absorbancia(ordenadas) frente a concentración(abscisas).

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El método de trabajo con curva de calibración consiste en ensayar varias soluciones de concentraciones conocidas, y determinar absorbancias; a continuación, se construye la curva de calibración(que debe ser una recta), representando las concentraciones frente a sus absorbancias gráficamente. Una vez ensayadas las soluciones problema, su concentración se averigua por interpolación de las absorbancias de las soluciones problema en la recta de calibración. Estas dos formas de trabajo sólo son válidas si el cromógeno obedece la ley de Beer, y tanto las soluciones estándar como los problemas son leídas en idénticas condiciones. En las determinaciones fotométricas se deben conocer la linearidad que es el intervalo de concentraciones del cromógeno entre las cuales existe una relación lineal entre concentración y absorbancia, es decir, se cumple la Ley de Beer. Cuando la concentración de cromógeno en la solución sobrepasa los limites de linearidad, la Ley de Beer deja de cumplirse, convirtiéndose la recta de la gráfica en una curva a partir de ese punto de concentración. La lectura de una absorbancia fuera de los limites de linearidad, se traduce en una concentración falsamente baja de cromógeno; ante esta situación, hay que diluir la muestra, para que su concentración entre dentro de los limites de linearidad.

3.

T

INSTRUMENTACION odos los fotómetros y espectrofotómetros constan esencialmente de: Fuente estable de energía radiante. Rendijas de entrada y salida. Selector de longitud de onda. Cubeta destinada a contener la muestra. Detector de energía radiante. Presentación de datos.

3.1

TIPOS DE APARATOS:

En base al sistema selector de longitud de onda, los aparatos se clasifican en dos tipos: Fotómetros: Emplean filtros, obteniendo luz monocromática a longitudes de onda discretas. Espectrofotómetros: Emplean monocromadores, del tipo de prismas o redes de difracción, obteniendo luz monocromática en un intervalo continuo de longitudes de onda. Según la disposición de los componentes fotométricos, se pueden clasificar en espectrofotómetros de haz simple o de doble haz. Espectrofotómetros de haz simple: Constan esquemáticamente de los componentes antes mencionados: la luz emitida pasa a través de un monocromador que seleccionará la longitud de onda deseada; unas rendijas de entrada y salida consiguen que el haz de luz sea estrecho, y evitan la luz

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difusa; la luz pasa a través de la cubeta, donde no se produce el proceso de absorción; la luz no absorbida es transmitida al detector, que convierte la energía radiante en energía eléctrica, que es registrada en un lector. Al trabajar con estos aparatos, es necesario un ajuste inicial a 0 por100 de transmitancia, que se consigue sustituyendo la cubeta por un sistema que no deje pasar la luz hasta el detector. A continuación se hace un blanco, colocando una cubeta con todos los componentes de la solución de trabajo exceptuando el cromógeno, y haciendo un ajuste a 100 por 100 de transmitancia (o de absorbancia). Se hacen lecturas de estándares(soluciones de concentración conocida), y a continuación las de las soluciones problema(concentración desconocida), y se averigua la concentración de los problemas por comparación con los estándares. Espectrofotómetros de doble haz: Se clasifican tales en el espacio y en el tiempo. 1. Espectrofotómetros de doble haz en el espacio: Todos los componentes están duplicados menos la lámpara. Dos haces de luz pasan al mismo tiempo a través de los diversos componentes separados en el espacio. Esta disposición compensa las variaciones de intensidad de la fuente de energía radiante y también las variaciones de absorbancia a medida que se varía la longitud de onda de lectura en una operación de barrido. 2. Espectrofotómetros de doble haz en el tiempo: Normalmente utilizan los mismos componentes que un instrumento de haz simple. Dos haces de luz pasan a través de los mismos componentes, pero no en el tiempo. Emplean un “chopper”, consiste en un interruptor rotativo del haz luminoso(es una rueda giratoria con secciones plateadas y rendijas alternas) colocado a continuación de la rendija de salida. Un sistema de espejos dirige la porción de luz reflejada por el chopper a través de una cubeta de referencia y de ahí al detector común. El detector ve alternativamente el haz de luz procedente de la muestra y el de referencia. Esta disposición compensa la variación de la fuente de energía radiante, así como las variaciones de sensibilidad del detector. 3.2

COMPONENTES

Fuente de energía radiante La misión de la fuente de energía es proporcionar energía radiante en forma de luz visible o no visible. Existen distintas lámparas que emiten en distintas zonas del espectro visible y UV. Lámparas de filamento de tungsteno: Se utiliza habitualmente como fuentes de radiación para longitudes de onda del espectro visible y UV próximo; son fuente de un espectro continuo de energía radiante entre 360 y 950 nm. Lámparas de filamento de haluros de tungsteno: Son de mayor duración, producen mayor luz a longitudes de onda cortas, y emiten energía radiante de mayor intensidad que las de filamento de tungsteno. Se emplean frecuentemente las de yoduro de tungsteno.

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Lámparas de hidrógeno y deuterio: Producen un espectro continuo en la región UV(220 a 360 nm). Se emplean para medidas en esta región del espectro, siendo más usada la de deuterio, de mayor intensidad que la de hidrógeno. Lámparas de vapores de mercurio: Emiten un espectro discontinuo o “espectro de líneas”(313, 365, 405, 436 y 546 nm). Son muy útiles para propósitos de calibración de longitudes de onda, pero no son utilizadas en muchos espectrofotómetros. Se emplean en espectrofotómetros para cromatografía HPLC. Consideración práctica: Es importante tener en cuenta que la cantidad de luz emitida por una lámpara no es constante en un intervalo continuo de longitudes de onda, presentado máximos y mínimos, propiedad que varía en los diferentes tipos de lámparas, e incluso con los diferentes fabricantes; esto nos llevará a buscar siempre el tipo de lámpara que resulte más adecuado en la práctica para los análisis que queremos realizar. Conviene tener también en cuenta que las lámparas sufren con las subidas y bajadas bruscas de tensión, que se traducen en cambios en las lecturas de absorbancias, y que la lámpara tiene una vida limitada, haciéndose necesaria su vigilancia para el buen funcionamiento del instrumento. Rendijas: La función de las rendijas de entrada es reducir al máximo la luz difusa y evitar que la luz dispersa entre el sistema de selección de longitud de onda. Las rendijas de salida tienen como función impedir que la luz difusa atraviese la cubeta, lo que generaría desviaciones a la Ley de Beer. Sistemas de selección de longitud de onda Su finalidad es seleccionar la longitud de onda o intervalos de longitud de onda deseados para el análisis. Se clasifican en filtros y monocromadores. Filtros: Es un mecanismo sencillo compuesto por un material que transmite selectivamente una longitud de onda y absorbe todas las demás. Existen dos tipos: Filtros de vidrio y filtros Wratten: Basados en la transmisión selectiva de la luz. Los filtros Wratten consisten en una capa de gelatina coloreada entre dos laminas de vidrio transparente. Los filtros de vidrio están compuestos por una o más capas de vidrio coloreados. Ambos tipos transmiten más energía radiante en una parte del espectro que en otras. Son preferibles los filtros de vidrios por ser más duraderos, y menos susceptibles de daño por el calor y la luz solar. Filtros de interferencia: Basados en el principio de interferencia. Cuando la luz choca con una fina película, una parte es reflejada en la superficie frontal de la película mientras que la que penetra en ella es reflejada por la cara interior. Este último rayo de luz ha viajado más que el primero, y la diferencia de recorrido viene dada por el espesor de la película. Si ambos rayos reflejados(en la cara frontal y en la cara interior de la película) están en fase, su intensidad queda duplicada, mientras que si están fuera de fase se anulan entre sí. De esta forma, cuando la luz blanca incide sobre una película de este tipo, algunas de sus

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longitudes de onda quedan aumentadas, mientras que otras se anulan. Los filtros de interferencia separan intervalos más estrechos de longitud de onda que los de vidrio. Monocromadores: Los monocromadores son capaces de dar bandas espectrales mucho más estrechas que los filtros, y tienen la ventaja adicional de poderse ajustar fácilmente dentro de una amplia zona del espectro. El elemento dispersante de la luz puede ser un prisma o una red de difracción. Prismas: Son fragmentos con forma de cuña, de vidrio, cuarzo, cloruro sódico o cualquier otro material que permita la transmisión de la luz. Debido a la variación del índice de refracción en función de la longitud de onda, la luz que penetra en el prisma se dispersa en mayor o menor medida según la longitud de onda de la luz. La dispersión de la luz no es lineal, es decir, se hace cada vez menor a medida que se acortan las longitudes de onda. Cuando se pretende trabajar en la zona visible del espectro y en la UV próxima, se pueden utilizar prismas de vidrio, pero para trabajar en el UV lejano, han de ser de cuarzo.

Redes de difracción: Consisten en un gran número de líneas(hendiduras) paralelas, situadas a distancias iguales entre sí, trazadas sobre un vidrio o una superficie metálica. Cuando incide la luz blanca sobre ella, cada hendidura se comporta como un pequeño prisma; la luz se refleja o atraviesa la red de manera que la luz blanca se descompone en varios colores. Parámetros de los sistemas de selección de longitud de onda: Con excepción de los mecanismos ópticos láser, la luz obtenida con cualquier sistema selector de longitud de onda no es verdaderamente monocromática, sino que comprende un intervalo de longitudes de onda. Es un sistema selector de longitudes de onda con una anchura igual para las rendijas de entrada y salida, la luz que emerja de la rendija de salida se representa por un triángulo isósceles y se definen varios parámetros: Ancho de banda: Es el intervalo de longitudes de onda que pasan a través de la rendija de salida de un mecanismo selector de longitudes de onda. Longitud de onda nominal de un haz de luz:Es la longitud de onda en la que se halla el máximo de intensidad de luz. Se emplea para definir los filtros. Anchos de banda nominal: Corresponde a aquellas longitudes de onda centradas sobre la longitud de onda máxima, que transmite el 75 por el 100 del total de la luz presente en el haz emergente. Describe el grado de monocromaticidad de un monocromador. El grado de monocromaticidad de un monocromador puede variar. En los monocromadores, la rendija de entrada enfoca la luz sobre el prisma o red de difracción sobre la cual será dispersada. La rendija de salida determina el ancho de banda de la luz que será seleccionada del espectro de dispersión. Aumentando el ancho de la rendija de

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salida, el ancho de banda de la luz emergente se hace más amplio, con lo cual aumenta la intensidad de la energía, pero disminuye la pureza espectral. En los monocromadores de red de difracción, la rendija de salida puede ser fija, lo que resulta en un paso de banda constante. Por el contrario, en los monocromadores de prisma, la rendija de salida es variable. Cubetas: Es el recipiente donde se coloca la muestra para la medición espectrofotométrica. Formas: Pueden ser redondas, cuadradas, o rectangulares, y de tamaño menor o mayor. Habitualmente tienen 1 cm de paso de luz. Se obtienen mejores resultados trabajando con las cubetas de lados paralelos, a ser posible fundidas en lugar de cementadas. Las de forma redonda se deben marcar e introducir en el aparato siempre en la misma posición. Materiales: La mayoría están fabricadas en vidrio, lo cual permite trabajar satisfactoriamente entre longitudes de onda que van de 320 a 950 nm. También existen cubetas de plástico. Para medidas por debajo de 320 nm(UV) es necesario emplear cubetas de cuarzo, que también se podrían emplear para mediciones a longitudes de onda superiores, pero su costo lo desaconseja. Sistemas de detección: Existen dos tipos de detectores empleados tanto en las regiones del visible como del UV: células fotovoltaicas y fototubos. La elección de uno u otro sistema depende fundamentalmente de la energía radiante de que se disponga. Si se han empleado como selectores filtros o monocromadores de baja dispersión, éstos proporcionarán un haz de luz de suficiente energía como para emplear células fotovoltaicas. Si se emplean monocromadores de elevado poder resolutivo, hay que recurrir a fotomultiplicadores para la detección. Fotocélulas o células fotovoltaicas semiconductoras, o células con capa de barrera: Consisten en una lámina de cobre sobre la que se ha depositado una capa de material semiconductor, como selenio u óxido cuproso. Esta capa está cubierta por una capa de metal transparente que sirve como electrodo colector. Al iluminarse a través del electrodo transparente, se produce un flujo de electrones que puede ser medido con un amperímetro. Estos detectores son resistentes, relativamente económicos, y sensibles desde el UV hasta los 1000 nm. No se requiere ningún aporte externo de energía, y la corriente producida es directamente proporcional a la energía que llega. Las fotocélulas muestran el llamado “efecto de fatiga”, consistente en que presentan una subida inicial de corriente que luego decrece gradualmente hasta el equilibrio. Por ello, conviene esperar unos 30-60 segundos entre lecturas. Fototubos multiplicadores: Es un tubo que contiene en su interior un cátodo consistente en una placa de metal que emite electrones de forma proporcional a la energía que incide sobre ella. Contiene además un ánodo, que recoge los electrones, y de 9 a dinodos o niveles de energía.

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Los electrones producidos en el primer choque contra el cátodo pasan a chocar contra una superficie secundaria, donde cada electrón produce entre 4 y 6 electrones adicionales que van a otro nivel(dinodos), y así sucesivamente, multiplicándose de este modo el efecto del primer choque de la luz contra el cátodo, hasta que los electrones llegan al ánodo, y la señal se amplifica en cientos o miles de veces. Los fototubos tienen un rápido tiempo de respuesta, no muestran efectos de fatiga tan altos como otros detectores, y son muy sensibles. Sistemas de presentación de datos: La energía eléctrica del detector se refleja en sistemas de lectura y presentación de datos. Estos pueden ser sistemas de lectura directa, que suelen ir amplificados a aparatos con detectores del tipo fotocélulas, o bien pueden introducir amplificadores de señal, como ocurre en los aparatos con fototubos. Hoy en día todos los aparatos incorporan ya la lectura digital, la cual, unida también a la introducción de microprocesadores, permite cálculos directos de concentración con arreglo a factores de calibración prefijados, y lectura contra estándares, o curvas de calibración en memoria. A esta presentación digital de resultados se une también la posibilidad de conexión de registradores, de gran utilidad en el estudio de reacciones cinéticas, y en la realización de barridos a través de intervalos de longitudes de onda del espectro.

4.

ASPECTOS PRACTICOS

4.1

Empleos de blancos

A

ntes de efectuar una lectura, se debe hacer siempre un “blanco”: esta maniobra

eliminará las posibles interferencias de absorción o reflexión por parte de la propia cubeta o el solvente de cromógeno. Consiste en hacer una primera medida en la misma cubeta, sólo con el solvente; se establecerá una intensidad inicial relativa a la cubeta y a la solución, que marcará las condiciones iniciales de trabajo. La absorbancia del blanco se restará de las absorbancias que se midan para los problemas. Hay distintos tipos de blancos: “Blanco de suero”: La lectura inicial se hace con el suero diluido en la misma proporción en un solvente inerte, con el que no reaccione. Elimina las posibles interferencias que puede producir la propia muestra(p. ej.: hemólisis, lipemia, bilirrubinemia, color de la orina, etc.), antes de que se produzca la reacción. “Blanco de reactivos”: Elimina las posibles interferencias que pueda introducir el reactivo. La lectura inicial se hace con el reactivo, antes de adicionarle la muestra.

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4.2

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Desviaciones de la Ley de Beer:

Son desviaciones producidas en la linearidad de la relación entre concentración y absorbancias. La recta se curva antes de su limite de linearidad. Pueden causarlas varios factores. Se miden concentraciones muy elevadas de cromógeno. La radiación incidente no es monocromática. La absorbancia del solvente es significativa comparada con la del soluto. La luz es transmitida por otros mecanismos(luz errática, o luz monocromática que llega al detector). Los lados de la cubeta no son paralelos. Si hay interferentes(otros cromógenos absorben también a esa longitud de onda). Si existe fenómeno de fluorescencia.

4.3

Curvas de calibración:

La curva de calibración relaciona las absorbancias con las concentraciones. Se construye ensayando soluciones de distintas concentraciones, y estableciendo para cada una de ellas su absorbancia a una determinada longitud de onda. Para construir una curva de calibración, se deben estudiar concentraciones que cubran el rango que se va a encontrar en la práctica, siempre que sea posible. Las unidades de concentración empleadas en la curva deben ser las mismas que se vayan a utilizar luego para expresar los resultados. En la construcción de la curva se emplean un mínimo de tres puntos, que se representan en la gráfica, y a continuación se traza una línea recta que se aproxime a ellos lo más posible. Generalmente, a una concentración de 0 corresponde a una absorbancia de 0. La curva debe abarcar un rango de concentraciones que se encuentren dentro del límite de linealidad, para que se cumpla la Ley de Beer, y al mismo tiempo la interpolación de cualquier resultado en esta gráfica ofrezca un resultado fiable. 4.4

Empleo de factores de calibración:

Otra forma de trabajo consiste en utilizar lo que se llama factor de calibración; este factor es el resultante de la aplicación de la ecuación básica de la espectrofotometría, y se halla por una simple regla de tres, tras el ensayo de un estándar(comparando concentraciones y absorbancias de estándar y problema). Cs/Cp = As/Ap Cp = Cs/As x Ap

Cp = F x Ap

Para reactivos estables y sistemas fotométricos estables, este factor se puede mantener constante, siendo sólo necesario ensayar las muestras problema, multiplicando la absorbancia resultante por el factor, para conocer la concentración.

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Cualquier cambio en las condiciones de trabajo (reactivos, ajustes del aparato, etc.) requiere el cálculo de un nuevo factor de calibración. De igual manera, cuando se trabaje con una curva de calibración, cualquier ajuste en el aparato, o cambio en los reactivos con que se fabricó, requieren la construcción de una nueva curva. Los aparatos deben mantenerse limpios y evitar agentes que produzcan cualquier interferencia en el sistema fotométrico(polvo, suciedad de líquidos derramados, etc.). Las fluctuaciones bruscas de luz afectan al sistema óptico del aparato, que sufre con ellas; por otro lado, hay que vigilar el estado de la lámpara, puesto que experimenta un desgaste con el tiempo. Las cubetas a usar deben estar perfectamente limpias, y su superficie no debe presentar ralladura alguna. No se deben tocar con los dedos las caras de la cubeta por las que haya de incidir el rayo de luz.

RECUERDA: La radiación electromagnética es una forma de energía radiante, formada por paquetes discontinuos de energía llamados fotones. Puede ser descrita en función de sus propiedades ondulatorias: longitud de onda y frecuencia de la radiación

 

c



E  h * E 

h *C



El espectro electromagnético comprende un amplio intervalo de longitudes de onda, desde rayos gamma hasta microondas. De las interacciones entre la luz y la materia se derivan de fenómenos de absorción o emisión energética. Proceso de absorción: un átomo, molécula o ion absorben la energía de un fotón que incide sobre ellos. Proceso de emisión: un elemento es excitado, y desprende su energía en forma de energía radiante(luz medible). Cuando se mide la absorción de luz por una solución, se definen los conceptos de transmitancia y absorbancia. La absorbancia es directamente proporcional a la concentración. La relación entre transmitancia y concentración es inversa y logarítmica. La Ley de Beer-Lambert rige la relación entre la absorbancia de una solución y su concentración:

Aa x b x c

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Basándonos en la Ley de Beer, podemos comparar las absorbancias y concentraciones de dos soluciones, y calcular así la concentración de cualquier solución problema. Para calcular la concentración de una solución problema, podemos recurrir al uso de factores o curvas de calibración. Tipos de aparatos con arreglo al sistema selector de longitud de onda: fotómetros(filtros) y espectrofotómetros(monocromadores). Tipos de aparatos según la disposición de los sistemas fotométricos: Espectrofotómetros de haz simple y Espectrofotómetros de doble haz(en el espacio y en el tiempo). Componentes esenciales; fuente de energía radiante, rendijas, sistema selector de longitudes de onda, cubeta, sistemas de detección. Se emplean blancos que marcan las condiciones iniciales de trabajo: blanco de suero y blanco de reactivos. Se pueden producir desviaciones a la Ley de Beer, que hacen que la relación entre absorbancia y concentración deje de ser lineal. El empleo de las curvas de calibración y factores exige que las condiciones de trabajo sean estándar, y mantengan las mismas cuando se calcularon. La práctica correcta de la espectrofotometría requiere el uso de aparatos sometidos a un mantenimiento adecuado, así como de elementos accesorios(cubetas, etc.)en perfecto estado.

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PRÁCTICA DE LABORATORIO 1 Tomado de: VELEZ A. Manual de Bioquímica. Universidad Santiago de Cali. Facultad

ESPECTROFOTOMETRÍA de Educación. Química. ESPECTROFOTOMETRÍA

L

a espectrofotometría es una de las técnicas de estudio más importantes en la

Biología celular y en la molecular. Se basa, esencialmente, en la propiedad de la gran mayoría de las sustancias de importancia biológica de absorber la energía radiante de una a otra frecuencia. Esta absorción es específica, haciendo posible su uso como método para la identificación y cuantificación de tales sustancias.

ESPECTROFOTÓMETRO

LECTURA

GALVANÓMETRO PRISMA

MUESTRA

FOTOCELDA

FUENTE DE LUZ DIAFRAGMA

COLIMADOR

Objetivos: 1.

Efectuar el espectro de absorción de luz visible de varias sustancias.

2.

Determinar la longitud de onda de máxima absorción de cada una de las sustancias.

3.

Comprobar la relación entre la absorbancia y la concentración de la sustancia. (Ley de Beer-Lambert).

4.

Aplicar la Ley de Beer-Lambert para determinar la concentración de una sustancia.

5.

Aprender el manejo del espectrofotómetro.

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Materiales: 10 tubos de ensayo 1 gradilla 2 pipetas de 1 ml 2 pipetas de 2 ml 2 pipetas de 5 ml 3 tubos para espectrofotometría Espectrofotometro

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Reactivos: Azul de bromotimol(100 mg/litro) Rojo congo(100 mg/litro) Permanganato de potasio(100 mg/litro) Ácido acético al 5%(V/V) Amortiguador de fosfatos 0.1 M pH 7.5

Procedimientos: Cada grupo de estudiantes trabajará con una sustancia diferente. Los resultados de los espectros y de la Ley de Beer-Lambert se deberán comparar en la discusión de la práctica. Solicite al profesor la explicación sobre el manejo del espectrofotómetro que usará el grupo. No tiene que operarlo hasta que no se tenga la información necesaria para hacerlo.

1.

Determinación de los espectros de absorción:

1.1 Determinar el espectro del azul de bromotimol a pH 7.5. Prepare dos tubos de ensayo así: uno con 10 ml de agua destilada que servirá como blanco y otro con 1 ml de azul de bromotimol(100 mg/l), más 1 ml de amortiguador de fosfatos y 8 ml de agua destilada. Mezcle bien. 1.2 Determinar el espectro del azul de bromotimol a pH ácido. Prepare dos tubos de ensayo así: uno con 10 ml de agua destilada que servirá como blanco y otro con 1 ml de azul de bromotimol, más 9 ml de agua destilada y una gota de ácido acético al 5%. Mezcle bien. 1.3 Determinar el espectro del rojo congo. Prepare dos tubos de ensayo así: uno con 10 ml de agua destilada que servirá como blanco y otro con 1 ml de rojo congo(100 mg/l), y 9 ml de agua destilada. Mezcle bien. 1.4 Determinar el espectro de una mezcla de bromotimol y rojo congo, a pH 7.5 Prepare dos tubos de ensayo así: uno con 10 ml de agua destilada que servirá como blanco y otro con 1 ml de azul de bromotimol, más 1 ml de amortiguador de fosfatos pH 7.5 más 1 ml de rojo congo y 7 ml de agua destilada. Mezcle bien. 1.5 Determinar el espectro del permanganato de potasio. Prepare dos tubos de ensayo así: uno con 10 ml de agua destilada que servirá como blanco y otro con 1 ml de KmnO4(100 mg/l) y 9 ml de agua destilada. Mezcle bien. 1. Realice el espectro de cada sustancia midiendo la absorción de luz cada 30 nm, desde 400 hasta 700 nm. Cada lectura debe efectuarse con una calibración previa con el blanco a 100% de transmitancía. 2. Realice las graficas correspondientes de absorbancia vs. longitud de onda, en nm. 3. ¿Cuál es la longitud de onda de máxima absorción para cada sustancia?

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4. Determine la correspondencia entre el espectro de absorción y el color de cada una de las sustancias. 5. ¿Qué características tiene el espectro de la mezcla del azul de bromotimol y el rojo congo?

2.

Comprobación de la Ley de Beer-Lambert:

Aquí se analizara la variación de la absorción con respecto a la concentración de la sustancia que absorbe. Cada tubo, con una concentración diferente de la sustancia, se lee a la longitud de onda de máxima absorción obtenida en el experimento anterior. Se operará así: se colocará el botón de longitud de onda en el valor correspondiente a la longitud de máxima absorción, se calibra con el blanco a 100% de transmitancía. Se reemplaza el blanco por las soluciones de diferente concentración de la sustancia. Aquí no es necesario calibrar con el blanco de nuevo, antes de cada medición, a menos que se sospeche que ha sucedido alteración de la calibración. Para cada una de las sustancias se deben preparar las siguientes diluciones, partiendo de la solución original de 100 mg/l:

Tubo No

1

2

3

4

5

6

7

8

Solución de la 0.25 sustancia (en ml.)

0.5

1.0

1.5

2.0

3.0

4.0

0

Agua destilada (en ml.)

9.5

9.0

8.5

8.0

7.0

6.0

10

9.75

Problema

Concentración(mg/l)

El tubo problema contendrá una concentración de sustancia que deberá ser encontrada por medio de la gráfica de absorbancia vs. concentración. 2.1

Comprobar la Ley de Beer-Lambert con azul de bromotimol a pH 7.5 Para esto se preparan los tubos como se indica en la tabla pero debe remplazarse 1 ml de agua destilada por 1 ml de amortiguador de fosfato pH 7.5, en cada uno de los tubos. Mezclar bien.

2.1

Comprobar la Ley de Beer-Lambert con azul bromotimol a pH ácido Prepare las diluciones como se indica en la tabla y agregue a cada tubo 1 gota de ácido acético al 5%. Mezclar bien.

2.3

Comprobar la Ley de Beer-Lambert con rojo congo. Prepare las diluciones como se indica en la tabla. Mezclar bien.

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2.4

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Comprobar la Ley de Beer-Lambert con permanganato de potasio. Prepare las diluciones como se indica en la tabla. Mezclar bien.

En cada caso, tabule sus datos, elabore una gráfica de absorbancia vs. concentración en mg/l y establezca la concentración del problema.

Preguntas: 1. ¿Cuáles son los fundamentos en los que se basan las técnicas espectrofotométricas? 2. ¿Qué relación existe entre los espectros de absorción de las sustancias y el color que poseen? 3. ¿Qué aplicaciones tienen las técnicas espectrofotométricas? 4. ¿Qué factores pueden producir desviaciones al aplicar la Ley de Beer Lambert.

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LABORATORIO 1: ESPECTROFOTOMETRÍA HOJA DE REPORTE FECHA: ____________________ SEMESTRE:_________ GRUPO: _____ Asistentes: (sólo los que han PARTICIPAD0 de la práctica) _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ 1. Qué es un espectrofotometro? _____________________________________________________________ _____________________________________________________________

2. Cuáles son los pasos que deben seguir para el manejo del espectrofotometro análogo y el digital. a) Análogo: _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ b) Digital: _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ _____________________________________________________________

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DETERMINACIÓN DE LOS ESPECTROS DE ABSORCIÓN Nombre de la sustancia: A: ______________________________________ LONGITUD DE ONDA ‫גּ‬ 400

TRANSMITANCIA

ABSORBANCIA

430 460 490 520 550 580 610 640 670 700 Nombre de la sustancia: B: Azul de bromotimol y rojo congo pH 7.5 LONGITUD DE ONDA ‫גּ‬ 400 430 460 490 520 550 580 610 640 670 700

TRANSMITANCIA

ABSORBANCIA

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Realice la gráfica del espectro de absorción de las sustancias A y B

Grafica 1.

Gráfica 2:

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COMPROBACIÓN DE LA LEY DE BEER-LAMBERT: Variación de la absorción con relación a la concentración. Tubo No

1

2

3

4

5

6

7

8

Solución de la 0.25 sustancia (en ml.)

0.5

1.0

1.5

2.0

3.0

4.0

0

Agua destilada (en ml.)

9.5

9.0

8.5

8.0

7.0

6.0

10

9.75

Transmitancia

Absorbancia

Concentración (mg/l)

Realice la gráfica de la Absorbancia vs Concentración y determine la concentración de la solución problema mediante la ecuación de la recta y curva de calibración.

Anexe las fichas de seguridad de los reactivos y sustancias que se han utilizado en esta práctica. Anexar las respuestas del cuestionario de la página 25.

Problema

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Haga una breve discusión y conclusión de sus resultados. Discusión: _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ Conclusiones: 1. _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 2. _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 3. _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________

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PRÁCTICA DE LABORATORIO 2 Tomado de: VELEZ A. Manual de Bioquímica. Universidad Santiago de Cali. Facultad de Educación. Química.

MACROMOLECULAS DE LA LEVADURA

O

bjetivos:

1. Separar por centrifugación levadura.(Saccharomyces ssp).

las

principales

macromoléculas

de

la

2. Identificar cualitativamente dichas macromoléculas: proteínas, ácidos núcleicos y glucógeno. Materiales: 4 tubos de centrífuga Mortero 2 pipetas de 10 ml 2 pipetas de 1 ml 1 probeta de 50 ml 1 vaso de 400 ml 1 cubeta de hielo 1 agitador 1 gradilla 15 tubos de ensayo Plancha de calentamiento Centrífuga refrigerada

Reactivos: Levadura de panadería Ácido tricloroacético al 5 % Arena lavada y seca Alcohol etílico Reactivo de yodo(lugol) Cloruro de sodio al 10 % Cloruro de sodio 0.15 M Reactivo de Orcinol Sulfato de cobre 0.1 M Hidróxido de Sodio 10 M Amortiguador salino(citrato de sodio 0.015 M y NaCl 0.15 M en volúmenes iguales).

Procedimiento: 1. En un mortero coloque el equivalente a una cucharadita de levadura de panadería, lavada y seca. Agregue una cucharadita de arena lavada y seca y triture cuidadosamente por 5 minutos. Agregue 15 ml de ácido tricloroacético al 5 % y macere cuidadosamente por tres minutos más. Deje que la arena se asiente y decante la suspensión lechosa vertiéndola a un tubo de centrífuga. Centrifugue a 3000 revoluciones durante 5 minutos.

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Usted obtendrá un precipitado que contiene ácidos nucléicos y un sobrenadante que contiene glucógeno. 2. Pase el sobrenadante a un tubo de ensayo y el tubo de centrífuga con el precipitado colóquelo en un baño de hielo. Precipite el glucógeno añadiendo 2 volúmenes de alcohol etílico, agitando y enfriando en el baño de hielo. Pase este medio a un tubo de centrífuga y centrifugue a 3000 r.p.m. Descarte el sobrenadante y disuelva el precipitado en 1 ml de agua destilada. Para utilizar como control coloque otro tubo de ensayo 1 ml de agua destilada y a ambos agregue 1 ml del reactivo de yodo, el cual tiñe el glucógeno de pardo rojizo.

T

enga en cuenta los cambios y anote sus observaciones.

3. Ahora, tome el precipitado de ácidos nucléicos y proteínas y agréguele 15 ml de cloruro de sodio al 10 %, agitando cuidadosamente. Como tenía este medio con el tubo de centrífuga, páselo a un tubo de ensayo y colóquelo en un baño de agua hirviendo por 10 minutos. Enfríe luego cuidadosamente y pase el medio a un tubo de centrífuga, centrifugando a 3000 r.p.m., durante 3 minutos. El sobrenadante contiene ácidos nucléicos, precipitado protéico en un baño de hielo.

páselo a un tubo de ensayo, y deje el

Tome el tubo que contiene los ácidos nucléicos y precipítelos añadiendo 2 volúmenes de etanol frío, lentamente y agitando sobre un baño de hielo y déjelo por unos 3 minutos. Vierta el contenido a un tubo de centrífuga y centrifugue durante 3 minutos a 3000 r.p.m. Descarte el sobrenadante y disuelva el precipitado en 2 ml de amortiguador salino. Coloque en otro tubo como control 2 ml de amortiguador salino, y a ambos agregue 3 ml del reactivo de orcinol; coloque los tubos en un baño de agua hirviendo durante algunos minutos. Una coloración verde indica la presencia de ARN.

T

enga en cuenta los cambios y anote sus observaciones.

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4. Tome el precipitado de proteínas coaguladas y disuélvalo con 2 ml de solución salina 0.15M. En otro tubo de ensayo, como control coloque 2 ml de la solución salina. Añada a cada tubo 1 ml de la solución de sulfato de cobre, luego 2 ml de hidróxido de sodio 10 M. Mezcle y observe. La aparición de un color violeta indica la positividad de la prueba (Prueba del Biuret).

T

enga en cuenta los cambios y anote sus observaciones.

Preguntas: 1. Cuáles son los fundamentos de las técnicas de extracción (Cuál es la utilidad de cada uno de los pasos que se sigue y de cada uno de los reactivos que se utiliza para purificar las macromoléculas y de las pruebas de identificación empleadas en esta práctica. 2. Escriba las reacciones químicas correspondientes de las diferentes pruebas de identificación utilizadas.

Preparación de reactivos: Reactivo de Orcinol: Se disuelven 0.1 g de FeCl3 en 100 ml de HCl y se mezclan con 3.5 ml de etanol que llevan disueltos 0.3 g de Orcinol. Amortiguador salino: Se mezclan citrato de sodio 0.015 M y NaCl 0.15 M en volúmenes iguales. Lugol: Para 500 ml, pesar 0.83 g de KI y disolver en agua. Agregar 1.3 g de Yodo metálico. Agitar fuertemente.

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LABORATORIO 2: MACROMOLECULAS DE LEVADURA HOJA DE REPORTE FECHA: ____________________ SEMESTRE:_________ GRUPO: _____ Asistentes: (sólo los que han PARTICIPAD0 de la práctica) _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ 1. Describa la apariencia del macerado inicial? _____________________________________________________________ _____________________________________________________________

2. ¿Cuál es la apariencia y el color del precipitado y del sobrenadante obtenido después de la primera centrifugación? ____________________________________________________________ _____________________________________________________________

3. Qué sucede con el sobrenadante cuando se le agregan los volúmenes de etanol frío? Color? _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ 4. Cuál es la apariencia del precipitado después de la segunda centrifugación? _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ 5. Que observan cuando agregan el reactivo de yodo (lugol) _____________________________________________________________ _____________________________________________________________

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6. Cómo interpretan este resultado? _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ 7. Cómo interpretan lo que sucede al calentar el tubo que contiene ácidos nucleicos y proteínas? _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ 8. Describa el precipitado y el sobrenadante, productos de la tercera centrifugación? _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ 9. Qué apariencia presenta el sedimento después de la cuarta centrifugación? _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ 10. ¿Cómo reaccionan las muestras de los diferentes tubos con el reactivo de orcinol? _____________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ 11. Qué aspecto presenta la solución de proteínas después de disolverlas con la solución salina 0.15M? _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ 12. Qué observan al realizar el ensayo con NaOH y CuSO4 con ambas muestras? _____________________________________________________________ _____________________________________________________________

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13. Qué otros aspectos desean destacar de la práctica realizada? _____________________________________________________________ _____________________________________________________________

14. Anexar las fichas técnicas de los reactivos y sustancias empleadas en esta práctica. 15. Anexar las respuestas del cuestionario de la página 33

Haga una breve discusión y conclusión de sus resultados. Discusión: _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________

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_________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ Conclusiones: _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________

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PRÁCTICA DE LABORATORIO 3 Tomado de: VELEZ A. Manual de Bioquímica. Universidad Santiago de Cali. Facultad de Educación. Química.

AMINOÁCIDOS

O

bjetivos:

1. Separar los componentes de una mezcla de aminoácidos por medio de la cromatografía de papel. 2. Determinar el Rf de algunos aminoácidos en el sistema empleado. 3. Establecer la influencia de la estructura de la cadena lateral R de los aminoácidos en el Rf. 4. Analizar la reacción de algunos aminoácidos con ciertos agentes químicos que permiten su reconocen cualitativo y cuantitativo.

Materiales: 30 tubos de ensayo 3 gradillas 4 pipetas de 5 ml 2 pinzas para tubos Plancha de calentamiento 1 vaso de precipitados de 500 ml 2 tubos capilares 2 “clips” (debe traer el grupo) 1 papel para cromatografía 1 erlenmeyer de 500 ml con tapón 1 estufa a 110º C 1 rociador 1 secador de pelo (debe traer el grupo)

Reactivos: Nitrito de sodio(10 g/l) Reactivo de ninhidrina Ácido nítrico concentrado Solvente: Etanol + Agua + Amoniaco (80-10-10 en volumen) NaOH 10 M Ácido acético glacial Fenol(1 g/l) Nitroprusiato de sodio(20 g/l) Reactivo de Millón Papel indicador de pH Mezcla de aminoácidos(1 g/l) de alanina, leucina y ácido aspartico. Soluciones (1 g/l) de los aminoácidos: prolina, ácido aspártico, leucina, glicina, alanina, tirosina, fenialanina, triptófano, cisteína, metionina, lisina y asparagina.

Procedimiento: 1. Separación de aminoácido por medio de cromatografía de papel En el trozo de papel para cromatografía trace una línea con lápiz, a 2 cm del borde inferior (Maneje el papel por los bordes para no contaminarlo).

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Sobre esta línea y a una distancia de 2 cm de separación, coloque 3 aplicaciones de las soluciones siguientes (en puntos separados): a. Alanina b. Ácido aspártico d. Mezcla de alanina, leucina y ácido aspártico.

c. Leucina

Deje secar bien cada muestra antes de volver a aplicar sobre el mismo punto (Utilice el aire caliente de un secador de pelo). Cuando termine las aplicaciones y las muestras estén bien secas, enrolle el papel tratando de formar un cilindro, de modo que las muestras queden hacia fuera.Sujete el cilindro con un clip en el borde contrario al de las muestras. Coloque el papel de filtro enrollado en el centro del erlenmeyer que contiene el solvente, de tal modo que el borde con las muestras quede sumergido en él, y tratando de que el papel no quede inclinado y que no toque las paredes con el recipiente. Tápelo y deje desarrollar el cromató grama sin mover el recipiente, hasta que el frente del solvente llegue a unos dos centímetros del borde superior. Cuando esto ocurra, saque el papel del erlenmeyer con unas pinzas y colóquelo en un sitio ventilado para que se seque. Una vez seco solicite al profesor el rociamiento con ninhidrina(Evite respirar estos vapores) y déjelo en la oscuridad por media hora o a una temperatura de 110º C en la estufa, durante 5 minutos. Saque el papel y observe las manchas. Rodee su perímetro con una línea hecha a lápiz y determine el centro de la mancha.

Preguntas: 1. En qué consisten las manchas observadas? 2. Determine los Rf de los aminoácidos en el cromatógrama. 3. Qué explicaciones pueden darse a las diferencias de migración observadas?

2. Algunas reacciones químicas con aminoácidos: Reacción con ninhidrina: En diferentes tubos de ensayo coloque 0.5 ml de solución de los siguientes aminoácidos: prolina, ácido aspártico, arginina, leucina, asparagina, metionina y tirosina. Añada a cada tubo 0.5 ml de ninhidrina en acetona al 1 %. Coloque los tubos en un baño de agua hirviendo por 5 minutos. Deje enfriar a temperatura ambiente y observe la coloración de cada tubo. Un color azul, violeta o marrón se considera positivo. La prolina debe dar un color amarillo. Reacción xantoproteica: En sendos tubos de ensayo coloque 0.5 ml de solución de cada uno de los siguientes aminoácidos: glicina, tirosina, triptofano, fenilalanina, y fenol. Agregue a cada tubo 0.5 ml de ácido nítrico concentrado. Como la reacción es exotérmica, deje enfriar y observe las cambios de color.

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Agregue luego a cada tubo 2 ml de NaOH 10 M. El cambio de coloración amarilla en medio ácido, a anaranjado en solución alcalina, constituye un resultado positivo.

Prueba con nitroprusiato de sodio: Coloque en diferentes tubos de ensayo 2 ml de glicina, cisteina, tirosina, triptófano, fenilalanina, metionina, ácido aspártico, arginina. Agregue 0.5 ml de nitroprusiato y luego 0.5 ml de hidróxido de amonio. La aparición de un color rojo se considera positivo. Reacción con ácido glioxílico: Coloque en diferentes tubos de ensayo 2 ml de glicina, tirosina, triptófano, fenilalanina, metionina y añada 2 ml de ácido acético glacial que haya sido expuesto a la luz(contiene ácido glioxílico). Inclinando cada tubo y sin agitar deje caer lentamente por las paredes 2 ml de ácido sulfúrico concentrado. Observe que se forman dos capas y en su interfase hay un cambio de color. Un anillo de color violeta se considera positivo.

C

UESTIONARIO: Para todos los casos explique el fundamento químico de las

reacciones y escriba las ecuaciones correspondientes. En la hoja de reporte, después de analizar sus resultados, indique cuales reacciones son generales y cuales son específicas.

Preparación de reactivos: Ninhidrina: Ninhidrina 0.6 g y disolver en 300 ml, de acetona. La acetona puede reemplazarse por etanol, etanol o isopropanol. Solvente para la cromatografía: Para 800 ml, se mezclan 640 ml de etanol, 80 ml de agua destilada y 80 ml de amoniaco.

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LABORATORIO 3: AMINOACIDOS HOJA DE REPORTE Asistentes: (sólo los que han PARTICIPAD0 de la práctica) _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ 1. Separación de aminoácidos por cromatografía de papel Realicen un esquema del cromatograma después de haber sido revelado con nihidrina (Adhieran el cromatograma realizado)

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2. Cromatografía de aminoácidos: Fase estacionaria: _________________________ Fase móvil: ______________ Revelador: _______________________________________________________ Patrones: ________________________________________________________

3. Calculen el Rf para cada uno de los aminoácidos? a) Alanina:

_________________

b) Ácido aspártico:

_________________

c) Leucina:

_________________

d) Mezcla:

_____________________________________

4. Qué concluyen con respecto a lo observado. ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________

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2. Algunas reacciones de los aminoácidos. En la siguiente tabla indique el color u otra característica sobresaliente de la reacción positiva de los aminoácidos, con las diferentes pruebas realizadas: Aminoácido

Nihidrina

Xantoproteica

Nitroprusiato

Ácido

de sodio

glioxílico

PROLINA A. ASPARTICO ARGININA ASPARAGINA CISTEINA FENILALANINA FENOL GLICINA LEUCINA METIONINA TIROSINA TRIPTOFANO

5. Cuáles son las pruebas generales y cuáles son específicas para determinados aminoácidos? ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________

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Anexe las fichas de seguridad de los reactivos y sustancias que se han utilizado en esta práctica. Anexar las respuestas del cuestionario de la página 39 y 40. Haga una breve discusión y conclusión de sus resultados. Discusión: _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ Conclusiones:______________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ _________________________________________________________________

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PRÁCTICA DE LABORATORIO 4 Tomado de: VELEZ A. Manual de Bioquímica. Universidad Santiago de Cali. Facultad de Educación. Química.

PROTEÍNAS

O

bjetivos:

1. Determinar el efecto de la temperatura, los solventes orgánicos, los pH extremos, la concentración salina y los iones metálicos pesados, sobre la estabilidad de una proteína en solución. 2. Analizar algunas de las reacciones para la determinación de la presencia de proteínas. 3. Separar una proteína en solución por medio de insolubilización reversible e irreversible.

Materiales: 15 tubos de ensayo 2 gradillas 1 termómetro 1 vaso de 250 ml 4 pipetas de 5 ml 4 tubos de centrífuga 1 centrifuga 1 balanza 1 probeta de 50 ml Plancha de calentamiento 1 pinza de madera

Reactivos: Solución de albúmina al 2 % Acetona HCl 9 N NaCl al 20 % Sulfato de amonio Ácido tricloroacético al 50 % NaOH 5 M Sulfato cúprico 0.1 M Hidróxido de amonio 1 huevo (debe traerlo cada grupo)

Procedimiento: 1. Coagulación de una proteína: Coloque 7 tubos de ensayo en una gradilla y numérelos.(De la clara de huevo obtenida separe 5 ml, para el tubo, el resto se le agrega agua, se agita y se completan 100 ml. Luego se filtra y se hacen con esta solución todos los ensayos). Vierta en cada tubo 3 ml de la solución de albúmina, excepto al No 1 que lleva los 5 ml de clara. Realice lo siguiente: Tubo No. 1: Se calienta suavemente y poco a poco en un baño de agua, controlando la temperatura mediante un termómetro colocado en el interior del tubo. Determine la temperatura a la cual se insolubiliza la proteína. Tubo No. 2: Agregue 2 ml de acetona. Deje en reposo y observe que pasa al cabo de algunos minutos. Tubo No. 3: Añada 1 ml de HCl 9 N. Observe.

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Tubo No. 4: Agregue 2 ml de NaCl al 20 %. Observe Tubo No. 5: Añada 2 ml de HNO3 al 20%. Observe Tubo No. 6: Agregue 4 ml de NaOH 5 M. Observe Tubo No. 7: Control Preguntas:

1. ¿Qué explicación puede dar en cada caso? 2. ¿Cuáles factores pueden causar la coagulación de una proteína?

2. Precipitación de la proteína por iones metálicos pesados Deposite en un tubo de ensayo 3 ml de la solución de albúmina, y añádale 1 ml de acetato de plomo 0.005 M. Espere algunos minutos y observe. Preguntas:

1. ¿En qué consiste la reacción observada? 2. ¿Qué otras sustancias la pueden producir? Agregue ahora 1 ml de ácido etilendiaminotetracético(EDTA) 0.05 M. Agite y observe. Preguntas:

1. ¿Porque ocurre la reacción observada? 3. Insolubilización reversible e irreversible En un tubo de ensayo coloque 5 ml de la solución de albúmina, agregue en porciones pequeñas y agitando para que se disuelva bien, 2.36 g de sulfato de amonio. Observe. En otro tubo de ensayo, coloque 5 ml de la solución de albúmina y añada 1 ml de ácido tricloroacético al 50 %. Observe. Centrifugue las suspensiones de ambos tubos a 3000 r.p.m., durante 10 minutos. Separe el sobrenadante de ambos tubos por decantación, deséchelo y conserve el sedimento de ambos tubos. Preguntas:

1. ¿En qué consisten los sedimentos? Agregue a cada tubo 4 ml de agua destilada y agite bien. Observe y anote los resultados.

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Preguntas:

2. Compare ambos resultados. ¿Qué concluye? 4. Reacción xantoproteica: Coloque en un tubo de ensayo 3 ml de la solución de albúmina y agréguele 3 ml de ácido nítrico al 20 %. Observe. Caliente en un baño de agua por algunos minutos. Observe. Enfríe el tubo y posteriormente añada 3 ml de hidróxido de amonio. Anote los resultados. Preguntas:

1. Cuál es el fundamento químico de esta reacción?

5. Reacción de Biuret: Coloque en un tubo de ensayo 3 ml de la solución de albúmina. Añada el mismo volumen de hidróxido de sodio 5 M, y 5 gotas de sulfato cúprico 0.1 M. Observe. Preguntas:

1. Cuál es el fundamento químico de esta reacción? 2. ¿Cómo podríamos saber que una sustancia desconocida es una proteína? 3. ¿Qué coloración da la reacción del Biuret?

RECUERDA QUE DEBES: Interpretar todos estos resultados y elaborar las conclusiones correspondientes.

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PROTEÍNAS FECHA: ___________ SEMESTRE: ____________ GRUPO: ________ ASISTENTES: (Sólo los asistentes a la clase) ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________

1. Coagulación de proteínas: Tubo

Observaciones

1. Calor 2. Acetona 3. HCl 9N 4. NaCl 20% 5. HNO3 20% 6. NaOH 5M 7. CONTROL

OBSERVACIONES 2. Precipitación de proteínas por iones metálicos pesados Solución de albúmina + acetato de plomo:__________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________

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Qué ocurre al agregar EDTA? ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ 3. Insolubilización reversible e irreversible: Solución de albúmina + sulfato de amonio: _____________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ Sedimento del proceso anterior + 4 ml de agua destilada: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ _________________________________________________ Solución de albúmina + ácido tricloroacético: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ _________________________________________________ Sedimento del proceso anterior + 4 ml de agua destilada: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ Cuál de los tratamientos causó insolubilización reversible de la albúmina de huevo? ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ¿Porqué? ________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ Cuál de los tratamientos causó insolubilización irreversible de la albúmina de huevo? ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ¿Porqué? ________________________________________________________

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________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ 4. Reacción xantoproteíca: Solución de albúmina + HNO3 al 20% ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ¿Qué observa después de calentar suavemente? ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ 5. Reacción de Biuret: ¿Qué cambios observa al utilizar los reactivos del proceso? ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ¿Qué observaciones tienen de la práctica en general?: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________

14. Anexar las fichas técnicas de los reactivos y sustancias empleadas en esta práctica. 15. Anexar las respuestas del cuestionario de la página 46 y 47

16. Haga una breve discusión y conclusión de sus resultados.

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Discusión: _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ Conclusiones: _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________

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PRÁCTICA DE LABORATORIO 5 Tomado de: VELEZ A. Manual de Bioquímica. Universidad Santiago de Cali. Facultad de Educación. Química.

AMILASA SALIVAL

I

ntroducción:

La saliva, secretada por las glándulas salivales en cantidad aproximada de un litro diario, contiene una enzima que cataliza la hidrólisis(digestión) del almidón a través de una serie de intermediarios más pequeños(dextrinas) hasta que el producto final que es la maltosa. Esta enzima se llama Amilasa Salival, la que en la actualidad ha sido purificada y sintetizada en forma cristalina. La reacción enzimática de la amilasa salival puede seguirse fácilmente con la prueba de yodo. El yodo produce un color intensamente azul con el almidón.(Realmente sólo con el componente llamado amilosa). Cuando se hidroliza el almidón, las pruebas repetidas con yodo van desde un color azul, pasando luego al violeta, luego al rojo o pardo rojizo (dextrinas), y finalmente incoloro(dextrinas más pequeñas: maltosa), indicándose así el curso de la reacción. Objetivos: 1. Determinar algunas características de la reacción de hidrólisis del almidón por medio de la catálisis con la amilasa salival. 2. Medir el efecto de la concentración de la enzima con respecto a la velocidad de reacción. 3. Analizar el efecto de la temperatura y el pH sobre la actividad de la enzima. 4. Seguir las características cinéticas de la reacción de hidrólisis del almidón, mediante la aplicación de la prueba de yodo. 5. Deducir algunos factores que pueden afectar la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas.

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Velocidad de la reacción vs. Concentración de la enzima: Materiales: 12 tubos de ensayo 2 gradilla 2 4 3 1 1 1

laminas de vidrio goteros (Traerlos) pipetas de 5 ml hoja de papel milimetrado (traerla) probeta de 100 ml cronómetro o reloj con segundero (traerlo)

Reactivos: Saliva (traer frasco para toma de muestra de orina) Suspensión de almidón Lugol Parafina Buffer pH 6.8

Procedimiento: Estimule su flujo salival masticando suavemente un pedazo de parafina y deposite en un tubo de ensayo unos 5 ml de saliva. Prepare las siguientes diluciones de saliva utilizando agua de la llave, así: Dilución ml de saliva: ml de agua 1 : 9 0.5 : 9.5 0.2 : 9.8 0.1 : 9.9

Concentración de saliva %(V/V) 10 5 2 1

Mide la actividad de las 4 diluciones de saliva, de la siguiente manera: 1. En un tubo de ensayo coloque 2 ml de la suspensión de almidón y añada 2 ml de amortiguador de pH 6.8 y agite. 2. Coloque una gota de la mezcla anterior sobre la lámina de vidrio y agréguele una gota de la solución de yodo, para comprobar la reacción de almidón. (Debe aparecer un color azul intenso). 3. Coloque en tubo de ensayo 1 ml de saliva de la del 10 % y vierta sobre el contenido del tubo anterior(mezcla de almidón y amortiguador). En este momento se inicia la reacción y es el tiempo CERO. Agite. 4. Saque una gota de esta mezcla cada 20 segundos y colóquela sobre la lámina de vidrio y agréguele una gota de yodo. 5. Suspenda las pruebas, cuando al añadir la solución de yodo, la mezcla quede del mismo color que la solución yodada. 6. Anote el color que resulte, cada vez que haga las pruebas. 7. Explique las coloraciones presentadas. 8. Sobre la base del número de muestras determine el tiempo transcurrido.

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9. Repita los pasos de 1 hasta 5, utilizando cada vez la saliva de las otras concentraciones. En estos casos ustedes pueden alargar los intervalos de tiempo dependiendo de la velocidad que observen en el desarrollo de la reacción. 10. Compare la actividad de la saliva usada por ustedes, con la de otros grupos, en termino de los tiempos requeridos para llegar al punto final, en los tubos en los que agregó saliva al 2 %. 11. Compare el resultado de su propio experimento con los valores mínimo, máximo y promedio del curso. 12. ¿Qué explicación podrían proponer a las diferencias observadas? 13. Realice una gráfica del recíproco del tiempo requerido para llegar a su punto final(1/min) y su concentración. Para preparar el buffer pH 6.8: NaH2PO4 H2O 0.2 M 13.8 g/500 ml Na2HPO4 0.2 M 14.2 g/500 ml 122.5 ml de Na2HPO4 + 127.5 ml de NaH2PO4 y se completa la solución a 500 ml de Diluciones de la saliva

10%

5%

9 ml agua 1 ml saliva

2%

1%

9.5 ml agua

9.8 ml agua

9.9 ml agua

0.5 ml saliva

0.2 ml saliva

0.1 ml saliva

Preparación de las muestras para la prueba de velocidad de la reacción frente a concentración de enzima

2 ml Buffer 6.8 2 ml almidón

2 ml Buffer 6.8

2 ml Buffer 6.8

2 ml almidón

2 ml almidón

2 ml Buffer 6.8 2 ml almidón

1% 10%

5%

1 ml saliva

solución.

2%

1 ml saliva

1 ml saliva

1 ml saliva

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AMILASA SALIVAL PRIMERA PARTE HOJA DE REPORTE FECHA: ____________________ SEMESTRE:_________ GRUPO: _____ Asistentes: (sólo los que han asistido a la práctica) _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ 1. Velocidad de la reacción (1/t) frente a concentración de la enzima (V/V) Concentración de la saliva

Tiempo de la reacción

Velocidad de la reacción

% (V/V)

(t en segundos)

(1/t en minutos )

-1

10 5 2 1

Tiempo segundos

COLOR 10%

5%

2%

1%

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Con los datos obtenidos realice una gráfica en papel milimetrado. Anexe esta gráfica 1. Gráfica 1.

¿Cómo interpreta la gráfica realizada? _______________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ Compare sus datos con los resultados obtenidos por los otros grupos: Grupo No.

PH de la saliva

Tiempo de la reacción

Velocidad de la reacción

empleada en la práctica

(t en segundos)

(1/t en minutos )

-1

1 2 3 4 5 ¿Al analizar los datos que pueden concluir? _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________

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Anexe las fichas de seguridad de los reactivos y sustancias que se han utilizado en esta práctica. Anexar las respuestas del cuestionario de la página 54. Haga una breve discusión y conclusión de sus resultados. Discusión: _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ Conclusiones: 1_______________________________________________ ________________________________________________ ________________________________________________ 2_______________________________________________ ________________________________________________ ________________________________________________

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Velocidad de la reacción de la enzima con relación al pH y la temperatura.

M

ateriales:

Reactivos:

14 tubos de ensayo 2 gradillas 1 vaso de 500 ml 1 lamina de vidrio 2 goteros(Traerlos) 3 pipetas de 5 ml 1 hoja de papel milimetrado 1 probeta de 100 ml 1 termómetro(traerlo) Plancha de calentamiento

Saliva Suspensión de almidón Solución de yodo Parafina Amortiguadores de pH: 3.4, 5.0, 6.8, 8.0, 10.0 Otros: Baño de agua a 37º C Baño con hielo Baño de agua hirviendo Papel milimetrado Papel indicador de pH

Procedimiento:

Velocidad de Reacción vs. Temperatura 1. Prepare una dilución de saliva de concentración del 2 %. 2. En 4 tubos de ensayo de 2 ml de la suspensión de almidón y 2 ml del amortiguador de pH 6.8. 3. Vierta en 4 tubos de ensayo diferentes 1 ml de la saliva del 2 %. 4. En orden trabaje con cada par de tubos(mezcla de almidón y amortiguador y el de saliva) dejándolos durante unos 3 minutos en cada uno de los medios para que adquieran la temperatura del sistema, así: 1 par en baño de hielo 1 par en baño a 37º C

1 par a temperatura ambiente 1 par en baño de agua hirviendo

5. Una hora el contenido de cada par de tubos.(Recuerde que es el tiempo CERO), y proceda a realizar las pruebas con yodo tal como en la práctica anterior. Se recomienda que para los medios de temperatura ambiente y 37º C, se hagan ensayos cada 20 segundos; y para los baños en hielo y agua hirviendo cada 3 a 5 minutos según la actividad que haya mostrado la enzima.

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Preguntas: 1. ¿De las temperaturas utilizadas, cuál es la óptima para la acción de la amilasa salival? 2. ¿Porqué disminuye la actividad de la enzima a temperaturas extremas? 3. Relacione el experimento con la temperatura del cuerpo humano. 4. Realice una gráfica en papel milimetrado del 1/ tiempo vs. temperatura. 2. Velocidad de la Reacción vs. pH 1. Vierta en 5 tubos de ensayo 1 ml de la saliva del 2 % 2. En otros tubos de ensayo eche en cada uno 2 ml de la suspensión de almidón y amortigüe uno con 2 ml del buffer pH 3.4; otro con pH 5; otro con pH 6.8; el siguiente con pH 8 y finalmente el último con pH 10. 3. Realice los ensayos correspondientes con yodo como en los casos anteriores, utilizando intervalos de 20 segundos para los pH 6.8 y 8 y de 3 a 5 minutos para los otros casos.

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Preparación de las muestras para la prueba de velocidad de la reacción frente a temperatura Dilución de la muestra de saliva escogida

2 ml Buffer 6.8 2 ml almidón

2 ml Buffer 6.8

2 ml Buffer 6.8

2 ml almidón

2 ml almidón

37ºC

Baño de hielo

1 ml saliva

Ebullición

1 ml saliva

1 ml saliva

Preparación de las muestras para la prueba de velocidad de la reacción frente a pH Dilución de la muestra de saliva escogida

2 ml Buffer 3.4 2 ml almidón

3.4

2 ml Buffer 5.0

2 ml Buffer 8

2 ml almidón

2 ml almidón

5.0

1 ml saliva

2 ml almidón

10

8

1 ml saliva

2 ml Buffer 10

1 ml saliva

1 ml saliva

Preguntas: 1. De los pH utilizados, ¿cuál es el óptimo para la actividad de la amilasa salival? 2. Mida el pH de la saliva de todos los miembros de su grupo, utilizando el papel indicador. ¿Cuál es el pH más frecuente? 3. Compare con otros grupos de trabajo. ¿Cuál es el pH más común en el curso? 4. ¿Cómo relaciona el pH óptimo con el pH de su saliva? 5. Tabule sus resultados y haga una gráfica de 1/ tiempo vs. pH 6. ¿Disminuye la actividad de la amilasa salival a pH extremos? ¿Porqué?

62

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PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS:

P

ara preparar los Buffer:

pH 8: 94.7 ml de Na2HPO4 + 5.3 ml de NaH2PO4 y se completa a 200 ml de solución. pH 3.4 y 5: Ácido cítrico 2.1g/ 100 ml,

Citrato de sodio 2.34g/ 100 ml

3.4: 43.8 ml de ácido cítrico + 16.2 ml de citrato 5: 21.0 ml de ácido cítrico + 39,0 ml de citrato pH 10: Carbonato de sodio 1.06g /100 ml, Bicarbonato de sodio 0.84g /100 ml 10: 60 ml de carbonato + 40 ml de bicarbonato Almidón: 2.5 g de almidón soluble + 2.5 g de sal en 500 ml

63

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AMILASA SALIVAL SEGUNDA PARTE HOJA DE REPORTE FECHA: ____________________ SEMESTRE:_________ GRUPO: _____ Asistentes: (sólo los que han asistido a la práctica) _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ 2. Velocidad de la reacción (1/t) frente a temperatura. Temperatura de la

T ºC

Tiempo de la reacción

Velocidad de la reacción

(t en segundos)

(1/t en minutos -1)

reacción Baño de hielo Ebullición Ambiente

aprox 25ºC

Corporal

37ºC

Con los datos obtenidos realice una gráfica en papel milimetrado. Anexe la gráfica Cómo interpreta la gráfica realizada: ___________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ Gráfica 2.

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3. Velocidad de la reacción frente a pH pH de la reacción

Tiempo de la reacción

Velocidad de la reacción

(t en segundos)

(1/t en minutos -1)

3.4 5.0 6.8 8.0 10.0 Con los datos obtenidos realice una gráfica en papel milimetrado. Anexe la gráfica ¿Cómo interpreta la gráfica realizada?__________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ¿Qué otras observaciones tienen sobre la práctica? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ Qué pueden concluir de la práctica realizada? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

Gráfica 3

PRÁCTICA DE LABORATORIO 6 Tomado de: VELEZ A. Manual de Bioquímica. Universidad Santiago de Cali. Facultad de Educación. Química.

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Anexe las fichas de seguridad de los reactivos y sustancias que se han utilizado en esta práctica. Anexar las respuestas del cuestionario de la página 59 y 60. Haga una breve discusión y conclusión de sus resultados. Discusión: _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ Conclusiones: 1_______________________________________________ ________________________________________________ ________________________________________________ 2_______________________________________________ ________________________________________________ ________________________________________________

66

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RECONOCIMIENTO DE GLUCIDOS

O

bjetivos:

1. Utilizar una reacción general y algunas específicas para la identificación de glúcidos. 2. Efectuar algunas de las reacciones especificas para el reconocimiento de azucares reductores. 3. Analizar la capacidad de diversos tratamientos para ocasionar la hidrólisis de la sacarosa y del almidón. Materiales: 40 tubos de ensayo 1 vaso de 500 ml 1 mechero de gas 4 pipetas de 5 ml y 3 de 1ml Plancha de calentamiento 3 gradillas

Reactivos: Ácido sulfúrico concentrado 2 pinzas de madera Alcohol amílico Papel indicador de pH Reactivos de Molisch, Benedict, Bial, Barfoed y Selivanoff. Soluciones al 1 % de glucosa, fructosa, arabinosa, lactosa, sacarosa, maltosa y almidón.

Procedimiento: 1. Reacción de Molisch: En diferentes tubos de ensayo coloque 0.5 ml de las soluciones de los glúcidos y en otro 0.5 ml de agua destilada(blanco). Agregue a cada tubo con cuidado y sin agitar, 2 gotas del reactivo de Molisch, luego inclinando el tubo deje resbalar en cada uno 0.5 ml de ácido sulfúrico concentrado; deje reposar por unos tres minutos y observe la reacción.

Preguntas:

1. Qué tipo de glúcidos pueden reconocerse por esta reacción? 2. Explique el fundamento químico de ella. 2. Reacción de Benedict: En sendos tubos coloque 1 ml de las soluciones de glúcidos y en otro 1 ml de agua destilada(patrón). Agregue a cada tubo 1 ml del Reactivo de Benedict. En un vaso tenga agua a ebullición y coloque en los tubos durante unos 3 minutos.

67

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Preguntas: 1. ¿Qué tipo de glúcidos reaccionan con el Reactivo de Benedict? 2. Escriba la ecuación química general para este proceso. 3. Reacción de Barfoed: Coloque en diferentes tubos de ensayo 1 ml de cada una de las soluciones de glúcidos y en otro 1 ml de agua destilada. Agregue a cada uno 1 ml del Reactivo de Barfoed. Coloque los tubos en un baño a ebullición por 3 minutos. Observe los cambios y explique los resultados.

Preguntas: 1. Qué glúcidos se podrían identificar mediante esta reacción? 2. Escriba la ecuación química general para este proceso. 4. Prueba de Bial: Coloque en diferentes tubos de ensayo 1 ml de cada una de las soluciones de glúcidos y en otro 1 ml de agua destilada. Añada a cada uno 2.5 ml del Reactivo de Bial. Coloque los tubos en un baño hasta que su contenido comience a hervir. Un color azul verdoso de considera positivo. Deje enfriar los tubos y agregue a cada uno 3 ml de alcohol amílico, agite y observe.

Preguntas: 1. Qué tipo de glucidos pueden reconocerse por esta reacción? 2. Explique el fundamento químico de ella. 5. Prueba de Selivanoff: Coloque en ocho tubos de ensayo 2 ml del Reactivo de Selivanoff. Agregue a cada uno 5 gotas de la solución de cada glúcido y al último agua destilada. Coloque los tubos durante 1 minuto en agua hirviendo. Un color rojo intenso se considera positivo.

Preguntas: 1. La experiencia qué tipo de glúcidos identifica? 2. Cuál es el fundamento químico de esta prueba?

Preguntas: 1. Qué tratamientos provocaron la hidrólisis de la sacarosa y el almidón? 2. Qué conclusiones pueden sacar de lo observado?

68

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Preparación de los reactivos: 1. Molisch: 5 g de alfa-naftol en 100 ml de metanol (al usar) 2. Benedict: 1.73 de CuSO4 + 17.3 g de citrato de sodio + 10 g de Na2CO3 anhidro y disolver a 100 ml con agua destilada. 3. Barfoed: 4.5 g de acetato de cobre + 1 ml de ácido acético al 50 % y disolver a 100 ml con agua destilada. 4. Bial: 100 mg de orcinol + 100 ml de HCl concentrado + 100 mg de cloruro férrico. 5. Selivanoff: 0.5 g de resorcinol en un litro de HCl 3 N.

69

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PRUEBAS CUALITATIVAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE AZÚCARES Sustancia desconocida Prueba de Molisch

No da coloración

Da coloración roja violeta

No es carbohidrato

Es un carbohidrato Lugol

Color azul Almidón

Color rojo

Incolora Monosacárido o disacárido

Glucógeno o eritrodextrina

Reactivo de Barfoed

No hay precipitado o éste es muy escaso

Sacarosa

Precipitado rojo naranja abundante en 5-7 minutos Monosacáridos

(-) Benedict Fermentable Hiérvase con HCl y aplique la prueba de Seliwanoff para diferenciar cetosas de aldosas y la prueba de Bial para diferenciar pentosas de hexosas

Precipitado abundante en más de 5-7 minutos Disacáridos

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RECONOCIMIENTO DE GLUCIDOS HOJA DE REPORTE FECHA: ____________________ SEMESTRE:_________ GRUPO: _____ Asistentes: (sólo los que han asistido a la práctica) _____________________________________________________________ _____________________________________________________________

GLÚCIDOS

REACTIVOS MOLISCH

BENEDICT

BARFOED

BIAL

SELIVANOFF

AGUA ALMIDÓN MALTOSA LACTOSA SACAROSA FRUCTOSA ARABINOSA GLUCOSA DESCONOCIDO

Al analizar la tabla: A. ¿Cuáles reactivos son generales?__________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________. ________________________________________________________________ ________________________________________________________________.

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B. ¿Cuáles reactivos se consideran específicos? Y para cuáles azúcares? ________________________________________________________________ ________________________________________________________________. ________________________________________________________________ ________________________________________________________________. C. Qué otros aspectos desea consignar? ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________. ________________________________________________________________ ________________________________________________________________.

OBSERVACIONES: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________. ________________________________________________________________ ________________________________________________________________.

Anexe las fichas de seguridad de los reactivos y sustancias que se han utilizado en esta práctica. Anexar las respuestas del cuestionario de la página 65, 66 y 67 Haga una breve discusión y conclusión de sus resultados. Discusión: _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________

72

Guía de Laboratorio de Bioquímica General

L.D. Caicedo

_________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ Conclusiones: 1_______________________________________________ ________________________________________________ ________________________________________________ 2_______________________________________________ ________________________________________________ ________________________________________________

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PRÁCTICA DE LABORATORIO 7 Tomado de: VELEZ A. Manual de Bioquímica. Universidad Santiago de Cali. Facultad de Educación. Química.

ALGUNAS PROPIEDADES FÍSICAS Y QUÍMICAS DE LOS LÍPIDOS

I

ntroducción:

Los lípidos son compuestos insolubles en agua pero solubles en solventes orgánicos. Generalmente se encuentran distribuidos ampliamente en la naturaleza como ésteres de ácidos grasos de cadena larga. Desde el punto de vista químico los lípidos pueden dividirse en dos grupos principales: Simples y Compuestos. Los esteroides y las vitaminas liposolubles se consideran también lípidos Derivados. Muchos de estos compuestos son, sin embargo, alcoholes y no ésteres y por lo tanto no pueden saponificarse. Objetivos: 1. Determinar la solubilidad de las grasas en diversos solventes. 2. Realizar una saponificación sencilla y determinar algunas propiedades de los jabones. 3. Establecer la presencia de ácidos grasos libres y de insaturaciones en las grasas. 4. Realizar una prueba para el reconocimiento de esteroles.

Materiales: 15 tubos de ensayo 1 vaso de 50 ml 1 balanza 1 mechero de gas 1 espátula Soporte con aro y malla 2 gradillas 5 pipetas 1 agitador de vidrio 1 vaso de 250 ml

Reactivos: Papel indicador de pH HCl al 10 % HCl concentrado H2SO4 concentrado Escamas de jabón CaCl2 (50 g/ l) MgCl2 (50 g/ l) (CH3COO)2Pb (50 g/ l)

Otros: Mantequilla, margarina, aceite vegetal, anhídrido acético, etanol 95 %, cloroformo, éter etílico, benceno, tetracloruro de carbono, ácido esteárico, ácido oleico, fenolftaleína al 1 % en etanol, acetona, solución de colesterol en cloroformo(0.2 g/ l), NaOH 0.1 M y soluciones de mantequilla, aceite vegetal y ácido esteárico.

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Procedimiento: 1. Solubilidad: Numere 10 tubos de ensayo y coloque en cada uno 2 ml de aceite vegetal, y luego agregue a cada uno independientemente 1 ml de las siguientes sustancias: agua destilada, HCl al 10 %, NaOH 0.1 M, etanol frío, etanol caliente, cloroformo, éter etílico, tetracloruro de carbono, y acetona. Agite cada uno y deje reposar en la gradilla por 5 minutos y observe el grado de solubilidad.

Preguntas: 1. Cuáles son los mejores disolventes para las grasas? 2. Cuáles no disuelven las grasas? 3. Cómo explicarían estos resultados? 2. Emulsificación: En dos tubos de ensayo coloque 3 ml de aceite vegetal. Añada a cada uno 3 ml de agua destilada y sólo a uno de los tubos agregue unas escamas de jabón. Agite bien ambos tubos.

Preguntas: 1. Cómo se denomina la mezcla formada? 2. Cómo está constituida dicha mezcla? Deje los tubos en reposo y obsérvelos varias veces durante 15 minutos. 1. Notan ustedes cambios en las mezclas? 2. Cómo es la estabilidad de las mezclas en los tubos? 3. Explique los resultados. 3. Saponificación: Coloque en un vaso en 50 ml, unos 20 ml de agua y sométalos a ebullición(Mantenga el volumen constante). Cuando esté hirviendo añada 1 ml de ácido oleico. Agregue ahora y cuidadosamente, gota gota NaOH al 10 %, hasta que el medio sea claro. Tengan cuidado de no añadir un exceso de álcali.

Preguntas: 1. En que consiste la solución formada? 2. Escriba la ecuación química correspondiente.

75

Guía de Laboratorio de Bioquímica General

L.D. Caicedo

Numere ahora 5 tubos de ensayo y coloque en cada uno 2 ml de la solución anterior y efectúen las siguientes pruebas: TUBO

1: 2: 3: 4: 5:

Sature la solución con NaCl(sólido) Agregue 5 gotas de ácido sulfúrico concentrado Agregue 5 gotas de solución de cloruro de magnesio Agregue 5 gotas de solución de cloruro de calcio Agregue 5 gotas de solución de acetato de plomo

Observe y anote los resultados.

Preguntas: 1. Explique lo que ocurre en cada caso. 2. Escriba las reacciones químicas correspondientes. 4. Ácidos grasos libres: En diferentes tubos de ensayo coloque 1 ml de las soluciones de mantequilla, aceite vegetal, y ácido esteárico en éter. En otro tubo de ensayo coloque 10 ml de una solución de fenolftaleina y agregue cuidadosamente gota a gota a las muestras disueltas en éter, hasta que el color rosado de la solución de la solución de fenolftaleína no desaparezca, agitando el tubo(Máximo 15 gotas).

Preguntas: 1. Tenga en cuenta el número de gotas usadas en cada caso. 2. Qué explicación pueden dar en cada uno de los ensayos?

5. Prueba para esteroles: Atención: Los recipientes y sustancias que se utilizan deben estar exentos de agua. 1. Coloque en un tubo de ensayo seco 2 ml de solución de colesterol. Añada 5 gotas de anhídrido y luego 5 gotas de ácido sulfúrico concentrado. 2. Agite suavemente y deje reposar durante unos 5 minutos. 3. Observe y explique los cambios de color.

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RECONOCIMIENTO DE LÍPIDOS HOJA DE REPORTE FECHA: ____________________ SEMESTRE:_________ GRUPO: _____ Asistentes: (sólo los que han asistido a la práctica) _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ 1. Solubilidad Indique el grado de solubilidad o insolubilidad del aceite en cada uno de los casos (muy soluble, soluble, poco soluble, insoluble) HCl 10%

Etanol frío

NaOH 0.1M

Éter

Agua

CCl4

Etanol caliente

Acetona

¿Cuáles son los mejores disolventes? ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ _______________________________________________________________ ________________________________________________________________ 2. Emulsificación: ¿Qué observa en ambos medios: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ¿Qué tan estables son las mezclas? ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________

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3. Saponificación: ¿Qué observa en cada uno de los tubos después de realizar los ensayos?

a. NaCl _________________________________________________________ ________________________________________________________________ b. H2S04 ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ c. MgCl2: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ d. Ca Cl2: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ e.(CH3C00)2Pb:____________________________________________________ ________________________________________________________________ 4. Ácidos grasos libres: ¿Cuántas gotas del reactivo NaOH utilizó para neutralizar las muestras? Mantequilla: ______________ Aceite vegetal___________ ácido esteárico: ____________ ¿Cómo interpretan este resultado? ________________________________________________________________ ________________________________________________________________

6. Esteroles: Describan lo que observan: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________

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1. ¿Qué son los jabones? 2. ¿Cómo se pueden obtener los jabones? 3. ¿Qué enzima logra en el aparato digestivo la hidrólisis de las grasas? 4. ¿Qué ocurre con la emulsión de agua en aceite transcurridos unos minutos de reposo?¿Y con la de eter y aceite?¿A qué se deben las diferencias observadas entre ambas emulsiones?.

Anexe las fichas de seguridad de los reactivos y sustancias que se han utilizado en esta práctica. Anexar las respuestas del cuestionario de la página 74 y 75 Haga una breve discusión y conclusión de sus resultados.

Discusión: _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________

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Guía de Laboratorio de Bioquímica General

L.D. Caicedo

Conclusiones: 1_______________________________________________ ________________________________________________ ________________________________________________ 2_______________________________________________ ________________________________________________ ________________________________________________ 3_______________________________________________ ________________________________________________ ________________________________________________ 4_______________________________________________ ________________________________________________ ________________________________________________

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PRÁCTICA DE LABORATORIO 8 Tomado de: VELEZ A. Manual de Bioquímica. Universidad Santiago de Cali. Facultad de Educación. Química.

TRANSAMINACION

I

ntroducción:

La transaminación es una de las reacciones más importantes en el catabolismo y biosíntesis de los aminoácidos en la célula. Durante la reacción de transaminación se transfiere el grupo alfa-amino de un aminoácido al carbono alfa de un alfa-cetoácido, dando como productos un nuevo aminoácido y un nuevo alfacetoácido. La reacción de transaminación es catalizada por las enzimas llamadas transaminasas, que utilizan el piridoxalfosfato como coenzima. Estas enzimas se encuentran en la matriz citoplasmática y en las mitocondrias de las células de varios tejidos. Por ejemplo, en los mamíferos las transaminasas son abundantes en el hígado, corazón y riñón, principalmente. En esta práctica pretendemos examinar la reacción de transaminación utilizando como catalizador un extracto enzimático crudo obtenido de tejido cardiaco de ternera. Objetivos: 1. Obtener un extracto enzimático crudo a partir de corazón de ternera. 2. Utilizar el extracto enzimático para catalizar la reacción de transaminación entre el aminoácido L-alanina y el alfa-cetoácido alfa-cetoglutarato. 3. Analizar las características de la reacción efectuada mediante la utilización de la cromatografía de papel. 4. Deducir la importancia de las reacciones de transaminación en el metabolismo general de las células y los organismos.

Materiales:

Reactivos:

10 tubos de ensayo 2 gradillas 2 tubos de centrífuga plásticos 1 probeta de 100 ml 1 vaso de 250 ml 4 pipetas de 5 ml 1 pipeta de 1 ml 1 embudo papel filtro

Amortiguador de fosfatos 0.01 M, pH 7.4 Amortiguador de fosfatos M/ 15, pH 7.4 Solvente: Etanol- agua- amoniaco (80- 10- 10 por volumen) Ninhidrina 0.2 % en acetona Mezcla alanina- alfacetoglutarato Acido acético al 4 %

81

Guía de Laboratorio de Bioquímica General

L.D. Caicedo

Otros: 1 licuadora, 1 balanza, 1 baño de agua a 37º C 1 tira de papel filtro 2 clips 1 secador de pelo 1 rociador 1 vaso de 500 ml

1 cuchilla nueva Plancha de calentamiento 1 erlenmeyer de 500 ml con tapón 2 tubos capilares 1 estufa a 110º C 1 centrífuga

Procedimiento: 1. Prepación del extracto enzimático: Pese aproximadamente 30 g de corazón de ternero fresco, córtelo en pedazos pequeños y colóquelos en la licuadora con 60 ml de amortiguador de fosfatos 0.01 M, pH 7.4. Homogenice durante unos 3 minutos y luego reparta el volumen en dos tubos de centrífuga. Centrifugue a 3000 r.p.m. durante 15 minutos. Decante el sobrenadante en un tubo de ensayo y descártense los sedimientos. 2. Reacción de transaminación:

Prepárese cinco tubos de ensayo con las siguientes mezclas de soluciones. Adicionar siempre de último el extracto enzimático. Tubo # Solución Alanina - cetoglutarato Amortiguador M/15 pH 7.4 Agua destilada Alanina – acido glutámico Äcido glutámico Extracto enzimático

1

2ml 1ml 1ml

2

3

4

5

1 ml 2ml

1ml 2ml

1ml 2ml 1ml

2ml 1ml

1ml

1ml

1ml

1. Tan pronto como se hayan mezclado los ingredientes del tubo No 1(control a tiempo cero), añádale inmediatamente 0.2 ml de ácido acético al 4 %, mezcle bien y coloque el tubo en un baño de ebullición durante 3 minutos. Deje enfriar y filtre en un tubo de ensayo. Descarte el residuo. 2. Este será el filtrado libre de proteínas del tubo No. 1. Guárdelo para la cromatografía.

3. Antes de añadir la enzima al tubo # 2 caliente a ebullición durante 3 minutos. Agregue la enzima y añada 0.5 ml de ácido acético al 4%. Filtre en un tubo de ensayo y descarte el residuo.

82

Guía de Laboratorio de Bioquímica General

L.D. Caicedo

4. Los tubos 3 y 5 deben ser incubados por 30 minutos en un baño de agua mantenida a 30 – 35ºC terminada la incubación añádase 0.5 ml de ácido acético 4% y colóquelos en el baño de agua hirviendo por 3 minutos; luego filtrelos. 5. El tubo # 4 no necesita ningún procedimiento 6. Guarde los diferentes tubos para la cromatografía. 3. Cromatografía de papel: Coloque la tira de papel para cromatografía sobre una hoja limpia. Maneje el papel solo por las puntas. Trace una línea fina con un lápiz de grafito a 2 cm del borde inferior. Marque 5 puntos sobre la línea, con 2 cm de separación entre ellos. Utilizando cinco tubitos capilares realice 3 aplicaciones o sobre cada uno de los puntos, secando la muestra antes de volver a aplicar sobre el mismo punto, así (utilice un capilar diferente para cada muestra): Terminada la aplicación, enrolle la tira de papel teniendo cuidado de que las muestras queden afuera y manejando el papel solo por el borde superior. Sujete el borde superior con un “clip” tratando de formar un cilindro. Coloque 30 ml del solvente en el erlenmeyer sin humedecer las paredes. Introduzca el papel enrollado dentro del erlenmeyer, con el borde que contiene las muestras hacia abajo, en el centro del recipiente evitando el contacto entre el papel y las paredes del vaso. Tape el erlenmeyer con el tapón y déjelo quieto hasta que el frente del solvente haya llegado a 2 cm del borde superior. Cuando esto ocurra, saque el papel con cuidado y cuélguelo en un sitio ventilado para que se seque. Una vez seco solicite al profesor que sea rociado con el reactivo de ninhidrina (evite respirar los vapores) y colóquelo en una estufa a 110º C por 5 minutos. Observe las manchas de color púrpura que aparecen en el papel. Trace el perímetro de las manchas con lápiz establezca su Rf.

Preguntas: 1. 2. 3. 4. 5.

Identifique las manchas. En cuáles tubos ocurrió la reacción de transaminación? En los que la reacción no se llevó a cabo, porqué sucedió esto? Escriba la reacción de transaminación efectuada. Cuál es la importancia de las reacciones de transaminación en el metabolismo celular?

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Guía de Laboratorio de Bioquímica General

L.D. Caicedo

Preparación de los reactivos: 1. Amortiguador de fosfatos: 0.67 g/ 50 ml de NaH2PO4, (Solución A) 3.48g/ 100 ml de Na2HPO4 (Solución B) pH 7.4

Solución A

Solución B

Agua destilada

0.01 M M/ 15

4.75 ml 6.33 ml

20.25 ml 27 ml

Llevar a 100 ml Llevar a 200 ml

2. Alfa-cetoglutarato: 0.5 g se neutralizan hasta pH 7 con NaOH 1 N y luego se añaden 0.3 g de L-alanina. El volumen se completa hasta 50 ml con agua destilada.

84

Guía de Laboratorio de Bioquímica General

L.D. Caicedo

TRANSAMINACIÓN HOJA DE REPORTE FECHA: ____________________ SEMESTRE:_________ GRUPO: _____ Asistentes: (sólo los que han asistido a la práctica) ____________________________________________________________ _____________________________________________________________ 1. Qué apariencia tiene el macerado inicial? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

2. Cuál es la apariencia y el color del sobrenadante y el precipitado después de la centrifugación: __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

Reacción de transaminación: Prepárese cinto tubos de ensayo con las siguientes mezclas de soluciones. Adicionar siempre de último el extracto enzimático. Tubo # Solución Alanina - cetoglutarato Amortiguador M/15 pH 7.4 Agua destilada Alanina – acido glutámico Äcido glutámico Extracto enzimático

1

2ml 1ml 1ml

2

3

4

5

1 ml 2ml

1ml 2ml

1ml 2ml 1ml

2ml 1ml 1ml

1ml

1ml

85

Guía de Laboratorio de Bioquímica General

L.D. Caicedo

Antes de añadir la enzima al tubo # 2 caliente a ebullición durante 3 minutos. Agregue la enzima y añada 0.5 ml de ácido acético al 4%. Filtre en un tubo de ensayo y descarte el residuo. 3. Observa algún cambio en este tubo en cada procedimiento: __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

Los tubos 3 y 5 deben ser incubados por 30 minutos en un baño de agua mantenida a 30 – 35ºC terminada la incubación añádase 0.5 ml de ácido acético 4% y colóquelos en el baño de agua hirviendo por 3 minutos; luego filtrelos. El tubo # 4 no necesita filtración. 4. Qué observa después de agregar el ácido acético y colocar en ebullición durante 3 minutos: __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

5. De que color queda el extracto después de filtrarlo: __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

Efectúe la cromatografía de las soluciones de los 5 tubos. Realice un esquema del cromatograma, después de haber sido revelado con la nihidrina (Adhieran al informe el cromatograma realizado?

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Guía de Laboratorio de Bioquímica General

1

2

3

L.D. Caicedo

4

5

6. Calculen los Rf para cada uno de los aminoácidos. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

7. Qué concluyen con respecto a lo observado en esta práctica: __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

8. Qué otros aspectos desean destacar de la práctica realizada.

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Guía de Laboratorio de Bioquímica General

L.D. Caicedo

__________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

Anexe las fichas de seguridad de los reactivos y sustancias que se han utilizado en esta práctica. Anexar las respuestas del cuestionario de la página 74 y 75 Haga una breve discusión y conclusión de sus resultados.

Discusión: _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________

Conclusiones:

88

Guía de Laboratorio de Bioquímica General

L.D. Caicedo

1_______________________________________________ ________________________________________________ ________________________________________________ 2_______________________________________________ ________________________________________________ ________________________________________________ 3_______________________________________________ ________________________________________________ ________________________________________________ 4_______________________________________________ ________________________________________________ ________________________________________________

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Bibliografía: 1. Mulett, J., 1980. Curso de Biología Celular, UNIVALLE. Cali 2. Williams, B.L. y K. Wilson, 1981. Principios y técnicas de Bioquímica experimental, Omega, Barcelona. Pag. 137-155. 3. Freifelder, D., 1979. Técnicas de Bioquímica y Biología Molecular, Reverté, Barcelona, Pag. 421-450.

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ANEXOS MÉTODO DE LOWRY PARA DETERMINAR CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS

T

iempo requerido: 40 minutos Rango de sensibilidad: 5g/ml - 100g/ml

MATERIALES: Espectrofótometro Cubetas Pipetas Pipetas Pasteur Tubos (3-5 ml capacidad) Gradillas Vortex REACTIVOS: CuSO4.5H2O Na3C6H5O7(2H2O) (Cítrato de sodio) Na2CO3 NaOH Reactivo de Folin-Ciocalteu PROTOCOLO: Solución A: 100 ml 0.5 g CuSO4 1 g Na3C6H5O7(2H2O) (Cítrato de sodio) Adicionar agua destilada hasta completar 100 ml Esta solución puede ser almacenada a temperatura ambiente en forma indefinida. Solución B: 1000 ml 20 g de Na2CO3 4 g de NaOHAdicionar agua destilada hasta completar 1000 ml Esta solución puede ser almacenada a temperatura ambiente en forma indefinida Solución C: 51 ml 1 ml de la solución A 50 ml de la solución B Solución D: 20 ml 10 ml Folin-Ciocalteu phenol 10 ml de agua destilada

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PROCEDIMIENTO: 1. Lleve la solución de la muestra a 0.5 ml con agua destilada 2. Adicione 2.5 ml de la solución C 3. Mezcle y deje a temperatura ambiente por 5 – 10 minutos 4. Adicione 0.25 ml de la solución D y mezcle. 5. Después de 20 – 30 minutos lea A750. 6. Realice la curva de calibración con concentraciones conocidas de una proteína. 7. Determine la concentración de su muestra problema Pasos adicionales para purificar las proteínas cuando existen sustancias interferentes. Precipitación con Deoxychocolate- ácido tricloroacético También permite determinar la concentración de proteínas en soluciones diluidas (< 1 g/ml) Reactivos: 0.15% de deoxichocolate (DOC) y 72% de ácido tricloroacético (TCA) 1. A 1ml de la muestra de proteína añada 0.15% de DOC 2. Mezcle y deje a temperatura ambiente por 10 minutos 3. Agregue 0.1 ml de 72% TCA, mezcle y centrifuque por 5 – 30 minutos a 100-3000 xg. 4. Decante inmediatamente y remueva el precipitado con una pipeta. 5. redisuelva el precipitado directamente en la solución C

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PREPARACIÓN DE SOLUCION BUFFER FÓSFATO EN DIFERENTES PH Solución stock A: (0.2 M NaH2PO4) Disolver 27.6 g NaH2PO4 llevar a 1 L con agua destilada. Solución stock B: (Na2HPO4) Disolver 28.4g de Na2HPO4 y llevar a 1 L con agua destilada. PH

%A

%B

PH

%A

%B

5.8 5.9 6.0 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8

92.0 90.0 87.7 85.0 81.5 77.5 73.5 68.5 62.5 56.5 51.0

8.0 10.0 12.3 15.0 19.5 22.5 26.5 31.5 37.5 43.5 49.0

6.9 7.0 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8

45.0 39.0 33.0 28.0 23.0 19.0 16.0 13.0 10.5 8.5

55.0 61.0 67.0 72.0 77.0 81.0 84.0 87.0 89.5 91.5

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