Universidad Nacional del Nordeste Facultad de Medicina

Carrera de Especialización en Bacteriología Clínica

Aplicación de las Técnicas de Biología Molecular en el Laboratorio de Bacteriología

Genoma bacteriano • ADN – “Cromosómico” – “Extracromosómico” • Plásmidos • Transposones • Integrones

• ARN – ARNm – ARNt – ARNr

ADN

Plásmidos – Autorreplicantes – Tamaño y número variable – Heredables y Transferibles – Codifican funciones no esenciales Factor F (Pili sexuales) Factores R (Resistencia a antibióticos) Plásmidos Col (Bacteriocinas) Plásmidos de virulencia (Toxinas) Plásmidos metabólicos (Enzimas)

Transferencia de plásmidos Conjugación

Transposones • Secuencia de ADN que puede “saltar” de un sitio a otro del ADN • Pueden moverse dentro del ADN “cromosómico”, entre plásmidos o pasar de un plásmido al ADN “cromosómico” • Transposón simple o secuencia de inserción (IS) • Transposón compuesto (Tn)

Integrones • • •

Los integrones son plataformas de ensamblaje que incorporan cassettes genéticos y los convierten en genes funcionales asegurando su correcta expresión. Los integrones no son autotranferibles, pero al asociarse a transposones pueden moverse. Estructura – – – – – – –

Promotor de la integrasa Gen Intl1 que codifica la integrasa o recombinasa (Cataliza una recombinacion sitioespecifica) Zona attI (donde se insertan las IS) Promotor (uno o dos) para los genes de resistencia insertados Gen qacEΔ (Resistencia a compuestos de amonio cuaternario) Gen sul1 (Resistencia a sulfonamidas) Zona de lectura abierta Orf 5 (Función desconocida)

ARN • • • • •

Un esqueleto de azúcares y fosfatos ARN tiene uracilo en vez de timina. El uracilo se une a la adenina  ARN es una cadena simple Tres tipos: ARNm, ARNt y ARNr (70s)

Dogma Central de la Biología Molecular

Variaciones fenotípicas Cambios en las características de una bacteria sin que se altere su genoma Pueden ser – – – –

Morfológicas: tamaño, forma, flagelos Cromógenas: producción o no de pigmentos Enzimáticas: producción de enzimas inducibles Patogénicas: capacidad de producir enfermedad

Cepa lisa

Cepa rugosa

Variaciones genotípicas Mutaciones • • • •

Ocurren al azar Baja frecuencia Heredables No siempre se expresan

• • • • •

Sustitución de bases Adición de bases Pérdida de bases Alteración de muchos pares de bases Translocación

Estudio del ADN

Obtención del ADN • Medios sólidos (agar) • Medios Líquidos (caldos) • Muestras (Clínicas, alimentos)

Lisis celular • • • • • • •

Lisis alcalina Ebullición Shock térmico Proteinasa K Medios tensioactivos Sonicación Lisozima

Extracción del ADN • • • • •

Fenol/cloroformo Guanidina Sílice Separación magnética Filtración

Secuenciación

• A partir de un fragmento de ADN se determina la secuencia completa de bases

Enzimas de restricción • Reconocen una determinada secuencia de ADN (4-10 nt más o menos) y la cortan. • Se extraen de bacterias y poseen múltiples usos en Biología Molecular

Sondas de ADN

Sondas de ADN • Sustancia radioactiva –

32P

o 35S

• Compuesto fluorescente – Esteres de acridina

• Enzima – Peroxidasa o fosfatasa alcalina

• Sustancias de captura – Biotina (Avidina) o digoxigenina (Ac anti digoxigenina)

• Anticuerpos

Sondas de ADN • Hibridación in situ (FISH) – Muestra clínica + sonda marcada

Sondas de ADN • Detección directa en muestras clínicas – Neisseria gonorrhoeae – Chlamydias – Streptococcus Grupo A – Gardnerella

Sondas de ADN • Confirmación de cultivos – Mycobacterium spp – Streptococcus Grupos A y B – S. aureus – L. monocytogenes – N. gonorrhoeae – Campylobacter spp – H. influenzae

Sondas de ADN • Detección de genes de resistencia – Gen mec en Staphylococcus – Betalactamasas en enterobacterias

Chips o arrays de ADN

Chips o arrays de ADN

Clonalidad

Variación genotípica

Variación genotípica

Variación genotípica

Clonalidad

Tipificación molecular de Acinetobacter baumannii multirresistentes aislados de pacientes internados en la unidad de terapia intensiva de un hospital de adultos Tracogna MF; Presti SE; Gariboglio Vázquez ML; Merino LA

Clonalidad

Clonalidad

Clonalidad

Aplicaciones de la PCR en el Instituto de Medicina Regional

1. Detección de microorganismos no cultivables o de difícil crecimiento. • Mycoplasmas • Chlamydias • Helicobacter pylori • Mycobacterium tuberculosis

Helicobacter pylori 1

ureA

2

3

4

5

6

7

8

9

411 pb

Micoplasmas urogenitales 1

2

3

4

5

6

7

1500 pb

8

Mollicutes

500 pb 400 pb 300 pb

311 pb 281 pb

Ureaplasma Mycoplasma

200 pb

100 pb

ALTERNATIVA DIAGNOSTICA PARA MICROORGANISMOS DE DIFICIL AISLAMIENTO IMPLICADOS EN INFERTILIDAD MASCULINA Gómez, María V.; Deluca, Gerardo D.; Merino, Luis A.

2. Detección de genes de virulencia – Helicobacter pylori •

–

Escherichia coli • • • • •

–

ETEC: genes est, elt EPEC: genes eae, bfp EIEC: gen HipA EHEC: gen eae, stx EAEC: gen AggR

Vibrio cholerae • •

–

Genes cagA, vacA, babA2

Toxina CT: gen ctxA Proteína estructural de la fimbria: gen TCP

Staphylococcus aureus •

Leucocidina de Panton Valentine: gen PVK

Helicobacter pylori

Genotipificación de Helicobacter pylori en biopsias gástricas Medina MG, Medina ML; Lösch SL, Merino LA

Escherichia coli 1 ECEI

2

3

4

ECET

ECEP

ECEH

5 ECET

6 ECEA

7

E. coli verotoxigénica

Staphylococcus aureus 1

2

3

4

5

6

7

8

Luk-PV

Caracterización feno-genotípica de cepas de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina aisladas de fosas nasales de estudiantes de Medicina. Ford ML; Esquivel P; Lifschitz V; Gomez MV; Merino LA

4. Detección de genes de resistencia – Staphylococcus •

gen mecA

– Enterobacterias •

genes de betalactamasas

– Enterococcus •

genes vanA, vanB, van C

Staphylococcus aureus 1

2

3

4

5

6

7

8

mecA

Caracterización feno-genotípica de cepas de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina aisladas de fosas nasales de estudiantes de Medicina. Ford ML; Esquivel P; Lifschitz V; Gómez MV; Merino LA

Enterobacterias 1

CTX-M

2

3

4

5

6

7

pb

5. Detección de patógenos en alimentos o en el ambiente – – – – –

Salmonella Shigella Listeria Campylobacter E. coli 0157

Campylobacter M

1

2

3

4

5

6

7

8

9 10

773 pb C. jejuni 364 pb C. coli

Detección e identificación molecular de especies termotolerantes de Campylobacter Gariboglio Vázquez ML, Tracogna MF, Lösch LS, Merino LA

¡GRACIAS POR SU ATENCIÓN!