Diagnostico microbiológico El diagnóstico microbiológico es el conjunto de procedimientos y técnicas complementarias empleadas para establecer la etiología del agente responsable de una enfermedad infecciosa y poder así proceder a su tratamiento y a tomar, en caso de que fuera necesario, las medidas correspondientes para evitar la diseminación del patógeno. Para llevarlo a cabo, se parte de la información acumulada por el médico y que se recoge en la historia clínica del paciente en forma

de

síntomas,

signos

y

diagnóstico

clínico

más

probable

a

su

entender.

El diagnóstico microbiológico en bacteriología puede clasificarse en distintos tipos:

Directos: Implican la demostración del agente patógeno, sus metabolitos o alguno de sus componentes

antigénicos

en

los

fluidos

orgánicos

del

paciente.

Indirectos: Implican la demostración de la huella que el agente patógeno ha dejado en su contacto con el sistema inmunocompetente del paciente. A la hora de llevar a cabo la identificación es imprescindible la labor del laboratorio, que nos aportará datos preliminares o definitivos sobre los agentes patológicos causantes de la afección. Para ello, se lleva a término un procedimiento ordenado que comprende:

1.- Toma de muestras (esputo, sangre, heces, orina, tejido, LCR, etc) que dependerán de la sospecha de procedencia de la afección.

2.- Observación al microscopio, si procede, de la muestra (fresco, coloración )

3.- Cultivo: Obtención de colonias aisladas.

4.- Identificación del género y de la especie mediante test bioquímicos, genéticos, inmunológicos.

5.- Test de sensibilidad (punto de corte, MIC).

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Diagnostico microbiológico

1.- A la hora de tomar las muestras microbiológicas, debemos de hacerlo con el mayor rigor posible, siendo para ello muy importante el cumplimiento de los siguientes requisitos que permitirán

garantizar

el

resultado

correcto

del

estudio:

1.

Elegir el material que refleje el proceso patológico.

2.

Evitar contaminación con la flora del paciente.

3.

Obtener volumen suficiente para observación microscópica y cultivo.

4.

Obtener la muestra, si es posible, antes de iniciar la terapia antimicrobiana.

5.

Transportar la muestra rápidamente al laboratorio.

Las muestras deben ser identificadas con una etiqueta adherida al envase y los datos anotados deben coincidir exactamente con los de la solicitud de examen dado por el médico tratante. Una vez tenemos las muestras adecuadas, podemos comenzar a realizar las técnicas diagnósticas

correspondientes.

Dentro

del

diagnóstico

microbiológico

incluiremos:

A.- Métodos Directos:  Observación microscópica  Cultivo e Identificación  Técnicas Inmunológicas: inmunofluorescencia, aglutinación, ELISA  Técnicas moleculares: hibridación – molecular (PCR)

2.- Examen microscópico (fresco, tinción): La visualización de los microorganismos patógenos es la técnica más evidente. Sin embargo, debido a su pequeño tamaño y a la similitud estructural existente entre algunos de ellos, se generan numerosas complicaciones. Para evitar el problema del tamaño, se utilizan sistemas de ampliación de imagen como microscopios. Las tinciones diferenciales y específicas, nos permitirán paliar el problema de la similitud. Habitualmente, la visión microscópica de los agentes patógenos no nos ofrecerá un diagnóstico definitivo, sino una orientación diagnóstica.

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Diagnostico microbiológico Los microscopios ópticos permiten ver bacterias, hongos y protozoos. Para ver virus es necesaria una resolución mucho mayor que sólo alcanza el microscopio electrónico. Tinción de gran : A pesar de que fue desarrollada en el siglo XIX la tinción de gram es la más utilizada en el diagnóstico microbiológico. De tal modo que la información que ofrece de la composición de la pared bacteriana es la base de todas las clasificaciones en este reino. Se trata de una tinción diferencial que distingue entre bacterias con pared gruesa (gram positivas= teñidas de violeta) y bacterias con pared fina y membrana externa (gram negativas= tiñe de rojo). Sin embargo, no todas las bacterias se tiñen mediante esta técnica, ya que hay algunas que son resistentes a ella, como las que se nombran a continuación:Mycobacterias, ya que están encapsuladas- Mycoplasmas, porque no tienen pared - Formas L, por la pérdida ocasional de la pared

Gram negativas (fucsia)

Gram positiva(azul)

Tinción de Ziehl-Neelsen: También es una tinción diferencial. Se denomina tinción ácidoalcohol resistente y es específica para unas bacterias con estructura de pared única, las micobacterias. La pared de las micobacterias no está basada en peptidoglicano como las bacterias gram positivas y gram negativas, sino en ácidos micólicos. Esta particularidad las hace resistentes a la decoloración con ácido y alcohol que no se produce en casi ningún otro

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Diagnostico microbiológico tipo bacteriano. La tinción de Ziehl-Neelsen utiliza tres reactivos. El colorante primario es la fucsina que tiñe toda la preparación de rojo brillante. Como mordiente se utiliza flameado de la preparación con el colorante. La solución decolorante elimina el colorante primario excepto el los bacilos ácido alcohol resistentes. (BAAR). Por último el azul de metileno tiñe de azul el resto de la preparación. Esta tinción es útil en la detección de bacterias del género Micobacterium en muestras de esputo. La presencia de bacilos rojos sobre fondo azul constituye un diagnóstico casi definitivo de tuberculosis.

3.- Crecimientos en cultivos e identificación: Denominamos cultivo al proceso de laboratorio por el que se induce el crecimiento cuantitativo de los agentes patógenos. Para conseguir su crecimiento de manera artificial es necesario un aporte nutritivo suficiente así como las condiciones físicas adecuadas para su desarrollo. Para ello se utilizan los medios de cultivo. Por lo general, todos los microorganismos necesitan unos elementos imprescindibles que incluyen fuentes de energía, de carbono, algunas sales y elementos y por supuesto agua. Algunos requieren además otras sustancias adicionales como vitaminas o aminoácidos esenciales para cada especie. Al igual que ocurre con su nutrición, no todos necesitan las mismas condiciones físicas para crecer, por lo que hay que individualizar la temperatura, la humedad, el pH y otras características si queremos que nuestros cultivos salgan adelante. En los laboratorios de microbiología podemos encontrar medios de cultivo líquidos y sólidos.

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Diagnostico microbiológico Inmunofluorescencia directa (ID): Es una de las técnicas más antiguas y de uso más difundido en el laboratorio clínico. El principio básico de la inmunofluorescencia directa . Muestras clínicas apropiadas son recolectadas y colocadas sobre portaobjetos donde se dejan secar y fijar. Luego se agregan anticuerpos específicos marcados con isotiocianato de fluoresceína que difunden a través de la membrana celular y se combinan con los antígenos (Ag) . La reacción antígeno anticuerpo (Ag-Ac) se visualiza con el microscopio de fluorescencia, por la aparición de fluorescencia de color verde manzana. Sin embargo la realización de la reacción es laboriosa, depende mucho de la calidad de los reactivos, requiere un microscopio de fluorescencia y de una persona con experiencia para llegar a un diagnóstico certero, así como una recolección y preparación de la muestra adecuada. Aun así, el método, en manos de una persona con experiencia resulta útil para la identificación, ya que nos proporciona un diagnóstico etiológico en el curso de una jornada de trabajo. Además puede estudiar varias muestras simultáneamente.

TEST DE AGLUTINACION

El test de aglutinación es un método simple, de un solo paso,

que a veces se usa para la detección de antígenos en muestras clínicas. Los ensayos de aglutinación, dependen de la fijación inicial de anticuerpos específicos sobre eritrocitos o partículas de látex. Luego este reactivo se incuba con la muestra clínica en la cual se investiga el antígeno y las partículas se aglutinan si el antígeno adecuado se encuentra presente. Estas pruebas en general se complementan o se confirman por medio de otros ensayos debido al elevado porcentaje de reacciones inespecíficas.

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Diagnostico microbiológico ENZIMOINMUNOANALISIS (EIA) Los EIA para la detección de antígeno se basan habitualmente en la captura del antígeno por anticuerpos específicos unidos a una fase sólida, en general el pocillo de una microplaca o una pequeña esfera de plástico. El antígeno presente en la muestra clínica se combina con el anticuerpo fijado a la fase sólida y el antígeno se detecta mediante la adición de otro anticuerpo específico conjugado a una enzima. La enzima conjugada suele ser peroxidasa o fosfatasa alcalina. El substrato para esas enzimas varía. En la reacción con la peroxidasa el substrato es un peróxido capaz de oxidar un compuesto químico incoloro que en su forma oxidada tiene un color característico. Por esta técnica se puede procesar gran número de muestras en forma rápida y automatizada, no requiriendo de un observador experimentado para leer los resultados, ya que estos se leen por medio de espectrofotómetros especialmente diseñados (lectores de ELISA) , siendo entonces una técnica más objetiva.

REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Una nueva técnica, llamada Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), para incrementar el número de moléculas de DNA blanco en las muestras. La técnica consiste en la detección de microorganismos. Recordemos que cuenta con su propio acido nucleido, lo que permite disitinguirlos a través de un fragmento de acido nucleido sintetizado y marcado, denominado SONDA, que posee una secuencia complementaria a las secuencias especificas buscadas . Esta sonda además puede ser marcada con sustancias radioactivas, fluorescentes u otros marcadores. Tiene una sensibilidad tan alta que puede amplificar una única molécula de DNA y una sola copia de genes puede ser extraída.

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Diagnostico microbiológico B. Métodos indirectos: Son aquellos que reconocen la respuesta inmune (humoral o celular) por parte del huésped: . Detección de anticuerpos específicos por técnicas inmunológicas (EIA, IFI, WB, etc.). Producción de anticuerpos in vitro. Evidencia indirecta del crecimiento, en lugar de buscar el antígeno busca el anticuerpo (AC) la huella inmunológica que el agente microbiano dejo en el organismo. En el curso de una infección varían las poblaciones de anticuerpos frente al agente infectante. En una primera fase la clase predominante suele ser IgM, mientras que con el transcurso del tiempo las IgM disminuyen hasta desaparecer o quedar a baja concentración residual y, en cambio, aumentan las IgG. La búsqueda de anticuerpos clase IgM es de utilidad para hacer diagnóstico de infección reciente en una sola muestra de suero extraída en el período agudo de la enfermedad. La seroconversión es el aumento del título de anticuerpos cuatro veces o más observado en dos muestras pareadas de suero. La primera muestra se obtendrá en el período agudo de la enfermedad y la segunda, 15 a 21 días después de la primera, en el período de convalesencia. La seroconversión es útil para establecer el diagnóstico retrospectivo, pero no para el diagnóstico temprano de una infección, puesto que debemos esperar al período de convalecencia para obtener la segunda muestra del suero.

Métodos: - I. F.I - ELISA indirecta

Inmunofluorescencia indirecta (IFI) es una variante de IF que mide la cantidad de anticuerpo en una muestra.

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Diagnostico microbiológico WESTERN BLOT (WB) Las técnicas inmunológicas de Inmunoblot están encontrando amplias aplicaciones en el diagnóstico virológico. Son particularmente útiles para el diagnóstico del HIV. La técnica de WB se basa en la separación electroforética de proteínas virales que son posteriormente inmovilizadas en papel de nitrocelulosa con el objeto de determinar la presencia de anticuerpos específicos contra cada una de esas proteínas.

3.- Test de sensibilidad: Pruebas de sensibilidad Antimicrobiana: para bacterias El antibiograma es la prueba microbiológica que se realiza para determinar la sensibilidad de una colonia bacteriana a un antibiótico o grupo de antibióticos. El antibiograma, una vez realizado, da la siguiente información: •

Grado de sensibilidad de la colonia bacteriana a un determinado antibiótico.

•

Diferencia de sensibilidad por parte de la colonia a diferentes antibióticos.

•

Con esta información, se clasifica el efecto del antibiótico sobre esa determinada

colonia en: Resistente (R), Intermedio (I) y Sensible (S). En el ámbito clínico, el estudio sobre la bacteria causante de la infección y sobre el antibiograma es entregado al médico responsable del paciente. Este último es quien se encarga de decidir el tipo de antibiótico adecuado, dependiendo de los resultados del antibiograma y de otros factores procedentes del paciente, como por ejemplo alergia a la penicilina. La cuantificación de la actividad in vitro de los antimicrobianos se evalúa habitualmente mediante algunas de las variantes de los métodos de dilución. La Concentración Mínima Inhibitoria (CIM) se define como la mínima concentración de antimicrobiano (en μg/mL) que inhibe el crecimiento visible de un microorganismo después de 24 horas de incubación a 37°C. La CMI se ha establecido como "gold Standard" frente a otros métodos que evalúan susceptibilidad antimicrobiana; además de confirmar resistencias inusuales, da respuestas definitivas cuando el resultado obtenido por otros métodos es indeterminado La Concentración Mínima Bactericida (CBM), se define como la mínima concentración de antimicrobiano que elimina a más del 99,9% de los microorganismos viables

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Diagnostico microbiológico después de un tiempo determinado de incubación (generalmente 24 horas) (8,9). En ocasiones se hace necesario determinar la actividad bactericida de un agente antimicrobiano, como es el caso de endocarditis, osteomielitis, meningitis o infecciones en pacientes inmunosuprimidos, existe la necesidad de establecer métodos de laboratorio que definan la actividad de estos agentes

Pruebas de sensibilidad a antifúngicos tienen como objetivo conocer si los microorganismos ensayados son sensibles o resistentes a los antifungico y sirven para elegir de forma óptima el tratamiento .

Prueba de sensibilidad antivirales: es realiza igual con antiretrovirales

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