Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II Editores: Gabriela Levitus, Viviana Echenique, Clara Rubinstein, Esteban Hopp y Luis Mroginski

Consejo Argentino para la Información y el Desarrollo de la Biotecnología

Ediciones

Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

Editores: Dra. Gabriela Levitus, Dra. Viviana Echenique, Dra. Clara Rubinstein, Dr. Esteban Hopp Ing. Agr. Luis Mroginski.

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

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Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

Índice

Prefacio ...............................................................................................................................

6

Agradecimientos ................................................................................................................

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Lista de Autores ..................................................................................................................

7

Prólogo a la Primera Edición. Dr. Francisco García Olmedo .............................................

11

Prólogo a la Segunda Edición. Dr. Francisco García Olmedo ...........................................

11

Parte I: Herramientas Básicas ...........................................................................................

15

Capítulo 1: Establecimiento de cultivos de tejidos vegetales. Luis Mroginski, Pedro Sansberro y Eduardo Flaschland ……………………………………………………………………………………….

17

Capítulo 2: Morfogénesis. Silvia Radice .………………………………………………….……………….

26

Capítulo 3: La citogenética molecular e inmunocitogenética en el estudio de los genomas vegetales. Guillermo Seijo, Graciela I. Lavia, Germán Robledo, Aveliano Fernández y Viviana G. Solís Neffa. ..................................................................................................................................................

34

Capítulo 4: Herramientas básicas de ingeniería genética. Ingrid Garbus, Marisa Gómez y Viviana Echenique. ................................................................................................................................

47

Capítulo 5: Marcadores moleculares. María Carolina Martínez, Marcelo Helguera y Alicia Carrera.

70

Capítulo 6: Construcción de mapas de ligamiento genético, localización de genes y regiones cromosómicas asociadas a caracteres de interés en plantas. Gerardo D. L. Cervigni, Juan Pablo A. Ortiz y Sergio E. Feingold. .........................................................................................................

86

Capítulo 7: Genómica. Viviana Echenique, Juan P. Selva, Mauro Meier, Pablo Roncallo y Gustavo Schrauf. ..............................................................................................................................................

100

Capítulo 8: Transcriptómica. Silvina Pessino y Silvina Felitti. ..........................................................

121

Capítulo 9: Proteómica. Paula Casati y María F. Drincovich .............................................................

136

Capítulo 10: Metabolómica. Fernando Carrari, Telma E. Scarpeci, Luciano A. Abriata, Alejandro J. Vila y Estela M. Valle. .........................................................................................................................

146

Capítulo 11: Metagenómica. O. Mario Aguilar y Daniel H. Grasso. ...................................................

157

Capítulo 12: Bioinformática aplicada a la biotecnología vegetal. Norma Paniego, Ruth Heinz, Paula Fernández, Verónica Lia, Corina Fusari. ...................................................................................

170

Parte II: Métodos para generar y analizar diversidad

183

Capítulo 1: Polinización y fertilización in vitro. Susana Cardone, Gladys Pérez Camargo y Aurora Picca. ..................................................................................................................................................

185

Capítulo 2: Hibridación somática. Pablo Polci y Pablo Friedrich. ....................................................

197

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Capítulo 3: Epigenética y evolución!"#$%&'()"*!"+&,-.//$"0"1&'/),"2!"+&'3/""!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

211

Capítulo 4. Mutagénesis, TILLING y EcoTILLING. Alberto Prina, Alejandra Landau, María Gabriela Pacheco y Esteban Hopp ...................................................................................................................

217

Capítulo 5: Variación somaclonal. Susana Cardone, Sofía Olmos y Viviana Echenique. ...............

229

Capítulo 6: Aplicación de la transformación genética al mejoramiento vegetal. Marina L. Díaz, Diego C. Zappacosta, Pascual M. Franzone y Raúl D. Ríos ...............................................................

243

Capítulo 7: Usos del silenciamiento génico para el análisis funcional de genes candidatos. Cecilia Vázquez Rovere, Ariel Bazzini, Cecilia Rodríguez, Natalia Almasia y Sebastián Asurmendi ..

259

Capítulo 8: Análisis de experimentos biológicos. Sofía Olmos, Miguel DiRenzo, Mercedes Ibáñez, Nélida Winzer ..............................................................................................................................

271

Capítulo 9: Métodos multivariados para estimar variabilidad genética. Nélida Winzer, Miguel DiRenzo, Sofía Olmos y Mercedes Ibáñez. .........................................................................................

283

!"#$%&'''(&)*$+,+-&."#"&"/%0%#"#&.#+1#"2"-&,%&2%3+#"24%5$+&%&4,%5$46/"/475&8"#4%$"0

295

Capítulo 1: Obtención de plantas doblehaploides. Pablo Polci, Verónica Conti y Rubén Miranda y Nicolás Gear. ....................................................................................................................................

297

Capítulo 2: Aplicaciones de los marcadores moleculares. Alicia Carrera, Gabriela Tranquilli, Antonio Garayalde y Marcelo Helguera. ..................................................................................................

311

Capítulo 3: Marcadores moleculares y mejoramiento genético de cultivos. Carlos Sala, Mariano Bulos, Analía Fresco y Emiliano Altieri. ..........................................................................................

325

9".:$;0+&%8$%)"(.".,6."38"(.",$B/)"0"N&8"$:7'.B8&()"/&,":9,"($C.',&,"C.'6$.86.,"(."8-.,6'&"C$(&" cotidiana sin que se haya aceptado que un mínimo de estos conocimientos debería formar parte integral de la cultura general. La ignorancia de los hechos básicos relativos a nuestra herencia B.8>6$%&")"&"8-.,6'&"&/$:.86&%$8"&"/&"6)'7.=&"(."/),"%$.86?3%),"0"&"/&"($%6&(-'&"(." los medios de comunicación. Es preciso despejar este caos si queremos entendernos a partir de la ciencia, y no a sus espaldas. Q>':$8)," 6&/.," %):)" )'B&8$,:)," B.8>6$%&:.86." :)($3%&()," IJK+,L@" &/$:.86)," 6'&8,B>8$cos, ingeniería genética, ADN recombinante, transferencia génica, clonación, alimentos naturales, mejora genética e, incluso, biotecnología, han invadido nuestro lenguaje cotidiano sin orden ni concierto. A estas alturas empieza a ser difícil normalizar la situación, pero tratemos de contribuir a ello. R&"(.38$%$/@",.&8">,6&,"%>/-/&,")".8=$:&,"&$,/&(&,!"S&5)".,6&"(.38$%$6$%&",-A,$B-$.86."N&"$()"&U&($.8()":)($3%&%$)8.,".V6.8,&,"0",-,6&8%$&/.,!" Lo importante es la naturaleza de los cambios introducidos y no los métodos empleados para ello. De hecho, la ingeniería genética es sólo uno de esos métodos - una modalidad más de me5)'&"B.8>6$%&"O"0",6)(),@")A5.6$C),"0"/)B'),"(."/&"&/6.'&%$*,+2)*&-+&8%=% ;#,#&% se hace uso del cultivo de tejidos porque repre&#)/2% ")% &*&/#-2% #B!#'*-#)/23% 5"#% &*-!3*(,2% la complejidad generada por los fenómenos de correlación entre las distintas partes que normalmente están presentes en una planta entera. El explante que se usará estará condicionado por lo que se quiere estudiar. Un buen ejemplo lo constituye el cultivo de ovarios fecundados del tomate para estudiar los requerimientos nutricionales durante el crecimiento $#%3+&%?'"/+&8%=&*-*&-++$4)8% El cultivo de discos de tallos brindó una valiosa ayuda para estudiar la rizogénesis in vitro. @%Obtención de plantas con sanidad controlada. Es muy común la utilización del cultivo de tejidos para la obtención de plantas libres de virus (ver VIII.-9). El explante ideal para ello es el meristema (dependiendo de la especie, de 0,2-0,5mm de longitud) consistente del domo y de un par de primordios foliares. @%Micropropagación. En este caso dependerá del sistema que se quiere utilizar. Si lo que se quiere explotar es la brotación de meristemas, los ápices terminales y los segmentos uninodales de ramas jóvenes constituyen excelentes explantes. En este caso el cultivador de tejidos debe conocer perfectamente la 7*+3+>62%$#%32%'#!'+$",,*4)%$#%32%%!32)/2%!2'2% aprovechar aquellos explantes que en forma natural son propágulos. En cambio, si se pretende micropropagar mediante el empleo de &#-*332&%&*)/C/*,2&%D;#'%E2'/#%FG32% general se puede decir que cuando más joven e indiferenciado se encuentre el explante a cultivar, mejor será su respuesta in vitro. Es por ello que los meristemas apicales y axilares son ampliamente usados en numerosas especies. En el caso de la micropropagación de plantas leñosas, la edad del explante es un factor ,'6/*,+8%P*%3+&%/#.*$+&%&+)%.4;#)#&"'2)% TU##)LHV% DV2)*&-+&% #)$4(/+&8% X)+% % $#% #&/+&% compuestos es el PPM (Plant Preaservative Mixture). Otro ejemplo es el denominado G-1, un compuesto derivado de los furfurales de la ,2Q2%$#%2IA,2'8%K&/#%,+-!"#&/+#)/#% >#3*(,2)/#% D#)% #3% ,2&+% $#% -#$*+&%% semisólidos)

Sacarosa

30.000,00

50.000,00

20.000,00

PH

5,7

5,8

5,5

1)

Composición en mg·L

-1- 1.

MS = Medio de Murashige y Skoog (Physiol. Plant. 15: 473 - 97. 1962) N6 = Medio de Chu,C.C., Wang,C:C., Sun,C.S., Hsu, C., Yin, K,C., y Chu, C. (Sci. Sinica 18: 6 59- 668. 1975) B5 = Medio de Gamborg, O.L., Miller,R.A. y Ojima, K. (Exp.Cell Res. 50: 151 - 158. 1968)

@%[/'+&%,+-!"#&/+&8 Fuente de carbono: Prácticamente todos los cultivos son heterótrofos (comparativamente unos pocos son autótrofos) y por ende necesitan del suministro de una fuente de carbono. La sacarosa, en concentraciones de 2 al 5%, es el azúcar más utilizado. En algunos medios se la reemplaza por glucosa. En casos particulares se cita el empleo de maltosa o galactosa. También myo-inositol (100 mg/L) suele ser incorporado a los medios resultando un mejor crecimiento de los cultivos. Nutrientes minerales: Los medios de cultivo deben suministrar los mismos macro y micronutrientes que son esenciales para el crecimiento de las plantas enteras. En general se destacan las concentraciones relativamente

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altas de nitrógeno y potasio. El nitrógeno es suministrado en forma de amonio y/o nitrato. También se pueden utilizar urea, glutamina y ,2)2%1*$'+3*I2$28%K&%?")$2-#)/23%5"#%#3%1*#rro sea incorporado juntamente con un agente 5"#32)/#%DY2HK\T=:")2&% ocasiones para el cultivo de meristemas o para 32%#3+)>2,*4)%$#%7'+/#&8%K3%=^=*,+% #&% $#% ;*/23% *-!+'/2),*2% $"rante la aclimatación, teniendo en cuenta que la disminución de la transpiración será gradual y dependerá de la rehabilitación de los estomas, 2&6% ,+-+% /2-7*C)% $#3% $#&2''+33+% $#% 32% ,"/6,"la. El equipamiento necesario estará sujeto a la especie, pudiendo utilizarse desde túneles de polietileno para plantas que posean un elevado control de la transpiración (por ej. Malus pumila o Agave tequilana) o bien, a través del empleo de cámaras climatizadas (Fig.1) equipadas con sensores que permiten un descenso paulatino de la humedad relativa. En algunos casos puede resultar necesaria la aplicación exógena de =^=%D1+'-+)2%*);+3",'2$2%#)%#3%,+)/'+3%$#3%,*#rre de los estomas) o bien, el empleo de sustancias antitranspirantes que forman una capa &#-*!#'-#273#%#)%32%&"!#'(,*#%$#%32%1+.28%K)% este último caso deberán tomarse algunas precauciones debido a que pueden observarse re2,,*+)#&%$#%(/+/+B*,*$2$8 Resulta imprescindible evitar la exposición a temperaturas extremas tanto en la fase aérea como en el substrato. Mediante el empleo de extractores y/o acondicionadores de aire combinados con un sistema de niebla, es posible establecer la temperatura de la fase gaseosa entre los 25 y 30 ºC durante la estación estival, mientras que en la época invernal es necesario, a veces, el empleo de mantas térmicas o serpentinas, sea de agua o aire caliente a nivel

del substrato, para mantener la temperatura por encima de los 18-20 ºC. Sin lugar a dudas, la opción más económica es el empleo de la luz natural, disminuyendo su irradiancia (20-50%) mediante el agregado de mallas de sombreado («saram»). No obstante, en aquellas latitudes donde el nivel medio de 3"I% )2/"'23% #&% 72.+% 0% 3+&% $62&% &+)% ,+'/+&% $"rante una parte considerable del año, la luz ar/*(,*23%!"#$#%&#'%2!3*,2$2%,+-+%,+-!3#-#)/+% $#%32%3"I%)2/"'238%92&%3R-!2'2&%/"7"32'#&%O"+'#&,#)/#&% $#3% /*!+% M3"I% % $62N% &+)% #-!3#2$2&% #)% 1+'/*,"3/"'2% !2'2% !'+3+)>2'% #3% ?+/+!#'6+$+8% =&*-*&-+'2$#,#)% 23% F)>8% E273+%=8% 9")2% !+'%32%!32)*(,2,*4)%$*>*/23%$#%32%,R-2'2%$#%2,3*-2/2,*4)8%=% 32% P#,'#/2'62% b#)#'23% $#% J*#),*2% y Técnica (UNNE) y al Establecimiento La Ca,1"#'2% !+'% #3% 2!+'/#% ()2),*#'+% '#,*7*$+% !2'2% construir la misma. 8. Lecturas Recomendadas bK[ibK"32$+'#&% $#3% ,'#,*-*#)/+% $#7*$+% 2% que esos compuestos eran aún desconocidos. Los avances en el cultivo de tejidos vegetales ?"#'+)%-"0%3#)/+&%#)%&"&%*)*,*+&8%K)%WhS]"32,*4)%5"6-*,2%#)%32%!2'/#%2C'#2%0% #)%32%'26I8%T'272.+&%!+&/#'*+'#&%#)%,233+&%$#%32% misma especie, con el agregado de cinetina, 3.- Histología de la morfogénesis la primera citocinina descubierta, permitieron $#-+&/'2'%5"#%32%$*?#'#),*2,*4)%$#%7'+/#&% W% =#)#ral, cuando se reducen las cantidades de auxina y citocinina o se elimina la auxina. Las células embriogénicas desarrollan como embriones cuando las condiciones experimentales permiten que estas expresen su potencial. Pueden ocurrir dos condiciones ontogénicas diferentes, es decir que el origen de los embriones sea unicelular o pluricelular. En el caso de iniciarse a partir de una célula, la -*&-2%&#%26&32%$#%32&%$#-R&%!+'%")2%*-!+'/2)/#%-+$*(,2,*4)%#)%&"%!2'#$%,#3"32'%3-1%$#%^=E%WV%B8%B, yemas 2$;#)/*,*2&%DO#,12&:%#)%R!*,#&%$#%Fragaria x ananassa Duch. cultivados en Boxus + 0,1 mg l-1%$#%F^=%s%V8e% mg l-1%$#%^=E%s%V%3-1%$#%b=3 4 x. C'"!+%$#%,C3"32&%#-7'*+>C)*,2&%DO#,12&:%#)%Codiaeum variegatum (L) Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurón. 20 x. D, embriones somáticos en Codiaeum variegatum (L) Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurón 10 x. E, embriogénesis secundaria en Codiaeum variegatum (L) Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurón 10 x.

de los estratos procambiales y de manera sucesiva el desarrollo del ápice radical. El ápice de tallo se desarrolla más tarde, durante la etapa cotiledonar. En los embriones somáticos de algunas especies hay una etapa intermedia entre la globular y corazón llamada oblonga, que corresponde a la individualización del ápice de

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32%'26I%0%23%!'+,2-7*"-%#)%'#&!"#&/2%2%32%#3+)gación axial del embrión somático debido al transporte de auxinas (Fig 1 C). Los embriones de origen multicelular obtenidos por budding muestran la misma ontogenia que 3+&%,*>4/*,+&% W% j:8% P*)% embargo, debido al bajo porcentaje de embriones que llegan a esta etapa, esta tarea es casi imprescindible para una correcta evaluación de las respuestas encontradas con los diversos medios de cultivo empleados. Comparados con los embriones cigóticos de la misma especie, los embriones somáticos frecuentemente desarrollan de manera anormal +% &+)% *)-2$"'+&8% 92% 2)+-2362% -R&% ?'#,"#)/#mente encontrada es la formación doble o triple del sistema vascular, causada por la pobre polarización del transporte de auxinas. También se puede encontrar un contenido excesivamente alto, reducido o ausente de las reservas de almidón y/o proteicas, que el meristema apical o radical no estén desarrollados o que la embriogénesis sea repetitiva o secundaria (Fig 4 E). La falta del meristema apical o una escasa deposición de sustancias lipoproteicas en los embriones somáticos de algunas especies no $#7#% &#'% /+-2$2% ,+-+% ")2% 2)+'-23628% K&/+% !"#$#% &#'% ")% &6)/+-2% $#% *)-2$"'#I% $#7*$+% a la rápida formación de los mismos. En este caso una etapa intermedia que permita la maduración de las estructuras formadas permitirá incrementar el porcentaje de embriones somáticos capaces de germinar. 4.- Factores que afectan los procesos morfogénicos Los cuatro principales factores que condicionan la obtención y el crecimiento de nuevos órganos in vitro son: 4.1.- el genotipo 4.2.- las ,+)$*,*+)#&% 5"6-*,2& seleccionadas para realizar el cultivo. 4.3.- las ,+)$*,*+)#&% ?6&*,2& seleccionadas para realizar el cultivo. 4.4.- el explante. 4.1.- El genotipo es un factor determinante en todos los procesos morfogénicos, desde la capacidad del explante para su establecimiento en condiciones in vitro a la proliferación de callo, o la diferenciación y crecimiento de nuevos órga-

nos. Por esta causa, no es posible generalizar -#/+$+3+>62&%+%!'+/+,+3+&%$#%/'272.+%$#7*$+%2% 5"#%3+&%-#$*+&%$#%,"3/*;+'#>2$+%$#% thidiazurón. El genotipo y el tipo y concentración de reguladores del crecimiento empleados están estrechamente relacionados. 4.2.3.- antibióticos. En procesos de transformación con Agrobacterium tumefaciens es muy común el agregado de antibióticos del tipo cefotaxime; kanamicina y carbenicilina para la eliminación de la bacteria. En explantes de hoja de diferentes cultivares de Malus domestica se encontró que 250 mg L–1 de cefotaxime 2"-#)/2)% &*>)*(,2/*;2-#)/#% 32% '#>#)#'2,*4)% de brotes mientras que 500 mg L–1 de carbenicilina promueven la formación de callo y la

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kanamicina inhibe los procesos morfogénicos. 4.2.4.- carbón activado. En general se usa para adsorber compuestos tóxicos de la micro atmósfera gaseosa o el exceso de reguladores del crecimiento presentes en el medio de cultivo pero K8`8%E#//#'&&+)%0%&"%#5"*!+%$#%,+327+'2$+'#&%$#% 32%PU#$*&1%X)*;#'&*/0%+?%=>'*,"3/"'##)/#% >#3*(,2)/#% -R&% "/*3*I2$+% #)% #3% ,"3/*;+% in vitro% #&% #3% 2>2'2&% -2rinas. Las diferentes calidades existentes en el -#',2$+% -+$*(,2)% 32% #B!'#&*4)% -+'?+>C)*,2% debido a que pueden contener sustancias inhibitorias o promotoras del crecimiento. Tal es el caso del cultivo de hojas de Actinidia chilensis (en medio de MS con el agregado de 0,1 mg/L de =F=%s%W%->_9%$#%^=E:%,"02%'#&!"#&/2%-+'?+>C)*ca varió según el tipo de agar utilizado. Cuando #3%>#3*(,2)/#%#-!3#2$+%?"#%J1"7"/L2>2'2$+% $#% 2>2'% PFbm=% R sólo se indujo la proliferación de callo. K)%,2&+%$#%#,,*+)2'%-#$*+&%$#%,"3/*;+%365"*$+&C)*,2% +7&#';2$2% ;2'62% $#%-2)#'2%,+)&*$#'273#8%K3%,"3/*;+%365"*$+%#&%*-prescindible cuando se busca promover la morfogénesis indirecta a través de suspensiones celulares. Para ello es necesario cultivar los callos #)%-#$*+%365"*$+%,+)%2>*/2,*4)%!2'2%!#'-*/*'%5"#% las células se disgreguen y puedan diferenciar '26,#*(,2$+8%=%&"%;#IA)%32%'#&piración y la actividad fotosintética de las plantas. En condiciones de oscuridad, el CO2 incrementa mientras que en condiciones de luz, disminuye. En trabajos realizados con Ficus lyrata se han encontrado concentraciones variables, entre 0,5 % y 8,5 %, según el tipo de sello o tapa empleados. Concentraciones superiores al 1 %, que son generalmente tóxicas en condiciones in vivo, probablemente no fueron limitantes para la actividad fotosintética. La presencia de etileno en condiciones in vitro promueve diversas respuestas. Su acumulación tiene efectos inhibitorios sobre el cultivo de células, callos y anteras, La cantidad de etileno producida in vitro%;2'62%,+)%32%#&!#,*#%3–1) durante 20 minutos (Fig 5).

Figura. 5: Esquema de las diferentes respuestas morfogénicas obtenidas después de seis semanas de cultivo in vitro de hojas de Camellia japonica L. según la porción de la lámina. 1, callo organogénico. 2 embriogénesis somática directa. 3, regenera,*4)%$*'#,/2%$#%'26,#&8%]'+U/1% 2)$% $#;#3+!-#)/%*)%;*/'+8%E32)/%b'+U/1%i#>"32/*+)%Weg%WLWc8 \#%`3#'q%b8l8#neralmente se emplean tejidos meristemáticos porque presentan un alto índice mitótico (i.e. la razón entre el número de células en división y el número total de células observadas). Los órganos (ápices radicales o caulinares, óvulos, etc.) son pre-tratados con diversas sustancias que inhiben la formación del huso mitótico (col,1*,*)262%D$#%-#/2,C)/'*,+&%2%&"7-#/2,C)/'*cos, subtelocéntricos, acrocéntricos y telocén-

tricos) y, dentro de cada tipo, según su tamaño (de mayor a menor) ubicando los centrómeros alineados a una misma altura y los brazos cortos hacia arriba. En las plantas diploides (Fig. 1C y E) y alopoliploides, el cariotipo se compone de pares de cromosomas homólogos; mientras que en las autopoliploides (Fig. 1D y F) se compone de grupos de tres o más cro-+&+-2&% $#% 2,"#'$+% ,+)% #3% )*;#3% $#% !3+*$628% El orden que ocupa en el cariotipo cada par o

FIGURA 1. A-D: Metafases mitóticas teñidas con coloración de Feulgen. A: Lathyrus macropus, 2n = 2x = W]8% H=:8%=$#-R&"2)*)2%0%,*/+&*)2%3+%&+)%,+)%Jm=3 D,'+-+-*,*)2%=3). Las bandas pueden ser de tamaño e intensidad diferentes y presentar una distribución particular sobre los cromosomas de un complemento generando un patrón de bandeo ,2'2,/#'6&/*,+%Dj*>8%H^:8%K&/2&%/C,)*,2&% de bandeo cromosómico han permitido, en -",1+&%,2&+&'#&*4)8 La diferenciación lineal de los cromosomas por técnicas de bandeo no siempre es evidente en todos los grupos de plantas y, aún en aquellas especies que presentan buenos patrones de bandas, a menudo no se cuenta con ")% )A-#'+% &*>)*(,2/*;+% $#% -2',2$+'#&% ,+-+% para integrar los mapas de ligamiento con los -2!2&%?6&*,+&8%92%!+&*7*3*$2$%$#%!+&*,*+)2'%&#cuencias particulares sobre los cromosomas y, de esta forma, generar un gran número de marcadores cromosómicos ha sido posible gracias al desarrollo de las técnicas de hibridación in situ, cuyo uso se ha generalizado a partir del desarrollo de sistemas de marcado y de detección de sondas no radiactivas. 9$:';4'"#,'*7$'7$&'=(42&,27-#)/+% $#3% =\Y% ,'+-+&4-*,+% Dsecuencia blanco) y una secuencia complementaria marcada (sonda). La misma se aplica a preparaciones de células somáticas o germinales, previamente incubadas con enzimas (celulasa, pectinasa y citohelicasa) que remueven las paredes celulares. Las preparaciones son tra/2$2&%,+)%=iY2&2%=%!2'2%#;*/2'%1*7'*$2,*+)#&% *)#&!#,6(,2&% $#% 32% &+)$2% ,+)%=iY&% 0+B*>#)*)2'2?62%-+)+,'+-R/*,2% por cada sonda utilizada y una del complemen/+% ,'+-+&4-*,+% /#Q*$+% ,+)% \=EF% +% *+$"'+% $#% !'+!*$*+8% K&/2&% -*,'+?+/+>'2?62&% &+)% &"!#'puestas e integradas en una sola imagen. El posicionamiento relativo de las señales con respecto al centrómero, los telómeros u otros marcadores cromosómicos permite mapear con precisión cada sonda sobre el complemento cromosómico y representarlas en un idiogra-28%=% $*?#'#),*2% $#% 32% ,*/+>#)C/*,2% ,3R&*,262%,'+-+sómica y, por lo tanto, es posible reconocerlos en diferentes estados del ciclo celular.

Desde el desarrollo inicial de la técnica de FISH, se han mejorado sustancialmente tanto la sensibilidad%D*8#8%#3%/2-2Q+%-6)*-+%$#%")2% secuencia que puede ser detectada bajo el microscopio) como el poder de resolución espacial%D*8#8%32%$*&/2),*2%?6&*,2%-6)*-2%2%32%5"#% $+&%&#,"#),*2&%!"#$#)%&#'%*$#)/*(,2$2&%,+-+% independientes). Bajo condiciones óptimas de hibridación y de detección, la sensibilidad de esta técnica depende de la accesibilidad de la sonda a la región complementaria sobre el =\Y8% 92% -*&-28% 2C). Otra de las sondas de secuencias conservadas y repetidas en tándem que se emplean habitualmente en experimentos de FISH son las teloméricas (Fig. 2D). Las mismas son utilizadas tanto para establecer con precisión 3+&%36-*/#&%,'+-+&4-*,+&%,+-+%!2'2%'#;#32'%*)versiones que comprenden los segmentos cromosómicos distales y la ocurrencia de fusiones

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cromosómicas. Las sondas de secuencias no conservadas repetidas en tándem son muy A/*3#&%!2'2%#3%$#&2''+33+%$#%-2',2$+'#&%#&!#,6(,+&%$#%,'+-+&+-2&%0%$#%,+-!3#-#)/+&%,'+-

mosómicos; mientras que las de secuencias repetidas dispersas%3+%&+)%!2'2%$#()*'%'#>*+nes cromosómicas o genomios, en particular, !2'2%*$#)/*(,2'%3+&%>#)+-2&%!2'#)/23#&%#)%3+&%

FIGURA 2. Ag%^2)$#+%=>LY[i%#)%")2%-#/2?2&#%$#%Arachis hypogaea%$+)$#%&#%*$#)/*(,2)%32&%'#>*+)#&% +'>2)*I2$+'2&%$#3%)",3#+3+%#)%-2''4)%+&,"'+%DO#,12&:8%B: bandeo con quinacrina que distingue las regio)#&%1#/#'+,'+-R/*,2&%'*,2&%#)%=T%D#)%2-2'*33+%*)/#)&+:%$#%32&%'#>*+)#&%#",'+-2/*,2&%D2-2'*33+%!R3*$+:%#)% los cromosomas prometafásicos de Oziroe argentinensis. C: FISH doble en una metafase de A. batizocoi en donde se localizan los genes ribosomales 5S (en verde) y 45S (en rojo), la contratinción realizada con \=EF%$*?#'#),*2%72)$2&%1#/#'+,'+-R/*,2&%,#)/'+-C'*,2&%'*,2&%#)%=T%D#)%732),+:%$#%32&%!+',*+)#&%,'+-+sómicas eucromáticas (en azul). D: FISH que revela las regiones teloméricas (verde) de A. hypogaea. E: jFPn%5"#%'#;#32%32%$*&/'*7",*4)%!'#?#'#),*23%$#%")%'#/'+#3#-#)/+%#)%#3%>#)+-2%=%$#%A. hypogaea. F: GISH doble sobre una metafase de A. hypogaea%"/*3*I2)$+%,+-+%&+)$2&%=\Y%>#)4-*,+%$#%A. ipaensis (rojo) y de A. duranensis%D;#'$#:%5"#%$#-"#&/'2%32%,+)&/*/",*4)%23+!+3*!3+*$#%$#3%,"3/6>#)+%0%32&%#&!#,*#&%$*!3+*$#&% progenitoras más probables. G y Hg%=iYLjFPn%#)%2)/#'2%0%+;2'*+%$#%Paspalum notatum utilizando como &+)$2%")%=iY%-2',2$+%$#%#B!'#&*4)%$*?#'#),*23%0%/#.*$+L#&!#,6(,2%#)%!32)/2&%2!+-6,/*,2&%!#'+%)+%&#B"23#&8%92%*)/#)&*$2$%$#3%,+3+'%;*+3#/2%*)$*,2%,2)/*$2$#&%'#32/*;2&%$#3%=iY%2)23*I2$+%!'#&#)/#%#)%3+&%$*?#'#)/#&% /#.*$+&%$#%!32)/2&%2!+-6,/*,2&8%92%72''2%'#!'#&#)/2%e%-*,'2&%#)%=#)4-*,+%,3+)2$+%#)%;#,/+'#&#)#'2% !2/'+)#&%$#%&#Q23#&%$*&!#'&2&%+%*)#&!#,6(,2&% D72,q>'+")$:8%=%!#&2'%$#%#&/2%$*(,"3/2$+%0%#3%-2)6%Dj*>8%Hj:8%[/'2% $#% 32&% ;#)/2.2&% $#% 2)23*I2'% 3+&% 167'*$+&% 0% 3+&% alopoliploides con GISH doble o múltiple, consiste en la capacidad que ofrece esta técnica para detectar translocaciones intergenómicas, las que pueden pasar inadvertidas con los métodos convencionales de análisis genómico. Aplicado a células meióticas, GISH proporciona un método preciso para el análisis de los apareamientos cromosómicos que ocurren en los genomas híbridos. El estudio de la capacidad de los cromosomas de aparearse en meiosis es el procedimiento utilizado tradicionalmente para establecer las relaciones genómicas entre diferentes especies. Sin embargo, 27$ 3=,F#&$ ,(7%+=4#,'(72&$ 32#)C'*,2&% 02% 5"#% !#'-*/#g% W:% ,+)('-2'% #3% +'*>#)% 167'*$+% de la progenie, 2) determinar el origen de los cromosomas en las distintas generaciones, #)%!2'/*,"32''#&2)/#&#)C/*,+&% #&% #3% resultado de la distribución no al azar de los eventos de crossing-over a lo largo de los cromosomas. En este marco, el desarrollo de los mapas cromosómicos ha cobrado importancia debido a que, dependiendo de las regiones cromosómicas que se analicen y a la frecuencia de recombinación propia de cada una, los mapas genéticos pueden ser mejores o peores #&/*-2$+'#&%$#%32&%$*&/2),*2&%?6&*,2&%'#23#&8% Por tal motivo, en varias especies modelo se ha puesto especial énfasis en el desarrollo de marcadores cromosómicos por las técnicas de FPn%D!'*),*!23-#)/#%^=JLjFPn2$2%,+)%23>A)%12!/#)+%+%O"+'+cromo, la cual es precipitada masivamente por la HRP y unida en forma covalente al sitio de detección inicial. El sistema resultante es detectado mediante anticuerpos conjugados con fosfatasas alcalinas (para detecciones cromogénicas estándares) o directamente con mi,'+&,+!62%$#%#!*O"+'#&,#),*28%\#7*$+%2%5"#%32% tiramida adicionada sólo se deposita en las regiones próximas a la enzima, se logra aumen/2'%&*>)*(,2/*;2-#)/#%32%&#)&*7*3*$2$%&*)%!#'$#'% 8 Análisis de la expresión génica en teji- '#&+3",*4)8% 92% !'*),*!23% 3*-*/2)/#% $#%=iYLFPn% dos por ARN-ISH radica en que, generalmente, se puede analizar una sola sonda por cada hibridación. No 9+&%!'+/+,+3+&%$#%FPn%$#%=iY%'#&"3/2)%2!'+- obstante, esta técnica se ha utilizado para piados para describir los patrones temporales y comparar los niveles y sitios de expresión de espaciales de expresión de un determinado gen secuencias en numerosas especies de plana nivel celular o subcelular. En los organismos tas. Uno ejemplo de ello, es el análisis espacial multicelulares, ISH constituye un complemento de transcritos expresados diferencialmente en de los análisis de northern blotting, RT-PCR y !32)/2&%,+)%'#!'+$",,*4)%&#B"23%0%2!+-6,/*,2&% -*,'+2''20&#)L#&!#,6(,+&% -2',2$+&% ,+)% O"+'+,'+-+&% de tejido, aunque también puede realizarse so- directamente sobre porciones de tejidos u ór7'#%4'>2)+&%#)/#'+&%DuU1+3#L-+")/%FPnv#)#'23-#)/#%,\Y=:%-2',2$2%,+)% pio láser confocal de barrido. De este modo, haptenos que se hibridará directamente sobre se logra mejorar notablemente la calidad de los los cortes de tejido. Las detecciones se reali- resultados debido a que se eliminan los pasos zan con anticuerpos conjugados con fosfata- que generan artefactos e impiden realizar una &2&%23,23*)2&%+%,+)%O"+'+,'+-+&8% ,"2)/*(,2,*4)% !'#,*&28% 92% ,2'2,/#'6&/*,2% ,32;#% E2'2%25"#33+&%,2&+&%#)%3+&%5"#%#3%=iY-%2% $#%wXFPn%#&%32%,"2)/*(,2,*4)%$#%32%#B!'#&*4)%

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génica utilizando como estándar a los genes de mantenimiento celular (genes “housekeeping”, b=E\n% 0% WpP%=iY':8% K3% #-!3#+% $#% #&/#% #&tándar permite corregir la variación de la razón citoplasma/vacuola en los diferentes tipos celulares, los efectos ópticos de los tejidos y las &#Q23#&%)+%#&!#,6(,2&8%92%)2/"'23#I2%,"2)/*/2tiva de esta técnica hace posible el análisis de la expresión génica en órganos, a nivel tisular o celular, independientemente de las diferencias debidas a la edad o a los tipos de tejidos. Este método es mas rápido que los métodos tradicionales y puede utilizarse para estudiar la localización celular de la expresión de uno o ;2'*+&%>#)#&%#)%")%!#'6+$+%'#32/*;2-#)/#%,+'/+% $#%/*#-!+8%=&*-*&-+2)*I2,*4)% $#3% =\Y% #)% la cromatina regula la expresión y el mantenimiento de la información genética (replicación, reparación, recombinación y segregación) en forma dinámica. Las colas N-terminales de las histonas que conforman el núcleo de los nucleosomas están sujetas a diferentes modi(,2,*+)#&%!+&L/'2$",,*+)23#&%D2,#/*32,*4)*+)#&% $#/#'-*)2$2&% $#3% =\Y62% $#3% =\Y% '#tos y determinar incluso la secuencia de esos nucleótidos. Estos adelantos técnicos forman combinante y la clonación molecular han apor!2'/#%$#%32%/#,)+3+>62%$#3%=\Y%'#,+-7*)2)/#62% -+3#,"32'% $#7#)% contener toda la maquinaria genética para la 2-!3*(,2,*4)% $#3% =\Y% '#,+-7*)2)/#8% E"#$#% tratarse de organismos procariotas (bacterias) +%#",2'*+/2&%D3#;2$"'2&'2)% /2-2Q+'2)$#&23%&#%*),+'!+'2%23%-#$*+%$#%,"3/*;+%#)%!32,2% #;#)/+% $#% ,3+)2,*4)2'*(,2$+%5"#%,+)/*#)#%#3% 2)/*7*4/*,+% ,"02% '#&*&/#),*2% ,+)(#'#% #3% ;#,/+'62%-+3#,"32'%-R&%2-!3*2-#)/#%"/*3*I2$2&8 1. VECTORES DE CLONACIÓN Como hemos mencionado, un vector es una -+3C,"32%$#%=\Y%2%32%5"#%&#%")*'R%#3%?'2>-#)/+% $#% *)/#'C&% '#&"3/2)$+% #)% #3% =\Y% '#,+-7*nante y, debido a su capacidad de autorrepli,2,*4)A)%=\Y%,3+)2$+8%=5"#332&%,C3"las que continúan siendo resistentes a la ampicilina pero sensibles a la tetraciclina, contienen #3%!3R&-*$+%,+)%#3%?'2>-#)/+%$#3%=\Y%,3+)2$+8% Como la resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina puede determinarse independientemente en placas con agar, resulta fácil aislar bacterias que contengan los clones deseados y eliminar las células que no los contengan. B) Bacteriófagos o fagos: @#+($ R: se caracteriza por ser un fago especializado en la transducción (transducción especializada) por lo tanto este fago puede utilizarse también como vector de clonación para la recombinación in vitro. Es un vector de clonación particularmente útil porque: 1. Se conoce bien su estructura, genética molecular y funcionamiento

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E"#$#%*)&#'/2'%-20+'%,2)/*$2$%$#%=\Y%5"#% 32%-20+'62%$#%3+&%!3R&-*$+&%D#)/'#%WV%0%HV%q7: K3%=\Y%!"#$#%&#'%#(,*#)/#-#)/#%#-!25"#tado in vitro%$#)/'+%$#%32&%!2'/6,"32&%$#3%?2>+ 92&%!2'/6,"32&%$#3%?2>+%&+)%-",1+%-R&%#(cientes en la infección de las células hospedadoras (transfección) que la transformación. K3% ?2>+% |% /*#)#% ")% -2!2% >#)C/*,+% ,+-!3#jo. El tercio central del cromosoma, que contiene genes requeridos para la lisogenia pero )+%!2'2%#3%,*,3+%36/*,++% |% &*3;#&/'#% /*#)#% #B,#&*;2% cantidad de sitios de restricción, no es indicado como vector de clonación por lo que se han ,+)&/'"*$+% ?2>+&% |% -+$*(,2$+&% DJ12'+):#)% $#% replicación y los genes de resistencia a los antibióticos de su plásmido parental. Cos proviene de sitio cohesivo (“cohesive site”) en referencia a la terminal de simple cadena de 12 bases ,+-!3#-#)/2'*2%#)%#3%,'+-+&+-2%$#%|%-2$"ro. El sitio cos es reconocido por el sistema $#% #-!25"#/2-*#)/+% $#%=\Y% $#% |+% m% WS% 0% #3% !3R&-*$+% !^iSHS% 5"#% ,+)/*#)#)% 3+&% +'6>#nes de replicación de ambos. Normalmente la replicación depende del plásmido, pero cuando una célula que contiene un fásmido se infecta con un fago de tipo salvaje, el origen del fago es responsable de la replicación y se generan ,+!*2&% -+)+,2/#)2'*2&8% K&/#% =\Y% -+)+,2/#nario es empaquetado en viriones y puede aislarse fácilmente y ser utilizado para secuenciar. Habitualmente los fásmidos pueden transportar $#%?+'-2%#&/273#%")%?'2>-#)/+%$#%=\Y%,3+)2$+% -20+'%5"#%")%;#,/+'%/6!*,+%$#'*;2$+%$#%M13. !C$S4(3(&(3#&$#4"#)%!+',*+)#&%$#%=\Y%$#%-20+'%/2-2Q+%!2'2% efectuar el análisis genómico y obtener mapas ?6&*,+&% $#% ,'+-+&+-2&8% K3% primer sistema de ,3+)2$+% $#% >'2)$#&% ?'2>-#)/+&% $#% =\Y% ?"#% informado en 1987 por Burke y colaborado'#&*+)#&% esenciales que le otorgan estabilidad y bajo número de copias en cada bacteria, parA, parB y parC. oriS: origen de replicación unidireccional. CMr: gen marcador seleccionable en medio con cloranfenicol, repE: >#)%$#%!'+/#6)2%2"/+'#>"32/+'*2%#&#),*23%!2'2%32%'#!3*,2,*4)%$#&$#%oriS8%!^#3+^=JWW'2$+% $#% 5"*merismo. El fago P1 se replica primero como plásmido de bajo número de copias y luego ,+-+% ")% 32'>+% &#>-#)/+% $#%=\Y% ,+-!"#&/+% por múltiples copias de la secuencia repetida (concatemero), que es empaquetado en la cabeza del fago por un mecanismo similar al del fago lambda. Las propiedades de los clones E=J%!#'-*/#)%32%*)*,*2,*4)%$#%#-!25"#/2-*#)to en las etapas de clonación, escisión de las secuencias de alto número de copias después de la infección bacteriana y la inducción de la '#!3*,2,*4)%*)-#$*2/2-#)/#%2)/#&%32%2-!3*(,2,*4)%$#3%=\Y8%X/*3*I2)%23%*>"23%5"#%3+&%^=J&%#3% sistema cre-lox.

32%$#%=\Y%0%&#'%/'2)&?+'-2$2&%&#%$#)+-*)2)% competentes. Estas células secretan el factor $#%,+-!#/#),*2'2)%!2'/#%$#3%=\Y%?R>*,+8%P*%3+&%>#)#&%$#3% Introducción del vector en la célula donador no sufren recombinación homóloga hospedadora con el cromosoma de la bacteria de la célula receptora se perderán. b) transducción especializada (restringiEn el caso de la utilización de sistemas bacterianos, la introducción del vector en la célula da): ocurre sólo en algunos virus atemperahospedadora se realiza valiéndose de los me- dos, es decir, aquellos que se integran en el canismos naturales de la genética microbiana genoma como parte de su ciclo biológico. En dado que en los procariotas existen mecanis- #&/#%-#,2)*&-+%#3%=\Y%$#%")2%'#>*4)%#&!#,6mos de intercambio genético, que permiten (,2%$#3%,'+-+&+-2%$#3%1+&!#$2$+'%&#%*)/#>'2% tanto la transferencia de genes como la recom- directamente en el genoma del fago, reemplabinación del inserto, a través de uno de los si- zando algunos de sus genes. El genoma fágico recombinante puede empaquetarse seguiguientes procesos genéticos: damente en una cabeza de fago y el resto del Transformación: es un proceso por cual fago puede ensamblarse normalmente. Este #3%=\Y%3*7'#%$#3%-#$*+%2-7*#)/#%&#%*),+'!+'2% fago puede carecer de la capacidad de replien una célula receptora, trayendo aparejado ,2'2,*4)2'% #)% -#$*+&% 365"*$+&8% K)% #3% de restricción. Para actuar como sustrato de &#>")$+%,2&+'2(,2)$+% #3% tamaño en función de la inversa de la movilidad o el logaritmo del tamaño respecto de la movilidad. Dentro de las aplicaciones más comunes de 32% #3#,/'+?+'#&*&% #)% >#3% #)% 7*+3+>62% -+3#,"32'-#)/+&% $#% EJi#'*das por endonucleasas de restricción y separadas por electroforesis en gel a una membrana de nylon o nitrocelulosa. Esta transferencia se $#)+-*)2% P+"/1#')% ^3+/#3%$#%2>2'+&2%0%,+''*$2%#3#,/'+?+'C/*,2k%,:%/'2)&?#'#),*2%$#%32&%-+3C,"32&%$#%=\Y%$#&$#%#3%>#3%$#%2>2'+&2%12,*2%")%(3/'+%$#%)*/'+,#3"3+&2% !+'% ,2!*32'*$2$#3% 2% 32% &"!#'(,*#% $#% 32% -#-7'2)28% \#&!"C&% $#% 32% /'2)&?#'#),*2-#)/+%#&!#,6(,+% te idénticos. Sin embargo, las moléculas de =iY% &+)% -"0% &#)&*73#&% 2% 32% $#>'2$2,*4)% !+'% $#%=\Y8%92%'#2,,*4)%&#%72&2%#)%32%1*7'*$2,*4)% #)I*-2&%=iY2&2&8%E+'%3+%/2)/+*2%#&!#,*(,2%$#%/'272.+++% $#% 2-!3*(,2,*+)#&% *)#&!#,6(,2&% !"#de disminuirse iniciando la reacción de PCR a temperaturas elevadas (hot-start PCR). Pueden utilizarse polimerasas recombinantes que funcionan después de ser activadas por temperatura o polimerasas unidas a anticuerpos que mantie-

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nen bloqueado el centro activo de la enzima has/2%5"#%&+)%$#&)2/"'23*I2$+&%!+'%,23+'8%=$#-R&-#)/+8% 92&% &+)$2&% $#% &#,"#),*2% #&!#,6(,262%#)/'#%&68%92%23/2%#(,*#),*2%$#%3+&%,#72$+'#&% en la PCR individual, no asegura el éxito en la PCR múltiple, pero aumenta considerablemente las posibilidades de obtenerlo. La combinación $#%O+"'4?+'+&%2%"/*3*I2'%#)%3+&%$*?#'#)/#&%,#72$+res también debe elegirse de manera cuidadosa, para que no exista superposición entre los espectros absorción y emisión entre ellos. Análisis de curvas de disociación. Se basa en la aplicación de un gradiente de temperaturas creciente después de la PCR para monitorizar la cinética de disociación de los fragmentos 2-!3*(,2$+&-#)/+&% $#%=\Y% ,3+)2$+&% 5"#% '#!'#&#)/2)% #)% &"% ,+).")/+% #3%=\Y% /+/23% $#% ")% +'>2)*&-+%$#%*)/#'C&%+%7*#)%#3%=\Y,#)% buscados, que puede ser conocida o deducirse a partir de la secuencia de aminoácidos de la !'+/#6)2%!"'*(,2$28% X)2%$#%32&%!'*),*!23#&%$*(,"3/2$#&%#)%#3%,3+)2$+% $#% =\Y% >#)4-*,+% #&% 5"#% 23>")2&% &#cuencias están representadas una sola vez en #3% >#)+-2% 0% #&% $*?6,*3% 12332'32&8% E2'2% &"!#'2'% #&/2% 3*-*/2,*4)% $#% 32% -#/+$+3+>622&% 0% 32% &#gunda es que contiene prácticamente toda la secuencia correspondiente al extremo 5´. Se basa en la utilización de la enzima RNasaH, 5"#%'#,+)+,#%-+3C,"32&%167'*$2&%=iYL=\Y%0% $*>*#'#% 32% ,2$#)2% $#%=iY% $#.2)$+% /'+I+&% !#queños que permanecen unidos a la primera ,2$#)2%$#3%=\Y,%0%&*';#)%,+-+%primers para 32%=\Y%!+3*-#'2&2%F")+&%&#,/+'#&%)+%")*$+&%5"#%&+)%Ō$+&%!+'%")2%3*>2&2%$#%=\Y8 K&/2&%-+3C,"32&%$#%=\Y,%$#%$+73#%,2$#)2% están listas ahora para ser insertadas en un vector, que puede ser un plásmido o un deriva-

do del fago . Para ello se utiliza la transferasa /#'-*)23+8%K3%=\Y%$#3%?2>+%,+)/*#)#%$+&%&*/*+&%$#%'#&/'*,,*4)% EcoiF8%K3%=\Y%$#%32%'#>*4)%,#)/'23%)+%#&#),*23%$#3%?2>+%&#%'##-!32I2%!+'%=\Y%?+'R)#++8%P#%>#)#'2%2&6%")2%&#'*#%$#%-+3C,"32&%'#,+-7*)2)/#&%$*&!"#&/2&%#)%/2)$#-+&%!+&##)% fragmentos de mayor tamaño. Como resultado del cultivo en placa (plaqueo) de la genoteca, se obtienen cientos de miles a un millón colonias bacterianas o de placas de fagos (zonas claras o de lisis resultado de la !'+$",,*4)%$#%!2'/*,"32&%;6'*,2&:2'8%=%()%$#%'#23*I2'%32%7A&5"#$2%$#%")%>#)% particular (“screening”), la genoteca es replicada en membranas de nylon o nitrocelulosa, de manera tal que el patrón de placas en la caja original se vea exactamente reproducido en la -#-7'2)2%$#%)03+)%+%(3/'+%Dj*>8%r:8%92%7A&5"#da se lleva a cabo por hibridación con una sonda de ácido nucleico, lo cual requiere un conocimiento previo de la secuencia de interés. Elección de la sonda: En algunos casos, donde parte del gen ha sido clonado, este se utiliza para buscar las partes faltantes. Si se "&2%")%&+)$2%$+)$#%32%1+-+3+>62%#&%,+-!3#/2% el “screening” puede realizarse en condiciones de alta rigurosidad (es decir, con lavados más fuertes, que tienden a despegar lo que se ha ")*$+% *)#&!#,6(,2-#)/#:8% P*% 32% &+)$2% )+% #&% completamente homóloga el “screening” deberá realizarse a menores temperaturas y utilizando concentraciones salinas más elevadas en los lavados. Si no se tiene conocimiento previo de la secuencia puede construirse una sonda a partir de la secuencia de aminoácidos $#%32%!'+/#6)28 Cuando se utiliza esta estrate>*2*4)%$#%32%!'+/#6)2% que contenga el menor número posible de codones degenerados, utilizando el conocimiento de los codones más probables para la especie en estudio. Existen otras técnicas para localizar genes #)% 32&% >#)+/#,2&% $#%=\Y,*+)#&%,+)&#';2$2&%#)%?2-*3*2&%$#%!'+/#6)2&% para encontrar genes relacionados o bien la utilización de vectores de expresión. B) Genotecas Genómicas Un genoteca genómica puede obtenerse de cualquier tejido ya que todas las células de un organismo tienen la misma constitución genética. Se encuentran en ella, no solo las secuencias expresadas sino también las correspondientes secuencias regulatorias. Pueden utilizarse fagos como vectores, pero sucede que muchos de los genomas eucariotas son muy >'2)$#&'2)%#&,2328% Preparación de una genoteca de BACs. Como todo proceso de clonación, consiste en la preparación del vector, aislamiento y diges/*4)%$#3%=\Y#38%K&/+%!#'-*/#% construir genotecas con fragmentos de tamaños similares, de aproximadamente 150 kb. Estas genotecas de grandes insertos son consideradas recursos de largo plazo para investigación genómica y deben ser mantenidas continuamente, especialmente cuando son utilizadas para proyectos de secuenciación y mapeo a gran escala. En general, cuando se va a construir una genoteca debe elegirse cuidadosamente el genotipo de la especie utilizada ,+-+% ?"#)/#% $#%=\Y'2?626262%0%m#$*,*)28%e/2%K$*,*4)8%=,'*7*28 Sambrook J., Fmitsch E. F. and Maniatis T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor. P+"/1#')%K8%m8%Whre%\#/#,/*+)%+?%&!#,*(,%"#),#&% 2-+)>% \Y=% ?'2>-#)/&% &#!2'2/#$% 70% >#3% electrophoresis. J. Mol. Biol., 98, 503-517 jx//#'#'% l8#)C/*,+&*,2% !#'+% con diferente carga neta y por lo tanto con diferentes velocidades de migración en un campo eléctrico. Estas diferencias determinan patro)#&%,2'2,/#'6&/*,+&%$#%-*>'2,*4)%#3#,/'+?+'C/*,2% de las formas iso-enzimáticas. Varios factores $#()#)% #3% !2/'4)% $#% 72)$2&% +% I*-+>'2-2g% *:% YA-#'+% $#% >#)#&% 5"#% 32&% ,+$*(,2)g% 32% !'#&#),*2% $#% ;2'*+&% >#)#&% ,+$*(,2)$+% !2'2% ")2% misma enzima ha sido atribuida a procesos de duplicación génica y subsecuente divergencia a través de mutaciones diferentes en cada caso; ii) Estados alélicos: el proceso más simple de generación de nuevas formas enzimáticas es la mutación de un gen estructural, las variantes alélicas se denominan aloenzimas. Estos marcadores muestran codominancia (en un individuo diploide ambos alelos de un 3+,"&%&+)%#B!'#&2$+&%0%;*&"23*I2$+&:8%=%-+$+% de ejemplo, la enzima alcohol dehidrogenasa D=\n:62%23%#-7'*4)%#)%3+&%!'*-#'+&%#&/2$*+&%$#% ,'#,*-*#)/+8%K&/2&%!'+/#6)2&%12)%&*$+%#B/#)&2mente estudiadas en cereales y oleaginosas y se relacionan directamente con la calidad del grano. 92&% !'+/#6)2&% $#% '#&#';2% &#% #B/'2#)% -#diante procedimientos sencillos a partir de las semillas y se separan mediante electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (con detergentes). No se requiere detectar actividad enzimática, las pro/#6)2&% &#% ;*&"23*I2)% $*'#,/2-#)/#% !+'% /*),*4)% ,+)% =I"3% $#% J++-2&&*#% #;*$#),*R)$+&#% 3+&% !+3*-+'(&-+&%,+-+%$*?#'#),*2&%#)%32%-+;*3*$2$% electroforética. K)%32%-20+'62%$#%3+&%,#'#23#&#)#'2'% ")% 23/+% )*;#3%$#%!+3*-+'(&-+%!'+/C*,+%#)/'#%0%$#)/'+%$#% especies. Por ejemplo, en el caso del trigo, las principa3#&%!'+/#6)2&%$#%'#&#';2%$#3%>'2)+%&#%$#)+-*)2)%>3"/#)*)2&%0%>3*2$*)2&#'-+!32&-2%#%*$#)/*(,2,*4)%$#%;2'*#dades. Como en el caso de las isoenzimas, la 2!3*,2,*4)%$#%!'+/#6)2&%$#%'#&#';2%#)%32%,+)&trucción de mapas genéticos es limitada por el número de marcadores genéticos disponibles, sin embargo estos loci representan importantes marcas de referencia, por ejemplo, para los cromosomas 1 y 6 de trigo, donde están presentes los principales genes de gluteninas y gliadinas. Para más información sobre estructura, pro!*#$2$#&% 0% '+3% $#% 32&% !'+/#6)2&% $#% '#&#';2% #)% grano se recomienda la lectura de la revisión de Branlard et al. (2001). La principal ventaja de los marcadores bio5"6-*,+&%#&%&"%?R,*3%*-!3#-#)/2,*4)%#)%#3%327+'2/+'*+% 02% 5"#% *);+3",'2)% -#/+$+3+>62&% &#),*llas, rápidas y de bajo costo. Como desventajas se pueden citar: baja cobertura del genoma, di(,"3/2$#&%#)%32%*)/#'!'#/2,*4)%$#%3+&%'#&"3/2$+&% (principalmente para las Isoenzimas) y, en el ,2&+%$#%32&%!'+/#6)2&%$#%'#&#';2#)#&%,+$*(,2)/#&%&"#3#)%#&/2'%#&trechamente ligados (familias multigénicas), no se puede asumir independencia entre los loci. 5.4 Marcadores moleculares Un marcador molecular es simplemente un &#>-#)/+% $#%=\Y% ,+)% ")2% "7*,2,*4)% #&!#,6(,2% #)% ")% ,'+-+&+-2% D!")/+% $#% '#?#'#),*2:% cuya herencia puede seguirse en individuos de una población. La secuencia puede pertenecer 2% '#>*+)#&% ,+$*(,2)/#&% D>#)#&:% +% &*)% ?"),*4)% conocida. Con el advenimiento de las técnicas moder)2&%$#%7*+3+>62%-+3#,"32'%D!2'2%-R&%$#/233#%;#'% I.- 4), surgieron diversos métodos de detección $#%!+3*-+'(&-+%>#)C/*,+%$*'#,/2-#)/#%2%)*;#3% $#%=\Y8%K)%32%2,/"23*$2$#)#'2$+&%2%!2'/*'%$#3%=\Y% de distintos individuos por digestión con enzimas de restricción. Los fragmentos obtenidos se separan por su tamaño mediante electrofore&*&%0%&#%/'2)&(#'#)%2%")2%-#-7'2)2%$+)$#%&+)% desnaturalizados y luego hibridados con una &+)$28%K&/2%&+)$2%#&%")%?'2>-#)/+%$#%=\Y%$#% cadena simple (de secuencia conocida o no) que está marcado radioactivamente. La sonda se unirá a aquellos fragmentos de restricción con secuencia complementaria a la misma (ver enzimas de restricción y método de Southern Blot%#)%E2'/#%F2)#32&% D-*tocondrias o cloroplastos). Pueden emplearse sondas aisladas de especies relacionadas (por ejemplo, sondas aisladas de tomate pueden emplearse en papa y viceversa). La variabilidad genética presente en el marcador molecular proviene de diferencias en la &#,"#),*2% $#3% =\Y% >#)4-*,+% $#7*$2&% 2% -"taciones puntuales en los sitios de restricción, a duplicaciones, deleciones, inserciones, etc., 5"#% -+$*(,2)% 32% $*&/2),*2% #)/'#% !2'#&% $#% &*tios de restricción generando fragmentos po3*-4'(,+&% D$#% $*?#'#)/#&% /2-2Q+&:% Dj*>"'2% S:8% X)% 3+,"&% ij9E% #&/R% $#()*$+% !+'% 32% ,+-7*)2ción de una enzima de restricción y una sonda. Individuos homocigotas poseen el mismo pa-

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satélites, son repeticiones de secuencias de 9 a 100 pares de bases. El número de repeticiones es variable pero en general es menor a 1000. Existen dos formas de detectar los VNTR: por hibridación o por técnicas de PCR. En el pri-#'% ,2&+#)4-*,+% #&% $*>#'*$+% ,+)% enzimas de restricción que reconocen sitios adyacentes a la región repetida. Los fragmentos se separan por electroforesis, se inmovilizan en una membrana y se detectan mediante sondas. La longitud de los fragmentos de restricción producidos en diferentes individuos va'62% $#% 2,"#'$+% 23% )A-#'+% $#% '#!#/*,*+)#&% $#3% minisatélite. La diferencia básica entre RFLP y VNTR reside en el tipo de sonda utilizada. En la técnica de VNTR las sondas están constituidas por secuencias homólogas a las secuencias repetidas de los minisatélites, por lo tanto todos los loci hipervariables del genoma son detectados simultáneamente, mientras que en RFLP, las sondas son homólogas a secuencias A)*,2&% $#3% >#)+-2*/"$% $#% los fragmentos de restricción en cada locus hi!#';2'*273#+%&"%;*&"23*I2automatizar, se necesita disponer de las son- ción mediante electroforesis y tinción con brodas para la especie en estudio y requieren de muro de etidio. Esta opción se ha vuelto más infraestructura adecuada para mantener las frecuente con el aumento de información de sondas y trabajar con radiactivo, lo que los secuencias en bases de datos que permiten el hace relativamente costosos. $*&#Q+% $#% *)*,*2$+'#&% O2)5"#2)/#&% 2% $#/#'-*nados minisatélites. Sin embargo estos marca5.4.1.2 VNTR (Variable Number of Tandem dores han sido poco utilizados en plantas. Repeats) o repeticiones en tandem de número variable 5.4.2 m2',2$+'#&% 72&2$+&% #)% 32% 2-!3*(,2Los VNTR, también conocidos como mini- ,*4)%2'7*/'2'*2%+%&#-*%2'7*/'2'*2%$#3%=\Y

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5.4.2.1 i=E\&% D"23%5"#%3+&%&*/*+&%$#%1*7'*$2,*4)%#)%#3%=\Y-#)/+&%$#%=\Y%2-!3*(,2$+% debido a mutaciones en el sitio de reconocimiento del iniciador, deleciones, inserciones. Este marcador no permite diferenciar individuos heterozigotas, por lo que es un marca$+'% $+-*)2)/#8% 9+&% -2',2$+'#&% i=E\% #&/R)% basados en una técnica sencilla, de bajo costo de implementación, automatizable y no radio2,/*;28%=%$*?#'#),*2%$#%3+&%-2',2$+'#&%72&2$+&% en PCR convencional no se requiere informa,*4)%)",3#+/6$*,2%!'#;*2%!2'2%&"%$#&2''+33+'2?62#)C/*,28%K3%#)&20+%$#%=j9E% ,+-7*)2% 32% #&!#,*(,*$2$-#)/+&% por PCR. En esta etapa, se utilizan iniciadores de aproximadamente 20 nucleótidos que con/*#)#)%")2%&#,"#),*2%#&!#,6(,2%,+-!3#-#)/2ria a la secuencia de los adaptadores y además, 1 a 3 nucleótidos selectivos adicionales de secuencia arbitraria en su extremo 3´. Dado que sólo una subpoblación de los fragmentos +'*>*)23#&%#&%2-!3*(,2$2#)C/*,2%$#3%!+3*-+'(&-+%$#%=j9E% es la ausencia o presencia de fragmentos am!3*(,2$+&%$#%")%/2-2Q+%$#/#'-*)2$+%$2$+%!+'% mutaciones puntuales, inversiones, inserciones y deleciones que llevan a la pérdida o ganancia de un sitio de restricción o la alteración $#% 32% &#,"#),*2% '#,+)+,*$2% +% 2-!3*(,2$2% !+'% 3+&%*)*,*2$+'#&8%=3%*>"23%5"#%#)%3+&%i=E\&62% #&% #-!3#2$2% #)% análisis de expresión diferencial de genes, estudios del transcriptoma y genómica funcional.

-2',2$+'#&%*),3"*$+&%#)%32%!'#&#)/#%,2/#>+'62% '#5"*#'#)%$#3%$*&#Q+%$#%*)*,*2$+'#&%#&!#,6(,+&% !2'2%32%2-!3*(,2,*4)%$#%")%3+,"&%#)%!2'/*,"32'8

5.4.3.1 Microsatélites (Litt y Luty 1989) Los microsatélites son regiones hipervariables del genoma que contienen arreglos de secuencias simples en tandem de mono, di, tri, tetra o pentanucleótidos que se repiten entre 10 y 100 veces. Los marcadores microsatélites, también denominados Simple Sequence Length Polymorphism (SSLP), Simple Sequence Repeat Polymorphism (SSRP), Simple Sequence Repeats (SSR) o SequenceTagged Microsatellite Sites (STMS) se encuentran distribuidos por todo el genoma de la ma0+'62%$#%32&%#&!#,*#&%#",2'*+/2&8% Los microsatélites se detectan mediante su 2-!3*(,2,*4)% !+'% EJi% "&2)$+% *)*,*2$+'#&% #&!#,6(,+&%$#%HV%2%SV%!7%$#%3+)>*/"$%5"#%1*7'*$2)% #)% 32% '#>*4)% 5"#% O2)5"#2% 23% /2)$#-% $#% repeticiones (microsatélite). Estos marcadores se resuelven por electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes, mediante tinción con plata o por autoradiogra?62% D#)% #3% ,2&+% $#% "&2'% ")% *)*,*2$+'% -2',2$+% radioactivamente). Si se dispone de un secuenciador automático, se pueden resolver por tamaño en este equipo mediante el empleo de ")%*)*,*2$+'%-2',2$+%,+)%")%O"+'4?+'+#)C/*,2% $#3% !+3*-+'(&-+% $#/#,/2do en microsatélites se basa en la variabilidad del número de repeticiones en tandem y, consecuentemente, en el tamaño del microsatéli/#% 2-!3*(,2$+% #)% *)$*;*$"+&% $#% ")2% #&!#,*#8% Estas diferencias son originadas durante la re!3*,2,*4)%$#3%=\Y%$#7*$+%2%?2332&%#)%32%2,,*4)% $#% 32% =\Y% !+3*-#'2&2% $"'2)/#% #3% ,+!*2$+% $#% una región repetida donde incorpora o elimina repeticiones. Otro mecanismo responsable de la variación es el entrecruzamiento desigual entre cromosomas homólogos. En este caso se generan alelos con diferencias mayores en el número de repeticiones. El desarrollo de marcadores microsatélites 5.4.3. Marcadores moleculares basados en requiere del conocimiento de las secuencias 32%2-!3*(,2,*4)%&*/*+L#&!#,6(,2%$#3%=\Y O2)5"#2)/#&% 2$#,"2$2&% !2'2% #3% $*&#Q+% $#% En contraste con los marcadores basados en 3+&%*)*,*2$+'#&%#&!#,6(,+&8%9+&%!'*-#'+&%PPi% 32% 2-!3*(,2,*4)% $#% &#,"#),*2&% 2'7*/'2'*2&LL*+)#&%D!+/#),*23-#)/#:%2-!3*(,2$2&%!+'% el marcador MP-PCR, descripto anteriormente, aumentando la reproducibilidad, que es una de 32&%3*-*/2,*+)#&%$#3%"&+%$#%3+&%mELEJi8%=3%/#ner en el iniciador esas 4 bases extras, a este tipo de marcador se lo conoce también como -*,'+&2/C3*/#% 2),32$+% D=mELEJi*2%,+)&*&/#%#)% 2*&32'%#3%?'2>-#)/+%$#%=\Y%!+3*-4'(,+%$#3%>#3#)C/*,2% $#3% !+3*-+'(&-+% $#/#,/2$+% !+'% #3%-2',2$+'%J=EP%#&%32%!'#&#),*2_2"&#),*2%$#% &*/*+&%$#%'#&/'*,,*4)%#)%32%&#,"#),*2%2-!3*(,2$2%!+'%EJi8%K&/#%-2',2$+'%!#'-*/#%*$#)/*(,2'% individuos heterocigotas, por lo que se comporta como marcador codominante (Figura 6). 9+&%-2',2$+'#&%PTP%0%&"&%;2'*2)/#&%PJ=i% 0%J=EP#)#&62%$#%,+)?+'-2,*4)%$#% =\Y% &*-!3#% ,2$#)2% #)% #3#,/'+?+'#&*&% !2',*23mente desnaturalizantes (SSCP), etc. Posteriormente, se debe probar la existen,*2%$#%;2'*2,*4)%?#)+/6!*,2%2&+,*2$2%23%23#3+%#)% cuestión. Esto puede realizarse indirectamente, por estudios de asociación en poblaciones segregantes, o directamente, mediante la comparación de genotipos isogénicos generados por -"/2>C)#&*&%#&!#,6(,2%#)%32%&#,"#),*2%$#3%>#)% mediante TILLING, Targeting-Induced Local Lesions In Genomes (McCallum et al., 2003), etc. En varias aplicaciones, la gran ventaja que presentan los FM es su ligamiento completo con motivos (mutaciones) funcionales. En contraste con los marcadores tradicionales (distribuidos al azar en el genoma), los FM permiten: *:%32%2!3*,2,*4)%,+)(273#%$#%-2',2$+'#&%#)%!+blaciones sin necesidad de mapeo previo; ii) el uso de marcadores en poblaciones segregantes sin el riesgo de perder información debido a la recombinación; iii) una mejor representación de la variación genética en poblaciones naturales o de mejoramiento. K)%>#)#'23#)#&%2%#&,232%>#)4-*,2%&*>"#%/6!*,2-#)te los siguientes pasos: i) la construcción del 2''#>3+% $#%=\Yk% **:% 32% !'#!2'2,*4)% $#% &+)$2&%

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D2%!2'/*'%$#%=iY-%$#%32&%$*&/*)/2&%&*/"2,*+)#&% a comparar); iii) la hibridización del arreglo; iv) la detección de la señal y análisis de los datos por herramientas computacionales apropiadas. Existen diferentes sistemas de arreglos se =\Y)*(,2/*;2-#)/#%$#%32%-2)+%$#%3+&% proyectos de secuenciación completa del genoma de Arabidopsis thaliana y Oryza sativa (arroz) (para mas detalles ver Rensink y Buell, 2005). =$#-R&% $#% 32% ,+)/'*7",*4)% !2'2% #3% #)/#)$*miento de la expresión génica a gran escala, se vislumbra la posibilidad de emplear la técni,2%$#%2''#>3+&%$#%=\Y%#)%-#.+'2-*#)/+%2&*&tido por marcadores, 1%3$-0-'%#'%3, selección

de accesiones de germoplasma, desarrollo de plantas tolerantes a diferentes tipos de estrés, #/,8% =&*-*&-+#)#&% #Bpresados diferencialmente, en especial aquellos cuya expresión no es abundante o están involucrados en cascadas de transducción de señales, ampliará enormemente los horizontes una vez que esos genes puedan ser empleados como marcadores para selección asistida (Galbraith, 2006). 5.6 Marcadores SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) Si bien, son una clase particular de marca$+'#&% -+3#,"32'#&% 5"#% !+$'62)% &#'% *),3"*$+&% dentro del punto 5.4, se los decidió tratar aparte dado que los SNPs pueden derivar tanto de &#,"#),*2&%>#)4-*,2&%,+$*(,2)/#&%D5"#%&#%#B!'#&2):%,+-+%)+%,+$*(,2)/#&8% Recientemente, de la mano de los proyectos de secuenciación de genomas enteros de plantas, una nueva clase de marcadores molecu32'#&%$#)+-*)2$+&%PYE&%D!+3*-+'(&-+%$#%")% nucleótido), está siendo utilizada en distintos estudios genéticos. Estos marcadores se ba&2)%#)%32%$#/#,,*4)%$#%!+3*-+'(&-+&%'#&"3/2)tes de la alteración de una única base en una &#,"#),*2%$#%=\Y8%K)%32%(>"'2%r%&#%-"#&/'2)% &#,"#),*2&%$#%=\Y%#.#-!3*(,2)$+%23>")2&%;2'*2,*+)#&%$#%!")/+#)+/6!*,+&8 En tiempos recientes se han desarrollado ;2'*2&% -#/+$+3+>62&% !2'2% $#/#,/2'% PYE&% 5"#% utilizan diferentes estrategias para comparar '#>*+)#&%#&!#,6(,2&%$#3%=\Y%+7/#)*$2&%$#%;2rios individuos. La elección de uno de los métodos dependerá de muchos factores: costos, potencial para el procesamiento de los datos generados, los equipamientos necesarios y la $*(,"3/2$%$#%3+&%#)&20+&8 Inicialmente, los abordajes para la detección $#%PYE&%,+)&*&/62)%#)%2-!3*(,2'%0%&#,"#),*2'%

fragmentos genómicos equivalentes de regio)#&%>C)*,2&%#&!#,6(,2&%$#3%=\Y%$#%;2'*+&%*)dividuos y comparar sus secuencias buscando SNPs. La adopción de esa estrategia involucra #3% $*&#Q+% $#% *)*,*2$+'#&% !2'2% 2-!3*(,2'% &#>-#)/+&% $#%=\Y% $#% #)/'#% ]VV% 2% rVV% !7#)4-*,+%+7/#)*$+&%!+'%)#7"3*I2,*4)% D'+-!#'% #3%=\Y% #)% ?'2>-#)/+&% $#% ")% /2-2Q+% determinado y al azar), estos se unirán solo a los oligonucleótidos perfectamente complementarios y los productos no perfectamente

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complementarios (con mismatch) serán lavados. La unión perfecta de cada caso podrá ser /+-2$2% !+'% ")% &*&/#-2% $#% $#/#,,*4)8%=&6C)*,2&#%!'+/#*)&%2)$%7'#2$%U1#2/%5"23*/08% Euphytica 119: 59-67. J2#/2)+L=)+33C&#)#8%=-8%l8%n"-8%b#)#/8%]]gShpL]VW8%Whph8 m,J233"-%J8m8#)#&%*)%3#//",#8%T1#+'8%=!!38% Genet. 85:985-993. i#)&*)q% o8=8% ~% ^"#33% J8i8% HVVe8% m*,'+2''20% #B!'#&&*+)%!'+(3*)>%'#&+"',#&%?+'%!32)/%>#)+-*,&8% Trends Pl. Sc. 10(12): 603-609. Steinmetz L.M. 2000. Combining genome sequen,#&%2)$%)#U%/#,1)+3+>*#&%?+'%$*&&#,/*)>%/1#%>#netics of complex genotypes. Trends Pl. Sc. 5(9): 397-401. Tsuchihashi Z. & Dracopoli N.C. 2002. Progress in high throughput SNP genotyping methods. Pharmacogenomics 2: 103-110. Vos P., Hogers M., Bleeker M., Rijans M., Van de 9##% T81L$#()*/*+)%>#)+-#% !'+(3*)>%?+'%>#)#/*,%-2'q#'%$*&,+;#'08%T'#)$&%E38% Sc. 12(5): 196-202.

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I CAPITULO 6 Construcción de mapas de ligamiento genético, localización de genes y regiones cromosómicas asociadas a caracteres de interés en plantas Gerardo D L Cervigni, l"2)%E273+%=%['/*IC)*,2&%)+%,+$*(,2)/#&% o a segmentos génicos, en cuyo caso son denominados funcionales y constituyen marcadores “ideales” a los efectos de selección de genotipos. Un mapa genético establece de ma)#'2%!'+727*36&/*,2%#3%2''#>3+%3*)#23%$#%")%>'"!+% marcadores (o genes) sobre el genoma de una especie. Si bien el concepto data de principios $#%&*>3+%{{2)% y Bridges con mutantes de Drosophila, recién a partir del advenimiento de los marcadores moleculares fue técnicamente posible construir -2!2&% >#)C/*,+&% &2/"'2$+&% #)% 32% -20+'62% $#% las especies vegetales de interés agronómico. Usando este tipo de mapas es posible iden/*(,2'% 32% !+&*,*4)% 0% #3% #?#,/+% $#% >#)#&% &+7'#% caracteres de importancia mediante asocia,*+)#&% #&/2$6&/*,2&% #)/'#% 3+&% ;23+'#&% ?#)+/6!*cos y las variantes alélicas de los marcadores. La disponibilidad de mapas genéticos permite también la selección indirecta de genotipos deseables, comúnmente denominada MAS (del inglés Marker Assisted Selection), mediante el seguimiento de marcadores localizados en regiones genómicas determinadas. La utilización de marcadores comunes permite comparar la estructura del genoma de diferentes especies (comparative mapping:%#%*$#)/*(,2'%'#2''#>3+&% cromosómicos a pequeña y gran escala (micro y macro sintenia)%!2'2%#&/"$*+&%$#%(3+>#)*2%0% evolución molecular. Por otro lado, el desarro-

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llo de mapas genéticos altamente saturados permite el clonado posicional de genes. 2. Introducción a la construcción de mapas genéticos en vegetales Para comprender mejor las bases teóricas y metodológicas empleadas en el mapeo genético es necesario recordar algunos conceptos básicos de genética Mendeliana. Gregor Mendel realizó sus experimentos en Pisum sativum (arveja cultivada) efectuando cruzamientos controlados entre individuos que se $*?#'#),*272)%#)%$#/#'-*)2$2&%,2'2,/#'6&/*,2&% D,+-+% !+'% #.#-!3+% #3% ,+3+'% $#% 32% O+'2-#)/#%3+&%+7.#/*;+&%$#%#&/#%3*7'+8%=5"#33+&% lectores que deseen ampliar y profundizar los /#-2&%5"#%25"6%&#%$#&2''+332)%!"#$#)%,+)&"3tar los textos que se citan en la lista de referen,*2&%7*73*+>'R(,2&%23%()23%$#3%J2!6/"3+8% Los pasos fundamentales a seguir en la construcción de un mapa genético de una de/#'-*)2$2%#&!#,*#%+%#3%-2!#+%#&!#,6(,+%$#%")% gen (locus) de interés pueden resumirse en: 1) selección de progenitores y desarrollo de una población segregante (población de mapeo), 2) >#)#'2,*4)%$#%")%)A-#'+%&"(,*#)/#%$#%-2',2dores y registro de los mismos en cada uno de los individuos de la población (genotipado), 3) determinación de las frecuencias de recombinación entre marcadores y determinación de grupos de ligamiento y 4) determinación del orden de los marcadores y conversión de la frecuencia de recombinación (r) en unidades de mapeo o centiMorgan (cM). 2.1. Poblaciones de mapeo El primer paso en todo proyecto de mapeo es el desarrollo de una población segregan/#% !2'2% ")2% +% -R&% ,2'2,/#'6&/*,2&% $#% *)/#'C&8% La selección de los progenitores es un punto importante debido a que no sólo deben ser ,+)/'2&/2)/#%!2'2%32%,2'2,/#'6&/*,2%#)%#&/"$*+"*'% #)/'#% #3% >#)+/*!+% 1+-+,*>+/2% D==:% $#3% 1#/#'+,*>+/2% D=2:% +% ,+L$+-*)2)/#&% D/+$+&% 3+&% 23#3+&% !"#$#)% *$#)/*(,2'-*#)/+#)#&%+%wT9&8%=&*-*&-+"23% 2% 32% &"-2%$#%32%$*&/2),*2%#)/'#%=L^%s%^LJ8%P*)%#-72'>+_&+?/_-2!-2q#':% +% l+*)m2!% W8]% L% ]8V% DP/2-!% WhhSk% 1//!g__UUU8 kyazma.nl), permiten el análisis simultáneo de muchos marcadores en poblaciones de gran número de individuos, mediante la utilización de métodos de estimación de parámetros ,+-+% #3% $#% -RB*-2% !'+727*3*$2$% +% -6)*-+&% cuadrados. Estos programas poseen diferentes procedimientos, o rutinas, que permiten la

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estimación de r entre pares de marcadores, 32% *$#)/*(,2,*4)% $#% 3+&% >'"!+&% $#% 3*>2-*#)/+% 0% la determinación del orden de los marcadores dentro de cada grupo. El programa Mapmaker "/*3*I2% #3% /#&/% #&/2$6&/*,+% 9[\% score para evaluar el valor de r estimado y la posición más probable de un marcador en el grupo de ligamiento. El LOD score (logaritmo de los odds) es el logaritmo en base 10 del cociente entre la probabilidad de obtener los datos observados en caso de que los loci considerados estuvieran ligados, sobre la probabilidad de obtener los datos en ausencia de ligamiento. Un LOD = 3 para un par de marcadores indica que es mil veces más probable que los loci estén ligados respecto a que no lo estén. El programa Mapmaker también utiliza LOD score para comparar dife'#)/#&%4'$#)#&%!+&*73#&%#)/'#%;2'*+&%>#)#&8%=3% orden más probable le asigna un 0 y a los restantes le asigna valores negativos. Por su parte, el programa JoinMap (Stam, 1993) permite trabajar con distintos tipos de poblaciones e inclusive con distintos tipos de segregación dentro de la misma población. Este programa fue especialmente diseñado para estimar datos de ligamiento genético en poblaciones derivadas de especies altamente heterocigotas y/o donde )+%#&%!+&*73#%+7/#)#'%36)#2&%!"'2&8%[/'2%$#%&"&% principales ventajes es que permite “combinar” mapas derivados de distintas poblaciones (o $2/+&%7*73*+>'R(,+&:%&*%$*&!+)#)%-2',2$+'#&%#)% común (Stam 1993). Debido a que las unidades de mapeo genético están basadas en frecuen,*2%$#%'#,+-7*)2,*4)%&"%&*>)*(,2$+%#)%,"2)/+% 2%$*&/2),*2%?6&*,2%D)A-#'+%$#%)",3#4/*$+&:%#)/'#% dos loci%;2'62%&#>A)%32%#&!#,*#%,+)&*$#'2$2#)#&%$#%#?#,/+&%!'+)"),*2$+&#)+/6!*,+&

d -a

Efecto aditivo

mQQ - mqq mQQ + mqq d = mQq 2 2

án una generación F2 cuyos genotipos marcadores MM, Mm y mm estarán presente en la frecuencia de 1/4, 1/2 y 1/4, respectivamente. En este caso los efectos a, d y d/a son estimados con base en el marcador ligado al QTL, como sigue:

92% 2&+,*2,*4)% m2',2$+'LwT9% &#% ,+)('-2% &*%32&%$*?#'#),*2&%#)/'#%32&%-#$*2&%?#)+/6!*,2&% $#%>'"!+&%$#%-2',2$+'#&%&+)%#&/2$6&/*,2-#)te diferentes de cero (se rechaza de Ho). Las diferencias pueden ser evaluadas por medio $#3%2)R3*&*&%$#%32%;2'*2)I2%D=Y[G=:%+%!'"#72% t, #3*>*#)$+%")%)*;#3%$#%&*>)*(,2),*2%$#%E%‰%V62% !+$#-+&% X)2% ;#I% #;23"2$+% 0% ,+)('-2$+% #3% -+$#3+% considerar el cruzamiento entre dos progenitocompleto (modelo aditivo + dominante), debe res homocigotos cuya F1 posee la constitución analizarse la importancia relativa de cada uno >#)C/*,2%5"#%&#%#.#-!3*(,2%#)%32%j*>"'2%]8% =%$*?#'#),*2%$#3%-2!#+%!+'%-2',2&%&*-!3#&62%$#%'#>'#&*4)%-A3/*!3#%$#%#3*-*)2,*4)% poseer un mapa genético ya que la unidad de !+'%!2&+%D&/#!U*&#:8 En poblaciones de retrocruzamiento, sólo el análisis es el intervalo genético y no un marcagenotipo heterocigoto (Qq) y uno de los homo- dor individual. De manera resumida el mapeo cigotos (QQ o qq) están presentes por lo que por intervalo utiliza la siguiente estrategia: 1) el efecto aditivo y dominante quedan confun- como la distancia entre cada par de marcadodidos, en este apartado denominados g1 y g2, res es conocida, el método estima los parámetros del modelo a incrementos de distancias respectivamente, y estimados como sigue: >#)C/*,2&% !'#$#()*$+&#)+-2%,+-!3#/+%$*;*$*do el número de cromosoma o grupos de liga-*#)/+&% +7/#)*$+&8%T2-7*C)% #&% !+&*73#% $#()*'% ")%)*;#3%$#%&*>)*(,2),*2%!2'2%,2$2%*)/#';23+)*(,2),*2%$#3%,'+-+&+-2%!+'%#3% 3.4. Test de hipótesis y nivel de número de intervalos en el grupo de ligamiento &'+7'%,#7,'# (número de marcadores menos uno). La formulación de hipótesis adecuadas y j*)23-#)/#'2$+% $#% 1+-+3+>62% #;*$#),*2$+% entre especies, ha permitido la generación de 4. Mapas y marcadores funcionales los llamados marcadores génicos o funcionaEn la historia del desarrollo de los marcado- 3#&#)+/*!+&8% K&/2% A3/*-2% ,2'2,/#'6&- '2'%#3%2-*)+R,*$+%!2'2%#3%,"23%,+$*(,28%92%*$#)tica está sustentada en que las regiones no /*(,2,*4)%$#%PYE&%!"#$#%*)?#'*'&#%$*'#,/2-#)génicas del genoma no han sufrido presión de te a partir de datos de secuencias públicas, si selección sobre las mutaciones que pudieran estas corresponden a distintos genotipos, o por haber ocurrido en el transcurso de la evolución &#,"#),*2,*4)%$#%?'2>-#)/+&%$#%>#)#&%2-!3*(y por consiguiente ser más variables. La aso- cados por PCR de individuos diversos. ciación de los marcadores con caracteres de =")5"#% 1*&/4'*,2-#)/#% &#% 12% 2&"-*$+% 5"#% interés, como se ha visto anteriormente, está las secuencias tipo microsatélites son propias determinada por la distancia de recombinación $#3%=\Y%)+%,+$*(,2)/#-#)/+%$#% un gen y estableciendo la existencia de polimor(&-+%#)/'#%>#)+/*!+&%2%/'2;C&%$#%32%'#&+3",*4)% $#3%!'+$",/+%#)%>#3#&%$#%PPJE8%9+&%!+3*-+'(&mos detectados mediante esta técnica se basa #)%5"#%1#7'2&%&*-!3#&%$#%=\Y%,+)%&#,"#),*2&% distintas, migrarán diferencialmente en un campo eléctrico, en función de un diferente plegamiento intra-cadena dado por la complementariedad de bases. Patrones de bandas distintos #)/'#% >#)+/*!+&% #&/2'62)% *)$*,2)$+% ")2% ;2'*2,*4)%$#%&#,"#),*2%#)%#3%?'2>-#)/+%2-!3*(,2$+8% Sin embargo, no puede asegurarse identidad $#%&#,"#),*2%$#%$+&%?'2>-#)/+&%2-!3*(,2$+&#)#&%&*)%'#32,*4)%#)/'#%&6#)#&% !#'/#)#,*#)/#&% 2% '"/2&% -#/2743*,2&% !2'/*,"32'#&% D!+'% #.#-!3+g% &6)/#&*&% $#% carbohidratos), o a integrantes de una familia génica (por ejemplo: genes de la familia P450). Los mapas genéticos funcionales posibilitan establecer una estrategia de genes candidatos #)%32%*$#)/*(,2,*4)%$#%?2,/+'#&%'#&!+)&273#&%$#% QTLs a nivel molecular, a través de la coincidencia en la localización de QTLs y marcadores génicos. Un marcador funcional se convierte en gen candidato cuando está asociado al carác/#'%?#)+/6!*,+%2%/'2;C&%$#%")%2)R3*&*&%$#%-2',2&% simple, o cuando en un mapa su localización coincide con un QTL. En el primer caso, tanto el -2',2$+'%,+-+%#3%,2'R,/#'%?#)+/6!*,+%$#7#)%#&tar evaluados en la misma población, mientras que en el segundo caso esto no es necesario, y es factible comparar la posición de un marcador funcional con QTLs de mapas de otras poblaciones de la misma u otra especie. Por ejemplo, se ha encontrado que el locus del gen Lin5 del cro-+&+-2% F{% $#3% /+-2/#% ,+''#&!+)$*#)/#% 2% ")2% invertasa vacuolar (responsable de la degradación de sacarosa en glucosa y fructosa) colocalizada con el QTL Brix9-2-5 de rendimiento de azúcar de fruto, mientras que en papa el gen ortólogo invGE está asociado a variaciones en el nivel de azúcares reductores en tubérculos de una población segregante, y su posición coincide con el QTL Sug9a, responsable del endulza-*#)/+%!+'%?'6+%#)%/"7C',"3+&%$#%+/'2%!+732,*4)% $#% !2!28%=)R3+>2-#)/#% &#% 12% #),+)/'2$+% 5"#% marcadores funcionales, basados en análogos 2% >#)#&% $#% '#&*&/#),*2% Dib=&:% &#% 2&+,*2)% #)% diferentes especies a resistencias a distintas enfermedades fúngicas y virales. =&*-*&-+#nômica aplicada a populações derivadas de cruzamentos controlados. Primera Edición. Viçosa, Brasil. Ed. UFV. pp 568. STAM, P. 1993. Construction of integrated genetic 3*)q2>#%-2!&%70%-#2)&%+?%2%)#U%,+-!"/#'%!2,qage: JoinMap. Plant J. 3:739–744. WEISING, K.; NYBON, H.; WOLFF, K. y KAHL, G. 2005. Linkage analysis and genetic maps. En: \Y=% j*)>#'!'*)/*)>% *)% !32)/&8% E'*),*!3#&%O2)q*)>%-2'q#'&8%n#'#$*/0%chg% 315-324. JANSEN, R. C. 1993. Interval mapping of multiple quantitative trait loci. Genetics 135: 205-211. KEARSEY, M. J. y POONI, H.S. 1996. Estimation of

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

99

I CAPÍTULO 7.

se encuentran disponibles las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de miles de genes 0% !'+$",/+&% >C)*,+&% ,+$*(,2$+&% !+'% 3+&% >#Genómica nomas de varios organismos complejos. Esta información se utiliza para el estudio de enViviana Echenique; Juan P. Selva; Mauro Meier; fermedades humanas complejas y para com!'#)$#'% ?#)4-#)+&% /23#&% ,+-+% 32% (&*+3+>62% Pablo Roncallo; Gustavo Schrauf celular, el desarrollo, la conducta, la evolución, etc. También aportan información acerca de todos los aspectos del crecimiento y desarrollo 1 Introducción La «genómica» se desarrolló en las ulti- vegetal, diferenciación y respuesta a estreses mas dos décadas como consecuencia de los bióticos y abióticos. Gracias al potencial de re2;2),#&% '#23*I2$+&% #)% 7*+3+>62% -+3#,"32'% #% lacionar fenotipos biológica y económicamente Informática, dos áreas de la ciencia que han importantes con los genes responsables de los tenido un desarrollo tecnológico enorme, gene- -*&-+&%2,/"23-#)/#%#&%!+&*73#%*$#)/*(,2'%>#rando una revolución en el conocimiento y en nes de interés para ser transferidos a otros or>2)*&-+&%!+'%-#$*+%$#%/#,)+3+>62%>C)*,28%E+'% la comprensión de los procesos biológicos. El término fue acuñado en 1986 por Thomas otro lado, el conocimiento de la secuencia de Roderick para referirse a la subdisciplina de la los genes posibilita el desarrollo de marcadores genética que se ocupa del mapeo, secuen- perfectos, basados en la secuencia del mismo ciación y análisis de las funciones de geno- gen, lo cual facilita la selección y la transferenmas completos y sirvió de nombre para una cia de los mismos a variedades de interés. La revista especializada en la publicación de los ,+)."),*4)% #)/'#% /#,)+3+>62% >C)*,2#)+-2#)#&%$#%*)/#'C&%0% =iY%0%!'+/#6)2&8 permitirá interpretar, en términos moleculares, El objetivo de la genómica es la dilucidación los procesos biológicos. Para ayudar en este proceso han surgido poderosas herramientas ,+-!3#/2%0%#B2,/2%$#%32%&#,"#),*2%$#%=\Y%$#% bioinformáticas que permiten almacenar e in- un genoma haploide representativo de una especie. Cuando esta secuencia se conoce, abre terpretar esta información. Las aplicaciones de la genómica alcanzan a la puerta a numerosas posibilidades. Por análisis computacional de la misma y todos los ámbitos de la actividad humana re32,*+)2$+&% ,+)% 32% 7*+3+>622-*#)/+%$#%2''+IN8%K)%32%(>"'2%&#%-"#&/'2% #3%23*)#2-*#)/+%$#%3+&%,'+-+&+-2&%0%&#>-#)/+&%$#%,'+-+&+-2&%D*$#)/*(,2$+&%,+)%3#/'2&%-20A&,"32&:% $#%;2'*2&%>'2-6)#2&%,+)%3+&%$#3%2''+I%D,#)/'+:8%K3%>#)+-2%$#3%-26I%/*#)#%$+&%,+!*2&%&#-#.2)/#&%$#%,2$2% 73+5"#%$#%>#)#&%!+'%3+%5"#%#&/R%'#!'#&#)/2$+%!+'%$+&%2)*33+&%$#3%,6',"3+8%92&%36)#2&%#B/#')2&%!")/#2$2&% ,+)#,/2)%&#,/+'#&%2$02,#)/#&%$#%3+&%,'+-+&+-2&%$#%/'*>+8%m+$*(,2$+%$#%b23#%0%\#;+&%DWhhp:8

102 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

También es posible estudiar todos los genomas bacterianos asociados a genomas más complejos, sin necesidad de aislar y de cultivar especies microbianas particulares. Esto se denomina metagenómica (Parte I, Cap. 11). Para este estudio se extrae /+$+% #3%=\Y% $#% ")2% ,+-")*$2$% -*,'+7*2)2% $#% ")% ambiente particular (suelo, agua de mar, intestino humano, etc.), se determina que genes se encuentran presentes, cuales son sus funciones y las diferencias que existen entre distintas comunidades a este nivel. Más recientemente ha surgido la denominada “Genómica Sintética”, que pretende crear formas &*)/C/*,2&% $#% ;*$2% '#,'#2)$+% >#)+-2&% 2'/*(,*23#% ,+''#&!+)$#'62)% 2% ,'+-+&+-2&% -2',2$+'_,#)/*-+'>2)% D,m:8%=")5"#% /23% '#&+individuales y pueden utilizarse para locali- lución es un logro muy importante, un centizar nuevos genes por hibridación. Prime- morgan representa, en humanos, una megaro, utilizando sondas de localización conocida base, lo que equivale a un millón de pares de se establece que banda corresponde a cada bases o 1000 kb. Para lograr mayor resolución cromosoma. Luego, un nuevo gen clonado de actualmente existen los SNP, que son marcaubicación desconocida se utiliza como sonda $+'#&% 72&2$+&% #)% #3% !+3*-+'(&-+% $#% ")% &+3+% para asignarle una posición en un cromosoma nucleótido. determinado. - Hibridación in situ: cuando se dispone de /$ :J;4'"(&$ ,2)=)#42&$ '72)%/+$+&%3+&%,'+- a los cromosomas portadores de la secuencia, mosomas del roedor y un cromosoma huma- $#/#'-*)2'%&*%&+)%&#,"#),*2&%#&!#,6(,2&%$#%")% no particular. Siempre incluye un cromosoma cromosoma y determinar la posición del gen en humano que lleva un alelo salvaje defectivo #3%-*&-+8%K)%#3%,2&+%$#%O"+'#&,#),*2-#)/+&%$#%=\Y% cromosoma clonados superpuestos que, juntos represenEl próximo nivel de resolución consiste en ten un cromosoma o un genoma completo. Los determinar la posición de un gen o marcador -2!2&%2&6%+7/#)*$+&%&#%332-2)%mapas físicos, molecular sobre el cromosoma. Este paso es !+'5"#%#3%=\Y%#&%#3%-2/#'*23%?6&*,+%$#3%>#)+-28 importante porque los mapas genéticos pue$#)%23*)#2'&#%,+)%3+&%-2!2&%?6&*,+&%0%"/*3*I2'&#% 2.3 Secuenciación a gran escala del para validar los mismos. genoma - Generación de bancos de EST (etique- Mapeo por recombinación: en los casos tas de secuencias expresadas) en que ha sido factible hacerlo (organismos La complejidad de los genomas eucariotas experimentales como levaduras, mosca de la hace aconsejable, como primera aproxima?'"/2-#)/+&%$#%=\Y%'#!'#&#)/2$+&%#)%32%-*&-2% &+)%+'>2)*I2$+&%#)%")%-2!2%?6&*,+%0%3+&%,3+)#&%*)$*;*$"23#&%&+)%#,,*+)2$+&%0%&#,"#),*2$+&%!2'2%3+%,"23% se hace una nueva genoteca de trozos más pequeños («shotgun library»). La secuencia de los clones se #)&2-732%()23-#)/#%!2'2%'#,+)&/'"*'%32%&#,"#),*2%$#3%>#)+-28%m+$*(,2$2%$#%32%!"73*,2,*4)%$#3%F)/#')2tional Human Genome Sequencing Consortium, 2001

vida del organismo. Para ello se obtienen po732,*+)#&%$#%=\Y,%D5"#%'#O#.2)%&43+%&#,"#)cias expresadas) que se secuencian de forma masiva para generar miles de secuencias parciales conocidas como ESTs (Parte I, Cap. 8). Estas secuencias de entre 300-500 pb. suelen &#'%&"(,*#)/#&%!2'2%32%*$#)/*(,2,*4)%$#%3+&%>#nes mediante comparación con las secuencias existentes en las bases de datos públicas (ej. Genbank, EMBL), utilizando para ello programas de análisis informático (Parte I, Cap.12). Si la información contenida en la secuencia !2',*23%)+%#&%&"(,*#)/#*+)#&%,+$*(,2)/#&%$#%32&%)+%,+$*(,2)/#&#)+-2&%&#%"/*3*I2)%;#,/+'#&% ,+-+%3+&%,4&-*$+&-#)/+&%()23#&%$#3%-2'cador ligado son utilizados como sondas para seleccionar otros clones de la genoteca. Del segundo grupo de clones (los que solapan con el inicial) se hacen mapas de restricción y los =,/"23-#)/#% #B*&/#% ")2% /#,)+3+>62% -R&% fragmentos obtenidos son utilizados para reamoderna para el secuenciado de genomas, lizar una nueva ronda de selección de clones la pirosecuenciación. Esta técnica utiliza es- &"!#'!"#&/+&8%=&6% #3% !'+,#&+% $#% M,2-*)2$+N% feras atrapadas en una placa que contiene se mueve hacia ambos lados a partir del sitio 1.600.000 microceldas. Cada esfera (una por inicial, que culmina cuando se llega al gen de microcelda) permite realizar una reacción de interés. Existe otra técnica relacionada llamada &#,"#),*2,*4)%*)$*;*$"23*4)% 5"#% &#% ,'##% ,+)/*#)#% 23% de fotones, la traducida en una computadora >#)% $#% *)/#'C&8% J2$2% ?'2>-#)/+% $#% =\Y% #&% como la adición de un nucleótido determinado, luego circularizado, poniendo en contacto los generando una secuencia individual por cada extremos libres. Este procedimiento acerca ,#3$28%K&/2%/#,)+3+>62-#)/+&%#&!#,6(,+&%2%32%;2'*2,*4)%+7&#';2$28% 9+&% PYE% D!+3*-+'(&-+&% $#% ")% )",3#4tido simple) aceleran el mapeo de caracteres complejos.

4 Análisis funcional de los genes Una vez secuenciado el genoma completo !"#$#)% *$#)/*(,2'&#% 32% -20+'62% $#% 3+&% >#)#&% $#%")2%#&!#,*#8%i#&/2'62%#)/+),#&%$#/#'-*)2'% cuál es la función de cada uno de ellos y cómo *)/#'2,,*+)2)%!2'2%$#()*'%")%?#)+/*!+%$#/#'-*nado. La genómica funcional intenta resolver esta cuestión a través del estudio de: - El transcriptoma: &#%'#(#'#%23%#&/"$*+%$#% los 124%)2&$"2$2N142&'*7$"2$*,28% K3% -C/+$+% -R&% "/*3*I2$+% #&% #3% $#% -*,'+-2/'*,#&% $#%=\Y2&#+&2% 0% '#sonancia magnética nuclear) para analizar los cambios metabólicos provocados por mutaciones génicas o por la expresión de transgenes. La metabolómica puede ser aplicada al monito'#+%$#%#&/'#&#&%*)$",*$+&#)+-2%#&%&#*&%;#,#&%-#)+'%5"#%#3%$#3%-26I% y 37 veces menor que el del trigo. El estudio de estas dos especies permitirá arribar a conocimientos clave para el mejoramiento vegetal. Arabidopsis thaliana es una dicotiledónea que posee uno de los genomas vegetales más pequeños. Carece de importancia económica pero resulta ser un excelente organismo para la investigación puesto que es fácil de transformar y su ciclo de vida tarda sólo r%&#-2)2&8%K)%")%2'/6,"3+%!"73*,2$+%#)%Y2/"'#% DHVVV:%&#%2)23*I2%#3%>#)+-2%$#%='27*$+!&*&%2% partir de las 115.4 megabases secuenciadas (de un total de 125). Su evolución involucró una duplicación completa del genoma, seguida por una subsecuente pérdida y duplicación de genes, lo cual dio origen a un genoma dinámico, enriquecido por una transferencia lateral de genes de cianobacterias. Contiene 25.498 >#)#&% 5"#% ,+$*(,2)% !2'2% WW8VVV% ?2-*3*2&% $#% !'+/#6)2&'2-6)#2&'2-6)#2&% ,"3/*;2$2&'2-6)#2&% #&% !'+7273#,"3/*;2$2&%0%='27*$+!&*&#)%2%/'2;C&%$#%,+'/#&%0%#-!23-#&%23/#')2/*;+&%$#%")%-*&-+%=iY% mensajero (alternative splicing), lo que permite aumentar considerablemente la diversidad proteica a partir de los mismos mensajes. Las

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 111

Figura 7:%=3*)#2-*#)/+%$#%,'+-+&+-2&%$#%2''+I%DS'"!2dos en ciertas regiones del genoma mientras que otros se encuentran aislados. En la mosca, #3%)#-2/+$+%0%='27*$+!&*& la disposición de los genes es mucho más regular. =!'+B*-2$2-#)/#%la mitad del genoma humano consiste de secuencias repetitivas, &*#)$+% 32% -20+'62% elementos transponibles que se propagan replicándose e insertando una copia $#%&6%-*&-+&%#)%+/'2&%'#>*+)#&%$#3 genoma. En la actualidad solo dos tipos de ele-#)/+&% &+)% 2,/*;+&#)#&% &# encuentran en áreas con elevado contenido de G y C. Fragmentos de estos elementos también

112 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

se encontraron en las secuencias regulatorias que controlan la expresión de varios genes, por lo que se ha sugerido que, de alguna manera, !+$'62)% 2?#,/2'% !+&*/*;2-#)/# su expresión y evolución. Los genomas vegetales también están plagados de secuencias repetitivas (transposones y retrotransposones), que constituyen un !+',#)/2.#% -"0%*-!+'/2)/#%$#3%=\Y%)",3#2'%0% han contribuido, a lo largo de la evolución, a 32%#B!2)&*4)%$#%3+&%>#)+-2&8%K)%-26I%'#!'#sentan del 50 al 80% del genoma y en trigo el 80% (Fig. 8). De esta manera los genomas de los cereales pueden considerarse como islas de genes que se hallan dispersas en un mar de secuencias repetitivas.

7 Genómica y Agricultura Especialistas en varias disciplinas han llegado a la conclusión de que el alcance de la >#)4-*,2%&#'R%-20+'%#)%3+%5"#%&#%'#(#'#%2%32% #,+)+-62% 0% 32% ,23*$2$% $#% ;*$2% 5"#% #)% #3% R-bito de la salud humana. Gracias al aporte de grupos de investigación de todo el mundo se dispone de bases de datos públicas con información genómica de utilidad para los mejoradores. El conocimiento de cómo actúan los genes en una especie puede ayudar a los mejoradores a perfeccionar su función en otra. Las &#,"#),*2&% $#% 3+&% >#)+-2&% $#%='27*$+!&*& y de arroz proporcionan información relevante 2,#',2%$#%+/'+&%,"3/*;+&+&%#)%-26I%0%,#72$2#)#&%2&+,*2$+&% con caracteres como rendimiento, resistencia a 32%"62#)#&%,+-")#&%2&+ciados con estreses ambientales, tales como &23*)*$2$#)#&% *);+3",'2$+&% en los mecanismos que las hacen tolerantes. Dichos genes podrán entonces ser transferidos a especies de cultivo. Como ejemplos pueden citarse Agrostis adamsonii y Agrostis robusta, tolerantes a salinidad, Microlaena stipoides, tolerante a aluminio y Deschampsia antarctica, tolerante a bajas /#-!#'2/"'2&%D32%A)*,2%>'2-6)#2 que crece en 32%=)/R'/*$2:%(Fig. 9). También se ha mencionado que los factores $#% /'2)&,'*!,*4)% &#'62)% 32&% u332;#&v% !2'2% $#&bloquear funciones génicas que aprovechen la diversidad de la naturaleza para producir mejo-

Figura 9: Categorización funcional de ESTs de Deschampsia antarctica. El objetivo de este proyecto es #),+)/'2'%>#)#&%*);+3",'2$+&%#)%32%'#&*&/#),*2%2%72.2&%/#-!#'2/"'2&%!2'2%&#'%/'2)&?#'*$+&+%,+)%32%'26I%$#%")2%!32)/2% &"!#'*+'8% K&/2% 2&+,*2,*4)% )+% #&% #&!#,6(,2% $#% especie como el caso de Rhizobium y las leguminosas. El hongo puede ser de varios géneros y aporta fósforo a la planta). Recientemente &#% 3+>'4% 32% *$#)/*(,2,*4)++&% $#)+-*)2$+&%=62%!"#$#%,2-7*2'%#3%#&,#)2'*+%$#%3+&% cereales en dos áreas principales: (1) protegiendo al cultivo de estreses bióticos y abióticos y DH:% -+$*(,2)$+% #3% ,+),#!/+% $#% !'+$",,*4)% $#% «commodities» por el de producción de «specialities», por ejemplo para derivados de trigo con mayor valor agregado, como noodles (clase $#%($#+%-"0%"/*3*I2$+%#)%=&*2:233#/*/2&%$"3,#&#)/*)2%&#% ha trabajado en la secuenciación de Brucella abortus, agente causal de la brucelosis bovina. Investigadores argentinos participan también en proyectos de genómica en cooperaciones internacionales, como el consorcio involucrado en la secuenciación del genoma de Trypanosoma cruzzi, el proyecto que llevó a la clonación y caracterización de los genes de vernalización en trigo o el proyecto de búsqueda $#%>#)#&%$#%/+3#'2),*2%2%?'6+%#)%\#&,12-!&*2% antarctica. En Chile se ha completado recientemente la secuenciación de Piscirickettsia salmonis, patógeno intracelular de salmones que causa importantes pérdidas en esta industria. También se trabaja activamente en especies 1+'/6,+32&*'2&+3%0%32%*$#)/*(,2,*4)%$#%PYE&%2&+,*2$+&%2% caracteres agronómicos de importancia como la resistencia a estreses bióticos y abióticos. Por otro lado, el desarrollo de marcadores microsatélites, ESTs y el mapeo genético de las mismas es utilizado para asistir al mejoramien/+%0%'#23*I2'%*$#)/*(,2,*4)%;2'*#/238 En Chile se ha desarrollado un programa de genómica funcional coordinado por diversos ministerios, destinado a enfrentar problemas de postcosecha y enfermedades en plantas de

*)/#'C&% 2>'6,+328% [/'+% !'+0#,/+% $#% >#)4-*,2#)*)>#)%$#%n+32)$2% y en la que están comprometidos China, Estados Unidos, Holanda, India, Inglaterra, Irlanda, Nueva Zelanda, Polonia, Rusia y los &"$2-#'*,2)+&%J1*3##)/*)2%0%^'2&*38% Estos últimos, en conjunto, secuenciarán el cromosoma 3 del genoma de la papa y en total se deberán secuenciar los 12 cromosomas de la especie. K)% ;2'*+&% !26&#&% &#% 12)% &#,"#),*2$+% fragmentos de genomas de virus y viroides D='>#)/*)2#)/*)2% &#% esta realizando la caracterización biológica 0% -+3#,"32'% $#3% ;*'"&% $#3% -23% $#% i6+% J"2'/+% DmiJG:%,+)%#3%()%$#%#&/*-2'%32%$*;#'&*$2$%>#nética de las poblaciones del virus, detectar la existencia de razas y limitar la propagación de #&/2%#)?#'-#$2$%$#%*-!+'/2),*2%!2'2%#3%-26I8 K)% #3% 2Q+% HVVS% 32% =>#),*2% Y2,*+)23% $#% E'+-+,*4)% J*#)/6(,2% 0% T#,)+34>*,2% $#% ='>#)/*)2% D=YEJ0T:% 32)I4% ")2% ,+);+,2/+'*2% !2'2% E'+0#,/+&% $#% Ž'#2% $#% G2,2),*2% DE=G:62%-+3#,"32'8%K)%3+&%$+&%!'*meros subproyectos se encararon trabajos de prospección y caracterización funcional de regiones genómicas de interés en plantas superiores y bacterias zoonóticas mediante el aná3*&*&%$#%!#'(3#&%$#%/'2)&,'*!,*4)#)C/*,2%$#%#&!#,*#&%#)% peligro de extinción en ecosistemas naturales explotados por el hombre) y encarar la epide-*+3+>62% -+3#,"32'% $#% 32% (#7'#% 2?/+&2% 0% $#% 32% peste porcina clásica. K&/#%!'+0#,/+%2,272%$#%()23*I2'%D&#!/*#-7'#% de 2008) y, si bien aún no se ha realizado la #;23"2,*4)% ()23% $#3% -*&-+#)#&%$#3%>#'-+!32&-2% regional, de manera de disminuir la dependencia de variedades y genes desarrollados y ais32$+&%!+'%!26&#&%$#3%!'*-#'%-")$+%0%7"&,2'%&+luciones para problemas propios de la región, 5"#% $*?6,*3-#)/#% !"#$#)% &#'% #)?'#)/2$+&% !+'% programas de mejoramiento genético ajenos a la misma. 11 Lecturas / sitios recomendados J#),*%=8%b8%=)$%K,1#)*5"#% V. 2008. Expressed sequence tag analysis and development of gene associated markers in a near-isogenic plant system of Eragrostis curvula. Plant Molecular Biology. 67: 1-10. \#;+&%`8m%}%b23#%m8\8 2000. Genome relationship: the grass model in current research. Plant Cell 12: 637-646 K,1#)*5"#% G8#)#&%A)*,+&%#&!#,6(,+&% (como el Northern, slot, y dot blotting, la RTPCR semicuantitativa y cuantitativa y los ensayos de protección de nucleasas) hacia otros #)?+,2$+&% #)% 32% *$#)/*(,2,*4)% $#% -A3/*!3#&% /'2)&,'*!/+&%5"#%$*(#'#)%#)%&"%'#!'#&#)/2,*4)% entre las diversas muestras experimentales (como la hibridización substractiva, el display $*?#'#),*23#)#&%+%P=bK%0%32%1*bridización de microarreglos). La organización posterior de las secuencias dentro de grupos ?"),*+)23#&%72&2$2%#)%3+&%$2/+&%$#%1+-+3+>62% proporciona un marco básico para conducir )"#;+&%#&/"$*+&%$*'*>*$+&%2%$#()*'%#3%'+3%7*+34gico de cada producto génico. Por otra parte, la aplicación de técnicas de PCR en tiempo real y de hibridización in situ de tejidos permiten una validación más precisa de los datos de expresión diferencial obtenidos por métodos anteriormente citados. La capacidad tecnológica creciente permite ahora capturar sectores de tejidos o incluso células aisladas y analizar su contenido de =iY-62&% que son utilizadas habitualmente para el análisis del transcriptoma de plantas. Debido al muy rápido cambio y perfeccionamiento en las técnicas empleadas para abordar el estudio de la representación de mensajeros tanto a nivel de mesada como bioinformático, algunas de las -#/+$+3+>62&% -#),*+)2$2&% 25"6% 02% 12)% &*$+% reemplazadas y se usan actualmente en forma poco frecuente. Sin embargo hemos decidido incluirlas, dada su gran importancia histórica en relación al cambio de abordaje conceptual que va desde el análisis de la actividad de genes únicos al estudio integral de la expresión génica. Comenzaremos describiendo las técnicas en orden cronológico de desarrollo. Hibridización substractiva Los métodos de hibridización substractiva fueron creados a principios de los años 80 con #3% !'+!4&*/+% $#% ,+)&/'"*'% 7*73*+/#,2&% $#%=\Y,% para obtener sondas de genes expresados diferencialmente. Fueron los primeros que se utilizaron de manera amplia con el propósito $#%*$#)/*(,2'%>#)#&%'#>"32$+&%!+&*/*;2%+%)#>2tivamente en una escala global. Sus ventajas incluyen la habilidad de aislar genes de función relacionada sin tener conocimientos previos de su secuencia o identidad y el uso de téc)*,2&% ,+-")#&% $#% 7*+3+>62% -+3#,"32'% 5"#% )+% requieren equipos especializados de detección y análisis. El procedimiento general consiste #)% 32% 1*7'*$*I2,*4)% $#% ")% =\Y,% !'+;#)*#)/#% de una muestra prueba (tester) con un exceso $#%=iY-%!'+;#)*#)/#%$#%")2%-"#&/'2%,+)/'+3% (driver). Los transcriptos expresados en ambas muestras (tester y driver) forman moléculas de =iY-_=\Y,% 167'*$2&#)#'2%")2%-#$*$2%,"2)/*/2/*;2%0%2")5"#%#&%#(,*#)/#%#)%32%*$#)/*(,2,*4)% de genes que están completamente ausentes en el driver no revela fácilmente a aquellos que están presentes en ambas muestras en distinta !'+!+',*4)8%P#%'#23*I2'+)%-+$*(,2,*+)#&%!2'2% mejorar el protocolo original que incluyen la !'+$",,*4)% $#%=\Y,% ,+)% -2',2&% $#% 7*+/*)2% +% +3*>+D$T:SVL3R/#B% $#% -2)#'2% $#% '#()2'% 32% &#paración de las moléculas de cadena simple 0%$+73#8%T2-7*C)%&#%*),+'!+'4%32%2-!3*(,2,*4)% $#%=\Y,&%#,/+&%!+'%EJi%!2'2%$*&-*)"*'%32% ,2)/*$2$% *)*,*23% $#%=iY-% '#5"#'*$+% 0% 2"-#)/2'%32%#(,*#),*2%$#%,3+)2$+%$#%3+&%/'2)&,'*!/+&% seleccionados. También se ha utilizado un protocolo ingenioso conocido como hibridización substractiva de supresión (SSH) que fue diseñado para favorecer la detección de transcriptos raros expresados diferencialmente. Este incluye una normalización en la representación de los transcriptos diferenciales basada en la *)1*7*,*4)% $#% 32% 2-!3*(,2,*4)% $#% 25"#33+&% 5"#% son más abundantes, eliminando también la necesidad de separar moléculas de cadena doble y simple (ver Figura 1). Display diferencial y RAP-PCR Las técnicas conocidas en general como u1"#332&%$*>*/23#&%$#%=iYv%D=iY%()>#'!'*)/*)>:% incluyen al display diferencial (DD) y la PCR $#% =iY% ,#72$2% 2'7*/'2'*2-#)/#% Di=ELEJi:8% =-7+&% -C/+$+&% #&/R)% 72&2$+&% #)% ")2% 2-!3*(,2,*4)% !+'% EJi% $#% &"7>'"!+&% 23% 2I2'% $#% transcriptos a partir de dos o más muestras. La primera etapa de ambos procedimientos es ,+-A)%0%,+)&*&/#%#)%>#)#'2'%=\Y,&%12,*#)$+% una transcripción reversa de una fracción de 32&% -+3C,"32&% $#% =iY-% $#% ")2% -"#&/'28% K)%

el display diferencial esto se logra utilizando como cebador de la transcripción reversa a un poliT anclado con una o más bases adicionales 23%#B/'#-+%S€%$#3%=iY%-#)&2.#'+%D!+'%#.#-!3+% (T)12=J:8%K&/+&%+3*>+)",3#4/*$+&%&#%(.2)%23%=iY% mensajero a través de la unión de las bases adicionales, impidiendo que el poliT “resbale” &+7'#%$*&/*)/2&%I+)2&%$#3%!+3*%=8%K3%A)*,+%>'"!+% $#%=iY-&%5"#%#&%/'2)&,'*!/+%#)%?+'-2%'#;#'&2% es el integrado por las moléculas que llevan las bases complementarias a las bases adicionales del poliT en el extremo del mensajero adya,#)/#%23%!+3*=8%K)%,+)/'2&/#+%$#%127#'&#%'#23*I2$+%32%&6)/#&*&%$#%32% !'*-#'%1#7'2%$#3%=\Y,-#)tos de los transcriptos usando pares múltiples de cebadores de PCR. Tanto para el display $*?#'#),*23%,+-+%!2'2%#3%i=ELEJi'2)%3+,23*I2)$+%?6&*,2-#)/#%0%#&,*)$*#)$+%32% sección del gel de poliacrilamida que contiene 23% !'+$",/+% $#% *)/#'C&8% K)% 32% -20+'62% $#% 3+&%

casos debe realizarse un alineamiento de las *-R>#)#&% $#% 3+&% ?'2>-#)/+&% $#% 2-!3*(,2,*4)% con el gel de poliacrilamida seco. En los casos en que se utiliza tinción con nitrato de plata no es necesario realizar este paso, por lo cual la '#,"!#'2,*4)% $#% 32% 72)$2% #&% -",1+% -R&% #(,*#)/#8%9+&%!'+$",/+&%$#%EJi%&+)%!"'*(,2$+&% $#3%>#3%0%'#2-!3*(,2$+&8%E2'2%#33+%#3%?'2>-#)/+%

124 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

de poliacrilamida se procesa en fragmentos pe5"#Q+&%,+)%")%76&/"'6%5"#%&#%/'2)&(#'#)%2%")2% solución tampón adecuada para la elución de los fragmentos. Luego de una centrifugación, #3%&+7'#)2$2)/#%&#%!"'*(,2%,+)%?#)+3_,3+'+?+'-+%0%#3%=\Y%&#%!'#,*!*/2%,+)%#/2)+3#)#&% que están regulados tanto positiva como negativamente en una muestra respecto de las +/'2&8%P*)%#-72'>+#'!'*)/*)>%$#%=iY%,+-!2'/#)%,+)%#3%PPn%32%3*-*/2,*4)% de que no son cuantitativos. Uno de los problemas que suelen atribuirse 2%$*&!320%$*?#'#),*23%#&%32%2-!3*(,2,*4)%$#%?23sos positivos o sea fragmentos de genes que parecen estar diferencialmente expresados pero son luego cosiderados artefactos de PCR porque no pueden validarse por Northern blot o PCR en tiempo real. Es necesario dar una mirada más detallada a este punto. Es cierto 5"#%#&%*-!'#&,*)$*73#%'#23*I2'%32&%2-!3*(,2,*+nes de DD PCR por duplicado o triplicado para 2&#>"'2'&#% 5"#% 32% 2-!3*(,2,*4)% #&% '#!'+$",*ble y no se trata de una banda espuria. Pero una vez superado este punto de la reproduci7*3*$2$%$#%32%2-!3*(,2,*4)#)C/*,2&% $#% \Y=% genómico, puede ser aplicada también a pre-

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 125

!2'2,*+)#&%$#%=\Y,%$#%$+73#%1#7'2%!2'2%+7/#)#'%")%!#'(3%$#3%/'2)&,'*!/+-28%9+&%!2/'+)#&% obtenidos por esta técnica son una herramien/2%,+)(273#%0%#(,*#)/#%!2'2%32%*$#)/*(,2,*4)%$#% =iY-&% #B!'#&2$+&% $*?#'#),*23-#)/#8% 92% /C,)*,2% $#% =\Y,L=j9E' detecta fragmentos de '#&/'*,,*4)%$#%\Y=%!+'%-#$*+%$#%2-!3*(,2,*4)% por PCR. Comprende las siguientes etapas: i) >#)#'2,*4)% $#%=\Y,-#)/+&% $#% '#&/'*,,*4)% 2-!3*(,2$+&% en geles de poliacrilamida, vi) visualización de las huellas digitales genéticas mediante el uso $#%2"/+'2$*+>'2?62&#)#&%0%+/'+&%-Ctodos (ver Figura 3). AAAAAAAAAAAAAn(A)A

mRNA

TTTTTTTTTTTTTT Cebador Oligo dT

AAAAAAAAAAAAAn(A)A TTTTTTTTTTTTTT Síntesis de cDNA

cDNA Digestión con las endonucleasas de restricción

Ligación de los adaptadores

Preamplificación con los cebadores

Amplificación selectiva de fragmentos

YX XY YX

Huella digital (Fingerprint)

Figura 3.

126 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

XY

Las mayores ventaja del uso de la tecno3+>62% $#%=\Y,L=j9E' son: i) no se requiere información previa de secuencia; ii) se puede estudiar una fracción muy grande de todos los genes expresados, iii) es una técnica muy sensible que permite la detección de transcriptos de baja abundancia, iv) los fragmentos son ex/'26$+&% ?R,*3-#)/#% $#% 3+&% >#3#&% 0% 32&% &#,"#)cias correspondientes pueden determinarse sin necesidad de clonados previos.

normalizadas para ecualizar la abundancia de clones que corresponden a los diferentes transcriptos. Los EST secuenciados a partir de estas últimas pueden ser comparados para *$#)/*(,2'%/'2)&,'*!/+&%5"#%&#%#B!'#&2)%#)%")2% biblioteca y están completamente ausentes en otra, pero si se pretende obtener datos cuantitativos exactos que describan abundancia relativa se debe recurrir indefectiblemente a bi73*+/#,2&%$#%=\Y,&%)+%)+'-23*I2$2&8%T2-7*C)% existen productos comerciales que permiten la Etiquetas de secuencia expresadas construccion de bibliotecas donde los transcrip(Expressed sequence tags, ESTs) /+&%12)%&*$+%2-!3*(,2$+&%!#'+%-2)/#)*#)$+%32% La secuenciación exhaustiva de ESTs proporción relativa de unos respecto a otros, (Expressed Sequence Tags) es considerado lo que facilita la comparación cuantitativa entre principalmente un método para la caracteriza- muestras. ción de la expresión génica, a pesar de que la Las ESTs requieren de varias etapas de progeneración de ESTs resulta también importan- cesamiento, ensamblado en grupos (contigs) te para deducir la presencia de genes no pre- y anotación para que se pueda extraer infordichos en ausencia de datos genómicos. Las mación biológica a partir de las mismas. Para ESTs son obtenidas a gran escala por secuen- esto, resulta muy importante el almacenamien,*2,*4)%$#%")2%&+32%1#7'2%$#%,3+)#&%$#%=\Y,% to, la organización y la anotación de estas se(aproximadamente 500 pb) provenientes de cuencias utilizando distintas herramientas inbibliotecas que representan distintos tejidos o formáticas (revisadas por Nagaraj et al., 2007). condiciones experimentales. Las ESTs representan descripciones parciales de las regiones Análisis serial de la expresión de genes que se transcriben de un genoma. Una canti- (SAGE) dad creciente de centros de investigación han El análisis serial de la expresión de genes ,+)&/'"6$+%0%&#,"#),*2$+%7*73*+/#,2&%$#%=\Y,% DP=bK:%,+)&*&/#%#&#),*23-#)/#%#)%")2%;#'&*4)% #)%3+&%A3/*-+&%2Q+&8%K&/2%/#)$#),*2%&#%;#%'#O#- acelerada de la secuenciación de ESTs. Está jada en el número de ESTs depositadas en la basada en el concepto de que una etiqueta base de datos del NCBI (ESTdb), el que al 6 de ,+'/2%$#%")2&%!+,2&%72&#&%#&%&"(,*#)/#%!2'2% Junio de 2008 es de 2994249 provenientes de *$#)/*(,2'% *)#5"6;+,2-#)/#% 2% ")% /'2)&,'*!/+'#% 32% &2/"'2,*4)% $#% ")2% mA3/*!3#&%#/*5"#/2&%P=bK%&#%3*>2)%.")/2&%#)%")% biblioteca. Teóricamente, si se secuencia el nú- vector de clonado de manera que una reacción -#'+%&"(,*#)/#%$#%KPT&"'2% ]:8% J+-+% ,2$2% #/*5"#/2% P=bK% de secuencias obtenidas es limitado conviene '#!'#&#)/2% ")% A)*,+% /'2)&,'*!/+% $#%=iY-'2?62% '#,+-#)$2$2:8% ^'#;#-#)/#++%$#%3+&%?'2>-#)/+&% 2%HW%!7%0%P"!#'P=bK%2%Hc%!7-#)/+&% +7/#)*$+&% -#$*2)/#% P=bK% no se pueden utilizar directamente en bús5"#$2&%$#%1+-+3+>62%,+)%&#,"#),*2&%,+)/#)*das en bases de datos debido a que son muy cortos. Para poder asignar un gen a un dado fragmento es necesario contar con una base de datos de referencia construida previamente. Esta base de datos contiene información de fragmentos obtenidas in silico a partir de secuencias conocidas de transcriptos o de genes de la especie en estudio. Si un fragmento aisla$+%#B!#'*-#)/23-#)/#%!'#&#)/2%1+-+3+>62%,+)% una secuencia presente en la base de datos P=bK% $#% '#?#'#),*262%$#%&#,"#)cia. Es importante mencionar que las bases de datos de referencia pueden ser incompletas, debido a que comúnmente se incluyen en las mismas secuencias de alta calidad y anotadas !2'2% 2"-#)/2'% 32% #&!#,*(,*$2$8% P*)% #-72'>+-#)/+%!"#$#%!'#&#)/2'%1+-+3+>62%,+)%-R&% $#%")%>#)*)2'&#%#''+'#&%#&!#,6(,+&%!2'2%")%$2$+%?'2>-#)/+8% =$#-R&%&#%12%+7&#';2$+%5"#%32&%&#,"#),*2&% obtenidas por esta técnica presentan un ma-

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 129

yor contenido de G+C, lo que sugiere una pre?#'#),*2% $#% 2-!3*(,2,*4)% 5"#% ,+-!'+-#/#% 32% #B2,/*/"$%$#%32%,"2)/*(,2,*4)8 \+&% ;#)/2.2&% *-!+'/2)/#&% $#3% P=bK% &+7'#% la hibridización substractiva y el display diferencial es que los datos obtenidos son cuan/*/2/*;+&% 0% 2,"-"32/*;+&8% P*% &#% >#)#'2% 32% &"(ciente cantidad de información de secuencia &#%+7/*#)#)%!#'(3#&%#B2,/+&%$#%32%#B!'#&*4)%$#% los transcriptos, que describen la abundancia de todos los genes expresados en una célula o tejido. Existe una base de datos pública de expresión génica que ha sido creada para el almacenamiento y análisis de secuencias de P=bK%,"0+%!+$#'%,+)/*)"2'R%,'#,*#)$+%2%-#dida que se contribuya con más información. [/'2% ,2'2,/#'6&/*,2% $#% 3+&% $2/+&% $#% P=bK% #&% que pueden complementar otros de ESTs ge)#'2$+&% 2% !2'/*'% $#% 7*73*+/#,2&% $#%=\Y,% )+'-23*I2$2&%+%&"7&/'26$2&8%9+&%KPT&%7'*)$2)%*)?+'-2,*4)%$#%&#,"#),*2%-*#)/'2&%5"#%#3%P=bK% provee datos cuantitativos describiendo la abundancia de los transcriptos. Finalmente, a !#&2'%$#%5"#%#3%P=bK%'#5"*#'#%,2!2,*$2$%$#% secuenciación de última generación, la cantidad de datos que aporta puede ser 20 veces mayor que el que posibilita la misma cantidad de secuenciación EST. Hibridización de microarreglos Los microarreglos han revolucionado la bio3+>62% -+3#,"32'8% K&/2% /C,)*,2% "/*3*I2% ,*#)/+&% 2% miles de sondas altamente organizadas sobre ")2%&"!#'(,*#%&43*$2%!2'2%*)/#''+>2'%$#%-2)#'2% &*-"3/R)#2% 2% /+$2&% 32&% -+3C,"32&% $#% =iY% D$#()*$2&% ,+-+% 732),+&:% ,+)/#)*$2&% #)% ")2% muestra biológica. Las muestras a ser analiza$2&%&#%-2',2)%O"+'#&,#)/#-#)/#%+%'2$*2,/*;2mente y se aplican al microarreglo. Los ácidos nucleicos marcados hibridan con las moléculas $#% =\Y% ,+-!3#-#)/2'*2&% 5"#% &#% #),"#)/'2)% inmovilizadas en el microarreglo. La fuerza de 32%&#Q23%O"+'#&,#)/#%+%'2$*2,/*;2%,2!/"'2$2%!+'% 32&%&+)$2&%$#%=\Y%#)%#3%2''#>3+%#&%$#/#,/2$2%0% $*>*/23*I2$2%!2'2%&"%,"2)/*(,2,*4)8% Los microarreglos fueron originalmente diseQ2$+&%!2'2%*$#)/*(,2'%$*?#'#),*2&%$#%#B!'#&*4)% génica en dos muestras distintas basadas en las cantidades relativas de blancos unidos a una sonda determinada en el arreglo. La utili-

$2$%$#%32%/C,)*,2%&#%;#%'#O#.2$2%#)%&"%2-!3*2% variedad de aplicaciones que abarca desde el análisis de expresión génica hasta estu$*+&% $#% =\Y% >#)4-*,+% D,+-+% Comparative Genomic Hybridization - CGH- y Chromatin Immunop"'*(,2/*+)% -*,'+2''20&% L% ,+)+,*$+&% como ChIP-chips). Sin embargo, en este ca!6/"3+%&43+%$#&,'*7*'#-+&%3+&%-*,'+2''#>3+&%$#% =\Y,%0%$#%+3*>+)",3#4/*$+&2)%$#%&+)$2% !+'%,2!*32'*$2$%0%32%/#)&*4)%&"!#'(,*23%#)/'#%#3% buffer y el vidrio actúa para descargar las sondas. Las perturbaciones en la estructura de las descargas son frecuentes y son una fuente sig)*(,2/*;2%$#%;2'*2,*4)%$#%32%&#Q238%P*%7*#)%#B*&ten otras alternativas, la utilización de robots es la más popular debido a su disponibilidad, 23/2% O#B*7*3*$2$% 0% 72.+&% ,+&/+&8% 9+&% &"&/'2/+&% inertes sobre los cuales se depositan las sondas son variados. Los portaobjetos de vidrio cubiertos con poli-L-lisina fueron gradualmente reemplazados por sustratos con aminosilano comerciales debido a su mayor consistencia #)% ,"2)/+% 2% 32% -+'?+3+>62% $#% 32&% $#&,2'>2&8% E2'2% #&/#% /*!+% $#% 5"6-*,2&62&%!2'2%&+3",*+)2'% este problema como por ejemplo la generación de puntas de cerámica más uniformes. La evaporación durante el proceso de impresión de los microarreglos es la principal causa de variabilidad. La evaporación reduce el volumen de solvente en las microplacas de 384 pocillos y dentro del reservorio capilar de las puntas, lo que produce un aumento de concen/'2,*4)% $#% 32&% &+)$2&% 0% 23/#'2% 32&% ,2'2,/#'6&ticas de la solución de descarga. Como consecuencia de esto, las propiedades del punto &#-7'2$+%0%32%$*&/'*7",*4)%$#%32%&+)$2%$#%=\Y% $#)/'+% $#3% R'#2% $#3% -*&-+% &#% -+$*(,2)8% K&/#% problema se puede solucionar en parte regulando las condiciones de humedad y temperatura dentro de la cámara del robot donde se realiza la impresión de los microarreglos. Dado que existen numerosas interacciones entre los distintos componentes del proceso, no es sencillo predecir en forma exacta cómo va a resultar la combinación entre una solución de siembra y un sustrato determinados. Sin embargo, se están realizando constantemente estudios para examinar este proceso que, suma-

$+&%23%$#&2''+33+%$#%)"#;2&%/#,)+3+>62&#)3+8%=$#-R&% de detectar transcriptos estos chips permiten realizar hibridaciones comparativas de geno-2&%!2'2%$#/#,/2'%$#3#,*+)#&%0%!+3*-+'(&-+&#)C/*,2% 0%2%-+$*(,2'%#&/'",/"'23-#)/#%32%-+3C,"32% $#% manera de alterar la actividad de los diferentes $+-*)*+&%$#%32%!'+/#6)2%5"#%,+$*(,28

Tabla 1: Comparación de los principales métodos de relevamiento del transcriptoma. Características Detecta transcriptos conocidos Detecta transcriptos desconocidos Detecta transcriptos con splicing alternativo Detecta transcriptos antisentido Cuantificación Sensibilidad Especificidad Reproducibilidad

Comparable entre si

Costo

SAGE/ESTs

Microarreglos

DD/cDNAAFLP

Hibridización sustractiva

Sí Sí Sí

Sí No Sí o no

Sí Sí Sí

Sí Sí No

Sí Absoluta Alta Moderada Buena para transcriptos abundantes

Sí o no Relativa Moderada Alta Buena para datos obtenidos con la misma plataforma

Sí Relativa Alta Moderada Buena para transcriptos abundantes

Buena para transcriptos abundantes Más alto que el de microarreglos

Buena para transcriptos abundantes 5-10 veces menor que el de SAGE

Sí Relativa Alta Moderada Requiere realización de duplicados o triplicados Buena para transcriptos abundantes Muy bajo

Adaptado de Wang 2006 understanding SAGE data, Trends in Genetics.

134 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

Buena para transcriptos abundantes Muy bajo

Para maximizar el potencial de la transcriptómica es necesario un cambio de paradigma respecto a la interpretación de los resultados obtenidos en este tipo de experimentos. Este cambio de paradigma implica comprender que los datos de expresión no están libres de errores y aceptar que la variabilidad biológica espacio-temporal es una parte inherente y cuan/*(,273#%$#%#&/#%/*!+%$#%#B!#'*-#)/+&8%=%!#&2'% de que los continuos cambios en la expresión de genes en tiempo y espacio colocan al investigador en un escenario de arenas movedizas, es mucha y muy relevante la información que puede obtenerse de este tipo de estudios. Esta transición en la interpretación de los resultados será más fácil si se delinea claramente la diferencia entre proponer una función biológica a partir de simples datos de expresión y postular una hipótesis que debe luego validarse en base a datos experimentales concretos. Biblografía Recomendada =$2-&#)+-#%2)230&*&% in plants. The Plant Journal, 53, 636-644. b"'&q202#$8+'>_o+'k>'+"!&_mF=mK_-*2-#81/-3 Moody D. E. 2001. Genomics techniques: an over;*#U% +?% -#/1+$&% ?+'% /1#% &/"$0% +?% >#)#% #B!'#&&*+)8%l8%=)*-8%P,*8%rh%DK8%P"!!38:g%KWHpLKWSe8 Nagaraj S.H., Gasser R.B. and Ranganathan S. HVVr8% =% 1*/,11*q#'&% >"*$#% /+% #B!'#&&#$% &#quence tag (EST) analysis. Brief Bioinform., 8, 6-21. NimbleGen: 1//!g__UUU8)*-73#>#)8,+[q"7+% value to plant microarray experiments. Plant methods, 2:1.

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 135

I CAPÍTULO 9 Proteómica E2"32%J2&2/*%0%m2'62%j8%\'*),+;*,1 1. Introducción La proteómica, entendida como el estudio del patrón proteico de una célula u órgano, se encuentra ya en su segunda década como campo de estudio. Durante la primera década, la mayor parte de los estudios se realizaron principalmente mediante el uso de geles en dos dimensiones seguidos de técnicas de tinción convencionales. Si bien estos métodos continúan siendo utilizados de manera importante, durante esta segunda década otros métodos más sensibles y que además presentan mayor reproducibilidad han comenzado a ser utiliza$+&8%K&/2&%/C,)*,2&%12)%&*$+%,32&*(,2$2&%,+-+% “proteómica cualitativa”. Muchos de estos métodos están siendo aplicados en experimentos $#%7*+3+>62%;#>#/238%E+'%#.#-!3+#3##&% 7*$*mensionales son una herramienta para la resolución y visualización de isoformas proteicas, !'+$",/+&% $#% $#>'2$2,*4)% 0% -+$*(,2,*+)#&% postraduccionales; además de permitir el cál,"3+%#-!6'*,+%$#%32%-2&2%-+3#,"32'#)#'2$2%"/*3*I2)$+%")%#&,R)#'%$#%O"+'#&,#)cia capaz de adquirir las imágenes provenien/#&%$#%,2$2%")+%$#%3+&%O"+'#&,#)/#&%"/*3*I2$+&8% Esta técnica es muy sensible, ya que permite resolver alrededor de 1000 puntos proteicos ,+)%&+3+%eV%‹>%$#%!'+/#6)2&%&#-7'2$2#&% FKj_P\PLE=bK8% Esta técnica se basa en la integración de una ,2'>2%)#/2%)#>2/*;2%#)%32&%!'+/#6)2&%0%,+-!3#jos proteicos por adición del colorante azul de Coomassie, y permite la separación en condiciones nativas en la primera dimensión. En la &#>")$2%$*-#)&*4)%&#%'#23*I2%")%P\PLE=bK+%$#%32%#&!#,/'+-#/'62%$#%-2&2&'2?62% !'#;*+% 23% 32% &"!#'(,*#8% K)% 32% >+/2% &#% >#)#'2% ")2% '#!"3- 2)R3*&*&% !+'% mP8% 92% #&!#,/'+-#/'62% $#% -2&2&%

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 139

Tabla 1. Páginas disponibles correspondientes a bases de datos para identificación de proteínas para el análisis posterior a la espectrometría de masas ExPASy Proteomics MASCOT Prosight PTM Protein Prospector GPM PROWL

#3%5"#%32%-2',2%#&%*)/'+$",*$2%2%32%!'+/#6)2%+% 2%3+&%!C!/*$+&")+&%!C!/*$+&%&+)%#,,*+)2$+&% diferentes, permitiendo una comparación diy son fragmentados individualmente para ob- recta de las intensidades de los iones de las tener un segundo espectro MS (MS/MS) que dos mezclas. En principio, las dos muestras a permite obtener la secuencia de aminoácidos comparar pueden ser mezcladas al comienzo del péptido. La señal o integración de los picos del experimento, por lo que se eliminan virtualde los iones puede ser utilizada como técnica mente todas las potenciales variaciones téc$#% ,"2)/*(,2,*4)'2?62%365"*$2%,+-+%2%)*;#3% técnica es recomendable para sub-proteomas, de los pasos de ionización, hacen que la comcomo por ejemplo el fosfoproteoma. !2'2,*4)%$#%32&%*)/#)&*$2$#&%)+%%,+)(273#8% Por ello, se han desarrollado diferentes técni4.2. Marcado isotópico in vitro. ,2&% $#% -2',2$+% $#% 32&% !'+/#6)2&% 5"#% !#'-*Una alternativa es introducir la marca en los ten una directa comparación de los picos en !C!/*$+&% $#% -2)#'2% 5"6-*,2% $"'2)/#% +% 3"#>+% un mismo espectro MS o MS/MS. La base de $#%32%$*>#&/*4)%$#%32&%!'+/#6)2&8%X)2%;#)/2.2%$#% todas estas técnicas es la misma: se introdu- esta técnica es que cualquier muestra proteicen marcas inertes, estables e isotópicas a los ca puede ser marcada, eliminando la limitación péptidos de manera que los patrones de ioni- que existe al querer introducir la marca en una I2,*4)% 0% 32&% !'+!*#$2$#&% ,'+-2/+>'R(,2&% $#% célula viva. La mayor desventaja es el cuidado los péptidos marcados sean similares a los de que hay que tener para no introducir variaciolas muestras de origen, pero pueden ser dife- nes técnicas durante la obtención de la muesrenciados luego del análisis por un leve corri- tra proteica (en especial si existe algún paso de miento en el espectro de MS. De esta mane- fracción subcelular). ra, las dos muestras a comparar pueden ser corridas de manera simultánea y analizadas 4.2.1. Marcado con 18O durante la digestión a partir de un mismo experimento. Por ello, la con tripsina separación de los péptidos seguida de la cuan\"'2)/#% 32% 1*$'43*&*&% $#% 32&% !'+/#6)2&% ,+)% /*(,2,*+)%$#%3+&%*+)#&%'#O#.2%32%27")$2),*2%'#- /'*!&*)2#)+% $#3% 2>"2% &#% *),+'!+'2% 23% 32/*;2%$#%,2$2%!'+/#6)2%*)/2,/2%$#%32%,"23%$#'*;2% J%/#'-*)23%$#3%!C!/*$+%/'6!/*,+8%E+'%3+%/2)/+2&#+&2&3",2)2&2&#)% $#% 32% palabra metabolismo procede del griego metabolé% 5"#% &*>)*(,2% ,2-7*+-#)/+&%$#%32&%O+'#&:8%K)% las plantas, se estima que el número total de metabolitos supera los 200.000. El análisis del metaboloma de un sistema biológico dado es conocido como metabolómica. Este término no &*#-!'#% /*#)#% #3% -*&-+% &*>)*(,2$+'R(,2&% $#% &#!2'2,*4)% #)% $*&/*)/2&% ?2&#&% D>2&#+&22&8%KB*&/#)%$*?#'#)/#&%!'+tocolos en cuanto a las condiciones y tiempos

146 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

de corrida y se utilizan columnas diferentes en función del tipo de muestras y moléculas a analizar. Las moléculas se separan de acuerdo 2%&"&%!'+!*#$2$#&%?6&*,2&%0%5"6-*,2&%0%23%()23% de la columna, un detector emite una señal que es registrada como una serie de picos los que ,+)&/*/"0#)%#3%,'+-2/+>'2-28%K)%32%(>"'2%W%&#% observa un cromatograma obtenido luego de aproximadamente 40 minutos de corrida de una muestra de extractos de frutos de tomate. El ápice de un pico dado representa el momento de mayor intensidad registrado y se lo conoce como el tiempo de retención (RT) de ese grupo de moléculas. El RT es una propiedad de 32&%-+3C,"32&%5"#%!#'-*/#%32%*$#)/*(,2,*4)% $#% las mismas en el cromatograma. Sin embargo, dada la necesidad de volatilizar los extractos, es necesario un tratamiento !'#;*+% $#% 3+&% -*&-+&% 2% ()% $#% /'2)&?+'-2'% 32&% moléculas en compuestos menos polares y más volátiles. Este paso, denominado deriva/*I2,*4)'"!+&%5"6micos (tales como sililo -Si(CH3)3- y metoxi) a las moléculas que componen la muestra com-

pleja. Si bien se han desarrollado diferentes métodos de derivatización, esta etapa constituye la principal desventaja de la cromatogra?62%>2&#+&2%$2$2%32%$*;#'&*$2$%$#%!'+!*#$2$#&% (&*,+L5"6-*,2&%$#%32&%-*3#&%$#%-+3C,"32&%5"#% componen un extracto crudo. La principal di(,"3/2$% '2$*,2% #)% 32% #B2,/2% *$#)/*(,2,*4)% $#% los fragmentos obtenidos luego de la ionización de las distintas moléculas (ver siguiente &#,,*4)g%uK&!#,/'+-#/'62%$#%-2&2&8%E'*),*!*+&% básicos”). En este sentido, la aplicación de la cromato>'2?62%#)%?2&#%365"*$2%D9J:%,+)&/*/"0#%")%,+-plemento importante a la gaseosa y contribuye a expandir el rango de aplicaciones de las /C,)*,2&%,'+-2/+>'R(,2&%#)%-#/27+34-*,28%P*% bien la resolución de ésta es menor que la gaseosa, permite la separación de compuestos de mayor peso molecular y polaridad sin la necesidad del paso de derivatización previamente mencionado. No obstante los avances en el conocimiento #)% ,"2)/+% 2% 32% &#!2'2,*4)% #% *$#)/*(,2,*4)% $#% ,+-!"#&/+&%+'>R)*,+&2&#+&28%P+7'#%32&%+'$#)2$2&%&#%>'2(,2)%32&%*)/#)&*$2$#&%'#32/*;2&%$#%,2$2%>'"!+% $#%-+3C,"32&%&#!2'2$+8%^2.+%,+)$*,*+)#&%#B!#'*-#)/23#&%$#()*$2&%#&/2&%*)/#)&*$2$#&%&+)%!'+!+',*+)23#&% a la cantidad de la molécula en análisis presente en una muestra dada.

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 147

'#&"#3/+% 2A)% 32% #B2,/2% *$#)/*(,2,*4)% $#% -+3Cculas individuales presentes en una muestra compleja. El empleo de sistemas de cromato>'2?62% 2,+!32$+&% 2% #&!#,/'+-#/'62% $#% -2&2&% '#&"3/2% $#% >'2)% "/*3*$2$% #)% 32% *$#)/*(,2,*4)% $#% moléculas que se encuentran en trazas en una muestra compleja con un grado de exactitud de hasta 3-4 decimales. Espectrometría de masas. Principios básicos. 92% #&!#,/'+-#/'62% $#% -2&2&% #&% ")% -C/+$+% 5"#% !#'-*/#% 32% *$#)/*(,2,*4)% $#% -+3C,"32&% 2% partir del patrón de fragmentos que se generan 3"#>+%$#%32%*+)*I2,*4)%$#%32&%-*&-2&8%=%#&/#%!2trón se lo denomina espectro de masas y constituye la “huella digital” de una molécula dada. Esta es una de las funciones primarias de los espectrómetros de masas. Existen varias métodos para la ionización de moléculas: ioniza,*4)% 5"6-*,2% DJF:"2'"!+&%23$#16$+&%0%,#/+)2&%$#%32&%-+3Cculas presentes en la matriz. 9+&% #B/'2,/+&% 2&6% !'#!2'2$+&% &+)% *)-#$*2tamente inyectados en el cromatógrafo acoplado al espectrómetro de masas. Tanto las condiciones de corrida (tiempo, rampa de temperaturas, frecuencia de captura de datos, #/,:%,+-+%32&%#&!#,*(,2,*+)#&%$#%O".+%$#%>2&% 0% ,+3"-)2&% ,'+-2/+>'R(,2&% $#7#)% &#'% !"#&tas a punto para cada aplicación particular. En este sentido, en los últimos años se dispone de programas de computación especialmente diseñados por los fabricantes de espectrómetros que controlan toda la operación y posterior !'+,#&2-*#)/+%$#%$2/+&8%=%&"%;#I"'2%S:8 92%?'#,"#),*2%$#%27&+',*4)% 0 depende del campo aplicado (B0:62%$#%3+&%)A,3#+&%#)%!'#&#),*2%+%2"&#),*2%$#% un campo magnético externo (B0:%0%32&%/'2)&*,*+)#&%$#%3+&%)A,3#+&%#)/'#%")%)*;#3%$#%#)#'>62%0%+/'+%&"!#'*+'% al absorber una frecuencia (*0) ,+''#&!+)$*#)/#%2%32%$*?#'#),*2%$#%#)#'>62%D‘K:8

150 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

den de sensibilidad de estos núcleos es: 1H > 31P > 13 C > 15N. La detección de 1H o 31P, además de su alta sensibilidad, está favorecida por la alta abundancia natural de estos isótopos (99,9% y 100%, respectivamente). En cambio, los isótopos de 13C y 15N poseen una abundancia de 1,1% y 0,4%, lo ,"23%$*(,"3/2%-R&%2A)%&"%$#/#,,*4)8%K&/#%*),+);#niente se puede sortear enriqueciendo la muestra con el isótopo activo de interés. Cabe destacar que ninguno de estos isótopos es radioactivo, lo que facilita la manipulación de las muestras. Todos los elementos con isótopos magnéticos detectables por la técnica RMN pueden ser usados !2'2%*$#)/*(,2'%-#/27+3*/+&%#)%/#.*$+&%$#%!32)/2&%0% sus extractos. El 1H es el isótopo magnético más "/*3*I2$+% $#7*$+% 2% &"% 23/2% &#)&*7*3*$2$% *)/'6)&#,2% 0% &"% 27")$2),*2% )2/"'238% 92% ,+),#)/'2,*4)% 36-*/#% para poder detectar un metabolito por RMN de 1H en un extracto es alrededor de 10 µM. Para una muestra dada, la sensibilidad aumenta con el campo magnético del instrumento utilizado. Los metabolitos fosforilados pueden ser iden/*(,2$+&% 0% ,"2)/*(,2$+&% !+'% imY% "/*3*I2)$+% #3% isótopo magnético 31P. De esta manera se pueden estudiar un número pequeño de moléculas abundantes y de gran importancia metabólica

como es el fosfato inorgánico, nucleósidos trifosfatos, fosfomonoésteres, etc. Desplazamiento químico La frecuencia de absorción de cada núcleo $#!#)$#%$#%&"%,+)&/2)/#%>*'+-2>)C/*,2%%2%")% campo dado. Por ejemplo, a un campo de 9,4 T, los 1H absorben a 400 MHz, los 13C a 100,6 MHz y los 15N a 40 MHz. Sin embargo, no todos los 1 H ni todos los 13C absorben a la misma frecuencia. La frecuencia de absorción de cada protón depende de la ubicación del núcleo en las molé,"32&"62%!2'2%2&*>)2'%,+''#,/2-#)te las señales.

$#% !32)/2&% 5"#% !+)% #&!#,6(,2-#)/#% 23>"na ruta metabólica alterada. Un ejemplo de esto es el análisis de plantas de tabaco que !'+$",#)% ,+)&/*/"/*;2-#)/#% #3% R,*$+% &23*,63*,+%Ymi8% Journal of Experimental Botany. 2005, 56(410): 255-265. 9*&#,%l%DY+73#%j+")$2/*+)%_%E32)/%^*+3+>0%_% The Sumner group). UUU8*)?+-#/'*B8,+-% D\*;#'&+&% !25"#/#&% *)?+'-R/*,+&% !2'2% 23*)#2-*#)/+% $#% $2/+&% ,'+-2/+>'R(cos y espectroscópicos y análisis multivariados: EJ=#)+% '#&"3/2)/#% $#% 32% 2,/*;*dad fotosintética de los primeros organismos microbianos, y aún hoy los microorganismos aportan la mayor capacidad fotosintética del planeta. Cada proceso en la biósfera hace uso de la casi ilimitada potencialidad de los microorganismos para transformar el medio que los rodea. El resto de los organismos vivos dependemos en gran parte de ellos gracias a su capacidad de transformar compuestos en nutrientes asimilables, accesibles y requeridos para nuestra forma de vida. En este sentido mencionemos los siguientes ejemplos: La capacidad de transformar el nitrógeno molecular atmosférico en una forma asimilable por las diferentes formas de vida se encuentra restringida a los microorganismos. Miles de millones de microbios benignos que habitan el intestino nos ayudan a digerir los alimentos, degradar potenciales toxinas y combatir otros microorga)*&-+&%!2/4>#)+&8%T2-7*C)2&%$#%"&+%,36)*co, también como agentes de remediación de

suelos y agua, mejoramiento de la producción 2>'6,+32+%o2q&-2))*(,2/*;2-#)/#%23%,+)+,*-*#)/+%$#%-*,'++'>2)*&mos del suelo productores de antibióticos, con,3"62% % u”% $*&!+)#-+&% $#% ")2% 7"#)2% *)?+'-2ción que nos da un panorama claro del mundo -*,'+&,4!*,+%$#3%&"#3+”v8%P*)%#-72'>+#)Ctica, revolucionando la forma de ver a los microorganismos. El primer hito fue el trabajo de J2'3%o+#&#%5"*#)%!'+!"&+%2%%3+&%>#)#&%'=iY% ,+-+% ,'+)4-#/'+&% #;+3"/*;+&% Do+#>%$#%EJi%0%#3%$*&#Q+%$#%3+&%,#72$+'#&%5"#% !#'-*/#)% 2-!3*(,2'% #3% >#)% ,+-!3#/+#)#'23%+%'#&"3/2)/#%$#%32%2-!3*(,2,*4)%$#%&#,"#),*2&%$#3%>#)%WcP%'iY=%+% genes asociados a funciones tales como metabolismo nitrogenado, antibiosis, etc. (Figura 1). El avance y los logros ya alcanzadas por la metagenómica están asociados al desarrollo de capacidades técnicas de secuenciación de

Figura 1. Bibliotecas metagenómicas. Esquema del proceso de obtención y análisis de bibliotecas cons/'"*$2&%,+)%=\Y%#B/'26$+%$*'#,/2-#)/#%$#%-"#&/'2&% ambientales.

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de humedad, pasando desde una saturación por persistentes lluvias o defectos de drenaje 12&/2%!#'6+$+&%$#%2'*$#I8%K&/+%&">*#'#%5"#%32% composición de la comunidad microbiana experimenta ajustes periódicos en respuesta a esos cambios ambientales, aunque se ignora la manera cuali y cuantitativa del impacto de esos efectores. El suelo es un reservorio muy importante de carbono, y son los microorganismos quienes desempeñan roles protagónicos en el reciclado $#3%,2'7+)+8%=&*-*&-+)*(,2/*;2%$#%3+&% genomas de miembros raros de la comunidad (menos del 1%) se ha calculado necesario se,"#),*2'%WV8VVV%b7%$#3%=\Y%#B/'26$+%$#%&"#3+8% Por otro lado, se ha estimado en 1013 genes en un gramo de suelo provinentes de al menos 103 #&!#,*#&-#)/+&% $#%=\Y% "&2)$+% ;#,/+'#&% !32&-6$*,+&% y transformación en alguna cepa apropiada de la bacteria E. coli Dj*>"'2% W:8%=!2'#)/#-#)/##)4-*,+8% - Es muy probable que el número de geno-2&% $*&/*)/+&% !'#&#)/#&% #)% #3% &"#3+% '#O#.#% #3% /*!+% 0% ,2'2,/#'6&/*,2&% $#3% -*&-+k% 25"#33+&% $#dicados a la agricultura con un buen nivel de materia orgánica y humedad presentarán una diversidad más amplia que un suelo oligotrópi,+%0%,2'2,/#'6&/*,2&%#B/'#-2&%$#%!n%$#%=\YA)% Este método está basado en el análisis de la

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&#,"#),*2%$#3%>#)%5"#%,+$*(,2%!2'2%#3%>#)%5"#% ,+$*(,2% 32% &"7")*$2$% WcP% '%=iY% $#% 3+&% '*7+somas procarióticos. Todos los microorganis-+&% !+&##)% #&/#%=iY% 5"#% !'#&#)/2% ")2% 23/2% &*-*3*/"$% #)/'#% #33+&% !#'+% ,+)% $*?#'#),*2&% &"(cientes para su uso como medida de distancias evolutivas. Existe una amplia base de datos de &#,"#),*2&%$#3%WcP%'=iY%$#%+'>2)*&-+&%$*;#'&+&%5"#%12%!#'-*/*$+%#327+'2'%")%R'7+3%(3+>#nético llamado árbol de la vida. Esto permite "&2'% 3+&% $2/+&% -#/2>#)4-*,+&% $#% WcP% '=\Y% generado a partir de una determinada muestra 2-7*#)/23#)C/*,2-#)/#%2% las distintas secuencias, y eventualmente in?#'*'% 32% 7*+3+>62% 0% #,+3+>62% $#% 3+&% -*&-+&8% K3% 2)R3*&*&%$#3%D3+&:%>#)%D#&:%WcP%'=iY%#&%#,+)4micamente accesible a los laboratorios y es útil para evaluar diversidad microbiana. En particular, ha sido efectivo para revelar la abundancia de especies, y la estructura poblacional de -"#&/'2&%$#%&"#3+%D=>"*32'%#/%23862&%0%/#-!#'2/"'2&%4!/*-2&%$#%,'#,*-*#)/+8% Los miembros de una comunidad microbiana pueden diferir enormemente en sus activida$#&%7*+5"6-*,2&%#%*)/#'2,,*+)#&#)C/*,2% )+&% $*,#% #)% #3% -#.+'% de los casos quiénes son los miembros de la comunidad pero muy poco acerca de qué es lo que hace cada miembro. Uno de los prin,*!23#&%+7.#/*;+&%$#%32%#,+3+>62%-*,'+7*2)2%#&% el poder asociar la identidad de los diferentes microorganismos dentro de un hábitat con los procesos que ellos llevan a cabo en ese ambiente. Los métodos metagenómicos, que serán discutidos más adelante, comienzan a dar respuestas a esta segunda cuestión. Construcción de bibliotecas genómicas ambientales Muchos de los métodos corrientemente utilizados en la construcción de bibliotecas ambientales, son adaptaciones de las técnicas empleadas para la construcción de bibliotecas de insertos grandes de organismos eucariotas, /23#&%,+-+%,3+)2$+%#)%,'+-+&+-2&%2'/*(,*23#&% D^=J&:%0%36&*&%,#3"32'%#)%/2,+&%$#%2>2'+&28%P*)% embargo, en la construcción de genotecas ambientales se encuentran obstáculos que no se presentan en la construcción de bibliotecas de organismos aislados. La diversidad de nichos #,+34>*,+&% !32)/#2% $#&2?6+&% *)/#'#&2)/#&% 2% 32% hora de diseñar una estrategia adecuada para 32% +7/#),*4)% $#% ")% =\Y% $#% ,23*$2$% 2!'+!*2da y que el mismo represente la población de microorganismos presentes en ese ambiente. En la actualidad se han preparado diversas bibliotecas metagenómicas de variados ambientes, en esta sección discutiremos algunos de 3+&% 2&!#,/+&% ,'6/*,+&% 2% /#)#'% #)% ,"#)/2% #)% &"% preparación. La primera biblioteca ambiental se constru04%2%!2'/*'%$#%=\Y%$#%-*,'++'>2)*&-+&%+,#Rnicos, los que fueron concentrados a partir de

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2>"2% $#% -2'% 2)/#&% $#% 32% #B/'2,,*4)% $#%=\Y8% Sin embargo en el caso de otros habitat tales como el suelo, existen procedimientos alternativos, cada uno con sus ventajas y desventajas. La construcción de una biblioteca metagenómica de suelo se inicia con la toma de muestra. Como las muestras de suelo son heterogéneas, 3+&%$2/+&%(&*,+5"6-*,+&%/23#&%,+-+%/2-2Q+%$#% !2'/6,"32'2-+%$#% suelo, sin embargo el rendimiento es entre 10 y 100 veces mayor por lisis directa cuando se compara para una misma muestra. Para lograr la lisis celular directa, se utilizan una combinación de tratamientos enzimáticos, detergente y 23/2&%/#-!#'2/"'2&8%=$#-R&%$#3%=\Y%$#%32&%,Clulas procariotas lisadas, también se recupera =\Y%#B/'2,#3"32'%0%#",2'*+/28 9+&% -C/+$+&% $#% #B/'2,,*4)% $#% =\Y% 72&2dos en la separación de células como una etapa previa a la lisis de las mismas, aunque -#)+&% #(,*#)/#&% #)% /C'-*)+&% $#% ,2)/*$2$% $#% =\Y% '#,"!#'2$+% &+)% -#)+&% $2Q*)+&% !2'2% 32% integridad del mismo. La separación de los microorganismos de la matriz del suelo se logra mediante suaves fuerzas mecánicas como los procedimientos de mezcla, la rotación del pilón #)% -+'/#'+% +% 5"6-*,+&+%#&%$#%!'#&"-*'%5"#%#3%=\Y%2*&32do por lisis directa represente mejor la diversidad microbiana de una muestra de suelo, ya que este no incluye el paso de separación de las células, por lo tanto serán lisados aún los microorganismos que se adhieren fuertemente 2%32&%!2'/6,"32&8 El análisis metagenómico puede requerir de bibliotecas con insertos de tamaño grande o pequeño. Las bibliotecas de insertos pequeños &+)%&"(,*#)/#&%#)%#3%,2&+%#)%5"#%#3%2)R3*&*&%*)volucre el estudio de un único gen o un pequeño grupo de genes. Por el contrario, se requieren insertos mayores para el estudio de rutas metabólicas completas, procesos complejos u organización genómica. Independientemente del tamaño de inserto requerido, la prepara,*4)%$#%=\Y%#&%,'6/*,2%!2'2%#3%CB*/+%$#3%2)R3*&*&8% En el caso de emplear digestiones parciales de =\Y%!2'2%32%,+)&/'",,*4)%$#%32%7*73*+/#,2%&#%'#5"*#'#%!2'/*'%$#%")%=\Y%$#%")%/2-2Q+%!'+-#dio 3 veces mayor al de los insertos deseados. Por ende si se desea un inserto de 100 kb se $#7#'R%!2'/*'%$#%")%=\Y%$#%/2-2Q+%!'+-#$*+%•% SVV%q78%X)%=\Y%$#%#&/#%/2-2Q+%#&%-"0%;"3)#rable a las fuerzas de cizalla que se producen en el manipuleo de las soluciones, centrifugaciones, congelado-descongelado, etc. Por ello en estos casos la lisis de las células para la 3*7#'2,*4)%$#3%=\Y%0%&"%!+&/#'*+'%$*>#&/*4)%!2'cial con enzimas de restricción, se realiza en tapones de agarosa.

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Dependiendo del tamaño promedio de los insertos, las bibliotecas se construyen emplean$+% $*?#'#)/#&% /*!+&% $#% ;#,/+'#&8%=&6% 32&% $#% *)sertos pequeños (menores a 15 kb) emplean ;#,/+'#&% !32&-6$*,+&#)+-28% El usufructo exitoso de actividades micro7*2)2&% +% ;62&% -#/2743*,2&% '#5"*#'#% $#3% 3+>'+% $#% ;2'*2&% #/2!2&% ,'6/*,2&8% K)% !'*-#'% 3">2'#)C/*,2-#)/#%+%?#)+/6!*,2-#)/#8% Resulta obvio al encarar un proyecto de este tipo, que la correcta selección del ambiente apropiado, constituya una de las etapas fun$2-#)/23#&%!2'2%$2'3#%")2%72&#%!'+727*36&/*,2% razonable de éxito a nuestro diseño experimental. Por ejemplo, en un trabajo publicado por Rhee et al., (2005), cuyo objetivo fue el 2*&32-*#)/+% $#% >#)#&% )"#;+&% ,+$*(,2)/#&% $#% enzimas termoestables con actividad esterasa, se realizó la búsqueda sobre el metagenoma de muestras de suelo de sitios con aguas termales cuyas temperaturas fueron entre 65 y 90 o C (Rhee et al., 2005). Esta consideración da cierta certeza sobre la presencia de las funciones buscadas en la muestra pero, no asegura que la representación de los genes buscados #)% #3% -#/2>#)+-2#)4-*,+%#B!'#&#%")%*)$",/+'%$#3% promotor luxR, se sintetizará la proteina GFP '#;#3R)$+&#%O"+'#&,#),*28%K&/#%!'+,#$*-*#)/+% acoplado a cell sorting%2,/*;2$2%!+'%O"+'#&,#)cia, permite capturar aquellos clones potencial-

164 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

mente productores de compuestos de quorum sensing (Figura 2) (Lynn et al., 2005; Uchiyama et al., 2005). Otro método de enriquecimiento se basa en el uso de isótopos estables, en el cual se administra -como única fuente de carbono- un sustrato marcado con 13C a una comunidad de mi,'++'>2)*&-+&%!'+;#)*#)/#&%$#%&"#3+8%=5"#332% comunidad bacteriana capaz de utilizar ese sustrato incorporará 13C en sus macromolé,"32&#)4-*,+% $#3% 7*+(3-% 5"#% se forma sobre las aguas que drenan de una mina de hierro abandonada, ubicada en la Iron Mountain en Richmond, California ha permitido establecer la estructura de la comunidad y las ?"),*+)#&% -#/2743*,2&% 0% 7*+>#+5"6-*,2&8% K&2% agua de drenaje constituye un medio extremadamente adverso, su acidez es de pH 1.0 y posee un alto contenido en metales. También es rica en pirita (FeS2). No hay fuentes asimilables de carbono o nitrógeno más allá de las que pueden derivar del aire. Tyson et al. (2004)

Figura 28%=*&32-*#)/+% $#% ,3+)#&% !'+;#)*#)/#&% $#% ")% 7*73*+/#,2% -#/2>#)4-*,2'##)%O"+'#&,#)/%!'+/#*):%?2,*3*/2)$+%&"%$#/#,,*4)8%

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 165

secuenciaron una biblioteca construida con =\Y% #B/'26$+% $#3% 7*+(3-'2'+)% #)&2-blar a partir de datos metagenómicos los genomas de miembros del grupo Leptospirillum y Ferroplasma tipo II, también una sustanciosa información de otros miembros de la comunidad. El análisis de estos resultados fue muy &">#&/*;+8%%9+&%2"/+'#&%)+/2'+)%5"#%)+%12762)% detectado la presencia de Leptospirillum ferrooxidants, 32% #&!#,*#% (.2$+'2% $#% Y2. Por el contrario, el genoma de la comunidad reveló la presencia de miembros pertenecientes a los grupos II y III de Leptospirillum. El género Leptospirillum ha sido sub-dividido en 3 gru!+&*,2%$#%)*/'4>#)+:%5"#%3+&% autores asociaron al genoma de Leptospirillum grupo III. Estos datos permitieron concluir que la contribución de esta población al consorcio $#3% 7*+(3-% $#% 32% -*)2% R,*$262% 2% !2'/*'% $#% 32% +B*$2,*4)% $#3% 1*#''+8% =$#-R&2nismos asociados viven en el intestino. Estos 10 a 100 billones microorganismos desempeñan funciones tales como la extracción de nu/'*#)/#&%0%,23+'62&%$#%,+-!+)#)/#&%$#%)"#&/'2&% $*#/2&% 0% 32% &6)/#&*&% $#% ;*/2-*)2&% #&#),*23#&% 0% aminoácidos. Las bacterias intestinales tam7*C)% 20"$2)% 2% $#/+B*(,2'% !'+$",/+&% 5"6-*,+&% potencialmente nocivos que pueden estar pre&#)/#&%#)%3+%5"#%,+-#-+&8%=3>")+&%$#%3+&%-*crobios que viven en y sobre el cuerpo humano desempeñan un papel fundamental en la defensa contra agentes patógenos. Esta relación -"/"2-#)/#% 7#)#(,*+&2% )+&% 20"$2% 2% !'+/#-

166 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

gernos de enfermedades al tiempo que se da a los microbios un lugar para vivir. El uso de metagenómica para obtener un conocimiento más profundo de las comunidades microbianas #)%#3%,"#'!+%1"-2)+%!+$'62%&#'%*)-#)&2-#)/#% valioso en la comprensión tanto de microbios $2Q*)+&% % ,+-+% $#% 7#)#(,*+&+&% 0% !"#$#% ,+)ducir a formas más efectivas de diagnosticar, tratar y prevenir enfermedades. El enfoque metagenómico ofrece la posibi3*$2$% )+% &43+% $#% 2)23*I2'% 32% $*;#'&*$2$% (3+>#)C/*,2% $#% $*;#'&+&% 2-7*#)/#&% 0% 7*+(3-&32,*2'#&'2)% *$#)/*(,2'% ,3+)#&% que expresan fenotipos tales como, lipasas y amilasas. De igual modo Brady y col, recupe'2'+)% 2% !2'/*'% $#% ")2% 7*73*+/#,2% ,+&-6$*,2% $#% =\Y%$#%&"#3+%#3%,+).")/+%$#%>#)#&%)#,#&2'*+&% !2'2%32%&6)/#&*&%$#%;*+32,#6)2)*(,2%")2%/2'#2%32'>2% y tediosa. En la actualidad se dispone de equi!+&%,+)%/#,)+3+>62&%5"#%?2,*3*/2)%32%'#,+3#,,*4)% de colonias, y la inoculación en placas de numerosos clones al mismo tiempo. Mientras que la industria de alimentos y de detergentes se concentran en un número limitado de reacciones enzimáticas y sustratos, las *)$"&/'*2&%5"6-*,2%0%?2'-2,C"/*,2%/'272.2)%,+)% -*3#&%$#%-+3C,"32&%5"6-*,2%0%#&/'",/"'23-#)/#% diversas, y la producción de cada uno de estos requiere soluciones enzimáticas individuales. En consecuencia, debido a la riqueza de biocatalizadores potencialmente útiles, el uso de recursos microbianos es cada vez más difun$*$+%#)%32&%*)$"&/'*2&%5"6-*,2&%0%&+)%,+)&*$#'2$+&%*)$*&!#)&273#&%!2'2%32%5"6-*,2%+'>R)*,2% moderna. Es obvio que existe una amplia demanda de nuevos enzimas y biocatalizadores, y la metagenómica aparece como una de las /#,)+3+>62&%,+)%-20+'%!+/#),*23*$2$%!2'2%!'+veer de las moléculas necesarias. Es creciente la conciencia y la percepción global de que la disponibilidad de combusti-

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 167

bles fósiles no renovables no es sostenible en el futuro próximo, y se deberá superar esa $#!#)$#),*2% #)#'>C/*,28%=$#-R&62%#-#'>#)/#%#&%#3%#/2)+3%D23,+1+3%$#%>'2)+:L% un biocombustible de alto octanaje de derivado $#%-26I+'6,+32&% 2% #/2nol utilizable depende de un ingrediente esencial: las comunidades microbianas. En primer lugar, varios tipos de microorganismos deben trabajar en conjunto para transformar la celulo&2%2%!2'/*'%$#%$#&#,1+&%2>'6,+32&%#)%2IA,2'#&8% Luego, los azúcares son fermentados-también por los microbios- para producir etanol. Las vacas, con la ayuda de las bacterias, &+)% ,2!2,#&% $#% ,+);#'/*'% 32&% (7'2&% ;#>#/23#&% D,#3"3+&2:%#)%#)#'>62#/23#&% !"#$#% &#'% "&2$2%!2'2%,+);#'/*'%+/'2&%(7'2&%;#>#/23#&%#)% 2IA,2'#&% &*-!3#&8% T'2)&?+'-2'% 32&% (7'2&% ;#getales en azúcar requiere de tres enzimas. Estas tres enzimas han sido recientemente in/'+$",*$2&% #)% ")2% ;2'*#$2$% $#% -26I% $#)+-*nada Spartan III, que deriva de dos versiones anteriores. La primera versión contiene una enzima que procede de un microbio que vive en agua manantial caliente, y que es capaz de /'2)&?+'-2'% #3% >'2)% !+36-#'+% $#% ,#3"3+&2% #)% fragmentos de menor tamaño. La segunda versión contiene un gen de un hongo natural que ,+$*(,2%!2'2%")2%#)I*-2%,2!2I%$#%,3*;2'%#&/+&% fragmentos de celulosa en disacáridos. En la A3/*-2% ;#'&*4)% &#% *)/'+$".+% #3% >#)% ,+$*(,2)/#% de una enzima capaz de catalizar la hidrólisis

de los disacáridos en azúcares simples. Este gen fue aislado a partir de microbios presen/#&% #)% #3% '"-#)% $#% ;2,28% m#$*2)/#% *)>#)*#'62% >#)C/*,2%#&/#%>#)%12%&*$+%-+$*(,2$+%$#%?+'-2% tal de dirigir el producto de su expresión hacia vacuolas, de esta forma las enzimas digestivas permanecen almacenadas hasta su cosecha (Sticken, 2008). Estos son algunos ejemplos 5"#% !+)#)% $#% -2)*(#&/+% 32% !+/#),*23*$2$% $#% los enfoques metagenómicos tanto en su propósito biotecnológico como en el análisis de 32&%,+-")*$2$#&%2-7*#)/23#&8%K)%$#()*/*;2)*/2&% a 30% y coberturas mayores o iguales a 50%. mediante la comparación con genes de función Las bases de datos contra las cuales se reaconocida. La forma más precisa para hacer lizan las comparaciones juegan también un rol esta comparación es a nivel de productos de importante en relación al número y calidad de genes, o sea, trabajando con las secuencias 3+&%u1*/&v%'#,"!#'2$+&8%=3>")2&%$#%32&%72&#&%$#% de aminoácidos obtenidas a partir de la tra- $2/+&%$#%)",3#4/*$+&%0%!'+/#6)2&%-R&%"/*3*I2$2&% $",,*4)%$#%32&%&#,"#),*2&%)",3#+/6$*,2&%2%3+&% para la anotación de secuencias de plantas son seis marcos de lectura posibles. Este método los Índice de Genes (DFCI: http://compbio.dfci. de comparación de secuencias, que es central harvard.edu/tgi/), Unigenes (NCBI) y PlantGDB

,+-+% ^9=PT% !2'2% 12,#'% ,+-!2'2,*+)#&% ,+)tra los proteomas de cada una de las especies representadas en la base de datos. La Tabla 1 condensa un número importante de bases de $2/+&%#&!#,6(,2&%.")/+%,+)%&"&%2,,#&+&%o#7% para facilitar la exploración de las mismas. =&*-*&-+$78+'>_:8%92&%72&#&%$#%$2/+&% $#% !'+/#6)2&% 5"#% &#% "/*3*I2)% #)% >#)#'23% &+)g% Yi#)4-*,2&%#&!#,6(,2&%$#%#&!#,*#8 Bases de datos generales NCBI Plant Genomes Central PlantGDB: plant genome database MIPS plants databases

URL www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/PLANTS/PlantList.html www.plantgdb.org mips.gsf.de/proj/plant/jsf/genomes.jsp

Bases de datos multiespecie para genómica comparativa Phytozome: comparative genomics of plants Gramene: a Resource for Comparative Grass Genomics LIS: Legume Information System SALAD: Surveyed Alignment and Associating Dendrogram SGN: Solanaceas genomic network

www.phytozome.net www.gra mene.org www.comparative -legumes.org salad.dna.affrc.go.jp/salad www.sgn.cornell.edu

Bases de datos de genomas de iniciativas genómicas completas y parciales TAIR: The Arabidopsis Information Resource Rice Annotation Project Database (RAP -DB) Grain Genes 2.0: a Database for Triticeae and Avena MaizeDB Medicago truncatula: a model for legume research Lotus japonicus genome Wheat Applied Genomics SoyBase and the Soybean Breeder's Toolbox SoyMap: An integrated map of soybean for resolution and dissection of multiple Brassica rapa genome Compositae genomics projec t Cotton Marker Database Dendrome: a collection of forest tree genome databases and other forest genetic International Grape Genome Project Popu lus Genome Integrative Explorer

www.arabidopsis.org rapdb.dna.affrc.go.jp wheat. pw.usda.gov/GG2/index.shtml www.maizegdb.org www.medicago.org www.kazusa.or.jp/lotus masw heat.ucdavis.edu soybase.org www.soymap.org/ www.brassica -rapa.org/BRGP/index.jsp compgenomics.ucdavis.edu/compositae_index.php www.cottonmarker.org dendrome.ucdavis.edu www.vitaceae.org www.popgenie.db.umu.se

Bases de datos de diversidad PanZea: Molecular and Functional Diversity of the Maize Genome ToL: Tree of Life Web Project

172 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

www.panzea.org www.tolweb.org

$#% /#.*$+8% K3% $#&2''+33+% $#% /#,)+3+>62&% $#% 23/+% procesamiento de datos ha permitido abordar estudios de expresión génica en forma concertada para miles de genes a partir de distintos genotipos en determinados órganos, tejidos, y condiciones de crecimiento. El diseño de los #B!#'*-#)/+&% $#% #B!'#&*4)3+&%$#%=\Y,%!2'2%#;23"2'%#B!'#&*4)%>C)*,28 Los experimentos de microarreglos representan una de las herramientas más frecuentes para aproximarse a los análisis de expresión de genes a gran escala. Una vez que se obtienen los resultados surgen interrogantes como ¿Cuáles son los genes sobre o sub-expresados en el experimento?, ¿Cuáles son los !#'(3#&%$#%#B!'#&*4)%5"#%!"#$#)%'#;#32'&#%#)% general a partir de este experimento? En esta &#,,*4)% #.#-!3*(,2'#-+&% ")% ,2&+% $#% #&/"$*+% para ilustrar el proceso de análisis utilizando programas de libre distribución basados en el 3#)>"2.#%#&/2$6&/*,+%i%D^*+,+)$",/+':8% K)% #3% F)&/*/"/+% $#% ^*+/#,)+3+>62% $#% FYT=% Castelar (IB) se diseñó un microarreglo de =\Y,% ,+)/#)*#)$+% SWr% &#,"#),*2&% $#% /*!+% ESTs previamente desarrollados en base a &#,"#),*2&%4'>2)+L#&!#,6(,2&%$#%")2%36)#2%$#% girasol cultivado). Para la impresión de los mi,'+2''#>3+&% $#%=\Y,% &+7'#% &+!+'/#% $#% ;*$'*+"'2%Wg%#^*+!*!#3*)#8%=8%;*&/2%#&5"#-R/*,2k%^8%!R>*)2%*)*,*233+% debido a condiciones experimentales inevitables y propias de la plataforma utilizada. La normalización y el análisis de expresión global se realizaron en este caso a través de programas generados utilizando el programa R DX)*;#'&*/0%+?%=",q32)$:%2%/'2;C&%$#%&"%;#'&*4)% i%W8h8V%D1//!g__UUU8'!'+.#,/8+'>:8%9+&%$2/+&%$#% cada vidrio fueron normalizados corrigendo la dependencia por intensidad mediante la utiliza,*4)% $#3% &"2;*I2$+'% )+% !2'2-C/'*,+% 9[oKPP% (regresión local ponderada). Se realizó una inPreprocesamiento de los datos La imagen obtenida a partir de un microarre- tegración de los datos de las réplicas técnicas glo corresponde a la información cruda de un dentro de cada soporte (cada spot fue impreso #B!#'*-#)/+% $#% #&/2&% ,2'2,/#'6&/*,2&8% K&% 2&6% 4 veces) y las réplicas técnicas entre soporque los algoritmos computacionales convierten /#&% D*)/#',2-7*+% $#% O"+'4?+'+&% +% udye-swap”). la imagen en información numérica que cuan- Luego de este paso el producto obtenido es /*(,2% $*,12% #B!'#&*4)g% #&/#% #&% #3% !'*-#'% !2&+% una matriz de expresión génica cuyo análisis en un análisis de datos de microarreglos, y es &#% ?+,23*I2% #)% 32% *$#)/*(,2,*4)% $#% >#)#&% ,+)% fundamental la calidad y la rigurosidad obteni- expresiones diferenciales.

174 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

Figura 2: Imagen de una micromatriz de dos canales (Bello y col. 2006)

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 175

Limpieza de datos y transformación Una vez obtenida la matriz de expresión génica, existe una serie de pasos que se llevan a cabo para asegurar una alta calidad en el análisis. Ellos son: la remoción de spots dudosos o ,+)O*,/*;+&%D:533$*)M$5#9-$/), que se resuelve ya sea eliminando los spots con error aparente (con el consiguiente riesgo de pérdida de datos valiosos), o marcándolos para luego referirlos a la imagen original en el momento de su análisis; la corrección y/o sustracción del ruido de fondo (corrección o sustracción de background). La señal de fondo es indicadora de ")2%1*7'*$2,*4)%*)#&!#,6(,2%&*#-!'#%0%,"2)$+% la intensidad del spot de interés sea mayor que la intensidad del ruido de fondo. Si ocurre al revés, existe la posibilidad que esté representando un problema local en el microarreglo y la intensidad del spot se convierta en información )+%,+)(273#k%0%!+'%A3/*-+%32%/'2)&?+'-2,*4)%3+>2'6/-*,2%$#%3+&%;23+'#&%!2'2%12,#'%,+)&/2)/#% la variabilidad a todos los niveles de intensidad detectados. Análisis estadístico de los datos Evaluación de consistencia en las repeticiones Para evaluar las diferencias asociadas a las repeticiones biológicas de este experimento se obtuvo una ordenación de las mismas en un plano de ordenación generado mediante análisis de componentes principales aplicado a la matriz de expresiones génicas. Esta aproximación tuvo en cuenta la información de todos los genes simultáneamente y permitió establecer &*%")2%'#!#/*,*4)%&#%,+-!+'/272%$#%-2)#'2%2/6pica o no. K*$%#'1&5&'(%)*$)3-90./)*$)3$%$/)&.%)$D0-$sión diferencial. El análisis de la matriz de expresión génica &#%?+,23*I4%#)%32%*$#)/*(,2,*4)%$#%>#)#&%,+)%#Bpresiones diferenciales. Existen diversas estrategias para obtener un listado de genes candidatos. La estrategia más sencilla es aplicar una prueba de hipótesis tradicional gen a gen. Esta aproximación tiene el inconveniente de generar un gran número de falsos positivos. Los métodos correctivos, basados en el control de

la tasa de falsos positivos, presentan a su vez 32%$*(,"3/2$%$#%>#)#'2'%")2%23/2%/2&2%$#%?23&+&% )#>2/*;+&8% E+'% ,+)&*>"*#)/#62% utilizada en este trabajo consistió en complementar las técnicas de inferencia clásicas con un criterio de selección basado en el ordenamiento de genes y tratamientos en el espacio generado por los dos primeros ejes principales obtenidos de un análisis de componentes principales de la matriz de expresión génica. Posteriormente, y dentro del conjunto de genes seleccionados en el paso anterior, se realizó el '#,+)+,*-*#)/+%$#%>'"!+&%$#%>#)#&%,+)%!#'(3#&% de expresión similar mediante la aplicación de ")% 23>+'*/-+% $#% ,32&*(,2,*4)% )+% &"!#';*&2$223+&8 Búsqueda de marcadores funcionales en bases de datos genómicos Como mencionamos anteriormente, la secuenciación completa de los genomas de especies modelo o parcial de especies de interés ha generado una rápida acumulación de información biológica que es depositada en bases de datos genómicas y es fácilmente accesible a través de Internet. Esta información, que deriva en muchos casos de la caracterización de 36)#2&%#3*/#%$#%")2%-*&-2%#&!#,*#"'+&*$2$%0% detallada evaluación de esta instancia es fundamental para encontrar verdaderas variantes alélicas dentro de los diferentes grupos. Es por ello que se encuentran disponibles diverA"27)2,*4)%$#%>'"!+&%1#/#'4/*,+&"#)% $#% 32&% ;2'*2)/#&% -+)+-4'(,2&% !+'% la representación de tamaños variables del mi,'+&2/C3*/#%*$#)/*(,2$+%#)%23*)#2-*#)/+&%-A3/*ples de secuencias representadas en la bases de datos. Otra herramienta valiosa disponible #)%32%U#7%#&%JXbF%PPi%P#';#'%D1//!g__UUU8>#)+-#8,3#-&+)8#$"_,>*L7*)_,">*…&&'). Análisis de la variabilidad genética Finalizada la etapa de desarrollo de marcadores moleculares, la fase siguiente general-#)/#%,+)&*&/#%#)%32%>#)+/*!*(,2,*4)%$#%>'2)$#&%,2)/*$2$#&%$#%*)$*;*$"+&%2%()%$#%$#/#'-*)2'% las variantes alélicas presentes en cada uno de ellos para cada uno de los marcadores detec/2$+&8%92%#3#,,*4)%$#%32%-#/+$+3+>62%-2&%2!'+piada dependerá de los recursos disponibles y del nivel de procesamiento que se desee alcanzar. Entre las más utilizadas para el caso de los SNPs pueden mencionarse: secuenciación $*'#,/2+)",3#4/*$+&%23#3+L#&!#,6(,+&62&% 2)236/*,2&% 2!'+!*2$2&8%K)%3+&%A3/*-+&%2Q+&%32&%-#/+$+3+>62&%$#% mapeo por asociación han surgido como com-

plemento de las aproximaciones convencionales (ej. Mapeo de QTLs) y han ido cobrando cada vez más importancia como herramientas para alcanzar un mayor grado de resolución. En pocas palabras, el razonamiento subyacente al mapeo de asociación consiste en utilizar eventos de recombinación históricos a lo largo de un linaje, y no solamente aquellos ocurridos en una determinada población de mapeo, para establecer posibles relaciones entre genotipo 0%?#)+/*!+8%9+&%!+3*-+'(&-+&%'#&!+)&273#&%$#% 32% ;2'*2,*4)% ?#)+/6!*,2% )+% &+)% +7&#';2$+&% #)% forma directa, si no que surgen a partir de in?#'#),*2%#&/2$6&/*,28%92%72&#%!2'2%32%$#/#,,*4)% de tales correlaciones es la asociación no alea/+'*2%#)/'#%")%!+3*-+'(&-+%$2$+%0%32%;2'*2,*4)% ?#)+/6!*,2%!2'2%,*#'/+%'2&>+%$#%*)/#'C&2-*#)/+% (DL) entre las variantes genéticas causales de 32% ;2'*2,*4)% $#3% ,2'R,/#'% 0% 3+&% !+3*-+'(&-+&% analizados. Previo a cualquier estudio de mapeo por asociación, y para realizar un diseño experimental apropiado, es necesario conocer el grado y la estructura genómica del DL en la especie a evaluar, ya que éste es variable tanto entre especies como para las diferentes regiones de un mismo genoma. Las dos medidas preferi$2&% #)% 32% 3*/#'2/"'2% !2'2% ,"2)/*(,2'% \9% &+)% #3% ,+#(,*#)/#%$#%$#"*3*7'*+%#&/2)$2'*I2$+%D\:% y la correlación de frecuencias alélicas al cuadrado (r2). La estimación del DL generalmente involucra grandes cantidades de marcadores, razón por la cual suelen resultar útiles las he''2-*#)/2&%$#%&+?/U2'#%5"#%!#'-*/#)%&*&/#-2/*zar el cálculo de ambas medidas y representar >'R(,2-#)/#% 32&% 2&+,*2,*+)#&% 12332$2&% D!+'% #.8g%\Y=&!62&%5"#%!#'-*/#)%/#)#'%#)%,"#)/2%32%#&/'",/"'2% poblacional y el grado de parentesco entre los individuos analizados. En conclusión, el mapeo por asociación constituye una poderosa herramienta para la disección genética de caracteres complejos, siendo los SNPs marcadores ideales para la implementación de tales estudios dada su alta frecuencia y ubicuidad en los genomas.

Lecturas recomendadas =3/&,1"3% 2)$% &23/% &/'#&&#&% 72&#$%+)%,\Y=%-*,'+2''20%2)230&*&8%^mJ%E32)/% Biol 8:11. b"!/2!-!#*#32!#-!#5*# anteriormente citados sean exitosos es crucial tomado al maíz como sistema vegetal modelo, realizar el aislamiento de los óvulos y del polen en el cual estudiar los procesos de fusión de !"# !0# !-%*/&# $-+&08.+6&# */!62*/&;# 7&)# 0&# 32!# gametas y posterior embriogénesis, también es indispensable llevar a cabo la determinación se han realizado trabajos exitosos de fusión de la duración de los distintos estadios del de- de gametas en trigo, donde Kovacs (1995) losarrollo de ambos, como por ejemplo: gró la fusión de gametas in vitro, obteniendo como resultado estructuras multicelulares y en a) Determinar los tiempos de antesis, dehis- algunos casos del tipo de microcallos. En los cencia de las anteras y polinización, b) Precisar D0%+'&-#*G&-#-!#5*#0&.)*/&#$"*0'!"%!#0*#I2-+8"# el momento en que el estigma esté receptivo, de gametas en Nicotiana tabacum, la que puc)#9-7!6+$6*)#!0#+"-%*"%!#&7&)%2"*)*#0*#7&- diendo ser una especie modelo en dicotiledólinización y d) Establecer el tiempo adecuado neas para estudiar la fertilización in vitro, dada su capacidad para la regeneración de plantas, para recoger el polen. presenta sin embargo el inconveniente de que las gametas no se fusionan fácilmente. 3 Fertilización in vitro Tradicionalmente, se consideró que todas F2)*"%!#*G&-#0&-#6+!"%=$6&-#+"%!"%*)&"#+'+%*)# los mecanismos de fecundación que aconte- las células espermáticas tenían igual posibilicen in vivo, utilizando técnicas de fertilización dad de fusionarse con la célula huevo. Sin emin vitro de gametas aisladas; esta aplicación bargo, actualmente se sabe que existen mecafue más sencilla en animales y en plantas in- nismos de fusión preferencial a nivel gamético, feriores pero no pudieron ser aplicadas a las donde un determinado morfotipo de célula esplantas superiores hasta comienzos de la dé- permática es reconocido. Cuando está presencada de los noventa. Esto se debió a que la %!# !-%!# '!6*"+-'&# 5*H# 2"*# +/!"%+$6*6+8"# /!## fertilización in vivo en las plantas superiores es las dos células espermáticas, candidatas para un proceso muy diferente al que ocurre en los la fusión celular y una elección de la que se fusistemas animales y de plantas inferiores, don- sionará con la ovocélula. La discriminación se basa en las diferencias de las células espermáde las gametas son de vida libre. %+6*-# )!-7!6%&# /!# -2# 5!%!)&'&)$-'&# 6+%&70*-El primer aislamiento de células espermáti- '!-!#*#0*-#/+$620tades de la técnica, en algunos cruzamientos +"%!)!-7!6=$6&-#6&'�&-#)!*0+L*/&-#!"#7*7*;# algodón y Hevea brasiliensis, se comprobó que el cultivo de óvulos completos es más exitoso para el rescate de embriones que el cultivo de los embriones aislados. El rescate de embriones consiste en aislar los embriones de los óvulos de una planta y cultivarlos en un medio estéril que contenga los nutrientes esenciales que les permita concluir su desarrollo normal. Esta técnica es relativamente fácil de llevar a cabo en embriones maduros y sus posibilidades de éxito son muy :2!"*-,#O*-#/+$620%*/!-#-!#+"6)!'!"%*"#62*"to más inmaduro sea el embrión a rescatar, ya que los requerimientos nutricionales son más !-7!6=$6&-#!"#0*-#!%*7*-#%!'7)*"*-#/!#/!-*rrollo del embrión. Factores externos que condicionan el cultivo de óvulos y embriones Entre los factores externos más importantes que afectan el cultivo de óvulos y de embriones se citan: el medio de cultivo, la osmolaridad y los reguladores de crecimiento.

El óvulo presenta una gran cantidad de requerimientos nutricionales, que varían con el estadio de desarrollo del mismo y que es nece-*)+&#+/!"%+$6*)#7*)*#6*/*#!-7!6+!#!"#7*)%+62lar. Por consiguiente un aspecto fundamental a tener en cuenta en el rescate de embriones es la selección correcta del medio de cultivo adecuado para cumplir con los requerimientos durante las distintas etapas del desarrollo embrionario, siendo necesario a veces la transferencia de los embriones de un medio de cultivo a otro para garantizar un óptimo crecimiento. Se pueden reconocer dos fases en el desarrollo embrionario con respecto a la nutrición: !"

!"

#$" %$&'" (')'*+)*,-.$ en la que el embrión es dependiente del endosperma y demás tejidos maternos que lo rodean, y #$" " %$&'" $/)+)*,-.$, en la cual el embrión es capaz de sintetizar las sustancias requeridas para su crecimiento a partir de sales minerales y azúcares. La etapa crítica de pasaje de una fase a otra varía con las especies.

La introducción de agua de coco y extractos de endospermas en el medio de cultivo han sido muy útiles ya que activan el crecimiento y desarrollo de los embriones en el cultivo de óvulos de algunas especies vegetales. Por otro lado, no existe demasiada evidencia acerca de la absoluta necesidad de los reguladores de crecimiento para el desarrollo de los embriones extraídos, sean inmaduros o maduros, excepto en el rol que cumplen en la ruptura de la dormición. La concentración osmótica es un factor importante en el desarrollo de óvulos y embriones, dependiendo del estado de madurez de los mismos. La sacarosa presente en los medios de cultivo no sólo provee la fuente de carbono necesaria para el crecimiento sino que además mantiene la osmolaridad requerida para cada etapa del desarrollo. Está demostrado que una presión osmótica elevada previene la germinación precoz de los embriones inmaduros, evitando así la ocurrencia de malformaciones estructurales. A medida que van creciendo, los embriones necesitan ser transferidos a medios con progresivas disminuciones en los niveles de sacarosa.

190 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

A!-7!6%&#/!#0&-#)!32!)+'+!"%&-#/!#%!'7!)*tura, los embriones de la mayoría de las especies presentan un buen crecimiento en un rango de temperaturas que va de los 25º C a los 30º C. Aunque algunos estudios indican que la luz no es crítica para el crecimiento de los embriones, se demostró que en el caso de la cebada la luz disminuye las probabilidades de germinación precoz en los embriones inmaduros. Entre los medios de cultivo más difundidos para el cultivo de óvulos y embriones se pueden citar el de Murashige y Skoog (1962), Mon"+!)#PQRSTE;#A*"/&075#H#M&N#PQRUVE;#W*':&).# y col. (1976), Liu y col. (1993). 5 Aplicaciones de las Técnicas de Fertilización in vitro 5.1 Aplicaciones en el Mejoramiento Genético Vegetal Las técnicas antes mencionadas han sido utilizadas para salvar algunos obstáculos que se le presentan al mejorador de plantas cuando desea realizar cruzamientos, para el logro de ciertos objetivos de mejoramiento. A continuación se mencionan ejemplos de aplicación de las metodologías de polinización y fertilización in vitro: En algunas combinaciones de cruzamientos, la polinización placental in vitro permitió que se superen las barreras de incompatibilidad precigótica, obteniéndose embriones híbridos y aún plantas híbridas, imposibles de obtener mediante técnicas convencionales. Así se realizaron los cruzamientos de las siguientes especies: Zea mays x Z. mexicana, Nicotiana tabacum x N. amplexicaulis, Melandrium album x Viscaria vulgaris, M. Album x Silene schafta. La polinización in vitro se empleó también como vía para la obtención de plantas resistentes a estreses ambientales, ya que permite seleccionar para la fecundación aquellos granos de polen que tuvieron capacidad de germinar bajo diferentes condiciones de estrés, acelerando así la obtención de plantas resistentes. Esta estrategia se desarrolló en maíz, con polen cosechado de plantas creciendo a temperaturas elevadas y condujo a la obtención de plantas tolerantes a estrés por calor. En Brassica rapa, la selección de polen a baja tempe-

ratura tuvo un efecto positivo en el crecimiento de la progenie en condiciones de frío, logrando acumular más peso seco que en progenies obtenidas sin la selección previa del polen. El cultivo de óvulos y de embriones vegetales se emplea en mejoramiento vegetal cuando se desea: rescatar embriones abortivos de)+K*/&-#/!#0*#5+:)+/*6+8"#+"%!)!-7!6=$6*#&#+"%!)genérica, superar problemas de abscisión precoz del fruto, recuperar embriones de cruzas +"%!)!-7!6=$6*-# 32!# 6&"/26!"# *# 0*# &:%!"6+8"# de haploides y acortar el período de latencia que ocurre en algunas semillas por presentarse, en el endosperma o en la cubierta de la misma, inhibidores del desarrollo del embrión. Los siguientes ejemplos ilustran las diversas aplicaciones: Durante la producción comercial del tritica0!;# !-7!6+!# &:%!"+/*# *)%+$6+*0'!"%!# '!/+*"%!# el cruzamiento de trigo y centeno, el cultivo o rescate de embriones se utilizó para superar el alto grado de incompatibilidad del cruzamiento inicial, ya que los embriones abortaban en estadios tempranos del desarrollo debido a una incompatibilidad con el endosperma. Esta técnica y la aplicación de colchicina en plantas híbridas, fueron de fundamental importancia para salvar los problemas que se presentaron en el cruzamiento inicial y la marcada esterilidad que poseía la F1. El perfeccionamiento de estas dos metodologías fue decisiva para la producción de un gran número de triticales hexaploides y octoploides, cruzando el centeno con trigos duros y harineros, respectivamente, 0&.)*"/&#$"*0'!"%!#2"#*0%&#.)*/&#/!#I!)%+0+/*/, Las técnicas de rescate de embrionario son necesarias como complemento en la produc6+8"#*)%+$6+*0#/!#5*70&+/!-,#9"#!00*-;#-!#620%+K*"# embriones que se forman por partenogénesis o por eliminación de cromosomas luego de la 5+:)+/*6+8"# +"%!)!-7!6=$6*# &# +"%!).!"4)+6*,# 9"# algunos casos los embriones haploides se distinguen morfológicamente de los normales, de manera que se extraen y se los cultiva in vitro, en medios y condiciones adecuados (ver en este libro Parte IV-Capítulo 1). Otras veces es necesario esperar a obtener las plantas para determinar el nivel de ploidía. Esta técnica se ha utilizado con éxito en cebada, trigo y tabaco.

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 191

También se emplea el cultivo de embriones en casos en que el endosperma no se desarrolla normalmente, como sucede en los cruzamientos de cultivares diploides y tetraploides de Citrus, o cuando el mismo se desintegra después de la fecundación, como en Oenothera biennis x O. muricata o O.biennis x O. lamarckiana. Esta técnica también es de utilidad para sortear barreras de dormición o en casos donde la viabilidad de la semilla es baja, como en yuca y otras especies del género Manihot.

a partir de nucelas de óvulos jóvenes. Este es el caso de Citrus sp, Vitis vinifera, Malus domesticus, Psidium guajava y Pyrus serotina. La técnica de rescate de óvulos fecundados se utiliza también en aquellos cruzamientos en los que la barrera de incompatibilidad se encuentra a nivel del ovario como en el cruzamiento Trifolium repens x T. hybridum.

Las técnicas de fertilización in vitro pueden complementar, además, las metodologías El cultivo in vitro de embriones es también de transformación de plantas. Por ejemplo, a una alternativa para el intercambio de semilla través de la obtención de un embrión a partir a través de fronteras internacionales. En un de cigotos transgénicos que han sido maniproyecto de mapeo de genes con resistencia al pulados, utilizando un protocolo que involucra virus del mosaico, en yuca, desarrollado entre la microinyección de genes en el cigoto. Esta CIAT (Centro Internacional de Agricultura Tro- técnica evitaría la utilización de antibióticos y pical, con sede en Colombia) y IITA (Instituto genes de resistencia a herbicidas, como marInternacional de Agricultura Tropical, con sede cadores, durante el proceso de selección de !"#B+.!)+*E#I2!#"!6!-*)+&#%)*-0*/*)#X-%&6Y-Z#/!# las células transformadas. semillas desde Sudamérica al continente africano, el cultivo de embriones resultó ser un Otra ventaja de la fertilización in vitro es la excelente método para transferir germoplasma posibilidad de realizar cruzamientos entre plan6&"#'="+'&-#)+!-.&-#$%&-*"+%*)+&-, %*-#32!#-&"#$0&.!"4%+6*'!"%!#/+-%*"%!-;#I2-+&nando in vitro sus respectivas gametas para El cultivo de embriones ha ayudado tam- producir cigotos híbridos. Se evitan así los inbién al mejoramiento genético de especies le- convenientes que frecuentemente se observan G&-*-# 32!# %+!"!"# /+$620%*/# !"# 0*# .!)'+"*6+8"# en la hibridación somática, como por ejemplo la de sus semillas, como en Taxus mairei, o con ocurrencia de inestabilidad del híbrido respecto escasa producción de semillas como es el caso /!0# "D'!)&# /!# 6)&'&-&'*-# &# 0*-# /+$620%*/!-# de Pseudotsuga macrolepis. núcleo e inter-citoplasmáticas (ya que en este caso es la célula huevo la que contribuye con El cultivo de embriones inmaduros puede el citoplasma del cigoto híbrido. Además, en la ser aplicado para disminuir el tiempo necesa- fusión gamética, el desarrollo temprano del cirio en la obtención de un nuevo cultivar. Por goto está regulado por genes pertenecientes a ejemplo en soja se requieren unos diez años la célula huevo, los que brindan señales celula7*)*# !-%!# $",# @+# -!# 6&"-+.2!"# )!*0+L*)# K*)+*-# res propias, haciendo que progrese el ciclo cegeneraciones por año, en contraestación, se lular en forma exitosa con el resultado de proeacelera el proceso. El cultivo de embriones in- mbriones producto de las sucesivas divisiones maduros ahorraría, además, el tiempo de ma- celulares. Pese a la potencialidad de la técnica duración de la semilla. En este y en cada caso de hibridación distante a partir de gametos, es en particular, se debe realizar la evaluación del importante la elección de especies parentales :!"!$6+&#!6&"8'+6*)*#/!6+/+)##0*#2%+0+L*6+8"# */!62*/*-#7*)*#'+"+'+L*)#0*-#/+$620%*/!-#32!# de estas técnicas. -2).!"# 7)&/26%&# /!# 0*-# /+I!)!"6+*-# $0&.!"4%+6&-;#$-+&08.+6*-#H#/!0#6+60!020*),# Cultivo de nucelas En las plantas leñosas, los explantos de tejidos maduros pierden la ca5.2 Aplicaciones para dilucidar aspectos pacidad de regeneración, se ha inducido en- básicos del desarrollo en plantas tonces con éxito la embriogénesis somática O*-#/+$620%*/!-#!"#!0#*+-0*'+!"%&#/!#0&-#.*-

192 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

metos de las plantas superiores ha obstaculizado durante mucho tiempo la comprensión /!#0*#$-+&0&.=*#.*'4%+6*#H#/!#0&-#'!6*"+-'&-# que desencadenan la embriogénesis; los embriones cigóticos en su medio natural ofrecen /+$620%*/!-#/!:+/&#*#-2#%*'*G!32!G&#H#*0# hecho de estar inmersos en el tejido materno. A partir del aislamiento de células espermáticas, células huevo y cigotas, se han podido realizar estudios moleculares de las células germinales, evitando las interferencias que resultan de la interacción con el tejido somático. Asimismo se ha facilitado el análisis de los efectos genéticos, epigenéticos e interacciones núcleo-citoplasmáticas inherentes a los gametos como también el estudio del desarrollo del embrión y el endosperma. De este modo, la fertilización in vitro de las plantas superiores se ha convertido en un área de investigación importante, resultando actualmente uno de los campos principales de la biología vegetal.

Los estudios sobre la embriogénesis somática#%*':+4"#5*"#7!)'+%+/&#+/!"%+$6*)#7*%)&"!-# de expresión génica relacionados con este proceso, que se desencadena a través del cultivo de tejidos. El sistema mejor estudiado, en relación con la embriogénesis somática, es el de suspensiones celulares de zanahoria (Daucus carota). En este sistema, la remoción del 2,4-D (ácido 2, 4-diclorofenoxiacético) del medio de cultivo, genera una respuesta embriogénica por la cual los agregados celulares forman embriones que crecen, de a millares, en un medio líquido (ver en este libro Parte II-Capítulo 1). Los embriones somáticos constituyen una excelente herramienta para estudiar los procesos de desarrollo en plantas, ya que facilitan el acceso a gran cantidad de embriones libres. Las plantas parecen poseer un programa embriogénico preestablecido que se desen6*/!"*# !"# )!-72!-%*# *# 6&"/+6+&"!-# !-7!6=$cas. El proceso de fertilización dispara la em-

Tabla 1,#A!-2'!"#/!#0&-#*K*"6!-#'!%&/&08.+6&-#7&-+:+0+%*/&-#7&)#0*-#%46"+6*-#/!#fertilización in vitro 7*)*# !0# !-%2/+&# /!0# 7)&6!-&# /!# 0*# /&:0!# I!62"/*6+8"# /!# 0*-#C".+&-7!)'*-# P[&/+$6*/&# /!# \*".# H# 6&0,;# 2006).

Cultivo in vitro de cigotos y embriones

Fusión in vitro de gametas

Aislamiento de células generativas

Cada una de estas técnicas ha posibilitado:

Investigar los requerimientos del embrión durante su desarrollo Investigar los aspectos moleculares de la embriogénesis Determinar la rec eptividad del cigoto para la transformación

Investigar los mecanismos de activación del cigoto

Estudiar la ultraestructura de las células generativas

Hibridar especies distantes Investigar las diferencias entre las células del saco embrionario Obtener bibliotecas de ADNc de cigotas

Realizar electroforesis de productos de células generativas Construir bibliotecas de ADNc de células generativas

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 193

briogénesis cigótica, cuyos estadios normales de desarrollo se muestran en la Fig. 3. Una serie de investigaciones han demostrado que hay requerimientos para que los gametos se fusionen in vivo, por ejemplo la presencia de calcio, elemento que posee una actividad altamente fusogénica y que además activaría el desarrollo del cigoto. Además, al estudiar la ultraestructura celular se han encontrado diferencias en la arquitectura de los microtúbulos entre la célula huevo no fertilizada y el cigoto, demostrando que este cambio está inducido por la fertilización. El cultivo in vitro y las tecnologías diseñadas para estudiar la expresión génica han permitido analizar por separado la función de genes 7)!-!"%!-#/!#'*"!)*#!-7!6=$6*#!"#0*-#64020*-# que participan en el proceso de fertilización. Con la utilización de técnicas de especiales de electroforesis bidimensional se han podido +/!"%+$6*)#7)&%!="*-#/!#64020*-#.*'4%+6*-#H#6+góticas, encontrándose pocas diferencias entre los patrones proteicos de embriones somá%+6&-#H#6+.8%+6&-,#B+".#H#6&0*:&)*/&)!-#P]^^TE#

Figura 3. Estadíos de la embriogénesis en Arabidopsis thaliana

estudiaron la contribución de los genes de las células espermáticas, la célula huevo y la cigota y obtuvieron evidencias de que hay clusters de genes que están presentes en la célula huevo y espermáticas, que persisten en el cigoto, mientras que hay una gran cantidad de genes que son propios del cigoto, produciendo en éste nuevos transcriptos. En el caso particular de la gameta masculina, se sabe que cada una de las funciones para las cuales está destinada (reconocimiento, fusión y adhesión con la gameta femenina), está controlada por la activación de genes. Por ejem70&;#_2#H#6&0*:&)*/&)!-#PQRRRE#+/!"%+$6*)&"# H# caracterizaron dos genes de histonas gcH2A y gcH3 que actúan durante la maduración de la célula espermática y también el gen LGC1 que se expresa exclusivamente en las células gaméticas masculinas. El producto de este último gen (una proteína) fue localizado en la super$6+!# /!# 0*-# 64020*-# .*'4%+6*-# '*-620+"*-# -2giriendo un posible rol en la interacción célula espermática-célula huevo, en el momento del reconocimiento o señalización. Además, este mismo grupo de investigación aisló, a partir de 2"*# :+:0+&%!6*# /!# CFB6;# # /&-# .!"!-;# B%@Q# H# B%@];#32!#6&/+$6*"#7*)*#2"*#7&0+.*0*6%2)&"*-*;#!"L+'*#32!#%!"/)=*#0*#I2"6+8"#/!#'&/+$6*)# la pared celular durante la diferenciación de las células espermáticas. >!-!#*#0*-#/+$620%*/!-#32!#7)!-!"%*#!0#*+-0*miento de las gametas femeninas (hay menor !$6+!"6+*# !"# 0*# &:%!"6+8"# /!# 64020*-# 32!# !"# las masculinas), también se han logrado progresos en el esclarecimiento de sus funciones. Por ejemplo, recientes investigaciones han esclarecido detalles acerca de la expresión de genes involucrados en el gameto femenino que determinan la guía del tubo polínico y la maduración de las anteras, como por ejemplo el gen ZmEA1, en maíz, que posee una función en la atracción del tubo polínico a la micrópila. Cuando este gen está regulado negativamente, la señal direccional del tubo polínico a 0*#'+6)87+0*#!-#+"-2$6+!"%!#H#"&#-!#7)&/26!#0*# fertilización. En relación a la expresión de genes en la !':)+&.4"!-+-#/!0#'*=L;#-!#5*"#+/!"%+$6*/&#*0gunos diferencialmente expresados en la célula basal y apical del embrión bicelular. En esta

194 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

misma especie la célula huevo mostró un incremento en la abundancia de transcriptos que involucran funciones como la comunicación celular, el crecimiento y la división celular, la síntesis /!#CFB#H##I*6%&)!-#)!0*6+&"*/&-#6&"#!-%)!-!-#H# transducción de señales. Por otro lado, las células centrales del saco embrionario muestran una abundancia de transcriptos involucrados con los procesos relacionados con el metabolismo de la energía y la síntesis proteica. En cada caso, es%&-#7)&/26%&-#7*)!6!)=*"#)!1!(*)#6*%!.&)=*-#I2"cionales representadas en el futuro desarrollo del embrión y el endosperma. Como en el caso ya citado de la célula espermática, se han iden%+$6*/&# %*':+4"# !"# 0*# 64020*# 52!K&# H# 0*# 6+.&%*## genes de histonas que podrían representar un mecanismo regulatorio de varios genes. El número de herramientas disponibles en la actualidad para manipular las gametas de las plantas superiores provee numerosas oportu"+/*/!-# 7*)*# )!*0+L*)# 7)&.)!-&-# 6+!"%=$6&-# H# tecnológicos. La investigación en el área de la biología reproductiva de las Angiospermas ha entrado en una nueva fase, donde los métodos de la biología molecular permiten responder muchas preguntas acerca de los mecanismos fundamentales de la fecundación y activación del desarrollo embriogénico temprano. Un resumen de las técnicas de fertilización in vitro que han permitido el acceso a nuevas investigaciones en el área molecular de este tema, se muestran en la Tabla 1. El desarrollo de sistemas experimentales en varias especies, particularmente en dicotiledó"!*-;# -&"# "!6!-*)+&-# 7*)*# 6&"$)'*)# 0&-# )!-20%*/&-#&:%!"+/&-#!"#.)*'="!*-;#*#$"#/!#6&'70!mentar la información molecular acerca del proceso de fertilización y mejorar los métodos para la producción de plantas regeneradas fértiles, con combinaciones genéticas estables y de alta !$6+!"6+*, 6 Lecturas recomendadas MC@@# F,# QRSV,# C"# 20%)*-%)26%2)*0# *"/# B&'*)-Y+` interference study of the sperms of barley. Can J Bot 51:601-605. Ma9B#@,b#cCBW;#c,b#OdCe;#f,b#ghCBWb#C,b#idCB;#a. 2008. Isolation of egg cells and zygotes of Torenia fournieri L. and determination of their surface

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Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 195

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196 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

II CAPÍTULO 2

ello, la obtención de plantas híbridas somáticas requiere del previo aislamiento de protoplastos mediante la digestión enzimática de las pareHibridación Somática des celulares, para luego proceder a la fusión de protoplastos de distintos tipos parentales Pablo Polci y Pablo Friedrich (distintos genotipos) y posterior regeneración de plantas a partir de los productos de fusión. 1 Introducción La hibridación somática en plantas comenzó a La mejora genética de las plantas cultivadas desarrollarse a principios de 1970 con la aplien procura de incrementar la producción viecación de métodos químicos de fusión, y se exne siendo practicada por el ser humano desde tendió en los ´80 con el empleo de métodos de hace miles de años, seguramente desde el inielectrofusión. cio mismo de la agricultura. Para ello, el hom9-# )!0!K*"%!# /!-%*6*)# 32!;# *# 0&-# $"!-# /!0# :)!# 5*# !'70!*/&# 0&-# 6)2L*'+!"%&-# 6&"# !0# $"# mejoramiento genético, el sistema de protode incrementar la variabilidad genética, paso plastos no sólo se emplea para la obtención de inicial en el proceso de mejoramiento. De esta híbridos somáticos, sino que también constitumanera la hibridación entre especies diferentes ye un material apropiado para la incorporación 7!)'+%+8#*2'!"%*)#/!#'&/&#-+."+$6*%+K�*#7)&/!#CFB#!N8.!"&,#C-+'+-'&;#0*#I2-+8"#/!#7)&%&ductividad de diversos cultivos, como por ejemplastos tiene un uso mucho más amplio que plo los cereales. Sin embargo, en otros cultivos el estrictamente de interés agronómico; en tal esta estrategia no resultó exitosa a causa de sentido, es de gran utilidad en estudios de bioesterilidad sexual o incompatibilidad genética. logía celular así como para otras aplicaciones La hibridación somática, es decir, la obtenbiotecnológicas, por ejemplo, la producción de ción de plantas híbridas a partir de la fusión de anticuerpos monoclonales. células o de protoplastos derivados de células somáticas, surgió hace unos 30 años como 2 Hibridación somática vs. hibridación una herramienta muy promisoria para sortear sexual problemas de incompatibilidad precigótica.. En relación a su potencialidad para producir Esta técnica, si bien presenta algunas limitahíbridos, existen diferencias importantes entre ciones, como una elevada esterilidad o impola fusión de protoplastos somáticos y el cruzasibilidad de regenerar plantas en algunos camiento sexual: sos, demostró ser útil en la mejora genética de plantas, principalmente por permitir la introgre?# La hibridación sexual entre organismos sión limitada de genes de especies silvestres de diferentes especies está limitada por en los cultivos. Se utiliza, por ejemplo, cuando barreras de incompatibilidad. En algunos se quiere transferir resistencia a enfermedacasos estas barreras son precigóticas, des o tolerancia a estreses. También permite es decir, no permiten que se produzca la obtención de citoplasmas híbridos (cíbridos). la fecundación. Tal limitante no existe en La hibridación asimétrica y cibridización sirve la fusión de protoplastos, dado que este como puente para la transferencia de genes 7)&6!-&#!-#"&`!-7!6=$6&;#7!)'+%+!"/�*# individuales fusión de células de orígenes muy diverLa técnica de fusión de protoplastos se desos, incluso de organismos muy distansarrolló en la década de 1950-60, a partir de 6+*/&-# $0&.!"4%+6*'!"%!# P7&)# !(!'70&;# la observación de que ciertos virus pueden células animales y vegetales). Ello no inducir la fusión de células animales. Sin em-+."+$6*# 32!# 72!/*# )!.!"!)*)-!# 2"# &)bargo, recién en la década de 1980-90 tuvo un ganismo viable y fértil a partir de cualmayor auge debido a la aparición de métodos quier tipo de combinación entre células. químicos y eléctricos más apropiados para la De hecho, la búsqueda de híbridos de infusión de células vegetales. La pared presenterés agronómico ha demostrado que el te en estas células representa una barrera que principal aporte de esta metodología es normalmente impide la fusión entre ellas. Por

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 197

?#

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la introgresión, en los cultivos, de genes provenientes de plantas silvestres emparentadas. La hibridación sexual ocurre normalmente por fusión de células haploides (n + n), mientras que en la hibridación somática se fusionan dos protoplastos con sus genomas completos (2n + 2n) o con uno de ellos conteniendo sólo parte de su genoma. Otra diferencia está dada por la herencia de los genes extranucleares, esto es, plastídicos y mitocondriales. Mientras que en la reproducción sexual el genoma citoplasmático es aportado casi exclusivamente por la gameta femenina, en la hibridación somática se combinan organelas de ambos progenitores, produciendo nuevas combinaciones de genes citoplasmáticos.

tencia horizontal a enfermedades y otros son poligénicos, por lo que su transferencia es factible por hibridación somática pero no por transformación genética. Sin embargo, en la actualidad, con las nuevas herramientas aportadas por la genómica se está avanzando en el conocimiento de todos los genes involucrados en diversas vías metabólicas. Estos podrían ser transferidos en conjunto vía transgénesis.

4 Tipos de híbridos somáticos Cuando se realiza la fusión de protoplastos se obtienen células con el aporte de cromosomas de dos o más núcleos. Si los protoplastos involucrados en la fusión proceden de distintos tipos parentales se originan “heterocariones”, y si proceden del mismo tipo parental se originan “homocariones”. Cuando en el heterocarión ocurre la fusión de los núcleos (cario3 Hibridación somática vs. transforma- gamia), se forma una “célula híbrida”. ción genética A partir de una célula híbrida, que contiene La preponderancia que han tomado las téc- dos genomas completos, se puede regenerar nicas de transformación genética ha relegado una planta que, según cual haya sido el destino a la hibridación somática a un papel de menor del material genético nuclear durante las divi-+."+$6*6+8"#6&'!))*'+!"%*#:+&%!6"&08.+6*# siones celulares que siguen a la fusión, puede aplicada al mejoramiento de los cultivos. Com- ser de tres tipos: parando ambas metodologías, podemos destacar las siguientes diferencias: 1. Híbrido simétrico, que tiene el genoma nuclear completo de cada tipo parental. 2. Híbrido asimétrico, que tiene el genoma ?# En la transformación genética se incornuclear completo de uno de los parentaporan uno o pocos genes exógenos en les y sólo una parte del genoma nuclear una planta, mientras que en la hibridadel otro parental. ción somática el número de genes intro3. Cíbrido, que contiene el genoma nuclear /26+/&-#!-#'*H&)#/*/ !#-!#%)*"-$!completo de uno de los parentales, reren cromosomas de una especie a otra teniendo sólo material genético extranuo se combinan dos genomas completos. clear del otro parental. ?# La hibridación somática permite transferir caracteres sin necesidad de contar Es usual que en el proceso de regeneración con un conocimiento detallado de los de plantas híbridas ocurra una eliminación gramecanismos moleculares que determi- dual de cromosomas de uno de los tipos panan la expresión de dichos caracteres. rentales, produciéndose de este modo híbridos Por el contrario, la transformación gené- asimétricos o cíbridos. La práctica de la hibri%+6*#)!32+!)!#0*#7)!K+*#+/!"%+$6*6+8"#H#*+-- dación somática en plantas demostró que, en lamiento de los genes que determinan la general, los híbridos asimétricos y cíbridos son expresión del carácter de interés. más valiosos que los simétricos producidos ?# Caracteres tales como productividad, to- !"%)!# 70*"%*-# *0!(*/*-# $0&.!"4%+6*'!"%!,# >&)# lerancia a ciertos tipos de estrés, resis- esta razón se han desarrollado métodos para

198 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

inducir la hibridación asimétrica o cibridación, alterando el genoma de uno de los protoplastos parentales. En este caso se dice que se %)*"-$!)!#7*)%!#/!0#.!"&'*#/!#2"#7)&%&70*-%&# donante a uno receptor. Por lo tanto, teniendo en cuenta el material de partida empleado para la fusión, pueden producirse tres tipos de células híbridas: 1. Células híbridas simétricas, por fusión de dos protoplastos con sus genomas completos. 2. Célula híbrida asimétrica, por fusión de un protoplasto conteniendo su genoma completo con otro conteniendo su núcleo inviable o sólo una parte de su genoma nuclear. Los protoplastos donantes son irradiados con rayos X o Gamma, lo que provoca la fragmentación de los cromosomas. Una vez producida la fusión, dichos fragmentos tienden a eliminarse en las sucesivas mitosis, pero algunos de ellos pueden integrarse con el genoma del receptor produciendo un híbrido asimétrico. El tratamiento de irradiación parece no tener efectos deletéreos o mutagénicos sobre los genomas de organelas, probablemente debido a que cada célula posee varias copias de ellas. También puede producirse una célula híbrida asimétrica fusionando protoplastos receptores con microprotoplastos, conteniendo uno o pocos cromosomas. Los microprotoplastos se obtienen induciendo la formación de micronúcleos por tratamientos con agentes antimicrotúbulos. 3. Cíbridos, por fusión de un protoplasto conteniendo su genoma nuclear completo con un protoplasto enucleado o con su núcleo inviable. Los protoplastos enucleados o citoplastos pueden obtenerse centrifugando los mismos a alta velocidad en un gradiente de densidad isosmótico. Asimismo, el método de irradiación con rayos X o Gamma puede generar cíbridos en casos en que se produzca la eliminación total de los fragmentos cromosómicos. Los protoplastos que poseen su genoma nuclear completo (receptores), pueden ser tratados pre-

viamente con inhibidores metabólicos. En este caso sólo pueden sobrevivir, por complementación metabólica, los heterocariones conteniendo el núcleo del receptor y el citoplasma del donante enucleado. La segregación de los plástidos y mitocondrias de los dos tipos parentales también constituye una fuente importante de variabilidad en la regeneración de plantas híbridas. Es frecuente que ocurran recombinaciones de los genomas mitocondriales de ambos tipos parentales, pero ello es poco común entre plástidos. Dado que las organelas segregan independientemente unas de otras, la regla es que al cabo de pocas divisiones mitóticas las células formadas contengan plástidos provenientes de uno u otro tipo parental. Así, una célula híbrida origina una colonia de células que exhiben diferentes combinaciones de genes citoplasmáticos, pero con una mayor frecuencia de células que poseen mitocondrias recombinantes y plástidos de uno u otro tipo parental. El destino que sufre el material genético nuclear y extranuclear durante las divisiones celulares determina que, a partir de una población de células híbridas similares, se puedan regenerar plantas con diferentes combinaciones de genes nucleares, plastídicos y mitocondriales. La Figura 1 muestra un esquema de las etapas involucradas en la hibridación somática, las cuales son tratadas a continuación. 5 Aislamiento de protoplastos El desarrollo de métodos enzimáticos de aislamiento a partir de 1960 brindó la posibilidad de obtener grandes cantidades de protoplas%&-# K!.!%*0!-,# 900&# %2K&# .)*"# +"12!"6+*# !"# /+ferentes áreas de la biología y la biotecnología de plantas, dada la utilidad de los protoplastos 6&'&#-+-%!'*#!N7!)+'!"%*0#7*)*#!-%2/+&-#$-+&lógicos, bioquímicos y moleculares, así como para su aplicación al mejoramiento genético. Los protocolos de aislamiento emplean enzimas fúngicas con actividad celulasa y pectinasa, siendo necesario en algunos casos el agregado de hemicelulasas. Las celulasas y hemicelulasas degradan la pared celular, en

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 199

?

?

Aislamiento de protoplastos

Protoplastos parentales 1

Protoplastos parentales 2

?

?

Modificaciones genómicas para producción de híbridos simétricos/cíbridos y/o pretratamiento para posterior selección (opcionales)

Protoplastos parentales 1 (originales o modificados)

Protoplastos parentales 2 (originales o modificados) ?

? ?

? ?

Fusión de protoplastos

? Mezcla de protoplastos parentales y productos de fusión ?

?

Selección de células híbridas Protoplastos híbridos ?

Cultivo de protoplastos híbridos y regeneración de plantas

o

Cultivo de la mezcla de protoplastos en medio selectivo (opcional) y regeneración de plantas

Figura 1: Materiales y procesos involucrados en la hibridación somática.

200 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

tanto que las pectinasas digieren la matriz de pectina que mantiene adheridas a las células. El uso de enzimas disponibles comercialmente posibilitó el aislamiento de protoplastos de prácticamente cualquier tejido vegetal, siempre 32!#!0#'+-'&#"&#!-%4#0+."+$6*/&,#@!#5*#7&/+/&# aislar protoplastos de una gran cantidad de especies vegetales y regenerar plantas a partir de los mismos, permitiendo el uso de este sis%!'*#7*)*#0*#7)&7*.*6+8"#60&"*0#H#0*#'&/+$6*ción genética de plantas. El número de protoplastos aislados, su viabilidad y la pureza de la suspensión obtenida dependen de varios factores, debiendo establecerse en forma empírica las condiciones óptimas para un sistema determinado. Las etapas del aislamiento y los factores a considerar en cada una de ellas se describen a continuación: 1. Selección del material de partida. In12H!#!"#!0#)!-20%*/&#/!0#*+-0*'+!"%&#*-=# como en el proceso de regeneración posterior. Generalmente se emplean hojas y células en cultivo líquido o sólido. Cuando se emplean hojas, la edad y las condiciones de cultivo de la planta afectan el rendimiento. Se obtienen mejores resultados con hojas jóvenes totalmente expandidas que con hojas viejas (Fig. 2A). Para facilitar el contacto de las enzimas con las células, las hojas suelen cortarse !"#%)&L&-#7!32!G&-;#'2H#$"&-#!"#!0#6*-&# de las monocotiledoneas. Algunas veces se extrae la epidermis inferior antes de colocar la hoja en la solución enzimática, como sucede con las dicotiledoneas. Cuando se emplean células en suspensión, se obtienen mejores resultados si se encuentran en la fase exponencial de crecimiento. 2. Tratamiento enzimático. La concentración de la enzima y el tiempo de incubación requeridos para lograr la liberación de los protoplastos dependen del producto comercial utilizado. El pH generalmente se ajusta en un rango de 4,7 a 6, y la temperatura entre 25 y 30 °C. La duración del tratamiento enzimático y la relación volumen de solución/canti/*/#/!#%!(+/&#+"12H!"#!"#!0#)!"/+'+!"%&,#

Durante el aislamiento se produce la lisis de algunas células, que liberan enzimas hidrolíticas y compuestos oxidantes que pueden dañar los protoplastos, por lo que se suelen agregar inhibidores de proteasas y antioxidantes tales como el Polivinilpirrolidona-10. El agregado de un estabilizador osmótico a la solución enzimática es esencial para evitar la ruptura de los protoplastos a medida que son liberados, siendo más estables si la solución es ligeramente hipertónica. Para ello se utilizan solutos osmóticamente activos, comúnmente manitol o sorbitol, en concentraciones que varían entre 0,3 a 0,8 M según el tipo de protoplasto. La solución enzimática es generalmente suplementada con sales, comúnmente CaCl2, que incrementan la estabilidad de la membrana (Fig. 2B). 3. 01231'4$" 5" 3/*1-.$.1,6" 7'" #+&" 3*+)+plastos. Una vez lograda la liberación de los protoplastos, se procede a la remoción de las enzimas y de los restos de tejido y de células rotas. La suspensión -!# 7*-*# 7&)# 2"# $0%)&# /!# "H0&"# &# '!%!%)+# 6&"# '!/+&# *.*)+$6*/&;# donde se mezcla la solución de protoplastos con un medio de cultivo líquido a 40°C conteniendo 1,2% de agar, perferentemente agarosa (Fig. 4A). Los protoplastos quedan, así, atrapados en el medio semisólido y, luego de varios días, se ven las colonias formadas (Fig. 4B). Sin embargo, el medio líquido da mejores resultados por varias razones: (a) los protoplastos de varias especies solo pueden dividirse en medio líquido, (b) la presión osmótica del medio puede ser fácilmente reducida a los pocos días en cultivo, (c) la densidad celular puede

206 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

-!)# '&/+$6*/*# *.)!.*"/&# '!/+&# /!# 620%+K&# &# las células con especial interés pueden ser aisladas y cultivadas a alta densidad, (d) la degradación de algunos componentes del medio por la población de protoplastos puede producir algunas sustancias citotóxicas, cuya concentración alrededor de las células será menor en !0#'!/+�=32+/&,#h"*#%46"+6*#'2H#!$6+!"%!#32!# combina medio sólido y líquido es la de cultivo en perlas de agarosa, donde los bloquecitos con los protoplastos inmovilizados en agarosa son cortados en cuatro mitades y colocados en medio líquido, donde se cultivan en contínua agitación. Los protoplastos regeneran la pared celular luego de uno a cuatro días en cultivo. La presencia de pared es esencial para lograr una división regular. Luego de dos a tres semanas, producto de mitosis sucesivas, se forman microcolonias derivadas cada una de una célula, que dos semanas después se pueden ver a simple vista. Estos callos son transferidos a un medio de cultivo y a condiciones apropiadas para regenerar plantas (Fig. 4). Los principales factores a tener en cuenta para el cultivo de protoplastos son:

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Los requerimientos nutricionales: se han utilizado en muchos casos los mismos medios de cultivo que se utilizan en el cultivo de células y tejidos, pero en general son enriquecidos con vitaminas, azúcares, aminoácidos, reguladores de crecimiento y también con aditivos ines7!6=$6&-#6&'�!65!#/!#6&6&;#5+/)&0+L*do de caseína, extracto de levadura, etc. El potencial osmótico del medio de cultivo: los protoplastos requieren de protección osmótica antes de regenerar la 7*)!/# 6!020*),# B&)'*0'!"%!# -!# *(2-%*# con el agregado al medio de cultivo de manitol o sorbitol. La densidad celular: la densidad inicial de protoplastos varía de 104#p#Q^5 protoplastos/ml de medio de cultivo. Los cultivos con altas densidades producirán, a partir de cada protoplasto, colonias que deberán separarse tempranamente para evitar quimeras. Si deseamos colonias bien separadas para asegurar que provengan de un solo protoplasto, la densidad inicial /!:!#-!)#:*(*;#/!#Q^^#p#n^^#7)&%&70*-%&-t ml. Hay protoplastos de varias especies y tipos que no logran dividirse a bajas

Figura 4: Cultivo de protoplastos de tabaco. A.#>)&%&70*-%&-#/!#'!-8$0&,#B y D. Cultivo de los protoplastos en perlas de agarosa suspendidas en medio líquido. C. Detalle de la formación de callo a partir de protoplastos. E. Callo en medio de regeneración. F. Desarrollo de plantas a partir de callos de protoplastos. G. Planta regenerada.

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 207

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to cromosómico permite revelar si el híbrido posee el total de cromosomas de cada parental, si se han fusionado más de dos protoplastos, el grado de aneuploidía y posibles translocaciones intergenómicas. Mediante hibridación in situ !'70!*"/&# -&"/*-# /!# CFB# )!7!%+%+K&# !-7!6=$6&# /!# !-7!6+!# 72!/!# !K*02*)-!# con más profundidad la contribución de los genomas parentales y reestructuraciones cromosómicas en el híbrido. 3. Isoenzimáticos. El patrón de bandas isoenzimáticas del híbrido debe mostrar bandas de ambos parentales, pudiendo haber otras bandas que resultan de nuevas combinaciones de las subunidades enzimáticas. Habitualmente se analizan los patrones de glucosa-6-fosfato deshidrogenasas, fosfoglucoisomerasas, glutamato oxalacetato transaminasas, esterasas, peroxidasas y fosfatasas ácidas. Las isoenzimas son extremadamente variables entre tejidos vegetales, por lo que para el análisis se deben emplear los mismos tejidos u órganos, y en el mismo estadío fenológico. 4. A nivel de ADN. La demostración de la 7)!-!"6+*#/!#CFB#/!#*':&-#7*)!"%*0!-# es la prueba más directa de la hibrida6+8",#90#*"2!/!#00!K*)-!#*#6*:&)#AkO># P7&0+'&)$-'&-#!"#0*#0&".+%2/#/!#0&-#I)*.'!"%&-# /!# )!-%)+66+8"E;# AC>F# P7&0+'&)$-'&-# !"# !0# CFB# *'70+$6*/&# *0# *L*)E# o Southern blot, empleando sondas de CFB# )!7!%+%+K&# !-7!6=$6&# /!# !-7!6+!# &# /!#.!"!-#/!#CAB#)+:&-&'*0,

densidades de cultivo. Para estos casos se desarrolló la técnica de cultivo con células nodrizas o alimentadoras. Esta técnica consiste en exponer una suspensión de 106 protoplastos/ml a rayos X a dosis que inhiben la división celular pero que quedan metabolicamente activas. Estas 64020*-#-!#70*32!*"#!"#2"#'!/+&#*.*)+$cado, y luego se colocan por sobre éstas los protoplastos sin irradiar, de los cuales se formarán las colonias. También suele 2%+0+L*)-!# 7*7!0# /!# $0%)&# 7*)*# -!7*)*)0*-# de las células nodrizas. Otra técnica utilizada es el cultivo en microgota, donde se puede cultivar hasta un solo protoplasto. Cada microgota contiene entre 0,25 - 25 µl de medio de cultivo, logrando densida/!-#/!#]#p#U#N#Q^3 protoplastos/ml. Con ayuda de un micromanipulador se coloca la célula y se la cubre con aceite mineral para evitar la deshidratación del medio. Los tratamientos físicos: tratamientos de choque eléctrico y térmico estimulan la división de los protoplastos.. Las condiciones de cultivo: en general los protoplastos son sensibles a la luz, por lo cual durante el cultivo se los mantiene en oscuridad o bajo luz muy tenue. El origen de los protoplastos: el estado $-+&08.+6&# /!0# %!(+/&# /!0# 62*0# 7)&K+!"!"# y la calidad de los protoplastos son muy importantes para obtener una elevada !$6+!"6+*#!"#0*#)!-72!-%*#*0#620%+K&,#

:";7'6)1-.$.1,6"7'"#$&"3#$6)$&"(MA# )!!'70*L*"/&# 0&-# 2)*6+0&-# 7&)# %+'+"*-# para su posterior secuenciación. A través de estos métodos es posible analizar el estado de metilación de secuencias aleatorias (MSAP) o -!62!"6+*-#!-7!6=$6*-#P-!62!"6+*6+8"#7&)#:+-20$%&E#H#/!%!)'+"*)#0*#K*)+*6+8"#!7+.!"4%+6*#!"# poblaciones naturales.

Figura 2. Esquema que representa el análisis de '!%+0*6+8"#/!0#CFB#*#%)*K4-#/!#0*#%46"+6*#/!#[@C># (52.67('.%!&-=2&)%.%>2-4,8(%#29-
especies diferentes aunque relacionadas. Tanto en el caso de la alopoliploidía como en la 5+:)+/*6+8"#+"%!)!-7!6=$6*#/&-#.!"&'*-#/+K!)gentes se unen en un núcleo híbrido, desencadenando una serie de cambios genéticos y epigenéticos que dan lugar a una gran variabilidad fenotípica (Figura 3). En híbridos alopoliploides sintéticos de Arabidopsis se demostró que se producen inestabilidades fenotípicas asociadas con cambios en la metilación y en la expresión génica. Por otro lado en generaciones tempranas de híbridos alopoliploides de trigo y Brassica se reportaron cambios genéticos estructurales tales como eliminacio-

Figura 3. Esquema que representa el “estrés o shock genómico” producido por efecto de la hibri/*6+8"# +"%!)!-7!6=$6*,# 90# 6)2L*'+!"%&# /!# # /&-# !-pecies que han divergido induce alteraciones en los patrones de metilación en el núcleo híbrido que producen cambios en la transcripción y reestructuraciones genéticas tales como: movimiento de transposones, rearreglos cromosómicos y cambios en la cromatina.

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 213

nes de secuencias. En nuestro Laboratorio -!# &:%2K&# 2"# 5=:)+/&# +"%!)!-7!6=$6&# !"%)!# 2"# haploide de la papa cultivada Solanum tuberosum (2n=2x=24) y la especie silvestre Solanum kurtzianum (2n=2x=24). Algunas plantas 5=:)+/*-#7)!-!"%*:*"#'*0I&)'*6+&"!-#1&)*0!-;# similares a las descritas en Arabidopsis, que +"602=*"#6*':+&-#!"#0*#'&)I&0&.=*#1&)*0;#74%*0&-#/+-!6%*/&-;#*"%!)*-#*%)&$*/*-#H#!-%+0&-#)!torcidos entre otras. Por otro lado, los híbridos presentaban nuevos fragmentos de AFLP y AC>F# P?'&9!,- 4,8(%#29-
mostró cambios en los patrones de metilación de las plantas híbridas en relación a las especies progenitoras. Estos resultados obtenidos !"# /+-%+"%&-# 5=:)+/&-# +"%!)!-7!6=$6&-# -2.+!)!"# que existe una correlación entre la remodelación general de la metilación del genoma híbrido, los cambios genéticos y la alteración de la actividad génica y el fenotipo. En resumen, tanto la poliploidía como la hi:)+/*6+8"# +"%!)!-7!6=$6*# +"/26!"# 6*':+&-# .!nómicos como producto del estrés generado por la duplicación génica o por la reunión de dos genomas divergentes en un núcleo híbri/&,#C/!')!--;#B!j#c&)Y;#VUT#77,# Kalisz S. and Purugganan M.D. 2004. Epialleles vs FBC#'!%5H0*%+&"J#6&"-!32!"6!-#I&)#70*"%#!K&02tion. Trends in Ecology and Evolution 19:309-314. Madlung A. and Comai L. 2004. The effect of stress on genome regulation and structure. Annals of Botany 94:481-495. [*)$0#M,k,;#M*'*/) ,O,#*"/#[*-2!00+#A,\,#]^^R,# Phenotypic instability and epigenetic variability in a diploid potato of hybrid origin, Solanum ruizlealii. BMC Plant Biology 9:21. A*77#A,C,#*"/#\!"/!0#f,k,#]^^n,#97+.!"!%+6-#*"/# 70*"%#!K&02%+&",#B!j#>5H%&0&.+-%#QToJoQ`RQ, A+//0!# B,M,#*"/#m+)650!)# f,C,#]^^V,#9II!6%-#&I#)!2nited diverged regulatory hierarchies in allopolyploids and species hybrids. Trends in Genetics 19:597-600.

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 215

216 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

II. CAPÍTULO 4

ha contribuido considerablemente a dilucidar procesos biológicos fundamentales para la vida vegetal y para la productividad de los cultivos. Mutagénesis, TILLING y Las investigaciones en busca de mejorar la EcoTILLING !I!6%+K+/*/#H#0*#!-7!6+$6+/*/#/!#0&-#%)*%*'+!"tos mutagénicos sobre las plantas cultivadas, y Alberto Prina, Alejandra Landau, de procedimientos de manejo y selección más María Gabriela Pacheco y Esteban H Hopp !$6+!"%!-;#%2K+!)&"#2"#.)*"#*2.!#!"#0*-#/46*das del 50, 60 y 70. 3.1. Mutagénesis clásica Hoy existe un renovado interés por esta te3.1.1. Introducción mática al que sin duda contribuyó el enorme El concepto de mutación en Biología fue in- conocimiento generado por la biología molecutroducido a principios del siglo pasado por de lar, que alejó viejos fantasmas sobre la variabiVries, para designar a los cambios heredables lidad inducida, y el reciente desarrollo de técnide aparición súbita. Hoy en día las mutaciones cas moleculares de gran capacidad de análisis -!#!N70+6*"#7&)#*0%!)*6+&"!-#!"#!0#CFB;#32!#K*"# como la técnica de genética reversa denominadesde cambios en una o unas pocas bases (mu- /*#idOOdBW#P/!0#+".04-;#Targeting Induced Local taciones de punto) hasta pérdidas, adiciones o Lesions in Genomes). %)*"-0&6*6+&"!-#/!#.)*"/!-#7&)6+&"!-#/!#CFB# A continuación se discuten los principales (cambios estructurales) o incluso cromosomas I*6%&)!-#*#%!"!)#!"#62!"%*#7*)*#0*#*70+6*6+8"#!$y genomas enteros; también podrían incluirse ciente de la metodología clásica de mutaciones entre ellas las alteraciones heredables de na- inducidas en plantas cultivadas. La descripción turaleza epigenética, por ejemplo los cambios detallada de protocolos puede consultarse por !"# 0*# '!%+0*6+8"# /!0# CFB# PK!)# W)*"%`Fj&"%&"# !(!'70&#!"J#B!2II!);#QRRVb#dC9C;#QRRnb#g&&)"y Dickinson, 2005). Las mutaciones son el ori- neef, 2002. gen primario de la variabilidad genética y, por lo tanto, cierto control sobre su frecuencia y/o es3.1.2. Tratamientos mutagénicos pectro puede considerarse una herramienta de 3.1.2.1. Agentes mutagénicos gran valor para el mejoramiento de las plantas O&-#*.!"%!-#*)%+$6+*0!-#2%+0+L*/&-#!"#'2%*.4620%+K*/*-,#C#$"!-#/!#0*#/46*/*#/!0#]^;#@%*/0!)# nesis clásica pueden dividirse según su naturadesarrolló magistralmente las bases de la mu- leza en dos grandes grupos: físicos o químicos. tagénesis experimental en plantas cultivadas, e%)*# '*"!)*# *)%+$6+*0# /!# +"6)!'!"%*)# 0*# %*-*# hecho que fue contemporáneo a los trabajos de mutaciones es a través de las condiciones pioneros de Muller sobre mutagénesis en Dro- especiales del cultivo in vitro de células o de sophila. El primer éxito comercial consistió en tejidos (variación somaclonal). También existen una mutante de tabaco de hoja clara y de gran factores de naturaleza biológica que causan alcalidad obtenida por Tollenar (Holanda) que lle- gún tipo de inestabilidad genética mayor a la gó a cubrir una importante área de cultivo en habitual de la especie, como la producida por Indonesia a mediados de la década del 30. Hoy ejemplo por genes relacionados con los sisteen día existen en el mundo miles de cultivares '*-#/!#)!7*)*6+8"#/!#CFB#&)#0*#*6%+K*6+8"# inscriptos obtenidos por esta metodología. Se de transposones. incluyen en esta lista, cultivos de gran importanAgentes físicos cia económica, como los principales cereales, Entre éstos tenemos distintos tipos de radiaoleaginosas, así como, numerosas especies de hortalizas y cultivos industriales. Los caracteres ciones ionizantes como los rayos X, los rayos que han sido mejorados son muy diversos: to- gamma, los neutrones, los protones y las partílerancia a herbicidas, a estrés bióticos o abió- culas alfa, cada una de ellas con diferente poticos, calidad nutricional, industrial, etc. (para der de ionización y de penetración. Las radiaciones ionizantes al atravesar la más información ver IAEA 1995, Datta 2005). Además, la ampliación de la variabilidad dis- materia producen iones radicales inestables ponible por medio de las mutaciones inducidas y electrones libres, que a su vez originan una

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 217

serie de reacciones químicas directas (por ionización de un átomo en una molécula), o indirectas (por reacción de las macromoléculas con productos radiolíticos, mayormente con los radicales OH del agua). Entre otros cambios 32='+6&-#32!#*I!6%*"#!0#CFB#&62))!#0*#/!*'+nación de bases y producción de 8-hidroxiadenina y de varios glicoles de timina, oxidación de alcoholes de la desoxirribosa y roturas de las uniones carbono-carbono. Los tratamientos con radiaciones ionizantes implican habitualmente altos niveles de daño cromosómico, originando roturas simples y dobles de las cade"*-#/!#CFB;#H#!I!6%&-#$-+&08.+6&-#/!0!%4)!&-;# que conducen a una alta letalidad celular y a una alta esterilidad de las plantas de la primera generación, todo lo cual limita la obtención de una alta tasa de mutaciones en la segunda generación. La magnitud y el tipo de daño ocasionado por las radiaciones ionizantes son marcada'!"%!# +"12+/&-# 7&)# 6+!)%*-# 6*)*6%!)=-%+6*-# /!0# material tratado, como el estado metabólico y el contenido de agua y de oxígeno. Así también, los efectos de determinada dosis pueden variar de acuerdo al mayor o menor tiempo en que se aplica (tasa de irradiación), desde unos pocos segundos o minutos (irradiación aguda) hasta meses o años (irradiación crónica). Los efectos letales de determinada dosis pueden disminuirse, por ejemplo, cuando se aplica repartida en distintos momentos, con intervalos de uno o varios días de recuperación o incluso dividida en aplicaciones agudas realizadas en años sucesivos (tratamientos recurrentes). Las radiaciones ionizantes que más se han 2%+0+L*/*)*#+"/26+)#K*)+*:+0+/*/#6&"#$"!-#/!# $%&'!(&)*'+!"%&#-&"#0&-#)*H&-#_#H#0&-#.*''*;# con longitudes de onda del orden de fracciones de nanómetros (nm) a varios nm. Si bien los rayos gamma tienen mayor poder de penetración que los X, los dos pueden penetrar desde varios milímetros a centímetros, siendo por lo tanto adecuados para tratamientos aplicados sobre semillas o yemas vegetativas. Ambas son radiaciones de origen electromagnético de baja energía lineal liberada al atravesar la '*%!)+*;# 7&)# 0&# 32!# -&"# 60*-+$6*/*-# 6&'&# "&# densamente ionizantes, en contraposición con las densamente ionizantes, como por ejemplo

los neutrones ligeros. Las consecuencias genéticas típicas de las radiaciones ionizantes son las aberraciones cromosómicas, como las deleciones y translocaciones, que han resultado de utilidad para la ubicación de numerosos genes sobre los cromosomas. Las deleciones producidas por las radiaciones densamente ionizantes son de mayor tamaño y se agrupan, formando clusters, siendo más difíciles de reparar. Las de mayor tamaño difícilmente sor%!*"#!0#$0%)&#/!#0*#.*'!%&.4"!-+-;#7&)#0 !#!"# muchos casos no son transmitidas sexualmente a las progenies. Las deleciones conducen a knock outs génicos y han sido utilizadas por ejemplo para inactivar genes que promueven la susceptibilidad a algunas enfermedades en trigo. En combinación con la tecnología de mi6)&*))!.0&-# 72!/!"# 7!)'+%+)# 0*# +/!"%+$6*6+8"# de genes candidatos cuya expresión pueden cambiar drásticamente. En muchos casos, las deleciones pueden ser localizadas por medio de Southern blot# &# >MA# P)!*66+8"# !"# 6*/!"*# de la polimerasa). Por otro lado, las propiedades de las radiaciones ionizantes para romper los cromosomas y permitir así translocaciones han sido utilizadas desde hace más de 50 años para transferir segmentos cromosómicos entre distintas especies; técnica que se ha utilizado para mejorar la resistencia a enfermedades en trigo. La luz ultravioleta es también una radiación de origen electromagnético, pero a las longitudes de onda habitualmente utilizadas no se considera ionizante. Su longitud de onda es varios miles de veces superior a la de los rayos X y gamma, y por su baja penetración sólo es utilizable sobre materiales muy delgados, como por ejemplo granos de polen y cultivos celulares o de tejidos. La luz ultravioleta origina 2"#/*G&#'2H#!-7!6=$6&#-&:)!#!0#CFB;#6&"-%+tuido mayormente por la formación de dímeros /!#%+'+"*#32!#*#-2#K!L#-&"#!$6+!"%!'!"%!#)!parados por sistemas celulares muy especializados. Su efecto biológico varía considerablemente de acuerdo a la longitud de onda, siendo 0*#/!#'*H&)#*:-&)6+8"#7&)#!0#CFB#*32!00*#!"#!0# rango de 250 a 290 nm. Agentes químicos Las primeras investigaciones sobre la capacidad mutagénica de las sustancias químicas

218 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

datan de principios del siglo pasado, pero su 2-&# !"# $%&'!(&)*'+!"%&# -!# 6&"6)!%8# '265&-# años después a través de los trabajos que facilitaron el uso al disminuir los requerimientos en equipamientos e instalaciones. Existen muchas sustancias con capacidad mutagénica, sin embargo los más utilizados 6&"# $"!-# 7)&)#&%)�*/&;#0*#7&0+70&+/=*#72!/!#+"12+)#"&tablemente la expresión y vitalidad de las mutantes, los genotipos poliploides tienen mayor capacidad de soportar cambios drásticos como grandes deleciones de cromosomas o incluso

de cromosomas enteros. En éstos habitualmente se observa una menor proporción de cambios fenotípicos drásticos que en los diploides. 3.1.3.2. Expresión de los distintos daños El esquema de la Figura 1 indica los distintos momentos en que pueden observarse los daños producidos por el tratamiento de semillas (para más detalles ver Prina, 1989). Las proporciones de los distintos daños tienen ten/!"6+*-# /!$"+/*-# /!# *62!)/&# *0# '2%*)*# )!/26+)# 6&-%&-;# 0&-# CFB-# 7)&6!/!"%!-# de distintas plantas M2 (usualmente entre 2 y 10) se pueden mezclar para su análisis en un mismo tubo. Sobre una parte de la mezcla se )!*0+L*)MA;#2%+0+L*"/&# &0+.&"260!8%+/&-# 6&"# -!62!"6+*-# 1*"32!*"%!-# al segmento genómico de interés (previamente diseñados en base a la secuencia conocida). O&-# 7)&/26%&-# /!# *'70+$6*6+8";# 32!# 6&"-+--

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 225

tirán en una mezcla de secuencias normales y mutadas, se desnaturalizan sometiéndolos a alta temperatura y se les permite rehibridar entre sí bajando la temperatura. Algunas de las cadenas rehibridadas podrán ser heteroduplexas, es decir, una de las cadenas provendrá de una secuencia mutada y otra de una normal produciendo una doble cadena que contiene bases mal apareadas por falta de complementariedad. Estas bases mal apareadas serán reconocidas por la enzima endonucleasa CelI, produciendo un corte donde encuentra la anomalía. Los productos de la digestión con Cell se resuelven por electroforesis en geles de poliacrilamida, y si los oligonucleótidos utilizados !"# 0*# >MA# I2!)&"# 7)!K+*'!"%!# '*)6*/&-# 6&"# 12&)8I&)&-#P/!#12&)!-6!"6+*#)&(&#H#K!)/!#!"#0*# $.2)*E;#0&-#7)&/26%&-#/!0#6&)%!#7&/)-;#7&-+:0!'!"%!#)!!'70*6!"#!0# tratamiento con CelI#!"#0*#%46"+6*#/!#idOOdBW,# Al día de hoy las publicaciones de ultra-deep sequencing en virus, permiten detectar genomas con variaciones en mezclas que contienen muchísimos genomas no mutados. Otra variante utilizada es la DHPLC (del inglés, denaturing high-performance liquid chromatography) basada en la utilización de columnas para cromatografía líquida de alta presión que 7!)'+%!"#/+I!)!"6+*)#CFB#5!%!)&/D70!N#/!0#5&modúplex. Para reducir el número de muestras *"*0+L*/*-;#K*)+&-#7)&/26%&-#/!#>MA#H#7&-%!rior digestión con CelI se siembran en el mismo carril de un gel (por ejemplo toda una columna). Por otro lado se siembra también toda una $0*,#F!#!-%*#'*"!)*;#0*#*7*)+6+8"#/!#:*"/*-#/!#

igual tamaño en carriles pertenecientes a co02'"*-#H#$0*-#7!)'+%!#+/!"%+$6*)#0*#+"%!)-!66+8"# !"# 0*# 32!# -!# !"62!"%)*# !0# 7&6+00&# 6&"# !0#CFB# mutado (de un modo similar al esquema que se propone en la Figura 2). 9"# !0# 96&idOOdBW;# '!"&-# 2%+0+L*/&# 32!# !0# idOOdBW;#!"#02.*)#/!#*"*0+L*)#7&:0*6+&"!-#7)&venientes de mutagénesis inducida, los materiales de partida que se utilizan como fuente de variabilidad suelen ser los almacenados en bancos de germoplasma, o bien ecotipos de especies no domesticadas. Los problemas de este enfoque alternativo son varios: el acceso al material puede ser limitante, los fondos genéticos son demasiado variables, las mutaciones que disminuyen la adaptación de una planta no suelen estar representadas porque son !0+'+"*/*-#7&)#-!0!66+8"#"*%2)*0#&#*)%+$6+*0;#!%6, 3.3. Mutagénesis de inserción con transposones y ADN-T Otro sistema utilizado en genética inversa para el análisis funcional de genes consiste en la activación de transposones endógenos (siendo el Ac-Ds de maíz el más emblemático), mediante cruzamientos entre genotipos que resulten en la activación de dichos transposones o mediante la introducción de transposones foráneos por ingeniería genética (por ejemplo, el sistema Ac de maíz fue introducido en papa, el Enhancer o SPM de maíz en Arabidopsis o el '2%*/&)#A&:!)%-&'+*"&#Mu en maíz). Una de las grandes ventajas de esta técnica es que el elemento insertado proporciona un marcador molecular de secuencia conocida (tag) en el sitio de inserción (sitio de knock out), que puede facilitar el aislamiento del gen mutado por pérdida o ganancia de función debido a que la inserción es reversible. Las desventajas principales de esta aproximación son: que las mutaciones pueden ser inestables (revertir), y que la transposición tiene frecuencias bajas y no siempre la inserción es totalmente azarosa. Para potenciarla se pueden colocar promotores fuertes como el 35S del virus del mosaico /!0#6&0+1&)#PM*[lE#7*)*#6&"%)&0*)#0*#!N7)!-+8"# del gen de la transposasa. Las ventajas de ha6!)#!-%&#-!#)!1!(*"#!"#2"#*2'!"%&#-+."+$6*%+K&# en la tasa de mutación (hasta 1x10-4 en maíz, por ejemplo), y en que provee una secuencia

226 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

foránea conocida en el sitio de inserción, lo cual facilita el posterior clonado molecular. Existen algunas variantes de esta técnica como la captura de genes o de promotor (gene o promotor trapping), en este caso se pueden incluir secuencias foráneas de genes reporteros como uidA (GUS), gfp (GFP) y sus variantes de otros colores, o genes involucrados en la síntesis de antocianas (Lc), con o sin pro-

motores funcionales. Si el gen indicador que no contiene promotor se inserta al azar bajo el control de algún promotor endógeno, entonces se activará su expresión y se visualizará fácilmente. Otra ventaja de esta aproximación !-# 0*# +/!"%+$6*6+8"# -!"6+00*# -+"# "!6!-+/*/# /!# disponer de un fenotipo mutante, lo cual es útil cuando existen genes redundantes, heterocigosis o cuando se analizan genes activos

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 227

en distintos estadios de desarrollo. La función génica puede caracterizarse posteriormente en las mismas líneas si la inserción ha producido un knock out. O*# '2%*.4"!-+-# /!# +"-!)6+8"# 6&"# CFB`i# (segmento T de transferencia del plásmido Ti) consiste en aprovechar la propiedad del sistema basado en Agrobacterium tumefaciens, para la transformación genética de plantas. El segmento T se inserta teóricamente al azar en cualquier sitio de la eucromatina de las plantas, permitiendo así generar colecciones de mutantes de inserción con las características ya mencionadas anteriormente para los transposones; pero con mayor estabilidad que éstos y menor preferencia por el sitio de inserción. Sin embargo, como las frecuencias de mutación son extremadamente bajas, sólo se utilizan actualmente en combinación con transposones. Es decir que se incluye un transposón activo dentro del segmento T para inducir mutagénesis por transposición en la especie transformada. Una de sus desventajas, es que su uso estará limitado a aquellas especies que son transformadas por agrobacterias. Lecturas Recomendadas m+)YH#M,\,#f),#]^^Q,#i5!#+"5!)+%*"6!#&I#.!"!-#+"#'+%&65&"/)+*#*"/#650&)&70*-%-J#O*j-;#'!65*"+-'-;# *"/#'&/!0-,#C""#A!K#W!"!%;#Vn;#Q]n`QUo, Bouchez, D. and H. Höfte. 1998. Functional Genom+6-#+"#>0*"%-,#>0*"%#>5H-+&0;#QQo;#S]npSV] F*%%*#@,g,#]^^n,#A&0!#&I#60*--+6*0##'2%*%+&"#:)!!/ing in crop improvement. Daya Publishing House, India. 314 p. Dong C,J Dalton-Morgan, K Vincent, P Sharp A [&/+$!/# idOOdBW# [!%5&/# I&)# \5!*%# m)!!/+".# Plant Gen. March 2009 2:39-47 F)*7!)#m,\,;#[6M*002'#M,[,;#@%&2%#f,O,;#@0*/!#C,f,;# Moens C.B. 2004. A high-throughput method for +/!"%+IH+".# B`!%5H0`B`"+%)&-&2)!*# P9BhE`+"/26!/# 7&+"%# '2%*%+&"-# +"# L!:)*$-5,# [!%5&/-# M!00# m+&0;# 77, 91-112. W)*"%`F&j"%&"#A,i,#*"/#F+6Y+"-&"#a,W,#]^^n,#97+genetics and its implications for plant biology. 1. i5!#!7+.!"!%+6#"!%j&)Y#+"#70*"%-,#C""*0-#&I#m&%*ny, 96, 1143-1164. IAEA. 1995. Manual on mutation breeding Second 9/+%+&",# i!65"+6*0# A!7&)%-# @!)+!-# B&# QQR,# f&+"%# FAO/IAEA Division of Atomic Energy in Food and Agriculture, Vienna 1995. 288 p.

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228 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

II. Capitulo 5

*'70+$6*6+8"# H# '!%+0*6+8"# /!0#CFB# H# 6*':+&-# !"#!0#CFB#/!#0*-#&).*"!0*-,#>&)#!00&;#*2"32!# los caracteres morfológicos (como por ejemplo Variación somaclonal !0# 5F-#7!)'+-

tieron comprobar la susceptibilidad diferencial del genotipo al pasaje por cultivo in vitro, además de reunir información para encarar nuevos cruzamientos en programas brasileros de mejoramiento de esta especie. Existen numerosos ejemplos que indican que la variación molecular no siempre se expresa a nivel fenotípico y viceversa. Por ejemplo en el género Musa;#0*#%46"+6*#/!#AC>F-#)!K!08#7&0+'&)$-'&-#!"#70*"%*-#'+6)&7)&7*.*/*-#/!#I!notipo normal. Del mismo modo, plantas regeneradas de palmera datilera que presentaban I!"&%+7&-#1&)*0!-#*"&)'*0!-;#%2K+!)&"#7*%)&"!-# moleculares normales. Otros marcadores útiles son los AFLP (po0+'&)$-'&# !"# 0*# 0&".+%2/# /!# I)*.'!"%&-# *'70+$6*/&-# /!# CFBE;# 32!# 7!)'+%+!)&"# /!%!6%*)# la existencia de diferencias moleculares entre plantas de banana con fenotipos normales y aberrantes. Los microsatélites o SSRs, iniciales de su nombre en inglés “simple sequence repeats”, son altamente informativos, ya que son abundantes y están dispersos a través del genoma. Estos marcadores se utilizaron para el análisis de plántulas de álamo, obtenidas por micropropagación, donde se observaron '+6)&-*%40+%!-#7&0+'8)$6&-;#!"#70*"%*-#I!"&%=7+camente normales. A veces, para detectar una variante obtenida in vitro es necesario realizar pruebas especí$6*-,# >&)# !(!'70&;# 62*"/&# -!# !K*02*)&"# -&maclones de Cynodon dactylon en laboratorio, invernáculo y a campo, para resistencia a la &)2.*# '+0+%*),# h"# -&'*608";# !0# m)*L&-`AV;# %!nía un rendimiento equivalente al del cultivar madre, pero además era resistente a dicho insecto. Esto se debe a que produce niveles más bajos de un estimulante para la alimentación del insecto. Es decir que mantenía los caracteres agronómicos positivos del cultivar parental, pero tenía un cambio en la producción de un metabolito secundario que confería resistencia a la oruga. 5 La variación somaclonal y su aplicación en el mejoramiento genético La base del mejoramiento genético es la optimización de las interacciones génicas. Para lograr combinaciones génicas óptimas o superiores se requiere de diversidad genética. Esta

234 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

diversidad, que se encuentra normalmente en las poblaciones de individuos, puede provenir de cruzamientos sexuales, mutaciones induci/*-#PI=-+6*-# ='+6*-#)&/26+/*-#7&)#CFB` T, por elementos transponibles o retrotrasposones), hibridación somática y transformación genética. La variación somaclonal proporcionaría una fuente adicional de variabilidad genética, potencialmente útil en programas convencionales de mejoramiento. Algunas de las ventajas que presenta la variación somaclonal pueden resumirse de la siguiente manera: ?# Es una técnica poco costosa: requiere de un laboratorio de rutina y facilidades de campo. ?# Constituye una forma rápida de generar variabilidad genética, particularmente para cultivos con base genética estrecha y que son difíciles de mejorar a través de técnicas tradicionales. ?# Es exitosa para eliminar uno o pocos defectos en cultivares bien adaptados. ?# Puede utilizarse para mejorar especies de propagación sexual y vegetativa. ?# wO*-#%*-*-#/!#'2%*6+8"#-&"#)!0*%+K*'!"%!# elevadas si se comparan con las tasas de mutaciones espontáneas. La variación somaclonal ocurre con una frecuencia de 1 mutación cada 100 plantas regeneradas, en contraste con la tasa esperada de mutación espontánea de 10-7 p#Q^-9 mutaciones por par de nucleótidos por generación. ?# El conocimiento de las condiciones que generan inestabilidad genética durante el cultivo in vitro, permitiría utilizar el fenómeno como estrategia de mejoramiento y permitiría eludirlo en aquellos casos en que se requiera estabilidad genética. ?# El nivel de cambios no deseados es menor que cuando se utilizan mutágenos químicos o físicos, ya que, en el caso de la variación somaclonal, la mayoría de los cambios deletéreos producidos son !0+'+"*/&-#7&)#!0#$0%) !#)!7)!-!"%*#0*# regeneración de plantas.

En algunos casos, las variantes somaclonales no han avanzado de la etapa de laboratorio o invernáculo, probablemente debido a que el material seleccionado tiene poca importancia práctica. ?# La baja tasa de regeneración de plantas en cultivos de largo término. Generalmente en estos casos existe pérdida de la capacidad morfogénica. ?# La regeneración está limitada a genoti7&-# !-7!6=$6&-# 32!# 72!/!"# "&# -!)# /!# mucho interés para los mejoradores. ?# Algunos somaclones son inestables (variación epigenética). ?# Algunos presentan alteraciones no deseables como aneuploidía, esterilidad, etc. Desde el punto de vista productivo y comercial, una variante somaclonal debería 62'70+)#0&-#-+.2+!"%!-#)!32+-+%&-Jw ?# Involucrar caracteres agronómicamente útiles. ?# El nivel de expresión del carácter debe superar al de sus progenitores. ?# El carácter mejorado debe estar combinado con todos los otros caracteres agronómicos de la variedad que son importantes para el cultivo. ?# La variación debe ser heredable y estable (sin reversión) en la progenie. En general, los mejoradores buscan en los somaclones caracteres de importancia práctica. El recurso es utilizar cultiva)!-# *0%*'!"%!# */*7%*/&-# 7*)*# '&/+$6*)# unos pocos caracteres, ya que resulta más sencillo mejorar selectivamente una variedad de uso corriente que crear una nueva. 5.1 Estrategias para la selección de variantes útiles Las estrategias que se han utilizado para obtener variación somaclonal comprenden: a) Obtención de plantas por cultivo de células o tejidos, que luego son analizadas para el carácter deseado.

Entre las desventajas cabe mencionar:

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 235

La Figura 1 resume los pasos a seguir para la obtención de un cultivar por variación soma60&"*0,#>*)*#!-%!#$"#-!#620%+K*#0*#'!(&)#K*)+!/*/# disponible y se seleccionan, entre las plantas

regeneradas, aquellas que expresen el carác%!)# /!# +"%!)4-,# 9-%*-# 70*"%*-# P.!"!)*6+8"# A^E# se emplean para generar progenies sexuales (en el caso de plantas con este tipo de repro-

Figura 1. Estrategia para la producción comercial de variantes somaclonales (izauierda) y gametoclonales (derecha), en arroz.

236 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

ducción), sobre las cuales se vuelve a realizar la selección para el carácter agronómico buscado, tratando de mantener a la vez todas las características favorables de la variedad. En plantas autógamas, como trigo, arroz y cebada, se considera aceptable la evaluación de la es%*:+0+/*/#/!0#6*),MeOc9Ab# i,# mAe\B,# QRRU,# A!.+-%)*%+&"# &I# m)*L&-`AV# :!)'2/*.)*--# .!)'plasm. Crop Science. 34: 542. FC#@dOlC#M,b#M,#[CBWeOdBb#C,#[eiib#[,#[CMaCDO.# ]^^o,# W!"!%+6# /+K!)-+%H# *--&6+*%!/# j+%5# +"# vitro and conventional bud propagation of Saccharum# K*)+!%+!-# 2-+".# # AC>F@# *"*0H-+-,# >0*"%## Breeding. Vol 127 (2): 160-165. 9C@i[CB#>,b#\9m@i9A;#k,b#>di9O;#f,b#Aem9Ai@;# D. 1991.Evaluation of somaclonal variation during somatic embryogenesis of interior spruce (Picea glauca engelmannii complex) using culture '&)75&0&.H#*"/#+-&LH'!#*"*0H-+-,#>0*"%#M!00#A!ports 10: 425-430. 9lCB@#F,b#@aCA>;#\,#QRoV,#@+".0!#.!"!#'2%*%+&"-# in tomato plants regenerated from tissue culture. Science.221: 949-951. kACBqeB9# >b# @hCA9q# cb# @eOCAd# Ab# kClA9i# Cb# Axe@# Ab# FxCq# >CO9e# C,# QRRT,# @&'*60&"*0# variation in three Argentinean varieties of Triticum aestivum#j+%5#/+II!)!"%#Y*)H&%H7+6#+"-%*:+0+%H,#>0*"%# Breed. 115: 89-93. WCOO9We# k,b# [CAixB9q;# d,b# M9O9@idBe;# M,;# ieAdmde;#[,#QRRS,#i!-%+".#-&'*60&"*0#K*)+*%+&"# 2-+".# AC>F-# +"# Quercus suber L. somatic embryos. Int. J. Plant Sci. 158(5): 563-567. GAUTO ACOSTA M. 2008. Evaluación a campo de somaclones de Lolium perenne y sus progenies

240 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

/!#'!/+&-#5!)'*"&-,#i)*:*(&#/!#+"%!"-+$6*6+8"# para optar al grado de Ingeniero Agrónomo. Facultad de Agronomía. (UBA). 73 pp. W9d9A# i,# QRRQ,# M5)&'&-&'!# K*)+*:+0+%H# +"# 6*002-# produced plants. In Genetics and Breeding of Ornamental Species. 79-106. Harding & Mol. eds. gC9>>O9A#@,#[,b#>adOOd>@;#A,#O,#QRRV,##d"#l+%)&# Cell Dev.Biol. 29: 125-130. fCdB# @,# [+6)&7)&7*.*%+&"# &I# -!0!6%!/# -&'*60&"!-# of Begonia and Saintpaulia. 1997 J. Biosci. Vol. ]];#B2':!)#n#PnonpnR]E, gAdgeAdCB# C,# QRRQ,# 9-%*:+0+/*/# .!"&%=7+6*# !"# células,tejidos y plantas derivados del cultivo in vitro. En Cultivos de tejidos en la Agricultura. MdCi,#A&6*#\,#H#[)&.+"-YH#O,#9/-, OCAgdB# >,b# @Me\MAeki,# \,# QRoQ,# @&'*60&"*0# variation - a novel source of variability from cells cultures from plant improvement. Theor. Appl. Genet. 60, 197-214. OdBCM9Ae# A,b# kA9diC@# COl9@# 9,b# lC@sh9q# C,# ]^^^,# a&%-7&%-# &I# FBC# +"-%*:+0+%H# )!K!*0!/# through the study somaclonal variation in rye. Theor Appl Genet. 100: 506-511. [CFOhBW#C,b#Me[Cd;#0,#]^^U,#i5!#!II!6%#&I#-%)!--# on genome regulation and structure. Annals of Botany. 94:481-495. eO[e@# @,b# W,# OCldC;# [,# Fd# A9Bqe;# O,# [AeWdB@gdbl,# 9Ma9Bdsh9,# ]^^],# W!"!%+6# analysis of variation in micropropagated plants of Melia azedarach L. In Vitro Cellular & Developmental Biology Plant. 38: 617-622.

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Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 241

242 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

II. CAPÍTULO 6

minación de plantas transgénicas. Conviene destacar que la transformación de plantas es una tecnología que aporta variabilidad genétiAplicación de la transformación ca conocida sin alterar el fondo genético por lo genética al mejoramiento vegetal que puede ser considerada como una metodología conservativa de mejoramiento, similar, en Marina L. Díaz, Diego C. Zappacosta, ese sentido, a la mutagénesis inducida o a la >*-62*0#[,#k)*"L&"!#H#A*D0#F,#A=&-# retrocruza. Este último aspecto es de gran importancia ya que la creación de cultivares es un 1 Introducción proceso acumulativo, es decir, que se desea El mejoramiento genético vegetal se originó introducir características favorables sin perder hace aproximadamente 10.000 años, cuando las mejoras logradas anteriormente. El gerel hombre se hizo agricultor y comenzó la do- moplasma transgénico es posteriormente inmesticación de las plantas. En el siglo XX, con corporado al proceso de mejoramiento el cual la incorporación de los cruzamientos sexua- dependerá de la especie y del tipo de cultivar 0!-;#!0#6&"&6+'+!"%&#/!#0*#:+&0&.=*#1&)*0#/!#0*-# a obtener. especies, el desarrollo de la genética y de la En 1983 se informaron los primeros experiestadística experimental, entre otros avances, mentos de expresión de un transgen (gen inse conformaron los métodos de mejoramiento troducido por vía asexual) en células vegetales actualmente utilizados. El mejoramiento ge- y al año siguiente se obtuvieron las primeras nético convencional se basa en la existencia plantas transgénicas (tabaco y petunia). Desde de variabilidad genética para los caracteres entonces se ha extendido la aplicación de esta que se desea mejorar y la manipulación de la tecnología a más de 120 especies. Las plantas misma mediante la reproducción sexual. Esto transgénicas se obtienen por diversos métohace que el aprovechamiento de la variabilidad /&-;# 0&-# 32!# 5*"# -+/&# '&/+$6*/&-# 7*)*# 6*/*# este restringido por barreras de compatibilidad especie en particular, aumentándose de esta reproductiva. El reciente desarrollo de méto- I&)'*#0*#!$6+!"6+*#/!#0&-#'+-'&-, dos de transferencia de genes que no implican Entre sus aplicaciones de interés agropecuacruzamientos, como la transformación genéti- rio se encuentran la obtención de plantas con ca, permite superar esta limitación, abriendo resistencia a estreses bióticos (virus, insectos, nuevas perspectivas en el mejoramiento de las hongos y bacterias), a estreses abióticos (saplantas. linidad, sequía, etc.), tolerancia a herbicidas La transformación genética o transferencia 7*)*#I*6+0+%*)#!0#6&"%)&0#/!#'*0!L*-#H#'&/+$6*de genes, técnica también conocida como in- ción de la calidad nutricional de los cultivos engeniería genética, permite introducir en plantas tre otras. La transformación genética también genes provenientes no solo de otras especies constituye una herramienta útil para estudios vegetales muy alejadas desde el punto de vis- básicos que permiten conocer y/o profundizar ta evolutivo sino incluso de hongos, virus, bac- acerca de la estructura y función de genes esterias y animales. Asimismo, a través de esta 7!6=$6&-;# *-7!6%&# 7*)%+620*)'!"%!# )!0!K*"%!# %!6"&0&.=*#!-#7&-+:0!#'&/+$6*)#0*#!N7)!-+8"#/!# en la era genómica. genes presentes en el genoma de la planta. Si bien se suele denominar OGMs (organismos 2 Requerimientos para la obtención de .!"4%+6*'!"%!# '&/+$6*/&-E# *# 0*-# 70*"%*-# &:- plantas transgénicas tenidas mediante esta metodología, es oportuPara todas las técnicas de transformación no considerar que todas las plantas que han desarrolladas hasta el momento es necesario sido mejoradas por el hombre a partir de su disponer del transgen a introducir (éste con/&'!-%+6*6+8";#5*"#-+/&#'&/+$6*/*-#.!"4%+6*- -+-%!# !"# -!62!"6+*-# )!.20*%&)+*-# H# 6&/+$6*"%!# mente por lo cual son OGMs y consideramos clonadas en un vector de transformación) y de más apropiado utilizar para las plantas obteni- 2"*# '!%&/&0&.=*# !$6+!"%!# 7*)*# -2# %)*"-I!)!"das mediante transformación genética la deno- cia al genoma vegetal. Luego se induce el de-

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sarrollo de plantas mediante distintas técnicas de cultivo de tejidos y se procede al análisis molecular de las plantas regeneradas in vitro 7*)*#+/!"%+$6*)#*32!00*-#32!#7&)%!"#H#!N7)!-!"# el o los transgenes en los niveles deseados. Finalmente, mediante experimentos de campo y laboratorio se estudia el comportamiento de los individuos transgénicos y su descendencia. Por lo tanto, los elementos básicos que se requieren en trabajos de transformación genética en plantas son: 1. h"#-+-%!'*#!$6+!"%!#/!#620%+K&#/!#%!(+/&-# que permita regenerar plantas completas y fértiles. 2. Vectores apropiados, que permitan el clonado del gen de interés y su transferencia al tejido blanco de transformación. 3. Un protocolo de transformación, es decir, un sistema de transferencia de genes y de selección del material transformado. 4. Herramientas de análisis molecular para detectar la presencia del transgen y los productos del mismo en la planta. Antes de iniciar la descripción de los items anteriores, resulta importante destacar que para lograr una planta transgénica deben ocurrir tres procesos en una misma célula: a) El transgen debe ser transferido al interior de la célula, :E#90#%)*"-.!"#/!:!#+"%!.)*)-!#*0#CFB#6!02lar y c) Se debe regenerar una planta completa a partir de la célula transgénica en la que se K!)+$6*)&"#0&-#7)&6!-&-#*#H#:, Dado que las células tienen diferente competencia o capacidad de respuesta para cada uno de estos procesos, la puesta a punto de un pro%&6&0&#!$6+!"%!#/!#%)*"-I&)'*6+8"#.!"4%+6*#)!quiere maximizar la cantidad de células competentes para todos ellos de manera simultánea. 2.1 Cultivo de tejidos vegetales Los métodos de transformación más utilizados actualmente se basan en la obtención de células transgénicas y posterior recuperación de plantas completas y fértiles a partir de las mismas a través del cultivo y selección in vitro. Esto es posible gracias a la propiedad de

totipotencia expresada por las células vegetales. En la mayoría de las especies se observa 2"*# +'7&)%*"%!# +"12!"6+*# /!0# .!"&%+7&# !"# 0*# respuesta al cultivo in vitro, razón por la cual es frecuente que se utilizen genotipos modelo P/!# *0%*# )!-72!-%*E# 6&"# $"!-# !N7!)+'!"%*0!-# los cuales no necesariamente presentan interés agronómico. Por ello, cuando se usa esta %!6"&0&.=*#6&"#$"!-#/!#'!(&)*'+!"%&#.!"4%+6&# es muy importante conocer la respuesta morfogenética de distintos genotipos con adaptación local, de modo de poder transformar directamente genotipos con valor agronómico. Por otra parte, en el cultivo in vitro, un prolongado período de subcultivos puede inducir la aparición de variación somaclonal no deseable ya 32!# !-# 6&"K!"+!"%!# +"%)&/26+)# -&0&# 0*-# '&/+$caciones que se desean y en forma controlada. 2.2 Construcción del vector Para introducir un transgen es necesario que el mismo sea incorporado previamente en un vector (por ejemplo un plásmido). Para ello, '!/+*"%!#0*#%!6"&0&.=*#/!0#CFB#)!6&':+"*"%!;## -!# /+.+!)!# !0# CFB# !N%)*=/&# /!# 2"# &).*"+-'&;# cualquiera sea su origen, con enzimas de restricción. Estas endonucleasas tienen la capa6+/*/#/!#)!6&"&6!)#!"#!0#CFB#-!62!"6+*-#!-7!6=$6*-# 6&'72!-%*-# 7&)# 7&6&-# "260!8%+/&-# H# posteriormente producir cortes en las mismas. Los fragmentos de restricción así obtenidos pueden ser ligados enzimáticamente a vectores de clonado, obteniéndose, de este modo, 60&"!-# /!#CFB# )!6&':+"*"%!# PK!)# 7*)%!# dE,#C0ternativamente, se puede utilizar una tecnología de clonado basada en el mecanismo de )!6&':+"*6+8"#-+%+&`!-7!6=$6*#/!0#I*.�*':/*# 6&"&6+/*#6&'&#-+-%!'*#WCi9\Cc#Pd"K+%)&.!"E, Un transgen está compuesto por una secuen6+*#6&/+$6*"%!#P)!.+8"#%)*/26+:0!#6&'7)!"/+/*# entre los codones de iniciación y terminación de la traducción) y por secuencias regulatorias que determinan tanto el momento del desarrollo de la planta como el tejido y el nivel en el que se expresará. Muchas veces los genes utilizados provienen de bacterias (procariotas) H#2-2*0'!"%!#"H!/!"#!N7)!-*)-!#!$6+!"%!mente en células eucariotas. Por lo tanto, resulta necesario reemplazar las secuencias regulatorias bacterianas por otras aptas para su

244 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

expresión en células vegetales. En este contexto, la secuencia más importante es la co))!-7&"/+!"%!#*0#7)&'&%&);#-+%+&#/!0#CFB#*0#62*0# -!#2"!#0*#!"L+'*#CAB`7&0+'!)*-*#7*)*#+"+6+*)# el proceso de transcripción (Fig. 1). En la elección del promotor a utilizar en la construcción del transgen, hay que considerar la especie vegetal a transformar, ya que su nivel y patrón de expresión pueden variar al ser utilizados en especies distintas a la de origen del mismo. Dentro de los promotores se distinguen aquellos constitutivos, que permiten la expresión del gen en toda la planta en forma continua, los inducibles, que responden a factores ambien%*0!-#H#$"*0'!"%!#0&- !-7!6=$6&-#/!#%!(+/ !# permiten la transcripción en órganos y tejidos particulares (Tabla 1). Los promotores pueden -!)# '&/+$6*/&-# 6&"# !0# $"# /!# *2'!"%*)# 0*# !Npresión de los genes que regulan. Así, pueden truncarse, adicionárseles un intrón o unírseles secuencias de otros promotores. Además, es necesario que el transgen disponga de una re-

gión no traducida en el extremo 3’ del mismo, que incluya la señal de corte y poliadenilación (terminador), necesaria para el correcto procesamiento del transcripto correspondiente. Por otra parte, el nivel y patrón de expresión del gen también puede estar afectado por la posición del mismo en el genoma de la planta, fenómeno conocido como “efecto de posición”. Esto puede deberse a la presencia de otras secuencias regulatorias cercanas como inten-+$6*/&)!-#H##-+0!"6+*/&)!-;#*#0*#!-%)26%2)*#/!# la cromatina, al patrón de metilación, etc. Este aspecto es particularmente relevante considerando que con los métodos de transformación genética nuclear utilizados actualmente, las inserciones de los transgenes en el genoma de la planta son al azar, Así, la cantidad de proteína producida por un transgen comúnmente varía más de 100 veces entre individuos transformantes obtenidos en el mismo experimento. La solución para evitar los “efectos de posición” es /+)+.+)#0*#-!62!"6+*#/!#+"%!)4-#*#-+%+&-#!-7!6=$-

Figura 1: Estructura molecular del transgen

Tabla 1: Promotores usados en la transformación genética de plantasv

Constitutivos

Promotores Específicos de tejido

Inducibles

nos (nopalina sintetasa de Agrobacterium) 35 S (virus del mosaico del coliflor) Ubi (ubiquitina de maíz) Act 1 (actina de arroz) TA 29 (tapete de la antera de tabaco) faseolina (cotiledones de poroto) TobRB 7 (raíz de tabaco) patatina (tubérculo de papa) glutenina (endosperma de trigo) subunidad pequeña de Rubisco (luz) alcohol deshidrogenasa-1 (anaerobiosis) proteína de shock térmico (calor)

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 245

K!.!%*0!-,#90#i`CFB#6&"%+!"!#.!"!-;#00*'*/&-# &"6&.!"!-;# 32!# -!# !N7)!-*"# !$6+!"%!'!"%!# en la célula vegetal infectada y producen síntesis de hormonas vegetales, responsables de la proliferación anormal del tejido. Además, contiene los genes responsables de la síntesis de opinas (fuente de carbono y nitrógeno para la 2.3 Métodos de transformación La pared celular constituye un obstáculo bacteria). El sistema mediado por A. tumefaciens es el 7*)*#0*#!"%)*/*#/!0#CFB#*#0*#64020*#32!#%&/&-# los métodos de transformación genética tienen más estudiado y utilizado en la transformación que superar de algún modo. Estos métodos /!# 70*"%*-,# 90#i`CFB# !-%&-%!)+&)'!"%!#-!#%)*"-$!)!"#0&-#!N70*"%!-# a un medio de cultivo que contiene un antibiótico que actúa como bacteriostático para detener el desarrollo de Agrobacterium y el agente selectivo correspondiente al gen marcador seleccionable utilizado. Una vez completado el protocolo de cultivo y selección in vitro se recuperan las plantas transgénicas (Fig. 3). El análisis por hibridación molecular de plantas transgénicas y su progenie ha demostrado que !0#i`CFB#-!#+"6&)7&)*#*0#CFB#6)&'&-8'+6&#H# se hereda en forma estable. Los plásmidos Ti sin oncogenes se denominan ‘desarmados’, son de gran tamaño y resul%*#/+I=6+0#+"%)&/26+)#.!"!-#!"#-2#i`CFB#2-*"/&# %46"+6*-#5*:+%2*0!-#/!#CFB#)!6&':+"*"%!,#>&)# esta razón se han desarrollado dos sistemas de vectores para introducir genes en Agrobacterium: los vectores cointegrados, y los bina-

rios. En los vectores cointegrados la inserción /!0#CFB#32!#6&"%+!"!#0&-#%)*"-.!"!-#/!"%)&#/!0# i`CFB#/!#2"#70MA# P%)*"-6)+76+8"# )!K!)-*# -!.2+/*# /!# >MAE# 6&'&# 0*# 5+/)+/*6+8"# /!#CAB# &# XB&)%5!)"# :0&%ting” pueden resultar valiosas herramientas para detectar los transcriptos de interés pre-!"%!-# !"# 0*# '2!-%)*,# O*# Ai`>MA# 7)!-!"%*# *0.2"*-# K!"%*(*-# I)!"%!# *0# B&)%5!)"# :0&%%+".J# se requiere poca cantidad de material, posee una alta sensibilidad y la muestra es de fácil preparación. Por otra parte, la hibridación del CAB# 2%+0+L*# 6&'&# -&"/*# !0# %)*"-.!";# &I)!6!# información sobre el tamaño del transcripto y 7!)'+%!# -2# 62*"%+$6*6+8",# M*:!# /!-%*6*)# 32!# 0*# Ai`>MA# 72!/!# %*':+4"# -!)# 2%+0+L*/*# 6&'&# %46"+6*#/!#62*"%+$6*6+8"#/!#%)*"-6)+7%&-, - ELISA y “Western blotting”: aquellas plantas que poseen la secuencia de interés y la expresan como transcripto, pueden ser ana0+L*/*-#6&"#!-%*-#%46"+6*-#+"'2"&08.+6*-#*#$"# de determinar la presencia de la proteína codi$6*/*#7&)#!0#%)*"-.!", O*#*6%+K+/*/#/!#0*#7)&%!="*#6&/+$6*/*#7&)#!0# transgen debe ser medida, ya sea por ensayos :+&32='+6&-# &# 7&)# :+&!"-*H&-;# *# $"# /!# +"%!)pretar correctamente el fenotipo de la planta &:%!"+/*,# C/!',# ]^^],# XC# M&'7*)+-&"# :!%j!!"# M)&7# F&mestication, Classical Plant Breeding, and Ge"!%+6#9".+"!!)+".Z,#M)&7#@6+,#U]JQSo^pQSR^, Halpin C. 2005. “Gene stacking in transgenic plants p#%5!#65*00!".!#I&)#]Qst century plant biotechnology”. Plant Biotechnology Journal, 3:141-155. a*"+"# [,;# >*-LY&j-Y+# f,;# ]^^V,# X>0*"%# .!"&'!# '&/+$6*%+&"#:H#5&'&0&.&2-#)!6&':+"*%+&"Z,#M2)rent Opinion in Plant Biology 6: 157-162. a&)-65#A,;#k)*0!H#A,;#A&.!)-#@,;#@*"/!)-#>,;#O0&H/# C,;# a&II'*"# B,# QRoU,# Xd"5!)+%*"6!# &I# I2"6%+&"*0# foreign genes in plants”. Science 223: 496-498. g0!+"#i,;#\&0I#9,;#\2#A,;#@*"I&)/#f,#QRoS,#Xa+.5#K!locity microprojectiles for delivering nucleic acids +"%�+K+".#6!00-Z,#B*%2)!#V]SJ#S^`SV, O!!#O,#H#W!0K+"#@,#]^^o,#Xi`FBC#m+"*)H#l!6%&)-#*"/# Systems”. Plant Physiology Vol. 146: 325-332. Maliga P. 2004. “Plastid transformation in higher 70*"%-Z,#C""2,#A!K,#>0*"%#m+&0,##nnJ]oRpVQV,# Puchta H. 2003. “Marker-free transgenic plants”. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 74: 123-134. A!.+-%!)# f# PQRRSE# XC77)&*65!-# %&# !K*02*%+".# %5!# transgenic status of transformed plants”. TiBTech, 15:141-6. @'*00#d,;#]^^S,#XABC+#I&)#)!K!*0+".#*"/#!".+"!!)+".# plant gene functions”. Current Opinion in Biotechnology 18:148-153.

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 257

258 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

II. CAPÍTULO 7

cial) puede también mostrar cambios visibles o medibles, los cuales permiten evidenciar la actividad del gen. Por ejemplo si uno reduce la Usos del silenciamiento génico expresión de un gen involucrado en la síntesis para el análisis funcional de de pigmentos, dicha planta puede presentar una disminución en la coloración de sus hojas. genes candidatos. Esta disminución dependerá del grado de reducción en la expresión del gen, pudiendo preM!6+0+*#l*L32!L#A&K!)!;#C)+!0#m*LL+"+;# sentar desde pequeñas manchas amarillentas M!6+0+*#A&/)=.2!L;#B*%*0+*#C0'*-+*#H# o hasta la falta total de coloración foliar (Figura Sebastián Asurmendi 1). Este capítulo considerará únicamente esta segunda estrategia de reducción de la expreEl progreso de las disciplinas genómicas ha sión génica mediada por el mecanismo denogenerado una rápida acumulación de informa- minado silenciamiento génico. Los métodos ción biológica relacionada a la estructura de basados en el silenciamiento génico presentan los genomas, su organización, su composición varias ventajas respecto a otros empleados en número de genes, su grado de homología en el campo de la genómica funcional. Una y sus relaciones evolutivas. Esta información de ellas es la posibilidad de silenciar varios o puede ser aprovechada para el análisis funcio- todos los miembros de una familia multigénica nal de genes promoviendo un gran avance en simultáneamente. Esto es altamente relevante /+I!)!"%!-# *-7!6%&-# 6&'&# !0# $%&-*"+%*)+&# &# !0# cuando se realizan estudios de genómica en de respuestas a estreses ambientales, entre organismos poliploides, como por ejemplo en otros. Para el estudio de la funcionalidad de el caso del trigo en el cual existe una gran regenes candidatos existen diversas estrategias. dundancia genética (Travella y col., 2006). Otra La más antigua (no por eso menos efectiva o de las ventajas es que permite obtener distinutilizada) consiste básicamente en sobre-ex- tos grados de silenciamiento del gen (débil, inpresar un gen, es decir aumentar la expresión termedio y fuerte) siendo útil para el análisis de del gen de interés a niveles tan altos que su fenotipos asociados a genes cuya disminución función o actividad puede aumentar y así ser total resultaría letal. Finalmente, también se medible u observable mediante técnicas mo- puede mencionar la capacidad de generar un leculares o simplemente fenotípicamente. Por -+0!"6+*'+!"%&#!$6+!"%!#*#7*)%+)#/!#-!62!"6+*-# ejemplo, la sobreexpresión de genes del me- de pequeño tamaño permitiendo el estudio de tabolismo puede producir un aumento impor- genes cuya secuencia completa se desconoce tante en el crecimiento de una planta. La se- (Lu y col., 2003). Actualmente existen diversas metodologías gunda estrategia es antagónica a la primera y consiste es disminuir los niveles de expresión basadas en el silenciamiento génico. Algunas del gen en estudio. Esta reducción (total o par- de las mismas requieren de la generación de

Figura 1. Foto mostrando el blanqueo del tejido de plantas en las cuales se silenció el gen PDS en las especies Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum respectivamente de izquierda a derecha

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 259

plantas transgénicas portadoras de una construcción capaz de silenciar al gen candidato, mientras que en otras el silenciamiento se desencadena a partir de la replicación de un virus que porta en su genoma un fragmento del gen a silenciar. Dependiendo del problema especí$6&# *# )!-&0K!)# -!# /!:!)iW@# !-# /!-!"6*/!"*/&#!$6+!"%!'!"%!#7&)#+"%!)'!/+*)+&-#/!# /-ABC#32!#72!/!"#%!"!)#-2#&)+.!"#!"J#%)*"-genes nucleares cuyos transcriptos forman naturalmente estructuras tipo horquilla o “hairpin” P57ABC+E;#.!"!-#32!#-!#!N7)!-*"#!"#*0%&-#"+veles, transcriptos aberrantes que pueden ser )!6&"&6+/*-# 6&'&# /-ABC# &# !-%)26%2)*-# /!# /-ABC#32!#-!#.!"!)!"#/2)*"%!#0*#)!70+6*6+8"# de un virus. Cualquiera sea su origen, una vez I&)'*/*-# 0*-# !-%)26%2)*-# /!# /-ABC;# 0*-# '+-mas son reconocidas por una enzima AB*-*# FMO# H# 7)&6!-*/*-# /*"/&# 02.*)# *#-+ABC-#/!#]Q#*#]n#7:,#9-%&-#-+ABC-# -!# *-&6+*"# *0# 6&'70!(&# Ad@M;# !0# 62*0# !-# 6*7*L# /!# /!.)*/*)# !-7!6=$6*'!"%!# %&/&# *32!0# ABC# 32!# 6&'7*)%*# 5&'&0&gía con la secuencia que desencadenó el proceso y también pueden ser utilizados como templado por las polimerasas 6!020*)!-#/!7!"/+!"%!-#/!#ABC#PA/A7-E# para sintetizar la segunda hebra del gen *#-+0!"6+*)#*'70+$6*"/&#/!#!-%*#I&)'*#0*# señal de silenciamiento (Figura 2).

Figura 2. Esquema del silenciamiento génico inducido por virus, por sobre expresión de transgén o expresión de secuencias duplicadas invertidas. Se detalla como el ABC#!-#7)&6!-*/&#!"#-+ABC#/!#]Q`]n#7:#Pk+.2)*#*/*7tada de Voinnet 2001)

262 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

@ABA@- 4,8(%#$'$%C&- 7- ,!>%,%2&.!- 92(PTGS Una de las características del mecanismo de silenciamiento en plantas es la capacidad de ser sistémico, es decir de poder propagar a toda la planta la reducción del gen el cual resultara inicialmente disminuido en un único tejido. Por ello se ha propuesto la existencia de una señal de silenciamiento capaz de moverse a través del organismo propagando el mismo. Estas vías de movi'+!"%&# /!# 0*# -!G*0# -!# 60*-+$6*"# -!.D"# la distancia que alcancen. Así, en la vía de movimiento de corta distancia los -+ABC-# .!"!)*/&-# !"# 2"*# 64020*# -&"# capaces de migrar directamente a células adyacentes a través de los plasmo-

desmos (conexiones directas entre células) y establecer en estas últimas el silenciamiento. Una vez que en la célula adyacente es degra/*/&#!0#'ABC#5&'80&.&#*0#-+ABC;#-!#.!"!)*"# "2!K&-#-+ABC-;#*'70+$6*"/&#*-=#0*#-!G*0#32!# se trasladará por toda la planta. Se ha reporta/&#*-+'+-' !#!-%*#*'70+$6*6+8"#-!#.!"!)*# *# 7*)%+)# /!# 0*# -="%!-+-# /!# /-ABC# '!/+*/*# 7&)# 2"*#ABC#7&0+'!)*-*#ABC#/!7!"/+!"%!##A/A7# (Baulcombe, 2004). En la vía de movimiento de larga distancia la señal se traslada a través /!0#1&!'*#7!)'+%+!"/&#!0#'&K+'+!"%&#*#7*)%!-# muy distantes del lugar de origen. Esto fue demostrado mediante experimentos que emplean injertos en los que plantas silenciadas para un dado transgen son capaces de producir el silenciamiento de ese transgen en plantas no silenciadas. Si bien aún no se conoce cuál es la señal de silenciamiento de larga distancia, es muy probable que sea distinta de la señal que migra de célula en célula debido a que los dos procesos pueden ser separados farmacológica o genéticamente (Dunoyer y Voinnet 2008). La dispersión del silenciamiento tiene una gran importancia principalmente en la defensa frente a virus, ya que a partir del sitio inicial de infección, donde se indujo el silenciamiento, se produce una señal que genera la defensa antiviral en los tejidos adyacentes que de resultar previa a la llegada del virus limitará la propagación del mismo al resto de la planta. 1.3 Regulación génica por microRNAs Como hemos mencionado, el silenciamiento es un mecanismo natural por el cual se regula la expresión de genes. En particular, los '+6)&ABC-# P'+ABC-E# -&"# 2"# %+7&# !-7!6=$6&# /!# '&04620*-# /!# ABC# de bajo peso molecular (21 pb) que 6&"%)&0*"#0*#*62'20*6+8"#/!#'ABC# !"/8.!"&-# *0# )!.20*)# $"*'!"%!# 0*# expresión de diferentes genes. A diI!)!"6+*#/!#0&-#-+ABC-#0&-#'+ABC-#

-&"# 6&/+$6*/&-# 7&)# .!"!-# !"/8.!"&-;# 7&)# 0&# %*"%&# /+$!)!"# !"# -2# :+&.4"!-+-,# O&-# '+ABC-# son genes endógenos completos, con la úni6*#7*)%+620*)+/*/#/!#32!#"&/+$6*"#7*)*#"+".2"*#7)&%!="*;#-+" !#-2#ABC#'!"-*(!)&#!-# procesado generando una pequeña molécula /!#]Q#7:#*7)&N+'*/*'!"%!,#O&-#'+ABC-#5*"# sido descriptos sólo en organismos eucariontes, desde plantas a humanos (Bartel 2004). A!-2'+/*'!"%!;# 0&-# '+ABC-# -!# &)+.+"*"# *# partir de transcriptos que se pliegan sobre sí mismos dando lugar a una estructura pre62)-&)*# /!# ABC# /&:0!# 6*/!"*# P/!"&'+"*/*-# 7)!`'+ABC-E;# 0*-# 62*0!-# -&"# 7)&6!-*/&-# /!# manera que se produce una única cadena de '+ABC# /!# 7!32!G&# %*'*G&# P]Q`]]# "%E# '+!"tras que la cadena complementaria, denomina/*#'+ABC~;#!-#/!.)*/*/*,#9"#0*#k+.2)*#VC#-!# muestran ejemplos de estructuras secundarias

Estructura del Construcción genética transcripto de RNA

% PTGS

n

7

27

4

25

58

43

65

34

96

23

Gen candidato en sentido

Gen candidato en antisentid o

hpRNA (brazos de gen candidato, gen GUS como secuencia espaciadora)

hpRNA (brazos de gen candidato, intrón en antisentido como secuencia espaciadora)

hpRNA (brazos de gen candidato, intrón en sentido como secuencia espaciadora)

Figura 3. A) Se representan las típicas estructuras de rulo &#-%!'`0&&7#/!#0&-#'+ABC-,#'+AQTU#/!#C)*:+/&7-+-#H#-2-# homólogos de Oryza y Populus. El segmento correspondien%!#*0#'+ABC#'*/2)&#-!#'2!-%)*#!"#6&0&)#)&(&#P*/*7%*/&#/!# f&"!-`A5&*/!-#H#6&0,#]^^TE,#B)#9-32!'*#/!0#7)!`'+AQTU*# /!#C)*:+/&7-+-# H# !0# 7)!`'+A`Wk># -+"%4%+6&,# 9"# )&(&# -!# !"62!"%)*#!0#'+AQTU#'*/2)&#H#!"#K!)/!#0*#7&)6+8"#)!!'70*L*/*#7*)*#.!"!)*)#!0#'+A#*)%+$6+*0#'+A`Wk>#'*/2)&,#@!#'2!-tra la energía libre (#G) y la entalpía (#U) del ensamblado.

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 263

/!#0&-#'+ABC-,#h"*#K!L#32!#!0#%)*"-6)+7%&#/!0# '+ABC# !-# 7)&6!-*/&# H# !0# '+ABC# '*/2)&# )!-20%*"%!# !-# +"6&)7&)*/&# *0# 6&'70!(&# Ad@M;# !0# 62*0#*0#/+)+.+)-!#6&"%)*#!0#'ABC#:0*"6&#)!7)+'!# su expresión génica ya sea mediante degra/*6+8"#!-7!6=$6*#&#+"5+:+6+8"#/!#0*#%)*/266+8",# En las plantas el proceso de degradación es el más común, mientras que en el reino animal la inhibición de la traducción es el proceso más frecuente. (Hutvagner y Zamore, 2002; Doench y col. 2003; Zeng y col. 2003). Estas pequeñas moléculas son extraordinariamente importantes en la regulación o modulación de los pro6!-&-#6!020*)!-;#2"#-&0&#'+ABC#72!/!#)!.20*)# la expresión muchos genes por lo tanto incidir en la regulación de múltiples procesos ya que muchos de los genes blancos son factores de trascripción, porejemplo la alteración de la ex7)!-+8"#/!#2"#D"+6&#'+ABC#!"#70*"%*-#72!/!# cambiar totalmente el fenotipo de la misma.

basados en el mecanismo de silenciamiento génico. Entre los mismos se encuentra el uso de moléculas antisentido, de moléculas con !-%)26%2)*# /!# 5&)32+00*# P57ABC+E;# /!# '+ABC@# *)%+$6+*0'!"%!# /+-!G*/&-# H# !0# -+0!"6+*'+!"%&# génico inducido por virus (ver Tabla 2). A continuación se exponen algunos de los métodos más usados en la actualidad para lograr establecer el silenciamiento génico. Cada uno de estos métodos presenta ventajas y desventajas que determinan que sean más o menos aptos para el estudio particular del gen asilenciar y en la especie que se desea emplear, con lo que resulta de suma importancia evaluarlas antes de elegir la metodología. Estas metodologías pueden a su vez agruparse en dos categorías principales de acuerdo a que involucren la producción de plantas transgénicas o no. Siendo ésta una metodología un tanto lenta y laboriosa.

2. Métodos que emplean el mecanismo de silenciamiento para disminuir la expresión génica en plantas Varios métodos han sido desarrollados para disminuir la expresión de un gen en estudio

2.1 Metodologías para el análisis de genes candidatos que implican transgénesis. La transformación estable con construcciones capaces de inducir el silenciamiento de un gen candidato es quizá la aproximación más

Tabla 2: Métodos basados en el mecanismo de silenciamiento génico, para disminuir la expresión de un gen. Construcción empleada

Antisentido

HpRNAi

Requerimiento de transgénesis para obtener un silenciamiento sistémico

Si

Si

Construcción empleada

Origen de dsRNAs que luego son procesados por DCL.

gen blanco

Formación de dsRNA por apareamiento del transcripto sentido y del antisentido.

gen blanco

miRNAs artificiales

VIGS

Si

gen blanco

Formación de dsRNA por apareamiento del transcripto sentido y del antisentido.

264 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

i

miRNAs

Explota a los precursores de miRNAs endógenos para generar sRNAs.

No

Genoma viral

gen blanco

Los dsRNAs se forman durante la replicación viral o bien por estructuras secundarias que adquiere el virus.

0*).&-#I)*.'!"%&-#/!#/-ABC#32!#-&"#!$6+!"%!-# 7)!62)-&)!-#/!#-+ABC-#H#!"#6&"-!62!"6+*#/!0# -+0!"6+*'+!"%&# .4"+6&# PM52*".# H# [!H!)&j+%L;# ]^^^;# \!-0!H# H# 6&0,;# ]^^QE,# O*# 2%+0+L*6+8"# /!# esta estrategia requiere un estudio minucioso de la variabilidad de secuencia del gen que se quiere silenciar, por ejemplo si éste forma parte de una familia génica se debe considerar si desea disminuir la expresión de sólo un miembro de la misma o, por el contrario, silenciar a todos los miembros de la familia. Es decir que es muy importante la elección de la secuencia que se va a utilizar en la construcción ya que ésta 2.1.1 Silenciamiento mediante moléculas debe ser muy conservada, de un tamaño no menor a 100 pb y no debe presentar homología con estructura de horquilla Un desarrollo reciente y efectivo para desen- con secuencias de genes que no se desean sicadenar silenciamiento génico en plantas es el lenciar. Una vez elegida la secuencia, ésta se uso de largos precursores que formen estruc- coloca en sentido y en antisentido de manera turas de horquilla, es decir moléculas de do- 32!# 0*# /-ABC# -!# I&)'!# I# !"#.!0#/!#7&0+*6)+0*'+/*#/!#'*%!)+*0#!N%)*=/&#/!#0*-#L&"*-#+"$0%)*/*-,#>€#K!6%&)#K*6=&,

266 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

cido por virus, por su sigla en inglés) se aplica a la técnica que emplea virus recombinantes a $"#/!#/+-'+"2+)#0*#!N7)!-+8"#.4"+6*#/!#2"#.!"# endógeno. La construcción de vectores virales que portan en su genoma insertos derivados de secuencias génicas vegetales permite silen6+*)# !-7!6=$6*'!"%!# 0*# -!62!"6+*# !"/8.!"*# homóloga al inserto introducido en el vector viral. VIGS es una metodología que no requiere de transgénesis por lo tanto es rápida y versátil, siendo ideal para estudios a gran escala. En los últimos años ha ido adquiriendo una gran relevancia debido a la necesidad de analizar la abundante información surgida de los proyectos genómicos. Sin embargo, su mayor desventaja radica en que el nivel de silenciamiento es variable y que depende mucho de la especie a utilizar. Brevemente, la metodología de VIGS consiste en el clonado del gen candidato en un vector viral, la incorporación de este último en Agrobacterium H# $"*0'!"%!# !"# 0*# +"&620*6+8"# de plantas con el cultivo bacteriano para lo cual existen diversos métodos Uno de los métodos '*H&)'!"%!# !'70!*/&-# !-# 0*# *.)&+"$0%)*6+8"# que consiste en inyectar mediante una jeringa sin aguja la solución de Agrobacterium en la cara abaxial de la hojas de una planta. Otro de los métodos es el denominado “agrodrench” que consiste en regar la planta a la altura del tallo con la solución deseada PAH2# H# 6&0,;# 2004). Tras la agroinoculación de las plantas los vectores virales son incorporados a las células vegetales donde forman nuevos genomas virales causando la infección sistémica de la planta. En cada una de las células infectadas se produce la replicación viral induciendo el -+0!"6+*'+!"%&# /!0# .!"# 6*"/+/*%&# PA2+L# H# 6&0,;# 1998; Liu y col., 2002). Existen varios vectores virales desarrollados para VIGS (que se resumen en la tabla 4), sin embargo el sistema de scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0717- ldW@# :*-*/&# !"# !0# K+)2-# iAl# !-# 2"*# /!# 0&-# VUno]^^S^^^]^^^^]y0".€!-y")'€+-&,# d@@B# más utilizados en la actualidad ya que presenta ciertas ventajas frente a otros vectores virales. 0717-3458 Este virus ocasiona un nivel menor de sínto2.3 Metodología para el análisis de genes mas en las plantas, puede infectar meristemas candidatos que no requiere transgénesis: H#%+!"!#2"#*'70+&#)*".&#/!#5&-7!/*"%!-,#iAl# silenciamiento génico inducido por virus !-# 2"# K+)2-# /!# ABC# /!# 7&0*)+/*/# 7&-+%+K*# 6&"# 2"# .!"&'*# :+7*)%+%&,# h"&# /!# !-&-# ABC-# .!(VIGS). El término VIGS (silenciamiento génico indu- "&'+6*-# I2!# '&/+$6*/&# /!# '&/&# /!# !0+'+"*)#

2.2 Determinación de la actividad de vectores aptos para el silenciamiento de forma !"#$%&!'"&#()*#(#+"'&$,-!"#.&/$ Dado que obtener plantas transgénicas es 2"*# 0*:&)# /+$620%&-*# H# /!# 0*).*# /2)*6+8";# -!# pueden realizar aproximaciones útiles previas al desarrollo de las mismas. Así, para analizar 0*# !$6*6+*# /!# 2"*# 5&)32+00*# /!# -+0!"6+*'+!"%&# &# !0# 6&))!6%&# 7)&6!-*'+!"%&# /!# 2"# '+ABC# *)%+$6+*0# -!# 72!/!# )!*0+L*)# 2"# %!-%# /!# -+0!"6+*miento local utilizando Agrobacterium tumefaciens. Esta técnica consiste en realizar co*.)&"$0%)*6+&"!-# .!"!)*0'!"%!# /!# 5&(*-# /!# N. benthamiana con diferentes agrobacterias transformadas; una conteniendo un plásmido expresando el gen blanco y otra conteniendo el plásmido silenciador a evaluar, es decir la misma secuencia blanco (o parte de la misma) re7!%+/*#!#+"K!)%+/*#&#!0#'+ABC#*)%+$6+*0,#h"*#K!L# transcurrido el tiempo necesario para el establecimiento del silenciamiento se analizan, por !(!'70&#'!/+*"%!#0*#%46"+6*#/!#XB&)%5!)"#:0&%Z;# los indicadores del silenciamiento en la zona *.)&+"$0%)*/*,# F+65&-# +"/+6*/&)!-# -&"# !"# 7)+mer lugar una reducción en el nivel de acumulación esperado del gen blanco y en segundo 02.*)#0*#*7*)+6+8"#/!#-ABC-#5&'80&.&-#*0#.!"# blanco. En la Figura 4B se muestra un típico en-*H&#/!#+"/266+8"#/!#>iW@#'!/+*"%!#*.)&+"$0traciones de hojas de N. benthamiana utilizando como gen blanco el reportero GFP y como plásmidos silenciadores una construcción con estructura de horquilla que posee la secuencia de GFP en sentido y antisentido separada por un intrón (dsGFP) o bien una construcción 32!# !N7)!-*# !0# '+ABC# *)%+$6+*0# 32!# 7&-!!# ]]# 7:# /!# 0*# -!62!"6+*# /!# Wk># P'+A`Wk>E,# >*)*# mayor información acerca de la realización de experimentos de silenciamiento empleando la %46"+6*# /!# *.)&+"$0%)*6+8"# -!# 72!/!# 6&"-20%*)# el trabajo de Bazzini y col. (2007). 5%%7Jttjjj,

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 267

Tabla 4: Vectores virales para su uso en VIGS .Tabla adaptada de Godge y col., 2008. Virus

Género

Hospedantes naturales importantes

Tobacco Mosaic Virus

Tobamovirus

Nicotiana tabacum

Tobacco Rattle virus

Tobravirus

Potato Virus X

Potexvirus

Barley stripe mosaic virus Tomato goleen mosaic virus

Hordeivirus

Begomovirus

Probado en

Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum Amplio rango N. benthamiana, de hospedantes Arabidopsis, Tomate, especies de Solanum, pimiento

Genes silenciados

Referencias

PDS, PSY

Kumagai et al (1995)

Varios genes PDS, PSY, GFP, EDS, RAR, NPR1 PDS, GFP

Liu et al (2002b) Ratcliff et al (2001)

Solanum tuberosum Brassicca Campestris Trigo, cebada, maíz

N. bentahmiana, Solanum tuberosum Trigo, cebada

PDS

Holzberg et al (2002) Scofield et la ( 2005)

Lycopersicum sculetum

N. benthamiana

Su(Sulfur gene)

Peele et al (2001)

las proteínas no esenciales e incorporar un sitio múltiple de clonado en donde se puede introducir el fragmento del gen candidato que se desea silenciar, dejando las regiones no tradu6+:0!-#H#0*#)!.+8"#6&/+$6*"%!#/!#0*#7)&%!="*#/!# la cápside intactas. Posteriormente este vector fue mejorado por el grupo del Dr. Dinesh Kumar mediante la incorporación del promotor 35S duplicado el cual incrementa la transcripción, del terminador de la nopalina sintetasa y de la secuencia de una ribozima que permite -+'20*)# !0# $"*0# Vu# /!0# .!"&'*# K+)*0# /!# I&)'*# más adecuada (Liu y col., 2002). Así, la base del silenciamiento inducido por virus puede explicarse fundamentalmente mediante el mecanismo de PTGS. Estudios realizados en N. benthamiana empleando un transgén de la proteína reportera GFP muestran que el mecanismo de VIGS puede ser separado en

Ruiz et al (1998)

dos etapas, una de iniciación y otra de mantenimiento. La primera sería absolutamente dependiente de la presencia del virus, siendo los genes blancos silenciados sólo si la planta es infectada por el virus. Mientras que la segunda !%*7*# -!)=*# +"/!7!"/+!"%!# /!0# '+-'&,# PA2+L# H# col., 1998, Jones y col., 1999). @+6&17'*$.1+6'&"-6$#'& A lo largo de este capítulo se describieron algunas de las metodologías empleadas frecuentemente para estudios de genética reversa basados en el silenciamiento génico. Como se mencionó al inicio del capítulo el empleo de estas metodologías presenta ciertas ventajas respecto a otras, sin embargo una de las consideraciones que hay que tener en cuenta al usar los métodos basado en silenciamiento gé"+6&#!-#0*#!-7!6+$6+/*/#/!0#'+-'&"#!0#$"#/!#

268 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

evitar que se altere la expresión de otros genes no deseados. Estudios realizados en Arabidopsis thaliana indican que al emplear como inserto la región completa de un gen se alteran aproximadamente la expresión de 4 genes no deseados (Ping Xu y col., 2006). En el último tiempo han surgido varios trabajos en donde se proponen distintos modos de controlar y/o disminuir estos efectos no deseados, entre ellos se encuentran el uso de programas bioinformáticos que permiten analizar cuál es la mejor región a emplear de modo de obtener un -+0!"6+*'+!"%�&#')!'+&# B&:!0# de Fisiología o Medicina en el año 2006. Actualmente se están desarrollando numerosos estudios en los cuales mediante silenciamiento génico se logra obtener plantas inmunes a infecciones virales o bacterianas, disminuir la

alergenicidad de vegetales comestibles y estudiar la función de los genes. Bibliografía: C'!/!&;#>,;#a*:2#c;#CI-*)#g;#[+%%!0-%!"#@65!+/#e;# >*-LY&j-Y+# f,# ]^^^,# F+-)27%+&"# eI# i5!# >0*"%# W!"!#[&'#A!0!*-!-#i)*"-6)+7%+&"*0#@+0!"6+".#eI# [!%5H0*%!/#W!"!-,#B*%2)!;#U^n#PTSoVEJ#>,#]^V`T, m*)%!0# F,>,# ]^^U,# [+6)&ABC-J# W!"&'+6-;# :+&.!"!-+-;#'!65*"+-'#*"/#I2"6%+&",#M!00J#QQTJ]oQp]RS, m*206&':!;# F,M,# ]^^U,# ABC# @+0!"6+".# d"# >0*"%-,# B*%2)!;#UVQ#PS^^TEJ#>,#VnT`TV, Bazzini, A.A., Mongelli, V.C., Hopp, H.E., Del Vas, M. And Asurmendi, S. 2007. A Practical Approach i&#i5!#h"/!)-%*"/+".#C"/#i!*65+".#eI#A"*#@+lencing In Plants. Electronic Journal Of Bio%!65"&0&.H;#Q^#P]EJ#QSo`QR^,#!d@@BJ#^SQS`VUno, Chapman E. J., Carrington J. C. 2007. Specializa%+&"# C"/# 9K&02%+&"# eI# 9"/&.!"&2-# @'*00# A"*# >*%5j*H-#B*%#A!K#W!"!%,#B&Kbo#PQQEJooU`RT M52*".;#M,k,#C"/#[!H!)&j+%L;#9,#[,#]^^^,#@7!6+$6# and heritable genetic interference by double-%)*"/!/#ABC#+"#C)*:+/&7-+-#%5*0+*"*,#>)&6,#B*%0,# Acad. Sci. USA 97, 4985-4990. Doench J.G., Petersen, C.P., And Sharp, P.A. ]^^V,#-+ABC-#6*"#I2"6%+&"#*-#'+ABC-,#W!"!-#y# F!K,QSJ#UVopUU], Dorokhov Iu, L. 2007. Gene Silencing In Plants. Mol Biol (Mosk), 41(4): P. 579-92. Dunoyer P., Lecellier C.H., Parizotto E.A., Himber M,;#l&+""!%#e,#]^^U,#>)&:+".#%5!#'+6)&ABC#*"/# -'*00# +"%!)I!)+".# ABC# 7*%5j*H-# j+%5# K+)2-`!"6&/!/# -277)!--&)-# &I# ABC# -+0!"6+".,# >0*"%# M!00# QTJQ]VnpQ]n^, Dunoyer, P. And O. Voinnet. 2008. Mixing And Matching: The Essence Of Plant Systemic Silencing? Trends Genet, 24(4): P. 151-4. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E. And Mello, C. C. 1998. "Potent And @7!6+$6#W!"!%+6#d"%!)I!)!"6!#mH#F&2:0!`@%)*"/!/# A"*# d"# M*!"&)5*:/+%+-# 90!.*"-,‚# B*%2)!;l&0,# VRQ;#B&,#TTTR;#>,#o^T`QQ,# Furner, I.J., M.A. Sheikh, And C.E. Collett. 1998. Gene Silencing And Homology-Dependent Gene @+0!"6+".# d"#C)*:+/&7-+-J# W!"!%+6# [&/+$!)-#C"/# Dna Methylation. Genetics, 149(2): P. 651-62. W&/.!# [A;# >2)Y*H*-%5*# C;# F*-.27%*# d;# g2'*)# PP. 2008. Virus-induced gene silencing for func%+&"*0#*"*0H-+-#&I#-!0!6%!/#.!"!-,#>0*"%#M!00#A!7,# 27(2):209-19. Jones, L. Hamilton A.J, Voinet O, Thomas C.L, [*20!;# C,f# c# m*206&':!# F,M# QRRR,# A"*`F"*# Interactions And Dna Methylation In Post-Tran-

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 269

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cient Tool For Functional Genomics In Hexaploid m)!*/#\5!*%,#>0*"%#>5H-+&0&.H#QU]JT`]^#P]^^TE l*"6!# l,;# l*265!)!%# a,# ]^^Q,# ABC# -+0!"6+".# +"# plants: Defense and counterdefense. Science ]R]J]]SSp]]o^, Vaucheret, H. And M. Fagard. 2001. Transcriptional Gene Silencing In Plants: Targets, Inducers And A!.20*%&)-,i)!"/-#W!"!%,#f*"bQSPQEJ]R`Vn l&+""!%;#e,#]^^Q,#ABC#-+0!"6+".#*-#*#70*"%#+''2"!# -H-%!'# *.*+"-%# K+)2-!-,# i)!"/-# W!"!%# QS;# UURp 459. \!-0!H;#@,#l,;#a!00+j!00;#M,#C,;#@'+%5;#B,#C,;#\*".;# [,#m,;#A&2-!;#F,#i,;#O+2;#s,;#W&&/+".;#>,#@,;#@+".5;# @,#>,;#C::&%%;#F,;#@%&2%(!-/+(Y;#>,#C,;#A&:+"-&";#@,# >,;#W0!*K!;#C,#>,;#W)!!";#C,#W,#C"/#\*%!)5&2-!;# >,# [,# ]^^Q,# M&"-%)26%# F!-+."# k&)# 9I$6+!"%;# 9Ifective And High - Throughput Gene Silencing In >0*"%-,‚#>0*"%#f;#l&0,#]S;#B&,#T;#>,#noQ`R^, q!".;#c,;#c+;#A,;#C"/#M200!";#m,A,#]^^V,#[+6)&ABC-# *"/# -'*00# +"%!)I!)+".# ABC-# 6*"# +"5+:+%# 'ABC# !N7)!--+&"# :H# -+'+0*)# '!65*"+-'-,# >)&6,# B*%0,# C6*/,#@6+,#Q^^J#RSSRpRSoU,#

270 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

II. CAPÍTULO 8

continua puede ser manejado como si se tratara de un carácter de herencia mendeliana mediante la introgresión de un fragmento de 6)&'&-&'*#6&"%!"+!"/"#siO#7&)#)!%)&6)2zamientos sucesivos en las variedades comer6+*0!-,#O&-#siO-#)!7)!-!"%*"#2"#"2!K&#-+-%!ma de enfocar el estudio básico y el manejo práctico de los sistemas poligénicos y de la genética cuantitativa.

Análisis de Experimentos Biológicos @&I=*#e0'&-b#[+.2!0#F+#A!"L&b# [!)6!/!-#d:*G!Lb#B40+/*#\+"L!) 1 La variación biológica La variabilidad genética es un hecho universal en las poblaciones reproductivas y una condición preliminar necesaria para el cambio evolutivo y para la respuesta al mejoramiento genético mediante selección o hibridación. Por otra parte son conocidos los peligros que implica la uniformidad y la falta de diversidad en las especies cultivadas y en los animales domésticos, como consecuencia de la erosión genética. La variación que presentan los individuos de una población puede ser discontinua o continua. Los caracteres cualitativos de variación discontinua, como los marcadores molecula)!-;#7!)'+%!"#60*-+$6*)#*#0&-#+"/+K+/2&-#-+"#*'bigüedades, ya que estos caracteres están regidos por uno o por pocos genes y el ambiente no tiene efecto en su manifestación fenotípica. En cambio, los caracteres cuantitativos, representados por la mayoría de los caracteres de interés agronómico, presentan variación continua y los fenotipos, que están determinados por poligenes y por efectos ambientales, -&"#/+I=6+0!-#/!#60*-+$6*)#!"#6*%!.&)=*-#/+-6)!tas. Para su análisis deben emplearse métodos biométricos, que no miden el efecto de genes individuales o de segmentos cromosómicos !-7!6=$6&-;#-+"&#/!#%&/&#!0#.!"&'*, Durante los últimos años ha surgido un consenso entre los mejoradores y genetistas moleculares sobre la conveniencia del uso de marcadores moleculares para asistir a la selección de caracteres cuantitativos (MAS, Marker Assisted Selection). La biotecnología ha colaborado mediante la construcción de mapas genéticos saturados, esto es, con innumerables marcadores moleculares a lo largo de los cromosomas, que permiten ubicar regiones de *6%+K+/*/#62*"%+%*%+K*#PsiO-;#s2*"%+%*%+K!#i)*+%# Loci). De esta manera un carácter de variación

A"B>3'*12'6)+".1'6)3'*12'6)+".1'6)*)*#-+'70+$6*)#!0#*"#!"#2"#-80&#'&/!0&,#90#CBelC#7!)'+%!# estudiar el efecto principal de ambiente, mientras que la interacción genotipo-ambiente más el efecto principal de genotipo (G) es tratado de forma multivariada mediante el ACP. De manera análoga con el método GGE biplot (evaluación simultánea del G + GE), se /!-6)+:!# !0# ss9# :+70&%# Ps# †# s9E# 32!# )!/26!# la dimensionalidad de la información obtenida -&:)!# 'D0%+70!-# siO-# !"# 'D0%+70!-# *':+!"tes. En este método se representan los pa%)&"!-# /!# +"%!)*66+8"# siO`*':+!"%!# *# 7*)%+)# /!#2"*#%*:0*#/!#/&-#K=*-#PsiO-#H#*':+!"%!-E# y por lo tanto es posible visualizar los efectos /!# 0&-# siO-# /!"%)&# H# *# %)*K4-# /!# *':+!"%!-# o mega-ambientes. Esta tabla se descompone en componentes principales y los dos prime)&-# 6&'7&"!"%!-# 7)+"6+7*0!-# -!# .)*$6*"# 7*)*# siO-#H#*':+!"%!-#!"#0*#I&)'*#/!#2"#:+70&%,#90# )!-20%*/&#/!0#ss9#:+70&%#6&"%+!"!#+"I&)'*6+8"# -&:)!# 0&-# !I!6%&-# 7)+"6+7*0!-# /!# 0&-# siO-# &# efecto aditivo, resumido como el efecto medio a través de ambientes e información sobre la +"%!)*66+8"# siO`*':+!"%!# )!0*6+&"*/*# 6&"# 0*# !-%*:+0+/*/# /!# 0&-# siO-,# 90# 7)+'!)# *"*)*#+"%!)7)!%*)#0*#'!%&/&0&.=*#/!0#ss9#:+70&%# -!# 2%+0+L8# 2"*# %*:0*# siO`*':+!"%!# Pc*"# H# i+"Y!);#]^^nE;#6&"#&65&#siO#PsQ#*#soE#H#&65&# ambientes (E1 a E8) (Tabla 2). El biplot fue realizado con el programa Infogen (Balzarini y Di

280 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

A+!"L&;#]^^UE#!"#:*-!#*0#!I!6%&#*/+%+K&#/!#0&-# sU#72!/!"#-!)#6&"-+/!)*/&-#siO-#6&"#!I!6%&-# mayores. Los restantes no son necesariamensiO-, te menores porque sus efectos podrían apareTabla 2. 9I!6%&-#*/+%+K&-#/!#&65&#siO-#PsQ#*#soE# cer en la CP3 o CP4. Similitud entre QTLs: La distancia y el ánen ocho ambientes (E1 a E8). .20&#!"%)!#/&-#siO-#!-#2"#+"/+6*/&)#/!#0*#-+E6 E7 E8 militud en sus respuestas a los ambientes. Así E1 E2 E2 E3 E4 E5 Q1 1 2 2 2 2 1 1 0 1 7&)#!(!'70&;#sT#!-#'2H#/+I!)!"%!#/!#s];#sU#H# Q2 -2 -2 -2 -3 -4 2 3 4 6 sS,#O&-#siO-#6&"#7*%)&"!-#-+'+0*)!-#72!/!"# Q3 2 -2 -2 -1 -2 -3 -2 -1 -2 ser tratados de la misma forma en la selección Q4 2 4 4 3 1 1 4 2 1 asistida por marcadores. H121#1)/7"'6)*'" $2=1'6)'&" 5".#$&1-.$.1,6" Q5 3 -2 -2 -2 -3 -4 -3 -3 -3 Q6 0 0 0 0 0 -3 -4 -5 -6 de mega-ambientes: La distancia y el ángulo entre dos ambientes miden la similitud en la Q7 -6 -5 -5 -4 -3 0 0 0 0 !N7)!-+8"#/!#0&-#siO-,#9"#0*#k+.2)*#Q#-!#&:Q8 3 -3 -3 4 4 3 -3 4 -4 servan dos grupos de ambientes, E1 a E4 vs E5 a E8. Los ambientes dentro de cada grupo son similares (ángulos pequeños) pero los dos 90#!I!6%)+"6+7*0#/!#s;#/!#9;#H#/!#0*#s9#!N- grupos son independientes (ángulo recto). Por plicaron 40, 3 y 57% de la variación total, res- 0&# %*"%&;# -!# +/!"%+$6*"# /&-# '!.*`*':+!"%!-,# pectivamente. El biplot de las CP1 y CP2 expli- Esto implica, que la selección de genotipos en caron el 79% de la variación total (Figura 1). El un mega-ambiente es independiente del otro, y ss9# :+70&%# 7!)'+%!# K+-2*0+L*)# /+-%+"%&-# %!'*-# que las estrategias de selección requeridas en relacionados con la evaluación y utilización de cada mega-ambiente deben ser distintas. 0&-#siO, Efecto principal y estabilidad de los QTL a QTLs mayores vs menores: La distan- través de ambientes: El punto que representa 6+*#/!#0&-#siO-#*0#&)+.!"#7!)'+%!#K+-2*0+L*)#0*# el ambiente promedio (AP) se obtiene con la '*."+%2/#/!#-2-#!I!6%&-,#C-=;#s];#sT;#sS;#sn#H# '!/+*#/!#0&-#6&!$6+!"%!-#M>Q#H#M>]#*#%)*K4-# de los ambientes. La línea que pasa a través del ambiente promedio y el origen del biplot es llamada eje x del ambiente promedio y las proH!66+&"!-#-&:)!#!-%!#!(!#62*"%+$6*"#!0#!I!6%&# /!#0&-#siO-,#C-=;#0&-#!I!6%&-#7)+"6+7*0!-#/!#0&-# siO-#*#%)*K4-#/!#*':+!"%!-#-&"J#sU##sQ##‡# # sS# # sn,# O*# 0="!*# 7!)7!"/+620*)# *0#C># 32!# pasa por el origen se llama eje y del ambiente promedio. Las mayores proyecciones de los siO-# -&:)!# !0# !(!# y indican poca estabilidad /!#0&-#'+-'&-,#C-=#s];#sS#H#sT#-&"#7&6&#!-%*:0!-# H# sQ;# sV;# sU# H# sn# -&"# )!0*%+K*'!"%!# estables a través de los ambientes. Para una '!(&)# +"%!)7)!%*6+8"# /!# so# 32!# %&'*# K*0&)!-# +"%!)'!/+&-;#-!#7&/)=*#)!*0+L*)#2"#.)*"/&)*ˆ-# :&N‰,# C""2*0# )!K+!j# &I# !6&0&.H# *"/# systematics, 21: 129-166. Manly, B.F. 1986. Multivariate Statistical Methods. A Primer. Chapman and Hall, London. A!"65!);#C,M,#QRRn,#[!%5&/-#&I#[20%+K*)+*%!#C"*0H-+-,#f,#\+0!H#*"/#@&"-;#d"6,#B!j#c&)Y, c*";# \,b# i+"Y!);# B,C,# ]^^n,# C# :+70&%# *77)&*65# I&)# +"K!-%+.*%+".# siO`:H`!"K+)&"'!"%# 7*%%!)"-,# [&lecular Breeding 15: 31-43.

282 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

II. CAPÍTULO 9

una corrida electroforética de isoenzimas o marcadores moleculares. b) Datos doble estado excluyentes. El carácMétodos multivariados para ter tiene sólo dos estados posibles y la asignaestimar variabilidad genética ción del "0" ó el "1" es indistinta. 9(!'70&-J#M*)F-, A

B

C

D

E

F

1 2 3 4 5 6 7 8

1 2 3 4 5 6 7 8 1 1 0 0 1 1 0

A B C D E F A A B C D E F

B

C

D

2 1 1 0 1 1 1 E

3 0 1 1 1 0 1

Bandas 4 1 1 0 0 1 1

5 1 1 0 0 1 1

6 0 0 1 0 0 1

F

A 1 1 0 1 1 0 1 0 7 1 0 0 0 1 1 A

1 0.5 0 0.333 1 0.5 0.5 1 0.167 0.4 0.5 0.571 0 0.167 1 0.2 0 0.429 0.333 0.4 0.2 1 0.333 0.25 1 0.5 0 0.333 1 0.5 0.5 0.571 0.429 0.25 0.5 1

A B C D E F

Además, ambas matrices son simétricas: la asociación entre A y E es la misma que la que se da entre E y A. Por eso, basta mostrar la mitad de la matriz de asociación. Esta observación será válida para todas las medidas que se presenten en este capítulo. Si los datos son binarios pero de estados equivalentes, dos muestras deberán considerarse más asociadas tanto cuando comparten ‚2"&-‚#6&'&#‚6!)&-‚;#H*#32!#0*#6&/+$6*6+8"#32!# se les asigna es indistinta. Este es un proceso típico en el análisis de la información a partir de bandas. Primero se co/+$6*#0*#+"I&)'*6+8";#-!#6&"-%)2H!#0*#'*%)+L#/!# datos y, en este caso, se calcularon las matrices de asociación de Jaccard y Dice a efectos de observar las características mencionadas más arriba. Entre las muestras A y C no se observaron bandas en común, por lo tanto a = 0 y tanto Jaccard como Dice dan 0. Por otro lado, A y E comparten la presencia de las mismas bandas: a = 5, b = 0, c = 0. Tanto Jaccard como Dice dan 1. Entre B y E: a = 3, b = 1, c = 2. Por lo tanto, de las 6 bandas presentes en una u otra

1 0.667 0 0.5 1 0.667

B 0 1 1 1 1 0 0 0

C 0 0 1 0 0 1 0 1

D 1 1 1 0 0 0 0 0

E 1 1 0 1 1 0 1 0

F 0 1 1 1 1 1 1 1

8 0 0 1 0 0 1 B

C

D

E

F

0.667 0 0.5 1 0.667 1 0.286 0.571 0.667 0.727 0.286 1 0.333 0 0.6 0.571 0.333 1 0.5 0.4 0.667 0 0.5 1 0.667 0.727 0.6 0.4 0.667 1

muestra comparten 3. Así Jaccard vale 0.5. El total de bandas de B es 4 y el total de bandas detectadas en E es 5. El promedio de estos totales da 4.5 por lo que la asociación de Dice da (3/4.5) = 2/3 = 0.667. Se observa también que, salvo los 0 y los 1, todos los valores de Jaccard son menores que los de Dice. Además, ambas matrices son simétricas: la asociación entre A y E es la misma que la que se da entre E y A. Por eso, basta mostrar la mitad de la matriz de asociación. Esta observación será válida para todas las medidas que se presenten en este capítulo. Si los datos son binarios pero de estados equivalentes, dos muestras deberán considerarse más asociadas tanto cuando comparten ‚2"&-‚#6&'&#‚6!)&-‚;#H*#32!#0*#6&/+$6*6+8"#32!# se les asigna es indistinta. Un índice recomendable por su simplicidad es el de Simple Matching o de Concordancia Simple: @d[>O9#[CiMadBW### SM = 12

a+d a+b+c+d

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 285

Simplemente es la proporción de caracteres que comparten las dos muestras. Si se piensa que la matriz de datos anterior corresponde a ocho caracteres binarios de estados equivalentes la matriz de asociación con el índice de Simple Matching dará: A B C D E F

A

B

C

D

E

F

1

0.625 1

0 0.375 1

0.5 0.625 0.5 1

1 0.625 0 0.5 1

0.5 0.625 0.5 0.250 0.5 1

O&-#72"%&-#>~#€## ( p1 , p 2 ,..., p m ) H#s~#€# ( q1 , q 2 ,..., q m ) están sobre una esfera de radio 1. La distancia Cuerda es, precisamente, la longitud de la cuerda que une esos dos puntos. >*)*# !0# 6*-&# '# €# ];# -!# K!# !"# !0# .)#H#s, Distancia de Estándar de NEI (1972): Esta distancia tiene una base biológica. Expresa la probabilidad de que dos alelos tomados al azar de dos poblaciones diferentes sean idénticos, con respecto a la probabilidad de que lo sean dos alelos tomados al azar de la misma población. Sean, como antes, las poblaciones 1 y 2 y las frecuencias alélicas de un locus:

286 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

(p q

se puede interpretar como la probabilidad que dos alelos sean iguales si uno ha sido elegido al azar de la población 1 y el otro de la población 2. i i

(p

2 i

es la probabilidad que dos alelos elegidos al azar de la población 1 sean iguales;

(q

2 i

es la probabilidad que dos alelos elegidos al azar de la población dos sean iguales. Los dos últimos términos equivalen a un estado de homocigosis en la población 1 y 2, respectivamente. B!+#/!$"!#7)+'!)�*#Identidad normalizada (varía entre 0 y 1): m

(p q

i i

I=

i =1 m

m

i =1

i =1

( pi2 ( qi2 y luego la Distancia Estándar: D12 = - ln I. Si se usan varios loci se trabaja con el pro'!/+&# *)+%'4%+6&# /!# 0*-# 7)&:*:+0+/*/!-# /!$"+das anteriormente resultando: r

mi

(( p q

ij ij

D12 & ' ln

i =1 j=1

r

mi

(( pij2 i =1 j=1

r

mi

(( q

2 ij

i =1 j=1

Ejemplo: Para la información de la Tabla 2, en el caso de las frecuencias de cinco alelos provenientes de dos loci, se tiene: I = 0.857986 y, por lo tanto, D = 0.15317.

Tabla 2: Datos de frecuencias alélicas de dos loci 7*)*#!0#624$+ 2"+ !"5"+ 3.&#(&3'/mente a la disminución en el tamaño de 212+ (/+ !$+ "#+ "24'+ (/'2&-('(&)#+ '+ '71"//$2+ &#!&8&!1$2+ porcentaje de embriones gemelos obserderivados de especies poliploides, cuya constivados varía con la especie y el genotipo. tución genética es igual a la de los gametos !" Genes marcadores?+ ($#+ "24"+ -#+ 31"!"+ normales de dicha especie. Por ejemplo, un utilizarse cualquier par de alelos cuyos autopoliploide AAAA (2n = 4x) daría lugar a infenotipos dominante y recesivo sean dividuos “haploides” AA (n = 2x), que por tener ;6(&/%"#4"+ !&24
&5/"29+ >#+ /'+ 3.6(4&('*+ dos juegos cromosómicos (AA) no podrían ser conviene utilizar marcadores que posean &#(/1&!$2+"#+/'+!"-#&(&)#9+:$.+/$+4'#4$*+1#'+2$manifestaciones fenotípicas claras en lución sería denominar como haploides a los semilla o en plántula y de esta manera individuos originados a partir de especies dihacer una selección más económica en 4&"%3$+ ,+ "2;1".@$9+ :'.'+ &!"#4&-('.+ A'ploides, que posean un solo juego de cromosoploides en una variedad que se supone mas (n = x), llamando polihaploides a aquellos homocigota, se realizan cruzamientos individuos con una composición cromosómica con otra variedad que sea homocigota igual que la gamética normal de la especie, para el alelo alternativo. La mayor parque tengan dos o más juegos cromosómicos te de la descendencia será heterocigota (n > x). Otra posibilidad sería considerar el tér(diploide), con fenotipo dominante. Los mino haploide en un sentido más amplio, comindividuos que aparezcan con el fenotipo prendiendo en éste a todos los individuos que recesivo serían haploides, obtenidos por posean una constitución cromosómica igual a partenogénesis o androgénesis, según la de los gametos normales de la especie (n = sea el fenotipo recesivo materno o pater2n/2). Llamaríamos de esta manera monoploino, respectivamente. des y polihaploides a los individuos provenienAntecedentes tes de plantas diploides (2n= 2x) y poliploides >/+ 8'/$.+ !"+ /$2+ A'3/$&!"2+ 2"+ ($#$("+ !"2!"+ (2n> 2x) respectivamente. De aquí en adelan1922, cuando se descubrió la producción es4"*+'+/$2+-#"2+3.6(4&($2+,+"#+($#($.!'#(&'+($#+ pontánea de los mismos, siendo superior a /'+2"01#!'+!"-#&(&)#*+#$2+.";".&."%$2+'/+4#4."+/$2+('2$2+!"+haploidía espontánea es somáticas de la especie. común la poliembrionía, que, con una gran va-

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 297

riación entre los distintos genotipos, ocurre en una amplia gama de especies, géneros y fami/&'29+ >#+ "24$2+ ('2$2+ "2+ ;."(1"#4"+ /'+ '3'.&(&)#+ de haploides procedentes de una sinérgida del saco embrionario, puesto que se ha comprobado en muchas especies que las células antípodas degeneran antes de la fecundación. >#+BCDD*+E1A'+,+F'A"2AG'.&+!"2(15.&".$#+ que las anteras de Datura innoxia Mill. generaban plantas haploides al ser cultivadas in-vitro. >24"+ 3.$("2$*+ ($#-.%'!$+ 3$24".&$.%"#4"+ 3$.+ H&42(A+ ,+ H&42(A+ IBCDCJ+ "#+ 4'5'($*+ 2"+ A'+ 14&/&zado para producir haploides en numerosas "23"(&"29+>#+"/+('2$+!"+Datura innoxia, las frecuencias de inducción son casi del 100% y el rendimiento es de más de mil plántulas o callos 3$.+'#4".'+"#+($#!&(&$#"2+)34&%'2+I-01.'+BJ9 >#+ "241!&$2+ !"+ '#!.$024$2+ 3'2$2+ 2$#+ 562&($2+ "#+ 1#+ 3.$0.'%'+ !"+ mejora, pudiendo existir otras etapas en función del modo reproductivo de la especie. Así por ejemplo, el tiempo requerido para la obtención de un nuevo cultivar de trigo de ciclo invernal es de aproximadamente diez años, a 4.'8#+/'2+3/'#4'2+autógamas, con los métodos convencionales de mejoramiento, la homocigosis práctica se logra recién luego de seis a ocho generaciones de autofecundación. Mientras que con una técnica de producción de haploides seguida de duplicación cromosómica, es posible llegar a homocigosis completa en solo una generación. >#+ /'2+ 3/'#4'2+ alógamas, la producción de homocigotas resulta de gran importancia. Al trabajar con especies de polinización cruzada se favorece naturalmente la heterocigosidad, y, de ser posible la autofecundación, la obtención de A$%$(&0$4'2+2"+8"+!&-(1/4'!'+3$.+/'+ endogamia. >#+ 3/'#4'2+ bulbosas, árboles frutales y forestales la homocigosis juega un rol muy importante en el aceleramiento de los programas de mejora. Debido al prolongado tiempo requerido para alcanzar la fase adulta, el proceso de mejora resulta extremadamente largo, aún siendo posible la autopolinización.

2. Generación de poblaciones de mapeo: para el mapeo genético de plantas, diversos tipos de poblaciones pueden ser utilizadas. La selección del tipo de población a usar se realiza en función de los objetivos de la investigación y del tiempo y recursos disponibles. Las poblaciones de mapeo con el mayor contenido de información son aquellas obtenidas a partir del cruzamiento entre dos individuos homocigo4$2+($#4.'24'#4"29+>#+/'2+3/'#4'2+UB+$54"#&!'2*+ el desequilibrio de ligamiento es máximo, y las poblaciones derivadas a partir de estas plantas UB+ 3.$(1.'#+ "O3/$.'.+ "24"+ !"2"71&/&5.&$9+ :'.'+ especies de autofecundación o que toleran la autofecundación pueden utilizarse poblaciones UK*+U#*+VWX2+IRecombinant Imbred Lines), derivadas de retrocruzas y doblehaploides. Las poblaciones de doblehaploides representan la variabilidad genética entre los progenitores /1"0$+!"+$(1..&!'+1#'+2$/'+%"&$2&2+IUBJ*+,+2$#+ especialmente indicadas cuando se realizan estudios con QTL (Quantitative Trait Locus), ya

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 299

a bajas temperaturas. R+ Plantas de Brassica napus con mayor contenido de aceite del ácido erúcico en /'2+A$P'29+>24"+'("&4"+2"+12'+($%$+/15.&cante en la industria. 6. Mutagenesis: si se aplica mutagénesis a un sistema de haploides, se obtienen mutantes sólidos, lográndose la homocigosis del mutado rápidamente luego de la duplicación ($#+($/(A&(&#'9+>#4."+/$2+'0"#4"2+%14'024"+ %#+/'+#'41.'/"@'*+/'+A'3/$&!M'+"2+($#4.$lada por el gen hap, llamado gen inhibi!$.+!"+/'+A'3/$&!M'9+>O&24"+21-(&"#4"+"8&dencia que sugiere que la androgénesis in-vitro también está bajo control génico, y que este carácter puede ser transferido desde clones con alta respuesta a otros no respondedores. Se ha hallado variabilidad en la respuesta entre especies y 'a#+!"#4.$+!"+"//'29+>#+("5'!'+,+4.&0$+/$2+ caracteres inducción de callos y regeneración de plantas son altamente hereda-

302 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

Figura 4. Producción de callos y plantas a partir del cultivo de anteras de Triticum aestivum. (A) Callo 5/'#($+ ,+ ($%3'(4$+ 2$5."+ 1#'+ '#4".'+ I="(A'J9+ IhJ+ Detalle del callo señalado en (A). (C) Callo transferido a medio de cultivo para regenerar planta. (D) Plántula de trigo regenerada a partir de callo, con 2&24"%'+.'!&(1/'.+"#+;$.%'(&)#9+I>J+:/'#4'+A'3/$&!"+ ($%3/"4'+ -#'/&@'#!$+ /'+ "4'3'+ !"+ .124&('(&)#*+ (."ciendo sobre sustrato inerte (Perlita).

bles, y se ha sugerido que ambos caracteres estarían controlados por muchos genes. Por lo tanto, el mejoramiento de la capacidad androgénica no parece difícil, 2&"#!$+/'+&!"#4&-('(&)#+!"+0"#$4&3$2+($#+ gran capacidad de respuesta un paso indispensable para su incorporación en los bloques de cruzamiento. 2. >/+]+!"+'/5&#&2%$?+/'+$(1.."#(&'+!"+3/'#tas albinas representa un serio problema para la aplicación del cultivo de anteras en programas de mejoramiento de cereales. La incidencia depende, no sólo de la especie, sino también de la varie!'!*+(&46#!$2"+8'/$."2+!"+\Z*+gZ+,+BZZ]+ para tres variedades diferentes de arroz. Bernard (1980) ha sugerido que las altas temperaturas incrementan la diferencia entre la velocidad de replicación del

material nuclear y el de las organelas, resultando en un desarrollo retardado o incompleto de los plástidos, lo cual conduciría a la producción de fenotipos albinos. De acuerdo a este autor, el desarrollo de un sistema fotosintético funcional es promovido por el tratamiento con bajas temperaturas, aunque no siempre un pretratamiento con frío reduce incidencia de albinismo. Q9+ Las condiciones de crecimiento de las plantas donantes: la edad y las condiciones ambientales en que crecen las plantas afectan considerablemente la capacidad androgénica de las mismas. Los factores ambientales más críticos son el fotoperíodo, la intensidad de luz, la temperatura, la nutrición y la concentración de CO29+>24$2+;'(4$."2+&#(&!&.M'#+ en la capacidad de producir las divisiones celulares morfogénicas que conducen al desarrollo de embrioides y la re0"#".'(&)#+!"+3/'#4'29+>24"+a/4&%$+3'2$+ es crítico dentro de todo el proceso, es altamente dependiente de la calidad del callo, y está asociado fuertemente a toda /'+A&24$.&'+3."8&'+!"/+(1/4&8$9+>#+0"#".'/*+ se ha informado que la utilización de an4".'2+!"+/'2+3.&%".'2+=$.'(&$#"2+;'8$."ce la respuesta androgénica, mientras 71"+/'2+($/"(4'!'2+'/+-#'/+!"+/'+"24'(&)#+ muestran una menor respuesta al cultivo, generando una menor cantidad de "%5.&$&!"29+>#+Brassica napus, el crecimiento de las plantas a bajas temperaturas mejora la producción de embrioides obtenidos a partir de anteras. 4. >/+"24'!$+!"+!"2'..$//$+!"+/'2+%&(.$23$ras: en la fase gametofítica de las plantas, que comienza luego de la meiosis, las microsporas sufren inicialmente una división mitótica asimétrica que da origen a dos células de distintos tamaños: la generativa (más pequeña y con un núcleo altamente condensado) y la vegetativa (más grande y con un núcleo difuso). >#+ /'2+ 0.'%M#"'2*+ "/+ #a(/"$+ 0"#".'4&8$+ se divide nuevamente originando dos núcleos espermáticos. Uno generará el endosperma triploide al fusionarse con

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 303

los dos núcleos polares del saco embrionario, mientras que el segundo fertilizará a la oósfera produciendo el cigoto diploide, que constituirá el primer paso de la nueva fase esporofítica. Los embrioides haploides se originan in-vitro a partir de una de las vías que se enuncian a continuación. Cuando la primera división mitótica de la micróspora es asimétrica, los haploides se originan por repetidas divisiones de la célula vegetativa, de la ge#".'4&8'+$+!"+'%5'29+>#+('%5&$*+(1'#!$+ la primera división mitótica es simétrica, ambas células resultantes contribuyen al desarrollo del haploide. Por lo tanto, una célula gamética masculina puede revertir su desarrollo gametofítico hacia el grano de polen y dar origen directamente a un #1"8$+&#!&8&!1$9+>#+0"#".'/*+/'2+%&(.$2poras que se encuentran en la primera división mitótica son las que mejor res3$#!"#9+>24$+8'.M'+/"8"%"#4"+($#+/'+"2pecie vegetal, pero esta reversión no es posible luego de iniciada la deposición !"+ '/%&!)#9+ >/+ "24'!M$+ %62+ '3.$3&'!$+ para los cereales es el de micróspora uninucleada media y tardía. \9+ Los pretratamientos: distintos tipos de estrés aplicados durante el estadío adecuado pueden enmascarar el programa gametofítico e inducir la expresión de 0"#"2+ "23"(M-($2+ !"/+ !"2'..$//$+ "23$.fítico. Si bien las bajas temperaturas son consideradas como el mejor pretratamiento, también otros pueden estimular la androgénesis, como el calor, el choque osmótico, la centrifugación de las anteras o hasta una incisión en la parte 213".&$.+ !"+ /'+ &#=$."2("#(&'+ !$#'#4"9+ También se citan la poda, la pulverización con etrel, la irradiación, la reducción en la presión atmosférica, la anaerobiosis, el tratamiento en una atmósfera saturada de agua y la aplicación de gametocidas. Las bajas temperaturas aplicadas sobre la planta madre, sobre las yemas =$.'/"2+P)8"#"2+$+2$5."+/'2+'#4".'2*+0"neralmente estimulan la embriogénesis. >/+;.M$+"24&%1/'+/'+!&8&2&)#+%&4)4&('+2&%#+(1'#4$+'+/$2+ reguladores de crecimiento, la mayoría de los cereales requiere de la presencia de auxinas y de citocininas en el medio de cultivo y las respuestas parecen depender de los niveles endógenos de tales reguladores. Por ejemplo, para lograr la inducción en trigo es indispensable el 12$+!"+K*fYL+"#+($#("#4.'(&$#"2+!"+B*\+ '+ K+ %0S/9+ >O&24"#+ $4.'2+ 2124'#(&'2+ 71"*+ adicionadas al medio de cultivo, ayudan en la estimulación de la androgénesis, como la glutamina y el inositol. También 2"+ (&4'#+ $4.$2+ ($%31"24$2+ &#"23"(M-cos como extracto de papa, de batata, de mandioca, de trigo germinado y de "#!$23".%'2+ !"+ '..$@+ ,+ !"+ %'M@9+ >#+ ocasiones, si el medio es suplementado con leche de coco los granos de polen desarrollan directamente en embrioides. b) Medios de regeneración: la variedad de medios de regeneración citada es menor cuando se la compara con la de los medios de inducción. Los más utili@'!$2+2$#+%$!&-('(&$#"2+!".&8'!'2+!"/+ medio MS, con concentraciones de carbohidratos similares a las utilizadas en los medios de cultivo de tejidos tradicio#'/"2+IQZ0S/+!"+2'('.$2'J*+14&/&@'#!$+'0'.+ IZ*D]J+($%$+0"/&-('#4"*+'1O&#'2+%"#$2+ poderosas, y un balance hormonal a favor de las citocininas 7. Las condiciones de incubación: las características ideales de cultivo son es3"(M-('2+3'.'+('!'+"23"(&"*+,+'a#+3'.'+ cada genotipo dentro de una misma es3"(&"9+ >24'2+ ';"(4'#+ 3'.4&(1/'.%"#4"+ /'+ 4'2'+!"+'52$.(&)#+-#'/+!"+#14.&"#4"2+,+/'+ regeneración de plantas verdes. La duración e intensidad lumínica, la temperatura y la orientación de las anteras sobre el medio de cultivo pueden tener un efecto considerable en algunas especies.

II. Cultivo de Microsporas: comprende la obtención de individuos haploides a partir de microsporas aisladas. Las espigas son pretratadas y las microsporas liberadas son colocadas en un medio de cultivo donde desarrollarán embriones haploides que serán luego transferidos a un medio de regeneración para originar 3/6#41/'2+ I-01.'+ \J9+ >24"+ 2&24"%'+ "2+ ($#2&!"rado el de mayor potencial para la producción de doblehaploides, debido a que induce a las %&/"2+ !"+ %&(.$23$.'2+ 71"+ ($#4&"#"+ 1#'+ =$.+ '+ dividirse y producir embriones. La ausencia de la pared de la antera podría mejorar la nutrición y eliminar las restricciones físicas para la '#!.$0/+!&'0.'%'+%1"24.'+/'2+!&;"."#4"2+"4'3'2+ del cultivo de anteras y de microsporas aisladas. Para el cultivo de anteras, las etapas requeridas a partir de anteras hasta la obtención de las plantas haploides pueden describirse como sigue: a) yema =$.'/+ 3."8&$+ '+ /'+ '#4"2&2*+ B5J+ '#4".'2*+ B(J+ '#4".'2+ en cultivo, 1d) y 1e) proliferación de las anteras, 1f) callo haploide, 1g) diferenciación de callo, h) planta haploide. Para el cultivo de microsporas aisladas: 'J+,"%'+=$.'/+3."8&$+'+/'+'#4"2&2*+Q5J+%&(.$23$.'2+ '&2/'!'2+!"+1#'+'#4".'*+Q(J+(1/4&8$+!"+%&(.$23$.'2*+ Q!J+"24'!$+%1/4
(/"'!$*+Q"J+,+Q;J+"%5.&)#+"#+!"sarrollo.

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4$."2+!"4".%&#'#4"2+!"+/'+"-(&"#(&'+!"/+%24'!&$+!"+/'2+%&(.$23$.'2?+($%$+2"+(&tara anteriormente para el cultivo de anteras, es imprescindible el chequeo del estadio correcto de las microsporas para que conserven su capacidad androgénica. \9+ Pretratamientos: los más utilizados consisten en el uso de frío, estrés osmótico, presencia o ausencia de determinados nutrientes, etc. Se ha demostrado que los nutrientes disponibles para las microsporas durante el pretratamiento constituyen un factor decisivo que determina la calidad de los embriones originados. D9+ Densidad de cultivo de las microsporas: la densidad de las microsporas en cultivo afecta el desarrollo de las mismas y el número de microsporas que entrarán en !&8&2&)#9+ >O&24"+ 1#'+ ($#("#4.'(&)#+ %M#&ma para el desarrollo de las microsporas, y una densidad óptima para una mayor regeneración. Las condiciones más favorables deben ser ajustadas en cada caso

y para cada genotipo en particular. 7. Medio de inducción: se han estudiado diferentes concentraciones de azúcares, distintas fuentes de nitrógeno orgánico, y la adición de diferentes de auxinas al %"!&$9+>#+0"#".'/+2"+210&"."+/'+2124&41ción de sacarosa por maltosa como fuente de carbohidratos, la disminución de la concentración de nitrato de amonio, el agregado de glutamina, y el empleo de APA (ácido fenil acético) como auxina para favorecer la inducción. 8. Medio de regeneración: la composición del medio de regeneración puede afectar el vigor y supervivencia de las plántulas. d'2A'+ "4 al. (2001), trabajando con cebada, encontraron en este método una %'#".'+ "-(&"#4"+ !"+ 3.$!1((&)#+ !"+ LN*+ con una mejor respuesta y una menor dependencia del genotipo que en el caso del cultivo de anteras. A esto se le suma la ventaja de contar con una elevada cantidad de microsporas haploides en un "24'!$+-2&$/)0&($+1#&;$.%"*+71"+($#24&41yen excelentes blancos para la mutagénesis, la selección y la transformación. !!!4+ ,&26&")(&*$+ !$%#6#0-#(:'()+ #+ !$%#6;#$/+4&"%3$+."71".&!$+3'.'+/'+."0"#".'(&)#+ de plantas es menor. Q9+ X'+"-(&"#(&'+"#+/'+."0"#".'(&)#+!"+3/'#tas parece ser mayor. La gran limitante de este sistema lo constituye el hecho de que la mayoría de los cultivares de trigo no pueden cruzarse con H. bulbosum debido a la presencia de los genes de incompatibilidad, Kr1 y Kr2, y al desconocimiento del estado de estos genes en los genotipos de trigo y de H. bulbosum involucrados en los cruzamientos, debido a que los genotipos se seleccionan en base a criterios agronómicos y no a un sistema de compatibilidad de cruzamien-

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tos con H. bulbosum. Para sortear estos inconvenientes, se ha sugerido como alternativa realizar los cruzamientos de trigo utilizando maíz como polinizador I-01.'+ DJ9+ X1"0$+ !"+ /'+ ;".4&/&@'(&)#+ !"/+ óvulo de trigo por el polen de maíz, durante las primeras mitosis del cigoto, los cromosomas del maíz son eliminados. >24$+2"+!"5"+'+1#'+&#($%3'4&5&/&!'!+"#tre los cinetocoros de estos cromosomas ,+/'2+-5.'2+!"+/$2+A12$2+'(.$%64&($2+71"+ hace que en las primeras anafases los cromosomas de maíz vayan quedando

."@'0'!$2+ "#+ "/+ (&4$3/'2%'*+ !$#!"+ -#'/%"#4"+ 2$#+ !"0.'!'!$29+ >/+ ."21/4'!$+ de este proceso es un embrión haploide de trigo. Seguidamente, los embriones inmaduros deben ser rescatados en un medio de cultivo apropiado. A través de las cruzas con maíz se han obtenido haploides de trigo de cultivares tanto compatibles como incompatibles con H. bulbosum, lo cual sugiere que el sistema de incompatibilidad no afecta al método de trigo x maíz, por lo que sería menos dependiente del genotipo.

Figura 6. Producción de haploides de Triticum aestivum por cruzamientos de trigo x maíz (Zea mayz). ImJ+>23&0'2+!"+4.&0$+($.4'!'2+"#+"/+('%3$+,+('24.'!'2+"#+"/+/'5$.'4$.&$9+IhJ+:/'#4'2+!"+%'M@+I!$#'#4"2+ de polen) crecidas en invernáculo. (C) Desgrane de espigas para realizar la desinfección de los granos y 3$24".&$.+."2('4"+!"+"%5.&$#"29+ILJ+E.'#$+($#+!$2+"%5.&$#"2+A'3/$&!"2+I3$/&"%5.&$#M'J9+I>J+>%5.&$#"2+ inmaduros rescatados y creciendo in-vitro9+IUJ+:/'#4'+.124&('!'9+IEJ+,+INJ+:/'#4'2+($#+QY\+%'($//$2+($#+ sus raíces sumergidas en solución de colchicina para la duplicación cromosómica. I. Plantas tratadas con colchicina y llevadas a macetas con tierra en cámara de crecimiento

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IV. Ginogénesis #%" +#+. en maíz: el empleo de líneas con elevada frecuencia de haploides como polinizadores motivó al desarrollo de la tecnología para la obtención de haploides maternos in-vivo9+ >24"+ A'//'@0$+ '5.&)+ #1"8'2+ posibilidades para el empleo de polinizadores seleccionados en función de su capacidad de incrementar las frecuencias de haploides. Líneas inductoras fueron desarrolladas a partir !"/+ 0".%$3/'2%'+ !"+ T4$(n+ D+ !"+ o"/"8'!'+ A'3/$&!M'p9+>/+%"('#&2%$+$/1(.'!$+"#+/'+0"#"ración de haploides estaría basado en la falta de fertilización de la oosfera durante la doble ;".4&/&@'(&)#9+>#+."/'(&)#+'+"24"+;"#)%"#$+2"+A'+ planteado la hipótesis en que se asume que las líneas inductoras de haploidía presentan dos células espermáticas con diferente velocidad !"+!"2'..$//$+I-01.'+gJ9 >/+%#4."+/'2+4#+ "/+ ('2$+ !"+ 1#'+ "23"cie autógama, como el trigo, es posible ganar generaciones haciendo dos cosechas en un año, especialmente en aquellos cultivares de ($.4$+(&(/$+8"0"4'4&8$9+>24$*+2&#+"%5'.0$*+!&-culta la observación de algunas características agronómicas importantes, que no pueden ser observadas en los genotipos en esas condicio#"2*+'4"#4'#!$+($#4.'+1#'+2"/"((&)#+"-(&"#4"9+ Para los trigos de tipo invernal y facultativos, con ligeros requerimientos de vernalización, esta ganancia de generaciones no es posible o es compleja. La producción de individuos

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doblehaploides que puedan participar anticipadamente en la etapa de evaluación agronómica se plantea como una solución promisoria a este problema, reduciendo los tiempos y presupuestos. Muchos interrogantes quedan aún sin resolver, limitando la aplicación extensiva de esta tecnología a algunos modernos programas de mejoramiento vegetal. Algunas preguntas a las que debemos encontrar respuestas son: >#+ 71"+ 0"#".'(&)#+ 2"0."0'#4"+ 2"+ '3/&('+ "/+ método de doblehaploides? ¿Cuál es el número de individuos doblehaploides derivados de un cruzamiento, representativo de la variabilidad gamética creada en la cruza, que permita un aprovechamiento integral, comparable al logrado con el método convencional de selección a campo? ¿Cómo superar la escasa cantidad de semilla producida? q>2+1#'+41('.3&'+ e9+N$.#*+`9+c"#2"#*+e9+t!"#5'(A*+t9+T(A&"!".+ (eds). W. De Gruyter, Berlin. pp. 217-229.

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III. CAPÍTULO 2

dades y el otorgamiento de nuevas patentes. >#+ /'+ '(41'/&!'!+ 2"+ !&23$#"+ !"+ 3'4.$#"2+ %$leculares varietales para una extensa lista de Aplicaciones de los marcadores "23"(&"29+ U."(1"#4"%"#4"*+ 1#+ 0.13$+ !"+ loci moleculares 3$/&%).-($2+ !"+ 1#+ %'.('!$.+ %$/"(1/'.*+ 4'/"2+ ($%$+%&(.$2'424'+ &!"#4&-('(&)#+ 2"+ A'+ 5'2'!$+ 4.'!&(&$#'/- en las líneas parentales, polinización cruzada mente en el uso de caracteres morfológicos y espontánea o mezcla de semillas durante la -2&$/)0&($29+L"2';$.41#'!'%"#4"*+/'+14&/&@'(&)#+ siembra, cosecha o embolsado. Los individuos de recursos genéticos de origen común en di- ;1".'+!"+4&3$+31"!"#+&!"#4&-('.2"+%"!&'#4"+"/+ patrón molecular. Del mismo modo, pueden ferentes programas de mejoramiento ha reduestablecerse las relaciones de descendencia (&!$+/'+"-(&"#(&'+!"+!&2(.&%&#'(&)#+3$.+%'.('entre una serie de líneas parentales y sus híbridores fenotípicos (descriptores), que si bien dos. Asimismo, la caracterización molecular de son importantes, presentan limitaciones (bajo líneas puras permite conocer el nivel de varia3$/&%$.-2%$*+ &#=1"#(&'+ '%5&"#4'/*+ !"3"#!"#bilidad genética presente en la colección, concia del estadio de desarrollo de planta, etc.). -.%'.+A$%$(&0$(&2*+3."(&2'.+/'+&!"#4&-('(&)#+,+ Como alternativa para resolver este problema, '2&24&.+ "#+ /'+ 3/'#&-('(&)#+ !"+ /$2+ (.1@'%&"#4$2+ los marcadores moleculares resultan de gran destinados a producir híbridos de característiutilidad por su número virtualmente ilimitado cas superiores. y por su habilidad para explorar variabilidad genética a nivel del ADN. WTbm+ IInternational Bancos de germoplasma Seed Testing Association) y UPOV (Union Pour >/+ 3.$("2$+ !"+ 2"/"((&)#+ 3'.'+ %"P$.'+ ,+ /'2+ La Protection Des Obtenions Vegétales) son prácticas de la agricultura moderna han geneentidades internacionales que han distribuido rado una pérdida notable de diversidad en la información para estandarizar los análisis de %',$.M'+ !"+ /'2+ "23"(&"2+ (1/4&8'!'29+ >/+ .""%/'5$.'4$.&$+3'.'+/'+&!"#4&-('(&)#+!"+(1/4&8'."2*+ plazo paulatino de las variedades primitivas y para reglamentar la utilización de diferencias por los nuevos cultivares de indudables ventamoleculares en la evaluación de homogenei- jas económicas ha producido una reducción en dad intra-varietal, la discriminación de varie- el número de genotipos que se cultivan. La ero-

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sión genética puede tener graves consecuencias para el cultivo, principalmente en relación ($#+ 21+ 81/#".'5&/&!'!+ 2'#&4'.&'9+ >24"+ 3.$("2$+ puede ser atenuado mediante la creación de bancos de germoplasma, que constituyen un componente vital de los programas de mejora. Las colecciones pueden mantenerse como bancos de semilla, a campo, in-vitro o criopre2".8'!'29+ >24'+ '(4&8&!'!+ 2"+ 81"/8"+ 3'.4&(1/'.mente relevante para el Continente Americano y el Caribe, que constituyen los centros de origen de cultivos importantes como maíz, poroto, cacao, papa, maní, pimiento, tomate, zapallo, además de numerosas medicinales, aromáticas, frutales y forestales. Los recursos genéticos de una especie cultivada comprenden: i) cultivares antiguos y de reciente obtención; ii) poblaciones locales mantenidas por los productores, “landraces”; iii) poblaciones silvestres de la misma especie o formas maleza; iv) especies relacionadas. Los marcadores moleculares permiten caracterizar accesiones cultivadas y silvestres, estudiar el proceso de domesticación, establecer ."/'(&$#"2+-/$0"#/+3.$("!&%&"#4$+($#2&24"+56sicamente en analizar los materiales mediante marcadores proteicos o de ADN, y calcular %"!&!'2+!"+!&8".2&!'!+I#&8"/+!"+3$/&%$.-2%$*+ riqueza alélica, presencia de alelos únicos) y !"+ 2&%&/&41!+ 0"##+($#4.'24"*+/$2+0"#"2+71"+($!&-('#+/$2+.'20$2+%$.;$/)0&($2+,S$+ agronómicos poseen un fuerte efecto fenotípico y han estado sometidos a intensas presiones de selección en las distintas etapas del mejoramiento. Por lo tanto, estos caracteres representan grupos de genes sometidos a diferentes fuerzas de cambio a lo largo del proceso de domesticación. Los marcadores moleculares combinados con datos morfológicos, agronómicos y de origen, conforman una base de

datos integral que permite describir la variación genética en colecciones de germoplasma. s"'%$2+ '/01#$2+ "P"%3/$29+ >#+ ('2$2+ ($%$+ el girasol (Helianthus annuus), originario de >24'!$2+ u#&!$2*+ "/+ '#6/&2&2+ !"+ !&8".2&!'!+ A'+ demostrado que el proceso de domesticación ha reducido considerablemente la base genética de los materiales cultivados en relación a las poblaciones silvestres. Por el contrario, en poroto (Phaseolus vulgaris) y olivo (Olea europea), las formas cultivadas conservan gran parte de la variabilidad presente en las poblaciones de los centros de origen en América y >1.$3'*+."23"(4&8'%"#4"9+X'+($%3'.'(&)#+"#tre los materiales silvestres y cultivados de una "23"(&"+3".%&4"+'!"%62+&!"#4&-('.+/$2+/10'."2+ de origen del cultivo, conocidos como centros de domesticación. Una vez que los recursos genéticos disponibles han sido caracterizados, es posible decidir cuáles serían los cruzamientos que más contribuirían a la expansión de la base genética. Aunque frecuentemente el proceso de domesticación involucra una pérdida importante de diversidad que es revelada por marcadores moleculares dispersos en el genoma, los cam5&$2+%62+2&0#&-('4&8$2+"#+"/+3'2$+!"+;$.%'2+2&/vestres a cultivadas pueden ser explicados por unos pocos genes. Por ejemplo, Dubcovsky y Dvorak (2007) describen un fenómeno llamado síndrome de domesticación, que es mayoritariamente adjudicado a genes que controlan la arquitectura morfológica de la espiga y el mecanismo de dispersión de las semillas. Uno de ellos es el gen Br (brittle raquis) que determi#'+1#+.'71&2+71"5.'!&@$+I'#("24.'/J+$+-.%"+!"+ la espiga; otro es el gen Tg (tenacious glume) 71"+!"4".%&#'+0/1%'2+-.%"%"#4"+'!A".&!'2+'/+ grano (ancestral) o granos desnudos y el tercero es el gen Q, que gobierna el libre desgrane de la semilla madura y la forma cuadrada de la "23&0'9+>/+'/"/$+q produce una espiga piramidal de raquis elongado (espeltoide) cuyas semillas no se desgranan fácilmente al madurar. La espiga del trigo moderno es la resultante de la combinación de los alelos br+I.'71&2+-.%"J*+tg (grano desnudo) y Q, que generan una espiga cuadrada, que permite el libre desgrane de la semilla madura desnuda, facilitándose enormemente la cosecha del grano.

312 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

mente importantes, en comparación con los mapas obtenidos mediante el uso de marcadores morfológicos o isoenzimáticos. Consecuentemente, cuanto mayor sea el número de marcadores incorporados a un mapa genético mayor será su capacidad de resolución y utilidad como marco de referencia para incorporar genes asociados a características de interés económico. Para incorporar un carácter de interés agronómico en un mapa genético es necesario cumplir con las siguientes etapas: 1. Desarrollar una población segregante Mapas Genéticos para el carácter agronómico en cuestión. Un mapa genético de una especie animal o 2. Caracterizar la población segregante vegetal muestra la distribución lineal de marutilizando marcadores moleculares policadores en cada uno de los cromosomas que %).-($2+ I($#+ !&;"."#(&'2+ "#+ /'+ 2"(1"#($#24&41,"#+"/+0"#$%'+!"+1#+$.0'#&2%$9+>24"+ cia de ADN entre los parentales). Para mapa esta basado en el concepto clásico de construir un mapa mínimo es deseable ligamiento: si dos o más genes o marcadores disponer de al menos cuatro marcadores están físicamente cercanos sobre el mismo cromoleculares por cada cromosoma del mosoma, sus alelos se transmiten usualmente genoma en estudio. juntos a través de la meiosis. Las proporciones Q9+ >8'/1'.+;"#$4M3&('%"#4"+"/+('.6(4".+'0.$en que estos genes segregan en una poblanómico sobre los individuos de la población se apartan de las esperadas bajo la ley de (&)#+ 2"0."0'#4"9+ >24"+ 31#4$+ "2+ (.1(&'/*+ segregación independiente. La mayor parte de ya que si la evaluación del carácter en los gametos contendrán las mismas combinala población de mapeo no es precisa, el ciones alélicas que los padres; sólo aquellos mapeo del carácter será erróneo o irreameiocitos que experimenten un intercambio lizable. entre cromátides no hermanas o crossover ge4. W!"#4&-('.+%'.('!$."2+/&0'!$2+'/+('.6(4".+ nerarán gametos con combinaciones alélicas agronómico en cuestión (co-segregación diferentes de las parentales (recombinantes). entre fenotipo del carácter y fenotipo del >/+;1#!'%"#4$+!"/+%'3"$+0"##+/$2+a/4&%$2+'k$2+A'+($%"#@'!$+'+12'.2"+ una nueva estrategia de mapeo denominada mapeo por asociación, que utiliza el concep4$+!"+!"2"71&/&5.&$+!"+/&0'%&"#4$+IXLJ*+!"-#&!$+ como la asociación no al azar de alelos de diferentes loci. La hipótesis de base considera que en poblaciones grandes, con apareamientos al azar (panmixis), con los loci segregando independientemente y en ausencia de selección, mutación, o migración, los loci+ 3$/&%).-($2+ están en equilibrio: la frecuencia de un cierto haplotipo depende del producto de las frecuen(&'2+'/#+ 4#+ "/+ 3.&%".+ ('2$*+ /'+ "24.'tegia se basa en focalizar el análisis sobre el gen de interés en una población segregante mediante el uso de marcadores previamente desarrollados sobre porciones de secuencias de dicho gen, o con marcadores localizados en las regiones adyacentes que se encuentren ligados al carácter en cuestión. >/+2"01#!$+('2$+ tiene que ver con que la transferencia de genes de interés se realiza comúnmente mediante cruzas amplias, que requieren luego del cruzamiento inicial, una serie de retrocruzas hacia el 3'."#4'/+"/&4"+$+."(1.."#4"9+>/+3.$!1(4$+-#'/+"2+ un material que posee el fondo genético original con la nueva característica incorporada. >#+ este caso, la estrategia se basa en un análisis más amplio de la población segregante, ya que el uso de marcadores no sólo se aplicará para /'+&!"#4&-('(&)#+!"/+0"#+'2$(&'!$+'+/'+('.'(4"rística de interés, sino que también se carac4".&@'.6#+$4.'2+."0&$#"2+!"/+0"#$%'2*+'+-#+!"+ &!"#4&-('.+'712+"23"rable que esta limitante se vaya superando con el tiempo por el permanente avance tecnoló0&($9+ >#+ "24"+ 2"#4&!$+ "/+ '%3/&$+ !"2'..$//$+ !"+ %'.('!$."2+ 5'2'!$2+ "#+ '%3/&-(&'(&)#+ ITTV2+ iSimple Sequence RepeatsY*+ TH:2+ iSingle Nucleotide Polymorphisms-) ha permitido sim3/&-('.+ /'2+ %"4$!$/$0M'2+ '+ '3/&('.*+ "#+ ($%paración con aquellos marcadores basados "#+ A&5.&!'(&)#+ IVUX:2+ i52$6'.-6.*/" 4'&(12/6" Length Polymorphism-, por ejemplo), reducien!$+($24$2+,+4'%5&#+0"#".'/*+'/+($%3'.'.+%'3'2+0"#24'+2"#&'+2"+8'+3".!&"#!$+'+ medida que se comparan especies más aleja!'2+ -/$0"#/+ (/$#'!$+ 3$2&(&$#'/+ ($#2&24"+ "#+ "/+ '&2/'miento de un gen responsable de un carácter particular a partir del conocimiento de su /$('/&@'(&)#+ "#+ "/+ 0"#$%'9+ >/+ 3.$("2$+ 14&/&@'+ información genética (modo de herencia del carácter y ubicación del gen/es en una región "23"(M-('+!"+1#+%'3'J*+%$/"(1/'.+I2"(1"#(&'+ nucleotídica de aquellos genes presentes en la región cromosómica asociada con el carácter), y de función o expresión de los genes. >/+3.&%".+3'2$+3'.'+/$0.'.+"24$+"2+2"/"((&$nar parentales que sean contrastantes para el carácter vinculado al gen en cuestión, por ejemplo, una variedad de trigo susceptible y otra resistente a la roya de la hoja. Una vez seleccionados los parentales se desarrolla una población segregante, la más sencilla es una

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 317

UK*+ '+ 3'.4&.+ !"+ /'+ (1'/+ 2"+ ($#24.1,"+ 1#+ mapa genético utilizando marcadores moleculares, ,+2$5."+"24"+%'.($+2"+&!"#4&-('#+/'2+."0&$#"2+ cromosómicas asociadas al control de dicha resistencia. u#'+ 8"@+ &!"#4&-('!'+ !&(A'+ ."0&)#*+ 3'.'+ avanzar hacia el clonado posicional, es necesario mejorar el grado de resolución del mapa "#+ "2'+ @$#'9+ >24$+ 2"+ /$0.'+ 2'41.'#!$+ !&(A'+ región con nuevos marcadores moleculares e incrementando el número de individuos de la 3$5/'(&)#*+'+-#+'1%"#4'.+/'2+3$2&5&/&!'!"2+!"+ encontrar recombinantes entre marcadores es4."(A'%"#4"+ /&0'!$29+ >/+ $5P"4&8$+ "2+ ."!1(&.+ "/+ intervalo del genoma analizado al fragmento mínimo posible que contenga al gen de interés. Muchos de estos marcadores pueden obtenerse del mapeo comparativo en regiones cromosómicas ortólogas de especies emparentadas ($#+0"#$%'2+%"#$2+($%3/"P$29+>#+"/+('2$+!"+ trigo, serían arroz, cebada, sorgo, Triticum monococcum, Triticum tauschii, etc. Una vez reducido al mínimo el intervalo de genoma portador del gen de interés, el paso siguiente es obtener la secuencia nucleotídica del mismo. Una forma de hacerlo es mediante una caminata cromosómica, para lo cual es necesario contar con un mapa físico (secuencia nucleotídica) de la región. Para el ejemplo que estamos considerando, la caminata se inicia seleccionando de una "biblioteca" del genoma de trigo (BAC library) aquellos clones (tomos) 71"+ A&5.&!"#+ ($#+ /$2+ %'.('!$."2+ 71"+ ='#quean al intervalo portador del gen. Los clones seleccionados en la hibridación contra la biblioteca son digeridos con enzimas de restric(&)#+3'.'+&!"#4&-('.+"#+('!'+('2$+;.'0%"#4$2+ compartidos y no compartidos. Se estima que los clones seleccionados con un mismo marcador deben tener en común al menos un fragmento de digestión (el fragmento que posee la secuencia del marcador). Los fragmentos no compartidos corresponden a los extremos de estos clones parcialmente solapados entre sí. >24$2+"O4."%$2+2"+14&/&@'#+($%$+#1"8$2+%'.cadores para extender la caminata cromosómica hacia el gen, reiniciando la búsqueda de (/$#"2+"#+/'+5&5/&$4"('+0"#)%&('9+>24"+3.$("2$+ se hace simultáneamente en ambos sentidos, hasta lograr que el mapa físico (secuencia nu-

cleotídica) que se ha iniciado desde cada mar('!$.+='#71"'#4"+;$.%"+1#+($#4
$+$+xcontig" !"+;.'0%"#4$2+!"+mLH+0"#)%&($+!"+4.&0$9+>24"+ contig contiene la secuencia del gen en estu!&$9+ >/+ 3'2$+ 2&01&"#4"+ ($#2&24"+ "#+ /'+ 2"(1"#ciación del contig. A partir de esta información, y por análisis de secuencia con herramientas bioinformáticas, se determinan los genes presentes y aquellos posibles candidatos del ca.6(4".+"#+"241!&$9+X'+3.1"5'+!"-#&4&8'+3'.'+"2tablecer el hallazgo del gen en cuestión es la 3.1"5'+!"+($%3/"%"#4'(&)#9+>24$+($#2&24"+"#+ transformar una planta que carece del carácter en estudio (siguiendo con el ejemplo, una variedad de trigo susceptible) con cada uno de los genes candidatos y determinar cual de ellos /"+($#-"."+"/+('.6(4".+I"#+"24"+('2$+."2&24"#(&'+ al patógeno). A partir de la secuenciación completa del genoma de arroz es posible obtener una primera estimación de los genes presentes en nuestro contig, con algunas salvedades, como son la 3."2"#(&'+!"+0"#"2+"23"(M-($2+!"+'..$@+I71"+ no estarán en el contig de trigo) y trigo (que no estarán en el genoma de arroz), ruptura de la colinearidad de genes entre genomas por rearreglos cromosómicos, etc. Como ejemplo, en el clonado posicional del gen Vrn-1 en Triticum monococcum se utilizó una población de QZC\+ &#!&8&!1$2+ UK*+ 3'.'+ //"0'.+ '+ !"/&%&4'.+ 1#+ ".8'/$+!"+Z*Zf+(F+"#+"/+(.$%$2$%'+\mm que contenía dos genes candidatos. Posteriormente, mediante estudios de expresión de estos genes se observó que sólo uno de ellos (Ap1) presentaba un patrón de expresión idéntico al gen Vrn-1. Para llegar a esto se trabajó con marcadores provenientes de las bibliotecas de los genomas de cebada, sorgo, arroz y Triticum monococcum I-01.'+KJ9 Distribución de la variabilidad genética en poblaciones naturales y conservación Las especies están constituidas por unidades o demos más o menos aislados denominados poblaciones. Una especie vegetal raramente se extiende en forma continua e ininterrumpida. >#+0"#".'/+'!$34'+1#'+!&24.&51(&)#+"#+3'.(A"29+ >/+#a%".$+!"+&#!&8&!1$2+"#+('!'+3$5/'(&)#*+"/+ modo reproductivo (autogamia-alogamia), las distancias inter-demos, el tipo de polinización

318 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

I0.'8"!'!Y'#"%)-/'Y"#4$%)-/'J*+/'+'((&)#+!"/+ hombre en la fragmentación del hábitat y el origen (especies nativas-especies introducidas) determinan en conjunto una distribución de la variación genética propia de cada especie. Los programas de conservación utilizan a menudo información acerca de la distribución de la variación genética para establecer prioridades y estrategias de manejo. Las variaciones dentro y entre poblaciones colaboran en /'+!"-#&(&)#+!"+/'2+1#&!'!"2+'+($#2".8'.+,+2"+ convierten en elementos importantes para la toma de decisiones relacionadas con la protec(&)#+ !"+ /'+ 5&$!&8".2&!'!9+ >2+ !"2"'5/"+ 71"+ /'2+ poblaciones seleccionadas para formar parte de las áreas protegidas, contengan la mayor diversidad genética posible de modo de asegurar el mayor potencial evolutivo. A partir de marcadores codominantes como las isoenzimas y microsatélites, pueden obtenerse parámetros de diversidad: P, número de loci+ 3$/&%).-($2S#a%".$+ 4$4'/+ !"+ loci analizados; A, número promedio de alelos por locus; Ho, heterocigocidad observada; y He, hetero(&0$(&!'!+"23".'!'+IBY+y3i2, pi: frecuencia alélica del alelo i). Dado que los genotipos homo y heterocigotos pueden ser reconocidos, es posible probar si la población se encuentra en equilibrio de Hardy Weinberg. Con los datos de frecuencias alélicas disponibles se calculan índices tales como Nei, Rogers, o Prevosti y se construyen matrices de distancia genética (D), a partir de las cuales es posible realizar análisis de agrupamientos que permiten visualizar las semejanzas o diferencias genéticas entre poblaciones. >#+"/+('2$+!"+%'.('!$."2+dominantes como los RAPD (5&/3*1" #1%0.,-&6.*/" *+" 7*081*'phic DNAJ+$+mUX:+I#1%0.,23"4'&(12/6"92/(th Polymorphism) el genotipo heterocigoto no puede ser reconocido y se asume para una especie diploide que cada banda corresponde '+ 1#+ /$(12+ ($#+ !$2+ '/"/$2*+m+ ,+ '9+ >/+ A$%$(&goto dominante (AA) y el heterocigoto (Aa) corresponden a la presencia de la banda y la ausencia corresponde al homocigoto recesivo (aa). Los parámetros de diversidad pueden ser

estimados: P de la misma manera que para marcadores codominantes; A es dos, por de-#&(&)#w+2)/$+"2+3$2&5/"+('/(1/'.+N"+'+3'.4&.+!"+ las frecuencias alélicas estimadas, asumien!$+ "71&/&5.&$9+ >#4$#("2+ + q = q 2 donde q es la frecuencia del alelo a y q2 la frecuencia de individuos con ausencia de banda; luego p = B+ i7+ 2&"#!$+ p la frecuencia del alelo A. Con estos datos, para calcular la He se procede de la misma manera que para marcadores codominantes. >/+ "241!&$+ !"+ 8'.&'5&/&!'!+ ($#+ %'.('!$."2+ dominantes no permite determinar si una población está o no en equilibrio de Hardy Weinberg. Las diferencias genéticas entre poblaciones pueden igualmente ser estimadas con métodos que no utilizan frecuencias alélicas y que por lo tanto no asumen equilibrio. Uno de estos métodos se basa en el cálculo de distancias binarias entre pares de individuos, que consideran la proporción de bandas comparti!'29+ >/+ 3'2$+ 2&01&"#4"+ ($%3."#!"+ 1#+ '#6/&2&2+ de la varianza molecular (AMOVA) que permite particionar esta varianza en sus componentes dentro y entre poblaciones a diferentes nive/"29+>/+3.$0.'%'+E"#m/>O+!&23$#&5/"+"#+http:// GGG9'#19"!19'1Sh$z$SE"#m/>OS, permite realizar AMOVA y otros análisis de variabilidad, distancia genética y correlaciones a partir de datos moleculares. Posee un sólido soporte teórico, es de acceso libre y de fácil manejo dado que se agrega a la barra de herramientas t;-("+>O("/9+ >/+ 2&01&"#4"+ "2+ 1#+ "P"%3/$+ 2&%3/&-('!$+ !"+ uso de este programa. Paso 1) Confección de la tabla de datos en ;$.%'4$+3'.'+E"#m/>O+($#4"#&"#!$+."0&24.$+!"+ marcadores RAPD de dos poblaciones vegetales. - Número de loci RAPD: 11 (A1) - Número de individuos totales: 10 (B1) - Número de poblaciones: 2 (C1) Y+Ha%".$+!"+&#!&8&!1$2+!"+/'+3$5/'(&)#+m?+\ (D1) Y+Ha%".$+!"+&#!&8&!1$2+!"+/'+3$5/'(&)#+h?+\ II>BJ

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 319

A 11

B 10

3

ind

pob

4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

A A A A A B B B B B

1 2

C 2

D 5

E 5

F

G

H

I

J

K

L

M

N

P2 240 P2 260 P2 330 P2 400 P2 440 P6 520 P6 550 P6 590 P6 650 P6 660 P6 800

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

1 1 1 1 1 0 0 1 1 0

1 1 1 1 1 0 0 1 1 0

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

0 1 1 1 1 0 1 1 0 1

1 0 1 0 1 0 0 0 0 0

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

1 1 0 1 0 1 1 1 1 1

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

0 1 1 0 1 1 1 1 1 1

1 1 1 1 1 0 1 0 1 1

Paso 2) Cálculo de las distancias binarias entre individuos. E"#m/>O++⇒ Distance ⇒ Genetic (binary) ⇒+++td A 1 2 3

4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

B

D E 2 5 5 Hoja1 Binary D Pop1 Pop2 1 2 3 4 5 0 3 0 3 2 0 2 1 3 0 3 2 0 3 0 5 4 6 5 6 5 2 4 3 4 4 1 3 2 3 2 1 3 2 3 5 2 4 3 4 1

C

F

10

G

H

1

10

6

7

0 2 3 3 2

0 3 3 0

I 8

0 2 3

J 9

0 3

K

L

10

0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

:'2$+QJ+m+3'.4&.+!"+/'+%'4.&@+!"+!&24'#(&'+2"+."'/&@'+"/+'#6/&2&2+!"+8'.&'#@'+%$/"(1/'.+ E"#m/>O+++⇒ AMOVA (tri or square distance matrix; 999 permutations) ⇒+++++td+ Percentages of Molecular Variance Among Pops 33%

Within Pops 67%

Summary AMOVA Table --------------------------------------------------Source df SS MS Est. Var. % --------------------------------------------------Among Pops 1 4,00 4,00 0,57 33% Within Pops 8 9,20 1,15 1,15 67% Total 9 13,20 1,72 100% --------------------------------------------------Stat Value P (rand >= data) PhiPT 0,331 0,020

Del análisis se concluye que la diferenciación molecular entre las poblaciones representa un QQ+]+!"+/'+8'.&'#@'+4$4'/*+,+71"+"2'+!&;"."#(&'+ "2+2&0#&-('4&8'+I3{+Z*ZKJ9 X'+ !&8".2&!'!+ 0"#/+ "241!&$+ !"+ marcadores moleculares en diferentes plantas de una población y su progenie ha contribuido a determinar el tipo de reproducción de numerosas especies vegetales ?0%&9)(&*$+"#.+@7A/+;/+ =1P$+ 08'/1'#!$+3$5/'(&$#"2+'+!&24'#(&'2+ crecientes desde una determinada fuente de 3$/"#*+"/+=1P$+024'5/"(".+(16/+"2+"/+ árbol correcto entre todos los posibles es una tarea difícil que en parte es resuelta mediante el uso de métodos estadísticos, como técnicas de re-muestreo, que generan índices de ($#2&24"#(&'+ $+ ($#-'5&/&!'!+ 3'.'+ ('!'+ 6.5$/9+ Las relaciones establecidas de este modo se ($4"P'#+/1"0$+"#+."/'(&)#+'+/'2+8M'2+-/$0"#/+%$!$+"#+71"+2"0."0'+1#+%'.('!$.+($!$%&dado que están basados en reacciones de hi- #'#4"+"#+1#'+3.$0"#&"+"."23"(M-('*+3".%&4"+ bridización, lo que garantiza la homología de inferir el comportamiento disómico o polisómilos segmentos que se comparan entre los di- co, lo que permite caracterizar una especie en ferentes taxa. RAPDs no requiere un conoci- cuanto a su origen alo- o autopoliploide, resmiento previo del genoma en estudio y puede pectivamente.

322 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

>#+/'+"8$/1(&)#+!"/+024'+&#;$.%'(&)#+."21/4'+!"+0.'#+ aplicación en el mejoramiento de estos cultivos así como en la comprensión de la evolución de los genomas. >#+ /$2+ a/4&%$2+ 'k$2*+ A'+ 4$%'!$+ 0.'#+ &%3$.4'#(&'+ /'+ -/$0"#&'+ 5'2'!'+ "#+ !'4$2+ !"+ 2"cuencias de ADN, en la que cada base de un grupo de secuencias alineadas, constituye un carácter a comparar. La velocidad de cambio !"/+mLH+'+/$+/'.0$+!"/+3.$("2$+"8$/14&8$+!&-"re en las distintas porciones de un genoma, encontrándose algunas secuencias altamente conservadas y otras con elevadas tasas de sustitución. Si los taxones a comparar han divergido recientemente, será conveniente utilizar secuencias altamente variables, que hayan "O3".&%"#4'!$+ 21-(&"#4"2+ ('%5&$2+ "#+ ($.4$2+ períodos de evolución. Por el contrario, si las especies a comparar llevan mayores tiempos de divergencia (especies poco relacionadas) deben utilizarse secuencias más estables, con menores tasas de sustitución. Por otro lado, la existencia de genomas nucleares, mitocondriales y plastídicos que evolucionan a tasas espe(M-('2*+ ."3."2"#4'#+ A"..'%&"#4'2+ '!&(&$#'/"2+ 3'.'+"241!&'.+/'2+."/'(&$#"2+-/$0"#9+BCCQ9+Vm:L+8'.&'4&$#+G&4A&#+'#!+'%$#0+#'41.'/+3$31/'4&$#2+$;+$14crossing buffalograss Buchloe dactyloides (Nutt) >#0"/%9+ bA"$."4&('/+ '#!+ m33/&"!+ E"#"4&(2*+ lD*+ CKgYCQf9 W#4".#'4&$#'/+ V&("+ E"#$%"+ T"71"#(�+ :.$P"(4 KZZ\9+ bA"+ %'3Y5'2"!+ 2"71"#("+ $;+ 4A"+ .&("+ 0"#$%"9+H'41."*+fQD*+gCQYlZZ9 F'#&;"24$+F9F9*+T(A/'44".+m9V9*+N$33+N9>9*+T16."@+ >9_9*+ '#!+ L15($82n,+ c9+ KZZB9+ }1'#4&4'4&8"+ "8'/1'4&$#+ $;+ 0"#"4&(+ !&8".2&4,+ &#+ GA"'4+ 0".%3/'2%+ 12�+%$/"(1/'.+%'.n".2*+`.$3+T(&"#("*+fB*+DlKY DCZ9 Moore G. 2001. Oranges and lemons: clues to the taxonomy of Citrus from molecular markers. b."#!2+&#+E"#"4&(2*+Bg*+\QDY\fZ9 Paterson A, Tanksley S, Sorrells M. 1991. DNA markers in plant improvment. Advances in Agron$%,9+fD*+QCYCZ9

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 323

:"'n'//+V*+T%$12"+:9>9+KZZD9+E"#m/>O+D?+E"#"4&(+ '#'/,2&2+&#+>O("/9+:$31/'4&$#+0"#"4&(+2$;4G'."+;$.+ 4"'(A�+'#!+."2"'.(A9+F$/"(1/'.+>($/$0,+H$4"2*+ D*+KllYKC\9 Rieseberg L, Seiler G, 1990. Molecular evidence and the origin and development of the domesti('4"!+ 21#=$G".+ IHelianthus annuus, Asterace'"J9+>($#$%&(+h$4'#,*+ff*+gCYCB9 TA"..,+ m9+ U/YE'.(&'*+ c";;.,+ F9+ bA$.#25"..,+ '#!+ >!G'.!+T9+h1(n/".+Ws9+KZZQ9+T4.1(41."+$;+/&#n'0"+ disequilibrium in plants. Annu. Rev. Plant Biol., \f*+Q\gigf9 T$/4&2+ >*+ T$/4&2+ :9+ KZZZ9+ `$#4.&514&$#+ $;+ 3/'#4+ %$lecular systematics to studies of molecular evolu4&$#9+:/'#4+F$/"(1/'.+h&$/$0,*+fK*+f\Yg\9 T4"&#*+Hw+`9+U"1&//"4*+b9+e&(n".*+>9+T(A/'0"#A'1;*+'#!+ h9+ d"//".9+ KZZZ9+ T150"#$%"+ (A.$%$2$%"+ G'/n�+&#+GA"'4?+m+f\ZYn5+3A,2&('/+($#4&0+&#+b.&4&(1%+ monococcum L. spans the Lr10 resistance locus &#+ A"O'3/$&!+ GA"'4+ Ib.&4&(1%+ '"24&81%+ X9J9+ :.$(9+ H'4/9+m('!9+T(&9+uTm9*+Cg+IKfJ*+BQfQDiBQffB9 b$A%"+ c*+ E$#@'/"@+ L*+ h""5"+ T*+ L171"+ F9+ BCCD9+ mUX:+'/'/,2&2+$;+0"#"+3$$/2+$;+'+G&/!+5"'#+($."+ ($//"(4&$#9+`.$3+T(&9*+QD*+BQg\YBQlf9 Yan, L., Loukoianov, A., Tranquilli, G., Helguera, M., U'A&%'*+ b9+ '#!+ c9+ L15($82n,+ KZZQ9+ :$2&4&$#'/+ (/$#�+$;+GA"'4+8".#'/&@'4&$#+0"#"+sVHB9+:.$(9+ H'4/9+m('!+T(&9+uTm*+BZZ*+DKDQYDKDl9+

324 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

III. CAPÍTULO 3 Marcadores moleculares y mejoramiento genético de cultivos `'./$2+T'/'w+F'.&'#$+h1/$2w+m#'/&'+U."2($w+ >%&/&'#$+m/4&".&+

Introducción >/+%"P$.'%&"#4$+0"#/+ 3.$("2$+ ;1#!'%"#4'/+ 71"+ 215,'("+ "#+ el mejoramiento es el de cambio adaptativo por sustitución alélica bajo selección. La mutación, /'+A&5.&!'(&)#+"."23"(M-('+,+/'+4.'#20#+"/+"O4."%$*+

1#+3.$0.'%'+71"+('."("+!"+8'.&'5&/&!'!+I~2A v+ 0) no tendrá posibilidad de generar nuevos genotipos por recombinación y selección por lo que su progreso genético se verá severamente !&2%
&!$+IE,+v+ZJ9+:$.+$4.'+3'.4"*+"/+3.$0."so por selección es inversamente proporcional al número de años que se tarda en completar un ciclo de selección (y) y al desvío fenotípico I~PJ9+ >/+ !"28M$+ ;"#$4M3&($+ ."="P'+ 562&('%"#4"+ el grado de interacción entre el genotipo y el '%5&"#4"+ 3'.'+ "O3."2'.+ 1#+ !'!$+ ;"#$4&3$9+ >#+ otras palabras, es una medida de la correlación existente entre genotipo y fenotipo. Consideremos un determinado carácter (por ejemplo, la resistencia a una enfermedad) el cual está gobernado por un solo gen con dos alelos, el alelo de resistencia es incompletamente dominante, el patógeno está siempre presente y las condiciones ambientales para que se produzca la infección son siempre favorables. Por lo tanto, si se observa una planta sin síntomas puede concluirse que la misma "2+A$%$(&0$4'+3'.'+"/+'/"/$+!"+."2&24"#(&'9+>#+ forma similar, si se observa una planta muy afectada por la enfermedad se concluirá que la planta es homocigota para el alelo que con-"."+ 212("34&5&/&!'!*+ ,+ 4$!'2+ /'2+ 3/'#4'2+ 71"+ muestren fenotipos intermedios podrían consi!".'.2"+ A"4".$(&0$4'29+ >#+ "24"+ ('2$+ &!"'/*+ "/+ fenotipo estaría indicando exactamente cuál es el genotipo de cada individuo, la correlación entre fenotipo y genotipo tendería a 1 y el desvío fenotípico tendería a cero. Bajo esas condiciones el progreso genético por elección sería máximo. Lamentablemente, en la práctica este tipo de ejemplo jamás ocurre. Los caracteres de importancia económica no siempre están gobernados por un único gen, sino por varios, y las relaciones de dominancia y de epistasis (interacción entre genes) suelen ser bastante complicadas. Asimismo, el patógeno puede o no estar presente, y el ambiente puede o no ser favorable para el desarrollo de la enfermedad. Por todas esas razones, la asociación entre fenotipo y genotipo es en general escasa, lo que hace que al evaluar individuos a través de su fenotipo no se esté seleccionando el genotipo adecuado y la recombinación incluirá muchas cruzas entre individuos que no portan "/S/$2+0"#S"2+!"2"'!$29+>/+."21/4'!$+"2+71"+"/+

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 325

incremento de los alelos favorables dentro de la población se hace a tasas más lentas y, por ende, el progreso genético es mucho menor. La tecnología de marcadores moleculares se 31"!"+'3/&('.+3'.'+$34&%&@'.+$+A'(".+%62+"-ciente todos y cada uno de los factores determinantes de la ganancia genética o del progreso genético por selección. Así, los marcadores moleculares pueden utilizarse para: Organizar, mantener e incrementar la diversidad genética. De este modo se verá incrementado el numerador de la ecuación y, por ende, el progreso genético. Disminuir la interacción genotipo/ambiente. Si en lugar de seleccionar por el fenotipo se seleccionara por el genotipo de cada individuo, tendería a disminuir drásticamente el denominador de la ecuación de ganancia genética, con el consiguiente incremento del progreso 3$.+2"/"((&)#9+>24"+4&3$+!"+2"/"((&)#+2"+!"#$mina “selección asistida por marcadores moleculares” o, simplemente, “selección asistida”. Disminuir el tiempo requerido para completar los ciclos de selección. Si para incorporar un carácter dentro del germoplasma del cultivo 2"+ 4'.!'+ 121'/%"#4"+ D+ '+ g+ 0"#".'(&$#"2*+ /$2+ marcadores moleculares permiten acortar esos 3/'@$2+'+Q+0"#".'(&$#"2*+3$.+/$+71"+"/+3.$0."2$+ genético se verá incrementado. Adicionalmente, los marcadores permiten la introgresión de tales caracteres con un mínimo de incorporación de genes provenientes del individuo dador, garantizando de ese modo, que no se reduzcan las medias poblacionales para aquellos caracteres que no están relacionados con el 0"#+.$!1(&!$9+>24"+4&3$+!"+%/+mLH+ $54"#&!$+ "2+ 14&/&@'!$+ ($%$+ %$/!"+3'.'+."'/&@'.+"/+3.$("2$+!"+'%3/&-('(&)#+3$.+ PCR del marcador elegido. Los fragmentos obtenidos para cada individuo son resueltos mediante electroforesis. Los resultados son leídos e interpretados para decidir la selección de los individuos que presenten el alelo de interés. Actualmente, una o más etapas de este proceso pueden ser automatizadas.

y varios descendientes de la primera retrocuza con el padre resistente. Tales descendientes muestran el fragmento que indica la presencia del gen de resistencia, o bien, ambos fragmentos, lo que indica que son heterocigóticos para el gen de resistencia. >O&24"#+ '/01#$2+ '23"(4$2+ &%3$.4'#4"2+ 71"+ deben considerarse para la implementación de la selección asistida por un carácter en 1#+ 3.$0.'%'+ !"+ %"P$.'9+ >//$2+ 2$#?+ 'J+ "/+ 4&3$+ de marcador elegido; b) la distancia genética entre el marcador y el gen de interés; c) la/s fuente/s posible/s para el carácter o gen de interés. Respecto del primer punto, cuando se practica selección asistida por marcadores es necesario evaluar cientos o miles de plantas en ;$.%'+"-(&"#4"+,+"//$+!"4".%&#'+/'+"/"((&)#+!"+ los mismos. Cierto tipo de marcadores (como por ejemplo aquellos basados en la hibridación !"/+mLH*+($%$+/$2+VUX:2J+#$+2"+'!'34'#+5&"#+

'+"24"+-#+!'!$+71"+2$#+4#+0"#".'/*+/$2+%'.('!$."2+5'2'!$2+ en PCR son los más indicados para este tipo de aplicación. Por esta razón, en muchas opor41#&!'!"2+2"+($#8&".4"#+%'.('!$."2+VUX:2+"#+ marcadores basados en PCR. Dentro de los marcadores basados en PCR, los marcadores %1/4&31#4$+ I($%$+ /$2+mUX:2+ i#1%0.,23" 4'&(ment Length PolymorphismY*+Vm:L2+iRamdon #1%0.,-&6.*/" *+" 7*081*'%:.-" ;24'+ a/4&%'+ !&-(1/4'!+ 2"+ ."21"/8"+ !&2"k'#!$+ marcadores SCAR (Sequence Characterized #1%0.,23" 52(.*/) a partir del fragmento po/&%).-($+ 71"+ "246+ '2$(&'!$+ '/+ 0"#+ $+ ('.6(4".+ !"+".#+"2$2+('2$2*+ posteriormente se deberá determinar si cada individuo es o no homocigótico mediante análisis de la descendencia de cada planta. Para solucionar este inconveniente lo que se hace es diseñar un marcador CAPs (Cleaved Am%0.,23" 7*081*'%:.-" =2>)2/-2) o bien utilizar /'+4/+2"01#!$+ punto importante se relaciona con la distancia genética existente entre el marcador molecu/'.+ ,+ "/+ 0"#+ !"+ ".#+3.&%".+/10'.*+2"+!"5"+

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 327

tratar de saturar la región de interés con un mayor número de marcadores para hallar uno que esté más cercano al gen. Si ello no fuera posible o los nuevos marcadores hallados no se "#(1"#4."#+21-(&"#4"%"#4"+(".('#$2+'/+0"#+!"+ interés, se puede optar por utilizar dos marcadores -uno por “encima” y otro por “debajo” del gen en cuestión- para reducir la probabilidad de ($%"4".+ "..$."2+ !"+ "8'/1'(&)#9+ U&#'/%"#4"*+ /'+ tercera consideración a realizar es acerca de la fuente del carácter o gen de interés. Cuando en un dado cultivo un carácter o un gen tienen un solo ancestro dador (o sea, hay una sola fuente original), existirá un solo tamaño de fragmento para el alelo de interés y uno o varios fragmentos de diferente tamaño para los otros alelos. >#+ ($#2"(1"#(&'*+ /$2+ ."21/4'!$2+ $54"#&!$2+ !"+ la población de mapeo del carácter en cuestión son inmediatamente utilizables o trasladables a otras poblaciones y líneas. No obstante, lo usual es que existan diferentes fuentes. Si esto es así, primero hay que determinar los tamaños de fragmento tanto para las diferentes fuentes de resistencia como para aquellos individuos que no portan el alelo de interés, ya que en muchas oportunidades el tamaño de fragmento puede variar entre diferentes fuentes de resistencia. Asimismo, en otras poblaciones o en otro sector del germoplasma, un marcador detectado pre8&'%"#4"+ ($%$+ 3$/&%).-($+ "#+ /'+ 3$5/'(&)#+ !"+ %'3"$+ $.&0&#'/+ 31"!"+ 2".+ %$#$%).-($+ "#4."+ individuos contrastantes para el carácter, lo que puede inducir a errores de evaluación.

gorrosa, o bien depende de ambientes especí-($2+$+"24'!$2+!"+!"2'..$//$+71"+&#=1"#(&'#+/'+ expresión del fenotipo. Asimismo, para el caso de resistencia a enfermedades, cuando el patógeno está ausente en el lugar donde se realiza la selección o su frecuencia de aparición (su incidencia) varía mucho entre años. Cuando se necesita un elevado número de individuos para evaluar fenotípicamente el carácter en cuestión (ejemplo: calidad panadera en trigo), los marcadores permiten realizar tal evaluación sobre un solo individuo y en las primeras generaciones de endocría. Cuando es necesario apilar o “piramidizar” varios genes o QTLs que determinan un solo carácter, como por ejemplo la resistencia a roya de la hoja o a la fusariosis de la espiga en trigo, lo que puede ser muy engorroso o virtualmente imposible si se utilizan métodos fenotípicos solamente. `1'#!$+ 2"+ #"("2&4'+ &#!&8&!1'/&@'.+ "-('@mente las fuentes de resistencia a patógenos existentes en el germoplasma y buscar nuevas ;1"#4"2+3'.'+($%3/"%"#4'.+/'2+'#4".&$."29+>24'+ prospección de recursos genéticos mediante el uso de marcadores no está limitada a las resistencias a patógenos sino que puede emplearse para otros caracteres, como por ejemplo la calidad del producto. X$2+%'.('!$."2+%$/"(1/'."2*+-#'/%"#4"*+!"bido a que permiten determinar la genética subyacente detrás de un dado fenotipo garantizan la generación del mismo en forma recurrente. >#+$4.'2+3'/'5.'2*+/$2+%'.('!$."2+3".%&4"#+."Y B70%&'()(&/$#0+-)6)+#.+70/+"#+0#.#((&*$+ obtener las combinaciones de genes o QTLs asistida por marcadores en mejoramiento cuya interacción gobierna un determinado fegenético. notipo, proceso que -si librado al azar- sería de X'2+P124&-('(&$#"2+3'.'+"/+!"2'..$//$+,+12$+!"+ una ocurrencia altamente improbable. MAS en mejoramiento genético pueden agru>#+ /'+ 4'5/'+ B+ 2"+ "P"%3/&-('#+ '/01#$2+ !"+ /$2+ 3'.2"+"#+D+('4"0$.M'2+!&;"."#4"2+/'2+(1'/"2+2$#+ caracteres en distintos cultivos cuya selección relevantes para casi todos los cultivos: se realiza por medio de marcadores moleculaCuando la heredabilidad del carácter que se res. Como puede apreciarse, estos caracteres está evaluando es baja (o sea, cuando la expre- van desde resistencias a enfermedades hasta 2&)#+ !"+ 1#+ ('.6(4".+ 2"+ A'//'+ '/4'%"#4"+ &#=1&!'+ caracteres que están relacionados con la capor el ambiente) ya sea porque la genética del lidad del producto, incluyendo caracteres de carácter es compleja, la penetrancia es baja o la herencia simple (por ejemplo, la resistencia a expresividad es variable. Cercospora sojina en soja) hasta caracteres de Cuando no hay métodos efectivos, precisos o herencia compleja (por ejemplo, la calidad parutinarios de selección fenotípica o convencio- nadera en trigo o la resistencia a la virosis cononal, o éstos son caros, su determinación es en- cida como Mal de Río Cuarto en maíz).

328 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

Tabla 1.+>P"%3/$2+!"+('.'(4"."2+3'.'+/$2+(1'/"2+2"+."'/&@'+2"/"((&)#+'2&24&!'+14&/&@'#!$+%'.('!$."2+%$leculares agrupados por rasgo. Los ejemplos fueron escogidos para representar la diversidad de ámbitos donde esta metodología encuentra aplicación. V";9?+BJ+E1$+"4+'/9+IKZZ\J+bA"$.9+m33/9+E"#"49+BBB*+CD\YCgB9+KJ+L"!.,8".+"4+'/9+IBCCDJ+E"#$%"+QC*+lQZY lQ\9+QJ+T'/'+"4+'/9+IKZZ\J+T$/9+:'49+m.09+WH:W+mVZQlQZK+fJ+:'#n$8&(+"4+'/9+IKZZlJ+:/'#4+h.""!9+BKD*+ffZY fff9+\J+zA1+"4+'/9+IKZZDJ+`.$3+T(&9+fD?BZCfYBZCC9+DJ+T14n'+IKZZBJ+>13A,4&('+BBC*+BDCYBgg9+gJ+X""+"4+'/9+ IKZZfJ+bA"$.9+m33/9+E"#"49+BZC*+BDBZYBDBC9+lJ+F'0'/A'"2+"4+'/9+IKZZfJ+E"#"4&(2+BDg*+BCZ\YBCBf9+CJ+_'#+ "4+'/9+IKZZQJ+:HmT+BZZ*+DKDQYDKDl9+BZJ+F$A/".+"4+'/9+IKZZfJ+>13A,4&('+BQl*+QQYfZ9+BBJ+T'/8&+"4+'/9+IKZZKJ+ :/'#4+F$/9+h&$/9+fl*+DZBYDBQ9+BKJ+>//&2+"4+'/9+IKZZKJ+bA"$.9+m33/9+E"#"49+BZ\*+BZQlYBZfK9+BQJ+mA%'!+IKZZZJ+ bA"$.9+m33/9+E"#"49+BZB*+lCKYlCD9+BfJ+L&24"/;"/!+"4+'/9+IKZZDJ+H"G+:A,4$/$0&24+BDC*+g\QYgDQ9+B\J+X&//"%$+r+ V�/1#!+IKZZKJ+:/'#4+h.""!9+BKB*+KBZYKBg9+BDJ+d&%+"4+'/9+IKZZDJ+>13A,4&('+B\K*+QDBYQDD9+BgJ+h&/,"1+"4+'/9+ IKZZDJ+`.$3+T(&9+fD*+BCBQYBCBl9+BlJ+E1##'.+"4+'/9+IKZZDJ+F$/9+h.""!9+Bg*+KfBYK\D9+BCJ+T'/'+"4+'/9+IKZZlJ9+ `.$3+T(&9+I"#+3."#2'J9+KZJ+_'#0+"4+'/9+IKZZgJ+c9+m0.&(9+U$$!+`A"%9+\\*+BfYKf9+KBJ+b"..,+r+N'..&2+IKZZBJ+>1.9+ U$$!+V"29+b"(A#$/9+KBQ*+fK\YfQB9

Tipo de Rasgo

Resistencias a enfermedades y plagas

Resistencias a estrés abiótico

Cultivo

Ejemplos

Soja

Resistencia a Nematodo del Quiste

SSR

1

Trigo

Resistencia a Roya de la hoja

SCAR

2

Maíz Girasol Soja

Resistencia a Mal de Rio IV Resistencia a Plasmopara Resistencia a insectos

3 4 5

Trigo

Tolerancia a heladas

Soja Sorgo

Tolerancia a salinidad Tolerancia a aluminio Requerimiento de frío para florecer Requerimiento fotoperiódico para florecer Días a floración Enanismo Calidad panadera Porcentaje de proteína en el grano Dureza del grano Inhibidor de tripsina (Kunitz) Bajo contenido de ácido linolénico

SSR CAPS SSR RFLPAFLP SSR RFLP

7 8

RFLP

9

Trigo Trigo Adaptación

Maíz Trigo Trigo

10 11 12 13 14

CAPS SSR

15 16

SNP

17

Girasol Alto contenido de ácido oleico

SCAR

18

Girasol Resistencia a imidazolinonas

INDEL

19

SCAR SCAR

20 21

Trigo Soja Soja

Resistencia a herbicidas

AFLPSCAR AFLP SCAR SCAR

6

SCAR

Trigo Calidad del producto

Marcador Ref

Maíz Soja

Resistencia a glifosato Resistencia a glifosato

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 329

Conversiones Se denomina retrocruza asistida por marcadores moleculares o conversión al proceso de introgresar un carácter controlado por uno o pocos genes desde un genotipo dador o donante a un genotipo recurrente, de modo tal de obtener el trasfondo genético del recurrente con el carácter deseado. Los marcadores se utilizan para realizar la selección por el carácter de interés y, aún más importante, para seleccionar las plantas de modo tal de recuperar más rápidamente el trasfondo genético del padre recurrente. Para entender mejor la importancia de este método como así también su implementación, lo mejor es comenzar por analizar el método convencional o tradicional de retrocruzas.

línea pura (el padre recurrente, R) de muy bue#'2+('.'(4".M24&('2+'0.$#)%&('2*+3".$+!"-(&"#4"+ para un carácter, se cruza con un individuo que exhibe el carácter en cuestión (individuo dador, LJ*+,+2"+$54&"#"#+!"2("#!&"#4"2+UB9+>24'2+3/'#4'2+ UB+ 2"+ ."4.$(.1@'#+ ($#+ "/+ 3.$0"#&4$.+ V9+ X'+ progenie obtenida se denomina “retrocruza 1” Ih`BJ9+>#+"24'+0"#".'(&)#+h`B+2"+2"/"((&$#'#+ las plantas que muestran el carácter de interés y se retrocruzan con “R”, obteniéndose la “retrocruza 2” (BC2). Se repite de nuevo este proceso de selección por el carácter y retrocruzamiento con el progenitor “R” hasta llegar a una gene.'(&)#+I121'/%"#4"+/'+."4.$(.1@'+D*+h`DJ+"#+/'+ cuál se han recuperado todas las características del progenitor R, se seleccionan los individuos que presenten el carácter de interés y se au4$;"(1#!'#9+>#+/'+3.)O&%'+0"#".'(&)#+Ih`DUKJ+ se seleccionan aquellas plantas homocigóticas El método de mejoramiento por retrocruzas para los genes que gobiernan el carácter en >/+%#+ "24"+ ('2$*+ posible iniciar la recombinación en etapas intermedias del prola implementación del método ceso de conversión. de retrocruzas (supongamos que se desea incorporar la reporcentaje de similitud que, en promedio, ten- sistencia a una enfermedad a una variedad de drán los individuos en la BC2 será del 92% (se- 4.&0$J+ "2+ ."/'4&8'%"#4"+ 2&%3/"9+ >#+ /'+ 3.6(4&('+ gún el número de plantas que se obtengan se real del mejoramiento, los casos son en general pueden lograr individuos con el 98-99% de si- un poco más complicados. Así, por ejemplo, si militud). Repitiendo el mismo procedimiento en se desea incorporar un carácter controlado por la BC2, se autofecundan los individuos con los un alelo dominante que se expresa en la semimayores porcentajes de similitud para obtener lla (ejemplo: alto contenido de ácido oleico en /'+h`KUK9+>#+"24'+0"#".'(&)#+2"+4".%&#'#+!"+ la semilla de girasol), no se pueden seleccionar seleccionar los segregantes que presentan el las plantas en cada generación de retrocruzas gen de interés en estado homocigótico e iden- '#4"2+!"+71"+#+"24"+('2$*+2"+ tidad genética con el padre recurrente para el deben hacer todos los cruzamientos posibles

332 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

con el padre recurrente y evaluarlos cuando se obtengan las semillas de cada planta. Recién en ese momento se podrán descartar aquellas cruzas con las plantas que no presentaban el ('.6(4".+!"+"./+"%3/"$+!"+%'.('!$."2+%$/"(1/'."2+."!1ce notablemente las complejidades descriptas ya que todos los ejemplos mencionados (se/"((&$#'.+ &#!&8&!1$2+ !"231#+2M#4"2&2*+/$+'#4".&$.+&#!&ca que el parecido morfológico entre materiales genéticos tiene escaso valor para realizar 1#+ %'#"P$+ "-(&"#4"+ !"+ /'+ !&8".2&!'!+ 0"#24$2+!'!$."2+2"+14&/&zan para introgresar tales caracteres en líneas elite de alto potencial de rendimiento que no los poseen (representadas con diferentes to#$2+!"+0.&2"2+"#+/'+0.6-('+3'.'+2"k'/'.+212+!&ferencias genéticas). Por otra parte, las líneas elite, se eligen de modo tal que exhiban entre ellas escaso parecido genético. A medida que el proceso de conversión de cada línea avanza (o sea, se minimiza la contribución genética !"/+!'!$.+($%$+2"+'3."(&'+"#+/'+0.6-('+!"2!"+ UB+ A'(&'+ h`KJ*+ 2"+ ($%&"#@'#+ '+ (.1@'.+ "#4."+ sí a las líneas elite en proceso de conversión de modo de obtener recombinantes entre los materiales elite y que lleven el gen de interés I."3."2"#4'!'2+ "#+ /'+ 0.6-('+ ($%$+ &#!&8&!1$2+ que presentan combinaciones de colores de diferentes líneas y la región del genoma que lleva el gen de interés de la línea dadora). De esta forma, si bien las conversiones continúan de modo tal de obtener cultivares aptos para el mercado, se genera al mismo tiempo germoplasma de alto rendimiento con los genes '3$.4'!$2+3$.+/'+/M#"'+!'!$.'9+>2"+0".%$3/'2ma ingresa al programa de mejora convencional para continuar el proceso de mejoramiento del rendimiento por selección. Por todo lo expuesto anteriormente, el mejoramiento genético en la actualidad debe ser el resultado de la estrecha colaboración y del sinergismo entre los programas de mejora

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 335

convencional y molecular. Como se ha mostrado previamente, los ciclos de evaluación, selección y recombinación del mejoramiento convencional continúan siendo el corazón del proceso, pero ahora cuentan con el aporte de la tecnología de marcadores moleculares a través de la selección asistida y del análisis de /'+!&8".2&!'!+!"/+0".%$3/'2%'+I-01.'+\J9+b'/"2+ '3$.4"2+($#4.&51,"#+'+1#'+%"P$.'+2&0#&-('4&8'+ del progreso genético por selección a través del mantenimiento e incremento de la diversidad y de la reducción de la interacción genotipo x ambiente. Por otro lado, la base genética puede actualmente enriquecerse en forma continua con nuevos genotipos y con nuevos caracteres por medio de las conversiones asistidas por marcadores.

Lecturas recomendadas

m8&2"+c`9+KZZf9+F$/"(1/'.+%'.n".2*+#'41.'/+A&24$.,*+ and evolution. 2nd+ "!9+ T&#'1".+ m22$(&'4"2*+ W#(9*+ Sunderland, MA. h"(n%'##+c9T9+'#!+T$//".+F9+BClD9+V"24.&(4&$#+;.'0ment length polymorphisms in plant genetic im3.$8"%"#49+tO;$.!+T1.89+:/'#4+F$/9+`"//+h&$/9*+Q*+ BCDYK\Z9 h".#'.!$+ V9*+ F$."'1+ X9+ '#!+ `A'.($22"4+ m9+ KZZD9+ H1%5".+ '#!+ -4#"22+ $;+ 2"/"(4"!+ &#!&8&!1'/2+ &#+ marker-assisted and phenotypic recurrent selec4&$#9+`.$3+T(&9*+fD*+BCgKYBClZ9 `A'.($22"4+m9+'#!+E'//'&2+m9+BCCl9+W#49+ KZZ\9+ T"/"(4&$#+ theory for marker-assisted backcrossing. Genetics, 170, 909-917. Figura 5. W#4".'((&)#+"#4."+"/+%"P$.'%&"#4$+($#8"#- Gimelfarb A. and Lande R. 1994. Simulation of mar(&$#'/+,+"/+%"P$.'%&"#4$+%$/"(1/'.9+>#+"/+."(1'!.$+ ker-assisted selection for non-additive traits. Gese esquematiza la naturaleza cíclica del mejoramien#"49+V"29*+Df*+BKgYBQD9 to convencional y, por fuera del mismo, los aportes Gimelfarb A. and Lande R. 1994. Simulation of marproporcionados por el mejoramiento molecular. ker-assisted selection in hybrid populations. Ge#"49+V"29*+DQ*+QCYfg9 E&%"/;'.5+m9+ '#!+ X'#!"+ V9+ BCC\9+ F'.n".Y'22&24"!+ selection and marker-QTL associations in hybrid 3$31/'4&$#29+bA"$.9+m33/9+E"#"49*+CB*+\KKY\Kl9 E1&%'.€"2+>9:9*+V1'#"+c9*+T(A".;+h9L9*+T$##&#$+m9+ '#!+L'.0&"+c9L9+KZZg9+F'.n".Y'22&24"!+2"/"(4&$#*+ current status, and future perspectives in crops, /&8"24$(n*+;$."24.,*+'#!+-2A9+Umt*+V$%"9 Harlan H.V. and Pope M.N. 1922. The use and va/1"+$;+5'(n(.$22"2+&#+2%'//+0.'&#+5.""! +c9+N"."!9*+BQ*+QBCYQKK9 N$23&4'/+ U9+ KZZK9+ F'.n".Y'22&24"!+ 5'(n(.$22+ 5.""ding: A case study in genotype building theory. pp BQ\YBfB9+W#?+F9T9+d'#0+I"!9J+}1'#4&4'4&8"+0"#"-

336 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

4&(2*+0"#$%&(2*+'#!+3/'#4+5.""! +`mhW+:15/&2hing. N$23&4'/+U9+'#!+`A'.($22"4+m9+BCCg9+F'.n".Y'22&2ted introgression of quantitative trait loci. Gene4&(2*+Bfg*+BfDCYBfl\9 N$23&4'/+ U9*+ E$/!.�".+ W9+ '#!+ t3"#2A'G+ T9+ KZZZ9+ >;-(&"#4+ %'.n".Y5'2"!+ ."(1.."#4+ 2"/"(4&$#+ ;$.+ %1/4&3/"+ 71'#4&4'4&8"+ 4.'&4+ /$(&9+ E"#"49+ V"29*+ g\*+ 1181-1189. d$"5#".+ V9F9+ KZZf9+ F'.n".+ '22&24"!+ 2"/"(4&$#+ &#+ 4A"+ ("."'/2?+ bA"+ !."'%+ '#!+ 4A"+ ."'/&4,9+ 33+ QBgY QKC9+W#?+:9d9+E134'+'#!+V9d9+s'.2A#",+I"!9J+`"."'/+0"#$%&(29+d/1G".+m('!"%&(*+L$.!."(A4*+bA"+ Netherlands. d$$.##"";+ F9+ '#!+ T4'%+ :9+ KZZB9+ `A'#0�+ 3'.'!&0%2+ &#+ 3/'#4+ 5.""! + :/'#4+ :A&2&$/9+ BK\?B\DY B\C9+ d1%/',+ m9F9*+ h'"#@&0".+ :9T9*+ E&//+ d9T9*+ TA"/4$#+ L9V9*+ E.',5$2(A+ V9m9*+ X1n'2@"G2n&+ m9c9+ '#!+ e"2"#5".0+L9F9+KZZQ9+u#!".24'#!�+4A"+>;;"(4+ $;+V,"+`A.$%'4&#+&#+h."'!+eA"'49+`.$3+T(&9+fQ?+ BDfQYBD\B9 X'#!"+ V9+ '#!+ bA$%32$#+ V9+ BCCZ9+ >;-(&"#(,+ $;+ marker-assisted selection in the improvement of 71'#4&4'4&8"+4.'&429+E"#"4&(2*+BKf*+gfQYg\D9 Paterson A.H., Tanksley S. and Sorrells M. 1991. DNA markers in plant improvement. Advances in Agronomy, 44, 19-89. :.+V9*+F'.'&2+E9U9*+:."4$.&12+z9m9*+c'#2"+h9c9N9*+ F'.'&2+m9T9+ BCCg9+m+ 241!,+ $;+ %$!&-"!+ ;$.%2+ $;+ the LrBC+4.'#2/$('4&$#+$;+($%%$#+GA"'49+bA"$.9+ m33/9+E"#"49*+C\?+fKfYfQZ9+ V&5'14+c9F9+'#!+N$&2$#+L9+BCCl9+F'.n".Y'22&24"!+ 2"/"(4&$#?+ H"G+ 4$$/2+ '#!+ 24.'4"0&"29+ b."#!2+ :/'#4+T(&9*+Q*+KQDYKQC9 T'/'+ `9*+ h1/$2+ F9+ '#!+ >(A'.4"+ F9+ KZZ\9+ om0.$5&$tecnología. Curso de grado para estudiantes de biología y agronomía”. Mentaberry A. (ed) Universidad de Naciones Unidas, Programa Biolac. T".8&#+ h9*+ F'.4&#+ t9`9*+ F1.$3"'J+,+(1"#4'+($#+1#'+$.0'#&@'(&)#+ "23"(M-('+ 71"+ "2+ /'+ t-(&#'+ !"+ /'+ u:ts+ ($#+ sede en Ginebra, Suiza, integrada por un Secretario General, un Vice-Secretario General, su cuerpo técnico y su personal administrativo. La República Argentina actualizó en el año 1991 su legislación en materia de derecho de obtentor mediante el Decreto Reglamentario Hj+KBlQ+I2"+/'+($#$("+($%$+m(4'+!"+BCgl+!"+ la UPOV). De esta forma pudo acceder a ser miembro de la UPOV en el año 1994. Vale hacer esta aclaración ya que luego, fue adoptada y puesta en vigencia una tercera versión del Acta de UPOV que es la que se conoce como Acta de 1991, a la que Argentina aún no adhirió. W#!"3"#!&"#4"%"#4"+ !"+ "24$*+ !"+ /$2+ Df+ miembros parte de UPOV a diciembre de 2007, 24 son parte del Acta 1978 -incluido Argenti#'Yw+B+"2+3'.4"+!"/+m(4'+!"+BCDBSgK+,+QC+%&"%bros son parte del Acta de 1991. Todas estas Actas cuentan con principios básicos que son comunes y nuevas regulaciones que se han incorporado como consecuencia de los avances técnicos y tecnológicos en la obtención de va.&"!'!"2+8"0"4'/"2+IF&"%5.$2+!"+/'+u#&)#+W#ternacional para la Protección de las Obtencio#"2+s"0"4'/"2+i+T4'412+'/+Bl+!"+P1#&$+!"+KZZg+ i+u:tsJ9 L"2!"+21+'!A"2&)#+'/+`$#8"#&$+!"+u:ts+i+ Acta de 1978, la República Argentina participa

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 339

activamente en los diferentes órganos de decisión de la UPOV: Consejo; Comité Consultivo; `$%&424'!$2+'+-#+!"+3$!".+//"8'.+'!"/'#4"+"/+"O'%"#+49+ Una opción es la que se conoce como exa%"#+ $-(&'/*+ "#+ "/+ 71"+ "2+ /'+ %&2%'+ $-(&#'+ /'+ que se encarga de conducir el ensayo a campo (colección de variedades), agrupar a la variedad inédita con las más parecidas en virtud de los caracteres de agrupamiento que el obtentor informa, tomar las observaciones y expresiones de cada carácter siguiendo la guía técnica correspondiente, determinando su distinción y 3.$!1(&.+/'+!"2(.&3(&)#+$-(&'/+!"/+(1/4&8'.9+:'.'+ esta opción, es necesario contar con recursos económicos y humanos, estaciones de evaluación en diferentes localidades, personal de campo, etc. La mayoría de los países europeos utilizan esta forma de examen técnico. Otra opción es la reconocida como examen realizado por terceras partes, en el que 3".2$#'/+ '(."!&4'!$+ 3$.+ /'+ $-(&#'+ $+ "/+ %&2%$+ obtentor, es el encargado de llevar adelante los ensayos de campo, tomar los datos, comparar las variedades similares, presentar una descripción completa del cultivar (morfológica, -2&$/)0&('*+ ;"#$/)0&('*+ !"+ ($%3$.4'%&"#4$+ 2'nitario y de cualidades industriales si corres3$#!"J*+ ($#+ /'2+ 8".&-('(&$#"2+ ";"(41'!'2+ 3$.+ "/+3".2$#'/+49+>24'+L&."((&)#+"2+"/+‚."'+424'+3.&%".'+($%3'.'(&)#+!"+('.'(4"."2+ se efectúa mediante un programa que permite la comparación entre las diferentes expresiones de los caracteres que forman parte de un descriptor. 2. >24$2+('.'(4"."2*+31"!"#+2".+%62+$+%"#$2+ &#=1"#(&'5/"2+ !"+ '(1".!$+ ($#+ /'2+ condiciones del medio en el que se está efectuando la descripción. Así, existen caracteres de tipo cualitativo que son /$2+%"#$2+&#=1"#(&'!$2+3$.+($#!&(&$#"2+ externas y, consecuentemente, más deseables para poder efectuar la comparación. Los otros caracteres, denominados cuantitativos pueden variar o varían en virtud del ambiente (por ejemplo, altura de planta; largo de hoja, etc.). Q9+ Consecuentemente, luego de efectuada la comparación primera, el técnico examinador debe analizar el resultado y, de 2".+ #"("2'.&$*+ 8".&-('+ '+ ('%3$+ /$2+ ('racteres y sus expresiones diferenciales o incluso, está facultado para efectuar "#2',$2+$-(&'/"29 4. >24$2+ a/4&%$2*+ 2$#+ ";"(41'!$2+ 3$.+ /$2+ técnicos de la Dirección de Registro de Variedades en los casos en que poder establecer la distinción se haya convertido en un estudio no del todo sencillo, como es el caso de la soja, para la que !"2!"+ "/+ 'k$+ BCCf*+ "/+ WHmT>+ ($#!1("+ sus propios ensayos por medio de la Dirección de Registro de Variedades, cuyos resultados luego son comparados con los declarados por el obtentor. >24$2+ "#2',$2+ ,+ 8".&-('(&$#"2+ '+ ('%3$*+ también son efectuados para otras especies ($#+"/+-#+!"+3$!".+($..$5$.'.+/'2+!"(/'.'(&$#"2+

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 341

de los obtentores y realizar el seguimiento del mantenimiento de la pureza varietal a lo largo de los años. >#+(1'#4$+'+/$2+!"2(.&34$."2+8'.&"4'/"2*+"O&2te uno por especie y todos ellos incluyen los caracteres utilizados a nivel internacional para ";"(41'.+ /$2+ "O6%"#"2+ LN>9+ >24'2+ !&."(4.&("2+ técnicas de la UPOV, son efectuadas por los expertos de los diferentes miembros que parti(&3'#+!"+/$2+0.13$2+4#+/'2+ mismas, se explica claramente la forma de ejecución del examen, la toma de observaciones y datos y las expresiones de cada carácter en base a las observaciones efectuadas. Todos los descriptores están integrados por caracteres que son, como ya dijimos, de tipo morfológico, -2&$/)0&($*+;"#$/)0&($*+!"+($%3$.4'%&"#4$+'+"#fermedades y que, en determinadas especies, incluyen a los referidos a calidad industrial. Cada variedad, cuenta con su descriptor, que no es ni más ni menos que la combinación de las expresiones de cada carácter que lo integra. >2'+ ($%5&#'(&)#+ !"+ ('.'(4"."2+ #$2+ !'+ /'+ "Opresión de la identidad varietal. Hace que esa variedad sea esa y no otra. Nos permite iden4&-('./'+ %"!&'#4"+ "24$2+ ('.'(4"."2+ ($#4"#&!$2+ en el descriptor y la combinación de sus expresiones. Cuando el técnico que realiza el examen LN>+($%3'.'+/'+!"2(.&3(&)#+!"+8'.&"!'!+&#+,+3$!.M'+14&/&@'./'+ '+ ";"(4$2+ !"+ /'+ &!"#4&-('(&)#+ !"+ 21+ (1/4&8'.+ llegado el caso. >#+ 2"2&$#"2+ ."(&"#4"2+ !"+ /'+ u:ts+ !"+ /$2+ Cuerpos de decisión, se ha considerado el tema referido a la utilización de las técnicas %$/"(1/'."2+3'.'+$4.$2+-#"2*+'!"%62+!"/+!"+/'+ &!"#4&-('(&)#*+($%$+3$.+"P"%3/$+"#+/'+!"4".%&nación de variedades esencialmente derivadas. Por supuesto que las recomendaciones de la UPOV son guías técnicas que cada miembro puede tomar e incorporar en su país, no siendo obligatorias per-se, pero es sumamente importante que en ese ámbito se esté discutiendo en los cuerpos técnicos correspondientes, la utilidad de las técnicas moleculares con miras a que el sistema de derecho de obtentor cuente con otra herramienta que colabore en su implementación y ejercicio. :$.+ a/4&%$*+ /'+ U"!".'(&)#+ W#4".#'(&$#'/+ !"+ T"%&//'2+IUWTJ+71"+#1(/"'+'+/$2+$54"#4$."2+I3'.ticipan dos organizaciones argentinas), consi!".'+71"+A'24'+4'#4$+#$+2"+31"!'#+!"-#&.+!&2tancias mínimas para la distinción, el impacto que esas técnicas tendrán en los requisitos de uniformidad y estabilidad y, la disponibilidad de marcadores públicos, no es posible que puedan 2".+14&/&@'!$2+3'.'+"/+"O'%"#+LN>+3$.+2M+2$/$29+ :".$+ /'+ UWT+ ($#2&!".'+ 71"+ 2M+ 31"!"#+ 2".+ 14&/&@'!$2+"#+/'+&!"#4&-('(&)#+!"+1#'+8'.&"!'!+3.$tegida y/o en la determinación de una variedad "2"#(&'/%"#4"+ !".&8'!'+ IU"!".'(&)#+ W#4".#'(&$#'/+ !"+ T"%&//'2+ i+ L$(1%"#4$2+ !"+ 3$sición 2$5."+3.$3&"!'!+"/"(41'/+Y+KZZDJ9+

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La noción de variedad esencialmente deriva!'*+ '3'."("+ "#+ "/+ '.4M(1/$+ Bf9\9+ !"/+ `$#8"#&$+ W#4".#'(&$#'/+3'.'+/'+:.$4"((&)#+!"+/'2+t54"#(&$#"2+s"0"4'/"2+i+u:ts+m(4'+!"+BCCB9+ >#+ "2"+ 2"#4&!$+ “Se considerará que una variedad es esencialmente derivada de otra variedad – la variedad inicial – si i) se deriva principalmente de la variedad inicial, o de una variedad que a su vez se deriva principalmente de la variedad inicial, conservando al mismo tiempo las expresiones de los caracteres esenciales que resulten del genotipo o de la combinación de genotipos de la variedad inicial; ii). se distingue claramente de la variedad inicial, y iii) salvo por lo que respecta a las diferencias resultantes de la derivación, es conforme a la variedad inicial en la expresión de los caracteres esenciales que resulten del genotipo o de la combinación de genotipos de la variedad ./.-.&0?E Por otra parte, pero en ese mismo sentido, el Convenio agrega que: “Las variedades esencialmente derivadas podrán obtenerse, por ejemplo, por selección de un mutante natural o inducido o de un variante somaclonal, selección de un individuo variante entre las plantas de la variedad inicial, retrocruzamien6*$"*"6'&/$+*'1&-.*/2$"%*'"./(2/.2'F&"(2/G6.-&?" I`$#8"#&$+W#4".#'(&$#'/+3'.'+/'+:.$4"((&)#+!"+ /'2+t54"#(&$#"2+s"0"4'/"2+i+m(4'+BCCBJ9 >24'+ #$(&)#+ 3."4"#!"+ .$!1(&.+ 1#'+ %"P$.+ relación de derechos entre obtentores y titu/'."2+!"+!"."(A$9+>/+`$#8"#&$*+4'/+($%$+"246*+ contiene en todas sus versiones vigentes, una excepción al derecho del obtentor, reconocida como H2I-2%-.J/" 320" ,6*12D*'&3*'? o “breeder's exemption”. Por esta excepción al !"."(A$*+ 1#+ -4$%"P$.'!$.+ 31"!"+ 4$%'.+ ($%$+ fuente de variación inicial el material de propagación de una variedad que se encuentra con titularidad vigente (inscripta en el Registro Nacional de la Propiedad de Cultivares en el caso de la República Argentina) y sin solicitar autorización al titular de ese derecho vigente (el obtentor) utilizar ese material de propagación de esa variedad protegida como fuente de variación a partir de la que podrá obtener una nueva variedad, siempre y cuando no deba utilizar en cada nuevo ciclo de producción de su nueva variedad, al material de propagación de la variedad protegida.

Si pensamos, por ejemplo en variedades obtenidas por recombinación de ADN, se podría suscitar una relación de desequilibrio en cuanto a los derechos de obtentores y titulares de otros derechos. Así, el obtentor de una variedad protegida, queda exceptuado de su derecho ante la utilización de su variedad como ;1"#4"+!"+8'.&'(&)#+&#&(&'/+3'.'+$4.'+%"P$.'9+>#+ cambio, el titular de un derecho de, por ejem3/$*+3'4"#4"+2$5."+1#+0"#+%$!&-('!$*+3.$!1(4$+ o procedimiento determinado, podrá ejercer su derecho ante la utilización de un tercero. Sin duda, el desbalance entre derechos y titulares es notable. Por esta razón, el Acta de 1991 de la UPOV introduce la noción de variedad esencialmente derivada por el que: “En la práctica, el nuevo sistema ha creado un marco dentro del cual, las partes interesadas pueden negociar: a) aquel que desea emprender una selección “mejorante” (con inclusión de un trabajo de transformación mediante ingeniería genética) sobre una variedad protegida, concertará un acuerdo con el obtentor de esta variedad antes de comenzar sus trabajos (esos acuerdos ya se han concertado entre empresas de ingeniería genética y obtentores “tradicionales”); b) cuando un trabajo de selección resulte de forma imprevista en la creación de una variedad esencialmente derivada, los dos obtentores se entenderán sobre la explotación de esta última si constituye un verdadero mejoramiento; el precio que ha de pagar el usuario no será una regalía doble, sino una suma determinada por las leyes del mercado (por la competencia). Si no hay mejoramiento, o bien el obtentor de la variedad esencialmente derivada decidirá que no la va a explotar, o bien el obtentor de la variedad inicial ejercerá su derecho para negar al segundo obtentor el derecho a explotar la variedad; c) los obtentores de variedades resultantes de una selección “innovante” y los inventores de productos o de procedimientos que dan lugar a variedades esencialmente derivadas tienen derechos de valor sensiblemente equivalente y, por consiguiente, se ven obligados a concertar acuerdos equilibrados” (Ley tipo sobre la protección de las obtenciones ve0"4'/"2+i+u:ts+i+BCCDJ9 “La noción de variedad esencialmente derivada hace intervenir el grado de semejanza

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 343

entre una de las variedades parentales (la va>/+hFb+"2+1#+0.13$+!"+"O3".4$2+"#+"/+"O'riedad inicial) y la variedad derivada. Para que %"#+LN>*+"23"(&'/&24'2+"#+4241!&'.+/'+3$2&5/"+'3/&('(&)#+!"+/'2+49+ una serie de problemas de tipo legal y político >#+"/+'k$+BCCQ+2"+//"8)+'+('5$+/'+3.&%".'+."- referidos al uso de estas técnicas, que debeunión del Grupo de Trabajo en Técnicas Bio- rían ser discutidos en el ámbito de un grupo 71M%&('2+ ,+ F$/"(1/'."2+ ,+ !"+ 3".-/"2+ !"+mLH+ "23"(M-($9+ >#+ $(415."+ !"/+ %&2%$+ 'k$+ "/+ `mc+ en particular, conocido como Grupo BMT. aceptó la formación de dicho grupo, y en 2001

344 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

se acordó el mandato de lo que se denominó T150.13$+>23"(&'/+!"+>O3".4$2+b/+ E.13$+ !"+ `$#21/4'+ !"/+ hFb+ !"5".6+ evaluar los posibles modelos de aplicación propuestos por el Comité Técnico, sobre la base de los trabajos realizados por el BMT y los subgrupos sobre cultivos, para la utilización de las técnicas bioquímicas y moleculares en el examen de la distinción, la homogeneidad y la estabilidad en relación con: a). la conformidad con el Convenio de la UPOV. b). las posibles repercusiones en la "-('(&'+!"+/'+3.$4"((&)#*+($%3'.'!' con la obtenida mediante los métodos actuales del examen, y pronunciarse sobre la eventual disminución de la "-('(&'+!"+/'+3.$4"((&)#+$;."(&!' mediante el sistema de la UPOV. 2. Al realizar su evaluación, el Grupo de Consulta del BMT podrá remitir cuestiones concretas al Comité Administrati8$+ ,+ c1.M!&($+ $+ '/+ `$%&424"+ modelo tiene una serie de supuestos: R+ el ensayo para el marcador debe realizarse sobre el mismo número de plantas individuales, la misma cantidad de años y los mismos criterios que para los ensayos a campo. R+ !"5"+8".&-('.2"+71"+."'/%"#4"+"/+%'.('dor está ligado al gen. R+ si se tienen distintos marcadores para la misma característica, éstos se considerarán como distintos métodos para evaluar esa característica. R+ 2&+2"+4&"#"#+!&24$2+0"#"2+71"+($#-"."#+ la misma característica, éstos se considerarán como distintos métodos para

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evaluar la misma característica. fenotípica entre dos variedades. Luego, R+ si existen distintos marcadores ligados se establece la diferencia entre variedaa diferentes elementos regulatorios para des utilizando una distancia molecular. Si el mismo gen, estos marcadores serán la correlación entre ambas distancias es considerados como distintos métodos ;1".4"*+2"+8".6+'/0$+2&%&/'.+'+/'+-01.'+B9+ para evaluar la característica. >#+ "24"+ ('2$+ "/+ 1%5.'/+ !"+ L&24&#(&)#+ :/12+ Sobre estos dos últimos puntos se deja asen- para marcadores moleculares, puede ser extado que se podrán hacer consideraciones, en trapolado a partir del umbral basado en caractanto que pueden existir distintos mecanismos terísticas tradicionales. De esta forma, se tode acción de los genes (que otorguen ciertas marán las mismas decisiones sin importar cual diferencias) y que algunos elementos regulato- !"+ /$2+ %#+"/+('2$+!"/+(1'!.'#4"+f*+/$2+3'."2+ de variedades están por debajo del umbral de distinción tradicional (por lo tanto serían similares), pero resultan distintas utilizando características moleculares. Para evitar posibles inconvenientes al poner en práctica este método, ambos sistemas deben ser corridos en paralelo ,+2"+!"5".6#+!"4".%&#'.+1%5.'/"2+/$+21-(&"#temente altos (con marcadores moleculares) !"+%'#".'+!"+%&#&%&@'.+"24$2+('2$29+>24"+2&24"%'+A'+2&!$+('/&5.'!$+"#+U.'#(&'+3'.'+"/+('2$+ del maíz utilizando caracteres basados en proteínas. Los supuestos de esta opción son los siguientes: R+ Se supone que las diferencias calculadas entre variedades utilizando marcadores moleculares, incluyen a las diferencias encontradas dentro de las variedades. R+ >24'+ $3(&)#+ 2".6+ 14&/&@'!'+ 3'.'+ "24'5/"cer la Distinción Plus para el manejo de las colecciones de referencia. R+ X'+%"4$!$/$0M'+14&/&@'!'+"2+/$+21-(&"#4"mente robusta y repetible. Q9+ Creación de un nuevo sistema: esta opción se basa en la utilización de caracteres moleculares del mismo modo en que se utilizan los caracteres no moleculares "O&24"#4"29+ >24"+ "#;$71"+ 2&0#&-('+ 71"+ las diferencias claramente distinguibles en los caracteres moleculares se considerarían niveles de umbral para evaluar la Distinción. Para esta opción es fundamental analizar las repercusiones que podría tener el nuevo sistema, en el nivel de la protección, en comparación con el 2&24"%'+ '(41'/9+ >24$+ 2"+ 31"!"+ //"8'.+ '+ cabo mediante la revisión de las posibles diferencias en las decisiones tomadas 14&/&@'#!$+1#$+1+$4.$+2&24"%'9+>24"+#1"8$+ sistema se ha ensayado utilizando fundamentalmente marcadores SSR (Short Sequence Repeat o microsatélites) y más recientemente marcadores SNP (Single

H1/("$4&!"+:$/,%$.3A&2%+$+3$/&%$.-2%$+ de nucléotido simple) en rosa y también existen algunos ejemplos en trigo y vid, ninguno de ellos actualmente aceptado por la UPOV. Como ejemplo, a continuación se describe brevemente como sería el ensayo en el caso de rosa. Para esta especie se han preseleccionado 7 marcadores SSR. La prueba se lleva a cabo sobre dos plantas individuales de cada variedad candidata. Si ésta tiene al me#$2+Q+5'#!'2+$+3&($2*+!&;"."#4"2+."23"(4$+ de las otras variedades, se la considera distinta, y se podrá luego realizar el ensayo a campo para evaluar la estabilidad ,+ /'+ A$%$0"#"&!'!9+ >#+ "/+ ('2$+ !"+ 71"+ no sea distinta, se la evaluará con otros 7 marcadores SSR. Si se encuentran al %"#$2+ Q+ 5'#!'2+ $+ 3&($2+ !"+ !&;"."#(&'*+ entonces se la considerará distinta y se la evaluará a campo para determinar si es homogénea y estable. Si no se logra la distinción, se considera que es una variedad ya existente o una mutante y se la evaluará a campo tanto para determinar la homogeneidad y la estabilidad como para determinar la distinción, siempre utilizando características no molecula."29+ >/+ .&"20$*+ "#+ (1'#4$+ '+ %'#4"#".+ "/+ nivel de protección, de esta opción es que puede ocurrir que variedades que no hayan sido consideradas distintas usando las características tradicionales, sean consideradas distintas basándose en esta opción. Si bien la probabilidad de que eso ocurra es baja, la UPOV aún no ha aceptado a este nuevo sistema Iu:ts+b`SQlSBf+i+`mcSf\S\*+KZZKJ9 Otros modelos de uso de las técnicas bioquímicas y moleculares >/+0.13$+hFb+4&"#"+!"#4.$+!"+21+'/('#("+/'+ 3$2&5&/&!'!+ !"+ !&2(14&.+ 4"%'2+ !"+ &!"#4&-('(&)#+ de variedades y referidos a las variedades esencialmente derivadas. Además de la posibilidad de usar a los marcadores moleculares 3'.'+ /$2+ "O6%"#"2+ LN>*+ #+ "24"+ ('2$+ /'+ 3.$31"24'+ "2+ "8'/1'.+ 0.'#+ ('#4&!'!+ !"+ %'.('!$."2+ I#$+ %"#$2+ !"+ B\Z+ '+ 200 marcadores) de manera tal de “saturar” el genoma y así determinar el grado en que se distinguen una variedad de la otra. Para eso debe !"-#&.2"+1#+1%5.'/+!"+!&24&#(&)#*+71"+2"+"24'5/"ce usando pares de variedades de genealogía conocida o pares de aquellas que han sido pro-

ducidas usando los métodos que pueden llevar a derivación, y calculando la similitud. Su magnitud dependerá de la especie, de la variabilidad genética y del proceso de mejoramiento. Si al evaluar dos plantas, la similitud de las mismas está por debajo del umbral, se puede decir que las plantas son distintas. Pero si la similitud supera al umbral, estaremos en una zona de “posible derivación” y entonces se deberán //"8'.+'+('5$+/$2+"#2',$2+'+('%3$+I-01.'+QJ9+

Figura 3.+>271"%'+!"+1%5.'/"2+!"+!&24&#(&)#+3'.'+ variedades esencialmente derivadas. (Adaptado de Le Buanec, 2007).

Selección de marcadores moleculares y construcción de bases de datos: directrices del BMT Durante la 8va sesión del grupo BMT en KZZQ*+2"+"#4"#!&)+71"+".'+#"("2'.&$+($%"#@'.+ a armonizar metodologías para la generación !"+!'4$2+%$/"(1/'."2+'+-#+!"+'2"01.'.+/'+('/&dad de los datos producidos y para que éstos '!"%62+ 2"'#+ '("34'!$2+ 1#&8".2'/%"#4"+ '+ -#+ de ser usados en la caracterización de variedades. También se consideró fundamental poder establecer normas o ejemplos de diseños de 5'2"2+!"+!'4$2*+"23"(M-('2+3'.'+!'4$2+%$/"(1/'."2+!"+!&24$+4&3$9+>24'2+($#2&!".'(&$#"2+ se plasmaron en los borradores de las Directrices del BMT. >24"+4"O4$*+71"+'a#+2&01"+"#+!&2(12&)#*+($#tiene lo siguiente: R+ !"-#&(&$#"2+0"#".'/"29+ R+ criterios básicos para la selección de metodologías adecuadas. R+ criterios generales para la selección de %'.('!$."2+ ,+ (.&4".&$2+ "23"(M-($2+ 3$.+ tipo de marcador. R+ consideraciones sobre el origen y tipo de material a analizar y sobre la cantidad de

348 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

plantas o semillas requeridas en cada caso (tamaño de muestra según tipo de propagación del material). consejos sobre el uso de materiales de referencia y la calidad de ADN requerido. Consejos sobre la forma de interpretación de los datos y de los resultados.

>#+ "24"+ 2"#4&!$+ /'+m2$(&'(&)#+ W#4".#'(&$#'/+ !"+ m#6/&2&2+ "#+ T"%&//'2+ IWTbmJ*+ ($%"#@)+ "#+ 2007 a conducir ensayos inter-laboratorio con -#"2+!"+&!"#4&-('(&)#+!"+8'.&"!'!"2+%"!&'#4"+ la técnica de microsatélites (SSR) para cuatro especies de interés comercial mundial: trigo, soja, maíz y arroz.

A continuación se presenta un resumen de los diversos puntos sobre selección y uso de marcadores de ADN para poder generar datos de calidad y que sean universalmente aceptados: a. considerar un análisis basado en estudios de especie por especie. b. acordar el tipo de marcador. c. acordar sobre el equipamiento a utilizar y la plataforma de detección. d. acordar sobre los laboratorios que se in-

5/$0&"#6)(&/$#0+'$).#0 La postura de la UPOV respecto de los marcadores moleculares es objeto de evaluación continua debido a la evolución constante de estas técnicas y a las nuevas posibilidades que ofrecen en línea con los criterios del organismo. Conforme a la actual postura de la UPOV, es posible aplicar los planteamientos del punto 1. (las características moleculares como cualidades predictivas de características tradicionales) ya que basándose en las premisas de la propuesta, ésta está en conformidad con el `$#8"#&$+!"+/'+u:ts+,+#$+%".%'.M'+/'+"-('cia de la protección suministrada en virtud del actual sistema. También es posible aplicar lo descrito en el punto 2. (comparación de niveles de umbral para caracteres moleculares con la distancia mínima en caracteres tradicionales), ya que cuando se utilizan para la gestión de colecciones de referencia está en conformidad con las disposiciones del Convenio de la UPOV ,+#$+%".%'.M'+/'+"-('(&'+!"+/'+3.$4"((&)#+21ministrada en virtud del sistema actual. Sin embargo, la UPOV considera que no se ha alcanzado un acuerdo respecto de los plan4"'%&"#4$2+!"/+31#4$+Q9+I(."'(&)#+!"+1#+#1"8$+ sistema basado en marcadores de ADN). Se ha observado que no existe consenso en relación con la aceptación de dicha opción ya que se considera que no hay conformidad con el Convenio de la UPOV. Tampoco hay acuerdo ."23"(4$+!"+2&+%".%'.M'+/'+"-('(&'+!"+/'+3.$4"(ción suministrada en virtud del actual sistema. Asimismo se ha expresado la preocupación de que si se adopta dicho enfoque, podrían utilizarse un número ilimitado de marcadores para encontrar diferencias entre variedades que estén en el plano genético que no necesariamen4"+ 2"+ ."="P"#+ "#+ ('.'(4"."2+ %$.;$/)0&($2+ I('racteres en los que se basa el sistema actual de la UPOV). U&#'/%"#4"+ 2"+ A'#+ $52".8'!$+ 1#'+ 2".&"+ !"+ cuestiones generales, como por ejemplo la ac-

R+ R+

cluyan en un posible ensayo entre laboratorios.

e. acordar sobre criterios de calidad. f.+8".&-('.+/'+;1"#4"+!"/+%'4".&'/+8"0"4'/+($# el que se trabaja. g. acordar qué marcadores se utilizarán en un primer ensayo colaborativo, cuáles laboratorios y sobre qué plataformas distintas. h. conducir un ensayo colaborativo. i. desarrollar un protocolo para evaluar los datos moleculares. j. acordar sobre el material vegetal y el grupo de materiales de referencia a ser analizado y el origen del mismo (por especie). k. analizar la colección de referencia en diferentes laboratorios, con diferentes sistemas de detección, realizando análisis por duplicado, e intercambiando muestras y extracciones de ADN si ocurre algún problema. l. utilizar variedades, muestras de ADN y/o alelos de referencia en los análisis. m.+8".&-('.+('!'+"4'3'*+&#(/1,"#!$+/'+"#4.'Y !'+!"+!'4$29+>#+/$+3$2&5/"+'14$%'4&@'.9+ n. llevar adelante un ensayo “ciego” en diferentes laboratorios utilizando la base de datos. o. adoptar un procedimiento de manera tal de poder incluir nuevos datos. (UPOV BMT Guidelines-proj-8, 2007) >#+!"-#&4&8'+"24"+4"O4$+&#!&('+71"+/$2+"#2'yos que se realicen utilizando marcadores de ADN, deben estar validados a través de un ensayo inter-laboratorio.

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 349

cesibilidad a las técnicas protegidas por patentes, la necesidad de tener en cuenta la relación ($24$2Y5"#"-(&$2+ !"+ "24$2+ #1"8$2+ "#;$71"2*+ la importancia de la relación que existe entre los caracteres fenotípicos y las técnicas mole(1/'."2+ ,*+ -#'/%"#4"*+ /'+ #"("2&!'!+ !"+ "O'%&#'.+4'%5&T=ZB'['H:G\'IJ'E#$(3'!$0)1;+$#3'>]=3B'['H:G@'IJ' ácido 3-indolbutírico (IBA). D) Etapa de Multiplicación: vástagos luego de 30 días sobre medio de multi*+$#"#$%&'>/)($3'JX'-.*+)/)&,"(3'#3&'G:GG'IJ'T=Z:')-,3-'V$/),$+-.+5%9$(3Bh'Z`Z'>Z3+$1%,'#/)#.*"#)34)vencionales y bandeo cromosómico. También, se evalúa el tamaño del genoma y se analiza el ,%):#'#,"6%'&%4':#3)#6)0)6)#"#2"#"4"6%)*,%"#-)*','14'6&"1%)*&'# 1)%>&%,'# /)# 2'3# ,6'1'3'1"3# &=4%,"#/)#2'3#,6'1'3'1"3#)*#1)&"-"3)#1%&>&%,"# tomando en cuenta las siguientes característi)*#6"?"3:#)34),%)3:#@=;6%/'3#7#4'2%42'%/)3A !'3# )3&./%'3# ,%&'()*+&%,'3# 4)61%&)*# "*"2%- cas: P# Número básico (x), número gamético (n) ?"6#2"#46)3)*,%"#/)#,6'1"&%*"#%*&6'(6)3"*&)#)*# y número somático (2n). ,.2&%9'3#7#)34),%)3#*"&.6"2)3:#,'*&6%;.7)*/'#"2# P# Tamaño absoluto y relativo de los cromo)3&./%'#/)#2"#&6"*3-)6)*,%"#/)#()*)3#)*#46'(6"somas. mas de mejoramiento. En el área agronómica, P# Posición de los centrómeros. 4'6# )1%,'QA 6)"2%?"6#)3&./%'3#()*+&%,'3#7#1"4"3#-=3%,'3A# P# Tamaño del genoma. C*#42"*)3#/)#,'*3)69",%>*#/)#2"#;%'/%9)63%P# F/)*&%0,",%>*# ,6'1'3>1%,"# 1)/%"*&)# 2"# dad la citogenética evalúa los daños genéticos localización física de secuencias (FISH). 5.)#2'3#&"D'*)3#4.)/"*#3.-6%6#4'6#)2#3%3&)1"#/)# 46)3)69",%>*# /)# 2"3# 3)1%22"3# '# 4'6# )2# %14",&'# El número básico (x), es el número menor de /)#2"#4'2.,%>*#"1;%)*&"2A## Las técnicas de citogenética molecular (hi- ,6'1'3'1"3#*),)3"6%'#4"6"#5.)#)2#'6("*%31'# bridación in situ) combinan información citoló- 3)"#9%";2)##7#6)46)3)*&"#)2#1=*%1'#/)#,6'1'gica clásica con información molecular de las 3'1"3#/)#.*"#3)6%)#4'2%42'%/)A#C2#*B1)6'#("-

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mético (n), es el número de cromosomas que 22)9"*#2"3#("1)&"3#7#4.)/)#,'%*,%/%6#'#*'#,'*# el número básico, de acuerdo con el nivel de 42'%/="# /)# 2"# )34),%)# 5.)# 3)# &6"&)A# C2# *B1)6'# somático (2n), es el número de cromosomas que llevan las células somáticas. !"3#,"6",&)6=3&%,"3#/)2#,"6%'&%4'#3'*#()*)6"21)*&)# ,'*3&"*&)3# )*# .*# (6.4'# /)# )34),%)3# 7# "B*#/)#(+*)6'3:#4)6'#"#1)*./'#',.66)*#9"6%",%'*)3#)3&6.,&.6"2)3#7R'#*.1+6%,"3#5.)#4.)/)*# ,"1;%"6#)2#*B1)6':#&"1"S'#7#4'3%,%>*#,)*&6'mérica de los cromosomas y concomitante1)*&):#2"#3%1)&6="#/)2#,"6%'&%4'A !'3# 46%*,%4"2)3# 6)"66)(2'3# ,6'1'3>1%,'3# 6)34'*3";2)3# /)# 2"3# /%-)6)*,%"3# ,"6%'&=4%,"3# )*&6)# (6.4'3# &"D'*>1%,'3# 4.)/)*# 1'/%0,"6# la forma de los cromosomas sin cambiar su *B1)6'# ,'1':# 4'6# )*A Es interesante destacar que los rearreglos )3&6.,&.6"2)3#1)*,%'*"/'3:#"2#1'/%0,"6#2"#4'3%,%>*#/)#2'3#()*)3:#4.)/)*#,"1;%"6#&"1;%+*#2"# funcionalidad de éstos aunque no se detecten ,"1;%'3#*'&'6%'3#)*#2"#1'6-'2'(="#/)2#,"6%'&%4'A K%3&%*&"3# )34),%)3# 4.)/)*# )3&"6# "%32"/"3# 6)46'/.,&%9"1)*&)#3%#)2#@=;6%/'#)*&6)#)22"3#4'see rearreglos en condición heterocigota que ',"3%'*)*#/%3&.6;%'3#)*#)2#"4"6)"1%)*&'#1)%>&%,':# 5.)# /)&)61%*)*# )3&)6%2%/"/A# C3&"3# )34),%)3# 4.)/)*# 4'3))6# 4',"3# /%-)6)*,%"3# "# *%9)2# ;%'5.=1%,':# 1'2),.2"6# '# 1'6-'2>(%,'# 4)6'# 3.3# diferencias cromosómicas las mantendrían ais2"/"3#6)46'/.,&%9"1)*&)#I)34),%)3#,6=4&%,"3QA Cuando se realizan estudios cromosómi,'3#,'14"6"/'3#*'#@"7#2)7)3#'#46%*,%4%'3#5.)# 4)61%&"*# %*-)6%6# ,"6",&)6=3&%,"3# "*,)3&6"2)3# '# /)6%9"/"3#/)2#,"6%'&%4':#7"#5.)#3)#4.)/)*#)*,'*&6"6# (6"*/)3# /%-)6)*,%"3# ,"6%'&=4%,"3# )*&6)# )34),%)3# 6)2",%'*"/"3A# C3&"3# 9"6%",%'*)3# 3'*# dinámicas y no están relacionadas con com42)*# )34",%"2#/)#2'3#,6'1'3'1"3#)*#)2#*B,2)'#IE%gura 1 A y B). Las técnicas de bandeo cromosómico ofre,)*#1"6,"/'6)3#5.)#4)61%&)*#%/)*&%0,"6#()*'1"3#7R'#,6'1'3'1"3:#3%*#)1;"6('#*'#)3#4'3%;2)# ,'*',)6# 2"3# 3),.)*,%"3# ,'146)*/%/"3# )*# dichos marcadores. Por lo tanto, las bandas C 5.)#3'*#3%1%2"6)3#)*#&"1"S'#7#4'3%,%>*#4.)/)*#

380 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

/%-)6%6# )*# 2"# ,'14'3%,%>*# /)# 3.3# 3),.)*,%"3:# $e# "2# ,'*&)*%/'# /)#JKL# /)2# ("1)&'# @"42'%/)# 2"3#,."2)3#4.)/)*#3)6#/%3,6%1%*"/"3#.&%2%?"*/'# 7#a\$e#"#2"#,"*&%/"/#/)#JKL#()*>1%,'#5.)#3)# técnicas de hibridación in situ (Figura 2 E y F). encuentra en el núcleo de células somáticas no 6)42%,"/"3A# K"/'# 5.)# 2"# 4'2%42'%/%"# )3# .*# %14'6&"*&)# 1'/'# /)# )34),%",%>*# 7# 1.,@"3# 42"*&"3# ,'*3%/)6"/"3# /%42'%/)3# I1"=?:# Arabidopsis) han 1'3&6"/'#3)6#4'2%42'%/)3#"*&%(.'3:#2'3#&)61%*'3# a9"2'6#$e#7#&"1"S'#/)2#()*'1"#4.)/)*#6)3.2&"6# "1;%(.'3# )*# )3&'3# ,"3'3A# C*# .*# /%42'%/)# ambos términos serían sinónimos. Sin em;"6(':# )*# .*# 4'2%42'%/)# )2# a9"2'6# $e# 6)46)3)*ta el contenido de ADN de todos los genomas ancestrales que lleva el núcleo gamético. En estos casos es necesario conocer el conteni/'#/)#JKL#/)2#()*'1"#;83%,'#a$De#7"#5.)#2"# 4'2%42'%/="#3>2'#".1)*&"#)2#a9"2'6#$e#4)6'#*'#)2# a$DeA# !'# )34)6"/'# )*# .*# 4'2%42'%/)# )3# 5.)# )2# a9"2'6#$e#".1)*&)#)*#-'61"#/%6),&"#,'*#)2#*%9)2# /)#42'%/="#7#5.)#)2#a$De#4)61"*)?,"#,'*3&"*&)A#G%*#)1;"6(':#)*#1.,@'3#4'2%42'%/)3#3)#';3)69>#5.)#)2#a$De#&%)*/)#"#/%31%*.%6#"#1)/%/"# 5.)# ".1)*&"# )2# *%9)2# /)# 42'%/="A# C3&'# 3.(%)6)# que ocurre disminución del tamaño del geno1"#2.)('#/)#2"#-'61",%>*#/)2#4'2%42'%/)#7#5.)# )3&)#-)*>1)*'#4'/6="#)3&"6#6)2",%'*"/'#,'*#)2# 46',)3'# /)# /%42'%/%?",%>*# ,6'1'3>1%,"# 7# ()Figura 1: A: Bandeo C en Metafase mitótica de Z. nómica. m. 334A#mexicana.#!"#`),@"#%*/%,"#.*"#;"*/"#$A#B: !"3#46%*,%4"2)3#,".3"3#/)#9"6%",%>*#I%*&6"#'# b"*/)'# KJUF# )*# ,)*&)*'A# !"# `),@"# 1.)3&6"# .*"# %*&)6)34),=0,"Q#/)2#,'*&)*%/'#/)#JKL:#/)3,"6banda de heterocromatina telomérica. C: Dos gru- &"*/'# 2"# 9"6%",%>*# )*# )2# *%9)2# /)# 42'%/=":# 3'*c# 4'3#/)#M#;%9"2)*&)3#K%",%*)3%3#/)#1"=?A#bc#$6'1'"*).42'%/=":# 4'2%1'6031'# *.1+6%,'# 4"6"# ,6'soma B. N: nucleolo. D: $'*0(.6",%>*#1)%>&%,"#)*# mosomas accesorios (cromosomas B), reesDiacinesis de maíz x Z. perennis (F1), se observan M#F#d#M#FF#d#M#FFF#7#"(6.4",%>*#)34",%"2#/)#2'3#FFA#Fc#.*%- &6.,&.6",%'*)3# ,6'1'3>1%,"3# ,'*# 4+6/%/"# '# valentes, II: bivalentes y III: trivalentes. E: Dos gru- /.42%,",%>*#/)#1"&)6%"2#()*+&%,'#7#9"6%",%>*#)*# 4'3#"3%*,6>*%,'3#/)#M#FF#,"/"#)*#J*"-"3)#F#/)#1"=?A# )2# *B1)6'# /)# ,'4%"3# /)# 3),.)*,%"3# *'# ,'/%0F:#U.)*&)3#7#-6"(1)*&'3#)*#J*"-"3)#F#/)#&6%,)4%6'A# cantes. !"3#`),@"3#1.)3&6"*#2'3#-6"(1)*&'3#7#2"3#,";)?"3# El tamaño del genoma es muy variable en/)#`),@"#%*/%,"*#2'3#4.)*&)3A#G: Asociación secun- &6)#(6.4'3#/)#42"*&"3A#C*#J*(%'34)61"3#'3,%2"# daria de bivalentes en Metafase I de Senecio mada- )*&6)#f:fM#4(#)* Cardamine amara#7#]\[:Z#4(# gascariensisA# !"# `),@"# 1.)3&6"# /'3# FF# "(6.4"/'3A# en Fritillaria assyriaca, variación que no se enH:#K)3%*"43%3#)*#U6'-"3)#F#/)#Z. luxurians x Z. m. cuentra necesariamente relacionada con nivel 334A# mexicana (F1). N: nucleolo. Barra: 10 um en /)# 42'%/="A# !"# 9"6%",%>*# /)2# &"1"S'# /)2# ()*'Fig. A-F y H. Barra: 3 um en Fig. G. ma se encuentra, a grandes rasgos, relaciona/"#,'*#/%-)6)*,%"3#)*#2"#,'142)*#/)#E).2()*# )*# '6("*%31'3# 3.4)6%'6)3# 3)# )*,'*&6># 5.)# )2# '# 4'6# ,%&'1)&6="# /)# `.&%,'3# y abióticos. Actualmente, está demostrado que cambios en el tamaño del genoma involucran 4+6/%/"# '# ("*"*,%"# /)# 3),.)*,%"3# 6)4)&%/"3# I)2)1)*&'3# &6"*34'*%;2)3:# 6)&6')2)1)*&'3:# 1%crosatélites, macrosatélites, etc). Estas se lo,"2%?"*#)*#6)(%'*)3#%*&)6(+*%,"3#7#4.)/)*#)3&"6# /%34)63"3# )*# )2# ()*'1"# '# )*# "66)(2'3# )*# tandemA# J.*5.)# 2'3# )2)1)*&'3# &6"*34'*%;2)3# 3'*#&6"*3,6%4,%'*"21)*&)#%*",&%9'3#4.)/)*#",tivarse en condiciones de variación o estrés "1;%)*&"2A# C2# )3&6+3# ()*>1%,'# 46'/.,%/'# 4'6# 2"# @%;6%/",%>*# %*&)6)34),=0,"# 7# 2"# 4'2%42'%/%?"ción, en la naturaleza o como consecuencia de 468,&%,"3#/)#1)*# del ciclo mitótico y meiótico, latitud y altitud de ,6),%1%)*&'A#G)#@"*#)*,'*&6"/'#/"&'3#5.)#4)61%&)*#3.4'*)6#5.)#/%-)6)*,%"3#)*#)2#&"1"S'#/)2# ()*'1"# 4'3))*# 3%(*%0,"/'# "/"4&"&%9'# )*# 2"# )9'2.,%>*:#/%9)63%0,",%>*#7#"/"4&",%>*#"#/%3&%*&'3# "1;%)*&)3A#J2(.*'3# ".&'6)3# 4'3&.2"*# 5.)#

existen mecanismos moleculares que generan JKL# 6)4)&%/'# *'# ,'/%0,"*&)# 5.)# ",&B"# ,'1'# mutágeno y/o agente regulador. !"# 9"6%",%>*# %*&6")34),=0,"# )*# )2# ,'*&)*%/'#/)#JKL#)3#"B*#.*#&>4%,'#/%3,.&%/'#".*5.)# existen casos, como el del género Zea, donde ha sido demostrada inequivocamente. En maíz (Zea mays#334A#mays) las diferencias en el ta1"S'# /)2# ()*'1"# 6"/%,"*:# 46%*,%4"21)*&):# )*# el número de cromosomas accesorios (cromosomas B) y en el contenido de heterocromatina /)# 2'3# ,6'1'3'1"3# /)2# ,'142)1)*&'# 6)(.2"6:# 5.)# )3&8# 6)46)3)*&"/"# )*# (6"*# 4"6&)# 4'6# ;2'5.)3# @)&)6',6'18&%,'3# /)*'1%*"/'3# ah*';3eA# C3&./%'3#,%&'()*+&%,'3#,283%,'3#6)"2%?"/'3:#4'6# *.)3&6'# (6.4'# /)# %*9)3&%(",%>*# )*# 6"?"3# *"&%vas del Noroeste argentino (NOA), revelaron 2"# )D%3&)*,%"# /)# .*"# ,'66)2",%>*# 4'3%&%9"# )*&6)# cromosomas B y altitud de cultivo, sugiriendo .*# 3%(*%0,"/'# "/"4&"&%9'# 4"6"# )3&'3# ,6'1'3'mas accesorios. Además, el análisis de la variabilidad microsatélite en estas razas de maíz ,'*061># 2"# 4"6&%,%4",%>*# /)# -.)6?"3# 3)2),&%9"3# )*#)2#1"*&)*%1%)*&'#/)#2"#,'66)2",%>*#/)3,6%4&"A !"# 46)3)*,%"# /)# ,6'1'3'1"3# ",,)3'6%'3:# 5.)# 3'*# @)&)6',6'18&%,'3:# *'# ,'/%0,"*&)3# 7# 3%*# -.*,%'*)3# 9%&"2)3# 4"6"# )2# '6("*%31':# 3'*# -6),.)*&)3# )*# 6"?"3# *"&%9"3# /)# 42"*&"3# ,.2tivadas tales como maíz y centeno. El modo 4"6&%,.2"6# /)# @)6)*,%"# /)# )3&'3# ,6'1'3'1"3:# ,'*#1),"*%31'3#/)#%14.23'#5.)#@",)*#5.)#3)# @)6)/)*#,'*#1"7'6#-6),.)*,%"#5.)#2"#)34)6"/"# 4'6#@)6)*,%"#1)*/)2%"*":#";6)#.*#*.)9'#,"14'# /)# %*9)3&%(",%>*# )*# 2'# 5.)# 3)# 6)0)6)# "# 3.# .&%2%?",%>*#,'1'#4'6&"/'6)3#/)#()*)3#B&%2)3#)*# 46'(6"1"3#/)#1)&%,'# *'61"2:# '# 3)"# ;.)*# "4"6)"1%)*&'# entre cromosomas homólogos, el cual se ve 6)`)&%,'#/)#3.3#@=;6%/'3#E]A#G%#)2# @=;6%/'# "*"2%?"/'# 4'3))# -'61",%>*# /)# FF# 7# )3# -+6&%2#3)#4.)/)#,'*,2.%6#5.)#@"7#"0*%/"/#I@'1'2'(="Q#)*&6)#3.3#()*'1"3#4"6)*&"2)3A#G%*#)1;"6(':#4'/6="#',.66%6#5.)#".*5.)#2"3#)34),%)3# 4"6)*&"2)3#&.9%)6"*#.*"#)2)9"/"#@'1'2'(="#)*# cuanto a las secuencias de ADN, los híbridos fueran estériles, con formación de univalentes IFQ# )*# 3.# 1)%'3%3A# C3&"# )3&)6%2%/"/# 4'/6="# /);)63)#"#2"#",,%>*#/)#()*)3#5.)#%*&)60)6)*#,'*# )2#46',)3'#*'61"2#/)#"4"6)"#1%)*&'#I-'61",%>*# /)2# ,'142)*# )*# 2"# -'61",%>*# /)2# @.3':#

etc.; los cuales se observarían también en el 4'2%42'%/)#/)6%9"/'A#C*#)3&'3#,"3'3#2"#1)%'3%3# %66)(.2"6#7#2"#)3&)6%2%/"/#*'#)3&"6="*#6)`)*# 6)(.2"6# /)# ;%9"2)*&)3# 7# desarrollo normal de los estados II de la meio3%3:# 4'3)"*# )2)9"/"# )3&)6%2%/"/A# U'/)1'3# )*,'*&6"6# )61.2"3# ()*>#1%,"3# 4"6"# 2'3# &"D'*)3# /)# Zea#,'*#\*V\f#IJDJD#bDbDQ:#4"6"#Zea perennis# IJ4J4J4lJ4l# b4]b4]# b4\b4\Q# 7# 4"6"# 2'3# @=;6%/'3# \*V^f# IJ4Jm4JD# b4bm4# bDQA# L.)3&6'# (6.4'#/)#%*9)3&%(",%>*#@"#)*,'*&6"/'#"/)183:# en teosintes, razas nativas de maíz e híbridos ,'*#\*V\f:#-'61",%>*#-6),.)*&)#/)#/'3#(6.4'3# /)# M# FF# ,"/"# .*':# 1.,@"3# 9),)3# "3',%"/'3# "# husos acromáticos distintos. Este doble huso sería una evidencia de la existencia de genomas ancestrales con 10 cromosomas cada uno. Este fenómeno está asociado a una leve "3%*,6'*="# /)# 2'3# /'3# (6.4'3# /)# M# FF# /.6"*&)# el desarrollo meiótico (Figura 1E). Este fenómeno ha sido observado con alta frecuencia )*# 2=*)"3# "2'42831%,"3# ';&)*%/"3# 4'6# *.)3&6'# (6.4'# /)# &6";"*#)34",%"2#/)#2'3#,6'1'3'1"3#)*#)2# *B,2)'# 46'1'9%)*/'# 2"# 3)4"6",%>*# /)# 2'3# /'3# genomas ancestrales de 10 cromosomas cada .*'A#!"#46)3)*,%"#/)#/'3#(6.4'3#"3%*,6>*%,'3# /)# M# FF# ,"/"# .*'# 4)61%&%># %*-)6%6# 2"# *"&.6"2)?"#

4'2%#42>%/)#/)#Zea (Figura 1E). En Zea y otros 4'2%42'%/)3# ,'1'# Senecio se observó asociación secundaria de II, sugiriendo la existencia de homeología entre los genomas ancestrales. C*#)2#46)3)*&)#"4"6&"/'#3)#@"#)&%,'#4)61%&)#/%2.,%/"6#)2#'6%()*#7#4'3&.2"6#2'3#1'/'3#/)#)34),%",%>*#/)#"2(.*"3#)34),%)3A#J/)183#/)#2"#.&%2%/"/#)*#)3&.dios taxonómicos y evolutivos, el conocimiento /)#2"#1)%'3%3#)3#/)#%14'6&"*,%"#-.*/"1)*&"2#)*# )3&.#/%'3#"42%,"/'3:#7"#5.)#)*#2"#46'/.,,%>*#/)# @=;6%/'3#'#4'2%42'%/)3#/)#%14'6&"*,%"#"(6'*>1%ca se debe lograr un máximo de fertilidad y esto )3&8#6)2",%'*"/'#,'*#)2#,'14'6&"1%)*&'#,6'1'sómico durante la formación de sus gametos. 5.- Citogenética molecular La Citogenética Molecular (ISH: Hibridación In Situ) combina información acerca de la morfología nuclear o cromosómica con la informa,%>*# 1'2),.2"6# /)# 2"3# 3),.)*,%"3:# 7# 4)61%&)# 6)"2%?"6# )3&./%'3# /)# 1"4)'# 7# /)# /%3&6%;.,%>*# física de las mismas, analizar relaciones evo2.&%9"3# )*&6)# )34),%)3# 7# )3&./%"6# 2"# '6("*%?"ción del genoma y la arquitectura nuclear. Por 2'#&"*&'#2"#,%&'()*+&%,"#1'2),.2"6#"4'6&"#%14'6tantes resultados a los estudios de sistemáti,":#02'()*%":#;%'/%9)63%/"/:#)9'2.,%>*:#1)*:# "# *%9)2# /)# secuencias. U"6"#6)"2%?"6#)3&"#&+,*%,"#3)#4.)den utilizar una gran variedad de sondas: desde ADN genómico total (GISH: Hibridación In Situ i)*>1%,"Q:#@"3&"#3),.)*,%"3#)34),=0,"3# FISH (Hibridación In Situ Fluorescente), tales como sondas de cromosomas individuales o -6"(1)*&'3# ,6'1'3>1%,'3# I';&)*%/"3# 4'6# 1%,6'/%3),,%>*Q:#3),.)*,%"3#/)#JKL#6)4)&%/'#)*#

384 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

tandem:#6)&6'&6"*34'3'*)3:#3),.)*,%"3#/)#()*)3#B*%,'3#'#/)#;"1%cos que ocurrieron en su evolución. Por otra 4"6&):#2'3#)D4)6%1)*&'3#/)#EFGH#4)61%&)*#/)&)61%*"6# 2"# /%3&6%;.,%>*# 7# 4'3%,%>*# /)# 1"&)6%"2# ,6'1'3>1%,'#)D&6")34),=0,':#2"#)D%3&)*,%"#/)# "4"6)"1%)*&'#7#6),'1;%*",%>*#%*&)6()*>1%,':# 7#2"#3)(6)(",%>*#46)-)6)*,%"2#/)#/)&)61%*"/'3# cromosomas o segmentos cromosómicos. U'6# 3.# 4"6&):# )2# iFGH:# )*# )2# 5.)# 3)# .&%2%?"# ADN genómico total como sonda, revela homo2'(="3#)34),=0,"3#/)2#JKL:#46%*,%4"21)*&)#)*# 2'# 5.)# 6)34),&"# "# 3),.)*,%"3# 6)4)&%/"3A# C3&"# &+,*%,"#-",%2%&":#4'6#)*# /)# 2"# *"&.6"2)?"# /)# 3.# "4"reamiento meiótico (auto o alosindético). Ade183#4)61%&)#/)&),&"6#,6'1'3'1"3#'#3)(1)*tos cromosómicos introgresantes en híbridos y generaciones segregantes, lo cual es de gran .&%2%/"/# )*# 42"*)3# /)# 1)1%,"3#%*&)6)34),=0,"3:# )*# )3&./%'3# )9'2.&%9'3# 7# &"D'*>1%,'3A# C3# %14'6&"*&)# 3)S"2"6# 5.)# 2"3# 6)2",%'*)3# ';&)*%/"3# 1)/%"*&)# iFGH# *'# 3'*# "-),&"/"3# 4'6# ()*)3# 5.)# 46'/.,)*# /%3&.6;%'3# )*# )2# "4"6)"1%)*&'# 1)%>&%,'# I"3%*"43%3:# /)3%*"43%3:# "4"reamiento homeólogo o heterólogo), siendo de (6"*#.&%2%/"/#4"6"#"*"2%?"6#@'1'2'(="3#/)#@=;6%/'3#'#4'2%42'%/)3#5.)#46)3)*&"*#)3&)6%2%/"/#(+*%,"A#J/)183:#)2#EFGH#7#)2#iFGH#46'4'6,%'*"*# información acerca de la localización cromosómica y genómica de loci transgénicos, número

7#4'3%,%>*#/)#,'4%"3#%*3)6&"3#7#3.#,'66)2",%>*# ,'*#2"#)D46)3%>*#7#2"#6)(.2",%>*A# Para los casos en que las secuencias a de&),&"6# 3'*# 1.7# ,'6&"3# I1)*'6)3# "# ^ff4;Q# 3)# @"*# /)3"66'22"/'# /%3&%*&"3# 1'/%0,",%'*)3# /)# la técnica de FISH que consisten en sistemas /)#"142%0,",%>*#/)#2"3#3)S"2)3#/)#@%;6%/",%>*:# EFGH#3';6)#0;6"3#/)#JKL:#EFGH#3';6)#,6'1'3'1"3# 4"5.%&+*%,'3# '# /)3,'*/)*3"/'3A#J/)más, se han utilizado variantes como PRINS (Primed In Situ Hybridization) y C-PRINS (Cycling PRINS), entre otras. La técnica de PRINS 3)#;"3"#)*#)2#"4"6)"1%)*&'#/)#'2%('*.,2)>&%/'3# %*%,%"/'6)3# "# 3),.)*,%"3# ,'142)1)*&"6%"3# )*# cromosomas desnaturalizados in situ, segui/'#/)#2"#)2'*(",%>*#/);%/"#"#2"#%*,'64'6",%>*:# 1)/%"*&)#.*"#JKL#4'2%1)6"3":#/)#*.,2)>&%/'3# marcados. En el C-PRINS intervienen una serie de ciclos termales análogos a la reacción en ,"/)*"#/)#2"#4'2%1)6"3"A En estudios realizados en nuestro laboratorio, la hibridación in situ# 4)61%&%># 6)9)2"6# 2"# ,'14'3%,%>*# ()*>1%,"# /)2# &6%@=;6%/'# &6%,)4%6':# que es un cereal sintético de origen trigenérico: &6%(':# ,)*&)*'# 7# "(6'4%6':# 7# ,.7"# ,'14'3%,%>*# genómica y cromosómica, luego de varios años /)# 3)2),,%>*:# )6"# /)3,'*',%/"A# C2# &6%,)4%6'# 3)# '6%(%*>#4'6#)2#,6.?"1%)*&'#/)#&6%&%,"2)#I\*VZ\Q#D# &6%('4%6'#I\*VMYQ#,.7"#E]#4'3)="#\*VZWn#2.)('# de varias generaciones de selección este híbrido se estabilizó en 2n=42. Los estudios de GISH realizados sobre los cromosomas de tri,)4%6'# K'*# N)*+# FLTJ# )142)"*/'# 3'*/"3# /)# ADN genómico de centeno (Figura 2A) y de Thinopyrum#1'3&6"6'*#]Z#,6'1'3'1"3#4)6&)*),%)*&)3#"2#()*'1"#N#/)#,)*&)*'#7#4)5.)S"3# zonas de introgresión de Thynopyrum. Con la 0*"2%/"/# /)# %/)*&%0,"6# 2"# &'&"2%/"/# /)# 2'3# ,6'1'3'1"3# /)2# &6%,)4%6'# 3)# )142)"6'*# 2"3# 3'*das pSc119.2 (aislada de centeno y que hibri/"#,'*#4"&6'*)3#,"6",&)6=3&%,'3#3';6)#&'/'3#2'3# cromosomas de los genomas R y B de trigo y sobre algunos cromosomas de los genomas A y D de trigo), pAs1 (aislada de Aegilops squarrosa y que hibrida sobre los cromosomas del genoma D de trigo), y pTa71 (aislada de trigo y que revela zonas organizadoras del nucléo2'#4'65.)#,'*&%)*)#()*)3#6%;'3'1"2)3QA#C3&'3# )D4)6%1)*&'3#1'3&6"6'*#2"#46)3)*,%"#/)#Y#?'nas de ADN ribosomal, 2 en cromosomas de

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 385

centeno y 4 en cromosomas trigo (Figura 2B), 1%)*&6"3#5.)#2"#,'2'6",%>*#,'*#42"&"#IJ(OLoNQ# indicó que sólo 4 de ellas eran activas forma/'6"3#/)#*.,2+'2'3A#G)#,'146';>#)*&'*,)3#.*# -)*>1)*'#/)#3.46)3%>*#%*&)6()*>1%,"#5.)#22)vó al silenciamiento de los genes ribosomales /)#,)*&)*'#)*#46)3)*,%"#/)2#()*'1"#/)#&6%(':# I"*042"3&="QA# U'6# 2'# )D4.)3&'# 3)# 4.)/)# /)/.cir que el uso conjunto de las técnicas clásicas 7# /)# FGH# 4)61%&%># )3&";2),)6# 5.)# 2"# ,'14'3%,%>*#()*>1%,"#7#,6'1'3>1%,"#/)#&6%,)4%6'#K'*# René INTA es AABBRR, con introgresión de Thinopyrum#)*#)2#,6'1'3'1"#YJ#IE%(.6"#\JQ. U'6# '&6"# 4"6&):# )D4)6%1)*&'3# /)# EFGH# .&%2%?"*/'#2"3#1%31"3#3'*/"3#*'3#4)61%&%)6'*#,"racterizar distintas líneas de Triticale obtenidas )*#*.)3&6'#4"=3A C*# 2"# (6"1=*)"# 4"&"(>*%,"# Bromus pictus I\*V[fQ# @)1'3# 6)"2%?"/'# )D4)6%1)*&'3# /)# GISH que han demostrado que Bromus setifolius#I\*V\XQ#)3#.*'#/)#3.3#46'()*%&'6)3#IE%(.ra 2C). Esta información evolutiva es relevante 4"6"# )2# 1)*# /)# )3&"#4'&)*,%"2#)34),%)3#-'66"(%camente observables mediante bandeo C y DAPI. C3&'3#4.)/)*#)3&"6#,'*3&%&.%/'3#4'6#/'3# -"1%2%"3#/)#JKL#"2&"1)*&)#6)4)&%/'#)*#tandem

I]Xf4;# 7R'# TNO]QA# C*# *.)3&6'# 2";'6"&'6%'# 6)"2%?"1'3# )D4)6%1)*&'3# /)# EFGH# 4"6"# /%2.,%/"6# 2"#,'14'3%,%>*#/)#3),.)*,%"3#/)#2"3#/%3&%*&"3# ;"*/"3#@)&)6',6'18&%,"3#'#h*';3#IKJUFdQA#C3&'3# *'3# 4)61%&%)6'*# ';3)69"6# 5.)# )D%3&)# (6"*# 9"6%";%2%/"/# )*# 2"# ,'14'3%,%>*# /)# 3),.)*,%"# /)#2'3#/%3&%*&'3#ah*';3e#2'#,."2#6)3.2&>#/)#(6"*# .&%2%/"/#4"6"#,"6",&)6%?"6#2"3#2=*)"3#7#6"?"3#/)# maíz y teosintes estudiadas hasta el momento (Figuras 2G y 2H). En maíz y teosintes los métodos de GISH y EFGH# *'3# 4)61%&%)6'*# "*"2%?"6# 2"3# "0*%/"/)3# genómicas existentes entre los distintos xones de ZeaA# _*# )61.2"3#()*>1%,"3#42"*&)"/"3# 4"6"# 2"3# /%3&%*&"3# )34),%)3# /)# Zea, avalando )2#'6%()*#4'2%42'%/)#/)2#1"=?#7#/)#3.3#)34),%)3# silvestres relacionadas. o&6'#"34),&'#5.)#3)#@"#/)3"66'22"/'#B2&%1"mente dentro de la citogenética molecular es el de la microdisección y clonado de cromo3'1"3# '# 3),,%'*)3# ,6'1'3>1%,"3A# C*# 42"*tas, es muy útil como fuente de sondas y se "42%,"#4"6"#"*"2%?"6#()*'1"3:#4"6"#)3&";2),)6# 6)2",%'*)3#)*&6)#,6'1'3'1"3#7#(6.4'3#/)#2%("1%)*&'#)34),=0,'3:#2',"2%?"6#()*)3#/)#%*&)6+3:# y relacionar las distancias físicas y genéticas )*#1"4"3#/)#2%("1%)*&'A U'6#&'/'#2'#)D4.)3&'#4'/)1'3#,'*,2.%6#5.)# la citogenética molecular es de gran utilidad en estudios evolutivos, sistemático-taxonómicos 7# "42%,"/'3:# 7"# 5.)# )*# )2# )3&./%'# /)# 2"3# 6)2",%'*)3#()*>1%,"3#)*&6)#)34),%)3#1.)3&6"#2"3# similitudes entre sus genomas y la distribución -=3%,"# /)# 2"3# 3),.)*,%"3# 6)4)&%/"3# 5.)# ,'14"6&)*A#C*#)2#"*82%3%3#/)#@=;6%/'3#7#4'2%42'%/)3# *"&.6"2)3#'#"6&%0,%"2)3:#4)61%&)#,'*',)6#/)2#'6%()*#/)#@=;6%/'3#%*&)6)34),=0,'3:#/)&)61%*"6#)2# origen genómico de los cromosomas involu-

386 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

Libros ,6"/'3#)*#/%3&%*&"3#,'*0(.6",%'*)3#1)%>&%,"3:# establecer las relaciones genómicas entre las )34),%)3#4"6)*&"2)3:#"*"2%?"6#2'3#/'1%*%'3#,6'- b)**)&&# qA# KA# "*/# !)%&,@# FAsA# \ffMA# i)*'1)# 3%?)# )9'2.&%'*# %*# 42"*&3A# F*c# T@)# )9'2.&%'*# '-# &@)# 1'3>1%,'3# /)# ,"/"# ()*'1"# 4"6)*&"2# I3.# "6()*'1)3A#i6)('67#TAN#I)/AQA#C23)9%)6#F*,A#44#XWO quitectura nuclear), detectar cromosomas y/o ]Y\A introgresadas y translocaciones intra e intergeb)**)&&# qA# KA# ]WWMA# T@)# /)9)2'41)*&# "*/# .3)# '-# nómicas. Agradecimientos: A la SECyT, a la Agencia de Promoción $%)*&=0,"# 7# T+,*%,"# 7# "2# $oLF$CT# 4'6# 0*"*,%"6# 2'3# 46'7),&'3# UF$T# ]Z]]W:# UFU# MW\[# 7# PICT 14170; a la Universidad de Buenos Aires 4'6#)2#'&'6("1%)*&'#/)#2'3#3.;3%/%'3#Cp][X#7# CpZZYA#J3%1%31':#"(6"/),)1'3#"#2"#E",.2&"/# de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) donde 3)#22)9"*#"#,";'#2"#1"7'6#4"6&)#/)#2"3#&"6)"3# /)#%*9)3&%(",%>*A#J2#G6A#K%)('#E%*h#4'6#2"#,'*fección de las láminas. Literatura recomendada Artículos E)66"6%#qANA:#i6)%6?)3&)%*#H#CA:#U","4)2'#JA:#L"6"**#)*#2'3#-'66"*#/)#42"*&"3# &6"*3(+*%,"3# ;6%*/"*# 2"# 4'3%;%2%/"/# /)# ()-

nerar variación genética cuando esta es inexistente o tiene una heredabilidad muy baja. En 2"# ",&."2%/"/# 3)# /%34'*)# /)# 1)&'/'2'(="3# )0,%)*&)3#4"6"#2"#&6"*3-'61",%>*#/)#-'66"*#"#,"14'#/%3&%*&"3#)34),%)3# -'66"*# /)#46'&)=*"3#)34),=0,"3A#!"#&),*'2'(="#(+*%,"# 4)61%&)#%/)*&%0,"6#2"3#46'&)=*"3#%*9'2.,6"/"3#7# 2"3# )*?%1"3# ,2"9)# "# 3)6# 1"*%4.2"/"3:# )2# "%32"1%)*&'# /)# 2'3# ()*)3# ,'66)34'*/%)*&)3# 7# 2"# 1"*%4.2",%>*#/)#3.#)D46)3%>*#)*#42"*&"3#&6"*3génicas. A continuación desarrollaremos ejem42'3#/)#/%3&%*&"3#"42%,",%'*)3A

2.1.1 Manipulación de la biosíntesis de lignina C2#46%*,%4"2#';*#7# digestibilidad de los forrajes. Los efectos negativos de la lignina sobre la /%()3&%;%2%/"/#/)4)*/)*#/)#3.#,'*&)*%/':#,'14'3%,%>*# /)# 1'*>1)6'3# 7# (6.4'3# -.*,%'*"2)3# 7# /)2# (6"/'# /)# )*&6),6.?"1%)*&'# ,'*# 2'3# 4'2%3",86%/'3# /)# 2"# 4"6)/# ,)2.2"6A# !"# 2%(*%0,",%>*# )3# .*# 46',)3'# "2&"1)*&)# ,''6/%*"/'# 7# 6)(.2"/'# 4'6# .*# ,'**#()*+&%,"#/)# ligninas, a saber: la síntesis de monolignoles, )2# &6"*34'6&)# /)# 2'3# 1%31'3# /)3/)# )2# 3%&%'# /)# 3=*&)3%3#"2#/)#4'2%1)6%?",%>*:#7#)2#/)#4'2%1)6%?",%>*#/)#1'*'2%(*'2)3#4"6"#/"6#2'3#46'/.,&'3# 0*"2)3A#_*"#/)#2"3#)3&6"&)(%"3#183#)D42'6"/"3# 4"6"#1)*#*)("&%9"#/)#2"#)D46)3%>*#/)# COMT, CAD y 4CL conduce a una alteración )*#2"#,'14'3%,%>*#/)#2"#2%(*%*":#'#"#.*"#/%31%nución de su contenido, con incrementos signi- Figura 2. B) q"4)'#/)#2'3#()*)3#,'66)34'*/%)*&)3# 0,"&%9'3#)*#2"#/%()3&%;%2%/"/#/)#2"#1"&)6%"#3),"A# "#2"#9="#/)#;%'3=*&)3%3#/)#2%(*%*":#)*#2'3#(6.4'3#/)# En algunos de estos casos la lignina resultó 2%("1)*&'#!i\#7#!i[#/)#6"%(683#4)6)**)A

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 391

C*#)3&"#)34),%)#&"1;%+*#3)#6)(.2"6'*#*)("&%vamente las enzimas CAD y COMT. Dado que los genes estructurales involucrados en la biosíntesis de lignina se encuentran 6)(.2"/'3# "# *%9)2# /)# &6"*3,6%4,%>*:# '&6"# )3&6"&)(%"# 4"6"# 2"# 1"*%4.2",%>*# ()*+&%,"# %*9'2.,6"# 2"#1"*%4.2",%>*#/)#-",&'6)3#/)#&6"*3,6%4,%>*#/)# &%4'#qybA C2# 6),%)*&)# %*&)6+3# )*# 2"# 46'/.,,%>*# /)# ;%','1;.3&%;2)3# "# 4"6&%6# /)# ,)2.2'3"# @"# %14.23"do la ingeniería genética de ligninas, utilizando como sistemas modelo cultivos energéticos como Populus trichocarpa y Brachypodium distachyon. La gran cantidad de biomasa que 46'4'6,%'*"*# 2'3# -'66"*#/)#.*#()*#1%,6';%"*'#4"6"#2"# fructosiltransferasa (gen SacB) de Bacilus subtilis )*#42"*&"3#/)#&";",'#7#4"4":#5.)#,"6),)*# de fructanos y acumulan almidón, condujo a la acumulación de cantidades considerables de -6.,&"*'3# /)# )2)9"/'# 4)3'# 1'2),.2"6:# 5.)# 2)3# ,'*06%)6'*#.*#1)*#/)#2"#;%'3=*&)3%3#/)#-6.,&"*'3# )*# 42"*&"3# &6"*3(+*%,"3# 4"6"# 1)*#/)# 2'3#()*)3:#)2#*B1)6'#/)#,'4%"3#7#3.#.;%,",%>*#

392 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

)*#)2#1"4"#()*+&%,'#3)#/)&)61%*"6'*#.&%2%?"*do marcadores moleculares. También se cons&6.7)6'*#9),&'6)3#4"6"#2"#6)(.2",%>*#1)/%"*&)# ARN sentido y antisentido de los genes men,%'*"/'3A#!"3#,'66)34'*/%)*&)3#42"*&"3#&6"*3(+*%,"3#3)#.&%2%?"*#4"6"#2"#/%3),,%>*#1'2),.2"6# /)2#1)&";'2%31'#/)2#-6.,&"*'3#7#4"6"#,'146)*/)6#3.#6'2#03%'2>(%,'#)*#2"3#42"*&"3:#7#&"1;%+*# 4"6"# 1)*#/)#5.)#+3&'3#-.*,%'*"68*#)*#2"#;%'síntesis de taninos. El estudio de mutantes de la vía metabólica /)#2'3#`"9'*'%/)3#)*#Arabidopsis#46'4'6,%'*># abundante información acerca de la identidad de las enzimas involucradas en la síntesis de &"*%*'3# )*# )3&"# )34),%)A# C3&'# 4)61%&%># )2# ,2'nado, entre otros, de los genes CHS, CHI, F3H

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 393

y DFR:#7#/)#2"#%/)*&%0,",%>*#7#,2'*"/'#/)2#()*# BAN (BANYULSQ:# 5.)# 4"6),)# 3)6# )34),=0,'# de la vía de biosíntesis de taninos. Por otro lado se ha intentado la regulación negativa o 4'3%&%9"#/)#)*?%1"3#,2"9)#5.)#6)(.2"*#)3&"#9="# chalcona sintetasa (CHS) y leucoantocianina-4 6)/.,&"3"# I!JNQ:# '# 2"# )D46)3%>*# /)# ()*)3# 6)(.2"/'6)3# 5.)# &%)*)*# .*# ",,%'*"6# 42)%'&6>4%,'# I,'*# )-),&'3# "# 9"6%'3# *%9)2)3# -)*'&=4%,'3QA# _*# )*# ,'*3&%&.&%9"# /)# ()*)3# 5.)# ,'/%0,"*# 46'&)=*"3#"*&%-B*(%,"3#IJEU3Q#)*#42"*&"3#&6"*3(+*%,"3:#;"()*'3A# N),%)*&)1)*&)#3)#';&.9%)6'*#42"*&"3#/)#-)3tuca alta con elevados niveles de resistencia a R. solani y a P. grisea, mediante la transformación genética simultanea con cuatro genes: *#+*#+*),-., 3 glucanasa AGLU1, fago T4 lisozima, dermaseptin rana, y arroz Pi9. 2.2.2 Transgénesis para incrementar la resistencia a enfermedades virales La mayoría de los métodos clásicos utiliza/'3#4"6"#46)9)*%6#2"3#%*-),,%'*)3#9%6"2)3#3'*#2"boriosos y económicamente inviables. Se han %/)*&%0,"/'#-.)*&)3#4'&)*,%"2)3#/)#&'2)6"*,%"#'# 6)3%3&)*,%"#)*#"2-"2-"#7#)*#.*"3#4',"3#)34),%)3# de Trifolium:#4)6'#*'#)D%3&)#.*"#6)3%3&)*,%"#*"tural a estos virus que sea transferible, efectiva 7#/.6";2):#7#5.)#4.)/"#3)6#%*,'64'6"/"#"#,.2&%vares de leguminosas forrajeras. La tecnología (+*%,"#)3#.*"#'4,%>*#"&6",&%9"#4"6"#2'(6"6#)3&)# ';2"6)3# 4'6# "S'A# Cada uno de ellos infecta individualmente a un (6"*#*B1)6'#/)#)34),%)3#/%3&6%;.%/"3#4'6#&'/'# )2#1.*/'A#_*"#%*&)6)3"*&)#"42%,",%>*#/)2#1)*#/)#4"&>()*'3# 1%)*&6"3#",,%'*"*#3';6)#2"#42"*&"A#C*#4"3&.6"3# %*-),&"/"3#4'6#/)*3"3#4';2",%'*)3#/)#%*3),&'3# 42"("#3)#46'/.,)*#/%31%*.,%'*)3#)*#2"#46'/.,,%>*#/)#1"&)6%"#3),"#5.)#9"*#/)2#\f#"2#ZfgA k"6%'3# %*3),&'3# ,'1'# Wiseana spp, Costelytra zealandica, Teleogryllus commodus, Sminthurus viridis, Sitona spp, Coleophora spp, Inopus rubriceps y Acyrthosiphon spp 4.)/)*# ,".3"6# /"S'3# 3%(*%0,"&%9'3# "# 2)(.1%*'3"3# 7# (6"1=*)"3A#J#0*#/)#%*,6)1)*&"6#2"#6)3%3&)*,%"#"# los mismos se han utilizado distintos enfoques transgénicos. Uno de ellos es la utilización de 2"#46'&)=*"#,6%3&"2%*"#)#%*@%;%/'6)3#/)#46'&)"3"3# de Bacillus thuringiensis (BtQA# U'6# )*#*)gativamente los alergenos del mismo. Estudios 6)"2%?"/'3#,'*#2"3#42"*&"3#&6"*3(+*%,"3#Lolp1 y Lolp2 revelaron una disminución en los niveles /)#)D46)3%>*#/)#2'3#"2)6()*'3#)*#)2#4'2)*A#!"3# 42"*&"3# /)# 6"%(683# &6"*3-'61"/"3# ,'*# Lolp1 )9%/)*,%"6'*# .*# /)3"66'22'# 6)46'/.,&%9'# *'61"2# 7# 4'2)*# 9%";2)A# C3&'3# )3&./%'3# 4)61%&%68*# ,'146)*/)6#"B*#1"3#)2#6'2#-.*,%'*"2#/)#)3&'3# "2)6()*'3# )*# 2"# 42"*&"# 7# )D42'6"6# )2# 4'&)*,%"2# 4"6"# 2"# ';&)*,%>*# /)# ,.2&%9"6)3# /)# 6"%(683# @%4'"2)6(+*%,'A# 2.3.2 Manipulación de cambio de fase y &'(*/%01 La disminución del valor nutritivo en algunas -'66"*#)*#-'66"*#/)2#/)3"66'22'#6)46'/.,&%9'#)*# forrajeras es el gen indeterminate 1 (ID1). Este ()*# /)3)14)S"# .*# 6'2# %14'6&"*&)# )*# )2# ,'*&6'2#/)#2"#%*%,%",%>*#`'6"2#7#)*#)2#1"*&)*%1%)*&'# /)# .*# )3&"/'# `'6"2# /)&)61%*"/'# )*# 1"=?A# G.# mutación es la única conocida en monocotile/>*)"3#5.)#;2'5.)"#)34),=0,"#7#3)9)6"1)*&)# 2"#&6"*3%,%>*#@",%"#.*#,6),%1%)*&'#6)46'/.,&%9'A# Recientemente se aisló y caracterizó un ADNc /)# 42"*&"3# /)# 6"%(683# 4)6)**)# @'1>2'('# /)# )3&)#()*A#G)6="#)34)6";2)#5.)#2"#%*@%;%,%>*#/)# la transición del estado vegetativo a la forma,%>*#/)#,"S"3#`'6"2)3#)#%*`'6)3,)*,%"3#)*#(6"míneas incremente la calidad del forraje y, en consecuencia también disminuya la cantidad /)#"2)6()*'3#/)2#4'2)*A !"# %*@%;%,%>*# '# )2# ,'*&6'2# /)# 2"# `'6",%>*# )*# -'66"*# /)#3)1%22":#)3&)#;2'5.)'#/)#2"#`'6",%>*#/);)6="# 3)6#6)9)6&%/'A#_*"#4'3%;%2%/"/#4"6"#2'(6"6#)3&)# 0*#3)6="#2"#.&%2%?",%>*#/)#.*#46'1'&'6#%*/.,%;2)# 4"6"#,'*&6'2"6#2"#3.46)3%>*A

G)#@"*#.&%2%?"/'#/%-)6)*&)3#)*-'5.)3#4"6"#2"# 1"*%4.2",%>*# /)2# /)3"66'22'# 6)46'/.,&%9'# 5.)# 4'/6="*#,'*/.,%6#"#.*#;2'5.)'#/)#2"#`'6",%>*:# "2#/)3"66'22'#/)#2"#"4'1%D%3#I&%4'#/)#6)46'/.,,%>*# "(81%,"# ,'1B*# )*# ,%)6&"3# )34),%)3# /)# gramíneas) y androesterilidad (esterilidad de 2"# 4"6&)# 1"3,.2%*"# /)# 2"# 42"*&"Q:# 5.)# "/)183# 4'3%;%2%&"6="*# )2# 1"*&)*%1%)*&'# /)# 2'3# &6"*3()*)3A#C3&'#)3#/)#4"6&%,.2"6#%14'6&"*,%"#4"6"# -'66"*#";%)6&":# 1)/%"/"#4'6#)2#9%)*&':#7"#5.)#2"#/%34)63%>*#/)2# 4'2)*#)3#.*#-",&'6#%14'6&"*&)#)*#2"#)9"2.",%>*# de riesgo de las gramíneas genéticamente mo/%0,"/"3A 2.3.3 Manipulación de la senescencia G)# @"# ';3)69"/'# )*# 42"*&"3# &6"*3(+*%,"3# 5.)# 2"# 46'/.,,%>*# ".&'66)(.2"/"# /)# ,%&',%*%nas inhibe la senescencia foliar (envejecimiento de la hoja que culmina en la muerte de la misma). Este sistema se basa en la utilización /)#.*#46'1'&'6#)34),=0,'#/)#3)*)3,)*,%"#/)# A. thaliana:# )2# GJi]\:# 5.)# ,'*&6'2"# 2"# )D46)3%>*# &6"*3(+*%,"# /)# .*# ()*# 4"6"# 2"# %3'4)*&)nil transferasa (ipt) de Agrobacterium tumefaciens. C2#46'/.,&'#/)#)3&)#()*#,"&"2%?"#.*#4"3'# )*#2"#;%'3=*&)3%3#/)#,%&',%*%*"3A#!"3#42"*&"3#5.)# )D46)3"*#)3&)#()*#46)3)*&"*#.*#6)&6"3'#)*#2"# senescencia foliar y no exhiben anomalías de *%*(B*#&%4'A#C*#&6+;'2#;2"*,':#()*)3#"*82'('3# de ipt quiméricos ;"()*'# ;%'2>(%,'# 7# 2"# @";%2%/"/# 4"6"# ,6),)6# )*# 86)"3# 1"6(%*"2)3# 5.)# 4'3))*# 2"3# -'66"*# )2)9"/'3# 7# ,'*&)*)6# 2'3# &6"*3()*)3:#4)61%&%6="#.&%2%?"6#"#2"3#-'66"*#/)#)*?%1"3#%*/.3&6%"2)3:# 46'/.,&'3# -"61",+.&%,'3:# 9",.*"3:# "*&%,.)64'3# 7# 4283&%,'3# ;%'/)(6"/";2)3# )*&6)# otros. La alfalfa tiene ciertas características que la convierten en un interesante bioreactor. C*&6)#)22"3#3)#/)3&","*#2"#4)6)**%/"/#7#2"#,"4",%/"/#/)#46'/.,%6#/'3#>#&6)3#,'3),@"3#)*#)2# año, existiendo además la tecnología adecua/"#4"6"#)D&6")6#2"3#46'&)=*"3#/)#%*&)6+3#/)*#/)#2'3#&6"*3()*)3:#)9"2."6#2'3#*.)9'3# -)*'&%4'3#)#%/)*&%0,"6#2'3#)9)*&'3#/)#&6"*3-'61",%>*# "/),."/'3# 4"6"# )2# /)3"66'22'# /)# ()61'42"31"# 7# ,.2&%9"6)3# &6"*3(+*%,'3# )3# *),)3"6%'#6)"2%?"6#)*3"7'3#/)#,"14'#42"*%0,"/'3:# )*#46%*,%4%'#)*#4)5.)S"#)3,"2"A G'2'#/)34.+3#/)#@";)6#6)"2%?"/'#)3&"3#)9"2.",%'*)3# 3)# 4.)/)*# %*&)(6"6# )3&'3# 1"&)6%"2)3# )*# 46'(6"1"3# /)# 1)*#/)# 42"*&"3#&6"*3(+*%,"3#IE%(.6"#^QA 01*#/)#,.2&%9"6)3#3%*&+&%,'3#IE%(.ra 3B). En la Figura 3B se muestra la estrategia

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 397

)*&6)# 2"# 46'()*%)# T]# IC&"4"# \Qn# %/)*&%0,",%>*# 4'6#U$N#,."*&%&"&%9"#'#,6.?"#/)#46.);"#/)#2"3# 42"*&"3#T\#5.)#3'*#@'1',%('&"3#4"6"#2'3#&6"*3()*)3# IC&"4"# ^QA# U'6# B2&%1':# 2"3# 42"*&"3# elite @'1',%(>&%,"3# 4"6"# 2'3# &6"*3()*)3# 3'*# 3)1;6"/"3#4"6"#3.#3)2),,%>*#)*#.*#,6%"/)6'#1%,":# 2'# ,."2# 3%(*%0,"# que se cuenta con gran cantidad de nuevas @)66"1%)*&"3# 7# &),*'2'(="3# 4"6"# )2# /)3,.;6%Figura 3. A)#C35.)1"#/)#2"#2%;)6",%>*#"#,"14':#"# 1%)*&'# /)# ()*)3# 7# 4"6"# )2# "*82%3%3# (2';"2# /)# 4)5.)S"#)3,"2":#/)#42"*&"3#&6"*3(+*%,"3#/)#&6+;'2# 2'3# ()*'1"3A# T'/'# )3&'# "4'6&"68# %*-'61",%>*# ",)6,"# /)# &'/'3# 2'3# "34),&'3# /)2# ,6),%1%)*&'# ;2"*,'#%*1.*)3#"#JqkA 9)()&"2:#/)3"66'22':#/%-)6)*,%",%>*#7#6)34.)3&"3# a estreses bióticos y abióticos, revolucionando )2#1)*# /)#;"3)3#/)#/"&'3#/)#2'3#46%*,%4"2)3#,.2&%9'3n# 4'3%;%2%&"*/'# 2"# %/)*&%0,",%>*:# ,"6",&)6%?",%>*# -.*,%'*"2#7#.3'#/)#()*)3#9"2%'3'3#4"6"#2'3#3%3&)1"3#/)#46'/.,,%>*#/)#-'66"&%,'#/)#2"#46'()*%)#5.)#22)9"#)2# transgén y está ligado al gen marcador npt2, o "*82%3%3#4'6#U$N:#3)(.%/'#4'6#,6.?"3#/%"2+2%,"3#

3.1 Descubrimiento de genes y microarreglos para el análisis de la ,>7:,8$()*#,*+,),8*,)*7/').'8*9"::';,:'8 !"3#)34),%)3#1'/)2'#4"6"#2"3#,."2)3#3)#@"*# )*,"6"/'#46'7),&'3#/)#()*>1%,"#;"3"/'3#)*# ESTs son Lotus japonicus y Medicago truncatula. Se han generaron mas 220.000 ESTs de M. truncatula# 4'6# ,'*3'6,%'3# %*&)6*",%'*"2)3# 0*"*,%"/'3# 4'6# )2# 1B2&%42)3# )*&)/%/"3# /)# /%9)63'3#4"=3)3A#o&6'#46'(6"1"#)*&6)#Agriculture Victoria-DNRE (Australia) y AgResearch Limited (Nueva Zelanda) generó mas de 100.000 CGT3#/)#,.2&%9'3#-'66"*# 1'2),.2"6A# C3&'# ,'146)*/)# )2# "*82%3%3# /)# 4"&6'*)3# /)# )D46)3%>*# (2';"2# '# 4"&6'*)3# /)# )D46)3%>*# )34),=0,'3# .&%2%?"*/'# Figura 4. B) Análisis de la imágen de los microarre@%;6%/",%>*# ,'*# 3'*/"3# ,'142)*#-)*'&=4%,"#,'*9)*,%'*"2A C2# "*82%3%3# ,'14"6"&%9'# /)# 3),.)*,%"3# 7# datos de microarreglos de raigrás y tréboles con aquellos de Arabidopsis y arroz, conjun&"1)*&)#,'*#2'3#46'(6"1"3#/)#/)3,.;6%1%)*&'#

Figura 4. C) Microarreglos de ADNc de trébol blan,'#.&%2%?"*/'#NLJ#/)#@'*%,"A

Figura 4. A)#U)602)3#/)#)D46)3%>*#"#&6"9+3#/)#1%,6'"66)(2'3#/)#JKL#.&%2%?"*/'#/'3#,'2'6"*&)3#`.'6)3,)*&)3# I$7M# 7# $7^Q# 4"6"# 1"6,"6# /'3# 1.)3&6"3# /)#NLJ#&'&"2#46'9)*%)*&)3#/)#/%3&%*&"3#3%&.",%'*)3# /)# ,6),%1%)*&'# '# /)3"66'22':# 4'6# )*#/)#()*)3#/)#6"%()*)3# 5.)# )3&8*# 6)(.2"/'3# 4'3%&%9"1)*&)# )*# "1- (683:#,'14"6"*/'#()*)3#5.)#3)#)D46)3"*#)*#&"22'# y raíz. bas situaciones.

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 399

de ESTs en M. Truncatula:#@"*#"4'6&"/'#%*-'6Agriculture Victioria-DNRE también ha en1",%>*# ",)6,"# /)# 2'3# "34),&'3# ,'*3)69"/'3# ,"6"/'#.*#46'(6"1"#/)#()*>1%,"#/)#)*/>0&'3# y divergentes en la organización y función del de gramíneas, focalizado en el descubrimiento genoma de gramíneas y leguminosas. /)# ()*)3# (6"1=*)"O)*/>0&'# )*# 2"# "3',%",%>*# Festuca arundinacea/Neotyphodium coeno?10*@$6A$"*B*7'."+,)(6$&' phialumA# J# &6"9+3# /)# )3&)# 46'(6"1"# 3)# @"*# Las leguminosas y gramíneas ofrecen la ()*)6"/'#"46'D%1"/"1)*&)#XAfff#3),.)*,%"3# 4'3%;%2%/"/#/)#)3&./%"6:#"#*%9)2#()*>1%,':#%*&)- del hongo que se analizaron a través de soft6",,%'*)3#/)#/%3&%*&'3#&%4'3#,'1'#4'6#)*#';&)*%/"#)*#)3&'3#)3- "4'6&)# /)# *.&6%)*&)3# 4"6"# )2# @'*('# )*/'-=&%,'# &./%'3#3)68#/)#(6"*#9"2'6#4"6"#/)3"66'22"6#6)3%3- y en la biosíntesis de metabolitos secundarios &)*,%"#"#4"&>()*'3#7#1)*# ",)6,"# /)# 2"# %*&)6",,%>*# El trabajo de descubrimiento de genes en )*/>0&'O@.+34)/:# "3=# ,'1'# /)# 2'3# 1),"*%3M. truncatula está orientado a estudiar la res1'3#03%'2>(%,'3#,'*/.,)*&)3#"#.*#%*,6)1)*&'# 4.)3&"#/)#2"#42"*&"#"*&)#2'3#4"&>()*'3#7#"#,")*#)2#9%('6#/)#2"#42"*&"#7#"#.*"#1"7'6#&'2)6"*6",&)6%?"6#/%-)6)*&)3#3%3&)1"3#4"&'(+*%,'3#5.)# cia a estreses. Estas herramientas genómicas incluyen hongos como Colletotrichum trifolii y 7#)2#,'*',%1%)*&'#()*)6"/'#4'3%;%2%&"68*#)2#/)Phytophthora medicaginis, y bacterias como 3"66'22'#/)#&),*'2'(="3#4"6"#1"*%4.2"6#2"#"3'Xylella fastidiosa y Xanthomonas alfalfae. Para mediados del 2000 el US M. truncatu- ,%",%>*#(6"1=*)"O)*/>0&'#7#"3=#%*,6)1)*&"6#)2# la Functional Genomics Project generó 27.000 6)*/%1%)*&'#/)#2"#42"*&":#1)&%,'3#7#"2&)6"6#2"#)34)de hojas infectadas con Colletotrichum, \AZY\# ,%0,%/"/#)*/>0&'#@.+34)/#"#0*#/)#;)*)0,%"6#"# ESTs de hojas infectadas con Phytophthora, 2"#%*/.3&6%"#/)2#,+34)/#7#/)2#-'66"*#/)#2"#&'D%las leguminosas utilizando L. japonicus como *"A#!"#46'&),,%>*#/)#2'3#1)6%3&)1"3#/)#Lolium modelo. C3&)#46',)3'#/)#*'/.2",%>*#%*9'2.,6"# /)#.*#)D,)3'#/)#@)6;%9'6="#)3#9%&"2#4"6"#)2#+D%&'# 2"# %*&)6",,%>*# ,'142)*#/)#)3&"#7#'&6"3#)3*'3# 7# 3.3# 46'/.,&'3:# ,'*# 46',)3'3# /)# /)3"- 4),%)3#/)#(6"1=*)"3A#C2#/)3"66'22'#/)#"3',%"66'22'#)*#2"#42"*&"#5.)#%*9'2.,6"*#4)6,)4,%>*#7# ,%'*)3#3%1;%>&%,"3#)*&6)#(6"1=*)"3#7#)*/>0&'3# transmisión de señales y morfogénesis. El ob- /)2#(6.4'#Epichloë/ Neotyphodium 6)46)3)*&"# *#(2';"2#/)#()4 Resumen y conclusiones nes con microarreglos basados en las mismas. 3", -0&, 4-#!.0&, +/0&, &$, 5+, %$+-!6+10, 7", C3&'# 4'3%;%2%&"68# 2"# ';&)*,%>*# /)# ()*)3# ,2"9)# considerable progreso en el establecimiento 7#9"6%"*&)3#/)#()*)3#/)#42"*&"3#)D>&%,"3:#1.- de las metodologías requeridas para chos de ellos nuevos y la determinación de sus el mejoramiento molecular de plantas 4"&6'*)3#/)#)D46)3%>*#)*#6)34.)3&"#"#)3&6)3)3# forrajeras. Numerosas estrategias ";%>&%,'3#)34),=0,'3A biotecnológicas están siendo consideradas _*# 46'(6"1"# /)# D)*'O()*>1%,"# 22)9"/'# en relación al mejoramiento de la calidad "# ,";'# 4'6# Agriculture Victioria-DNRE se en- nutritiva a través de la alteración en la cuentra abocado a seleccionar gramíneas y biosíntesis de lignina, carbohidratos leguminosas australianas nativas y exóticas, solubles y protoantocianas, y de la "/"4&"/"3# "# )3&6)3)3# "1;%)*&"2)3# )D&6)1'3A# expresión regulada de proteínas ricas en

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aminoácidos esenciales, resistentes al rumen. También se pretende incrementar la resistencia a patógenos y plagas, .+"!'7-+%, $-, (%$(!.!$"#0, 8, 1$&+%%0--0, +, *", de incrementar la persistencia y demorar &$"$&($"(!+9, !.'$1!%, -+, :0%+(!;"9, %$27-+%, negativamente los alergenos del polen. Más recientemente el creciente interés en la producción de biocombustibles a partir de celulosa ha impulsado a la ingeniería genética de ligninas para facilitar la liberación de celulosa y hemicelulosa. Las primeras plantas forrajeras transgénicas están siendo evaluadas a campo y se han seleccionado eventos de transformación para el desarrollo de nuevos cultivares. !"3#@)66"1%)*&"3#()*>1%,"3#4)61%&)*#,'146)*/)6# 1)*# /)# @)66"1%)*&"3# 7# 1)&'/'2'(="3#1'2),.2"6)3#4"6"#)2#1)*#)14=6%,"#;"3"/"#)*#)2#-)*'&%4'A# C3&"3# )3&6"&)(%"3# 3'*# 46'1%3'6%"3# 3'2"1)*&)# ,."*/'#3)#2"3#,'*3%/)6"#/)*&6'#/)#.*#46'(6"1"#/)#1)*# /)# -'66"#,6.?"3#%*&)6)34),=0,"3# /)# Hieracium# 4"6"# %*&)*&"6# ,'*061"6# los resultados obtenidos en sus famosos estudios sobre la herencia en las arvejas de jardín. q)*/)2#"&6%;.7>#)66>*)"1)*&)#"#.*"#3.4.)3&"# a-6),.)*&)# ".&'4'2%*%?",%>*e# 2"# -"2&"# /)# 3)(6)gación observada en varios cruzamientos. Hoy 3";)1'3# 5.)# 1.,@"3# )34),%)3# /)2# (+*)6'# Hieracium#3'*#"4'1=,&%,"3A# G)#,'*3%/)6"#5.)#2"#"4'1%D%3#@"#)9'2.,%'*"/'#,'1'#.*#3%3&)1"#/)#6)46'/.,,%>*#"2&)6*"&%vo a la sexualidad a través de la reformulación /)#3.3#46'(6"1"3#/)#/)3"66'22'A#U'6#)3':#4"6"# ,'146)*/)6#1)0&'# I)2# (6"*'# /)# 4'2)*# 7# )2# 3",'# )1;6%'*"6%':# *QA# !"# 1)%'3%3# 5.)# ',.66)# )*# 2"3# `'6)3# 4'3%;%2%&"# la recombinación y reducción del contenido ge*+&%,'#7#/"#2.("6#"#2"#-'61",%>*#/)#2"3#)34'6"3# -)1)*%*"3#I1)(834'6"3Q#)*#)2#>9.2'#7#1"3,.2%*"3#I1%,6>34'6"3Q#)*#2"3#"*&)6"3A#C*#2"#1)("3-

4'6'(+*)3%3#3)#()*)6"*#,."&6'#,+2.2"3#@"42'%/)3#"#4"6&%6#/)#.*"#a,+2.2"#1"/6)#/)#2"#1)(834'6"e#5.)#3)#/%-)6)*,%"#)*#2"#*.,)2"#/)2#>9.2'A# C*#2"#1"7'6#4"6&)#/)#2"3#"*(%'34)61"3:#&6)3#/)# )3&"3# ,+2.2"3# @"42'%/)3# /)()*)6"*:# 1%)*&6"3# 5.)# 2"# 6)3&"*&)# ,'*3&%&.7)# 2"# 1)(834'6"# -.*,%'*"2A#U'6#)2#46',)3'#/)#1)("("1)&'(+*)3%3:# (una serie acotada de mitosis ordenadas), esta ,+2.2"#/)3"66'22"#.*#1)("("1)&>0&'#,'*',%/'# ,'1'#a3",'#)1;6%'*"6%'eA#C2#3",'#)1;6%'*"6%'# 183#,'1B*#)3#)2#/)#&%4'#Polygonum, formado 4'6#X#*B,2)'3#@"42'%/)3#I*Q#,'*&)*%/'3#)*#3%)&)# células, a saber: la ovocélula, dos sinérgidas, .*"#,+2.2"#,)*&6"2#;%*.,2)"/":#7#&6)3#"*&=4'/"3A# U'6#'&6"#4"6&):#)*#2"3#"*&)6"3#2"3#1%,6>34'6"3# /)3"66'22"*# 2'3# (6"*'3# /)# 4'2)*# 1)/%"*&)# .*# 46',)3'#/)#1%,6'("1)&'(+*)3%3A#C2#4'2)*#1"/.6'#)3&8#&=4%,"1)*&)#%*&)(6"/'#4'6#&6)3#,+2.2"3# @"42'%/)3# I*Q:# /'3# /)# 2"3# ,."2)3# ,'*3&%&.yen los gametos masculinos. La otra tiene una función relacionada con el crecimiento del tubo 4'2=*%,'A# !"#-'61",%>*#/)#2"#3)1%22"#6)5.%)6)#/)2#46'ceso de doble fecundación: un gameto mas,.2%*'#I*Q#3)#-.3%'*"#,'*#2"#'9',+2.2"#I*Q#4"6"# '6%(%*"6# "2# ,%('&'# I\*QA#J# 4"6&%6# /)# )3&)# ,%('&'# se desarrolla el embrión. La célula central del 3",'#)1;6%'*"6%'#,'*#3.3#/'3#*B,2)'3#I*#d#*Q# 3)#-.3%'*"#,'*#)2#'&6'#("1)&'#1"3,.2%*'#4"6"# '6%(%*"6# )2# )*/'34)61'A#J3=:# 2"# -.3%>*# /)# /'3# ("1)&'3#@"42'%/)3#B*%,'3#/)6%9"/'3#/)#2"#/%3tribución al azar del material genético durante las meiosis masculina y femenina resulta en la ()*)6",%>*#/)#46'()*%)3#()*+&%,"1)*&)#/%9)63"3A#C*#6)3.1)*:#)*#2"#6)46'/.,,%>*#3)D."2#2"# 1)%'3%3#46'/.,)#2"#6),'1;%*",%>*#()*+&%,"#/)# 2'3#,"6",&)6)3#/)#"1;'3#46'()*%&'6)3#7#("1)&'3#@"42'%/)3A#!"#-),.*/",%>*#-.3%'*"#/)#1"nera aleatoria un gameto masculino con uno -)1)*%*'#4"6"#'6%(%*"6#.*#*.)9'#%*/%9%/.'#,'*# una constitución genética única. !"#"4'1%D%3#)2./)#2"#6.&"#3)D."2#)9%&"*/'#2"# reducción meiótica y la fecundación. El óvulo desarrolla una semilla cuyo embrión contiene )D",&"1)*&)#)2#1%31'#()*'&%4'#5.)#2"#42"*&"# que lo origina. Por lo tanto este carácter (también llamado agamospermiaQ# @"# 3%/'# /)0*%/'# como reproducción asexual a través de semillasA#!"#"4'1%D%3#-.)#/)3,6%4&"#)*#183#/)#Zff# )34),%)3#/)#42"*&"3#4)6&)*),%)*&)3#"#^M#-"1%-

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 403

lias diferentes, entre las que se destacan las i6"1=*)"3:# 2"3# $'14.)3&"3:# 2"3# N'38,)"3# 7# 2"3#N.&8,)"3A#U6)3)*&"#-'61"3#/%9)63"3#7#4"6),)#@";)6#3.6(%/'#9"6%"3#9),)3#%*/)4)*/%)*temente durante la evolución. Brevemente, los )1;6%'*)3#"4'1=,&%,'3#4.)/)*#-'61"63)#"#&6"vés de una ruta esporofítica o gametofítica. C*#2"#"4'1%D%3#esporofítica, también llamada embrionía adventicia, los embriones surgen directamente de una célula somática de la nucela o de los tegumentos del óvulo. Comúnmente 3)#-'61"*#)1;6%'*)3#1B2&%42)3#"#4"6&%6#/)#,+2.2"3# *.,)2"6)3# I)34'6'-=&%,"3Q# 5.)# ,'14"6&)*# el óvulo junto con el embrión de origen sexual 7# .&%2%?"*# 3.# )*/'34)61'# 4"6"# /)3"66'22"63)A# C3&"#-'61"#/)#"4'1%D%3#"4"6),)#,'1B*1)*&)# en los cítricos, los cuales se convirtieron en un 3%3&)1"# 1'/)2'# 4"6"# )3&./%"6# )2# 46',)3'A# C*# la apomixis gametofítica# 3)# -'61"*# 3%)146)# 3",'3# )1;6%'*"6%'3# 5.)# /%0)6)*# )*# "2(.*'3# "34),&'3#/)2#("1)&>0&'#-)1)*%*'#@"42'%/)#I*Q# ()*)6"/'# "# 4"6&%6# /)# 2"# 1)(834'6"# -.*,%'*"2A# G.#46%*,%4"2#/%-)6)*,%"#)3#46),%3"1)*&)#)2#@),@'# /)# 3)6# /%42'%/)3# I\*Q# 7"# 5.)# 2'3# *B,2)'3# 5.)#2'3#,'*-'61"*#*'#@"*#4"3"/'#4'6#)2#46',)3'#1)%>&%,'#7#4'6#2'#&"*&'#*'#@"*#6)/.,%/'#3.# contenido de ADN. Por eso se dice que estos 3",'3# )1;6%'*"6%'3# '# 1)("("1)&>0&'3# 3.6()*#4'6#.*#46',)3'#/)#apomeiosis I"4'c#46)0*:#2"#"4'1%D%3#("1)&'-=&%,"#4.)/)#3)6#,2"3%0,"/"#,'1'c#diplosporía, ,."*/'#)2#3",'#)1;6%'*"6%'#3)#'6%(%*"#"#4"6&%6# /)#2"#,+2.2"#1"/6)#/)#2"#1)(834'6"#1%31"#7"# 3)"#4'6#1%&'3%3#'#2.)('#/)#.*"#-"22"#)*#2"#1)%'sis o aposporía, cuando el saco embrionario 3)#'6%(%*"#/%6),&"1)*&)#4'6#1%&'3%3#"#4"6&%6#/)# una célula somática cercana, usualmente una célula de la nucela. Los sacos embrionarios, 3)"*# +3&'3# "4'34>6%,'3# '# /%42'34>6%,'3:# ,'*tienen un gameto femenino 2n, la ovocélula, a 4"6&%6# /)# 2"# ,."2# 3)# /)3"66'22"# /%6),&"1)*&)# )2# )1;6%>*#4'6#4"6&)*'(+*)3%3#3%*#5.)#)D%3&"#-),.*/",%>*A#J3=:#1%)*&6"3#)*#)2#46',)3'#3)D."2# 2"# 6)/.,,%>*# 1)%>&%,"# 3)# ,'142)1)*&"# ,'*# 2"# -),.*/",%>*# 5.)# 6)3&".6"# )2# *%9)2# /)# 42'%/="# \*:#)*#2"#"4'1%D%3#("1)&'-=&%,"#2"#".3)*,%"#/)# 6)/.,,%>*# 3)# ,'142)1)*&"# ,'*# 2"# 4"6&)*'(+*)3%3A#!"#"4'1%D%3#("1)&'-=&%,"#-.)#)3&./%"/"#

183# 46'-.*/"1)*&)# 5.)# 2"# "4'1%D%3# )34'6'-=&%,":# 46%*,%4"21)*&)# 4'6# 3)6# )2# &%4'# 46)3)*&)# )*# 2"3# (6"1=*)"3:# /'*/)# 1.,@"3# )34),%)3# ,'*# 9"2'6# "(6'*>1%,'# 46)3)*&"*# )3&)# 1'/'# /)# 6)46'/.,,%>*A# C*# 2"# E%(.6"# ]# 3)# 1.)3&6"# .*# )35.)1"# ,'14"6"&%9'# 3%142%0,"/'# /)# 2"3# 9="3# /)# 6)46'/.,,%>*# 3)D."2# 7# "4'1=,&%,"# )*# "*(%'34)61"3A#!'3#/%-)6)*&)3#1),"*%31'3#/)# "4'1%D%3# ';3)69"/'3# )*# /%3&%*&'3# (+*)6'3# )*# ,'14"6",%>*#,'*#)2#46',)3'#3)D."2#/)#1)("gametogénesis, fueron esquematizados en la Figura 2. N),'6/)1'3# 5.)# )*# 2"3# "*(%'34)61"3# )D%3&)# .*"# /';2)# -),.*/",%>*A# C*# 2"# "4'1%D%3# ("1)&'-=&%,"# 2"# 4"6&)*'(+*)3%3# )D,2.7)# %*9"6%";2)1)*&)# .*"# /)# 2"3# )&"4"3# /)# )3&"# /';2)# fecundación: la unión de los gametos masculinos con los femeninos. Sin embargo, no necesariamente se anula la fecundación de los *B,2)'3# 4'2"6)3A#J.*5.)# )*# "2(.*'3# ,"3'3# )2# )*/'34)61'#4.)/)#/)3"66'22"63)#)*#-'61"#".tónoma (sin la unión de un gameto masculino ,'*# 2'3# *B,2)'3# 4'2"6)3# /)2# 3",'# )1;6%'*"6%'# "4'34>6%,'# '# /%42'34>6%,'Q# )*# 1.,@"3# )34),%)3# "4'1=,&%,"3:# ,'1'# )*# 2"# 1"7'6="# /)# 2"3# (6"1=*)"3#&6'4%,"2)3:#)3#*),)3"6%'#5.)#.*#("meto masculino se fusione con el o los núcleos 4'2"6)3#/)#2"#,+2.2"#,)*&6"2#/)2#3",'#)1;6%'*"6%'#4"6"#-'61"6#)2#)*/'34)61'A#J#)3&)#46',)3'# se lo llama pseudogamia. $"3%# &'/'3# 2'3# 3",'3# )1;6%'*"6%'3# /%42'34>6%,'3# I,'*# )D,)4,%>*# /)# 2'3# /)# Eragrostis) ,'*3)69"*#2"#&=4%,"#)3&6.,&.6"#/)#2'3#3",'3#)1brionarios de origen meiótico, generalmente con siete células y ocho núcleos. Sin embargo, )*#2"#"4'34'6="#2'3#3",'3#1.)3&6"*#4'6#2'#()neral una constitución muy variable, tanto en taxones diferentes como dentro de un mismo &"D>*# IE%(.6"# \QA# U'6# )0&'#,'*#.*"#'9',+2.2"#`"*5.)"/"#4'6#/'3#3%*+6gidas y una célula central uninucleada y extensamente vacuolizada. Esta estructura de saco "4'34>6%,'#-.)#/)3,6%4&"#4'6#46%1)6"#9)?#4"6"# Panicum maximum#7#4'6#)3"#6"?>*#"#2'3#1)("("1)&>0&'3#,'*#)3&"#1'6-'2'(="#3)#2'3#,'*',)# ,'1'# 3",'3# "4'34>6%,'3# /)# &%4'# Panicum.

404 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

Figura 1: Rutas biológicas de reproducción sexual y apomíctica. Durante la sexualidad una célula de 2"#*.,)2"#/)2#>9.2'#3)#/%-)6)*,%"#,'1'#,+2.2"#1"/6)#/)#2"#1)(834'6"#7#2.)('#/)#3.-6%6#.*#46',)3'#/)#1)%'3%3#/"#'6%()*#"#,."&6'#1)(834'6"3#@"42'%/)3A#T6)3#/)#)3&"3#1)(834'6"3#/)()*)6"*#7#2"#,."6&"#/"#'6%()*#"# la formación de un saco embrionario luego de una serie de mitosis, donde todos los núcleos celulares es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

G%*#)1;"6(':#)*#2"3#)34),%)3#"4'34>6%,"3#/)# Paspalum:# .*# (+*)6'# &"1;%+*# 4)6&)*),%)*&)# a la tribu Paníceas igual que Panicum, existe una característica en la constitución de los sa,'3#"4'34>6%,'3#5.)#2'3#/%-)6)*,%"#*)&"1)*&)# /)2# &%4'# Panicum: en Paspalum los sacos generalmente tienen una célula central con dos *B,2)'3#4'2"6)3#7#"#9),)3#&6)3#IE%(.6"#^QA#C3&"# ,"6",&)6=3&%,"# )3# %14'6&"*&)# 4'65.)# /);%/'# "# 2"# 43)./'("1%":# 2"# 6)2",%>*# ()*>1%,"# 1"&)6*"R4"&)6*"# /)2# )*/'34)61'# )3# /%3&%*&"# )*# 2"3# 42"*&"3#3)D."2)3#7#)*#2"3#"4'34>6%,"3A#C*#2"3# 3)D."2)3:#@"7#.*"#6)2",%>*#\R]#1"&)6*'R4"&)6*'#I1"/6)#*#d#*n#4"/6)#*Q:#1%)*&6"3#5.)#)*#2"3# "4'34>6%,"3#)3"#6)2",%>*#)3#()*)6"21)*&)#ZR]# I1"/6)#\*#d#\*n#4"/6)#*QA#C*#Panicum la relación es 2/1 tanto en las sexuales como en las "4'34>6%,"3#I*#d#*R*#)*#2"3#3)D."2)3#7#\*R*#)*# 2"3#"4'34>6%,"3QA

Otros aspectos sustanciales del carácter apomixis H"7# 9"6%"3# ,"6",&)6=3&%,"3# 4"6&%,.2"6)3# /)# )3&)# 1'/'# /)# 6)46'/.,,%>*# 5.)# 1)6),)*# 3)6# 6)1"6,"/"3A#U'6#.*"#4"6&)#2"#"4'1%D%3#.3."2mente no altera la formación del microgame&>0&'#7#2"#1)%'3%3#',.66)#)*#2"3#"*&)6"3#()*)6"*/'#4'2)*#6)/.,%/':#".*5.)#"#9),)3#3)#';servan tasas inferiores de viabilidad. Además, "4'1%D%3#7#3)D."2%/"/#*'#3'*#46',)3'3#1.&."1)*&)# )D,2.7)*&)3# 7"# 5.)# 4.)/)*# "4"6),)6# simultáneamente sacos reducidos (meióticos) 7#*'#6)/.,%/'3#I46'9)*%)*&)3#/)#"4'1%D%3Q#)*# .*"#1%31"#42"*&":#)*#.*"#1%31"#%*`'6)3,)*,%"#7#"B*#)*#.*#1%31'#>9.2'A#_*"#42"*&"#"4'1=,&%,"#5.)#)3#,"4"?#/)#()*)6"6#"2#1)*'3#.*"# 4"6&)# /)# 3.# 46'()*%)# 4'6# 1)/%'3# 3)D."2)3# 3)# ,'*',)#,'1'#a-",.2&"&%9"eA#U'6#2'#&"*&':#)*#2'3# ()*'&%4'3# "4'1=,&%,'3# -",.2&"&%9'3# 2"3# 46'()-

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 405

Figura 2: Distintos tipos de sacos embrionarios formados durante el proceso de apomixis. En la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

*%)3#3)(6)("*#,'1'#,2"3)3#1"&)6*"3#I\*#d#fQ# 7#*'O1"&)6*"3#'#";)66"*&)3A#H"7#&6)3#&%4'3#/%-)6)*&)3#/)#%*/%9%/.'3#";)66"*&)3#5.)#4.)/)*# )*,'*&6"63)#)*#2"#46'()*%)#/)#.*"#42"*&"#"4'1=,&%,"c#]Q#@=;6%/'3#bFFF#I\*#d#*Q#5.)#6)3.2&"*#/)# la fecundación de una ovocélula no reducida, \Q# @=;6%/'3# bFF# I*# d# *Q# 5.)# 6)3.2&"*# /)# 2"# -)-

cundación de una ovocélula reducida y 3) ha42'%/)3#I*#d#fQ#()*)6"/'3#4'6#4"6&)*'(+*)3%3# "#4"6&%6#/)#.*"#'9',+2.2"##6)/.,%/"A# U'6# '&6"# 4"6&):# 2"# "4'1%D%3# ("1)&'-=&%,"# 3)# 6)2",%'*"# -.)6&)1)*&)# ,'*# 2"# 4'2%42'%/="A# C*# ()*)6"2# 2"3# )34),%)3# "4'1=,&%,"3# 46)3)*&"*# 6"?"3#/)#;"0#02%+>)+&, 1$, &$((!0"$&, 1$, ;?7-0&, 1$, %+6+&, #$#%+'-0!1$&, 1$, Paspalum notatum. Jc#>9.2'#,'*&)*%)*/'#.*#3",'#)1;6%'*"6%'#1)%>&%,'#I2"3#/'3#3%*+6(%/"3#7#"2(.*"3#/)#2"3#"*&=4'/"3#*'#3)# ';3)69"*# 4'65.)# )3&8*# )*# .*"# 3),,%>*# "/7",)*&)# "2# ,'6&)# /)2# >9.2'QA# bc# >9.2'# ,'*&)*%)*/'# /'3# 3",'3# )1;6%'*"6%'3# "4'34>6%,'3# ,'*# /'3# *B,2)'3# 4'2"6)3A# N)-)6)*,%"3c# ":# "*&=4'/"3n# ):# '9',+2.2":# 4:# *B,2)'3# 4'2"6)3n#;"66"#V#^f#1%,6"3

/%42'%/)3Q# 5.)# 3)# 6)46'/.,)*# 4'6# 3)D."2%/"/# 7#'&6"3#/)#1"7'6#*%9)2#/)#42'%/="#I4'6#)*#\*#d# *A#!"#6)2",%>*#/)#2"#"4'1%D%3#,'*#2"#4'2%42'%/="# )3# )3&6),@"# 7"# 5.)# )D%3&)*# 1.7# 4','3# ,"3'3# 6)4'6&"/'3# /)# /%42'%/)3# 5.)# 1.)3&6"*# 6)46'-

/.,,%>*#"4'1=,&%,"A#CD%3&)*#9"6%"3#&)'6="3#5.)# )D42%,"*# 2"# ;"&)3%3# "2&)6*"&%9"#4'/6="#3)6#5.)#.*"#,'*/%,%>*#)4%()*+&%,"#"3',%"/"#,'*#2"#4'2%42'%/="#4'3%;%2%&"6"#2"# )D46)3%>*# /)2# "2)2'# /)&)61%*"*&)# /)2# ,"68,&)6A# J3=:#"#*%9)2#/%42'%/)#)2#"2)2'#/)&)61%*"*&)#/)#2"# "4'1%D%3#)3&"6="#)9)*&."21)*&)#46)3)*&):#4)6'# 3>2'#3)6="#,"4"?#/)#)D46)3"63)#)*#-'61"#"46),%";2)#)*#)*&'6*'3#4'2%42'%/)3#5.)#46'9)"*#.*# 4"%3"1%,'# 1.7# %14'6&"*&):# ,'1'# )3# el caso de varias gramíneas forrajeras, los ci&6.3:#)2#1"*('#7#2"3#-6)3"3A#H"3&"#)2#46)3)*&):# 3>2'#3)#/%34'*)#/)#46'(6"1"3#/)#1)*#4'3%;%2%&"#"142%"6# 2"# ;"3)# ()*+&%,"# /%34'*%;2)# 7# )9)*&."21)*&)# %/)*&%0,"6# %*&6'/.,,%'*)3# 3)D."2)3# '# "2&"1)*&)# 3)D."2)3# I"4'1=,&%,"3# -",.2&"&%9"3# ,'*# "2&"# )D46)3%>*#/)#3)D."2%/"/QA#!"#)9"2.",%>*#/)#)34),%)3#6)2",%'*"/"3#)3#&"1;%+*#.*"#"2&)6*"&%9"# %14'6&"*&)# ,."*/'# *'# 3)# /%34'*)# /)# 42"*&"3# 3)D."2)3# /)# 2"# )34),%)# /)# %*&)6+3A# C*# /)# 3)D."2%/"/#

408 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

4"6"#6)"2%?"6#2"3#,6.?"3:#)*#)2#1'1)*&'#/)#2"# selección habrá que usar el criterio contrario, )3# /),%6:# 3)2),,%'*"6# 2'3# 1)*#/)# 2"#"4'1%D%3A#C3&'#,'*/.,%68#"#2"#';&)*,%>*#/)# nuevas variedades genéticamente estables. El ';*# ,'142)&"1)*&)#I'#,"3%#,'142)&"1)*&)Q#"4'1=,&%,"# 5.)# 4.)/"*# 3)6# &6"*3-'61"/'3# )*# ,.2&%9"6)3# 1)/%"*&)#3.#1.2&%42%,",%>*#4'6#3)1%22"3A#C2#,"1%*'#*'#)3#3)*,%22'#4'65.)#)*#,"/"#()*)6",%>*# )3# *),)3"6%'# /%3&%*(.%6# )*# 2"# 46'()*%):# ,.82)3# 3'*#2'3#%*/%9%/.'3#()*)6"/'3#4'6#3)D."2%/"/#7# ,.82)3#4'6#"4'1%D%3A#K)*&6'#/)#2'3#()*)6"/'3# 4'6#3)D."2%/"/:#@";68#5.)#3)2),,%'*"6#2'3#5.)# "2#1%31'#&%)14'#4'3)"*# 2"3#1)1%,"3#7#46)3)*&)*#.*#"2&'#(6"/'# /)#)D46)3%>*#/)#2"#"4'1%D%3A#o&6'#"34),&'#"#&)*)6#)*#,.)*&"#)3#)2#*%9)2#/)#42'%/="#/)#2'3#46'()*%&'6)3# 5.)# 3)68*# )142)"/'3# )*# 2'3# ,6.?"1%)*&'3A#!'3#46%1)6'3#)3&./%'3#/)#@%;6%/",%>*# indicaron la necesidad de realizar cruzas entre )34),%)3#3)D."2)3#7#"4'1=,&%,"3#,'*#)2#1%31'# *%9)2#/)#42'%/="#7"#5.)#9"6%'3#%*&)*&'3#6)"2%?"/'3#)*&6)#/%42'%/)3#3)D."2)3#7#4'2%42'%/)3# I)*# ()*)6"2#&)&6"42'%/)3Q#"4'1=,&%,'3#,'*/.*# /)#"2(.*"3#)34),%)3A#T6)3#2=*)"3#/)#&6";"1%,"3#7#3.#"/"4&";%lidad al cultivo. En el sur de los Estados Unidos 3)#@"*#4'4.2"6%?"/'#"2(.*"3#9"6%)/"/)3#&)&6"42'%/)3#"4'1=,&%,"3#/)#P. notatum (Argentine, Paraguay, Paraguay 22, Wilmington, Tifton 7 y otras). También se cultivan algunas variedades "4'1=,&%,"3#/)#K"22%3(6"33#IP. dilatatum) selec,%'*"/"3#/)#2"#1%31"#1"*)6"A#C*#*.)3&6'#4"=3# 3)#,.2&%9"6'*#/.6"*&)#1.,@'#&%)14'#/'3#9"6%)/"/)3#"4'1=,&%,"3#/)#P. guenoarum: el Pasto N'*Q:#,.7'3#,.2&%9"6)3#46'9%)*)*#/)#3)2),,%'*)3#46",&%,"/"3#3';6)#1"&)6%"2)3# *"&%9'3# /)# T"*?"*%"# 7# G./8-6%,"A# C2# 4"3&'# 22'6>*# -.)# %*&6'/.,%/'# )*# J6()*&%*"# "46'D%1"/"1)*&)#)*#]W^f#)*#.*"#)3&"*,%"#/)#2"#46'9%*cia de San Luis. De ahí, en 1947, semillas del cultivar Tanganyika #I46%1)6#,.2&%9"6#"/"4&"/'Q# -.)6'*# 6)1%&%/"3# "# 2"# C3&",%>*# CD4)6%1)*&"2# FLTJ#J*(.%2:#/'*/)#-.)6'*#1.2&%42%,"/"3#,'*3&%&.7)*/'#2"#;"3)#/)#2"#%*&)*3%0,",%>*#/)2#,.2&%9'# )*# *.)3&6'# 4"=3n# \Q# 2"# 3)(.*/"# 4'3%;%2%/"/# /)# mejoramiento, en la que aún se ha avanzado 4',':# ,'*3%3&)# )*# realizar cruzamientos con genotipos sexuales poliploides naturales, que 3'*# 1.7# 6"6'3A# _*# ;.)*# )*#,6'1'3>1%,"# /)# .*"# 42"*&"# /%42'%/)# 3)D."2A# q)/%"*&)# )3&)# &%4'# /)# &6"&"1%)*&'3# 3)# @"*# ';&)*%/'# 42"*&"3# &)&6"42'%/)3#3)D."2)3#)*#B. ruziziensis, E. curvula, P simplex, P. notatum y P. hexastachium. !"#/%34'*%;%2%/"/#/)#)3&"3#42"*&"3:#"/)183#/)# -",%2%&"6#2'3#42"*)3#/)#,6.?"1%)*&'3:#4)61%&%>#2"# realización de estudios detallados de la heren,%"#/)2#,"68,&)6#"4'1%D%3#)*#"2(.*"3#/)#)3&"3#

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 409

)34),%)3A#J,&."21)*&):#4';2",%'*)3#3)(6)("*tes de P. notatum#';&)*%/"3#"#4"6&%6#/)2#,6.?"1%)*&'# )*&6)# %*/%9%/.'3# &)&6"42'%/)3# 3)D."2)3# I()*)6"/'3#)D4)6%1)*&"21)*&)Q#7#"4'1=,&%,'3# *"&.6"2)3#)3&8*#3%)*/'#)9"2."/"3#)*#46.);"3#"# ,"14'#)*#E2'6%/":#CC__A#^Q#_*"#&)6,)6#)3&6"tegia de mejoramiento consiste en la obtención de variantes somaclonales a partir del cultivo in vitro de tejidos. Esta metodología se basa )*# 2"# "4"6%,%>*# /)# 9"6%",%'*)3# @)6)/";2)3# )*# 2"3# 42"*&"3# 6)()*)6"/"3# in vitro (conocidas ,'1'#9"6%"*&)3#3'1",2'*"2)3Q#5.)#4.)/)*#.&%2%?"63)#)*#)2#1)*# )*#2'3#46>D%1'3#Mf#"S'3#.&%2%?"*/'#.*"#3.4)60,%)#/)#3%)1;6"#%(."2#'#1)*'6#"#2"#",&."2:#)3"# '4,%>*#6)3.2&"#/)#,6.,%"2#%14'6&"*,%"A#G)#,"2,.2"#5.)#3'2"1)*&)#4"6"#2"#46'/.,,%>*#/)#"66'?# @=;6%/'# 7# ,'*# .*"# &"3"# 1'/)6"/"# /)# ",)4&",%>*# 4'6# 4"6&)# /)# 2'3# "(6%,.2&'6)3:# )3&"# &),*'2'(="#;6%*/"6="#;)*)0,%'3#(2';"2)3#4'6#.*'3#\# Usos potenciales de la apomixis en el a 4 billones de dólares anuales. Las ventajas mejoramiento de plantas naturalmente enumeradas y muchas otras no mencionadas sexuales "5.=# @",)*# 5.)# )3&)# ,"68,&)6# 6)46)3)*&)# .*# La ausencia de recombinación durante la ;)*)0,%'#4'&)*,%"2#)*'61)#4"6"#2"#"(6%,.2&.6"# megagametogénesis y de fecundación de la 7#5.)#3)#@"7"*#,'14"6"/'#2'3#%*,6)1)*&'3#4''9',+2.2"# 4'6# .*# ("1)&'# 1"3,.2%*'# 4'3%;%2%&"# &)*,%"2)3#)*#2"#46'/.,,%>*#"#&6"9+3#/)2#.3'#/)# 2"#()*)6",%>*#/)#)1;6%'*)3#5.)#46)3)*&"*#.*"# esta tecnología con aquellos derivados de la ,'*3&%&.,%>*# ()*+&%,"# %/+*&%,"# "# 2"# /)# 2"# 42"*- 6)9'2.,%>*#9)6/)#"#4"6&%6#/)#2'3#"S'3#YfA# &"#1"/6)A#!"#"4'1%D%3#)3#.*#,"68,&)6#.&%2%?";2)# )*#)2#1)*# 1%22"3:#*.)9'3#@=;6%/'3#%*&)6)34),=0,'3#)#%*&)6- 3'*#3%1%2"6)3#"#2'3#/)#2"#3)D."2%/"/A#J#4)3"6#/)# ()*+6%,'3:#4)61%&%)*/'#)2#/)3"66'22'#/)#()*'&%- 3.#"142%"#/%3&6%;.,%>*#)*#2"3#"*(%'34)61"3:#)2# 4'3#1)*#/)#46'()*%)3#"4'1=,&%,"3#/)#.*# determinado individuo. En las cruzas de este &%4'# I5.)# 4.)/)*# 3)6# %*&6"# '# %*&)6)34),=0,"3Q# 3)#.&%2%?"#.*#4'2%42'%/)#3)D."2#*"&.6"2#'#()*)6"/'#"6&%0,%"21)*&)#,'1'#42"*&"#1"/6):#1%)*&6"3# 5.)# .*# ()*'&%4'# "4'1=,&%,'# ,'*&6%;.7)# ,'1'# /"/'6#/)#4'2)*A# C2#1'/'#/)#,2"3%0,",%>*#/)#2"3#46'()*%)3#)*# "4'1=,&%,"3# 7# 3)D."2)3# -.)# 1'&%9'# /)# ,'*&6'versia durante varias décadas entre los inves&%("/'6)3#/)/%,"/'3#"2#)3&./%'#/)#2"#"4'1%D%3A# q%)*&6"3# "2(.*'3# 46'4'*="*# &)*)6# )*# ,.)*&"# 3.# (6"/'# /)# )D46)3%9%/"/:# ,'*3%/)68*/'2'# como un carácter cuantitativo, otros consideraban que era más conveniente tratarlo como .*#,"68,&)6#,."2%&"&%9':#7#46'4'*="*#,2"3%0,"6#"# .*"#42"*&"#,'1'#"4'1=,&%,"#3%)146)#7#,."*/'# llevase al menos un saco embrionario no re/.,%/'A# C2#46%1)6#1'/'#/)#,2"3%0,",%>*# 6)3.2&"6="#"/),."/'#3%#2"#/%-)6)*&)#)D46)3%9%/"/#/)# 2"#"4'1%D%3#3)#'6%(%*"3)#)*#2"#*),)3%/"/#/)#2"# acción conjunta de varios genes mayores que /)&)61%*"6"*# )2# ,"68,&)6# '# )3&.9%)3)# %*`.%/"# 4'6# 2"# 46)3)*,%"# /)# 1'/%0,"/'6)3:# 1%)*&6"3# 5.)#2"#3)(.*/"#"46'D%1",%>*#3)6="#183#"46'4%"/"#3%#)2#,"68,&)6#)3&.9%)3)#,'*&6'2"/'#4'6#.*# ()*# 3%142)# ,.7"# )D46)3%9%/"/# /)4)*/%)3)# /)# -",&'6)3#)4%()*+&%,'3#"3',%"/'3A#G)#3";)#5.)# )2# "1;%)*&)# 4.)/)# "-),&"6# )2# (6"/'# /)# "4'1%D%3#)*#"2(.*"3#)34),%)3:#2'#5.)#3.(%)6)#5.)# )-),&%9"1)*&)#4.)/)#@";)6#&"*&'#()*)3#1'/%0,"/'6)3#,'1'#-",&'6)3#)4%()*+&%,'3#*# ()*>1%,"# @",)# 4)*3"6# 5.)# "42%,"6# )2# 1'/)2'# cualitativo es esencialmente correcto, aunque 4)61"*),)#4)*/%)*&)#)2#)3&./%'#/)#,.82)3#3'*# 2'3#-",&'6)3#5.)#"-),&"*#2"#)D46)3%9%/"/#/)2#,"rácter. !"# "4'1%D%3# )34'6'0&%,"# 3)# @)6)/"# )*# -'61"#3%142)#,'1'#.*#,"68,&)6#/'1%*"*&)A#C*#)2# B*%,'#)3&./%'#/)#1"4)'#6)4'6&"/'#@"3&"#"@'6"# en Citrus#)2#,"68,&)6#46)3)*&>#.*"#3)(6)(",%>*# 3%142)#,'*#.*"#6)2",%>*#/)#3)(6)(",%>*#/)#^c]A# G%*#)1;"6('#2"#"42%,",%>*#/)2#1"4)'#/)#}T!3# 6)3.2&># )*# 2"# %/)*&%0,",%>*# /)# Y# 2',%# 1"7'6)3# ,'*# )-),&'3# 4'3%&%9'3# '# *)("&%9'3:# .*# 4"&6>*# 183# ,'142)*# del carácter. En la mayoría de las gramíneas -'66"*#()*+&%,"# /)#2"3#42"*&"3#3)D."2)3#3)6="#/)2#&%4'#*.2%42)D'# I""""Q# 1%)*&6"3# 5.)# 2'3# %*/%9%/.'3# "4'1=,&%,'3#3)6="*#.*%42)D'3#IJ"""Q:#3%)*/'#J#)2#"2)2'# /'1%*"*&)# /)&)61%*"*&)# /)# 2"# "4'34'6="A# !'3# ,6.?"1%)*&'3#/)#%*/%9%/.'3#/)#)3&)#&%4'#()*)6"6="*#46'()*%)3#E1 que segregan en sexuales 7# "4'1=,&%,'3# ,'*# 6)2",%'*)3# /)# 3)(6)(",%>*# "46'D%1"/"3#"2#]c]:#".*5.)#)*#"2(.*'3#,"3'3# se observan fuertes desviaciones en esta relación. Las distorsiones en la segregación en P. notatum#@"*#3%/'#"&6%;.%/"3#"#.*#)-),&'#42)%'&6>4%,'# 2)&"2# /)2# ()*R)3# /)&)61%*"*&)3# /)# 2"# "4'1%D%3:#'#"#.*#2%("1%)*&'#4"6,%"2#,'*#.*#()*# letal. Por otro lado en Poa pratensis está claramente documentado que existe recombinación )*&6)#2"#"4'34'6="#7#2"#4"6&)*'(+*)3%3:#2'#,."2# %*/%,"#.*#,'*&6'2#%*/)4)*/%)*&)#4"6"#,"/"#.*'# /)#)3&'3#,'14'*)*&)3A#J/)183#*'#3)#';3)69"# 3.46)3%>*#/)#2"#6),'1;%*",%>*#)*#2"#6)(%>*A#C*# )3&"#)34),%)#2"#4"6&)*'(+*)3%3#4.)/)#)9"2."63)#-8,%21)*&)#)*#".3)*,%"#/)#-)6&%2%?",%>*#4'6#)2# desarrollo de embriones luego del tratamiento con auxina. Cuando este carácter se analizó en forma cualitativa se demostró que involucra "#.*#B*%,'#()*A#U'3&)6%'61)*&)#3)#4'3&.2>#4"6"# Poa#.*#1'/)2'#()*+&%,'#183#,'142)*#/)#2"#4"6&)*'(+*)3%3:#2"#46)9)*,%>*#/)#2"#4"6&)*'(+*)3%3#7#)2#/)3"66'22'#/)# 2"#1)(834'6"A#C3&)#B2&%1'#1'/)2'#)3#3'3&)*%/'# 4'6#2"#';3)69",%>*#/)#,2"3)3#/%3,6)&"3#,'*#/%-)6)*&)#)D46)3%9%/"/#/)2#,"68,&)6#"4'1%D%3:#5.)# 4'/6="*#3)6#)D42%,"/"3#1)#,'1'#4'2%*%?"/'6#"#.*"#42"*&"# "4'1=,&%,":#+3&"#6)3.2&>#3)6#.*#()*'&%4'#J"""A# ~$>1'#)3#4'3%;2)#5.)#)2#()*'&%4'#.*%42)D'#3)"# )2#B*%,'#)D%3&)*&)#)*#2"3#4';2",%'*)3#"4'1=,&%,"3#-",.2&"&%9"3#C3&"3#,.)3&%'*)3#42"*&)"*#2"# 4'3%;%2%/"/# /)# 5.)# 2"# @)6)*,%"# /)# 2"# "4'1%D%3# *'# 4.)/"# 3)6# )D42%,"/"# B*%,"1)*&)# )*# ;"3)# a la constitución genética, sino que también /);"# &)*)63)# )*# ,.)*&"# )2# )*&'6*'# )4%()*+&%co asociado y la estrecha relación de ambas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cuando esta última existe. El ligamiento entre )2#/)3"66'22'#/)2#3",'#)1;6%'*"6%'#/%42'34>6%,'# 7#2"#4"6&)*'(+*)3%3#4.)/)#3)6#)2%1%*"/'#)*#"2# menos dos taxones de Asteraceae: Erigeron y TaraxacumA#C*#,6.?"3#/)#/%42'%/)3#3)D."2)3#7# &6%42'%/)3# "4'1=,&%,'3# /)# Taraxacum muchos híbridos 3x y 4x forman semillas en ausencia /)# 4'2%*%?",%>*:# 1%)*&6"3# 5.)# )2# )*/'34)61'# se desarrolla autónomamente, tal como se )34)6"6="#)*#Taraxacum#"4'1=,&%,'3A#G%*#)1bargo, varios híbridos 3x no forman semillas si *'#3)#2'3#4'2%*%?":#".*5.)#.*'#/)#)22'3#46'/.*# ,283%,"# )*&6)# .*"# 42"*&"# 3)D."2# 7# .*# 4"6%)*&)# "4'1=,&%,'#*"&.6"2n#%%Q#%*%,%",%>*#/)#2"#)D46)3%>*# /)#2"#"4'1%D%3#4'6#)D4)6%1)*&'3#/)#;2'5.)'#/)# ()*)3#I1.&"*&)3#T:#)&%5.)&"/'#&6"*34'3%,%'*"2:# mutagénesis) y iii) transformación de cultivares 3)D."2)3#,'*#()*)3#5.)#,'*&6'2"*#2"#)D46)3%>*# /)2#,"68,&)6A#!"3#/'3#46%1)6"3#"46'D%1",%'*)3# ya fueron intentadas, aunque hasta el momen&'#2'3#46'7),&'3#*'#@"*#3%/'#/)2#&'/'#)D%&'3'3A# !"# &)6,)6"# '4,%>*# &'/"9="# ,'*&%*B"# 3%)*/'# @%4'&+&%,"A# !'3# 46%1)6'3# )D4)6%1)*&'3# /%6%(%/'3# "# %*&6'/.,%6# 2"# "4'1%D%3# "# &6"9+3# /)# ,6.?"1%)*&'3# -.)6'*# 6)"2%?"/'3# @",)# .*'3# Zf# "S'3# 4'6# KA# F. Petrov, quien realizó hibridizaciones entre 1"=?# 7# 6"?"3# &)&6"42'%/)3# /)# Tripsacum dactiloydes#I.*"#)34),%)#/%42'34>6%,"#&"1;%+*#4)6&)*),%)*&)#"#2"#&6%;.#/)#2"#J*/6'4'(>*)"3#%(."2# 5.)# )2# 1"=?QA# U'3&)6%'61)*&)# '&6'3# (6.4'3# /)# %*9)3&%(",%>*#46'/.*#/)2#()*'1"#/)# )3&"# )34),%)# )3&8# -.)6&)1)*&)# "3',%"/'# ,'*# 2"# ,"4",%/"/# /)# ()*)6"6# @=;6%/'3# ,'*# "2(B*# (6"/'# /)# 6)46'/.,,%>*# 3)D."2# I"4'1=,&%,'3# -",.2&"&%9'3QA#!"#%14'3%;%2%/"/#/)#()*)6"6#)3&)# &%4'#/)#%*/%9%/.'3#)3#2"#46%*,%4"2#/%0,.2&"/#5.)# )*-6)*&"#)3&)#3%3&)1"A#_*"#/%0,.2&"/#"/%,%'*"2# es el fuerte requerimiento de una relación 2:1 )*#)2#*B1)6'#/)#()*'1"3#@"42'%/)3#1"&)6*'3# 7#4"&)6*'3#5.)#,'*&6%;.7)*#"#2"#-'61",%>*#/)2# )*/'34)61'# )*# 1"=?A# C3&'3# 46';2)1"3# @"*# /)1'6"/'#)2#46'(6)3'#)*#2"#%*&6'/.,,%>*#/)#2"# Transferencia del carácter apomixis a "4'1%D%3#)*#1"=?#)*#2'3#B2&%1'3#"S'3A#!"#&6"*3especies de interés agronómico -)6)*,%"#/)#2"#"4'1%D%3#"2#1%6%ca Poa pratensisQ#)*#.*'#/)#2'3#4','3#)*#()*>1%,"# 5.)#/)&)61%*"#2"#-'61",%>*#"4'1)%>&%,"#/)#.*# 3",'#)1;6%'*"6%'A#G%1%2"61)*&):#2"3#46'()*%)3# '6%(%*"/"3# "# 4"6&%6# /)# ,6.?"3# )*&6)# /%42'%/)3# 3)D."2)3#7#4'2%42'%/)3#"4'1=,&%,'3#/)#Erigeron annuus# 1'3&6"6'*# 5.)# 9"6%"3# 42"*&"3# /%42'34>6%,"3# *'# -'61";"*# )1;6%'*)3:# 3.(%6%)*/'# 5.)# 3)# @";="# )2%1%*"/'# )2# ,'14'*)*&)# /)# 2"# 4"6&)*'(+*)3%3A# G)# /)1'3&6># ,2"6"1)*&)# 5.)# las dos características segregaban en forma %*/)4)*/%)*&)A#!"#6)(%>*#5.)#22)9"#)2#2',.3#KFU# I5.)#/)&)61%*"#2"#/%42'34'6="Q#&"1;%+*#46)3)*ta restricción de la recombinación (como en el caso de la región APO en la mayoría de las es4),%)3#"4'34>6%,"3#)3&./%"/"3Q:#4)6'#*'#"3=#2"# 6)(%>*#6)34'*3";2)#/)#2"#4"6&)*'(+*)3%3A#o&6"# )34),%)# /%42'34>6%,"# )D&)*3"1)*&)# )3&./%"/"# es Tripsacum dactyloides, debido a que es un 4"6%)*&)# 2)*# )*&6)# 2"# )D46)3%>*#/)#2"#"4'1%D%3#7#2"#4'2%42'%/=":#)34),%"21)*&)#/)#2"#".&'42'%/="A#C*#(6"1=*)"3#/)#2"# subfamilia Panicoideas (Paspalum, Panicum, Tripsacum, Brachiaria, Melinis# 7# '&6"3Q# )3# 4'3%;2)#5.)#)2#3%3&)1"#"4'1=,&%,'#/%0)6"#/)2#5.)# existe en Pooideas (Poa, Elymus y otras). Son *),)3"6%'3#,'*',%1%)*&'3#;83%,'3#183#46'-.*/'3# /)# 2"# )1;6%'2'(="# /)# )34),%)3# 3%29)3&6)3# ,'*#3%3&)1"3#"4'1=,&%,'3:#4"6"#/)&)61%*"6#5.+# (+*)6'#'#5.+#)34),%)#3'*#2'3#183#"/),."/'3# 4"6"# ';&)*)6# 2'3# ()*)3# 5.)# 4'/6="*# .&%2%?"63)# )*#-.&.6"3#&6"*3-'61",%'*)3#()*+&%,"3#5.)#4)61%&"*#.3"6#2"#"4'1%D%3#)*#2'3#,)6)"2)3A# !'3# %*&)*&'3# 4"6"# ()*)6"6# 1.&"*&)3# "4'mícticas inactivando genes de la sexualidad 4'6# )&%5.)&"/'# &6"*34'3%,%'*"2# '# 1.&"(+*)3%3# no han tenido éxito aún en recrear el carácter 4)6'#4)61%&%)6'*#2"#%/)*&%0,",%>*#/)#9"6%'3#()*)3#%*9'2.,6"/'3#)*#)2#,'*&6'2#/)#)&"4"3#4"6&%,.2"6)3#/)#3.#/)3"66'22':#,'1'#2"#46'2%-)6",%>*# /)2#)*/'34)61'#)*#".3)*,%"#/)#-)6&%2%?",%>*#'# 2"# ()*)6",%>*# /)# 3",'3# *'# 6)/.,%/'3# 5.)# 4'6# -),.*/",%>*#46'/.*# 5.)# /)&)61%*"# 2"# "4'1%D%3#

es un sector no recombinante de tamaño cal,.2"/'#)*#.*'3#Mf#q4;A#G)#"%32"6'*#WW#,2'*)3# de BAC conteniendo marcadores moleculares 5.)#1"4)"*#)*#)3&"#6)(%>*A#J2(.*'3#/)#)3&'3# ,2'*)3#-.)6'*#.&%2%?"/'3#4"6"#6)"2%?"6#)3&./%'3# /)#EFGH#I@%;6%/%?",%>*#`.'6)3,)*&)#in situ; del inglés &"'(23/21$) %1) 3%$") 456(%7%8*$%'1) sobre ,6'1'3'1"3#/)#)3&"3#)34),%)3A#C*#P. squamulatum# 2'3# )D4)6%1)*&'3# /)# EFGH# ,'*061"6'*# 5.)#2"#6)(%>*#"3',%"/"#"#2"#"4'34'6="#IJGiNQ# )3#-=3%,"1)*&)#1.7#(6"*/)#I183#/)#Mf#q4;Q#7# que está localizada cerca del telómero sobre )2# ;6"?'# ,'6&'# /)2# ,6'1'3'1"# 4'6&"/'6A# T"1bién demostró que la ASGR es hemicigota y de naturaleza heterocromática. Se encontró una 3)S"2#46'9)*%)*&)#/)#.*"#6)4)&%,%>*#,)*&6'1+rica en el extremo distal de la ASGR, lo que 3.(%)6)#5.)#)2#,6'1'3'1"#4'6&"/'6#3.-6%>#.*"# inversión. En Pennisetum ciliaris el cromosoma 4'6&"/'6#)3#\f#q4;#183#2"6('#5.)#3.3#46)3.*tos homeólogos, y la ASGR se localiza cerca del centrómero, en una región hemicigota y @)&)6',6'18&%,"A#C*#"1;"3#)34),%)3#IP. squamulatum y P. ciliaris) la ASGR contiene una re(%>*#/)#"26)/)/'6#/)#]^#q4;#/)#;"*#/)#;"*#

414 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

)D%3&)*#1B2&%42)3#3),&'6)3#183#4)5.)S'3#5.)# ,'14"6&)*# sintenia con distintos cromosomas /)#"66'?#I,6'1'3'1"3#]:#\:#Z:#Y:#[:#X:#]f#7#]]QA# _*# 3),&'6# 5.)# 6)46)3)*&"# \AM# q4;# I€\# g# /)# la región) fue secuenciado, y los genes inclui/'3#3)#,'*',)*A#C*&6)#)22'3#)3&8*#Z#,'4%"3#/)# genes homólogos a baby-boom, que fueron )3&./%"/'3#/)&"22"/"1)*&)#,'1'#4'3%;2)3#,"*/%/"&'3#"#,'*&6'2"6#"2(.*"#)&"4"#/)#2"#"4'1%D%3# )*# 2"# )34),%)A# Baby-boom# @";="# 3%/'# %/)*&%0cado inicialmente en Brassica napus, inducido )*#,.2&%9'3#/)#1%,6>34'6"3#5.)#6)"2%?";"*#)1;6%'(+*)3%3# 3'18&%,"A# !"# 3'2"# 3';6))D46)3%>*# de baby-boom en Arabidopsis thaliana induce 2"# -'61",%>*# /)# )1;6%'*)3# 3'18&%,'3# ),&>4%,'3#)*#@'*# 4'6# 1"4)'# ()*+&%,'# /)2# 2',.3# "4'# )*# )34),%)3# /)# Paspalum determinó una alta conservación de la región entre P. notatum, P. simplex y P. mallacophylum. En P. notatum se observa homología (sintenia) con segmentos de los cromosomas 12 y 2 de arroz, mientras que en Paspalum simplex y Paspalum malacophyllum sólo con el cromosoma 12 de arroz. Dado que también en Brachiaria brizantha:# 9"6%"3# 3'*/"3# 5.)# 1"4)"*# )*# )2# ,6'mosoma 2 de arroz fueron asociadas al locus "4':# )3# 4'3%;2)# )*&6)9)6# .*"# ,%)6&"# ,'*3)69",%>*# /)2# 1),"*%31'# /)# ,'*&6'2# /)# 2"# "4'34'6="# 4"6"# "2(.*"3# )34),%)3# /)# (6"1=*)"3A# U'6# '&6'#2"/':#"#4"6&%6#/)#.*"#()*'&),"#)*#bJ$#/)# P. simplex 3)#"%32>#.*#,2'*#I^ZYH]fQ#5.)#,'*&%)*)#3),.)*,%"3#]ffg#2%("/"3#"#2"#"4'34'6="# en P. simplex y P. notatumA# CD4)6%1)*&'3# /)# EFGH# ,'*# )2# ,2'*# ^ZYH]f# /)&)61%*"6'*# 5.)# )2#2',.3#"4'#3)#)*,.)*&6"#)*#6)(%'*)3#*'#4)ricentroméricas del genoma de P. simplex. La 3),.)*,%",%>*# /)# ^ZYH]f# 6)9)2># \# 6)(%'*)3# que mostraron homología con los genes EXS I.*# 6),)4&'6# /)2# &%4'# 46'&)=*"# 5.%*"3"# 6%,'# )*# leucinas) y PKD#I/'1%*%'#/)#46'&)=*"#5.%*"3"QA# C3&'3#()*)3# 6)3.2&"6'*# 3%1%2"6)3# "#GCNt#I6),)4&'6#&%4'#46'&)%*"#5.%*"3"#/)#2"#)1;6%'(+*)sis somática) el cual fue asociado con la inducción de la formación de embriones somáticos en zanahoria y con la formación de los sacos

)1;6%'*"6%'3#"4'34>6%,'3#)*#Poa. En P. notatum (como en Pennisetum squamulatumQ# &"1;%+*# 3)# 4'3&.2># 2"# )D%3&)*,%"# /)# una inversión genética en la región del APO locus, en base a observaciones citogenéticas y a )9%/)*,%"3#46'9)*%)*&)3#/)2#1"4)'A#!'3#/"&'3# /)6%9"/'3# /)# 1"4)'# ()*+&%,'# %*/%,"*# 5.)# 2"# 6)(%>*# "3',%"/"# "# 2"# "4'1%D%3# )*# P. notatum )3#.*#3),&'6#)D&)*3'#/)#^Y#q4;:#5.)#46)3)*&"#.*"#-.)6&)#3.46)3%>*#/)#2"#6),'1;%*",%>*#7# "4"6)"1%)*&'#46)-)6)*,%"2#/)#,6'1'3'1"3#I9)6# E%(.6"#ZQA#CD4)6%1)*&'3#/)#qGJU#I4'2%1'6031'#/)#"142%0,",%>*#3)*3%;2)#"#1)&%2",%>*n#/)2# inglés 92$45#*$%'1) :213%$%;2) /*$%'1) ?'lymorphismsQ#7#NE!U#I4'2%1'6031'#/)#2'*(%&./# de fragmentos de restricción, del inglés Restriction Fragment Length Polymorphisms) con enzimas sensibles a metilación y la secuencia,%>*# /)# ,2'*)3# 46'9)*%)*&)3# /)# 2"#JGiN# 4)6mitieron determinar que se trata de una región metilada extensivamente y que contiene abun/"*&)3# &6"*34'3'*)3# 7# 6)&6'&6"*34'3'*)3A# C*# resumen, los estudios realizados en Paspalum indican que, en forma similar al caso de Pennisetum squamulatum, la ASGR es una región )D&)*3":# 5.)# 4'/6="# @";)6# 3.-6%/'# .*"# %*9)63%>*# 7# 5.)# 46)3)*&"# &'/"3# 2"3# ,"6",&)6=3&%,"3# /)#2"#@)&)6',6'1"&%*"c#3.46)3%>*#/)#2"#6),'1binación, metilación extensiva, abundancia de )2)1)*&'3# &6"*34'*%;2)3# 7# "4"6)"1%)*&'# 46)ferencial de cromosomas. Además se detectó que varios genes de esta región están silen,%"/'3#)*#2"3#6"?"3#"4'1=,&%,"3#6)34),&'#"#2"3# sexuales (ver siguiente sección). Expresión de genes durante el desarrollo apomíctico Una serie de trabajos recientes enfocados )*# )3&./%"6# 2"# )D46)3%>*# /)# ()*)3# )*# 42"*&"3# "4'1=,&%,"3#7#3)D."2)3:#@"*#%*-'61"/'#)2#"%32"1%)*&'#/)#&6"*3,6%4&'3#/)#JNL1#)34),=0,'3# /)2# /)3"66'22'# "4'1=,&%,'A# C*# )2# "S'# ]WWY# 3)# 4.;2%,># .*# &6";"*#/)#.*#1"4"#()*+&%,'#/)#Paspalum notatum.

bancos de datos. Más adelante otros autores %*-'61"6'*#2"#)D46)3%>*#/)#asg1#I()*#)34),=0,'#/)#2"#"4'1%D%3#]Q#)*#46%1'6/%'3#`'6"2)3#/)# .*"#",,)3%>*#"4'1=,&%,"#/)#(.%*)"(6"33#IPanicum maximumQ#"3',%"/"#&)14'6"21)*&)#,'*# 2"#"4"6%,%>*#/)#2"3#,+2.2"3#%*%,%"2)3#/)#2"#"4'34'6="A#!"#3),.)*,%"#/)#asg1 es similar a varios ()*)3#)34),=0,'3#/)#2"#3)1%22"#'#)2#)1;6%>*#/)# /%-)6)*&)3#)34),%)3#9)()&"2)3:#)*&6)#)22'3#rd22 I.*#()*#)D46)3"/'#)*#3)1%22"3#)#%*/.,%/'#4'6# sequía en A. thaliana), grp#I.*#()*#5.)#,'/%0,"# .*"# 46'&)=*"# 6%,"# )*# (2%,%*"# /)# 2"# 4"6)/# ,)2.lar de ovarios de Phaseolus vulgaris), usp (un ()*#5.)#,'/%0,"#"#.*"#46'&)=*"#/)#3)1%22"#/)# Vicia fava), plyg1#I.*#()*#5.)#,'/%0,"#"#.*#46),.63'6#/)#2"#,"/)*"#;)&"#/)#4'2%("2",&.6'*"3"# de Lycopersicum esculentum) y adr6p (un gen 6)(.2"/'#*)("&%9"1)*&)#4'6#".D%*"#/)#Glycine max). La homología de secuencia con todos )3&'3# ()*)3# )3# "2&"1)*&)# 3%(*%0,"&%9"# 4'6# 2'# 5.)#2'3#".&'6)3#%*&)646)&"6'*#5.)#asg1#4'/6="# ,.142%6#.*"#-.*,%>*#*.)9"#/)*&6'#/)2#,'142)jo de formación del embrión y la semilla, rela,%'*"/"#,'*#2"#"4"6%,%>*#/)#2"3#%*%,%"2)3#/)#2"#

"4'34'6="A# T"1;%+*# 3)# ,'14"6># 2"# )D46)3%>*# /)# ()*)3# )*# `'6)3# /)# ()*'&%4'3# 3)D."2)3# 7# "4'1=,&%,'3#/)#P. notatum#7#3)#%/)*&%0,>#"2#()*# arp1, que es homólogo a la cinesina katD de A. thalianaA#G)#%/)*&%0,"6'*#Y#()*)3#/)#)D46)3%>*# /%-)6)*,%"2# )*# '9"6%'3# /)# 42"*&"3# "4'1=,&%,"3# y sexuales de Brachiaria brizantha, entre ellos .*#()*#@'1>2'('#"#.*"#46'&)=*"#5.%*"3"#I-"1%lia MAP quinasas, del inglés mitogen-activated protein). Recientemente una caracterización más ex&)*3"# /)2# &6"*3,6%4&'1"# -.)# ,'142)&"/"# 4"6"# 2"3#)34),%)3#"4'34>6%,"3#Poa pratensis y Paspalum notatumA# !"# 1%31"# 4)61%&%># )2# "%32"1%)*&'# /)# ,)*&)*"6)3# /)# ()*)3# /)# )D46)3%>*# /%-)6)*,%"2# )*# `'6)3# /)# ()*'&%4'3# 3)D."2)3# 7# "4'34>6%,'3#IE%(.6"#MQA#k"6%'3#()*)3#,'1.*)3# -.)6'*#%/)*&%0,"/'3#)*#"1;"3#)34),%)3:#7#1.,@'3#/)#2'3#6)3&"*&)3#4)6&)*),)*#"#2"3#1%31"3# 9="3# -.*,%'*"2)3A# !'3# ()*)3# %/)*&%0,"/'3# 3)# %*3,6%;)*# /)*&6'# /)# .*"3# 4',"3# ,2"3)3# '*&'2>(%,"3c# &6"*3/.,,%>*# /)# 3)S"2)3:# 46'&)>2%3%3:# ,'*&6'2#/)2#,%,2'#,)2.2"6:#,'*&6'2#/)#2"#&6"*3,6%4ción, estructura de la cromatina y actividad de

416 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

Figura 5: B"C-!&!&,1$,$D'%$&!;",1!>$%$"(!+-,1$,2$"$&,$",!":0%$&($"(!+&,1$,'-+"#+&,+'0.)(#!(+&,8, sexuales.#U"*)2#JA#F1"()*#/)#2'3#>6("*'3#6)46'/.,&%9'3#/)#Paspalum notatum#,"4&"/"#4'6#1%,6'3,'4="# )2),&6>*%,"#/)#;"66%/'#7#,'2'6)"/"#"6&%0,%"21)*&)A#C*#)2#,)*&6'#3)#';3)69"#)2#'9"6%'#6'/)"/'#4'6#2"3#"*&)6"3# 5.)#@"*#2%;)6"/'#"2(.*'3#(6"*'3#/)#4'2)*#I()*&%2)?"#/)#2"#K6"A#J*"#q"6="#i'*?82)?:#FboLC:#$oLF$CTQA# Panel B. Geles de display diferencial#1'3&6"*/'#2"#)D46)3%>*#/)#&6"*3,6%4&'3#)*#2'3#>6("*'3#6)46'/.,&%9'3# /)#.*"#42"*&"#"4'1=,&%,"#I}Z]][Q#7#'&6"#3)D."2#I}Z]XXQ#/)#Paspalum notatumA#!"3#`),@"3#%*/%,"*#2'3# &6"*3,6%4&'3# 5.)# 46)3)*&"*# )D46)3%>*# /%-)6)*,%"2A# U"*)2)3# $# 7# Kc# "# 4"6&%6# /)# 2'3# ()2)3# 3)# "%32"6'*# -6"(1)*&'3#/)#()*)3#5.)#-.)6'*#.&%2%?"/'3#,'1'#3'*/"3#)*#)D4)6%1)*&'3#/)#@%;6%/%?",%>*#in situ de tejidos 6)46'/.,&%9'3#/)#Paspalum notatumA#C*#)2#4"*)2#$#3)#1.)3&6"#2"#@%;6%/%?",%>*#/)2#&6"*3,6%4&'#L\\#,'*#2'3# >6("*'3#6)46'/.,&%9'3#/)#2"#42"*&"#3)D."2#}Z]XXA#C*#)2#4"*)2#K#3)#1.)3&6"#2"#@%;6%/%?",%>*#/)2#1%31'# &6"*3,6%4&'#L\\#,'*#2'3#>6("*'3#6)46'/.,&%9'3#/)#2"#42"*&"#"4'1=,&%,"#}Z]][A#C*#)2#>9.2'#3)#';3)69"#2"# ,2"6"#)D46)3%>*#/%-)6)*,%"2#/)2#()*#;2"*,'#I()*&%2)?"#/)2#K6A#i.%22)61'#G)%*#)3#"-),&"/"#)*#%*`'6)3,)*,%"3#4'6#.*#,"1;%'#)*#)2#*%9)2# /)#42'%/=":#2'#5.)#)9%/)*,%"#"#*%9)2#1'2),.2"6#)2# "2&'#(6"/'#/)#6)2",%>*#)*&6)#2"#"4'1%D%3#7#2"#4'-

2%42'%/%?",%>*A# J3%1%31':# 2'3# ()*)3# "-),&"/'3# /.6"*&)#2'3#,"1;%'3#/)#42'%/="#4)6&)*),)*#,2"ramente a las mismas clases funcionales que 2'3#,'*&6'2"/'3#/.6"*&)#2"#"4'1%D%3A Entre los genes activados o silenciados du-

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 417

6"*&)# )2# /)3"66'22'# "4'34>6%,'# 3)# )*,.)*&6"*# *.1)6'3'3#6)46)3)*&"*&)3#/)#.*"#,"3,"/"#/)# &6"*3/.,,%>*#/)#3)S"2)3#/)#&%4'#CNt#I5.%*"3"# 6)(.2"/"#4'6#3)S"2)3#)D&6",)2.2"6)3:#/)2#%*(2+3# extracellular receptor kinaseQA#U'6#)*QA# T"1;%+*# 3)# /)&),&># 2"# )D46)3%>*# /%-)6)*,%"2# /)# )2)1)*&'3# &6"*34'*%;2)3# )*&6)# 42"*&"3# "4'1=,&%,"3# 7# 3)D."2)3:# 4)6'# 6)3&"6="# ,'146';"6#3%#+3&"#3)#1"*&%)*)#)*#'&6'3#()*'&%4'3#7#3%#6)"21)*&)#4'/6="#)3&"6#,.142%)*/'#.*# rol relacionado con el carácter. En el caso de P. notatum, se observa un fenómeno interesante. Muchos de los genes si2)*,%"/'3#)*#2"3#42"*&"3#"4'1=,&%,"3#6)34),&'# a las sexuales cuentan con secuencias homó2'("3#)*#2"#4'6,%>*#/%3&"2#/)2#,6'1'3'1"#\#/)# arroz, una región que fue asociada con el locus "4'#)*#)3&"#)34),%)A#q83#"B*:#,."*/'#"2(.*'3# de estos genes silenciados fueron localizados )*# 2"# 46'4%"# )34),%):# 6)3.2&"6'*# "3',%"/'3# "2# 2',.3# "4'A# C3&)# (6.4'# /)# ()*)3# ,'146)*/)c# 2"# 46'&)=*"# !.*"U"6h# b:# .*# @'1>2'('# /)# 2"# 46'&)=*"# checkpoint# $Ht]:# .*"# 46'&)=*"# "*,2"/"#"#iUF:#.*"#46'&)=*"#3%1%2"6#"#)D&)*3%*":# .*"# qJU^t:# 4'2%.;%5.%&%*":# .*# 6),)4&'6# !NN:# .*"# 46'&)=*"# @%4'&+&%,"# 7# .*# 6)&6'&6"*34'3>*A# La ubicación de estos genes en cercanías del "4'#2',.3:#*#/%-)6)*,%"2#)*# 42"*&"3#"4'1=,&%,"3#7#3)D."2)3:#2'3#,'*9%)6&)*# )*#,"*/%/"&'3#%*&)6)3"*&)3#4"6"#)2#,'*&6'2#/)#2"# "4'1%D%3A#!'3#()*)3#%*,2.%/'3#)*#2"#6)(%>*#"4'# 4"6),)*#)3&"6#3%2)*,%"/'3#)*#42"*&"3#"4'1=,&%,"3#6)34),&'#"#2"3#3)D."2)3A#G)#@"#4'3&.2"/'# que en P. notatum# 4'/6="# @";)6# ',.66%/'# .*"# inversión de un sector sinténico con los cromosomas 2 y 12 de arroz, seguida de una inva3%>*# /)# @)&)6',6'1"&%*"# )*# 2"# 6)(%>*:# 2"# 46'2%-)6",%>*# /)# 6)&6'&6"*34'3'*)3# 7# 2"# 1'/%0,",%>*#2',"2#/)#2"#)D46)3%>*#(+*%,"A#~U'/6="#)3&"# 1'/%0,",%>*#/)#2"#)D46)3%>*#3)6#2"#,".3"#/)#2"#

"4'1%D%3# ~$.82# '# ,.82)3# ()*)3# /)# 2"# 6)(%>*# 3)6="*# 6)34'*3";2)3# /)# /%34"6"6# )2# ,"68,&)6# !"# /%-)6)*&)# )D46)3%9%/"/# /)# 2"# "4'1%D%3# 5.)# ';3)69"1'3#)*#*.1)6'3"3#)34),%)3:#~)3#,'*3),.)*,%"#/%6),&"#/)2#(6"/'#/)#1'/.2",%>*#)4%genética que afecta a la región? Aunque se ha avanzado mucho en la caracterización de las bases moleculares del carácter, estas y otras 46)(.*&"3#4)61"*),)*#3%*#6)34.)3&"A# T"1;%+*# 3)# 6)"2%?"6'*# )3&./%'3# /)# )D46)3%>*# /)# &6"*3,6%4&'3# )*# %*`'6)3,)*,%"3# %*1"/.6"3#)*#()*'&%4'3#"4'1=,&%,'3#7#3)D."2)3#/)# /%-)6)*&)3# 42'%/="3# /)# 2"# )34),%)# /%42'34>6%,"# Eragrostis curvula. Los estudios realizados /)1'3&6"6'*#5.)#4"6"#.*#(6.4'#*.1)6'3'#/)# ()*)3#2'3#4)602)3#/)#)D46)3%>*#/)#.*#()*'&%4'# &)&6"42'%/)# "4'1=,&%,'# IZD# "4'Q# 7# .*# /%42'%/)# sexual (2x sex) resultaron casi idénticos entre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o#3)":#"*&)#.*#,"1;%'# /)#42'%/="#.*#(6.4'#*.1)6'3'#/)#()*)3#/);)6="#",&%9"6#3.#)D46)3%>*#4"6"#2'(6"6#1"*&)*)6#2"# sexualidad. Una falla en esta activación daría ,'1'# 6)3.2&"/'# .*# -)*'&%4'# "4'1=,&%,'A# C3&)# 1'/)2'#,'%*,%/)#,'*#2"#)9%/)*,%"#)D4)6%1)*&"2# de Paspalum# )*# )2# @),@'# /)# 5.)# 2"# "4'1%D%3# 4'/6="#)3&"6#,".3"/"#4'6#.*#3%2)*,%"1%)*&'#/)# 2"#)D46)3%>*#(+*%,"A#i)*+&%,"1)*&)#2"#"4'34'6="#7#2"#/%42'34'6="#*'#4"6),)*#&)*)6#)2#1%31'# '6%()*:#7"#5.)#2'3#/%34"6"/'6)3#/)#"1;'3#46'cesos han sido asociados a regiones sinténicas de arroz con diferente localización. Sin embar(':#9"6%'3#/)#2'3#()*)3#)D46)3"/'3#/.6"*&)#)2# /)3"66'22'#/%42'34>6%,'#3'*#2'3#1%31'3#'#&%)*)*# 6)2",%>*#,'*#2'3#/)#2"#"4'34'6="#I/)#@),@'#2"3# 1%31"3#,2"3)3#-.*,%'*"2)3#4"6),)*#"-),&"/"3Q# 4'6#2'#5.)#4"6),)#@";)6#.*"#6)2",%>*#1'2),.2"6#)9%/)*&)#)*&6)#"1;'3#&%4'3#/)#"4'1%D%3A#!"# )D46)3%>*# /%-)6)*,%"2# /)# ()*)3# -.)# )3&./%"/"#

418 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

&"1;%+*#)*#)34),%)3#/%42'34>6%,"3#/)#Boechera (Brasicaceae). En Boechera microphylla y B. lignifera#I"4'1=,&%,"3Q#7#B. formosa (sexual) 3)# /)&),&"6'*# ZMff# ()*)3# /%-)6)*,%"21)*&)# )D46)3"/'3#.&%2%?"*/'#1%,6'"66)(2'3A#C*&6)#2'3# ()*)3#%/)*&%0,"/'3#3)#)*,.)*&6"*#"2(.*'3#6)lacionados con la organización de la estructura /)2# ()*'1"# ,'1'# ()*)3# /)2# (6.4'# 4'27,'1;# IU,iQ#7#-",&'6)3#/)#&6"*3,6%4,%>*#/)#&%4'#qJKG# ;'DA#!'3#".&'6)3#4'3&.2"6'*#5.)#2'3#()*)3#/)2# (6.4'# U,i:# 3';6))D46)3"/'3# )*# 42"*&"3# "4'1=,&%,"3:# 4'/6="*# )3&"6# 46'/.,%)*/'# 2"# "2&)6",%>*#)*#2"#)D46)3%>*#/)#2'3#()*)3#/)#&%4'#qJKG# ;'D:#,'*,2.7)*/'#)*#)2#/)3"66'22'#/)#"4'1%D%3:# aunque se ignora si éste es el factor causal del /%34"6'#/)2#,"68,&)6#"#*%9)2#/)#,'*&6'2#()*+&%,'# )*#)3&"3#)34),%)3A o&6'3# )3&./%'3# /)# 1.,@"# %14'6&"*,%"# 4"6"# la elucidación de las bases moleculares de 2"# "4'1%D%3# %*-'61"6'*# 2"# ,"6",&)6%?",%>*# /)# 1.&"*&)3#)*#2"3#)34),%)3#1'/)2':#5.)#3%*#3)6# "4'1=,&%,"3:#46)3)*&"6'*#-)*'&%4'3#3%1%2"6)3#"# "2(.*"3# )&"4"3# 4"6&%,.2"6)3# /)# 3.# /)3"66'22'A# C*&6)#)22"3#/);)1'3#,%&"6c#]Q#2"3#1.&"*&)3#4"6tenogenéticas >2, >3@)>3A@)!272* y medicis de Arabidopsis thaliana#n#\Q#2"#1.&"*&)#"4'1)%>&%ca dyad de Arabidopsis thaliana; 3) una mutante LRR de arroz que da origen a células análo("3#"#2"3#%*%,%"2)3#/)#"4'34'6="#7#ZQ#2"#1.&"*&)# embriogénica somática SERK de zanahoria IGCNt# )3# .*# 6),)4&'6# /)# &%4'# !NNQA# U"6&%,.larmente en el caso de la interesante mutante "4'1)%>&%,"#dyad de A. thaliana, 3)#@"#,'*061"/'#5.)#2"#%*",&%9",%>*#/)#.*#()*#6)34'*3"ble de la cohesión de las cromátides hermanas y organización del centrómero durante la meio3%3# /)# ,+2.2"3# ()61%*"2)3# IKyJKRGwFT$H]Q# )3#,"4"?#/)#()*)6"6#.*#-)*>1)*'#3%1%2"6#"#2"# "4'1)%'3%3# )*# /%,@"3# ,+2.2"3:# 22)9"*/'# 2.)('# /)#2"#-)6&%2%?",%>*#4'6#4'2)*#7#"#2"#46'/.,,%>*#/)# @=;6%/'3#bFFFA#!"#;"*#/)#2"#"4'1%D%3A . Perspectivas J#4)3"6#/)#5.)#"B*#)3#*),)3"6%'#6)34'*/)6# numerosas cuestiones sobre la acción de ge-

*)3:#2"#-.*,%>*#7#2"#6)(.2",%>*#/)#2"#"4'1%D%3:# 3)# 9%32.1;6"# 4"6"# )2# -.&.6'# .*# )3,)*"6%'# 46'misorio. Nuestro entendimiento de las bases 1'2),.2"6)3# /)# 2"# "4'1%D%3# 3)# @"# %*,6)1)*tado notablemente a causa del desarrollo de &+,*%,"3#4'/)6'3"3#/)#;%'2'(="#1'2),.2"6#7#"2# ,6),%)*&)#%*&)6+3#)*#)2#&)1"#/)34)6&"/'#)*#2"3# %*3&%&.,%'*)3# ,%)*&=0,"3# )# %*9)3&%("/'6)3A# U'6# '&6"#4"6&):#,'*#)2#"/9)*%1%)*&'#/)2#"*82%3%3#()*>1%,'# "# (6"*# )3,"2"# 3)# /%34'*)# /)# *.)9"3# @)66"1%)*&"3#4"6"#)2#/)3,.;6%1%)*&'#/)#()*)3# 7#2'3#"*82%3%3#/)#)D46)3%>*A#C3#/)#)34)6"6#5.)# )*#2'3#46>D%1'3#"S'3#)3&)#".1)*&'#/)2#,'*'cimiento de las bases genéticas y moleculares /)2#,"68,&)6#4)61%&"#,'*&6'2"6#3.#)D46)3%>*#,'*# 0*)3# /)# 1)*#46'-.*/"#/)2#1),"*%31'# ;%'2>(%,'#6)34'*3";2)#/)#2"#"4'1%D%3#7#/)#2"3# %142%,"*,%"3# )9'2.&%9"3# /)6%9"/"3# /)# 3.# .&%2%?",%>*#4'/68#,'*,6)&"63)#3.#&6"*3-)6)*,%"#)D%&'3"#"#2"3#)34),%)3#/)#(6"*#,.2&%9'A#U"6"#)3&'# 3)# 6)5.)6%68# .*# -.)6&)# "4'7'# 0*"*,%)6'# "# 2'3# )3&./%'3#;83%,'3#3';6)#)2#&)1"A#U'6#'&6"#4"6&):# /"/'#5.)#2"#46';2)18&%,"#/)2#,"68,&)6#)3#1.7# ,'142)(%,"3# /%34'nibles, el cultivo de tejidos ha sido de las que 183#%14",&'#&.9'#)*#2"#`'6%,.2&.6"#".*5.):#)*# forma reciente, la genómica y la transgénesis han adquirido gran relevancia, sobre todo en cultivos como la rosa, el clavel y el crisantemo. C*# )3&)# ,"4=&.2'# ,'1)*&"6)1'3# 2'3# "9"*,)3# 46'/.,%/'3#"#4"6&%6#/)#)3&"3#&),*'2'(="3#)*#2'3# ,.2&%9'3#1)*,%'*"/'3#7#)*#42"*&"3#)*#1",)&"A

&"3#"#(6"*#)3,"2":#/);%/'#5.)#4)61%&)#*'#3'2'# 2"#46'/.,,%>*#1"3%9":#3%*'#2"#,'*3)69",%>*#/)# 1"&)6%"2#3)2),&'#7#2"#1.2&%42%,",%>*#/)#,2'*)3#/)# sanidad controlada. C*# 2"# ",&."2%/"/# 3)# .&%2%?"*# 46%*,%4"21)*&)# &6)3# )3&6"&)(%"3# 4"6"# 2"# 1.2&%42%,",%>*# in vitro: 1) organogénesis, 2) embriogénesis somática, 7# ^Q# &),*'2'(="# /)# ,.2&%9'# /)# ,+2.2"3# )*# ,"4"# 0*"#IT!$:#thin cell layerQ#4"6"#2"#1.2&%42%,",%>*# /)#42"*&"3#)*&6)#'&6"3#"42%,",%'*)3A

E:+')"+-),8$8 !"# 1%,6'46'4"(",%>*# 4'6# '6("*'(+*)3%3# )3# .*"# "2&)6*"&%9"# /)# (6"*# "42%,",%>*# 4"6"# 2"# 46'/.,,%>*# 1"3%9"# /)# 42"*&"3# )*# .*# ,'6&'# 2"43'A# G)#&6"&"#/)#.*"#@)66"1%)*&"#1.7#.&%2%?"/"#4"6"# 2"#1.2&%42%,",%>*#&"*&'#/)#'6*"1)*&"2)3#,'1'#/)# otros cultivos hortícolas, frutales, industriales y forestales. _*#6)5.%3%&'#%*/%34)*3";2)#)3#)2#"*#7#CC__#)*&6)#'&6'3A &'# )34),%"2# 4"6"# 2"# 1.2&%42%,",%>*# )*# 1"3"# /)2# El cultivo in vitro de tejidos resulta una he- híbrido Begonia x elatior es la utilización de las 66"1%)*&"# ,2"9)# 4"6"# 2"# 46'4"(",%>*# /)# 42"*- citocininas cinetina y zeatina, que a diferencia

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 421

de BAP, no afectan las características básicas /)#2"#42"*&"#,'1'#)2#,'2'6#/)#2"3#`'6)3:#.*#/)&"22)#*'#1)*'6#"2#/%3)S"6#.*"#)3&6"&)(%"#4"6"#2"# 46'/.,,%>*#/)#.*#,.2&%9'#'6*"1)*&"2A $'*#6)34),&'#"#2"#%*`.)*,%"#/)#2"#2.?:#)2#,.2tivo de Ficus benjamina# 4)61%&%># )3&./%"6# )2# efecto de la calidad de la luz sobre la inducción de yemas de novo. Se observó que al utilizar 84%,)3#,'1'#)D42"*&':#2"#&"?"#/)#7)1"3#-'61"das de novo resultaba mayor bajo luz roja. En el mismo estudio se advirtió que la calidad de luz *'#"-),&";"#)2#)*6"%?"1%)*&'#/)#)3&"#)34),%)A !'3# 6)5.)6%1%)*&'3# /)# 2"# )&"4"# /)# )*6"%?"1%)*&'# &"1;%+*# 3.)2)*# 3)6# 1.7# )34),=0,'3A# U'6# )*# ,'1)6,%"2# "# 4"6&%6# /)# )1;6%'(+*)3%3# 3'18&%,"# 6)5.%)6)# /)# .*"# 3)6%)# /)# "*# /)# 2'3#)1;6%'*)3:#'#-"3)#fA#!'(6"6#.*"#6)34.)3&"# embriogénica homogénea, en la forma, calidad 7#&%)14'#/)#1"/.6",%>*#/)#2'3#)1;6%'*)3:#)3# )3)*,%"2#4"6"#"2,"*?"6#2"#46'/.,,%>*#%*/.3&6%"2A k"6%"3#)34),%)3#'6*"1)*&"2)3#,'1'#,6%3"*temo, ciclamen, rosa, begonia, violeta africana 7#)3&6)22"#-)/)6"2#@"*#3%/'#46'4"("/"3#,'*#+D%&'#4'6#1)/%'#/)#)3&"#)3&6"&)(%"#I9)6#T";2"QA#U'6#

'&6'#2"/':#2'3#)D4)6%1)*&'3#6)"2%?"/'3#,'*#6'3"# y ciclamen, han contribuido en gran medida a incrementar nuestro conocimiento sobre las ;"3)3# /)# 2"# @)6)*,%"# /)# 2"# ,"4",%/"/# /)# )1;6%'(+*)3%3#3'18&%,"#/)#.*#()*'&%4'#/"/'A#U"recería ser que este rasgo estaría controlado 4'6#183#/)#.*#()*:#,.7"#*"&.6"2)?":#6),)3%9"#'# /'1%*"*&):#3)6="#)34),%)#/)4)*/%)*&)A G-/5/'8*,)*&'7'*%)' !"#&),*'2'(="#/)#,+2.2"3#)*#,"4"#0*"#IT$!Q# es una estrategia de cultivo de tejidos desarrollada en la década del 70. Consiste en utilizar ,'1'# )D42"*&'# .*"# 0*"# ,"4"# /)# ,+2.2"3# I)*&6)# f:M# 7# ]:f# 11# /)# )34)3'6Q:# )2# ,'6&)# 4.)/)# ser longitudinal (lTCL) o transversal (tTCL). El corte longitudinal generalmente involucra cé2.2"3# )4%/+61%,"3:# 3.;)4%/+61%,"3:# ,'6&%,"2)3:# ,"1;%"2)3# '# 1)/.2"6)3n# 5.)# 4.)/)*# 6)"2%?"63)#"#4"6&%6#/)#&"22'3:#@'*#,'1)6,%"2:#)*#"2(.*'3#,"3'3#3)#';3)69>#5.)#".1)*&"#2"#)0,%)*,%"#6)34),&'#/)2#.3'#/)#)D42"*&'3#a,'*9)*,%'*"2)3e:#)#%*,2.3'#",'6&"#/)#1"*)6"#3%(*%0,"&%9"# 2'3#&%)14'3#/)#,.2&%9'A# J/)183# /)# 6)()*)6"6# 42"*&"3:# "# &6"9+3# /)2# "#4"6"#2"#';&)*ción de embriones somáticos de geranio (Pelargonium x hortorumQ:# /'*/)# 3)# 9)6%0,># 5.)# con el uso de segmentos transversales de hi4',>&%2'#3)#2'(6";"#.*"#)0,%)*,%"#X#9),)3#1"7'6#)*#2"#46'/.,,%>*#/)#)1;6%'*)3:#6)34),&'#/)# 2'3#46'/.,%/'3#,."*/'#3)#.&%2%?";"#)2#@%4',>&%2'# )*&)6'#,'1'#)D42"*&'A# La orquídea es uno de los cultivos ornamen&"2)3# 183# "46),%"/'3:# &"*&'# 4"6"# `'6# /)# ,'6&)#,'1'#4"6"#42"*&"#)*#1",)&"A#G'*#)34),%)3#

,.7'3#46'/.,&'3#0*"2)3#&%)*)*#.*"#"2&"#,'&%?",%>*# )*# )2# 1)6,"/'A# J# 4)3"6# /)# 5.)# 1.,@"3# )146)3"3# 46'4"("*# in vitro# /%-)6)*&)3# )34)cies de esta monocotiledónea, son escasos 2'3# 6)4'6&)3# 4.;2%,"/'3# 3';6)# 46'&','2'3# /)# 1.2&%42%,",%>*# "# (6"*# )3,"2"A# $'*# )2# 1+&'/'# /)# 1%,6'46'4"(",%>*# ,'*9)*,%'*"2# /)# 7)1"3# "4%,"2)3:# )3# 4'3%;2)# 46'/.,%6# ,)6,"# /)# ]]Afff# 42"*&"3#"*."2)3A#G%*#)1;"6(':#3)#@"#6)4'6&"/'# 5.)#)2#.3'#/)#&T$!#/)#7)1"3#"4%,"2)3#3)#4'/6="#"2,"*?"6#.*"#46'/.,,%>*#/)#"26)/)/'6#/)# XfAfff#42"*&%*)3#4'6#"S'A En la Figura 1 se describen las alternativas de TCL según los tratamiento in vitro a los que se someten /%3&%*&'3# )D42"*&'3# /)# ,6%3"*temo (Dendranthema grandi&'(*). Así, variando las con/%,%'*)3# /)# ,.2&%9'# 4'/)1'3# 3)(.%6# /%-)6)*&)3# 9="3# 4"6"# 2"# 1.2&%42%,",%>*:#)3#+3&"#`)D%;%2%dad la que lo convierte la tec*'2'(="# )*# .*"# 4'/)6'3"# @)66"1%)*&"#4"6"#)2#)3&./%'#/)#2"# diferenciación vegetal. Otro cultivo ornamental al 5.)#3)#@"#"42%,"/'#)3&"#&),*'logía es la gentiana (Gentiana 344AQ:#9"2'6"/"#&"*&'#,'1'#`'6# /)# ,'6&)# 7# 42"*&"# )*# 1",)&"A# i)*&%"*"# 4.)/)# 3)6# # 46'4"("/"#4'6#1)/%'#/)#3),,%'*)3# &6"*39)63"2)3# /)2# 6),)4&8,.2'# `'6"2#5.)#6)()*)6"#7)1"3#4'6# organogénesis directa luego de 2 a 4 semanas de cultivo. Gladiolus# 344:# Heliconia 344:#Iris#344#7#Helianthus#344:# son otros de los géneros ornamentales que han sido exito3"1)*&)#46'4"("/'3#4'6#)3&"# tecnología.

Figura 1. El diagrama indica el origen de las tTCLs y las diferentes ,'*/%,%'*)3#/)#,.2&%9'#"42%,"/"3#4"6"#2"#';&)*,%>*#/)#42"*&%*)3#/)# crisantemo. (Gentileza de Jaime Teixeira da Silva, traducido)

424 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

H5."6'.$I'&$()*#,*/'*7:"7'+'&$()*$)*4$.:" C2# 46',)3'# /)# )3,"2"/'# 4"6"#2"#'4&%1%?",%>*#/)#2"#46'/.,&%9%/"/# /)# .*# 46',)3'# /)# 1%,6'46'4"(",%>*:# %*/)4)*dientemente de la estrategia que se utilice, requiere de la

%142)1)*&",%>*#/)#2'3#,.2&%9'3#)*#1)/%'#2=5.%do y el uso de biorreactores. En efecto, en un contexto comercial, esta tecnología tiene una serie de ventajas sobre las técnicas convencio*"2)3#I)*&6)#)22"3#2"#4'3%;%2%/"/#/)#".&'1"&%?"6# 2"#46'/.,,%>*:#/%31%*.7)*/'#,'3&'3#7#3%142%0cando tareas). En términos generales un biorreactor es un 6),%4%)*&)#'#3%3&)1"#5.)#1"*&%)*)#.*#"1;%)*&)# biológicamente# ",&%9'# 7# /)# ,'*/%,%'*)3# 46'4%cias (pH, temperatura, concentración de oxígeno:# *.&6%)*&)3:# )&,AQ# 4"6"# )2# )2)1)*&'# 5.)# 3)# ,.2&%9"A#C*#42"*&"3:#&6"/%,%'*"21)*&)#3)#2'3#@"# .&%2%?"/'# 4"6"# )2# ,.2&%9'# /)# 6"=,)3# 7# )*# 2"# 46'ducción de metabolitos secundarios. Como sis&)1"#/)#46'4"(",%>*:#*'#3'*#1.,@"3#2"3#)34)cies en los que se los ha utilizado exitosamen&)A#J2(.*'3# /)# )3&'3# ,"3'3# 3'*c# @%44)"3&6.1# (Hippeastrum spp.), ciclamen (Cyclamen persicum), clavel (Dianthus caryophyllus), gladiolo (B#*7%'#"3) C(*17%&'("!) y jacinto (Hyacinthus orientalisQA#$'1)6,%"21)*&):#3)#@"*#1.2&%42%,"/'#,'*#+D%&'c#@)2),@'3:#)34"&%02.1:#02'/)*/6':# estrella federal y liliaceas. C*#)2#"S'#]WWZ:#2"#061"#-6"*,)3"#IN VITRO PIC,#46)3)*&>#.*#3%3&)1"#/)#%*1)63%>*#&)14'raria al que denominó RITA (del francés: Récipient d’Inmersion Temporaire Automatique) I9)6#E%(.6"3#\#7#^QA#C2#3%3&)1"#4)61%&)#3.1)6(%6# 2'3#)D42"*&'3#)*#)2#1)/%'#/)#,.2&%9'#)*#-'61"# 3.,)3%9":#7#4'6#&%)14'#)#%*&)69"2'3#/)&)61%*"/'3#4"6"#,"/"#3%&.",%>*A#

Figura 2. Sistema original RITA, de origen francés /)3"66'22"/'#4'6#k%&6'4%,#GAJA

Figura 3.#C2#46%*,%4%'#/)#-.*,%'*"1%)*&'#/)#2'3#3%3&)1"3#/)#%*1)63%>*#&)14'6"6%"#3)#;"3"#)*#5.):#4'6# 1)/%'#/)2#&6";"*#/)#("3)3#4)6*#/)#2'3#&)*n#7#"/)183#3)# elimina el riesgo de contaminación cruzada. U)3)#"#)3&':#46)3)*&"*#,%)6&"3#/)39)*&"*:#,6),%1%)*&'#7# enraizamiento). C*&6)#2"3#)34),%)3#`'6"2)3#5.)#3)#@"*#1.2&%42%,"/'#4'6#1)/%'#/)#)3&"#&),*'2'(="#)*,'*&6"1'3# 2"# 4%S"# '6*"1)*&"2# IAnanas lucidus), ".*5.)# ,'1)6,%"21)*&)# 3>2'# 3)# 4.)/)# 1)*cionar al bananero ornamental (Musa basjoo ,9A#‚k"6%)("&"‚Q#7#9"6%"3#)34),%)3#/)#'65.=/)"3# (Orchydea#34QA# C3&'3# 3%3&)1"3# 3'*# )34),%"21)*&)# %*&)6)3"*&)3#4"6"#2"#46'4"(",%>*#/)#42"*&"3#3%*#*),)3%/"/#/)#2.?:#4.)3#4)61%&)*#.*#".1)*&'#/)# 2"#)0,%)*,%"#4'6#/%31%*.,%>*#/)#,'3&'3#"2#%*/)4)*/%?"63)#/)#2"#%2.1%*",%>*A#U'6#)*#/)#)3&)#4%(1)*&'# y de esta forma evitar la contaminación del color ;'6/>#)*#2'3#4+&"2'3A#!'3#,.2&%9'3#/)#2"3#*.)9"3# 9"6%)/"/)3# "?.2)3# @";6="*# "2,"*?"/'# 2"# )&"4"# /)#)*3"7'3#"#,"14'#7#4'/6="*#3)6#2"*?"/"3#"2# mercado en 2009. En otros géneros como Torenia, con el objetivo de incrementar la variabilidad en los colores, 3)#@"*#/)3"66'22"/'#1"&)6%"2)3#&6"*3(+*%,'3#4'6# 1)/%'#/)#2"#&+,*%,"#/)#,'3.46)3%>*#/)#2'3#()*)3# 5.)#,'/%0,"*#2"#KEN#I/%@%/6'`"9'*'2#6)/.,&"3"Q# y la CHS (chalcona sintetasa). En lobelia (Lobelia erimusQ:# 3)# ';&.9%)6'*# 42"*&"3# ,'*# `'6)3# "?.2)3#%*,'64'6"*/'#)2#()*#/)#2"#E^lMlH#/)#2%3%antus. En crisantemo, utilizando la tecnología de ARN "*&%3)*&%/':# 3)# @"# 2'(6"/'# 2"# ';&)*)6# `'6)3# /)# /%-)6)*&)3#&'*"2%/"/)3A#N),%)*&)1)*&)#.*#(6.4'# /)#'6%()*#2%,"#4"6"#2"#';tención de crisantemos de color blanco, al iden&%0,"6#2"#)*?%1"#$1$$KZ#I/)2#%*(2+3#carotenoid cleavage dioxygenaseQ:#,'1'#2"#6)34'*3";2)#/)#

426 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

la degradación de los carotenoides que ocasio*"#2"#4+6/%/"#/)#2"#,'2'6",%>*#amarilla. Incrementando fragancias _*'#/)#2'3#4"681)&6'3#/)#(6"*#9"2'6#"(6)("/'#)*#)2#1)6,"/'#/)#'6*"1)*&"2)3#)3#2"#,"4",%/"/# /)# 2'3# ,.2&%9'3# /)# 46'/.,%6# 4)6-.1):# 2"3# -6"("*,%"3# 3%69)*# 4"6"# "&6")6# &"*&'# "# 4'2%*%?"/'6)3#,'1'#"#4'&)*,%"2)3#,2%)*&)3A# G)# ,'*',)*# ,)6,"# /)# [ff# 46'/.,&'3# 9'28&%2)3#%*9'2.,6"/'3#,'*#)2#"6'1"#/)#2"3#42"*&"3# 7# `'6)3:# /)3/)# )2# 4.*&'# /)# 9%3&"# 5.=1%,'# 3'*# 8,%/'3#(6"3'3#/)6%9"/'3#/)2#;)*,)*':#-)*%246'4"*'2)3#7#&)64)*'%/)3A#G%#;%)*#3)#@"*#,2'*"/'# una interesante cantidad de genes involucrados en estas vías de síntesis, los avances en la bioquímica y la biología molecular de estos ,'14.)3&'3#3'*#"B*#1.7#2%1%&"/'3#7:#"#2"#-),@":# 3'*# 1.7# 4','3# 2'3# 6)4'6&)3# /)# "9"*,)3# )*#)3&"#)34),%"2%/"/A# Por el momento se obtuvieron resultados 46'1%3'6%'3#)*#4)&.*%":#,'*)# )2# %*,6)1)*&'# en la fragancia al regular negativamente la ex46)3%>*# /)2# ()*# /)# 2"# )*?%1"# E^lH# I,'1'# 3)# mencionó antes, involucrada en la biosíntesis /)# "*&',%"*%*"3QA# K)# 1'/'# 5.)# 2"3# `'6)3# 6)3.2&"6'*#183#482%/"3#4'6#.*"#/%31%*.,%>*#/)#2"# ,'*,)*&6",%>*#/)#"*&',%"*%*"3:#4)6'#,'*#1"7'6# fragancia debido a un incremento en la síntesis de metil benzoato. Resistencia a hongos, insectos y virus K"/'#5.)#'&6'3#,"4=&.2'3#46'-.*/%?"*#3';6)# 2"3#)3&6"&)(%"3#.&%2%?"/"3#4"6"#/)3"66'22"6#6)3%3&)*,%"#"#4"&>()*'3#)*#42"*&"3:#*'3#2%1%&"6)1'3# )*# )3&)# "4"6&"/'# "# ,'1)*&"6# "2(.*'3# ,"3'3# %2.3&6"&%9'3#)*#)2#86)"#/)#42"*&"3#'6*"1)*&"2)3A# !'3#1),"*%31'3#/)#/)-)*3"#/)#42"*&"3#3'*# ;"3&"*&)#,'142)*# /)2#&6"*3(+*:#"46'D%1"/"1)*&)#)2#\fg#/)#)3&"3#42"*&"3#46)3)*&";"*#*%9)2)3#"2&'3#/)#)D46)sión que correlacionaban con la ausencia de desarrollo de los síntomas de infección. Prolongando la vida en postcosecha C2#4)6='/'#/)#9%/"#4'3&,'3),@"#/)#2"3#`'6)3# /)4)*/)# /)2# (6"/'# /)# *.&6%,%>*:# 2"# ,"6("# 1%,6';%"*"# 7:# -.*/"1)*&"21)*&)# /)# 2"# 46'/.,,%>*#/)#)&%2)*'#I@'61'*"#"3',%"/"#"2#46',)3'# de senescencia). Existen sustancias como las 3"2)3#/)#42"&"#5.)#6)&"6/"*#)2#46',)3'#I",&B"*# ;2'5.)"*/'# )2#6),)4&'6#/)#)&%2)*':#CTN]Q:#3%*# embargo son muy tóxicas y su uso debería dejarse de lado. La ingeniería genética ofrece .*"# 3)6%)# /)# "2&)6*"&%9"3# 4"6"# 2'(6"6# 6)&6"3"6# )3&)#46',)3'A U'6#)*#/)#46'1'&'6)3# )34),=0,'3# /)# >6("*'# ()*)6"# )2# 1%31'# *%9)2# /)#46'&),,%>*#-6)*&)#"#)&%2)*':#7#46)3)*&"#9)*&"*# /)# 6)34.)3&"3# defensivas, no resultarían afectadas. Plantas con nuevas formas K)3/)#)2#4.*&'#/)#9%3&"#/)#)3&+&%,':#2"#1'/%0,",%>*#/)#2"#"65.%&),&.6"#/)#2"#42"*&"3#)3#.*'#

/)#2'3#4"681)&6'3#183#,'/%,%"/'3#)*#)2#1)*#/)#2"#-'61"#/)#2"3#42"*&"3#"/5.%ere relevancia a la hora de obtener un cultivo homogéneo en altura, o bien de incrementar la cantidad de brotes laterales. Por otro lado, una 42"*&"#,'*#-'61"#/%-)6)*&)#3%(*%0,"#.*#(6"*#%14",&'#)*#)2#1)6,"/'A J#4)3"6#/)#5.)#3)#,'*',)#.*#*B1)6'#%14'6tante de genes involucrados en la determina,%>*#/)#2"#"65.%&),&.6"#/)#2"3#42"*&"3:#3>2'#.*'3# 4','3#@"*#3%/'#.&%2%?"/'3#)*#,.2&%9'3#`'6=,'2"3A C*# 4)&.*%"# 3)# 3';6))D46)3># )2# -",&'6# !FE# (del inglés lateral shoot inducing factor) bajo )2#46'1'&'6#^MG#/)#$"qkA#G)#';3)69>#5.)#"2# "2&)6";"#)2#1)&";'2%31'#/)#2"3#,%&',%*%*"3#46'9',"*/'# 2"# "4"6%,%>*# /)# -)*'&%4'3# ,'*# 1"7'6# ,"*&%/"/# /)# 6"1"3# ,'*# 6"1%0,",%'*)3# 3),.*/"6%"3:#4','#.3."2)3#)*#)3&"#)34),%)A# !"#1%31"#42"*&":#4)&.*%":#3)#&6"*3-'61>#,'*# el gen ipt#I%3'4)*&)*%2#&6"*3-)6"3"#/)#A. tumefaciens):#;"2'#"2#/%-)6)*&)#*B1)6'#/)#,'4%"3# insertadas, sino también al sitio de inserción en )2#()*'1"#/)#2"#42"*&"A#J2#1)/%6#2'3#*%9)2)3#/)# )D46)3%>*# /)2# ()*# 3)# ';3)69># 5.)# ,'66)2",%'*";"*#,'*#)2#(6"/'#/)#%*&)*3%/"/#/)2#-)*'&%4'# ';3)69"/':#)3&'#)3:#"#1"7'6#*%9)2#/)#)D46)3%>*#

428 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

mayor grado de enanismo detectado (Figura 4). Usando esta estrategia lograron obtener .*"#6)/.,,%>*#)*#2"#"2&.6"#,'14"6";2)#"#2"#"2,"*?"/"#4'6#2"#.&%2%?",%>*#/)#2'3#%*@%;%/'6)3#/)# giberelinas, evitando los efectos colaterales 5.)#)3&'3#46'/.,&'3#46'9',"*A _*"#%*&)6)3"*&)#"2&)6*"&%9"#4"6"#%*,6)1)*&"6# la variabilidad genética es el uso de A. rhizogenes. Se trata de una bacteria del suelo que 4'3))#.*#1)("42831%/'#/)*'1%*"/'#N%#IE%(.6"#MQ:#/'*/)#3)#)*,.)*&6"*#2'3#()*)3#rol A, rol B, rol C, y rol D,#6)34'*3";2)3#/)#46'9',"6#"2&)6",%'*)3#-)*'&=4%,"3#/)*'1%*"/"3#6"=,)3#)*# cabellera (hairy roots). En la infección, la bac&)6%"#&6"*30)6)#"#2"#42"*&"#)3&'3#()*)3#5.)#,'/%0,"*#46'&)=*"3#5.)#%*&)69%)*)*#)*#2"#3=*&)3%3# /)#".D%*"3#7#'4%*"3A#J/)183#/)#",6),)*&"6#)2# desarrollo de las raíces en el sitio de infección, otros de los síntomas asociados son: enanis1':# 1"7'6# ,'14",%/"/:# 1)*'6# /'1%*"*,%"# "4%,"2:#9"6%";%2%/"/#)*#@'*A#_&%2%?"*/'#2"#1%31"#&),*'2'(="# se informaron resultados similares en lisiantus

Figura 4. Efecto del gen gai )*#42"*&"3#/)#,6%3"*&)mo. A la izquierda el control sin transformar, el resto 3'*#42"*&"3#&6"*3(+*%,"3#)D46)3"*/'#/%-)6)*&)3#*%veles del transgen que se correlacionaron con los síntomas de enanismo observado. Cortesía del Dr. G)&)4@)*#KA#s",h3'*A

Figura 5.#U2831%/'#N%#/)2#&%4'#"(6'4%*":#5.)#3)#,"6",&)6%?"#4'6#4'3))6#)2#JKLOT#/%9%/%/'#)*#/'3#T2#7# T6A# C*# 2"# 4'6,%>*# T2# 3)# )*,.)*&6"*# 2"3# 3),.)*,%"3# 5.)#,'/%0,"*#4"6"#2'3#()*)3#6'2#7#)*#T6#2'3#'*,'()*)3#".D]#7#".D\#7#/)#2"#3=*&)3%3#/)#'4%*"3A#J1;"3# 4'6,%'*)3#/)#JKL#T#3'*#&6"*3-)6%/"3#)*#)2#46',)3'# de transformación.

(D"3$'!*) C(*17%&'("!), rudbekia (Rudbeckia hirta), datura (Datura arborea y D. sanguinea), angelonia (Angelonia salicariifolia) y catarantus (Catharanthus roseus). Los genes rol también fueron utilizados en -'61"#%*/)4)*/%)*&)#/)2#3%3&)1"#/)#A. rhizogenes#4"6"#2"#&6"*3-'61",%>*#()*+&%,"#/)#42"&"3A#

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 429

Figura 6. A la izquierda los controles sin transformar de Nierembergia scoparia, a la derecha las 42"*&"3#&6"*3(+*%,"3#)D46)3"*/'#2"#3%*&'1"&'2'(="# de la enfermedad de las raíces en cabellera. Gentileza del Dr. Masahiro Mii de la Universidad de Chi;":#s"4>*A

Utilizando el rol C#;"*#,'*#)2# ()*'&%4'#3"29":#,'*#/%3&%*&'3#(6"/'3#/)# éxito, en lilium, limonium y rosa. 4. Genómica en ornamentales CD%3&)*#,"/"#9)?#183#46'7),&'3#/)#%*9)3&%(",%>*#";',"/'3#"2#/)3"66'22'#/)#46'7),&'3#/)# bioinformática y genómica, que se estructuran ,'1'#,'*3'6,%'3#1.*/%"2)3#,'*#)2#0*#/)#".*"6# esfuerzos y recursos: En ornamentales están activos los consorcios de Rosáceas GDR (Genome Database for Rosaceae) y Begonia; y el de Petunia hybrida y A. majus incluidas en la SGN (Sol Genomic Network).

!"# ,"6",&)6%?",%>*# /)# ()*)3# 4'6# 1)/%'# /)# marcadores moleculares clásicos como las )&%5.)&"3#/)#3),.)*,%"3#)D46)3"/"3#ICGT:#Expressed Sequence TagsQ# '# 2'3# 4'2%1'6031'3# de un sólo nucleótidos (SNP, Single Nucleotide Polymorphism), conjuntamente con la estima,%>*#/)#2"#/%9)63%/"/#()*+&%,":#4.)/)*#3)6#.&%2%?"/'3#4"6"#)3&";2),)6#2'3#1"6,"/'6)3#5.)#3)# ,'66)34'*/)*# ,'*# 6"3('3# -)*'&=4%,'3# /)# %*&)6+3A#y#.*"#9)?#';&)*%/'3#+3&'3#.&%2%?"62'3#4"6"# la selección asistida, la construcción de ma4"3#()*+&%,'3#7#2',.3#/)#,"68,&)6#,."*&%&"&%9'# (QTLs, Quantitative Trait Loci). C*#6'3":#4'6#)# .*"# 1.7# 46'1%3'6%"# 4)634),&%9"# 4"6"# 2"# ,'*-),,%>*# /)# 1"4"3# /)# }T!3# 7# 4"6"#)2#1)*#/)#-6"("*,%"A J2(.*'3#(6.4'3#/)#%*9)3&%(",%>*#&6";"*#I]QA#N"=,)3#)1)6()*&)3#)*#.*"#)&"4"#&)146"*"#/)2# ,.2&%9'#I\QA#$6),%1%)*&'#)*#42","#7#1)/%'#2=5.%/':#"#2"#%?5.%)6/"#3)#';3)69"#)2#(6"/'#/)#/)3"66'22'#/)#.*# ,'*&6'2#)*#1)/%'#3>2%/'#I^QA#U6%1)6"3#)&"4"3#/)#2"#'6("*'(+*)3%3#IZQA#U28*&.2"3#in vitro#IMQA#C9)*&'3#6),.4)6"/'3#2.)('#/)#2"#)&"4"#/)#",2%1"&",%>*#IYQA

7

8

;Q#!"3#`),@"3#%*/%,"*#2'3#)9)*&'3#[#7#X#I%?5.%)6/"#7#/)6),@":#6)34),&%9"1)*&)Q#7#3.#,'14"6",%>*#6)34),&'#/)#2"#42"*&"#3%29)3&6)A#G)#4.)/)#"46),%"6#/%-)6)*,%"3:#)*&6)#'&6"3:#)*#)2#&"1"S'#/)#2"3#`'6)3#7#2"#-'61"# y tamaño de las hojas. Figura 7.#K)3"66'22'#/)#2'3#46'/.,&'3#';&)*%/'3#)*#2'3#)*3"7'3#/)#&6"*3-'61",%>*#de Calibrachoa excellens con Agrobacterium rhizogenes.

narse con técnicas de transformación genética 5.)# 4)61%&"*# %*&6'/.,%6# 9"6%",%'*)3# )*# )2# 4"&6>*#/)#`'6",%>*#7#)D42'&"62'3#,'1)6,%"21)*&)A El conocimiento de la diversidad genética es /)#(6"*#"7./"#4"6"#.*#,'66),&'#1"*)*# 7# /)# "21",)*"1%)*&'# /)# JKL#)*#,@%43#7#)*#2%;6)6="3#/)#JKL,A Distintos trabajos con marcadores molecula6)3# ,283%,'3# 5.)# @"*# 4)61%&%/'# "*"2%?"6# &"*&'#

las relaciones genéticas como la diversidad )*&6)#/%3&%*&"3#)34),%)3A#U'6#)# /%-)6)*,%"6#/%3&%*&"3#)34),%)3:#()*)6"*/'#4)60les y clusters#5.)#4'/68*#3)6#.&%2%?"/'3#4"6"#2"# ,'14"6",%>*#,'*#'&6"3#)34),%)3A Por otro lado, estudios basados en RAPDs, FGGN3#7#1%,6'3"&+2%&)3#/)#,2'6'42"3&'#IJKL,4Q# @"*# 4)61%&%/'# )3&./%"6# 2"# /%9)63%/"/# ()*+&%,"# /)#/'3#)34),%)3#/)#46=1.2":#Primula sikkimensis y P. farinosa. En el último caso, el releva1%)*&'#/)#42"*&"3#/)#/%3&%*&"3#"2&%&./)3#4)61%&%># )3&";2),)6#2"#/%-)6)*,%",%>*#/)#2"3#4';2",%'*)3# a través del gradiente de altitudes. En came-

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 431

lia amarilla (Camellia nitidissima) se utilizaron NJUK3# 7#JE!U3# 4"6"# )3&./%"6# 2"# 9"6%";%2%/"/# 7#2"#)3&6.,&.6"#/)#/%3&%*&"3#4';2",%'*)3:#)3&'3# /"&'3#3'*#/)#9%&"2#%14'6&"*,%"#)*#2"#,'*3)69",%>*#/)#2"#/%9)63%/"/#()*+&%,"#/)#)3&"#)34),%)A# C*#2"#9"6%)/"/#ab2.)#U"66'&e#/)#&.2%48*#ITulipa 344Q#3)#2'(6>#)3&";2),)6#.*"#,'66)2",%>*#)*&6)# 2"#/)&),,%>*#/)#,"1;%'3#-)*'&=4%,'3#6)2)9"*&)3# )*#42"*&"3#1%,6'46'4"("/"3#7#2"#1'/%0,",%>*# /)#2'3#4)602)3#1'2),.2"6)3#/)#NJUK3#)#FGGNA# En junquillo (Narcissus tazetta var. chinensis) 3)#.&%2%?"6'*#NJUK3#7#JE!U3#4"6"#,"6",&)6%?"6# 1.&"*&)3#()*)6"/"3#4'6#6"/%",%>*#("11"A#!"# "2&"#-6),.)*,%"#/)#1.&"*&)3#/)&),&"/"3#4)61%tió determinar la efectividad del tratamiento. C*#9%'2)&"#/)#2'3#J24)3 (Cyclamen persicum) 3)# %*%,%># .*# 46'7),&'# /)# CGT3# 4"6"# )*&)*/)6# )2#46',)3'#/)#)1;6%'(+*)3%3#3'18&%,"A#J46'D%madamente un tercio de los genes involucra/'3# )*# )3&)# 46',)3'# 3)# ,.;6%># ,'*# 2'3# CGT3# analizados. En la colección generada de Ciclamen#3)#@"22>#.*"#"2&"#46'4'6,%>*#/)#()*)3#@'1>2'('3#,'*#2'3#%*9'2.,6"/'3#)*#)2#46',)3'#/)# embriogénesis somática en el sistema modelo de Daucus carota (zanahoria). En Gerbera hybrida se logró obtener una co2),,%>*#/)#JKL,#"#4"6&%6#/)#X#&)# 2"# %/)*&%0,",%>*# /)# ()*)3# )34),=0,'3# /)#`'6)3:#9"6%'3#/)#2'3#,."2)3#&)*/6="*#4'3%;2)3# -.*,%'*)3#)*#)2#/)3"66'22'#>6("*'O`'6"2A#!.)(':# )2# 1%31'# 1%,6'"66)(2'# 3)# .&%2%?># 4"6"# "*"2%?"6# 2'3# ,"1;%'3# &6"*3,6%4,%'*"2)3# 46'/.,%/'3# /.6"*&)#2"#'6("*'(+*)3%3#)*#Y#)3&"/%'3#/%-)6)*&)3# /)2#/)3"66'22'#`'6"2#/)#()6;)6"A#G)#2'(6>#%/)*&%0,"6#.*"#3)6%)#/)#()*)3#5.)#4"6&%,%4"6="*#)*#)2# /)3"66'22'#7#2"#"4)6&.6"#/)#2'3#4+&"2'3:#";6%)*/'# un camino interesante al manejo de la regula,%>*#/)#2"#`'6",%>*A En Petunia# 2"3# 2%;6)6="3# /)# JKL,# /)# `'6)3# 4)61%&%)6'*# /)3"66'22"6# CGT3# 7# 1%,6'"66)(2'3:# "#4"6&%6#/)#2'3#,."2)3#3)#/)3,6%;%)6'*#46'&)=*"3# %*9'2.,6"/"3#)*#2"3#9="3#/)4)*/%)*&)3#/)2#,"2,%'#7#)*#)2#1)&";'2%31'#/)#2"#4"6)/#,)2.2"6n#7# ()*)3#6)2",%'*"/'3#"#2"#"4)6&.6"#/)#2"3#`'6)3:# la biosíntesis de antocianinas y la degradación /)#46'&)=*"3A#

En conejito (A. majus) se aislaron secuen,%"3#6)4)&%/"3#)*#tandem de las regiones centroméricas de los cromosomas. Por medio de 2"# &+,*%,"# /)# @%;6%/",%>*# `.'6)3,)*&)# in situ IEFGHQ#3)#)3&";2),%>#.*#,"6%'&%4'#)3&8*/"6#.&%2%?"*/'# )3&"3# 3),.)*,%"3# 6)4)&%&%9"3A# U"6"# %*&)(6"6# 2'3# 1"4"3# ()*+&%,'3# 7# ,6'1'3>1%,'3:# se seleccionaron marcadores moleculares de ,"/"#(6.4'#/)#2%("1%)*&'#/)#.*"#,'2),,%>*#/)# ,6'1'3'1"3#"6&%0,%"2)3#/)#Antirrhinum 4"6"#2"# &6"*3-'61",%>*#/)#42"*&"3A#!'3#,2'*)3#3)#@%;6%/"6'*#4'6#EFGH#)*#2'3#,6'1'3'1"3#/)#,'*)#)3&";2),)6#2"#6)2",%>*#)*&6)#2'3#,6'1'3'1"3#7#2'3#(6.4'3#/)#2%("1%)*&'A## 6. Perspectivas Si bien se han obtenido resultados intere3"*&)3:# 4'6# )2# 1'1)*&'# 2"3# &+,*%,"3# /)# %*()*%)6="#()*+&%,"#@"*#&)*%/'#4','#%14",&'#)*#)2# ámbito de los cultivos ornamentales. T)*%)*/'#)*#,.)*&"#5.)#2"#-.)6?"#%14.23'6"# 5.)#1.)9)#)3&"#,2"3)#/)#%*/.3&6%"#)3#2"#4)61"*)*&)#6)*'9",%>*#7#2"#"4"6%,%>*#/)#*'9)/"/)3:# 2"3# 4)634),&%9"3# 3'*# 46'4%,%"3# 4"6"# )2# /)3"6rollo de nuevas variedades ornamentales utilizando técnicas biotecnológicas. En este marco )3#%14'6&"*&)#/)3&","6#5.)#"#2"#@'6"#/)#3)2),cionar los cultivos sobre lo cuales trabajar, de;)6="*#,'*&)142"63)#*'#3>2'#,.)3&%'*)3#&+,*%cas sino también comerciales y legales. Por otro lado, los avances en las técnicas biotecnológicas y el desarrollo de nuevos y me*#J(6'4),."6%":#^\:]]]O]\\A -Marinangeli P. 2003. Biotecnología del Lilium. En: E2'6%,.2&.6"#)*#2"#J6()*&%*"A#q"3,"6%*%:#!:#E#k%2)22"# y E. Wright Eds. Editorial Facultad de Agronomía _bJA#b.)*'3#J%6)3A#U8(3A#Y^#"#X\A Oq%3@%;"# t:# L%3@%@"6"# qA:# J;)# yA:# L"h"&3.h"# TA:# t"r"1.6"# HA:# t'/"1"# tA:# T"h)3"r"# TA:# J;)# sA# "*/# y"1"1.6"# GA# \ffYA# U6'/.,&%'*# '-# /r"6-# 4'&&)/# ()*&%"*# .3%*(# r%2/O&74)# Agrobacterium rhizogenes.#U2"*&#b%'&),@*'2'(7:#\^:#^^O^XA OL"h"("r"# H:# s%"*(# $@:# G"h"h%;"6"# HA:# t'*# /)# ()*)3#3%142)3#7#}T!3#Iloci involucrados en características cuantitativas o Quantitative Trait 2',%Q# @"*# 4)61%&%/'# %/)*&%0,"6# %*&)69"2'3# ()*>1%,'3# a6)2"&%9"1)*&)# "142%'3e# &=4%,"1)*&)# %*volucrando decenas de centiMorgans (cM), y 4'6# 2'# &"*&'# /),)*"3# '# ,)*&)*"3# /)# ()*)3:# 7# no los genes efectivamente involucrados en el control de la característica. Estos marcadores 3)#"42%,"*#/)*&6'#/)#&8,&%,"3#/)#3)2),,%>*#-"1%2%"6:#7#3>2'#.*"#)3&6"&)(%"#/)#1"4)'#/)#4'2%1'6031'3#/)#3),.)*,%"#5.)#)3&+*#3.0,%)*&)1)*&)#46>D%1'3#"#.*"#1.&",%>*#-.*,%'*"2#6)9)2"68# asociaciones entre marcadores moleculares y ,"6",&)6)3# /)# %*&)6+3# 183# 46),%3"3# IL)"2)# 7# G"9'2"%*)*:# \ffZn# i'*?"2)?Oq"6&%*)?# et al. \ffYQA# !"#%*-'61",%>*#/)#2'3#1"4"3:#,'*1%,'3# -'6)3&"2)3# 4B;2%,'3# 7# 46%9"/'3A# $'*# 2"# %*-'61",%>*# ()*>1%,"#/%34'*%;2):#3)#@"#.&%2%?"/'#2"#)3&6"&)(%"#/)2#a"*82%3%3#/)2#()*#,"*/%/"&'e#I,"*/%/"&)# ()*)#"446'",@Q#4"6"#2"#%/)*&%0,",%>*#/)#()*)3# 3.;7",)*&)3# )*# }T!3:# 4'6# )*e#I"33',%"&%'*# 1"44%*(Q#"#4"6&%6#/)#2"#;B35.)/"#/)#9"6%"*&)3# de genes candidatos. En contraste con el ma4)'# /)# }T!3:# 2'3# 1"6,"/'6)3# 5.)# 1.)3&6"*# "3',%",%>*# ,'*# .*# ,"68,&)6# -)*'&=4%,':# )3&8*# 1.7#,)6,"#'#/%6),&"1)*&)#)*#)2#()*#5.)#%*`.7)# en el carácter (Figura B). Esta táctica, toma ventaja de la gran variabilidad y bajo valor de desequilibrio de ligamiento que generalmente 46)3)*&"*# 2"3# 4';2",%'*)3# *"&.6"2)3# 7# 4.)/)# "42%,"63)#,."*/'#)D%3&)#(6"*#9"6%";%2%/"/#"2+2%,"#IGLU3#'#3%*(2)#*.,2)'&%/)#4'271'64@%313QA# En el caso de Eucalyptus:#.*"#46%1)6"#"3',%",%>*#)*&6)#4'2%1'6031'#)*#()*)3#,"*/%/"&'3#7# )2# 8*(.2'# /)# 2"# 1%,6'0;6%22"# -.)# 4.;2%,"/'# 4'6# Thumma et alA:#\ffMA#C*#,'*=-)6"3#2'3#)3&./%'3# /)#"3',%",%>*#-.)6'*#4%'*)6'3#7#3)#6)"2%?"6'*# )*#4%*'#&")/"#Ii'*?"2)?Oq"6&%*)?#et alA:#\ffYn# \ff[Q:#4%*'#6"/%"&":#4%*'#o6)(>*#I";)&'#;2"*,'Q# y falso abeto (abeto rojo). Hasta aquí, se ha hablado del estudio de la 9"6%";%2%/"/# /)# 2'3# -)*'&%4'3# *"&.6"2)3# 4"6"# 2"# búsqueda de las variantes genéticas que los ,".3"*:#,.7'#)35.)1"#()*)6"2#3%142%0,"/'#3)# muestra en la Figura C. La otra alternativa es 2"#1'/%0,",%>*#/)#.*#-)*'&%4':#"#&6"9+3#/)#2'3# "*82%3%3# /)# "*.2",%>*# '# 3.46)3%>*# Ih*',h# '.&Q# '# 3';6))D46)3%>*# /)# .*# ()*# 1)/%"*&)# 42"*&"3# transgénicas. F*/)4)*/%)*&)1)*&)# /)# 2"3# )3&6"&)(%"3# .&%2%?"/"3:# .*"# 9)?# %/)*&%0,"/'3# 2'3# -)*'&%4'3# ;)*)0,%'3'3:# 4.)/)*# 3)(.%63)# /'3# ,"1%*'3c# ]Q# %/)*&%0,"6# ()*'&%4'3# 5.)# ,'*&)*("*# )3&'3# "2)2'3#/)#%*&)6+3#)#%*&6'/.,%62'3#)*#2'3#46'(6"1"3# /)# 1)*# ()*+&%,"# 4"6"# 2"# %/)*&%0,",%>*# /)# 2"# 9"6%",%>*# "2+2%,"# 5.)# %*`.7)# .*# ,"68,&)6# -)*'&=4%,'# a"2&.6"e:# )*# .*# )3,)*"6%'# /)# ;"*A#$'1'#)1%,"#I4','3# ,%)*&'3#/)#;"3)3:#3)S"2"/'#4'6#,"*#"#.*#,"68,&)6:#)3#46';";2)#5.)#)3&+#1.7#,)6,"# /)#1"7'6#,'142)2'# )*# )2# 4)/%(6)# 7# 4.)/)*# rales del sistema (los árboles) y los numerosos .3"63)#)*#4';2",%'*)3##*"&.6"2)3A organismos que viven dentro de él. En las últi- Tomado de Will genomics guide a greener forest mas décadas, el acelerado avance de la fron- ;%'&),@#J*/6)r#TA#i6''9)6#$.66)*&#o4%*%'*#%*#b%'tera agrícola y ganadera ha reducido sensible- &),@*'2'(7#\ffM:#]Yc]MW|]YYA

436 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

Figura C:#C35.)1"#/)#&6";"*#7#"*82%3%3#/)#CGT3#1)/%"*&)#()*+&%,"#/%6),&"A J#4"6&%6#/)2#&)*#3)(6)("*&)#/)#,6.?"1%)*&'3#,'*&6"3&"*&)3#4"6"#)2#,"68,&)6#)*#,.)3&%>*#IG). La otra estrategia, (H) )3#.&%2%?"6#4';2",%'*)3#/)#%*/%9%/.'3#/)#(6"*# 9"6%";%2%/"/#-)*'&=4%,"#7#()*'&=4%,":#)*#/'*/)#)3&'3#GLU3#&6"&"*#/)#"3',%"63)#,'*#2'3#-)*'&%4'3, realizando 1"4)'#/)#"3',%",%>*#I9)6#&"1;%+*#Figura BQA#G)#';3)69"68*#/%-)6)*,%"3#3%(*%0,"&%9"3#/)2#,"68,&)6#)*&6)# 2'3#(6.4'3#5.)#4'3))*#.*'#.#'&6'#@"42'&%4':#3%#+3&)#)3&8#/%6),&"1)*&)#%*`.7)*/'#)2#,"68,&)6A#C*#)3&)#)35.)1"#()*)6"2:#)2##,"1;%'#/)#2"#;"3)#aJe#/)2#()*#/)#4'6#.*"#a$e:##()*)6"#.*"#1'/%0,",%>*#/)2#"1%*'8,%/'# )*#2"#46'&)%*":#5.)#%*`.7)#/%6),&"1)*&)#)*#2"#)D46)3%>*#/)2#,"68,&)6:#7##4.)/)#9%3."2%?"63)#)*#2'3#-)*'&%4'3# /)#2'3#%*/%9%/.'3#3)(6)("*&)3#/)#2"#4';2",%>*#/)#1"4)'#7#)*#2"#4';2",%>*#/)#"3',%",%>*A

1)*&)#2"#3.4)60,%)#;'3,'3"#"#.*"#&"3"#"*."2# de deforestación mundial de unos 13 millones /)#@"3:#"#2"#,."2#*.)3&6'#4"=3:#,'*&6%;.7)#,'*# .*#46'1)/%'#/)#^ffAfff#@"3#/)#;'35.)#*"&%9'# 4'6# "S'# IEJo# \ff[Q# .6()# 4'6# 2'# &"*&'# ",&."6# 684%/"1)*&)# )*# 2"# ,'*3)69",%>*# /)2# ;%)*# ,'1B*#()*+&%,'#-'6)3&"2#7"#5.)#/)#+2#/)4)*/)#2"# conservación de la diversidad genética y el uso "/),."/'# /)# 2"# 1%31"# )*# 46',)3'3# 46'/.,&%9'3#/)#%14'6&"*,%"#3',%'O),'*>1%,"A# Numerosos son los marcadores que se utili?"*#)*#)3&./%'3#/)#()*+&%,"#),'2>(%,"#,'*#0*)3# /)#,'*3)69",%>*#7#/'1)3&%,",%>*#/)#)34),%)3#

-'6)3&"2)3A# !"# 1"7'6="# 7"# @"*# 3%/'# 46)3)*&"/'3#7#/)3,6%4&'3#)*#)3&)#9'2.1)*#7#4.)/)*#3)6# )*,'*&6"/'3# )*# /%-)6)*&)3# 4.;2%,",%'*)3# I)(A# †%)()*@"()*#"*/#E2"/.*(#\ffXQA# _*"#/)#2"3#-'61"3#/)#"(6.4"6#"#2'3#/%-)6)*&)3# &%4'3# /)# 1"6,"/'6)3# ()*+&%,'3# .&%2%?"/'3# en estudios de genética ecológica forestal es )*# -.*,%>*# /)# 3.# .&%2%/"/# 4"6"# 6)`)*#/)#()*'1"3#7#)2#1'*%&'6)'#/)2#%14",&'#",&."2#/)#/%-)6)*&)3#&%4'3#/)#/%3&.6;%'3#3';6)#2"#/%9)63%/"/# genética en escala local !'3# 2=1%&)3# )*&6)# 2'3# (6.4'3# *'# 3'*# )D,2.7)*&)3#4'6#2'#5.)#4'/)1'3#,'*&"6#)*#"2(.*'3# ,"3'3#,'*#.*#1%31'#1"6,"/'6#5.)#3%69"#4"6"# 183#/)#.*#46'4>3%&'A P#

C*&6)#2'3#/)2#46%1)6#(6.4':#3)#/)3&","*# los marcadores genéticos de ADN de '6("*)2"3:# /)# 1%&','*/6%"3# 7# 4"6&%,.2"61)*&)# /)# ,2'6'42"3&'3# !"# '6("*%?",%>*# 1'2),.2"6#/)2#()*'1"#/)#,2'6'42"3&'#)3# )D&6)1"/"1)*&)#,'*3)69"/"#4'6#2'#5.)# diferentes taxones vegetales mantienen un mismo arreglo lineal de sus genes. Su evolución es lenta con una tasa mutacional del orden de 1-3 x 10-9 1'&%9'#4'6#)2# ,."2# 1.&",%'*)3# ',.66%/"3# )*# &%)14'3# geológicos son mantenidas hasta la actualidad. Con el monitoreo de la distribu,%>*#)34",%"2#/)#3.#9"6%",%>*#7#)*#(6"*des escalas, como las de distribución *"&.6"2# /)# .*"# )34),%)# 4.)/)*# 3)6# .&%2%?"/"3:#(%,'3# 7# 6)(%3&6'3# /)# 1%,6'->3%2)3:# 4"6"# "7./"6# "# 6),'*3&6.%6# 2"# @%3&'6%"# (2",%"6%"# 7# 4'3&O glaciaria de los bosques. De esta forma 3)# .;%,"*# 3%&%'3# /)# 46';";2)3# 6)-.(%'3# (2",%"6%'3#7#6.&"3#1%(6"&'6%"3#"#4"6&%6#/)# ellos durante la retracción de los hielos. !"#,'66),&"#%*&)646)&",%>*#/)#2"#/%3&6%;.,%>*#)34",%"2#/)#2=*)"3#()*)"2>(%,"3#/"/"3# 4'6# 2"3# 3),.)*,%"3# (+*%,"3# '# 3%&%'3# /)#6)3&6%,,%>*#4)61%&)*#6)"2%?"6#)3&./%'3# 02'()'(680,'3# /)*&6'# /)# (+*)6'3# 7# )34),%)3#IJ9%3)#\fffQA !"3#"*(%'34)61"3#4'3))*#@)6)*,%"#1"&)6*"# )*#)2#JKL#/)#,2'6'42"3&'#4'6#2'#5.)#)2#1'*%&'6)'# )34",%'O&)14'6"2# /)# 3.# 9"6%",%>*# 4)61%&)# /)0*%6# )2# 1'9%1%)*&'# @%3&>6%,'# /)# 2"# 3)1%22"# 7# 4'6# 2'# &"*&'# )2# `.*#*"&.6"2#/)#)3&"3#)34),%)3#)*#;"3)# "#2'3#@"42'&%4'3#)*,'*&6"/'3##Iq"6,@)22%#ˆ#i"22'#\ffY:#J?4%2%,.)&"#et al.2009) y la existencia de varios refugios glaciarios sobre la vertiente oriental de los Andes e incluso en el ecotono ,'*# 2"# )3&)4"# 4"&"(>*%,"A# !"# /%-)6)*,%"# /)2# )-),&'# 3';6)# 2'3# ;'35.)3# 4"&"(>*%,'3# /)# /'3# 4"&6'*)3#/%-)6)*&)3#/)#/%3&6%;.,%>*#)#%*&)*3%/"/# /)# 2"# B2&%1"# (2",%",%>*# 3)# 4.3'# /)# 1"*%0)3&'# también con estos marcadores en un estudio 46)2%1%*"6#6)"2%?"/'#,'*#Nothofagus antarctica IU"3&'6%*'# et al. \ffWQ# C3&'3# 6)3.2&"/'3# 4)61%&)*# ,'146)*/)6# 1)*#)34",%"2#",&."2# /)#2"#9"6%",%>*#()*+&%,"#)*#2"3#)34),%)3#"6;>reas de nuestros bosques. En el caso de una (%1*'34)61"#)1;2)18&%,"#,'1'#2"#Araucaria araucana se determinaron los sitios de mayor /%9)63%/"/# 7# 3)# 9)6%0,># *.)9"1)*&)# )2# 4"&6>*# general de diferenciación norte-sur hallado en '&6"3#)34),%)3:#1)/%"*&)#2"#/%3&6%;.,%>*#/)#2'3# @"42'&%4'3#"*"2%?"/'3#Iq"6,@)22%#)&#"2A#\ffWQ P# U"6"#2'3#';*%,":#-.)6"#/)#2'3#4"65.)3# nacionales, son las que contienen la mayor diversidad genética (Pastorino y Gallo 2002). Información obtenida con marcadores SSRs IJ6"*"# )&# "2A# \ffXQ# ,'*061># )2# ,"68,&)6# 6)2%,&."2#7#/)#"2&"#/%9)63%/"/#()*+&%,"#)*#)3&)#&%4'# /)#4';2",%'*)3#IJ6"*"#et al. 2010, )*#46)*3"QA# Con ambos marcadores se determinó además 2"#)3&6.,&.6",%>*#)34",%"2#/)2#3%3&)1"#/)#"4"6)"1%)*&'# )*# 4';2",%'*)3# /)# )3&"# )34),%)# # 7# .*#46',)3'#/)#/)6%9"#()*+&%,"A#

438 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

!"# )3&6.,&.6",%>*# ()*+&%,"# 7# 3.3# 4"&6'*)3# /)#/%3&6%;.,%>*#)34",%"2#@"*#3%/'#3.()6%/'3#)*# )3&./%'3#/)#6)()*)6",%>*#*"&.6"2#4'3&O%*,)*/%'# "# )3,"2"# /)# 6'/"2# )*# .*"# )34),%)# /)2# ()*+6'# Nothofagus utilizando marcadores genéticos %3')*?%18&%,'3#IU6)1'2%#7#t%&?;)6()6#\ffMQ En Roble Pellín (Nothofagus obliquaQ:#4./'# 3)6# /)&),&"/'# '&6'# 46',)3'# ()*+&%,'# 4',"3# 9),)3# )9%/)*,%"/'# )*# )34),%)3# -'6)3&"2)3c# .*# efecto de cuello de botella# )*# .*"# 4';2",%>*# )3&)4"6%"# 7# "%32"/"# "# .*'3# ^f# h1# "2# )3&)# /)# 2"3# 4';2",%'*)3# ,'*&%*."3# /)# 2"# )34),%)# Ii"llo et alA#\ffX:#J?4%2%,.)&"#7#i"22':#\f]fQA#J/)183:#1"6,"/'6)3#(+*%,'3#%3')*?%18&%,'3#4)61%&%)6'*# ,'*061"6# 2"# @%;6%/",%>*# *"&.6"2# )*&6)# )34),%)3#/)2#(+*)6'#Nothofagus 4'6#1)/%'#/)# "2)2'3#)34),=0,'3#/)#)34),%)#)*#/'3#2',%#/)#3)(6)(",%>*# %*/)4)*/%)*&) '# 4'6# /%-)6)*,%",%>*# de frecuencias alélicas en el género Prosopis Ik)6("# ]WWMQA Estos resultados contribuyeron )*#)2#46%1)6'#/)#2'3#,"3'3#"#-'61.2"6#.*#1'/)2'#/)#/%*81%,"#/)#@%;6%/",%>*#*"&.6"2#7#46'4'*)6#4".&"3#/)#1"*)*# )# %*&6'(6)3%>*# I6)&6',6.?"3Q# 4./%)6'*# 3)6# ,'*061"/"3#,'*#1"6,"/'6)3#1%,6'3"&+2%&)3#)*#.*# )3&./%'#,'14"6"&%9'#/)#3.#,"2%/"/#/)#1"/)6"A## Un estudio morfológico detallado junto con información sobre variación genética isoenzi18&%,"# 4)61%&%># /)&),&"6# 2"# @%;6%/",%>*# *"&.6"2# %*&)6)34),=0,"#4','#,'1B*#)*&6)#.*"#)34),%)# decidua (Nothofagus antarctica) y una siem46)9)6/)# IN. dombeyi) (Steconni et al. 2004). Un estudio que derivó en una medida concreta /)#46'&),,%>*#-.)#6)"2%?"/'#"#&6"9+3#/)2#"*82%3%3# combinado con marcadores de ADN de cloro42"3&'#)#%3')*?%18&%,'3A#$'*#)22'3#-.)#/)&),&"do el centro de mayor diversidad genética de 4';2",%'*)3#"6()*&%*"3#/)#Nothofagus nervosa Iq"6,@)22%# ˆ# i"22'# \ffYn# i"22'# )&# "2A# \ffWQ:# (Figura DQ:# 6)3.2&"*/'# )*# .*"# /),%3%>*# 4'2=&%ca sobre la conservación y manejo de masas boscosas P# C2# &)6,)6# (6.4'# /)# 1"6,"/'6)3# )3# .&%2%?"/'#)*#)3&./%'3#/)#46',)3'3#/)#%14'6&"*,%"#)9'2.&%9"#7#/)#()*+&%,"#)34",%"2#"# escala local, los cuales requieren esen,%"21)*&)# 1"6,"/'6)3# @%4)69"6%";2)3:# co-dominantes o dominantes (nSSR o

GGN# *.,2)"6)3:# ,4GGN# '# GGN# /)# ,2'6'42"3&'3:# NJUK, AFLP). Entre estos 46',)3'3# 0(.6"*# )3&%1",%'*)3# /)# `.*# /)2#@";%&"&:#"*82%3%3#/)#4"&)6*%/"/:#%/)*&%0,",%>*#/)#6)()*)6",%>*#*"&.6"2#9)()&"tiva, entre otros. J42%,"*/'# GGN3# #)2#`.*# )2),&6'-'6+&%,'# /)# JKL# /)# ,2'6'42"3&'# /)# 4';2",%'*)3# "6()*&%*"3# /)# Nothofagus nervosa (Raulí), que conjuntamente ,'*#%3')*?%1"3#-.)##.&%2%?"/'#4"6"#/)&),&"6#)2#,)*&6'# de mayor diversidad genética al oeste de la cuen,"#!"('#!","6#I3)S"2"/'#)*#)2#1"4"#4'6#)2#,=6,.2'# 22)*'Q:#/)6%9"*/'#2.)('#)*#.*"#1)/%/"#4'2=&%,"#5.)# 4)61%&%># 1'/%0,"6# )2# )3&"&.3# /)# 46'&),,%>*# /)# )3)# bosque.1:#q"4"#,'*#@"42'&%4'3#I/)#q"6,@)22%#7#i"22'#\ffYQ:2: Migración de fragmentos de restricción /)#JKL#/)#,2'6'4"3&'#)*#()2)3#/)#"("6'3"#I/)#q"6chelli et.al. ]WWXQ:##3: Bosque Hua-Hum incluido en 2"#*.)9"#86)"#46'&)(%/"QA

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 439

1%*"2# 4)6'# 5.)# "1;"3# 4';2",%'*)3# 3)# 1"*&%)*)*# ,'*),&"/"3# ()*+&%,"1)*&)# 4'6# `.*# donde los marcadores de ADN neutros ofrecen mayor utilidad. T"*&'#)*#2'3#46'(6"1"3#/)#1)*# 1"3%9":# 2"# ,'66),&"# %/)*&%0,",%>*# /)# ,2'*)3# )2%&):# "3=# ,'1'# 2"# %/)*&%0,",%>*# /)# 2'3# 46'()*%&'6)3# involucrados en cruzamientos controlados, ,'*3&%&.7)*# -",&'6)3# ,6=&%,'3# )*# 2"# 46'/.,,%>*# /)# )34),%)3# ,'1)6,%"2)3:# 7"# 5.)# )66'6)3# /)# %/)*&%0,",%>*#()*+&%,"#4.)/)*#"-),&"6#3)9)6"1)*&)# 2'3# *%9)2)3# /)# ("*"*,%"# )34)6"/'3# )*# 3%3&)1"3# "# (6"*# )3,"2"A# K%,@'3# "34),&'3:# "3=# como la estimación del nivel de contaminación ,'*# 4'2)*# 46',)/)*&)# /)# -.)*&)3# )D&)6*"3# )*# @.)6&'3# 3)1%22)6'3:# 4.)/)*# 3)6# "3%3&%/'3# 1)/%"*&)# j0*()646%*&j# '# @.)22"# /",&%2"6# /)2# JKL# 1)/%"*&)# )2# )142)'# /)# 2'3# GGN3:# (6",%"3# "# su naturaleza multialélica y herencia codomi-

nante. En el ámbito local estos marcadores se .&%2%?"6'*# ,'1'# /)3,6%4&'6)3# ,'142)1)*&"6%'3# 4"6"#2"#%*3,6%4,%>*#)*#)2#N)(%3&6'#L",%'*"2#/)# 2"#U6'4%)/"/#/)#$.2&%9"6)3#/)#2'3#46%1)6'3#]f# clones de Eucayptus grandis, mediante la uti2%?",%>*#/)#Y#GGN3#/)3"66'22"/'3#4'6#CqbNJUJ:#b6"3%2#IT'6"2)3#)&#"2A#\ffMQ#A !"# ,."*&%0,",%>*# /)# 2"# /%9)63%/"/# ()*+&%,"# dentro del stand, es uno de los criterios claves 5.)# /)0*)*# 2"# ,"2%/"/# /)# 2"# 3)1%22"# -'6)3&"2A# !"# 46'/.,,%>*# /)# 3)1%22"# ()*+&%,"1)*&)# 1)jorada, a través de Huertos Semilleros, integra 2"3# ",&%9%/"/)3# 46%'6%?"/"3# )*# 2'3# 46'(6"1"3# de mejoramiento del INTA, donde idealmente )2#1"&)6%"2#/)#46'4"(",%>*#/);)#46)3)*&"6#"2&'# valor genético y mantener alta diversidad. C2#@.)6&'#3)1%22)6'#,'*3&%&.7)#.*"#42"*&",%>*# /)# ,2'*)3# IHG$Q# '# 46'()*%)3# IHGUQ# 3)2),,%'nados intensivamente sobre la base de carac&)6=3&%,"3# /)# %14'6&"*,%"# ),'*>1%,":# )2# ,."2# ha sido sometido a los aclareos genéticos ne,)3"6%'3# 4"6"# ,'*3)69"6# B*%,"1)*&)# "5.)22'3# clones o individuos que han demostrado su su4)6%'6%/"/A#C3&'#4.)/)#'6%(%*"6#)2#/),6),%1%)*&'# /)2# *%9)2# /)# 9"6%";%2%/"/# ()*+&%,"# 46)3)*&)# )*#2"3#3)1%22"3#46'/.,%/"3#)*#)2#@.)6&'#7:#4'6# )D&)*3%>*:#)*#2"3#428*&.2"3#.&%2%?"/"3#)*#2"3#)D42'&",%'*)3#,'1)6,%"2)3:#,'*#4'3%;2)3#4+6/%/"3# /)#46'/.,&%9%/"/A#J#1'/'#/)#)*# /)# 2'3# *%9)2)3# /)# 46'/.,,%>*# /)# 3)1%22"3:# 6)/.,,%>*# de altura de fuste, área basal y volumen, y de-'61",%>*# /)# @'*# 4'6#)*/'("1%"A#G.#"42%,",%>*#4)61%&>#)2#"*82%3%3#()*>1%,'#/)#ZY#,2'*)3#3)2),&'3#4'6#-'61"# /)# -.3&)# 7# &"3"# /)# ,6),%1%)*&'# 7# 2"# %/)*&%0,",%>*#/)#*.)9)#4"6)3#/)#,2'*)3#183#/%9)6()*&)3:# 1"*&)*%)*/'# )2# WMA\g# /)2# *B1)6'# &'&"2# /)# "2)2'3# /)&),&"/'3# Iq"6,.,,%# U'2&6%# )&# "2A# 2003). Así mismo, estos marcadores han sido .&%2%?"/'3:4"6"#2"#)3&%1",%>*#/)#2"#"142%&./#/)# la base genética retenida en huertos semilleros /%3)S"/'3# "# 4"6&%6# /)# 4';2",%'*)3# /)# 1)*#/)#&+,*%,"3#1'2),.2"6)3#)*# 2'3#46'(6"1"3#/)#1)*# /)# *.)9'3# 1"teriales y mejorar las estrategias de selección. $'*# 2"# 0*"2%/"/# /)# )3&";2),)6# .*"# )3&6"&)(%"# "2&)6*"&%9"# /)# 3)2),,%>*# 4"6"# )2# /%3)S'# /)# .*# HSP local de E. dunnii, basado en el análisis conjunto de un índice de selección morfométrico y criterios de diversidad genética molecular, se realizó el estudio genómico de 37 familias /)#1)/%'#@)61"*'3:#3)2),&"3#4'6#-'61"#/)#-.3&):#KJU#7#/)*3%/"/#/)#2"#1"/)6":#46'9)*%)*&)3# /)#M#'6=()*)3#".3&6"2%"*'3#7#.*"#46',)/)*,%"# local. La diversidad genética y su distribución así como las relaciones genéticas entre los individuos, evidenciaron con claridad baja dife6)*,%",%>*# ()*+&%,"# )*&6)# 46',)/)*,%"3# 7# "2&"# /%-)6)*,%",%>*#)*&6)#-"1%2%"3:#/'*/)#)2#Xfg#/)# 2"#9"6%",%>*#&'&"2#-.)#)D42%,"/"#/)*&6'#/)#)22"3:# 3.(%6%)*/'#4'6#2'#&"*&'#5.)#)2#/%3)S'#/)2#HGU# debía basarse en la selección individual y fami2%"6#I†)2)*)6#et. al.#\ffMQA !"# /)&)61%*",%>*# /)# 2'3# 4'3%;2)3# '6=()*)3# de las razas locales de E. globulus#46'9)*%)*&)3# /)# J6()*&%*":# U'6&.("2:# C34"S"# 7# $@%2):# fue también abordada mediante el análisis de SSRs y AFLPs. Los estudios de diversidad ge-

*+&%,"#7#)3&6.,&.6"#4';2",%'*"2:#/%"(*'3&%,"6'*# una marcada asociación entre las razas locales )*&6)#3=:#"3=#,'1'#.*"#,2"6"#"0*%/"/#)*&6)#+3tas y las razas australianas del Sur y Sudeste de Tasmania, sugiriendo que dichas regiones -.)6'*#2"3#46%1)6"3#-.)*&)3#46'9))/'6"3#/)#3)1%22"3#/)#2"#)34),%)#IJ,.S"#et.al. 2004). 34'/5'&$()*#,*4':$'A$/$#'#*95)&$")'/*,)* programas de mejoramiento y #"6,8.$&'&$() !"# )D42'6",%>*# /)# 2"# 9"6%";%2%/"/# "2+2%,"# /)# genes candidatos mediante diversas técnicas de detección de SNPs, constituye un desafío 4"6"# )2# )3&./%'# /)# 2"# /%9)63%/"/# -.*,%'*"2# )*# )34),%)3#-'6)3&"2)3A## C*# 2'3# 46'(6"1"3# /)# 1)*#/)2#,"68,&)6#7#"#,'*&%*.",%>*#3)#/)&"22"*#2'3#/'3#)*# de los residuos forestales en la generación de biocombustibles (bioetanol) ya que reduce los ,'14'*)*&)3# %*@%;%&'6%'3# 7# )*6%5.),)# 2"# ,'*centración relativa de los hidratos de carbono -)61)*&";2)3A#C*#.*"#46%1)6"#)&"4"#3)#,"6",&)6%?># .*# H.)6&'# G)1%22)6'# $2'*"2# /)# 46%1)6"# generación (27 árboles) de E. grandis, tanto en la variabilidad de los genes candidatos involucrados en la via metabólica como en el con&)*%/'#7#,'14'3%,%>*#/)#2%(*%*"#IT'6"2)3#et al, \ffYQ:. Se encontraron escasas diferencias fe*'&=4%,"3# )*&6)# %*/%9%/.'3# 7# "2(.*"3# 9"6%"*&)3# alélicas diferenciales. En cuanto a la búsqueda de QTLs asociados a densidad de madera, se &6";"#)*#4';2",%'*)3#3)(6)("*&)3#2',"2)3#/)# E. grandis (García et al, 2007) y en el desa-

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 441

66'22'#/)#1"6,"/'6)3#-.*,%'*"2)3#/)#&%4'#CGTO GGN# "# 4"6&%6# /)# 3),.)*,%"3# 4.;2%,"/"3# /)# E. globulus (Acuña et al, 2007), información útil )*#)2#1"4)'#()*+&%,'#7#)3&./%'3#/)#9"6%";%2%/"/# funcional. \Q# !"# 3)(.*/"# "42%,",%>*# /)2# 46'(6"1"# 3)# 6)0)6)#"2#)3&./%'#/)#9"6%";%2%/"/#"#*%9)2#/)#*.cleótidos de genes involucrados en tolerancia a estrés abiótico tales como sequía y salinidad. Los genes seleccionados se estudiaron )*# 2"3# 4';2",%'*)3# /)# Austrocedrus chilensis y Prosopis spp, en sus gradientes naturales de /%3&6%;.,%>*# ()'(680,":# ";"6,"*/'# 2"3# ?'*"3# marginales, sometidas a estrés hídrico y sali*'A#J1;"3#)34),%)3#,'*3&%&.7)*#3%3&)1"3#1'/)2'#4"6"#)3&)#&%4'#/)#"*82%3%3:#3%)*/'#)34),%)3# -'6)3&"2)3# *"&%9"3# /)# %14'6&"*,%"# ),'*>1%,":# /)# 6)2"&%9'# 684%/'# ,6),%1%)*&'# 7# ,'*# .*# "2&'# 4'&)*,%"2# "/"4&"&%9'A# T%)*)*# 4'3%;%2%/"/)3# /)# adecuarse a cambios climáticos futuros, que 2)3#4)61%&%6="*#',.4"6#*%,@'3#5.)#*'#3)#3.4)64'*)*# ,'*# 2"# 46'/.,,%>*# -'6)3&"2# /)# )34),%)3# )D>&%,"3# /)# "2&'# 6)*/%1%)*&':# 4)61%&%)*/'# 2"# 6)3&".6",%>*# /)# ),'3%3&)1"3# /)(6"/"/'3# 4'6# 2"# )D42'&",%>*# -'6)3&"2# )D&6",&%9"A# $'*3&%&.7)*# .*"#"2&)6*"&%9"#46'/.,&%9"#7#)*#"2(.*'3#,"3'3# 4.)/)#3)6#,'1;%*"/"#,'*#2"#",&%9%/"/#"(6=,'2"# '# ("*"/)6"A#J# 4"6&%6# /)# CGT3# /)# Pinus pinaster, P. taeda, ?('3'=%3)H"#%&'(* y genes de Arabidopsis y Criptomeria japónica, se diseñaron ,);"/'6)3:# 3)# "142%0,"6'*# 7# "*"2%?"6'*# -6"(1)*&'3# ,'*# "2&'# 4'6,)*&"*#3)#,'*,)*&6"#)*#1'/%0,"6#)2#,'*&)*%/'#7#2"#,'14'3%,%>*#/)#2%(*%*"A#q.,@'3#/)#2'3# genes involucrados en la síntesis de la lignina @"*#3%/'#3';6))D46)3"/'3#'#%*@%;%/'3#)*#86;'2)3# ,'1'# 82"1':# 4%*'# 7# ).,"2%4&'3A# _&%2%?"*/'# 2"#)3&6"&)(%"#/)#"*&%3)*&%/'#4"6"#6)/.,%6#2"#)D46)3%>*#/)2#()*#4CL IH.#)&#"2A#]WWWn#G)/)6'--# )&#"2:#]WWWQ#'#".1)*&"*/'#2"#)D46)3%>*#/)#EMH# 3)#';&.9'#.*"#6)/.,,%'*#/)2#ZMg#/)2#,'*&)*%/'# /)# 2%(*%*"# 7# .*# ".1)*&'# /)2# ]Mg# /)# ,)2.2'3"# en álamos. Otros objetivos han sido la introducción de resistencia a insectos y hongos, tolerancia a herbicidas y las mejoras relacionadas con la EA;,.$4"8*#,*/'*.:')89":6'&$()*+,)-.$&'* ,"4",%/"/#/)#,6),)6#)*#3.)2'3#1"6(%*"2)3:#)Dde árboles hibiendo resistencia o tolerancia a los estreses _*'#/)#2'3#';*:# )3# 4'3%;2)# "&6%;.%6A# !'3# /'3# ';*#9)()&"&%9"#'#,'*# 46'/.,,%>*#6)/.,%/"#/)#4'2)*QA#!"#1'/%0,",%>*# genética a través del ensayo clonal es la estra&)(%"# 183# 2>(%,"# 4"6"# %*&)(6"62"# "# 2'3# 46'(6"mas tradicionales de mejoramiento de árboles. U'6#)3&"#6"?>*:#)3#46)-)6%;2)#.&%2%?"6#%*()*%)6="# ()*+&%,"# )*# )34),%)3# -'6)3&"2)3# 5.)# ,.)*&"*# ,'*#46'(6"1"3#"9"*?"/'3#/)#1)D%,"# /)# )3&6.,&.6"3# `'6"2)3# B*%,"1)*&)# IG@)4"6/#]WW[QA# C*# ,."*&'# "# 2"# .&%2%?",%>*# /)# 42"*&",%'*)3# -'6)3&"2)3#0&'66)1)/%"6:#3)#@"*#)*3"7"/'#/%-)6)*&)3#)3&6"&)(%"3#4"6"#".1)*&"6#2"#,"4",%/"/# de absorción de las raíces. Se han transformado híbridos de Populus usando un gen de 1"1=-)6'3#/)2#,%&',6'1'#UZMf,#4"6"#/)&'D%0,"6# &6%,2'6')&%2)*'#IT$CQ#7#'&6'3#,'14.)3&'3#@"2'genados, se han transformado callos embriogénicos de Liriodendron tulipifera con un gen 1'/%0,"/'#/)#2"#)*?%1"#;",&)6%"*"#1)6,B6%,'# reductasa (gen merA) (Che et al., 2003) y se @"*# 1'/%0,"/'# @=;6%/'3# /)# 82"1'# IPopulus alba x P. glandulosaQ#3';6))D46)3"*/'#.*#()*# /)# 0&'5.)2"&%*"3# I4+4&%/'3# 5.)# .*)*# 1)&"2)3# )*# @'*('3# 7# 42"*&"3Q:# 4"6"# 2"# )2%1%*",%>*# /)# cadmio. N:A"/,8*.:')8+-)$&"8*,)*H6,:$&'*/'.$)' C*#"2(.*'3#4"=3)3#/)#J1+6%,"#!"&%*"#3)#)3&8*#/)3"66'22"*/'#46'7),&'3#/)#&6"*3-'61",%>*# ()*+&%,"#/)#86;'2)3#4"6"#3.#,'1)6,%"2%?",%>*A# C*#$@%2):#"#&6"9+3#/)#.*#46'7),&'#,'**#()*+&%,"#/)#,2'*)3#/)# 82"1'3#4"6"#1'/%0,"6#2"#2%(*%*":#4"6"#&'2)6"*cia a herbicidas y resistencia a insectos. Conclusiones !"#1'/%0,",%>*#()*+&%,"#)*#)2#3),&'6#-'6)3tal es mucho más que una cuestión técnica; se han de tener en cuenta los valores sociocultu6"2)3#7#2'3#1B2&%42)3#.3'3#/)#2'3#;'35.)3#7#)3# *),)3"6%"#2"#",)4&",%>*#/)#2"#'4%*%>*#4B;2%,"A# G)# *),)3%&"*# 46'&','2'3# 0";2)3:# )D4)6%1)*&"/'3# 7# ,'*9)*%/'3# 4"6"# )9"2."6# 2'3# 6%)3('3# relacionados con los árboles forestales modi0,"/'3#()*+&%,"1)*&):#4)6'#2"#)9"2.",%>*#/)2# 6%)3('#)*#,.2&%9'3#/)#&"*#2"6("#/.6",%>*#42"*&)"# "2(.*'3#46';2)1"3A#C*#,'*3),.)*,%":#)2#/)3"66'22':# )*3"7'# 7# "46';",%>*# /)# 2'3# 86;'2)3# -'6)3&"2)3# 1'/%0,"/'3# ()*+&%,"1)*&)# 4"6"# .*"# .&%2%?",%>*# 183# ()*)6"2%?"/"# 4.)/)# 3.-6%6# .*# ,'3&'#)2)9"/'#7#)D%(%6#42"?'3#1.7#2"6('3A C*#,'**#,'*&6'2"/"#I)3&+6%2)3:# /)# 46'4"(",%>*# 9)()&"&%9"# '# ,'*# 46'/.,,%>*#

444 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

L.,2)'&%/)# U'271'64@%313# "&# $"*/%/"&)# i)*)3# 6)/.,%/"#/)#4'2)*QA#!"#1"/)6"#)3#9%&"2#4"6"#2"# -'6# K6'.(@&OG&6)33# N)34'*3)# %*# Pinus taeda L. ),'*'1="# 1.*/%"2# 4)6'# 2"# 46)3%>*# /)2# /)3"Genetics ][\c#]W]M|]W\YA rrollo humano y el crecimiento de la demanda i'*?"2)?Oq"6&Š*)?# GA$A:# w@))2)6# LA# $:# C63'?# CA:# están contribuyendo a la degradación de los Nelson C. D. and Neale D. B. 2007. Association ecosistemas forestales naturales, creando un Genetics in Pinus taeda#!AFA#w''/#U6'4)6&7#T6"%&3. dilema sobre el futuro de estos recursos. La Genetics#][Mc#^WW|ZfWA 1'/%0,",%>*# ()*+&%,"# 7# '&6"3# ;%'&),*'2'(="3:# q"6,@)22%:#U#"*/#i"22':#!JA#I\ffYQ#q.2&%42)#%,)O"()# 4.)/)*# &)*)6# .*"# -.*,%>*# /)# %14'6&"*,%"# )*# refugia in a southern beech from southern South 2"3#42"*&",%'*)3#-'6)3&"2)3A# J1)6%,"#"3#6)9)"2)/#;7#,@2'6'42"3&#KLJ#1"6h)63A#

Referencias J6"*"#qk:#i"22'#!J:#k)*/6"1%*#ii:#U"3&'6%*'#qs:# Sebastiani F, Marchelli P, 2010. High genetic 9"6%"&%'*# %*# 1"6(%*"2# -6"(1)*&)/# 4'4.2"&%'*3# "&# extreme climatic conditions of the Patagonian $746)33# Austrocedrus chilensis. Molecular Phylogenetics and Evolution, )*#46)*3". J?4%2%,.)&":#qq:#q"6,@)22%:#U:#i"22':#!JA#\ffWA#T@)# Effects Of Quaternary Glaciations In Patagonia As C9%/)*,)/#b7#$@2'6'42"3&#KLJ#U@72'()'(6"4@7# Of Southern Beech Nothofagus Obliqua. Tree Genetics and Genomes:# KoFc# ]fA]ff[R3]]\WMO 009-0209-x. b')6*#/)#2"#k"6%";%2%/"/# i)*+&%,"A#FKFJ#ppFA#N)9%3&"#/)#%*-'61",%>*#3';6)# %*9)3&%(",%>*# 7# /)3"66'22'# "(6'4),."6%'A# JS'# kA# LX#A44c#]XYO]Wf q%22)6'*:# qn# i"22':# !# ˆ# q"6,@)22%:# UA\ffXA# T@)# )--),&# '-# 9'2,"*%31# '*# 4'3&(2",%"2# 1%(6"&%'*# "*/# 3))/# /%34)63"2A#J# ,"3)# 3&./7# %*# 3'.&@)6*# G'.&@# America. Tree Genetics and Genomes,4:Z^MOZZ^ Pastorino, M.J., Marchelli, P, Milleron, M, Soliani, C and Gallo, L.A. 2009. The effect of different (2",%"&%'*# 4"&&)6*3# '9)6# &@)# ,.66)*&# ()*)&%,# variation distribution of the southern beech Nothofagus antarctica (G.Forster) Oersted. Genetica:#]^Yc[WOXX Torales, S., Marcucci Poltri S.N., Harrand L., Marcó qA# \ffMA# F/)*&%0,",%>*# i)*+&%,"# /)# $2'*)3# _&%2%?"*/'# q%,6'3"&+2%&)3A# FKFJ# ppFA# N)9%3&"# /)# información sobre investigación y desarrollo "(6'4),."6%'A#JS'#kA#LX#A44c#]W[O\ffA T'6"2)3# GA:U'14'*%'# E:# N'/6=(.)?# q:# i"22'# !:# k)6("# J:# q"6,@)22%# U:# U"3&'6%*'# q:# Cr)*3# q# :# Catalano S. y Marcucci Poltri S. 2009..Estudios 46)2%1%*"6)3# 4"6"# 2"# %/)*&%0,",%>*# /)# ()*)3# %*9'2.,6"/'3# )*# 2"# 6)34.)3&"# "# )3&6+3# ";%>&%,'# )*# )34),%)3# -'6)3&"2)3# *"&%9"3# kFF# G%14'3%'# Nacional de Biotecnología REDBIO-Argentina. !%;6'#/)#N)3B1)*)3#4"(AZWA †)2)*)6#LA:#q"6,.,,%#U'2&6%#GALA:#b"6&'2'*%#LA:#!>4)?# $ANA#J*/#H'44#HACA#\ffMA#G)2),&%'*#3&6"&)(7#-'6# a seedling seed orchard design based on both, trait selection index and genomic analysis by

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 445

1'2),.2"6# 1"6h)63c# "# ,"3)# 3&./7# -'6# C.,"274&.3# dunnii. Tree Physiology#\Mc#]ZM[O]ZY[ †%)()*@"()*# bA# J*/# E2"/.*(# qA# \ffXA# KLJ# q"6h)63# -'6# F/)*&%0,"&%'*# "*/# C9"2."&%'*# '-# Genetic Resources in Forest Trees: Case Studies %*#J;%)3:#U%,)"#"*/#U'4.2.3A#F*c#L"("&"#TAn#!‹6?# HA#"*/#w%/@'21#sA#qA#I)/3QA#\ffXA#b%'&),@*'2'(7# %*#J(6%,.2&.6)# "*/# E'6)3&67A# !‹6?# HA# "*/# w)*?)2# G. (eds) Molecular Marker Systems in Plant Breeding and Crop Improvement:#44#Z]^OZ\WA#

446 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

V. CAPÍTULO 6

C*# 3)*&%/'# "142%'# )D%3&)*# /'3# -'61"3# /)# 1'/%0,"6# 42"*&"3# 4'6# %*()*%)6="# ()*+&%,"# /)# manera de conferirles resistencia a virus: desTécnicas de Ingeniería Genética )*,"/)*"6# 6)3%3&)*,%"# 1)/%"*&)# 2"# )D46)3%>*# para conferir resistencia a virus /)# 3),.)*,%"3# ()*>1%,"3# /)6%9"/"3# /)2# 46'4%'# 9%6.3# "2# 5.)# 3)# /)3)"# ,'1;"&%6# I22"1"/"# en plantas 6)3%3&)*,%"# /)6%9"/"# /)2# 4"&>()*'# '# UKNQ# ':# /)3)*,"/)*"6# 6)3%3&)*,%"# 1)/%"*&)# 2"# )D46)q#/)2#k"3n#Js#K%3&+-"*'n 3%>*#/)#()*)3#*'O9%6"2)3#5.)#4'3))*#",&%9%/"/# $#N'9)6)#k8?5.)?n#HC#H'44 antiviral. Ambas estrategias se describirán a !"3# )*-)61)/"/)3# /)# 2"3# 42"*&"3# ,".3"*# ,'*&%*.",%>*A#IN),%)*&)1)*&)#3)#@"#4.;2%,"/'# 2"# 4+6/%/"# /)# "46'D%1"/"1)*&)# )2# ]Mg# /)# 2"# .*"#%*&)6)3"*&)#6),'4%2",%>*#3';6)#)2#&)1":#9)6# 46'/.,,%>*#"(6=,'2"#1.*/%"2A#C*#4"6&%,.2"6:#2"3# U6%*3:#)&#"2A#\ffX#)*#!),&.6"3#N),'1)*/"/"3QA# %*-),,%'*)3#9%6"2)3#46'/.,)*#4)6Resistencia a virus conferida por 1%,'3# 3%(*%0,"&%9'3# /)# 1"*)6"# /%6),&":# "# &6"secuencias virales 9+3# /)# .*"# /%31%*.,%>*# /)2# 6)*/%1%)*&'# 4'6# !"#46)9)*,%>*#/)2#/)3"66'22'#/)#)*-)61)/"efecto de la enfermedad e indirecta, y a través de un incremento en los costos debido a la uti- /)3#9%6"2)3#.&%2%?"*/'#()*)3#/)6%9"/'3#/)2#4"&>2%?",%>*# /)# 3)1%22"# 2%;6)# /)# 9%6.3# I4'6# )*#,2'*"2#,'1'#4"4":# ?'3#/)2#3%(2'#pp:#,."*/'#3)#/)1'3&6>#5.)#2"3# "*#,6.?"/"#I5.)#3)# ]WXM:# /'3# %*9)3&%("/'6)3# 46'4.3%)6'*# 5.)# 2"# describe brevemente más adelante). )D46)3%>*#/)#,%)6&'3#()*)3#/)2#4"&>()*'#)*#.*# K)3/)# ]WX^:# ,'*# 2"3# 46%1)6"3# ';&)*,%'*)3# @'34)/"*&)#"2&)6"6="#)2#;"2"*,)#*'61"2#/)#2'3# /)# 42"*&"3# /)# &";",'# 7# 4)&.*%"# &6"*3(+*%,"3:# ,'14'*)*&)3#9%6"2)3#7#46)/%*#/)#2"#46'&)=*"#/)#,843%/)#I$UQ#'#*.,2)',843%/)#Ii)*#LQ#9%6"2#)*#42"*&"3#&6"*3(+*%,"3A

Géneros de virus transgén

Virus

Especies vegetales

Tobamovirus

CP

TMV; ToMV; AIMV

tabaco; tomate

Potexvirus

CP

PVX; CyMV; WCIMV

tabaco

Potyvirus

CP

Carlavirus

CP

PVY; TEV; PRV; PPV PPV; tabaco; papa; papaya; maíz MDMV; SMV; WMV II; ZYMV tabaco; papa PVS

Luteovirus

CP

PLRV

papa

Comovirus

CP

SLRSV

tabaco

Nepovirus

CP

ArMV

tabaco

Tobravirus

CP

TRV

tabaco

Ilavirus

CP

TSV

tabaco

Geminivirus

CP

TYLCV

tomate

Tospovirus

Gen N

TSWV; INSV; TCSV; GRSV tabaco

!'3#",6>*%1'3#.&%2%?"/'3#I)*#'6/)*#"2-";+&%,'Q#3'*c#JFqkc#J2-"2-"#1'3"%,#9%6.3n#J6qkc#J6";%3#1'3"%,#9%6.3n# $qkc#$.,.1;)6#1'3"%,#9%6.3n#$7qkc#$71;%/%.1#1'3"%,#9%6.3n#iNGkc#i6'.*/*.%*(34' %6.3n#FLGkc# F14"&%)*3#*),6'&%,#34' %6.3n#qKqkc#q"%?)#/r"6-#1'3"%,#9%6.3n#U!Nkc#U'&"&'#2)"-#6'22#9%6.3n#UUkc#U2.1# 4'D#9%6.3n#UNkc#U"4"7"#6%*(34' %6.3n#UkGc#U'&"&'#9%6.3n#Ukpc#U'&"&'#9%6.3#pn#Ukyc#U'&"&'#9%6.3#yn#Gqkc# G'7;)"*#1'3"%,#9%6.3n#GG!NGkc#G&6"r;)667#2"&)*%*(34' %6.3n#T$Gkc#T'1"&'#,@2'6'&%,#34' %6.3n#TCkc# T';",,'#)&,@#9%6.3n#Tqkc#T';",,'#1'3"%,#9%6.3n#T'qkc#T'1"&'#1'3"%,#9%6.3n#TNkc#T';",,'#6"&&2)#9%6.3n# TGkc#T';",,'#3&6)"h#9%6.3n#TGwkc#T'1"&'#34'&&)/#r%2 %6.3n#Ty!$kc#T'1"&'#7)22'r#2)"-#,.62#9%6.3n#w$2qkc# w@%&)#,2'9)6#1'3"%,#9%6.3n#wqk#FFc#w"&)61)2'*#1'3"%,#9%6.3#FFn#†yqkc#†.,,@%*%#7)22'r#1'3"%,#9%6.3A

rística de cada virus, una menor cantidad de sitios de infección y un menor título viral. Se demostró que hay una correlación entre la re3%3&)*,%"#7#)2#*%9)2#/)#)D46)3%>*#/)#2"#46'&)=*"# /)#2"#,843%/):#5.)#2"#46'&),,%>*#",&B"#"#*%9)2# ,)2.2"6# 7# )3# 3.4)6"/"# 4'6# "2&"3# /'3%3# /)# %*>,.2'#I9%6%'*)3QA#C*#"2(.*'3#,"3'3#)3#3.4)6"/"# 4'6# %*',.2",%>*# ,'*# JNL# 9%6"2A# !"# 46'&),,%>*# )3#183#)-),&%9"#4"6"#)2#9%6.3#@'1>2'('#"2#5.)# dio origen al transgén. Sin embargo, abarca &"1;%+*# "# 9%6.3# 7# ,)4"3# 6)2",%'*"/"3# ".*5.)# 2"#)0,%)*,%"#3)#9"#6)/.,%)*/'#"#1)/%/"#5.)#2"# 6)2",%>*#02'()*+&%,"#3)#@",)#183#2)*# ,'*# 4"6&=,.2"3# 9%6"2)3# /)# Tqk# 4)6'# 2"# 6)3%3&)*,%"# )6"# 3';6)4"3"/"# si se las inoculaba con ARN viral infectivo. Se 4'3&.2>#)*&'*,)3#5.)#2"#46'&),,%>*#3)#/);="#"# la inhibición del desnudamiento viral en las cé2.2"3# %*-),&"/"3# %*%,%"21)*&)A# k"6%"3# 2=*)"3# /)# )9%/)*,%"# "4'7"*# )3&"# @%4>&)3%3A# U'6# )# 5.)# 2"3# 46'&)=*"3# /)# ,843%/)# 1.&"()nizadas de forma que carecen de la habilidad /)#".&'O"(6)("63)#*'#3'*#,"4",)3#/)#,'*-)6%6# 46'&),,%>*# -6)*&)# "# Tqk:# 7# 5.)# 2"3# 46'&)=*"3# 1.&"/"3#,"4",)3#/)#%*&)6",&."6#,'*#3=#1%31"3# ,'*#"0*%/"/#183#"2&"#,'*-)6="*#1"7'6#46'&),,%>*#5.)#2"#46'&)=*"#/)#,843%/)#3"29"*#/)#2"#46'&)=*"#/)#,843%/)#7# )2#*%9)2#/)#46'&),,%>*#-6)*&)#"#TqkA#U'3&)6%'6mente se demostró que el estado de agrega,%>*#/)#2"3#46'&)=*"3#/)#,843%/)#/)#Tqk#)*#2"3# 42"*&"3# &6"*3(+*%,"3# ,'66)2",%'*"# ,'*# )2# *%9)2# de resistencia observado. Estos resultados su(%)6)*# 5.)# 2"# 6)3%3&)*,%"# 4'6# )D46)3%>*# /)# 2"# ,843%/)# 9%6"2# I$UQ# )3&"6="# 1)/%"/"# 4'6# /)&)61%*"/"3#,'*0(.6",%'*)3#/)#2"#)3&6.,&.6"#,."&)6*"6%"#/)#2"#,843%/)#1"3#5.)#4'6#2"#)D46)3%>*# /)#2"#3.;.*%/"/#/)#,843%/)#)*#2"#&6"*3(+*%,"# per se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del movimiento vascular sea una consecuencia secundaria de la inhibición del desnudamien&'#9%6"2#)*#2"3#42"*&"3#)D46)3"*/'#46'&)=*"#/)# ,843%/)A# o&6'#,"3'#1.7#)3&./%"/'#)3#)2#/)2#9%6.3#Ukp# /)# 2"# 4"4"A# !"3# 42"*&"3# &6"*3(+*%,"3# 4"6"# 2"# ,843%/)# /)# Ukp# 6)3.2&"*# 46'&)(%/"3# "*&)# 2"# %*',.2",%>*#,'*#9%6.3#'#,'*#JNL#9%6"2A#G)#4'3-

&.2"# 5.)# 2"# 46'&)=*"# /)# ,843%/)# 3)# .*)# "2# '6%()*#/)#)*3"1;2"/'#2',"2%?"/'#)*#)2#)D&6)1'#Mm# /)2#JNL#9%6"2:#3.46%1%)*/'#/)#)3&"#1"*)6"#2"# &6"/.,,%>*#/)#2"#6)42%,"3"#9%6"2#I,.7'#()*#)3&8# localizado en el mismo extremo). También es 4'3%;2)# 5.)# %*@%;"# )2# 1'9%1%)*&'# /)# Ukp# /)# ,+2.2"# "# ,+2.2"# 7"# 5.)# 2"# 46'&)=*"# /)# ,843%/)# es un cofactor esencial de la traslocación sistémica. $'1'# 3)# /)346)*/)# /)# 2'3# /'3# )*# )*# 42"*&"3# &6"*3(+*%,"3# /)# '&6"3# 46'&)=*"3# 9%6"2)3# &"2)3# ,'1'# 2"#6)42%,"3"#9%6"2#INCUQ#'#/)#2"#46'&)=*"#/)#1'vimiento viral (MP).Ambas estrategias se describen a continuación. Protección debida a la expresión de la replicasa viral (REP) o de la proteína de movimiento viral (MP) !"#6)3%3&)*,%"#1)/%"/"#4'6#2"#6)42%,"3"#9%6"2# )3#2"#3)(.*/"#"42%,",%>*#183#"9"*?"/"#)*#)2# .3'# /)# ()*)3# /)6%9"/'3# /)2# 4"&>()*'# 4"6"# 2"# ';&)*,%>*#/)#42"*&"3#6)3%3&)*&)3#"#9%6.3A#C3&"# 6)3%3&)*,%"#-.)#46%1)6'#/)1'3&6"/"#)*#42"*&"3# /)#&";",'#5.)#)D46)3";"*#)2#()*#/)#2"#6)42%,"3"# /)# Tqk# I(+*)6'# &';"1'9%6.3Q# 7# 2.)('# ';3)69"/"# 4"6"# /%-)6)*&)3# -"1%2%"3# /)# 9%6.3# 5.)# %*,2.7)*# 2'3# &';6"9%6.3:# 4'&)DO:# 4'&7O:# "2-"1'O:# cucumo- y luteovirus entre otros. Los genes de 6)42%,"3"#9%6"2#,'*0)6)*#6)3%3&)*,%"#&"*&'#"#%*-),,%'*)3#46'/.,%/"3#4'6#)2#JNL#9%6"2#'#4'6#)2# virión y se ha demostrado que dan lugar a una resistencia muy efectiva y estable. Entre los )*#/)#46'&)=*"3#/)#1'9%1%)*&'#/%3-.*,%'*"2)3#'#1.&"*&)3#-.)#6)4'6&"/"#,'1'#,"4"?#/)#,'*-)6%6#.*"#6)3%3&)*,%"#183# "142%"#,'14"6"/"#,'*#2"#6)3%3&)*,%"#1)/%"/"# 4'6# $U# '# NCUA# U'6# )2# ,'*&6"6%':# 2"# )D46)3%>*# /)#46'&)=*"3#qU#3%*#1'/%0,"6:#4'6#2'#()*)6"2:# ".1)*&"*#2"#%*-),,%>*#9%6"2A#C2#1),"*%31'#4'3&.2"/'#)*#)3&)#,"3'#%142%,"#2"#)D%3&)*,%"#/)#/'1%*%'3#-.*,%'*"2)3#,'14"6&%/'3#4'6#qU3#/)#/%-)6)*&)3#9%6.3A#C3&'3#/'1%*%'3#4'/6="*#,'14)&%6# 4'6# -",&'6)3# ,)2.2"6)3# ,'1.*)3# 6)5.)6%/'3# 4"6"#)2#1'9%1%)*&'#7#)*#,'*3),.)*,%"#%14)/%6# )2#46'(6)3'#/)#2"#%*-),,%>*#/)#)3&'3#9%6.3A# Mecanismo de protección debida al desencadenamiento de resistencia mediada por ARN C*#]WW\#3)#/)1'3&6>:#4'6#46%1)6"#9)?:#5.)# 3)#4'/="#';&)*)6#6)3%3&)*,%"#"#9%6.3#1)/%"*&)# 2"#)D46)3%>*#/)#.*#JNL1#/)#,843%/)#9%6"2#*'# &6"/.,%;2):#)3#/),%6#*'#)6"#*),)3"6%"#2"#)D46)3%>*#/)#2"#46'&)=*"#,'/%0,"/"#4'6#)2#&6"*3(+*A# J# 4"6&%6# /)# )*&'*,)3# 3)# 4.;2%,"6'*# *.1)6'3'3# &6";"*#7# asintomático. En cualquiera de los dos casos, 7# "# /%-)6)*,%"# /)# 2'# 5.)# ',.66)# )*# 2"# 46'&),,%>*#1)/%"/"#4'6#2"#)D46)3%>*#/)#46'&)=*"3#/)# ,843%/)3#9%6"2)3:#2"3#42"*&"3#3'*#3'2"1)*&)#6)3%3&)*&)3#"#2"#%*-),,%>*#46'/.,%/"#4'6#9%6.3#)3trechamente relacionados con el virus que dio '6%()*# "2# &6"*3(+*A# C2# "*82%3%3# /)# )3&"3# 42"*tas a nivel molecular demostró que en general ,'*&%)*)*#,'4%"3#1B2&%42)3#/)2#&6"*3(+*#7#5.)# 3%#;%)*#46)3)*&"*#.*#"2&'#*%9)2#/)#&6"*3,6%4,%>*# en el núcleo, los niveles estables del ARNm /)2# &6"*3(+*# )*# )2# ,%&'42"31"# 3'*# 1.7# ;"#4'6#46%1)6"# 9)?#)*#42"*&"3:#4)6'#3)#@"#)*,'*&6"/'#&"1;%+*# )*# @'*('3# I/'*/)# 3)# /)*'1%*"# aquelling”) y animales como nematodos, moscas o mamíferos (donde se denomina interferencia media/"#4'6#JNLQA#b6)9)1)*&):#)2#UTiG#4.)/)#3)6# /)3)*,"/)*"/'#)0,%)*&)1)*&)#4'6#&6"*3()*)3# *.,2)"6)3#5.)#/"*#2.("6#"#&6"*3,6%4&'3#,'*#)3tructura de ARN de doble cadena (ARNdc) o 5.)#)D46)3"*#"2&'3#*%9)2)3#'#*%9)2)3#";)66"*&)3# /)#&6"*3,6%4&'3A#C*#42"*&"3#&"1;%+*#4.)/)#3)6# /)3)*,"/)*"/'#4'6#2"#6)42%,",%>*#/)#9%6.3#5.)# ()*)6"21)*&)#46'/.,)#%*&)61)/%"6%'3#6)42%,"&%9'3#/)#JNL/,#4'6#2'#5.)#3)#,'*,2.7>#5.)#)3&"# )3&6"&)(%"#/)#6)3%3&)*,%"#1)/%"/"#4'6#JNL#46'grama un mecanismo de resistencia antiviral 46))D%3&)*&)A# _*"# 9)?# /)3)*,"/)*"/'# )2# 46'ceso, los intermediarios que contienen ARNdc 3'*# 6),'*',%/'3# 4'6# .*"# *.,2)"3"# )34),=0,"# /)#JNL/,# 5.)# 2'3# 46',)3"# )*# -6"(1)*&'3# /)# JNL3# 4)5.)S'3# I22"1"/'3# 4)5.)S'3# %*&)6-)6)*&)3# Oa31"22# %*&)6-)6%*(eO# 3%JNLQ# /)# "1;"3# 4'2"6%/"/)3# 7# /)# \]# 7# \Z# *&# /)# 2'*(%&./A#J# 3.# 9)?:# 3)# 4'3&.2"# 5.)# 2'3# 3%JNL# ",&B"*# ,'1'# (.="3#4"6"#/%6%(%6#2"#1"5.%*"6%"#/)#/)(6"/",%>*# de ARN contra todo aquél ARN con homología "# 2"# 3),.)*,%"# /)3)*,"/)*"*&)A# _*# "34),&'# a destacar es que el silenciamiento mediado 4'6#JNL#)3#/)3)*,"/)*"/'#2',"21)*&)#7#2.)('# &6"*31%&%/'# "# &'/"# 2"# 42"*&"# 9="# .*"# 3)S"2# de silenciamiento móvil. Si bien se desconoce 4'6# )2# 1'1)*&'# 2"# *"&.6"2)?"# /)# 2"# 3)S"2:# 3)# 4'3&.2"# 5.)# +3&"# ,'*&%)*)# .*# ,'14'*)*&)# /)# 8,%/'# *.,2)%,'# 5.)# )D42%,"6="# 2"# )34),%0,%/"/# de secuencia del mecanismo de degradación y .*#,'14'*)*&)#46'&)%,'A# Utilizando los conocimientos que se fueron ",.1.2"*/'#3';6)#)2#1),"*%31'#/)#2"#46'&),,%>*#1)/%"/"#4'6#JNL:#3)#@"*#/%3)S"/'#7#.&%lizado construcciones genéticas que contienen 3),.)*,%"3# 6)4)&%/"3# %*9)6&%/"3# IFNQ# /)# &6"*3()*)3# 9%6"2)3A# !"# &6"*3,6%4,%>*# /"# 2.("6# "# 2"6-

450 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

('3#JNL/,# 5.)# 3'*# 1.7# )0,%)*&)3# 46),.63'res de siARNs. De esta manera se ha logrado ".1)*&"6#)2#4'6,)*&"*# 3)*&%/'#'#"*&%3)*&%/'#/"*#2.("6#"#.*#M#"2#\fg# /)#42"*&"3#&6"*3(+*%,"3#6)3%3&)*&)3:#.&%2%?"*/'# construcciones de transgenes IR se obtienen 183#/)2#Wfg#/)#2"3#42"*&"3#&6"*3(+*%,"3#6)3%3&)*&)3A# _&%2%?"*/'# FN3# -.)# 4'3%;2)# /)3)*,"/)*"6#6)3%3&)*,%"#1)/%"/"#4'6#JNL#)*#/%-)6)*&)3# -"1%2%"3# /)# 9%6.3A# G)# @"# /)1'3&6"/'# 46)9%"mente que este mecanismo de resistencia no )3#)-),&%9'#"*&)#9%6.3#,.7"#3),.)*,%"#/%0)6"#)*# 183# /)# .*# ]fg# 6)34),&'# /)# 2"# 3),.)*,%"# /)2# transgén. Con el objetivo de obtener una resis&)*,%"# 183# "142%":# 3)# -.3%'*"6'*# -6"(1)*&'3# /)#]Mf#4;#/)#3),.)*,%"3#9%6"2)3#4)6&)*),%)*&)3#"#,."&6'#&'34'9%6.3#)*#.*"#3%142)#,'*3&6.,ción IR quimérica obteniendo con esta estrate(%"#.*"#"2&"#-6),.)*,%"#/)#42"*&"3#&6"*3(+*%,"3# ,'*#6)3%3&)*,%"#1B2&%42)A Dado que el PTGS es un mecanismo de /)-)*3"# "*&%9%6"2# )*# 42"*&"3:# 6)3.2&"# )34)6"ble que se haya seleccionado en los virus de 42"*&"3# 2"# ,"4",%/"/# /)# ,'*&6"66)3&"6# "# )3&)# 1),"*%31'A#$'*(6.)*&)1)*&)#,'*#)3&"#)34),.2",%>*:#3)#)*,'*&6>#5.)#9"6%'3#9%6.3#/)#42"*&"3# ,'/%0,"*# 46'&)=*"3# 3.46)3'6"3# /)2# UTiGA# !.)('#/)#.*"#;B35.)/"#)D@".3&%9"#/)#3.46)sores de silenciamiento en una gran cantidad /)#9%6.3#/)#42"*&"3:#3)#,'*,2.7>#5.)#468,&%,"1)*&)#&'/'3#2'3#9%6.3#22)9"*#3.46)3'6)3#/)#3%2)*,%"1%)*&':#5.)#2'3#()*)3#5.)#2'3#,'/%0,"*# tienen secuencias y origen evolutivo diverso, y 5.)#2'3#/%3&%*&'3#3.46)3'6)3#",&B"*#%*@%;%)*/'# el silenciamiento a distintos niveles. Algunos ,'1'#2"#46'&)=*"#H$OU6'#,'/%0,"/"#4'6#2'3#4'&79%6.3#46)9%)*)*#2"#",.1.2",%>*#/)#2'3#3%JNL:# 4)6'# *'# )2%1%*"*# 2"# 3)S"2# 1>9%2# 5.)# 46'4"("# )2# 3%2)*,%"1%)*&'A# o&6'3# 3.46)3'6)3:# ,'1'# 2"# 46'&)=*"# 4\M# /)2# 9%6.3# Ukp# %*&)60)6)*# ,'*# 2"# 3)S"2# /)# 46'4"(",%>*# 3%3&+1%,":# 7# 0*"21)*&)# '&6'3:#,'1'#)2#,'/%0,"/'#4'6#)2#9%6.3#/)2#",@"4"66"1%)*&'#/)2#&'1"&)#ITbGkQ:#3.46%1)*#)2#3%lenciamiento sólo en las nervaduras. Incluso se @"*#)*,'*&6"/'#)*#9%6.3#"*%1"2)3#3.46)3'6)3# /)#3%2)*,%"1%)*&'#5.)#3'*#-.*,%'*"2)3#)*#42"*-

tas. Es interesante destacar que varios de los 3.46)3'6)3# /)# 3%2)*,%"1%)*&'# 9%6"2)3# /)3,6%4&'3# @";="*# 3%/'# 46)9%"1)*&)# ,"6",&)6%?"/'3# ,'1'#46'&)=*"3#6)34'*3";2)3#/)#2"#3%*&'1"&'logía, del movimiento viral y/o del fenómeno de sinergismo en la virulencia combinada de dos o más virus. !"# 4'3%;%2%/"/# /)# 2"# 3.46)3%>*# /)2# 3%2)*,%"1%)*&'#4'6#4"6&)#/)#.*#9%6.3#5.)#,')D%3&"#,'*# 2"3#42"*&"3#&6"*3(+*%,"3#46'&)(%/"3#4'6#)2#1)canismo de silenciamiento génico debe ser tomada en cuenta ya que la infección de una 42"*&"# 3%2)*,%"/"# ,'*# .*# 9%6.3# @)&)6>2'('# 5.)# 22)9"#.*#3.46)3'6#/)#3%2)*,%"1%)*&'#4.)/)#/"6# lugar a la reversión del silenciamiento tornán/'2"#3.3,)4&%;2)#"#2"#%*-),,%>*#9%6"2A#N)3.2&"#%14'6&"*&)#)*&'*,)3#)3&./%"6#5.+#9%6.3#,'%*-),&"*# .*#1%31'#@'34)/"/'6#)*#,'*/%,%'*)3#*"&.6"2)3#7#)*#2'#4'3%;2)#.&%2%?"6#42"*&"3#&6"*3(+*%,"3# con resistencia a ambos virus. En forma aná2'("#"#2"#)3&6"&)(%"#/)3,6%4&"#"*&)6%'61)*&)#)3# 4'3%;2)# /%3)S"6# ,'*3&6.,,%'*)3# %*,'64'6"*/'# /%3&%*&"3# 3),.)*,%"3# 9%6"2)3# 4)5.)S"3# 7# ,'*3)69"/"3#,'66)34'*/%)*&)3#"#2'3#/%3&%*&'3#9%6.3# contra los que se quiere obtener resistencia. Recientemente, ha surgido una variante al&)6*"&%9"# 4"6"# 2"# ';&)*,%>*# /)# 6)3%3&)*,%"# "# 9%6.3#1)/%"/"#4'6#JNLc#)2#.3'#/)#1%,6'JNL3# (miARNs). Los miARNs son ARNs endógenos 4)5.)S'3# 5.)# 6)(.2"*# 2"# )D46)3%>*# /)# ()*)3# )*# 42"*&"3# 7# "*%1"2)3A# C*# 42"*&"3:# )3&'3# 1%JNL3#/)#\]#*.,2+'&%/'3#3)#46',)3"*#"#4"6&%6#/)#6)(%'*)3#/)#astem loopse#/)#&6"*3,6%4&'3# 46%1"6%'3#2"6('3#5.)#2.)('#3)#",'42"*#"#,'142)*#/)2#46)O1%JNLA#C3&'#,'*/.*# /)2# 1%JNL# "6&%0,%"2# 7# )2# nivel de resistencia al virus obtenido. Asimis1'#2'3#".&'6)3#,'14"6"6'*#)3&"#)3&6"&)(%"#,'*# 2"#)3&6"&)(%"#,283%,"#/)#)D46)3%>*#/)#.*#a@"%64%*e#/)#/,JNL#/%6%(%/"#"#)3&"#1%31"#3),.)*cia y demostraron que la estrategia basada en )2# 1%JNL# "6&%0,%"2# -.)# 183# )-),&%9":# &"*&'# )*# 42"*&"3#&6"*3(+*%,"3#,'1'#)*#)*3"7'3#/)#)D46)3%>*#&6"*3%)*&)A# !"3#9)*&"()*'3A# C*# cambio, en el caso de los amiRNAs los blancos 4'&)*,%"2)3# 3'*# 1)*'6)3# 7# 4.)/)*# 3)6# )2)(%dos a priori# ,'*# 46),%3%>*A# G%*# )1;"6(':# )3&"# B2&%1"# ,"6",&)6=3&%,"# 4.)/)# "2# 1%31'# &%)14'# 3)6# .*"# /)39)*&"*#/)# riesgos en cuanto a la bioseguridad de estos oiq3:# )*# ,'*&6"4'3%,%>*# /)# 2"# 3';6)O)D46)-

3%>*# /)# ()*)3# 5.)# %*&)60)6"*# ,'*# )2# ,%,2'# /)# 1.2&%42%,",%>*#9%6"2#I,'1'#)3#)2#,"3'#/)#2"#,843%/)#.#'&6"3#46'&)=*"3#9%6"2)3QA#C3&'#3)#/);)#"# que la baja acumulación de ARN transgénico 1%*%1%?"# 2"3# 4'3%;%2%/"/)3# /)# .*"# 4'&)*,%"2# recombinación homóloga con ARN de origen viral infectante. Por otro lado, la ausencia de 2"#46'&)=*"#,'/%0,"/"#4'6#)2#&6"*3(+*#1%*%1%?"# drásticamente el análisis de riesgo alimentario /)2#oiq#7#)9%&"#)2#6%)3('#/)#&6"*3,"43%/",%>*# de otros virus en el caso en que el transgén ,'/%05.)#4"6"#2"#46'&)=*"#/)#,843%/)#9%6"2#-.*cional. Resistencia a virus conferida por genes no virales J/)183#/)#2"#6)3%3&)*,%"#/)6%9"/"#/)2#4"&>()*'#IUKNQ:#)*#2'3#B2&%1'3#"S'3#3)#@"*#)D42'6"/'#)3&6"&)(%"3#"2&)6*"&%9"3#4"6"#2'#';&)*,%>*# /)# 42"*&"3# &6"*3(+*%,"3# ,'*# 6)3%3&)*,%"# "# )*-)61)/"/)3#9%6"2)3A#C*&6)#)22"3:#2"3#183#46'1%3'6%"3# 3'*# 2"# )D46)3%>*# /)# "*&%,.)64'3# "*&%9%6"2)3#)*#42"*&"3#'#a42"*&%;'/%)3e#7#2"#)D46)3%>*# /)#46'&)=*"3#5.)#%*&)60)6)*#,'*#2"#&6"*31%3%>*# /)2#9%6.3#4'6#%*3),&'3#9),&'6)3A#J1;"3#)3&6"&)(%"3#3)#/%3,.&%68*#4'6#3)4"6"/'#183#"/)2"*&)A# o&6"3# "2&)6*"&%9"3# %*9'2.,6"*# 2"# )D46)3%>*# /)# ()*)3#/)#6)3%3&)*,%"#,'*&6"#9%6.3#)*#)34),%)3# diferentes de las cuales fueron aislados origi*"21)*&)A# U'6# )*#/)2#()*#Sw5#/)#&'1"&)#)*#42"*&"3#/)#&";",'#,'*0)6)#6)3%3&)*,%"#"#&'34'9%6.3A# o&6'# )*-'5.)# 46'1%3'6%'# )3# ()*)6"6# 6)3%3&)*cia mediante el silenciamiento de genes de la 42"*&"# )3)*,%"2)3# 4"6"# )2# ,%,2'# /)# 9%/"# 9%6"2A# C*#.*"#6),%)*&)#4.;2%,",%>*:#)2#3%2)*,%"1%)*&'# 4'6#JNL# %*&)6-)6)*&)# /)# 2'3# ()*)3# NtTOM1 y NtTOM3# I)3)*,%"2)3# 4"6"# 2"# 1.2&%42%,",%>*# /)# los tobamovirus) en Nicotiana tabaccum dio ,'1'#6)3.2&"/'#2"#%*@%;%,%>*#/)#2"#1.2&%42%,",%>*# del Tomato mosaic virus y otros tobamovirus, 4)6'# *'# "-),&># )2# ,6),%1%)*&'# /)# 2"3# 42"*&"3A# Otras estrategias incluyen el uso de la enzima \lOMlO# '2%('"/)*%2"3"# 3%*&)&"3"# /)# 1"1=-)6'3# )*#42"*&"3:#7#/)#%*@%;%/'6)3#*"&.6"2)3#7#)34),=0,'3#/)#2"#6)42%,",%>*#9%6"2#,'1'#2"#)D46)3%>*# /)#2"#46'&)=*"#%*",&%9"/'6"#/)#6%;'3'1"3#IUJUQ# de Phytolacca americana# Iapokeweed” en in-

452 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

(2+3QA#!"#)D46)3%>*#/)#UJU#)*#42"*&"3#/)#4"4"# 7#&";",'#&6"*3(+*%,"3#2"3#46'&)()#-6)*&)#"#.*"# variedad de virus, ya sea que éstos fueran ino,.2"/'3#1),8*%,"1)*&)#'#4'6#80/'3#9),&'6)3A# En los últimos años se encontraron o rediseS"6'*#9"6%'3#&%4'3#1)*'3#&>D%,'3#7#-'61"3#*'# &>D%,"3#/)#)3&"3#46'&)=*"3#2"3#5.):#)D46)3"/"3# )*# 42"*&"3# &6"*3(+*%,"3:# ,'*0)6)*# 6)3%3&)*,%"# "#9%6.3#3%*#46'/.,%6#)2#)-),&'#/)#2"#%*",&%9",%>*# de los ribosomas. Por otro lado, se estudió la ",&%9%/"/#"*&%9%6"2#/)#2"#46'&)=*"#FNFU#I46'&)=*"# RIP obtenida de bulbos de iris), una ARN-N-gli,'3%/"3":# )*# 42"*&"3# &6"*3(+*%,"3# /)# &";",':# ';3)698*/'3)# .*"# 6)/.,,%>*# 3%(*%0,"&%9"# /)# 2"3# 2)3%'*)3# 46'/.,%/"3# 4'6# )2# 9%6.3# Tqk# ,'*# 6)34),&'#"#2"3#42"*&"3#,'*&6'2A Expresión de anticuerpos en plantas transgénicas J#4)3"6#/)#5.)#2"3#42"*&"3#*'#3%*&)&%?"*#"*&%,.)64'3:#2"#)D46)3%>*#/)#"*&%,.)64'3#)*#42"*&"3# &6"*3(+*%,"3# )3# .*"# )3&6"&)(%"# 46'1)&)/'6"# 4"6"#';&)*)6#6)3%3&)*,%"#"#9%6.3A#!"#,'*3)69",%>*#/)#2"#)3&6.,&.6"#7#"0*%/"/#/)#2'3#1%31'3# @",%"#.*"#/)&)61%*"/"#46'&)=*"#9%6"2#3)6="#3.0,%)*&)#4"6"#%*&)66.14%6#-.*,%'*)3#)3)*,%"2)3#)# %14)/%6:#)*#,'*3),.)*,%":#2"#6)42%,",%>*#9%6"2A# Para que la estrategia sea efectiva es indis4)*3";2)# 2'(6"6# "2&'3# *%9)2)3# /)# )D46)3%>*# /)# 2'3# "*&%,.)64'3# )*# )2# ,'14"6&%1%)*&'# ,)2.2"6# /'*/)#',.66)#2"#6)42%,",%>*#9%6"2A#C*#2'3#B2&%1'3# "S'3#3)#@"*#/)3"66'22"/'#46'&','2'3#3)*,%22'3# 4"6"#2"#3)2),,%>*#/)#;.)*'3#"*&%,.)64'3:#5.)# %*,2.7)*#2"#3)2),,%>*#/)#"*&%,.)64'3#1'*',2'nales usando las tecnologías de hibridoma y genotecas utilizando la técnica de exhibición /)#)4%&'4)3#)*#;",&)6%>-"('3#'#aphage display”. En este sentido la obtención de bibliotecas de "*&%,.)64'3#/)#,"/)*"#B*%,"#I3,E9Q#3%*&+&%,'3:# @"*#%14.23"/'#2"#"42%,",%>*#/)#)3&"#)3&6"&)(%"A C*# ]WW^# 3)# /)1'3&6># 4'6# 46%1)6"# 9)?# 5.)# 2"# )D46)3%>*# ,'*3&%&.&%9"# /)# .*# "*&%,.)64'# /)# ,"/)*"#B*%,"#I3,E9Q#/%6%(%/'#,'*&6"#2"#46'&)=*"# /)# ,843%/)# /)2# Artichoke mottled crinkle virus ,".3";"#.*"#6)/.,,%>*#)*#2"#3.3,)4&%;%2%/"/#"2# 9%6.3:#5.)#3)#4'*="#/)#1"*%0)3&'#4'6#.*"#;"*#/)#2'3#3=*&'1"3A#C*#]WWY#3)#)D46)3>#.*#"*&%,.)64'#1'*',2'*"2#/)#,"/)*"#B*%,"# I3,E9Q# ,'*&6"# 2"# 46'&)=*"# /)# ,843%/)# /)2# Beet

necrotic yellow vein virus en Nicotiana benthamiana#7#)*#)2#\fff:#3)#1'3&6>#5.)#2"#)D46)3%>*# /)#2"#,"/)*"#E9#,'*&6"#2"#46'&)=*"#/)#,843%/)# /)2#9%6.3#Tqk#)*#2"#1)1;6"*"#42"318&%,"#/)# 42"*&"3#/)#&";",'#&6"*3(+*%,"3:#,'*-)6="#6)3%3tencia al virus. Otra variante de la misma estrategia consis&)#)*#)2#.3'#/)#3,E93#/%6%(%/'3#,'*&6"#46'&)=*"3# 5.)#*'#-'61"*#4"6&)#/)#2"#,843%/)#9%6"2#7#*:# ,'1'# 2"#6)42%,"3"#9%6"2A#_3"*/'#3,E93#';&)*%/'3#,'*&6"# 2"# NLJ# 4'2%1)6"3"# /)4)*/%)*&)# /)# JNL# IN/N4Q# /)2# Tomato bushy stunt virus# ITbGkQ:# 3)#';&.9%)6'*#42"*&"3#/)#N. benthamiana con altos niveles de resistencia no solo contra el TbGk:#3%*'#&"1;%+*#,'*&6"#'&6'3#1%)1;6'3#/)# la familia Tombusviridae como el Red clover necrotic mosaic virus, el Cucumber necrotic virus y el Turnip crincle virus. Recientemente 3)#/)1'3&6>#5.)#"2&'3#*%9)2)3#/)#)D46)3%>*#)*# 42"*&"3# /)# 4"4"# /)# .*# 3,E9# /%6%(%/'# ,'*&6"# 2"# 46'&)"3"#LF"#/)#Uky#/";"#46'&),,%>*#,'142)&"#,'*&6"#UkyA U'6#2'#&"*&':#2"#)D46)3%>*#/)#"*&%,.)64'3#/%6%(%/'3# ,'*&6"# 46'&)=*"3# 9%6"2)3# )3)*,%"2)3# @"# demostrado ser una alternativa interesante 4"6"#';&)*)6#6)3%3&)*,%"#"#9%6.3A 3D'%$&!;",1$,'%0#$)"+&,A7$,!"#$%*$%$", con la transmisión viral por parte de insectos vectores en plantas transgénicas La toxina BT de Bacillus thuringiensis ha 3%/'# 1.7# )-),&%9"# 4"6"# )2# ,'*&6'2# /)# %*3),&'3# ,'2)>4&)6'3# 7# 2)4%/>4&)6'3# 4)6'# @"3&"# )2# 1'1)*&':# *'# @"# 3%/'# )-),&%9"# 4"6"# ,'*&6'2"6# "# 2'3# %*3),&'3# 5.)# 3)# "2%1)*&"*# /)2# `')1"# 5.)# 4)6&)*),)*# "2# (6.4'# /)# 2'3# @)1=4&)6'3A# C3&)# (6.4'#/)#%*3),&'3:#)*&6)#2'3#5.)#3)#)*,.)*&6"*# 2'3# 3"2&"1'*&)3# Ialeafhoppers”) y las chicha66%&"3# Iaplanthoppers”), causan grandes daños de manera directa durante su alimentación y 46%*,%4"21)*&)# 4'65.)# 3'*# &6"*31%3'6)3# /)# 9%6.3A# G)# @"# /)1'3&6"/'# 5.)# 2"# )D46)3%>*# /)# 2),&%*"3#)*#42"*&"3#,'*0)6)#6)3%3&)*,%"#"#)3&)# &%4'#/)#%*3),&'3A#C*#4"6&%,.2"6:#2"#)D46)3%>*#/)# 2"# 2),&%*"# iLJ# )*# `')1"# /)# "66'?# )*# 42"*&"3# &6"*3(+*%,"3# 2)3# ,'*0)6)# 6)3%3&)*,%"# "# 2"# ,@%charrita Nilaparvata lugens que transmite entre otros a los virus Rice black streaked dwarf vi-

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 453

rus, Rice tungrovirus y Rice ragged stunt virus. Una estrategia similar se utilizó exitosamente 4"6"# ,'*&6'2"6# '&6'# &%4'# /)# %*3),&'3# ,'1'# 2'3# 80/'3c# 2"# )D46)3%>*# /)# ,%)6&"3# 2),&%*"3# /)# "*# /)2#&%)14'#/)#"2%1)*&",%>*#7#)*#)2#&"1"S'#/)# 2"3#4';2",%'*)3#/)2#80/'A _*"#&)6,)6"#)3&6"&)(%"#3)#;"3"#)*#2"#)D46)3%>*#/)#46'&)=*"3#/)#%*3),&'3#)*#)2#`')1"#/)# 42"*&"3# &6"*3(+*%,"3A# U'6# )*#)3&6),@"#,'*#2"#46'-

teína del insecto GroEL. Se ha demostrado que 42"*&"3# /)# &'1"&)# 5.)# )D46)3"*# 2"# 46'&)=*"# i6'C!#)*#)2#`')1"#3'*#6)3%3&)*&)3#"2#9%6.3A#G)# )34)6"#5.)#)3&"#)3&6"&)(%"#,';6)#1"7'6#%14'6&"*,%"#"#1)/%/"#5.)#3)#9"7"*#%/)*&%0,"*/'#2"3# -.*,%'*)3#/)#2"3#/%3&%*&"3#46'&)=*"3#/)#%*3),&'3# en su relación con la transmisión de virus. Plantas transgénicas con resistencia a virus cultivadas comercialmente, o en $#+'+&,+?+"6+1+&,1$,$D'$%!.$"#+(!;" En los últimos años se ha autorizado el cultivo comercial y consumo de una variedad de 42"*&"3# &6"*3(+*%,"3# ,'*# 6)3%3&)*,%"# "# 9%6.3# ;"3"/"#)*#"2(.*'#/)#2'3#1),"*%31'3#/)3,6%4tos (Tabla 2). CD%3&)# '&6'# (6.4'# 1.7# %14'6&"*&)# /)# 42"*tas transgénicas con resistencia a virus que 3)#)*,.)*&6"*#)*#)&"4"3#"9"*?"/"3#/)#)D4)6%1)*&",%>*# '# /)# 46.);"3# 4%2'&'# "# ,"14'A# C3# %*&)6)3"*&)# ,'*3&"&"6# 5.)# 2'3# 4"=3)3# )*# 9="3# /)# /)3"66'22'# @"*# "/'4&"/'# )3&"# &),*'2'(="# 7# &6";"*#)*#2";'6"&'6%'#I)Q:#46.);"3#4%2'&'#"#,"14'#I,Q#'#,'1)6,%"2%?",%>*#I,'Q#)*#4"=3)3#)*#9="3#/)#/)3"66'22'#I-.)*&)c#EJoA b%'AK),#rrrA-"'A'6(R;%'&),@R%*9)*&'67‡"/1%*R/)4R/)-".2&A"34QA Cultivo Ají

Virus CMV y TMV CVbMV

País China (c) Tailandia (e)

Ají pimiento

PVY CMV y TMV

Indonesia (e) Korea (e)

Algodón

CLCV CYDV Vigna mungo virus Tungro virus

Pakistán (e) China (e) India (e) Malasia (e)

Arroz

RRSV RDV RTV

Tailandia (e) China (c) China (c), Malasia e Indonesia (e)

Arveja

BGMV

Banana

BTV

Filipinas (c) y Egipto (e)

Batata Caña de azúcar Chaucha

SPFMV

Kenia (c), India y Filipinas (e)

SCMV y Yellow virus SCMV

Brasil (c) Egipto (c)

ABMV

Taila ndia (e)

AMV Cítricos

Garbanzo Maíz

Brazil (c)

Ucrania (e)

FBNYV

Egipto (e)

Trist eza virus

India y Cuba (e)

CPsV

Argentina (e)

CVpD

Indonesia (e)

CABMV

Zimbaw e (c)

VMYMV

India (e)

MSV

Sudáfrica (e)

MRCV

Argentina (e)

Maní

PStV

Indonesia (e)

IPCV

India (e)

Melón

CMV ZYMV

México y China (c) Egipto (c)

Nuez mocada

Stri pped virus

Papa

PVY PLRV PVY, PLRV PVX, PVY

Papaya

PMV PRSV RV RSV PRV

Pepino

ZYMV CMV -CGMMV

Pimienta Pimienta picante Pimienta dulce

CMV CVBMV , pepLCV CMV y TMV CMV

China (c) Argentina , Tunez y Vietnam (e) y China (c) Argentina (c) , Vietnam, Filipinas y Cuba (e) Brasil y Egipto(c) , Chile , India y Colombia (e) Perú, Sudáfrica e Indonesia (e) y México (c) Bangladesh e Indonesia (e) Malasia, Vietman, India, Indonesia y Malasia (e) China, Brasil y México (c) Filipinas (e) Cuba (c) Tailandia (e) Egipto (c) india (e) Malasia (e) Tailandia (e) República de Corea (c) China (c)

Virus R

China (co)

BGMV

Brasil (c)

Repollo

TuMV

China (c)

Ta baco

TSWV y PVY PVY TMV BYDV YMV

Poroto

Trigo

WYDRV Tomate

Geminivirus y Tospovirus Gemi nivirus CMV TYLCV

Uva

GLRaV, GFLV, GVA, GVB

ToLCV Zapallo

PMV, PAMV y SMV2 ZYMN

Zuchini

PMV, PAMV, SMV2 y ZAMV

Brasil (c) India (e), Republica de Corea (e) Indonesia y Rep. de Corea (e), China y México (c) China (e) China (e) China (e) Brasil (c) Cuba (e) Indonesia (e), México (c) y China (co) Tailandia, China y Egipto (e) India e Indonesia (e) Tunez (e) México (c) Egipto (c) México (c)

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 455

Lecturas Recomendadas -Abel, P. P., Nelson, R. S., De, B., Hoffmann, N., N'()63:#GA#iA:#E6"2)7:#NA#TA#ˆ#b)",@7:#NA#LA#I]WXYQA# K)2"7# '-# /%3)"3)# /)9)2'41)*&# %*# &6"*3()*%,# 42"*&3#&@"&#)D46)33#&@)#&';",,'#1'3"%,#9%6.3#,'"&# 46'&)%*#()*)A#G,%)*,)#\^\:#[^XO[Z^A -Akad, F., Eybishtz, A., Edelbaum, D., Gorovits, R., Dar-Issa, O., Iraki, N. & Czosnek, H. (2007). q"h%*(#"#-6%)*/#-6'1#"#-')c#)D46)33%*(#"#i6'C!# ()*)# -6'1# &@)# r@%&)`7# b)1%3%"# &";",%# %*# &@)# 4@2')1# '-# &'1"&'# 42"*&3# ,'*-)63# 6)3%3&"*,)# &'# &'1"&'# 7)22'r# 2)"-# ,.62# 9%6.3A#J6,@# k%6'2# ]M\:# 1323-1339. Ob".2,'1;):#KA#$A#I]WWYQA#q),@"*%313#'-#U"&@'()*O K)6%9)/# N)3%3&"*,)# &'# k%6.3)3# %*# T6"*3()*%,# U2"*&3A#T@)#U2"*&#,)22#X:#]X^^O]XZZA Ob''*6'/:#tA:#i"2)&?h":#KA:#L"(7:#UA#KA:#$'*6"/:#_A#ˆ# t6,?"2:#iA#I\ffZQA#G%*(2)O,@"%*#"*&%;'/%)3#"("%*3&# "# 42"*&# 9%6"2# NLJO/)4)*/)*&# NLJ# 4'271)6"3)# confer virus resistance. Nature biotechnology 22, XMYOXY\A Ob.,@)6:#CA:#!'@.%3:#KA:#9"*#U'44)2:#UA#qA:#i))6&3O K%1%&6%"/'.:#$A:#i'2/;",@:#NA#ˆ#U6%*3:#qA#I\ffYQA# q.2&%42)# 9%6.3# 6)3%3&"*,)# "&# "# @%(@# -6)5.)*,7# using a single transgene construct. The Journal '-#()*)6"2#9%6'2'(7#X[:#^YW[O^[f]A O$"*&':# TA# ˆ# U"2.h"%&%3:# UA# I]WWWQA# N)42%,"3)O mediated resistance to cucumber mosaic virus /')3# *'&# %*@%;%&# 2',"2%?"&%'*# "*/R'6# &6"-0,h%*(# '-# &@)# 9%6"2# 1'9)1)*&# 46'&)%*A# q'2# U2"*&# q%,6';)# Interactions 12, 743-747. OK%*(:#GA#wA#ˆ#k'%**)&:#oA#I\ff[QA#J*&%9%6"2#%11.*%&7# /%6),&)/#;7#31"22#NLJ3A#$)22#]^f:#Z]^OZ\YA -Fraley, R. T., Rogers, S. G., Horsch, R. B., Sanders, P. R., Flick, J. S., Adams, S. P., Bittner, M. L., b6"*/:# !A#JA:#E%*h:# $A#!A:#E67:#sA#GA:#i"22.44%:# iA# R., Goldberg, S. B., Hoffmann, N. L. & Woo, S. $A#I]WX^QA#CD46)33%'*#'-#;",&)6%"2#()*)3#%*#42"*&# ,)223A#U6',#L"&2#J,"/#G,%#_#G#J#Xf:#ZXf^OZXf[A -Golemboski, D. B., Lomonossoff, G. P. & Zaitlin, M. (1990). Plants transformed with a tobacco mosaic virus nonstructural gene sequence are resistant &'#&@)#9%6.3A#U6',#L"&2#J,"/#G,%#_#G#J#X[:#Y^]]O Y^]MA -Lindbo, J. A. & Dougherty, W. G. (1992). _*&6"*32"&";2)# &6"*3,6%4&3# '-# &@)# &';",,'# )&,@# 9%6.3# ,'"&# 46'&)%*# ()*)# 3)5.)*,)# ,"*# %*&)6-)6)# r%&@# &';",,'# )&,@# 9%6.3# 6)42%,"&%'*# %*# &6"*3()*%,# 42"*&3#"*/#46'&'42"3&3A#k%6'2'(7#]XW:#[\MO[^^A -Lindbo, J. A., Silva-Rosales, L., Proebsting, W. M. & Dougherty, W. G. (1993). Induction of a Highly G4),%0,# J*&%9%6"2# G&"&)# %*# T6"*3()*%,# U2"*&3c# F142%,"&%'*3# -'6# N)(.2"&%'*# '-# i)*)# CD46)33%'*# "*/# k%6.3# N)3%3&"*,)A# T@)# U2"*&# ,)22# M:# ][ZWO ][MWA

OL%.:# }A# wA:# !%*:# GA# GA:# N)7)3:# sA# !A:# $@)*:# tA# $A:# w.:# HA# wA:# y)@:# GA# KA# ˆ# $@.":# LA# HA# I\ffYQA# CD46)33%'*# '-# "6&%0,%"2# 1%,6'NLJ3# %*# &6"*3()*%,# J6";%/'43%3# &@"2%"*"# ,'*-)63# 9%6.3# 6)3%3&"*,)A# L"&.6)#;%'&),@*'2'(7#\Z:#]Z\fO]Z\XA -Palauqui, J. C., Elmayan, T., Pollien, J. M. & k".,@)6)&:# HA# I]WW[QA# G73&)1%,# ",5.%6)/# 3%2)*,%*(c# &6"*3()*)O34),%0,# 4'3&O&6"*3,6%4&%'*"2# silencing is transmitted by grafting from silenced stocks to non-silenced scions. The EMBO journal ]Y:#Z[^XOZ[ZMA OU)("/"6"()*'3# I;",&)6%"3:# @'*('3# 7#9%6.3Q:#,"/"#.*"#/)#)22"3#4'3))#,%)6&'#(6"/'# /)#3.3,)4&%;%2%/"/#"#"2(.*'#/)#+3&'3#0&'4"&>()*'3A#C2#,'*',%1%)*&'#/)#2"#%*&)6",,%>*#4"&>()*'O@'34)/"/'6:#2"3#@)66"1%)*&"3#.&%2%?"/"3#4'6# .*'3#4"6"#"&","6#7#2'3#1),"*%31'3#/)#/)-)*3"# 4"6"# )9%&"6# 2"3# ,'*3),.)*,%"3# /)# )3&)# "&"5.)# 4'6#2'3#'&6'3:#3'*#&)1"#/)#)3&./%'#/)#/%9)63'3# (6.4'3#/)#%*9)3&%(",%>*#"26)/)/'6#/)2#1.*/'A# Conocer los factores de virulencia utilizados 4'6#2"3#;",&)6%"3#0&'4"&>()*"3#7#3.#1),"*%31'# /)#",,%>*:#)3#%14'6&"*&)#4"6"#)2#/)3"66'22'#/)# 42"*&"3# 6)3%3&)*&)3# "# )*-)61)/"/)3A# U'6# '&6'# 2"/':# 46'-.*/%?"6# 2'3# ,'*',%1%)*&'3# 3';6)# 2'3# 1),"*%31'3# /)# /)-)*3"# 9)()&"2:# 4)61%&)# 42"near estrategias en el diseño de cultivos mejor "/"4&"/'3# "2# 1)/%':# 7"# 3)"# %*,6)1)*&"*/'# 2"# resistencia innata o a través de la introducción de genes de resistencia heterólogos. C3&)#,"4=&.2'#)3#.*"#;6)9)#6)3)S"#3';6)#2"3# 46%*,%4"2)3#;",&)6%"3#6)34'*3";2)3#/)#)*-)61)/"/#)*#42"*&"3:#3.3#@)66"1%)*&"3#'#-",&'6)3#/)# virulencia, su regulación, y otras estrategias im4'6&"*&)3#5.)#.&%2%?"*#/.6"*&)#)2#46',)3'#%*-),tivo. Las distintas estrategias biotecnológicas 4"6"# 2"# 46'/.,,%>*# /)# 42"*&"3# 6)3%3&)*&)3:# 7"# sea aquellas que ya se encuentran en el cam4':#,'1'#'&6"3#)*#/)3"66'22'#'#/)#4'&)*,%"2#.&%2%?",%>*:#&"1;%+*#3'*#46)3)*&"/"3#)*#)2#,"4=&.2'A# Tipos de interacción planta-bacteria !"3#42"*&"3:#,'1'#&'/'3#2'3#'6("*%31'3#9%vientes, interactúan con el medio ambiente y en él con otros organismos, entre ellos se encuentran las bacterias. Ambos organismos, ;",&)6%"3#7#42"*&"3:#%*&)6,"1;%"*#3)S"2)3:#)3&";2),%)*/'#.*"#)34),%)#/)#/%82'('A#!"3#,+2.las vegetales emiten secreciones conteniendo

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n#)3&'#',.66)#3>2'#3%#2"3#,'*/%,%'*)3#"1;%)*&"2)3# 3'*# -"9'6";2)3:# 3%# 2"3# /)-)*3"3# 46)-'61"/"3# /)# 2"# 42"*&"# 3'*# %*"/),."/"3:# 3%# 2"# 42"*&"#-"22"#)*#/)&),&"6#"2#4"&>()*':#)#%*,2.3'# 3%#2"3#6)34.)3&"3#/)#/)-)*3"#",&%9"/"3#3'*#%*)0,%)*&)3A#C*#.*"#%*&)6",,%>*#%*,'14"&%;2)#2"3# 42"*&"3# 6)3%3&)*# "2# "&"5.)# /)2# 4"&>()*'A# C3&"# 6)3%3&)*,%"#4.)/)#3)6#%*)34),=0,":#"#&6"9+3#/)# 2"# /)*'1%*"/"# 6)3%3&)*,%"# *'# @'34)/"/'6":# ;"3"2# '# %**"&":# )*# 2"# ,."2# )2# 4"&>()*'# *'# )*,.)*&6"#,'*/%,%'*)3#-"9'6";2)3#4"6"#%*-),&"6:#'# ;%)*#4'65.)#2"#42"*&"#46)3)*&"#;"66)6"3#)3&6.,&.6"2)3#"/),."/"3#'#3%*&)&%?"#,'14.)3&'3#&>D%,'3#5.)#%14%/)*#2"#46'2%-)6",%>*#7#,'2'*%?",%>*# /)#2"#;",&)6%"A#!"#6)2",%>*#%*,'14"&%;2):#7#4'6# 2'# &"*&'# 2"# 6)3%3&)*,%":# 4.)/)# 3)6# /);%/"# &"1;%+*# "# .*# 6),'*',%1%)*&'# )34),=0,'A# C*# )3&)# ,"3'# )D%3&)# .*"# ;"3)# ()*+&%,"# /)0*%/"A# G)# &6"&"# /)# 2"# 46)3)*,%"# /)# ()*)3# /)# 6)3%3&)*,%"# /'1%*"*&)3#)*#)2#@'34)/"/'6#5.)#2)#4)61%&)*# 6),'*',)6#()*)3#/)#"9%6.2)*,%"#/)2#4"&>()*'A# C*#2'3#"S'3#Zf#/)2#3%(2'#4"3"/':#H"6'2/#HA#E2'6# 46'4.3'#)2#1'/)2'#agen a gen” (ver Figura 1). Dicho modelo establece que la resistencia se 46'/.,)# ,."*/'# 2"# 42"*&"# )D46)3"# .*# ()*# /)# resistencia dominante (R, 46'&)=*"#NQ#7#)2#4"tógeno un gen de avirulencia dominante com42)1)*&"6%'#IAvr, 46'&)=*"#J96QA#C3&"#6)34.)3ta defensiva está frecuentemente asociada a .*"# N)34.)3&"# H%4)63)*3%;2)# IHNn# /)2# %*(2+3# Hypersensitive Response), que se caracteriza 4'6# .*"# *),6'3%3# 684%/"# 7# 2',"2%?"/"# )*# 6)34.)3&"#"2#"&"5.)#/)2#4"&>()*'A#C3#/),%6:#-6)*&)# "# 2"# %*9"3%>*# /)# &)*# HN# ',.66)# "46'D%1"/"1)*&)#\Z#@'6"3#/)34.+3#/)#5.)#2"#42"*&"# 4)6,%;)#.*#4"&>()*'#4'&)*,%"2A#G)#&6"&"#/)#.*# fenómeno conocido desde hace varios dece-

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 457

Figura 1. Modelo gen por gen. !"#0(.6"#1.)3&6"# las combinaciones de genes involucradas en distintas interacciones de resistencia/enfermedad entre .*#4"&>()*'#7#3.#@'34)/"/'6A#C*#2'3#"S'3#Zf#/)2# 3%(2'# 4"3"/':# H"6'2/# HA# E2'6# 46'4.3'# )3&)# 1'/)2'# 5.)#)3&";2),)#5.)#2"#6)3%3&)*,%"#3)#46'/.,)#,."*/'# 2"#42"*&"#)D46)3"#.*#()*#/)#6)3%3&)*,%"#/'1%*"*&)# (RQ#7#)2#4"&>()*'#.*#()*#/)#"9%6.2)*,%"#/'1%*"*&)# ,'142)1)*&"6%'#IAvrQA#C3&)#1'/)2'#)D42%,"#2'3#,"3'3# /)# ,'14"&%;%2%/"/# /)# %*,'14"&%;%2%/"/# 42"*&"O 4"&>()*'

*%'3:# 5.)# ,'14"6&)# ,"6",&)6=3&%,"3# ()*)6"2)3# ,'*#2"#"4'4&'3%3#'#1.)6&)#,)2.2"6#46'(6"1"/"A# C2#';*# /)2# 1%,6''6("*%31'#4"&'(+*%,'A !.)('#/)#.*"#HN:#2"#42"*&"#"/5.%)6)#6)3%3&)*,%"#)*#&)(%,'# 7#

"34),&'3#()*+&%,'O1'2),.2"6)3#3'*#Agrobacterium, Erwinia, Pseudomonas y Xanthomonas. C3&'3# '6("*%31'3# 4.)/)*# 3)6# ,.2&%9"/'3# )*# )2# 2";'6"&'6%':# 7# 4.)/)*# %*',.2"63)# -8,%21)*&)# )*# 42"*&"3# 4"6"# 6)"2%?"6# )3&./%'3# /)# 0&'4"&'genicidad. Por otro lado, las bacterias Gram4'3%&%9"3:#,'1'#Clavibacter, Curtobacterium y Rhodococcus, son más difíciles de manejar en condiciones controladas. Erwinia chrysanthemi, E. carotovora, E. amylovora 7# '&6"3# ]M# )34),%)3:# 3'*# 2"3# ,".3"*&)3# /)# 4./6%,%'*)3# ;2"*/"3# /);%/'# "# 3.# ,"4",%/"/# 4"6"# 46'/.,%6# (6"*/)3# ,"*&%/"/)3# /)# )*?%1"3# 4),&'2=&%,"3:# ,"4",)3# /)# 1",)6"6# &)*#42"*&"O4"&>()*'#1.7#)3&./%"/'A## o&6'3# (+*)6'3# /)# ;",&)6%"3# 0&'4"&>()*"3# son Agrobacterium, Rhodococcus, Spiroplasma, Xylella y Streptomyces. Xylella fastidiosa, es la causante de la clorosis variegada de los ,=&6%,'3:#7#-.)#2"#46%1)6"#;",&)6%"#0&'4"&>()*"# cuyo genoma fue secuenciado totalmente. Las bacterias del género Streptomyces son 46',"6%'*&)3# 02"1)*&'3'3# i6"1O4'3%&%9'3# 5.)# 46'/.,)*# )34'6"3# ,'1'# 46%*,%4"2# 1),"*%31'# /)#/%34)63%>*A#G>2'#.*"3#4',"3#)34),%)3#)*&6)#

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2"3# Zff# /)3,6%4&"3# 3'*# 4"&>()*"3# /)# 42"*&"3A# !"3# )34),%)3# /)# Streptomyces# 0&'4"&>()*"3# causan enfermedades a nivel de órganos y )3&6.,&.6"3#3.;&)668*)"3#/)#/%9)63"3#)34),%)3# 9)()&"2)3A#U'6#)(%,'3# 7# /)# %14",&'# "1biental o ecológico. En la actualidad, existen herramientas genéticas y moleculares que se 3.1"*#"#2"#&6"/%,%'*"2#,"6",&)6%?",%>*#-)*'&=4%ca de las diferentes bacterias. Entre ellas, se encuentran la secuenciación de ADN, la hibridación ADN-ADN, el análisis de isoenzimas y los marcadores moleculares. Factores de virulencia bacterianos !"3# ;",&)6%"3# 0&'4"&>()*"3# @"*# /)3"66'22"/'#.*"#3)6%)#/)#,'14.)3&'3#5.)#,'*&6%;.7)*#"# 2'3#0*)3#/)#%*9"/%6#7#,'2'*%?"6#2'3#6)34),&%9'3# @'34)/"/'6)3A# C3&'3# ,'14.)3&'3# '# -",&'6)3# /)#9%6.2)*,%":#/)&)61%*"*#2"#4"&'()*%,%/"/#7#)2# (6"/'#/)#9%6.2)*,%"#/)2#4"&>()*'A#K)4)*/%)*/'# /)#2"#%*&)6",,%>*#42"*&"O;",&)6%":#2"3#;",&)6%"3# 46'/.,)*# -",&'6)3:# "2(.*'3# /)# 2'3# ,."2)3# 3'*# ,'1.*)3#7#'&6'3#)34),=0,'3#4"6"#,"/"#%*&)6",,%>*#4"&>()*'O@'34)/"/'6A# q.,@'3#/)#)3&'3#-",&'6)3#3'*#46'&)=*"3#5.)# %*7),&"*#/%6),&"1)*&)#)*#2"#,+2.2"#@'34)/"/'6"#I46'&)=*"3#)-),&'6"3Q#"#&6"9+3#/)2#3%3&)1"#/)# 3),6),%>*# &%4'# FFF# IGGTOFFFQ:# .*# 3%3&)1"# ,'1B*# )*&6)# 2"3# ;",&)6%"3# 4"&>()*"3# &"*&'# /)# 42"*tas como animales, y que se induce cuando la ;",&)6%"#&'1"#,'*&",&'#,'*#)2#@'34)/"/'6A#!"1)*&";2)1)*&)#4"6"#)2#"()*&)#4"&>()*':#)3&"3# 46'&)=*"3#3'*#1'2+,.2"3#%/)"2)3#4"6"#3)6#6),'*',%/"3#4'6#)2#3%3&)1"#/)#/)-)*3"#/)#2"#42"*&"# (modelo gen a genQc#"#&6"9+3#/)#2"3#46'&)=*"3# /)#6)3%3&)*,%"#I46'&)=*"#NQ#2"#42"*&"#4.)/)#j6),'*',)6j# 2"# 46)3)*,%"# /)# /)&)61%*"/"# 46'&)=*"#)-),&'6"#I46'&)=*"#J96Q:#/)3)*,"/)*"*/'#2"# 6)34.)3&"#@%4)63)*3%;2)#IHNQA Algunos de los factores de virulencia han 3%/'#,"6",&)6%?"/'3#6),%)*&)1)*&)#,'1'#3.46)3'6)3#/)#2"#6)34.)3&"#/)#/)-)*3"#9)()&"2#7#2)# 4)61%&)*#"#2"#;",&)6%"#46'1'9)6#3.#,6),%1%)*&'# 7# /%-.3%>*# /)*&6'# /)2# &)()*'#4'6#4"6&)#/)2#@'34)/"/'6:#1)/%"*&)# distintos mecanismos, entre ellos: inhibición de 2"#)D46)3%>*#/)2#()*#avr, bloqueo de la secre,%>*# /)# 2"# 46'&)=*"# J96:# %*&)6-)6)*,%"# )*&6)# )2# J96#7#2"#46'&)=*"#N:#'#3.46)3%>*#)*#)2#,"1%*'# /)#3)S"2%?",%>*#/)#2"#6)34.)3&"#/)#/)-)*3"#6='# abajo al reconocimiento del Avr. !"3#,)4"3#9%6.2)*&"3#/)#Pseudomonas syringae#46'/.,)*#/%9)63"3#&'D%*"3#,'1'c#,'6'*"tina, faseolotoxina, tagetitoxina, tabtoxina, siringomicina, siringotoxina, etc. La toxina coro*"&%*":# 46'1.)9)# 2"# 9%6.2)*,%"# /)# P. syringae actuando como un análogo del jasmonato y 4'3))# 2"# ,"4",%/"/# /)# %*/.,%6# 3.3,)4&%;%2%/"/# en Arabidopsis thaliana. Diversas enzimas extracelulares son im4'6&"*&)3# -",&'6)3# /)# 9%6.2)*,%":# 7"# 5.)# )*# 3.#".3)*,%":#2"#9%6.2)*,%"#/)2#4"&>()*'#/%31%nuye considerablemente. La secreción de un "142%'# 6"*('# /)# )*?%1"3# ,"4",)3# /)# /)(6"/"6#,'14'*)*&)3#/)#2"#4"6)/#,)2.2"6#/)#42"*&"3#9"3,.2"6)3#7#'&6'3#,'14'*)*&)3#,)2.2"6)3:#

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 459

&%)*)*# .*# 4"4)2# %14'6&"*&)# )*# )*-)61)/"/)3# ;",&)6%"*"3# ,'1'# 2"3# 4'/6)/.1;6)3# ;2"*/"3# y también en bacterias que causan necrosis o 1"6,@%&"1%)*&'#9"3,.2"6A#C*&6)#+3&"3#4'/)1'3# 1)*,%'*"6# )*?%1"3# 4),&'2=&%,"3:# ,)2.2"3"3:# 46'&)"3"3:# (2%,"*"3"3:# 4'2%("2",&.6'*"3"3# 7# )3&)6"3"3A#!"#4'3)3%>*#/)#/%,@"3#)*?%1"3#("6"*&%?"#.*"#4.)6&"#/)#)*&6"/"#"#2"#42"*&"#'#.*"# 9)?#"/)*&6':#2"#46'9%3%>*#/)#*.&6%)*&)3#4"6"#3.# 1.2&%42%,",%>*A !"3# ;",&)6%"3# 46'/.,)*# .*"# )*'61)# 9"6%)/"/#/)#4'2%3",86%/'3#,'*3&%&.%/'3#4'6#/%9)63'3# "?B,"6)3A#!'3#)D'4'2%3",86%/'3#ICUGQ#4.)/)*# estar asociados a la membrana externa for1"*/'# ,"43.2"3# '# 3)6# 2%;)6"/'3# )*# )2# 1)/%'# extracelular. Estos EPS han sido involucrados )*# 4"&'()*%,%/"/# ,'**#,'*#)2#@'34)/"/'6:#-",%2%&"6="*#2"#/%3)1%*",%>*#/)2#4"&>()*'#1)/%"*&)#1),"*%31'3# que en algunos casos ya se han dilucidado. El D"*&"*':#5.)#)3#)2#4'2%3",86%/'#183#%14'6&"*&)# 46'/.,%/'# 4'6# &'/"3# 2"3# p"*&@'1'*"3:# ",&B"# 3.46%1%)*/'# 2"# /)-)*3"# 2',"2# 3%)*/'# )3&"# ",&%9%/"/# /)4)*/%)*&)# /)# )3&6.,&.6"# /)2# 1%31'A# C2#D"*&"*'#3.46%1)#)2#)*(6'3"1%)*&'#/)#2"#4"6)/#,)2.2"6#/)#2"#,+2.2"#9)()&"2#%*/.,%/'#4'6#)2# "&"5.)# /)2# 4"&>()*'# I/)4'3%,%>*# /)# ,"2'3"Q:# 1)/%"*&)#)2#3),.)3&6'#/)#%'*)3#,"2,%'#)#%*&)60riendo con el camino de señalización que lleva a la activación de la calosa sintetasa. En el caso de Agrobacterium:# .*# 4"&>()*'# 5.)#/)3"66'22"#&.1'6)3#)*#2"#42"*&"#@'34)/"/'6":#2"3#@'61'*"3#9)()&"2)3#3'*#%14'6&"*&)3# factores de virulencia que el microorganismo 46'/.,)c# ".D%*"3# 7# ,%&'5.%*%*"3A# !"# ".D%*"# 46%*,%4"2#46'/.,%/"#)3#)2#8,%/'#%*/'2",+&%,'#5.)# 1'/.2"#)2#&%)14'#/)#%*,.;",%>*#/)#2"#)*-)61)/"/A#!"3#,%&'5.%*%*"3#5.)#3)#46'/.,)*#3'*#9"rias (derivados de la zeatina) y determinan el tamaño del tumor. K%2+"!6+(!;",$",(0.7"!1+1$&,LI!0*-.F9, una estrategia bacteriana durante la interacción con la planta hospedadora Las bacterias no viven aisladas sino que forman una comunidad estructurada, coordinada

y funcional que se denomina comúnmente bio4)2=,.2"#'#;%'021A G)# @"# 4'/%/'# ';3)69"6# .*"# 6)2",%>*# /%6),&"# )*#2"#,"4",%/"/#/)#46'/.,%6#;%'0213#7#2"#9%6.2)*,%"#/)#)3&"3#;",&)6%"3A#!'3#;%'0213#3'*#)3&6.,&.6"3#%14'6&"*&)3#)*#)2#/)3"66'22'#;",&)6%"*'#7#4'/6="*#3)6#.*#;2"*,'#1.7#"46'4%"/'#4"6"# ,'*&6"66)3&"6#2"3#)*-)61)/"/)3#46'/.,%/"3#4'6# +3&"3#)*#2'3#6)34),&%9'3#@'34)/"/'6)3A C*&6)# 2"3# 9)*&"*#)*&6)#)34),%)3#I1%,6','*3'6,%'n# 3%*&6'031'Q:# 7# "/5.%3%,%>*# /)# *.)vas características genéticas !"# -'61",%>*# /)# ;%'0213# 6)5.%)6)# /)# 2"# ,"4",%/"/# /)# 2"3# ;",&)6%"3# /)# .*%63)# "# /%3&%*&"3# 3.4)60,%)3:#)*#4"6&%,.2"6#)2#&)*#)*&6)#;",&)6%"3#7#42"*&"3A#C2# sistema de regulación de la formación de bio021:#"2#%(."2#5.)#"2(.*'3#-",&'6)3#/)#9%6.2)*,%":# )*# 4"6&%,.2"6# 2"3# )*?%1"3# )D&6",)2.2"6)3# 7# 2'3# CUG:#3'*#/)4)*/%)*&)3#/)2#*B1)6'#/)#;",&)6%"3#46)3)*&)3:#'#/)2#1),"*%31'#,'1B*1)*&)# denominado quórum sensing. El fenómeno de quorum sensing fue recono,%/'#)*#2"#/),"/"#/)#2'3#Yf#)*#)3&./%'3#6)"2%zados con la bacteria J%6(%')>3/42(%. Esta bac&)6%"#1"6%*"#;%'2.1%*%3,)*&):#46'/.,)#2.?#3>2'#

460 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

cuando hay una gran cantidad de bacterias 46)3)*&)3A# G)# ';3)69># 5.)# 2"# 2.1%*%3,)*,%"# 3)# 46'/.,="# 4'6# ",.1.2",%>*# /)# .*# ",&%9"/'6# '# 1'2),.2"# a".&'%*/.,&'6"eA# C3&"# 1'2+,.2"# )3# 46'/.,%/"#4'6#2"#;",&)6%"#7#",&%9"#2"#2.1%*%3,)*cia cuando alcanza una determinada concen&6",%>*# ,6=&%,"A# !"3# ;",&)6%"3# 3'*# ,"4",)3# /)# ,)*3"6# 3.# /)*3%/"/# /)# 4';2",%>*# "# &6"9+3# /)# la detección de esta molécula autoinductora. Al mecanismo del censado de la densidad celular se lo llamó quorum sensing y la molécula ac&%9"/'6"# 46'/.,%/"# 4'6# JK) >3/42(% fue aislada )*#)2#"S'#]WX]:#3%)*/'#%/)*&%0,"/"#,'1'#.*"# N-(3-oxohexanoyl)-homoserin lactona. C2# 5.'6.1# 3)*3%*(# )3# .*# 46',)3'# 6)2"&%9"1)*&)# 3%142)A# !"3# ",%2O@'1'3)6%*# 2",&'*"3# IHG!Q# 3'*# 3%*&)&%?"/"3# "# .*# *%9)2# ;"3"2# 4'6# las acil-HSL sintasas (generalemente homólo("3#"#2"3#46'&)=*"3#&%4'#!.DF#/)#JK)>342(%). Las 1'2+,.2"3# /)# ",%2OHG!3# 3%*&)&%?"/"3# 3'*# 684%/"1)*&)#2%;)6"/"3#4'6#2"3#,+2.2"3#;",&)6%"*"3# 4'6#/%-.3%>*A#C2#%*,6)1)*&'#)*#)2#&"1"S'#/)#2"# 4';2",%>*#;",&)6%"*"#)2)9"#2"#,'*,)*&6",%>*#/)# las acil-HSLs. A niveles elevados de concentración, las acil-HSLs interactúan con un factor /)#&6"*3,6%4,%>*#I@'1>2'('#"#2"#46'&)=*"#!.DN# de JK) >342(%Q# 5.)# 1'/.2"# 2"# )D46)3%>*# /)# 2'3# ()*)3#6)(.2"/'3#4'6#5.'6.1#3)*3%*(A Como se muestra en la Figura 2, en la regulación de factores de virulencia a través de

5.'6.1#3)*3%*(:#2"3#46'&)=*"3#F#7#N#*# /%-)6)*,%"2# /)# 3.3# ()*)3:# R. solanacearum# .&%2%?"# )3&"# ,'142)*#/)#3)S"2)3#)*#5.>6.1#3)*3%*(:#}GA# !'3#1%,6''6("*%31'3#,)*3"*#3.3#4';2",%'*)3#"#&6"9+3#/)#.*#3'03&%,"/'#1),"*%31'#/)#,'1.*%,",%>*#,)2.2"6A#$."*/'#2"#/)*3%/"/#,)2.2"6#"2,"*?"#.*#/)&)61%*"/'#.1;6"2#3)#/%34"6"#2"#)D46)3%>*#/)#/)&)61%*"/'3# ()*)3A#C3&)#&%4'#/)#6)(.2",%>*#5.)#,'*&6'2"#/%9)63"3#-.*,%'*)3#;%'2>(%,"3:#)*&6)#)22"3#2"3#/)#9%6.2)*,%":#)3# conocido como autoinducción o quorum sensing. Las moleculas señallizadoras esenciales de este sistema son la acil-homoserin lactonas (acil-HSL).

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 461

9"# )2# /'1%*%'# /)# .*%>*# "#JKL# 46)3)*&)# )*# 2"# 6)(%>*#$O&)61%*"2#/)#)3&"#46'&)=*":#,'*9%6&%+*/'2"#)*#.*#",&%9"/'6#&6"*3,6%4,%'*"2#/)#2'3#()nes blancos. En R. solanacearum la densidad celular es censada mediante el éster metílico /)2#8,%/'#^O@%/6'D%#4"21=&%,'#I^OoHAUJqCQA#_*# *%9)2#)2)9"/'#/)#^OoHAUJqC#%*/.,)#2"#46'/.,ción de EPS I y de algunas exoenzimas. Estos -",&'6)3#/)#9%6.2)*,%"#46'1.)9)*#)2#"&"5.)#/)# la bacteria. En Xanthomonas camprestris 49 campestris (XccQ:# .*# 4"&>()*'# 5.)# "-),&"# ,6.,=-)6"3:# 2"# 46'/.,,%>*#/)#2"3#)*?%1"3#)D&6",)2.2"6)3#7#/)# CUG# )3&8# 6)(.2"/"# 4'6# )2# (6.4'# /)# ()*)3# rpf I6)(.2",%>*#/)#2'3#-",&'6)3#/)#4"&'()*%,%/"/Q:# ,'14.)3&'# 4'6# W# ()*)3# IrpfA-I). Los genes rpfB y rpfF# )3&8*# %142%,"/'3# )*# 2"# 6)(.2",%>*# 1)/%"/"# 4'6# 4)5.)S"3# 1'2+,.2"3# /%-.3%;2)3# denominadas DSF (del inglés diffusible signal factor), las cuales actuarían como comunicadoras intercelulares. M$";.!(+,8,I+(#$%!+&,*#0'+#;2$"+& U"6"#2"3#;",&)6%"3#0&'4"&>()*"3#2"#)6"#()*>1%,"#,'1)*?>#'0,%"21)*&)#,'*#2"#4.;2%,",%>*# de la secuencia del genoma de Xylella fastidiosa, el agente causal de la clorosis variegada de 2'3#,=&6%,'3A#_&%2%?"*/'#46'(6"1"3#/)#46)/%,,%>*# de secuencias se han encontrado en el geno1"#/)#)3&"#;",&)6%"#I/)#183#/)#\:M#1%22'*)3#/)# 4"6)3#/)#;"3)3Q#.*'3#\AWff#()*)3A#J/)183#/)# X. fastidiosa, ya se han secuenciado los geno1"3#/)#,)4"3#6)46)3)*&"&%9"3#/)#2"#1"7'6="#/)# 2'3# (6.4'3# &"D'*>1%,'3# 5.)# ,'*&%)*)*# ;",&)6%"3#0&'4"&>()*"3#/)#%14'6&"*,%"A#C*&6)#)22'3:# 9"6%"3#)34),%)3#/)2#(+*)6'#/)#Xanthomonas y Pseudomonas Para conocer el estado actual de la secuenciación de genomas en bacterias 0&'4"&>()*"3# 3)# 4.)/)# ,'*3.2&"6# 2"# ;"3)# /)# datos GOLD (ver Lecturas Recomendadas) donde se encuentra una lista actualizada de 2'3#46'7),&'3#/)#3),.)*,%",%>*A

2"#42"*&"#/)#1"*)6"#%*)34),=0,"#/%6%(%)*/'#.*"# 6)34.)3&"# ()*)6"2:# '# ;%)*# 4.)/)*# 3)6# /)&),&"/"3# )34),=0,"1)*&)# 4'6# )2# 46'/.,&'# /)# 2'3# genes de resistencia (RQA#!"3#46%1)6"3#3'*#1'2+,.2"3# 46)3)*&)3# )*# 2"# 3.4)60,%)3# /)# 2"# 1"7'6="# /)# 2"3# ;",&)6%"3# 0&'4"&>()*"3:# ,'1'# )2# 2%4'4'2%3",86%/'#I!UGQ#)*#2"#1)1;6"*"#)D&)6*"# /)#2"3#;",&)6%"3#i6"1O*)("&%9"3:#'#2"#`"()2%*":# ,'14'*)*&)#)3&6.,&.6"2#/)2#`"()2'A#C2#,'*()*'3#IUJqU3QA# C2#6),'*',%1%)*&'#)34),=0,':#,'1'#3)#1)*,%'nó en secciones anteriores, involucra la inte6",,%>*#/)2#46'/.,&'#/)#.*#()*#/)#Avr#/)2#4"&>()*'#7#)2#46'/.,&'#/)#.*#()*#/)#R#/)#2"#42"*&"A# En cualquiera de los casos (reconocimiento es4),=0,'#'#%*)34),=0,'Q:#2"#6)34.)3&"#/)#2"#42"*&"#)3&8#,'*3&%&.%/"#4'6#.*"#3)6%)#/)#)9)*&'3A#C*# 46%1)6#2.("6:#"#&6"9+3#/)#2"#1)1;6"*"#42"318&%,"#3)#46'/.,)#.*#684%/'#%*&)6,"1;%'#/)#%'*)3# con el medio extracelular. De esta forma, se incrementa la concentración intracelular de Hd y Ca\d, mientras disminuye la de Cl- 7#td. Este %*&)6,"1;%'# /)# %'*)3# )3# .*# 46)66)5.%3%&'# 4"6"# 2"#",&%9",%>*#/)#2"3#46'&)=*#5.%*"3"3#",&%9"/"3# 4'6#1%&>()*'3#IqJUtn#mitogen-activating protein kinaseQ#7#/)#2"#()*)6",%>*#/)#)34),%)3#/)# oxígeno reactivas (ROS; reactive oxygen species) a través de una NAD(P)H oxidasa asocia/"#"#1)1;6"*"A#_*"#9)?#",&%9"/"3#2"3#qJUt:# algunas son traslocadas al núcleo y otras son 684%/"1)*&)#-'3-'6%2"/"3#7#/)3-'3-'6%2"/"3A#E%*"21)*&):#3)#46'/.,)#2"#%*/.,,%>*#&6"*3,6%4,%'nal de un considerable número de genes en la ,+2.2"#9)()&"2:#)*&6)#)22'3#2'3#/)#2"3#46'&)=*"3# 6)2",%'*"/"3#"#2"#4"&'()*%,%/"/#IUNn#pathogenicity related proteins) y los genes involucrados )*# 2"# ;%'3=*&)3%3# /)# 0&'"2)D%*"3# I1)&";'2%&'3# 3),.*/"6%'3#2%4'-=2%,'3#/)#;"*#/)# &'#4'6#4"6&)#/)#+3&"3#/)#3)S"2)3#/)6%9"/"3#/)2# 2"#)D46)3%>*#/)#3.3#-",&'6)3#/)#9%6.2)*,%":#,'*4"&>()*'A#C3&"3#3)S"2)3#'#1'2+,.2"3#46)3)*- trolados a través del mecanismo de quórum &)3#)*#)2#4"&>()*'#4.)/)*#3)6#6),'*',%/"3#4'6# sensing (estrategia de quórum quenching, QQ,

462 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

Figura 3). Consiste en interferir en la comunicación entre bacterias a nivel de la generación /)#2"#3)S"2c#4'6#)*# /)# 2"# )*?%1"# %*&)6-)6="#,'*#2"#4"&'()*%,%/"/#%*,6)1)*&"*/'#2"# resistencia vegetal a la infección. Otra estrategia, enfocada a la alteración /)# 2"# )D46)3%>*# /)# 2'3# -",&'6)3# /)# 9%6.2)*,%":# consistió en la introducción del gen expI de E.

Figura 3. Quorum quenching. K%-)6)*&)3# )3&6"&)(%"3# 4.)/)*# .&%2%?"63)# 4"6"# %*&)6-)6%6# 2"# ,'1.*%,",%>*# )*&6)#,+2.2"3#;",&)6%"*"3A#CD%3&)*#/%-)6)*&)3#1),"*%31'3#5.)#"-),&"*#2"#6)(.2",%>*#4'6#",%2OHG!A#CD%3&)*# 1),"*%31'3#;%'5.=1%,'3#5.)#%*&)60)6)*#)*#2"#,'1.*%,",%>*#)*&6)#;",&)6%"3#"#*%9)2#/)#2"#()*)6",%>*#/)# 2"#3)S"2c#4'6#)*# ;",&)6%"*"#%*/.()*'O@'34)/"/'6# 4)61%&%># /)3"66'22"6# .*"# )3&6"&)(%"# 4"6"# ,'1;%*"6#()*)3#)34),=0,'3#/)#1"*)6"#/)#';&)*)6# una resistencia duradera. El Xa21#)3#)2#46%1)6# gen de resistencia de arroz caracterizado. La 46'&)=*"#,'/%0,"/"#4'6#)3&)#()*#4'3))#.*#/'1%*%'# /)# 3)6%*"R&6)'*%*"# 5.%*"3"# 7# )3# ,"4"?# de autofosforilarse en varios sitios en el curso /)#.*"#%*&)6",,%>*#%*,'14"&%;2)A#p"\]#,'*0)6)# resistencia a la mayoría de las razas de Xanthomonas oryzae#49A#oryzae (Xoo). Otro de los genes de resistencia, aislados de arroz y que ,'*0)6)#6)3%3&)*,%"#"#Xanthomonas oryzae 49A oryzae, es el gen Xa26. Si bien ambos genes ,'/%0,"*#46'&)=*"3#1.7#3%1%2"6)3:#)2#Xa26 con0)6)#6)3%3&)*,%"#&"*&'#)*#42"*&"3#9)*)3#,'1'# adultas; mientras que Xa21 sólo tiene efecto )*#42"*&"3#"/.2&"3:#2'#5.)#3.(%)6)#5.)#)3&"6="# 6)(.2"/'#4'6#()*)3#%*9'2.,6"/'3#/.6"*&)#)2#/)3"66'22'#/)#2"#42"*&"A#C3&"#&8,&%,"#/)#1"*%4.2",%>*#7#)D46)3%>*#/)#()*)3#N#)3#2"#183#.&%2%?"/"# tanto en mejoramiento clásico como con transgénicos. El descubrimiento de genes R en diferentes cultivos como cebada, maíz y tomate se ha acelerado notablemente debido al desarrollo /)# 2"3# &+,*%,"3# /)# 1"4)':# "%32"1%)*&'# 7# 3)cuenciación. Son interesantes las similitudes @"22"/"3# )*# 2"# )3&6.,&.6"# /)# 2"3# 46'&)=*"3# N# )*#)34),%)3#/)#42"*&"3#1'*'#7#/%,'&%2)/>*)"3:# lo que evidencia que los sistemas defensivos han sido conservados durante la evolución 7# /%9)63%0,",%>*# /)# 2"3# 42"*&"3A# !'3# ()*)3# R 183# ,'1.*)3:# ,'/%0,"*# 46'&)=*"3# %*&6",)2.-

lares con dominios de unión de nucleótidos y 3),.)*,%"3# 6)4)&%/"3# 6%,"3# )*# 2).,%*"3# ILbO LRR; nucleotide-binding/leucine-rich repeat) y con un dominio N-terminal variable, donde se observan motivos TIR (Toll-like receptor) o CC (coiled coil). _*# )*# 3)# )*,.)*&6"*# 2'3# 4+4&%/'3# "*&%1%,6';%"*'3A# !"# "142%"# /%3&6%;.,%>*# /)# )3&)# &%4'# /)# 1'2+,.2"3# en los reinos animal y vegetal sugiere que han ,.142%/'# .*# 6'2# -.*/"1)*&"2# )*# 2"# )9'2.,%>*# /)#)3&'3#'6("*%31'3#1.2&%,)2.2"6)3#,'142)2'# "/'4&"*# )3&"# ,'*-'61",%>*# una vez que se insertan en la membrana. !'3# 4+4&%/'3# "*&%1%,6';%"*'3# ",&B"*# -6)*&)# "#2'3#1%,6''6("*%31'3#)*#-'61"#)34),=0,"A#!"# ;"3)# /)# )3&"# )34),%0,%/"/# )3&8# /)&)61%*"/"# 4'6# 2"# *"&.6"2)?"# /%-)6)*,%"2# /)# 2"# 1)1;6"*"#

464 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

de las células bacterianas y las células animales o vegetales. En las bacterias, la membrana se organiza de forma tal que la gran mayoría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q"&3.?"h%O H."*(#IE%(.6"#ZQ#(6"0,"#)2#1),"*%31'#/)#",,%>*#/)#2'3#4+4&%/'3#"*&%1%,6';%"*'3A# G)# @"*# )D46)3"/'# )*# 42"*&"3# /%-)6)*&)3# &%4'3# /)# 4+4&%/'3# "*&%1%,6';%"*'3A# C*&6)# )22'3# 2"#3"6,'&'D%*"#5.)#)3#.*#4+4&%/'#"%32"/'#'6%(%*"21)*&)#"#4"6&%6#/)#2"#@)1'2%*-"#/)#2"69"3#/)#

Sarcophaga peregrina#4'6#.*#(6.4'#/)#,%)*&=0,'3#/)#2"#_*%9)63%/"/#/)#T'h%'#Is"4>*QA#C3&)# 4+4&%/'#4'3))#^W#"1%*'8,%/'3#7#4)6&)*),)#"2# (6.4'#/)#2"3#,),6'4%*"3:#,'*#",&%9%/"/#2=&%,"#7# antibacteriana contra muchas bacterias Gram4'3%&%9"3# 7# *)("&%9"3A# C*# )3&./%'3# in vitro, la 3"6,'&'D%*"#@"#6)3.2&"/'#"2&"1)*&)#)0,%)*&)#)*# la inhibición del crecimiento de algunas bacte6%"3# 0&'4"&>()*"3# &"2)3# ,'1'# Xanthomonas axonopodis#49A#citri. G)#@"#,'146';"/'#5.)#2"# )D46)3%>*# /)# 3"6,'&'D%*"# )*# 42"*&"3# /)# &";",':#;"*#/)2#4+4&%/'#"#2"#1)1;6"*"#1)/%"/"#4'6#2"#"&6",,%>*#)2),&6'3&8&%,"#/)#,"6("3n#"/)2("?"1%)*&'#/)#2"#,"4"#)D&)6*"#/)#2"#1)1;6"*"n# 3)#()*)6"*#&)*3%'*)3#)*#2"#;%,"4"#I`),@"3QA $c#-'61",%>*#/)#4'6'3#)*#2"#1)1;6"*"A#Kc#&6"*34'6&)#/)#4+4&%/'3#7#2=4%/'3#"#2"#,"4"#%*&)6*"#/)#2"#1)1;6"*"A#Cc#",,%>*#/)#2'3#4+4&%/'3#3';6)#a;2"*,'3e#%*&6",)2.2"6)3# I)*#"2(.*'3#,"3'3QA#Ec#,'2"43'#/)#2"#1)1;6"*"#;",&)6%"*"#7#6.4&.6"#/)#2"#,+2.2"A#!'3#2=4%/'3#6)46)3)*&"/'3# )*#"1"6%22'#4'3))*#,"6("#*)("&%9"A#!'3#2=4%/'3#6)46)3)*&"/'3#)*#*)(6'#*'#4'3))*#,"6("#*)&"A

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 465

9",.'2"3# /)# *.1)6'3"3# )34),%)3# 9)()&"2)3# 4'6#2'#5.)#)*&6"*#)*#,'*&",&'#,'*#2"3#;",&)6%"3# 0&'4"&>()*"3#.*"#9)?#5.)#+3&"3#@"*#46'/.,%/'#2"#2%3%3#'#6.4&.6"#/)#2"#,+2.2"#9)()&"2A#U',"3# lisozimas vegetales han sido caracterizadas y ,2'*"/"3:#4'6#2'#5.)#3)#@"*#;.3,"/'#2%3'?%1"3# /)#'&6'3#'6=()*)3#4"6"#3)6#)D46)3"/"3#)*#42"*tas transgénicas, como las del bacteriófago T4 (los bacteriófagos son virus que infectan a las bacterias) y la del huevo de gallina. El gen de la lisozima del bacteriófago T4, uno de los miembros más activos de esta familia de enzimas ;",&)6%'2=&%,"3:# @"# 3%/'# )D46)3"/'# )*# 42"*&"3# de Solanum tuberosumA#!"3#42"*&"3#&6"*3(+*%cas obtenidas fueron infectadas con la bacteria 0&'4"&>()*"#Erwinia carotovora#3.34A#atroseptica bajo condiciones de laboratorio e inverná,.2'A#_3"*/'#.*"#"2&"#46)3%>*#/)#%*-),,%>*:#3)# ';3)69># .*"# 6)/.,,%>*# 3%(*%0,"&%9"# )*# 2"# 1"ceración de los tejidos infectados. También se ,'146';>#5.)#2"#,"4",%/"/#/)#;6'&",%>*#/)#2'3# &.;+6,.2'3#&6"*3(+*%,'3#/)3"0"/'3#,'*#)2#4"tógeno resultó sumamente disminuída.

46%1)6"#0&'"2)D%*"#"%32"/"#7#,"6",&)6%?"/"#-.)# 2"#4%3"*&%*"#I3)#"%32>#)*#]WYf#"#4"6&%6#/)#2"3#9"%nas de Pisum sativumQA#G)#&6"&";"#/)#.*#%3'`"9'*'%/)# 4&)6',"64"*'A# !"# *"&.6"2)?"# 5.=1%,"# /)#2"3#0&'"2)D%*"3#,.;6)#468,&%,"1)*&)#&'/'#)2# )34),&6'# 5.=1%,'# /)# 2'3# 46'/.,&'3# *"&.6"2)3A# Recientemente se ha logrado la síntesis cons&%&.&%9"# /)# (2.,>3%/'3# /)2# %3'`"9'*'%/)# /"%/?)=*":# .*# 1%)1;6'# /)# 2"3# 0&'"2)D%*"3# /)2# &%4'# 4&)6',"64"*':#)*#,+2.2"3#/)#1"%?:#"#&6"9+3#/)# 2"#%*&6'/.,,%>*#/)#2"#)*?%1"#%3'`"9'*"#3%*&"3"# de Glycine max. Lecturas recomendadas:

Agrios GN. 2004. Plant Pathology. Elsevier F*,A:oD-'6/:#_t Collinge DB., Lund OS. and Thordal-Christensen HA# \ffXA# w@"&# "6)# &@)# 46'34),&3# -'6# ()*)&%,"227# )*(%*))6)/:#/%3)"3)#6)3%3&"**"*&3A#C.6'4)"*# Journal of Plant Pathology, 121, 217-231. Gurr SJ. and Rushton PJA#\ffMA#C*(%*))6%*(#42"*&3# with increased disease resistance: what are we ('%*(# &'# )D46)33A#T6)*/3# %*# b%'&),@*'2'(7:# \^:# \[MO\X\A Loh J., Pierson EA., Pierson LS., Stacey G. and Expresión de tioninas: Chatterjee AA# \ff\A# }.'6.1# 3)*3%*(# %*# 42"*&O !"3#&%'*%*"3#3'*#4'2%4+4&%/'3#6%,'3#)*#,%3&)="33',%"&)/# ;",&)6%"A# $.66)*&# o4%*%'*# %*# U2"*&# *"3:#46)3)*&)3#)*#)2#)*/'34)61"#7#)*#2"3#@'b%'2'(7:#Mc]^YWO]^[MA *#*'#)34),=0,"# Vojnov AA., Dow JM. and Bouarab K. 2007. 3)#;"3"#)*#2"#4)61)";%2%?",%>*#/)#2"3#1)1;6"N),)*&# 46'(6)33# %*# .*/)63&"*/%*(# &@)# 6'2)3# '-# nas celulares. KGEO6)(.2"&)/#9%6.2)*,)#-",&'63#%*#p"*&@'1'*"3# $'1'# )# )*# )*genomesonline.org

3"7'3#/)#%*',.2",%>*#,'*#;",&)6%"3#0&'4"&>()nas (Pseudomonas syringae 49A tabaci# ]M^# 7# P. syringae#49A#syringae)A#G)#,'146';>#5.)#2"3# 42"*&"3#&6"*3(+*%,"3#5.)#)D46)3";"*#)2#()*#/)# 2"#O&%'*%*"#46)3)*&";"*#1)*'6#46'4'6,%>*#/)# 2)3%'*)3# *),6>&%,"3:# )*# ,'14"6",%>*# ,'*# 2"3# 42"*&"3#*'#&6"*3(+*%,"3A# :L1$23%3)72)>$'*#2I%1*3M Entre las estrategias tendientes a incre1)*&"6# )2# 3%3&)1"# /)-)*3%9'# /)# 2"3# 42"*&"3# 3)#%*,2.7)#2"#3=*&)3%3#/)#0&'2)D%*"3:#2'#5.)#()*)6"21)*&)# %*9'2.,6"# 2"# 1'/%0,",%>*# /)# 9="3# ;%'3%*&+&%,"3# ,'142)*#/)#*.&6%)*&)3#7#2)#4)61%&%>#3.#"/"4&",%>*# a los cambios del medioambiente. A lo largo de 2"# )9'2.,%>*:# 2"# @";%2%/"/# /)# 2'3# @'*('3# 4"6"# %*-),&"6#"#2"3#42"*&"3#3.6(%>#)*#-'61"#6)4)&%/"# )#%*/)4)*/%)*&):#2'#5.)#/)&)61%*>#)2#/)3"66'22'# de una diversidad de estrategias en los hongos 0&'4"&>()*'3#4"6"#)9"/%6#2"3#/)-)*3"3#9)()&"2)3#7#,'142)&"6#3.#,%,2'#/)#9%/"#)*#2"3#42"*&"3A# Durante el desarrollo de la enfermedad se alte6"*#)*#2"#42"*&"#46',)3'3#6)2",%'*"/'3#"#2"#-'tosíntesis, a la absorción de agua y minerales /)2#3.)2'#7#3.#&6"*34'6&)#"2#6)3&'#/)#2"#42"*&":#"2# ,6),%1%)*&'#7#/)3"66'22':#&'/'#2'#,."2#6)4)6,.&)# negativamente en la agricultura. El desarrollo de estrategias biotecnológicas 4"6"# )2# 1"*)()*'3# -B*(%,'3# 4.)/)*# ",,)/)6# "# los tejidos vegetales y una vez establecidos en )22'3:# 2"3# &8,&%,"3# 5.)# .3"*# 4"6"# 3.# *.&6%,%>*A# Además se analizan brevemente las reacciones /)#/)-)*3"#5.)#4.)/)*#/)3"66'22"6#2"3#42"*&"3# -6)*&)#"#)3&)#"&"5.):#7#0*"21)*&):#,'1)*&"6#)2# "46'9),@"1%)*&'# /)# )3&)# ,'*',%1%)*&'# 4"6"# generar algunas estrategias biotecnológicas 5.)#4)61%&"*#1)(%,'#4.)/)*#3)6#/%3&%*&"3#)34),%)3#/)#@'*('3#0&'4"&>()*'3:#)3#,2"9)# &"1;%+*#4"6"#1)()*'3#3)#6),'1%)*/"#,'*3.2&"6# 2"# )D&)*3"# ;%;2%'(6"-="# 5.)# )3&8# /%34'*%;2)# )*# Agrios (2004), ya que esta breve enumeración 3>2'# 4)63%(.)# .*# ';()*'3# 3'*# 2'3#B*%,'3#5.)#4.)/)*#",,)/)6#"#2'3#*.&6%)*&)3# 9)()&"2)3#"#&6"9+3#/)#2"#,.&=,.2"#4'6#",,%>*#/)# enzimas denominadas cutinasas, que degradan la cutina. C3#%14'6&"*&)#&)*)6#)*#,.)*&"#5.)#/)#",.)6/'# "2# &%4'# /)# *.&6%)*&)3# 5.)# *),)3%&"*# 4"6"# ,'142)&"6#3.#/)3"66'22':#2'3#@'*('3#4"&>()*'3# 3)#4.)/)*#,2"3%0,"63)#)*#;%'&6'-'3#7#*),6'&6'fos 7#)2#@),@'#5.)#4)6&)*)?,"*#"#.*#&%4'#.#'&6'# determina las características de sus mecanismos de infección. Los biotrofos son aquellos

5.)# 3)# *.&6)*# /)# 2'3# &)()*'#;%'&6>0,'#';2%("/'#IJQ:#@)1%;%'&6>0,'#)*#2"#-"3)#;%'&6>0,"#IbQ#7#"2(.*"3#/)#2"3#9="3#/)#3)S"2%?",%>*#",&%9"/"3A#K)34.+3# /)#2"#"/@)3%>*#/)2#,'*%/%'#"#2"#3.4)6,%0)#/)2#&)*# 4'6# ,'*&",&':# ,'*/%,%'*)3# /)2# 1)/%'"1;%)*&)#I&)14)6"&.6"#7#@.1)/"/Q#7#2"# /%34'*%;%2%/"/#/)#*.&6%)*&)3A#K.6"*&)#)3&)#46',)3'# 3)# 46'/.,)# 1'9%2%?",%>*# /)# ,'14.)3&'3# /)#6)3)69":#4'2"6%?",%>*#7#;%'3=*&)3%3#/)#1)1;6"*"3# 7# 4"6)/# ,)2.2"6:# @"3&"# 5.)# 0*"21)*&)# )1)6()#)2#&.;'#()61%*"&%9':#@%-"#)34),%"2%?"/"# 5.)#"9"*?"#4'6#.*"#,'6&"#/%3&"*,%"#I9)6#E%(A]J# 7# ]bQA# C2# &.;'# ()61%*"&%9'# ,)*3"# 2"# 3.4)60,%)# /)2#@'34)/)6'#7#3%#3)#4)6,%;)*#2"3#3)S"2)3#-=3%,"3# 7# 5.=1%,"3# "46'4%"/"3:# 3)# %*/.,)*# .*"# 3)6%)# /)# )9)*&'3# 5.)# 0*"21)*&)# 22)9"68*# "# 2"# -'61",%>*#/)2#"46)3'6%'#IE%(A#]J#7#]bQA#K)#)3&)# 6),'*',%1%)*&'# 4"6&%,%4"*# /%9)63"3# 46'&)=*"3# -B*(%,"3:#,'1'#2"3#%*&)(6%*"3:#46'&)=*"3#&6"*3membrana que conectan eventos del medio externo con el citoesqueleto, o las hidrofobinas, que intervienen en el desarrollo de estructuras aéreas y en las interacciones de las hifas ,'*#3.4)60,%)3#@%/6'->;%,"3A# 3- Penetración en el hospedero. Para acceder a los nutrientes intracelulares /)2# @'34)/)6':# 2'3# 1%,6''6("*%31'3# 4"&>()*'3#/);)*#22)("6#"2#"4'42"3&'A#U"6"#,'*3)(.%62'# 4.)/)*# 4)*)&6"6# /%6),&"1)*&)# "# &6"9+3# /)# "4)6&.6"3# 46))D%3&)*&)3# ,'1'# @)6%/"3# '# )3&'1"3n#'#.3"6#.*"#)3&6"&)(%"#03%,'5.=1%,"#,'1;%*"/"#)()*'3#)*1"3,"6"*# 2'3#,'14'*)*&)3#)34),=0,'3#/)#3.#4"6)/#,)2.2"6#,'1'#5.%&%*":#1'/%0,8*/'2'3#5.=1%,"1)*&):# 7# "3=# )9%&"*# 3)6# 6),'*',%/'3# 4'6# 2'3# 3%3&)mas de defensa celulares. En el caso de los biotrofos obligados como Blumeria graminis#-A34A#hordei,#4"&>()*'#/)#2"# ,);"/":# ,."*/'# 2"# @%-"# /)# %*-),,%>*# 3)# 4'*)# )*# ,'*&",&'# ,'*# 2"# 1)1;6"*"# 42"318&%,"# /)# 2"# ,+2.2"# /)2# @'34)/)6'# 3)# %*%,%"# 2"# -'61",%>*# del haustorio, que es una estructura de nutrición del hongo que se desarrolla en el interior /)#.*"#,+2.2"#)4%/)61"2#4'6#%*9"(%*",%>*#/)#2"# 1)1;6"*"# 42"318&%,"A# C2# @".3&'6%'# &%)*)# .*"# )3&6.,&.6"# ,'142)*#/)#()*)3#6)2",%'*"/'3#"#2"#/)-)*3"#/)#2"#42"*&"A $'1'#3)S"2#/)#2"#6)34.)3&"#/)#/)-)*3"#/)3)*,"/)*"/"#)*#)2#@'34)/)6':#%*1)/%"&"1)*&)# /);"*#,'1%)*?"#"#)*(6'3"63)#4'6# )2# /)4>3%&'# /)# ,"2'3":# ,'14.)3&'3# -)*>2%,'3:# 2%(*%*":# ,)2.2'3":# 4),&%*":# 46'&)=*"3# ,'1'# 2"3# (2%,'46'&)=*"3#6%,"3#)*#@%/6'D%46'2%*"#7#4)6'D%/"3"3:#-'61"/'#2"#4"4%2"#5.)#6'/)"#"#2"#@%-"#/)# %*-),,%>*A# !"# 3=*&)3%3:# /)4'3%,%>*# 7# )*3"1;2)# /)# &'/'3# )3&'3# 1"&)6%"2)3# )3&8# ",'14"S"/"# 4'6#2"#2%;)6",%>*#/)#)34),%)3#6)",&%9"3#/)#'D=geno (ERO) entre las cuales se encuentra el 4)6>D%/'#/)#@%/6>()*'A#!"3#CNo#/)3)14)S"rían al menos tres funciones en la defensa de 2"#42"*&"c#I%Q#,6)"*#)2#"1;%)*&)#"46'4%"/'#5.)# 46'1.)9)# )2# 46',)3'# /)# 2%(*%0,",%>*# 7# 2"# -'61",%>*#/)#4.)*&)3#,6.?"/'3#)*&6)#6)3%/.'3#/)# "1%*'8,%/'3#/)#2"3#46'&)=*"3#/)#2"#4"6)/#,)2.lar (lo que las torna más resistentes al ataque /)#)*?%1"3#-B*(%,"3Q:#I%%Q#4'3))*#&"1;%+*#.*"# ",,%>*#&>D%,"#/%6),&"#3';6)#)2#4"&>()*'#-6)*"*do su crecimiento, y (iii) sirven como moléculas 3)S"2)3# 4"6"# %*/.,%6# 2"# )D46)3%>*# /)# "2(.*'3# genes relacionados a la defensa. A lo largo de la evolución y como modo de su4)6"6#2"3#6)34.)3&"3#%*/.,%/"3#)*#2"#42"*&":#2'3# @'*('3#0&'4"&>()*'3#@"*#)9'2.,%'*"/'#@",%"# 2"#46'/.,,%>*#/)#.*"#3)6%)#/)#1'2+,.2"3#/)*'1%*"/"3#)-),&'6)3#-B*(%,'3:#2"3#,."2)3#4.)/)*# actuar a distintos niveles. La naturaleza quími,"#/)#)3&'3#)-),&'6)3#)3#/%9)63":#2'#5.)#@"#/%0,.2&"/'#3.#%/)*&%0,",%>*A#!"3#42"*&"3#6)3%3&)*&)3#)D46)3"*#46'&)=*"3#46'/.,&'3#/)#()*)3#/)# resistencia o R#IE%(A#]JQ:#,"4",)3#/)#/)&),&"6# 2"#46)3)*,%"#/)#)-),&'6)3#I-",&'6)3#/)#"9%6.2)*cia) y desencadenar eventos relacionados a la transducción de señales e.g. cascada de MAP 5.%*"3"3#IE%(A#]bQ#5.)#0*"21)*&)#",&%9"*#.*"# /)-)*3"#)-),&%9"#)*#)3&'3#@'34)/)6'3A Como consecuencia de esta interacción, en la célula en contacto con el agente invasor y )*# "5.)22"3# 5.)# 2"# 6'/)"*# 4.)/)# /)3)*,"/)*"63)#2"#6)34.)3&"#/)#@%4)63)*3%;%2%/"/#'#HN:# 5.)#,'*3%3&)#)*#.*#,'142)*#/)#6)34.)3&"3#/)-)*3%9"3#2',"2)3# (LAR: resistenca local adquirida) y sistémicas (SAR: resistencia sistémica adquirida), siendo

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 471

estas últimas efectivas en sitios distantes del /)# %*-),,%>*A# !"# 6)34.)3&"# /)# @%4)63)*3%;%2%dad es considerada como uno de los factores 183#%14'6&"*&)3#5.)#-6)*"#)2#/)3"66'22'#/)#2'3# 4"&>()*'3#;%'&6'-'3#'#)*#2"#)&"4"#;%'&6>0,"#/)# 2'3#@)1%;%'&6'-'3:#%14%/%)*/'#3.#",,)3'#"#2'3# *.&6%)*&)3# 7# ,'*0*8*/'2'# "2# 3%&%'# %*%,%"2# /)# 2"# %*-),,%>*A#G%*#)1;"6(':#)*#)2#,"3'#/)#4"&>()*'3# *),6'&6'-'3:# ,"4",)3# /)# 46'/.,%6# &'D%*"3# que inducen la muerte celular, tiene un efecto '4.)3&'# 7"# 5.)# -",%2%&"# 2"# ,'2'*%?",%>*# /)# 2"3# 42"*&"3A K)34.+3# /)2# 6),'*',%1%)*&'# /)2# 4"&>()*'# se activan dos vías de transducción de señales 46%*,%4"2)3:#.*"#/)4)*/%)*&)#/)#8,%/'#3"2%,=2%,'# 7#2"#'&6"#5.)#/)4)*/)#/)#)&%2)*'#7#8,%/'##)*#)2#/%3)S'# /)#2"3#)3&6"&)(%"3#/)#%*9)3&%(",%>*#4"6"#&6"&"6# /)#6)34'*/)6#3';6)#"34),&'3#/)#)3&)#46',)3'# que aún se desconocen. C*# 2"# ",&."2%/"/# 3)# @"# ,'142)&"/'# 2"# 3),.)*,%",%>*#/)2#()*'1"#,'142)&'#/)#"2(.*'3# @'*('3# ,".3"*&)3# /)# %14'6&"*&)3# /"S'3# )*# cultivos como Magnaporthe oryzae (Dean et "2A:#\ffMQ#,".3"*&)#/)2#&%?>*#/)2#"66'?:#Ustilago maydis, y Fusarium, entre otros; el estado de 2'3#46'7),&'3#/)#3),.)*,%",%>*#/)#'&6'3#()*'1"3# -B*(%,'3# 4.)/)# 3)6# ,'*3.2&"/'# )*# www. ncbi.nlm.nih.gov. Sin embargo, el análisis de la gran cantidad /)# /"&'3# ()*)6"/'3# 4.)/)# &6"*3-'61"63)# )*# un factor limitante, que requiere la creación de

mejores herramientas bioinformáticas, la con-'61",%>*#/)#(6.4'3#/)#%*9)3&%(",%>*#%*&)6/%3,%42%*"6%'3#4"6"#/%2.,%/"6#2"#-.*,%>*#/)#2'3#*.)9'3# ()*)3:# 7# ,'1'# /)3"-='# )*# )2# -.&.6':# 4"6"# %*&)(6"6# 2'3# ,'*',%1%)*&'3# 7# "42%,"62'3# )*# 2"# "(6%,.2&.6"#"#(6"*#)3,"2"#Ip.#)&#"2A:#\ffYQA ESTRATEGIAS BIOTECNOLÓGICAS K)34.+3#/)#@";)6#46)3)*&"/'#2'3#"34),&'3# 183# 3';6)3"2%)*&)3# /)# 2'3# 46',)3'3# /)# %*&)6",,%>*#)*&6)#42"*&"3#7#4"&>()*'3#-B*(%,'3:#)*# )3&"#3),,%>*#3)#46)&)*/)#/"6#"2(.*"3#%/)"3#7# )geno o con sustancias químicas derivadas de +3&'3A#C3&"#%*&)6",,%>*#4.)/)#,'*/.,%6#"#5.)#2"# 42"*&"#*'#,'*&6"%("#2"#)*-)61)/"/#'#2'#@"("#)*# -'61"#1.7#/+;%2#3%#4)6,%;)#"#&%)14'#2"3#3)S"2)3#/)2#4"&>()*'#I%*/.,&'6)3#'#)2%,%&'6)3Q#7#2'(6"#%*/.,%6#.*"#6)34.)3&"#/)#/)-)*3":#4)6'#3)# enfermará si no logra detectarlas o si lo hace muy tardíamente (Dangl y Jones, 2001). En el 46%1)6# ,"3'# 3)# /%,)# 5.)# 2"# %*&)6",,%>*# )3# /)2# a&%4'#%*,'14"&%;2)e#7#)2#4"&>()*'#)3#a"9%6.2)*&'e#7#)*#)2#3)(.*/':#3)#&6"&"#/)#.*"#a%*&)6",,%>*# ,'14"&%;2)e#7#)2#4"&>()*'#)3#a9%6.2)*&'eA Un hecho interesante que es la base de una /)# 2"3# )3&6"&)(%"3# /)# 46'&),,%>*# 4'3%;2)3:# )3#

472 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

5.)# "2(.*'3# 4"&>()*'3# 4.)/)*# ,'14'6&"63)# ,'1'# "9%6.2)*&'3# ,'*# "2(.*'3# ()*'&%4'3# /)# 42"*&"3#7#,'1'#9%6.2)*&'3#,'*#'&6'3#()*'&%4'3A# K%,@'#)*#'&6"3#4"2";6"3:#)3&'#3%(*%0,"#5.)#a4'6# "2(.*"# 6"?>*e# )3)# 4"&>()*'# 4.)/)# /)3)*,"/)*"6# .*"# 6)34.)3&"# /)# /)-)*3"# )*# "5.)22'3# ()*'&%4'3# /)# 42"*&"# /'*/)# )3&";2),)# .*"# %*&)6",,%>*# /)2# &%4'# a%*,'14"&%;2)eA# !"# E%(.6"# \# 1.)3&6"#"#1'/'#/)#)&%,'#4"6"#%*/.,%6#2"#6)34.)3&"#/)# /)-)*3":#".*5.)#3)"#"9%6.2)*&'#7#)-),&%9'#4"6"# .*"#9"6%)/"/#)*#4"6&%,.2"6:#4.)/)#3)6#,"4"?#/)# 46'/.,%6# )*-)61)/"/# )*# '&6'# ,.2&%9"6:# 46'9'cando efectos no deseados en el cultivo. U"6"#3'2.,%'*"6#)3&)#%*,'*9)*%)*&)#3)#46'4.3'#2"#.&%2%?",%>*#/)#4"&>()*'3#1.)6&'3#'#%*",&%9"/'3#5.)#,'*3)69)*#2"#,"4",%/"/#/)#%*/.,%6#2"# 6)34.)3&"#/)-)*3%9"#)*#)2#9)()&"2:#'#)D&6",&'3# 46'9)*%)*&)3#/)#)3&'3#1%,6''6("*%31'3#%*",&%9"/'3:# /)# '&6'3# *'# 4"&>()*'3# 5.)# ,'*&)*("*# )2%,%&'6)3# /)# 2"# /)-)*3"# I1"*&)*("*# )2# 4'/)6# %*/.,&'6Q:# '# 2"# .&%2%?",%>*# /%6),&"# /)# ,'14.)3&'3#9)()&"2)3#,"4",)3#/)#%*&)61)/%"6#'#/)#",tuar como inductores naturales de la defensa %**"&"#/)#2"3#42"*&"3A# Como se muestra en la Figura 3, se investigó 2"#,"4",%/"/#/)#)D&6",&'3#)3&+6%2)3#/)#.*#4"&>()*'#/)#-6.&%22"#4"6"#%*/.,%6#.*"#6)34.)3&"#/)#

/)-)*3"#)*#42"*&"3#3.3,)4&%;2)3#/)#-6.&%22"A#G)# 4./'# 46';"6# 5.)# 2"# -6",,%>*# 4"6&%,.2"/"# IC$Q# y soluble (sobrenadante, SN) de extractos de conidios obtenidos del aislado avirulento (M23) del hongo Colletotrichum fragariae, mostra6'*# ,"4",%/"/# /)# %*/.,%6# 2"# 6)34.)3&"# /)# /)-)*3"#)*#42"*&"3#3"*"3#/)#-6.&%22"#,."*/'#3'*# "42%,"/'3# )*# -'61"# 46)9%"# "# 2"# %*-),,%>*# ,'*# .*# 4"&>()*'# 9%6.2)*&'# /)# C. acutatum, y que 2"# 46'&),,%>*# "/5.%6%/"# 4'/6="# 4)6/.6"6# )*# )2# &%)14'#I9)6#E%(A#^:#C$W:#C$^f:#GLW#7#GL^fQA# Los N)3.2&"/'3# 1'3&6"6'*# 5.)# 42"*&"3# &6"&"/"3#/)#)3&)#1'/':#*'#1"*%0)3&"*#3=*&'1"3#/)# 2"# )*-)61)/"/# "B*# @"3&"# Mf# /="3# 4'3&)6%'6# "# 2"#%*-),,%>*#I9)6#E%(A#^:#C$Mf#7#GLMfn#KGN#V# 1) y que ese efecto, del mismo modo que el 46'/.,%/'# 4'6# )2# @'*('# ",&%9':# 3)# /);="# "# 2"# %*/.,,%>*# /)# .*"# 6)34.)3&"# /)# /)-)*3"# /)# 2"# 42"*&"#I$@"2-'.*#)&#"2A:#\ff[QA K)3/)# )2# 4.*&'# /)# 9%3&"# &),*'2>(%,'# 3)# 4'-

5 4

Figura 3

9 dpi

3

30 dpi 50 dpi

2 1 0 EC EC 3

SN SN 2

C1 Cruz. Ctr.(+) C2 C.acut. Ctr. Prot.

Tratamientos Figura 3c#C9'2.,%>*#/)#2"#)*-)61)/"/#)9"2."/"#,'1'#FG#I=*/%,)#/)#3)9)6%/"/Q#"#2'3#W:#^f#7#Mf#/4%#I/="3# 4'3&)6%'6)3#"#2"#%*-),,%>*#,'*#.*#"%32"/'#9%6.2)*&'#/)#C. acutatumQ#/)#42"*&"3#/)#-6.&%22"#/)2#,.2&%9"6#U8()*'3#9%9'3#4"6"#)2#/)3"66'22'#/)#;%','*troladores. Sin embargo, esta nueva estrate(%"# &"1;%+*# 4.)/)# ,'*22)9"6# "34),&'3# *'# &"*# ventajosos que deben tenerse en cuenta antes de intentar su utilización directa como agente /)# ;%','*&6'2A# !'3# %*,'*9)*%)*&)3# 46)9%3%;2)3# 3)#6)0)6)*#"2#(6"/'#/)#)34),%0,%/"/#5.)#4.)den tener estos inductores con el cultivar utili?"/':#)3#/),%6:#/)2#)34),&6'#9"6%)&"2#/)#",,%>*A# !'#%/)"2#3)6="#5.):#4'6#.*"#3%142)#,.)3&%>*#/)# amortizaciones y costos, el efecto inductor fuera efectivo en muchas variedades de frutilla y aún mejor, en otros cultivos vegetales. Dicho de '&6"#1"*)6":#5.)#)3&'3#)D&6",&'3#4.)/)*#3)69%6# 4"6"# 46'&)()6# '&6"3# 9"6%)/"/)3# .# '&6"3# )34),%)3# "(6=,'2"3# /)# 3.3# 4"&>()*'3# 183# "(6)3%vos. En este sentido, es recomendable realizar )*3"7'3#,'*#'&6'3#,.2&%9"6)3#7#)34),%)3#9)()&"2)3#4"6"#,'146';"6#)2#(6"/'#/)#)34),%0,%/"/# 5.)#4.)/"#1"*%-)3&"6#)3&)#&%4'#/)#)2%,%&'6)3:#7"# 5.)#3%#3)#"*"2%?"#)2#'6%()*#/)#)3)#a%*/.,&'6e#3)# 4'/6="#4)*3"6#5.)#3)#&6"&"#/)#.*"#46'&)=*"#/)2# &%4'#J96#I46'&)=*"3#/)2#4"&>()*'#5.)#%*&)6",,%'*"*# )34),=0,"1)*&)# ,'*# 46'/.,&'3# /)# ()*)3# de resistencia RQ:# 7# 4'6# 2'# &"*&'# &)*)6# )-),&'# B*%,"1)*&)#3%#3'*#6),'*',%/"3#4'6#2"3#46'&)=*"3#,'/%0,"/"3#4'6#.*#()*#R#)34),=0,'#/)#2"# 42"*&"#IK"&&"#7#[email protected]%3@*"*:#]WWWQA#C3&"#B2tima aseveración se sustenta en la teoría del 6),'*',%1%)*&'# a()*O"O()*e# 46'4.)3&"# 4'6# /)# E2'6#7"#)*#]WMY:#4'6#2'#5.)#/);)6="1'3#)34)6"6#.*"#6)34.)3&"#1.7#)34),=0,":#)3#/),%6:#6)3&6%*(%/"# "# .*"# )34),%)# )# %*,2.3%9)# .*# ,.2&%9"6# determinado de la misma. En caso de ser cier&"#)3&"#@%4>&)3%3:#/);)6="1'3#)34)6"6#.*#6"*('# /)#",,%>*#1.7#6)/.,%/'#/)#)3&'3#)D&6",&'3:#4'6# 2'#5.)#2"#"42%,",%>*#/)#)3&"#)3&6"&)(%":#5.)/"6="#6)/.,%/"#"#.*#*B1)6'#4)5.)S'#/)#()*'&%4'3#/)#.*"#)34),%)#9)()&"2A C*# )3&'3# ,"3'3# @";6="# 5.)# 4)*3"6# )*# '&6"# "46'D%1",%>*# &),*'2>(%,"# 5.)# 4)61%&"# .*# .3'# 183# "142%'# /)# 2'3# )2%,%&'6)3# /)# /)-)*3"A# C*# ese sentido, se están investigando otros com4.)3&'3#/)#'6%()*#*"&.6"2#,'*#6)3.2&"/'3#%*&)resantes, algunos de los cuales son extractos %*",&%9'3# '# 46'&)=*"3# 4.6%0,"/"3# /)# 1%,6''6("*%31'3# ,'1'# )2# a@"64%*e# 5.)# )3# .*"# )3#

.*"# 46'&)=*"# /)6%9"/"# /)# 2"# ;",&)6%"# Erwinia amylovora con actividad elicitora de la defen3":# '# 1)&";'2%&'3# 3),.*/"6%'3# I*'# 46'&)%,'3Q# /)#42"*&"3#IE%2%44'*)#)&#"2A:#\ff]QA#G)#/);)6="# )34)6"6#5.)#)2#1),"*%31'#/)#%*/.,,%>*#/)#2"# 6)34.)3&"# /)# /)-)*3"# .&%2%?"/'# 4'6# )3&'3# 46'/.,&'3#'#,'14.)3&'3#3)"#1)*'3#6)3&6%*(%/'#"2# estar más conservado en el reino vegetal, lo 5.)# 4)61%&%6="# 46)9)6# .*# 6"*('# /)# ",,%>*# )Dtendido no sólo a otras variedades comerciales /)#-6.&%22"#3%*'#"#'&6"3#)34),%)3#,.2&%9"/"3A#N)3.2&"/'3# 46)2%1%*"6)3# ';&)*%/'3# *'3# 4)61%&)*# ";6%("6#)34)6"*?"3#)*#)3&"#/%6),,%>*A Todos estos resultados, nos hacen entrever .*# -.&.6'# 1.7# 46'1%3'6%'# )*# 2"3# %*9)3&%(",%'*)3# '6%)*&"/"3# "# 2"# )D&6",,%>*:# 4.6%0,",%>*# 7# ,"6",&)6%?",%>*# /)# 1'2+,.2"3# ,'*# ,"4",%/"/# /)#%*/.,%6#2"#6)34.)3&"#/)-)*3%9"#/)#2"3#42"*tas, ya sean de origen vegetal o microbiano, 4"6"#2"#-'61.2",%>*#/)#;%'%*/.,&'6)3#/)#"142%'# )34),&6':#,"4",)3#/)#&)*)6#",&%9%/"/#3';6)#/%ferentes variedades de distintos cultivos. E,V#!-!6+(!;",1$,M$"$&,H0#$"(!+-.$"#$, Involucrados en la Respuesta Defensiva o&6"# )3&6"&)(%"# 4'3%;2)# ,'*3%3&)# )*# .&%2%?"6# genes involucrados en la defensa vegetal, 5.)#4./%)6"*#,'*-)6%6#6)3%3&)*,%"#&'&"2#'#"2#1)*'3#.*#%*,6)1)*&'#4"6,%"2#/)#2"#6)3%3&)*,%"#)*# 42"*&"3# /)# %*&)6+3A# C3&'# /);)6="# 2'(6"63)# 4'6# )D46)3%>*# @'1>2'("# Ie.g. cuando el gen que 3)# %*&6'/.,)# 4'6# 9="# *'# 3)D."2# 46'9%)*)# /)# 2"# 1%31"# )34),%)Q# '# @)&)6>2'("# Ie.g. cuando el ()*#46'9%)*)#/)#.*"#)34),%)#/%3&%*&"#"#2"#5.)# se está transformando), utilizando herramientas de ingeniería genética. En estos casos, 4"6"#%*,6)1)*&"6#2"3#)D4),&"&%9"3#/)#+D%&'#/)# esta estrategia, se suelen elegir variedades de "2&'# 4'&)*,%"2# 46'/.,&%9'# 4)6'# 3.3,)4&%;2)3# "# 2"3#46%*,%4"2)3#)*-)61)/"/)3A#!"#46)(.*&"#5.)# 3.6()#)3#5.+#&%4'#/)#()*)3#,'*9)*/6="#,'*3%/)6"6# 7# )3"# 46)(.*&"# *'# &%)*)# .*"# 6)34.)3&"# &6%9%"2#7#)3#1.7#/)4)*/%)*&)#/)#2"#)34),%)#/)# %*&)6+3# 7# 2"# %*-'61",%>*# /%34'*%;2)# 3';6)# 2'3# ()*)3#5.)#1.)3&6)*#"2(B*#9"2'6#4'&)*,%"2A# A grandes rasgos y hasta tanto se diluciden los mecanismos involucrados en la resistencia 4'2%(+*%,"#.#@'6%?'*&"2:#'#3)#/%34'*("#/)#1+&'/'3#4"6"#,2'*"6#I"%32"6Q#)#%*&6'/.,%6#(6"*/)3# 4'6,%'*)3#,6'1'3>1%,"#4'6#.*"#9="#*'#3)D."2:#

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 475

Construcción utilizada: pHCHI

A

ch5B

CMv35s

B

nptII

Pnos

toct

Líneas transgénicas obtenida: ChiA y ChiB

C1

C

tnos

pBI

ChiA

ChiB

C2

Actividad quitinasa en líneas transgénicas

a

b

30 kDa

IS

NT pBI 39A 39B 35 ChiA ChiB ChiC

kDa

c

30 14

Figura 4c#J.1)*&'#/)#2"#6)3%3&)*,%"#%*/.,%/"#4'6#2"#)D46)3%>*#@)&)6>2'("#/)#.*#()*#/)#5.%&%*"3"#Ich5B) 46'9)*%)*&)#/)#Phaseolus vulgarisA#JQ#4H$HF:#,'*3&6.,&'#.&%2%?"/'#4"6"#2"#)D46)3%>*#/)2#()*#/)#5.%&%*"3"# )*#42"*&"3#/)#-6.&%22"#I,.2&%9"6#U8*#3)#6)"2%?>#,'*#]f#2#/)#.*"# 3.34)*,%>*#/)#]fY#,'*%/%'3R12A#!"3#@'&%,"Q# 7#,'*3),.)*&)1)*&)#/)#46'&),,%>*#"#2"#42"*&"# (Datta and Muthukrishnan, 1999). En cambio, si 3)#&6"&"#/)#.*#()*#/)#6)3%3&)*,%"#&%4'#R no hace -"2&"# ,'*',)6# 3.# ",&%9%/"/# )34),=0,":# 4)6'# 3%# /);)#&)*)6#2"#,"4",%/"/#/)#6),'*',)6#"2#4"&>()*'#)*#-'61"#/%6),&"#'#%*/%6),&"#4'6#1)/%'#/)2# 46'/.,&'#/)#.*#()*#avr del mismo (Axtell and Staskawicz, 2003; Mackey et al., 2002, 2003). C*&6)#2'3#()*)3#183#46'1%3'6%'3:#3)#4.)/)*# 1)*,%'*"6# "5.)22'3# 5.)# ,'/%0,"# 4"6"# "2(.*"# 46'&)=*"# 6)2",%'*"/"# ,'*# 2"# /)-)*3"# 9)()&"2# como ser: quitinasas, glucanases, entre las que tienen actividad enzimática hidrolíticas de ,'14'*)*&)3# /)# 2"# 4"6)/# ,)2.2"6# /)# @'*('3A# U)6'# &"1;%+*# 4.)/)*# 3)6# /)# ()*)3# 5.)# ,'/%0,"*#4"6"#)*?%1"3#5.)#*'#)3&8*#6)2",%'*"/"3# /%6),&"1)*&)#,'*#",&%9%/"/)3#@%/6'2=&%,"3:#4)6'# están sin embargo relacionadas a la regula,%>*#/)2#1)&";'2%31'#/)#)34),%)3#6)",&%9"3#/)2# oxígeno (i.e. glutation S tranferasas o GSTs, 3.4)6>D%/'# /%31.&"3"3# '# GoK3:# 4)6'D%/"3"3:# )&,Q:# "2# &6"*34'6&)# /)# 2=4%/'3# I%A)A# 2%4''D%()*"3"3:#!TU3:#)&,AQ:#'#3%142)1)*&)#5.)#*'#&)*("*# ",&%9%/"/#,'*',%/":#4)6'#,.7"#4"6&%,%4",%>*#)*# 2"# 6)34.)3&"# /)# /)-)*3"# @"7"# 3%/'# 46';"/"# I%A)A#46'&)=*"3#/)#&6"*34'6&)#/)#,"2,%':#6),)4&'res de etileno, MAMPs, etc.). Particularmente interesante son aquellos genes que aún cuan/'#3.3#46'/.,&'3#*'#4'3))*#.*"#",&%9%/"/#"*&%;%>&%,"# /%6),&":# ,'/%0,"*# 4"6"# 46'&)=*"3# 5.)# 4"6&%,%4"*# )*# 2"# 3)S"2%?",%>*# /)# 2"# 6)34.)3&"# /)-)*3%9":# 7"# 3)"# 4'6# 5.)# 6)(.2"*# )&"4"3# /)# la cascada de señalización (i.e. NPR1, GSTs), '#2"#)D46)3%>*#/)#()*)3#"3',%"/'3#"#2"#/)-)*sa (i.e. genes RQ#IT"*(#)&#"2A:#]WWWn#t%1#)&#"2A:# \ff\n#T'*)22'#)&#"2A:#\ffYn#q"6&%*)?#†"1'6"#)&# "2A:#\ffXQA

En los últimos años se ha incrementado el in&)6+3#4'6#2"#;B35.)/"#/)#()*)3#/)#6)3%3&)*,%":# *'#3>2'#4'6#2"#4'3%;%2%/"/#/)#.&%2%?",%>*#4"6"#2"# ';&)*,%>*#/)#9"6%)/"/)3#6)3%3&)*&)3:#3%*'#4"6"# dilucidar mecanismos de control y regulación /)#2"#6)34.)3&"#/)#/)-)*3":#7#/)#-",&'6)3#5.)# /)&)61%*)*# 2"# 3.3,)4&%;%2%/"/# '# 6)3%3&)*,%"# /)# 2"#42"*&"#@",%"#.*#4"&>()*'A# C3&)# 42"*&)'# 4)61%&)# 9%3."2%?"6# "2# 1)*'3:# &6)3#)3&6"&)(%"3#4'3%;2)3#I*'#)D,2.7)*&)3Q#5.)# 4.)/)*# ,'*&6%;.%6# 3%(*%0,"&%9"1)*&)# "2# 1)(%,'# /)# ,.2&%9"6)3A# U'6# .*# 2"/':#3)#4'/6="#%*&)*&"6#4'6#%*()*%)6="#()*+&%,"# aumentar la frecuencia de alelos (variantes gé*%,"3Q#/)#()*)3#&%4'#R que contribuyan a incrementar la resistencia a enfermedades. Por otra 4"6&):#3)#4'/6="#;2'5.)"6#'#"*.2"6#2"#)D46)3%>*# /)#()*)3#/)#2"#42"*&"#5.)#4)61%&)*#)2#46'(6)3'# /)#2"#)*-)61)/"/:#'#%*&)*&"6#3';6)O)D46)3"6#)*# 9"6%)/"/)3#3.3,)4&%;2)3:#()*)3#,.7"#",&%9%/"/# *'3#4)61%&"#%*,6)1)*&"6#2"#6)3%3&)*,%"A#K)#)3&'# se trata la siguiente sección. 3 Transferencia de Genes Involucrados en la Respuesta Defensiva por Ingeniería Genética La estrategia consiste en utilizar recursos ()*+&%,'3# /%34'*%;2)3# ,'*# "2&'# 4'&)*,%"2# /)# 6)*/%1%)*&':#)#%*,'64'6"6#4'6#%*()*%)6="#()*+&%,"#.*'3#4','3#()*)3#".3)*&)3#)*#2'3#()*'&%4'3#/)#4"6&%/"#I9"6%)/"/)3#'#,.2&%9"6)3Q:#5.)#2)# ,'*0)6"*#.*#%*,6)1)*&'#/)#6)3%3&)*,%"#"#)*-)6medades fúngicas. La literatura en ese senti/'#)3#&"*#)D&)*3"#5.)#4"6"#2'#5.)#3)#46)&)*/)# )*#)3&)#,"4=&.2'#3)6="#%14'3%;2)#6)3.1%62"A#G%*# )1;"6(':# 5.%3%+6"1'3# 6)3"2&"6# /'3# "34),&'3# 7#/)&)*)6*'3#3>2'#)*#.*'#/)#)22'3c#)2#46%1)6'# 3)#6)0)6)#"2#%14",&'#3',%'O,.2&.6"2#5.)#4.)/)# %142%,"6#2"#%*&6'/.,,%>*#/)#oiq3#I'6("*%31'3# ()*+&%,"1)*&)# 1'/%0,"/'3# 4'6# %*()*%)6="# ()nética) en el mercado y el otro, a la factibilidad /)#2'(6"6#2'3#1%31'3#';(%,'3#6)"2%?"/'3#/)#2"#%*&)6",,%>*# )*&6)# ()*'&%4'3# /)# Colletotrichum con distintos cultivares de frutilla (Fragaria x ananassa), 1.)3&6"*# 5.)# .*# "%32"/'# 4"6&%,.2"6# /)# @'*('# 4.)/)# "&","6# ,'*# /%3&%*&'3# (6"/'3# /)# 3)9)6%dad a diferentes cultivares de frutilla y también, 5.)# .*# ,.2&%9"6# /)# -6.&%22"# 4.)/)# 3)6# "-),&"/'# /)# 1"*)6"# /%-)6)*&)# 4'6# /%3&%*&'3# "%32"/'3# /)# @'*('3#4"&>()*'3A#C3&)#6)3.2&"/'#,2"6"1)*&)# muestra que no sólo hay variabilidad genética )*# 2'3# @'*('3# 4"&>()*'3# 4"6"# )2# ,"68,&)6# /)# 4"&'()*%,%/"/‘9%6.2)*,%":# 3%*'# 5.)# )*# 2"# -6.&%22"# @"7# &"1;%+*# 9"6%";%2%/"/# ()*+&%,"# 4"6"# )2# carácter de resistencia. Este dato es de gran %14'6&"*,%"#4"6"#"*"2%?"6#/%3&%*&"3#)3&6"&)(%"3# "2&)6*"&%9"3# 4"6"# '&'6("6# "# ,.2&%9"6)3# /)# -6.&%lla resistencia a la antracnosis o al moho gris. C3&'#3%(*%0,"#5.)#@";68#5.)#"*"2%?"6#;%)*:#,.82# metodología, si la clásica o la de transgénesis, ,'*9%)*)#.&%2%?"6#4"6"#&6"*3-)6%6#2"#,"6",&)6=3&%,"# /)3/)# )2# 1"&)6%"2# ()*+&%,'# 4','# /'1)3&%,"/'# a otro más domesticado. Concretamente todos 2'3# 46'(6"1"3# /)# 1)()*':#4'6#2'#5.)#*'#3)6="#4'3%;2)#1)2'('#5.)#,'*0)6"#6)3%3&)*,%":#4'/6="#3)6#.*#"2&)6*"&%9"#1.7# adecuada. Este el caso de la interacción entre frutilla y Botrytis: no se encontró ninguna variedad de frutilla con resistencia hacia Botrytis, 4'6# 2'# 5.)# 3)# /),%/%># %*,'64'6"6# 2"# 6)3%3&)*,%"# 4'6# %*()*%)6="# ()*+&%,"A# C*# 2"# E%(.6"# Z# 3)# 1.)3&6"*#6)3.2&"/'3#';&)*%/'3#4"6"#.*"#9"6%)/"/# /)# -6.&%22"# IU8*#/)#.*#()*#@)&)6>2'('#Ich5B) que ,'/%0,"#4"6"#.*"#46'&)=*"#I$@MbQ#/)2#&%4'#UN# "3',%"/"#"#2"#6)34.)3&"#/)#/)-)*3"#)*#4'6'&'# o Phaseolus vulgaris. En la Figura 4A se mues&6"#2"#,'*3&6.,,%>*#.&%2%?"/"#4"6"#&6"*3-'61"6#)2# cultivar Pájaro de frutilla, con la cual se obtu9%)6'*#/'3#2=*)"3#&6"*3(+*%,"3#5.)#)D46)3";"*# la quitinasa en forma correcta y activa: ChiA y ChiB. También (Figura 4B) se muestran los resultados de un ensayo de infección con Botrytis#)*#@'*#()*+&%,"#4'6#&6"*3(+&6"*3()*%,# ,"*'2"# 42"*&3# ;7# Rhizoctonia solani: *)3%3:#)3#.*"#)3&6"&)(%"#4'3%;2)#7#4.)/)#,'*&6%,7&',@)1%,"2#"34),&3#'-#,@%&%*#;6)"h/'r*#in vivo. buir efectivamente al manejo de enfermedades U2"*&#s:#Z:#\WMO^fMA 46'/.,%/"3# 4'6# 4"&>()*'3# -B*(%,'3:# /%31%*.7)*/'# 2'3# 6%)3('3# /)# )-),&'3# *',%9'3# 4"6"# )2# Catanzariti,A-M, Dodds, P.N. and Ellis, J.G. (2007). J9%6.2)*,)# 46'&)%*3# -6'1# @".3&'6%"O-'61%*(# medio ambiente y la salud humana, que tienen 4"&@'()*3A#ECqG#q%,6';%'2A#!)&&A#\YWc]X]O]XXA los fungicidas de origen sintético. 4 Conclusiones C*#)3&)#,"4=&.2'#3)#1'3&6>#,'1'#)2#,'*',%miento básico de los mecanismos de defensa 7# 2'3# -",&'6)3# %*9'2.,6"/'3# )*# 2"# 6)34.)3&"# /)-)*3%9"# '# )*# 2"# 6)3%3&)*,%":# 4)61%&)# /%3)S"6# desde la biotecnología, métodos racionales, 3.3&)*&";2)3#)#%*&)(6"/'3:#4"6"#"-6'*&"6#)2#/)3"-='#5.)#3%(*%0,"#)2#,'*&6'2#/)#)*-)61)/"/)3# fúngicas en la agricultura, dentro de un marco /)#46'&),,%>*#/)#2"#3"2./#@.1"*"#7#/)2#1)/%'# "1;%)*&)A#G%*#)1;"6(':#*'#4'/)1'3#/)*#/)#&6"*3(+*%,'3:#*'#"-),&)#)2#46'(6)3'# )34)6"/'#7#2"#/%34'*%;%2%/"/#/)#)3&"#@)66"1%)*&"# )*# 2'3# 4"=3)3# 1)*'3# /)3"66'22"/'3A# C3&'3# resultados también estimulan a continuar con el desarrollo de nuevas líneas de investigación 5.):#,'*#.*"#;"3)#-.)6&)1)*&)#,%)*&=0,":#4.)dan brindar sustentabilidad social, económica y ambiental a la agricultura, que es la base an,)3&6"2#7#1'/)6*"#/)#2"#46'/.,,%>*#/)#"2%1)*&'3#7#4'6#)*/):#/)2#/)3"66'22'#/)#2"#@.1"*%/"/A Reconocimientos: Los trabajos menciona/'3# )*# )3&)# ,"4=&.2'# -.)6'*# 0*"*,%"/'3# 4"6cialmente con fondos de Agencia Nacional de U6'1',%>*#$%)*&=0,"#7#T),*'2>(%,"#IEoL$7TQc# UF$To#\ffZ#[MW:#_*%9)63%/"/#L",%'*"2#/)#T.,.18*c#$F_LT#\YRK^ZY#7#$oLF$CTc#UFU#YZZ]A# NCh y CG son becarios del CONICET, y JCDR y APC son investigadores del CONICET. 5 Bibliografía Agrios GN. (2004). Plant Pathology. Elsevier F*,A:oD-'6/:#_t Axtell MJ and Staskawicz BJ. (2003). Initiation of NUG\O34),%0,# /%3)"33)# 6)3%&"*,)# %*# J6";%/'43%3# %3# ,'.42)/# &'# &@)#J96N4&\O/%6),&)/# )2%1%*"&%'*# '-# NFLZA#$)22:#]]\:#^YWO^[[A

$@"2-'.*# LN:# q.S>?# b2"*,'# s:# $";"22)6'# N)4.22'# JL, Castagnaro A, Díaz Ricci JC. (2007). Proteins secreted by an avirulent strain of Colletotrichum 344A# %*/.,)# 6)3%&"*,)# %*# 3&6"r;)667A# Biocell 31 I3.442Qc#]\ZA#J;3&6",&#U!O K"&&"# GAt# "*/# [email protected]%3@*"*# GA# I]WWWQ# Pathogenesis-Related Proteins in Plants. CRC U6)33:#b',"#N"&'*:#E!#A#44#\W]O\XX K"*(2#sA!A#"*/#s'*)3#sAKAiA#I\ff]QA#U2"*"&@'()*3# "*/# %*&)(6"&)/# /)-)*3)# 6)34'*3)3# &'# %*-),&%'*A# L"&.6):#Z]]:#X\YOX^^A Dean RA, Talbot NJ, Ebbole DJ, Farman ML, Mitchell Tt#I\ffMQ#T@)#()*'1)#3)5.)*,)#'-#&@)#6%,)#;2"3&# -.*(.3#q"(*"4'6&@)#(6%3)"A#L"&.6)#Z^ZcWXfOXYA E%2%44'*)# qU:# K%"?# N%,,%# s$:# $"3&"(*"6'# J# "*/# Farias RN. (2001). Effect of Fragarin on the $7&'42"31%,# q)1;6"*)# '-# &@)# U@7&@'4"&@'()*# Clavibacter michiganensis. Molecular Plantq%,6';)#F*&)6",&%'*3:#]Z:#W\MOW\XA E2'6#HH#I]WMYQ#T@)#,'142)1)*&"67#()*%,#373&)13# %*#`"D#"*/#`"D#6.3&A#J/9"*,)#i)*)&%,3:#X:#\W|MZA i2"?);6''h# sA# I\ffMQ# $'*&6"3&%*(# q),@"*%313# '-# K)-)*3)# "("%*3&# b%'&6'4@%,# "*/# L),6'&6'4@%,# 4"&@'()*3A#J**#N)9#U@7&'4"&@'2#Z^c\fMO\[A Glazebrook J, Chen W, Estes B, ChangHS, Nawrath $A# I\ff^Q# T'4'2'(7# '-# &@)# *)&r'6h# %*&)(6"&%*(# salicylate and jasmonate signal transduction /)6%9)/# -6'1# (2';"2# )D46)33%'*# 4@)*'&74%*(A# Plant J. ^Zc\][|\X H"*@%*)9":# tA# I\ffXQA# q)&";'2%,# )*(%*))6%*(# '-# 4@)*'2%,# ;%'37*&@)3%3# 4"&@r"73# "*/# 1)&";'2%&)# 46'02%*(# '-# 3&6"r;)667# IFragaria x ananassa). Kuopio Univ. Public. C. Nat. Enrivon. Sci. 231: ]OXWA t%1# ys:# !%*# L$:# q"6&%*# ib# I\ff\Q# Tr'# /%3&%*,&# Pseudomonas# )--),&'6# 46'&)%*3# %*&)6",&# r%&@# &@)# U&'#h%*"3)#"*/#",&%9"&)#42"*&#%11.*%&7A#$)22:#]fW:# MXW|MWXA Mackey D, Holt BF, Wiig A. and Dangl JL. (2002). RIN4 interacts with Pseudomonas syringae#&74)# III effector molecules and is required for RPM101)/%"&)/# 6)3%3&"*,)# %*# J6";%/'43%3A# $)22:# ]fX:# [Z^O[MZA

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 479

q",h)7# K:# b)2h@"/%6y:#J2'*3'# sq:# C,h)6# sN# "*/# K"*(2# s!A# I\ff^QA#J6";%/'43%3# NFLZ# %3# "# &"6()&# '-# &@)# &74)# FFF# 9%6.2)*,)# )--),&'6# J96N4&\# "*/# modulates PRP2-mediated resistance. Cell, 112, ^[WO^XWA Martínez Zamora, M.G., Castagnaro, A.P. and K="?#N%,,%:#sA$A#I\ffXQA#i)*)&%,#/%9)63%&7#'-#U&'O like serine/threonine kinase disease resistance genes in cultivated and wild strawberries. J.Mol. EvolA#Y[:#\]]O\\]A o%*# y:# T)D)%6"# /"# G%29"# s:# †@"*(# !:# †@"*(# G@# (2007) Transgenic strawberry: State of the art -'6#%146'9)/#&6"%&3A#/'%c]fA]f]YRs#b%'&),@*'2'(7# Advances 2007.12.004. Salazar, S.M.; Castagnaro, A.P.; Arias, M.E.; Chalfoun, N.; Tonello, U. and Díaz Ricci, J.C. I\ff[QA# F*/.,&%'*# '-# "# /)-)*3)# 6)34'*3)# %*# strawberry mediated by an avirulent strain of Colletotrichum.# C.6'4)"*# s'.6*"2# '-# U2"*&# Pathology, 117, 109-122. T"*(#p:#p%)#q:#t%1#ys:#†@'.#s:#t2)33%(#KE:#q"6&%*# ib# I]WWWQ# o9)6)D46)33%'*# '-# U&'# ",&%9"&)3# /)-)*,)#6)34'*3)3#"*/#,'*-)63#;6'"/#6)3%3&"*,)A# T@)#U2"*&#$)22:#]]:#]M|^fA

Tonello U, Mamaní MA, Salazar SM, Grellet C, Tortora ML, Castagnaro AP and Díaz Ricci JC Antioxidant activity and SA accumulation associated to the /)-)*3)#6)34'*3)#%*#3&6"r;)667A#Z\#N).*%>*#J*."2# /)#GJFbA#L'9%)1;6)#]\O]M:#\ffYA#N'3"6%':#G"*&"# E):#J6()*&%*"A#J;3&6",&#U!OU^\:#4A#]\XA k)22%,,):# iAn# K%"?# N%,,%:# sA$An# H)6*"*/)?# i"6,%":# !# "*/#$"3&"(*"6':#JA#I\ffYQA#C*@"*,)/#6)3%3&"*,)# to Botrytis cinerea mediated by the transgenic )D46)33%'*# '-# &@)# ,@%&%*"3)# ()*)# ,@Mb# %*# 3&6"r;)667A#T6"*3()*%,#N)3)"6,@:#]M:#M[OYXA p.#s:#U)*(#y:#K%,h1"*#qb:##G@"6'*#J#I\ffYQ#T@)# Dawn of Fungal Pathogen genomics. Ann Rev U@7&'4"&@'2#ZZc^^[OYYA

480 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

V . CAPÍTULO 9

6%";%2%/"/A# C3&'# B2&%1'# *'# )3# /)3)";2)# 4"6"# 2"# 46'/.,,%>*# /)# 42"*&"3# 2%;6)3# /)# 9%6.3:# /'*/)# )2#';*#/)#42"*&"3#2%;6)3#/)#4"&>()*'3#3%3&+1%cos, entre ellos los virus. Esta técnica consiste en aislar el meristema I)D42"*&'Q#7#3)1;6"62'#)*#.*#1)/%'#/)#,.2&%9'# "/),."/'# 5.)# 4'3%;%2%&)# )2# /)3"66'22'# /)# .*"# 42"*&"# ,'142)&"A# C2# &+61%*'# ,.2&%9'# /)# 1)6%3&)1"#4'6#2'#()*)6"2:#*'#)3#,'66),&"1)*&)#)142)"/':#7"#5.)#)*#2"#1"7'6="#/)#2'3#,"3'3:#3)# 3%)1;6"# )2# /'1'# 1)6%3&)18&%,'# ",'14"S"/'# 4'6#.*'#'#/'3#46%1'6/%'3#-'2%"6)3A#C2#/'1'#)3# una estructura generalmente menor a 0,1 mm muy difícil de extraer en forma aislada, y de la ,."2#6)3.2&"#,'*#-6),.)*,%"#,'142%,"/'#';&)*)6# .*"# 42"*&"# ,'142)&"A# U"6"# )22':# )3# *),)3"6%'# un medio de cultivo con concentraciones de hormonas y sales equilibradas y condiciones "1;%)*&"2)3# )3&6%,&"3:# 4'6# ,'*3%(.%)*&):# )3&'# ha llevado a que los resultados en ese sentido 3)"*#1.7#4';6)3A#U'6#)3&"#6"?>*:#)*#2"#1"7'ría de los casos, se utiliza el domo meristemá&%,'#",'14"S"/'#/)#]#>#\#46%1'6/%'3#-'2%"6)3A# Quizás lo aconsejable sería utilizar el término ,.2&%9'#/)#a7)1"e:#a;6'&)e#'#a&"22'eA#J#4)3"6#/)# ello, utilizaremos la denominación cultivo de 1)6%3&)1"#4'6#3)6#)3&"#2"#&)61%*'2'(="#183#/%fundida, aunque no estrictamente correcta. C*# ()*)6"2# 3)# ,'*3%/)6"# 5.)# 2"3# 42"*&"3# 46'9)*%)*&)3# /)2# ,.2&%9'# /)# 1)6%3&)1"# 3'*# %/+*&%,"3:# .# @'1>2'("3:# "# 2"# 42"*&"# 1"/6)# /)# /'*/)#3)#)D&6"()*'3#)*#-'61"#*"&.6"2A# U'6# '&6"# 4"6&):# 2"3# )34),%)3# 5.)# 3)# 46'4"gan exclusivamente en forma agámica no tienen esta ventaja. Cuando son infectadas sis&+1%,"1)*&)# 4'6# 9%6.3:# )3&'3# 3'*# &6"*31%&%/'3# /)3/)# 2"# 42"*&"# 1"/6)# "# 2"# /)3,)*/)*,%"# ,'*# "2&"#)0,%)*,%"A#C3&"#3%&.",%>*#4)61%&)#5.)#2"#%*fección continúe de generación en generación y se disemine a diferentes regiones a través del ,'1)6,%'# /)# )3&'3# 46'48(.2'3# I;.2;'3:# &.;+6,.2'3:#)35.)*# /)#42"*&"3#2%;6)3#/)#9%6.3#4'6#1)/%'3#"6&%0,%"2)3# *#/)#42"*&"3# in vitro. El sistema más frecuentemente utilizado y con mayores éxitos, es el cultivo de me6%3&)1"# 3.42)1)*&"/':# )*# "2(.*'3# ,"3'3:# 4'6# &6"&"1%)*&'3#/)#&)61'&)6"4%"#'#5.%1%'&)6"4%"A# Distribución de los virus en las plantas !'3#9%6.3#)*#2"3#42"*&"3#*'#)3&8*#.*%-'61)mente distribuidos. En las infecciones sistémi,"3:#"2(.*'3#)3&8*#2%1%&"/'3#"2#`')1"#'#"#4',"3#,+2.2"3#4"6)*5.%18&%,"3#"/7",)*&)3:#'&6'3# involucran a todas, o casi todas las células de 2"#42"*&"A#J2(.*'3#9%6.3:#/)2'# .*'3# 4','3# %*9"/)*# 2'3# *.)9'3# tejidos meristemáticos.

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 481

!'3#1)6%3&)1"3#3.)2)*#&)*)6#4','3#'#*%*(B*# 9%6.3A#!"3#6"?'*)3#4"6"#)22'#*'#)3&8*#)3,2"6),%/"3#,'142)&"1)*&)#4)6'#3)#1)*,%'*"*#,'1'# 4'3%;2)3#2"3#3%(.%)*&)3c ]AOG%3&)1"# 9"3,.2"6# 4','# /%-)6)*,%"/'A# !'3# 9%6.3#3'*#684%/"1)*&)#&6"*34'6&"/'3#"#2'#2"6('# /)# &'/"# 2"# 42"*&"# 4'6# )2# `')1":# 7# "3=# 3)# /%3tribuyen sistémicamente. Los meristemas no &%)*)*# &)*# /)#2'3#9%6.3A#U'6#2'#&"*&'#3)#4.)/)#3.4'*)6#5.)# las altas concentraciones de auxinas endóge*"3# )D%3&)*&)3# )*# 2'3# 84%,)3# 1)6%3&)18&%,'3# 4.)/)*#46'/.,%6#.*#)-),&'#3%1%2"6A ZAO# J2(.*'3# )D4)6%1)*&'3# 3'3&%)*)*# 2"# @%4>&)3%3#/)#5.)#2"#@";%2%/"/#/)#2'3#1)6%3&)1"3# 4"6"# )3,"4"6# /)# 2"3# %*-),,%'*)3# 9%6"2)3# 3)# debe a un mecanismo de silenciamiento genético viral ocurrido en células meristemáticas, cuyo objetivo es la degradación del ARN viral. El silenciamiento génico es un mecanismo de 6)(.2",%>*#1)/%"*&)#)2#,."2#2"#,+2.2"#%14%/)#2"# )D46)3%>*#/)#.*#()*A#C2#3%2)*,%"1%)*&'#(+*%,'# 4'3&6"*3,6%4,%'*"2# %142%,"# 2"# /)(6"/",%>*# /)# .*#JNL# 1)*3"*#/)#9%6.3#)*#.*"#,+2.2"#)#%14)/%6#5.)#3)#/%-.*/":#/"/'#5.)#)D%3&)# .*#46',)3'#/)#/%3)1%*",%>*#3%3&+1%,"#/)2#3%2)*ciamiento. Es decir, que la inducción del silenciamiento en la zona de infección genera una señal móvil que inicia el silenciamiento en zonas /%3&"*&)3#/)2#'6("*%31'A#C3&"#3)S"2#4'/6="#1'9)63)#"#&6"9+3#/)2#`')1":#'#/)#.*"#,+2.2"#"#'&6"# 4'6#42"31'/)31'3A# Existe además un mecanismo basado en un 46%*,%4%'#3%1%2"6#5.)#6)(.2"#2"#)D46)3%>*#/)#()nes endóngenos. J2(.*'3#&6";"(%,'# /)2# )D42"*&':# 2"# ,'*,)*&6",%>*# /)# @'61'nas endógenas, las contaminaciones internas '#)D&)6*"3#46'/.,%/"3#/.6"*&)#)2#/)3"66'22'#/)2# ,.2&%9':# )2# &"1"S'# 7# 2',"2%?",%>*# /)2# )D42"*&':# etc. Mencionaremos aquí algunas consideracio*)3#@",%)*/'#)34),%"2#6)-)6)*,%"#"#"5.)22"3#5.)# "-),&"*#2"#';&)*,%>*#/)#42"*&"3#2%;6)3#/)#9%6.3A @0(+-!6+(!;",1$-,$D'-+"#0P Frecuentemen&)# 3)# .&%2%?"*# 1)6%3&)1"3# "4%,"2)3# 7# "D%2"6)3#

482 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

,'*# ;.)*'3# 6)3.2&"/'3# 4"6"# 2"# 46'/.,,%>*# /)# 42"*&"3#2%;6)3#/)#9%6.3A#G%*#)1;"6('#)3#",'*3)jable el uso de yemas terminales ya que tienen .*#1"7'6#,6),%1%)*&'#4'&)*,%"2#5.)#2"3#7)1"3# laterales. En general los meristemas más jóvenes se desarrollan mejor que los viejos y 46'/.,)*# 183# 42"*&"3# 2%;6)3# /)# 9%6.3# 5.)# 2"3# 7)1"3#2"&)6"2)3:#46';";2)1)*&)#4'65.)#&%)*)*# un crecimiento más activo que las axilares. Sin )1;"6('# &"1;%+*# )3# 4'3%;2)# 2"# ';&)*,%>*# /)# 42"*&"3#3"*"3#"#4"6&%6#/)#7)1"3#"D%2"6)3A Estación o momento de la extracción: los meristemas en activo crecimiento son los 183# 6),'1)*/"/'3# 4'6# 3.# "2&'# 4'&)*,%"2# /)# /)3"66'22'A# C3&'# &"1;%+*# -"9'6),)# 2"3# 4'3%;%2%/"/)3#/)#';&)*)6#42"*&"3#2%;6)3#/)#9%6.3A#U"6"# )34),%)3#9)()&"2)3#,'*#4)6='/'3#/)#/'61"*,%"# /)0*%/'3# 2'3# 1)*#7#/)#()*)6"6#,+2.2"3#4"6"#-'61"6# &)2'#46'/.,)#,"22'#5.)#2.)('#4.)/)#6)()*)6"6# 42"*&"3A# $'1'# 3)# 1)*,%'*># "*&)6%'61)*&):# 2"# /%-)6)*,%",%>*# "# 4"6&%6# /)# ,"22'# %142%,"# .*# %*,6)1)*&'# )*# 2"# 4'3%;%2%/"/# /)# 1.&",%'*)3# 7# variabilidad no deseada cuando se intenta ob&)*)6#42"*&"3#()*+&%,"1)*&)#%(."2)3#"#2"#42"*&"# /'*"*&)#/)2#)D42"*&'A#U'6#)3&"#6"?>*#()*)6"21)*&)# 3)# ,.2&%9"# )2# /'1':# ,'*# .*'# '# /'3# 46%1'6/%'3# -'2%"6)3:# "# 4"6&%6# /)2# ,."2# 3)# ';&%)*)# ,'*#-6),.)*,%"#.*"#42"*&"#,'142)&"A C2# &"1"S'# /)2# )D42"*&'# "3=# ,'1'# )2# *B1)6'#/)#46%1'6/%'3#5.)#/);"#4'3))6:#/)4)*/)68# )*# ,"/"# ,"3'# /)2# ';4%,"#3)#46',)/)#"# 2"# )3,%3%>*# /)2# )D42"*&'A# _*"# 9)?# )D&6"=/'# 3)# coloca en un medio de cultivo adecuado y es 1"*&)*%/'#;"*# /)# *.1)6'3"3# 42"*&"3# "# 4"6&%6# /)# .*":# ,'*3&%&.7)*/'# "3=# .*# ,2'*#46'9)*%)*&)#/)#.*#3'2'#1)6%3&)1":#"2#5.)# 3)#,'*',)#,'1'#1)6%,2'*A#!"#1.2&%42%,",%>*# '# 1%,6'46'4"(",%>*# 4.)/)# )-),&."63)# 4'6# 46'2%feración de brotes axilares, brotes adventicios, formación de embriones somáticos, etc., tra&"*/'# 3%)146)# /)# )9%&"6# 2"# -'61",%>*# /)# ,"22'# ,'1'#4"3'#46)9%'#"#2"#/%-)6)*,%",%>*A#!"#)&"4"# /)#1.2&%42%,",%>*#4.)/)#%*9'2.,6"6#9"6%'3#6)4%ques del material a medio de cultivo fresco. Se @"#9%3&'#,'*#-6),.)*,%"#5.)#2"#&"3"#/)#1.2&%42%,",%>*#9"6="#,'*#)2#&%)14'#/)#4)61"*)*,%"#/)2# )D42"*&'# )*# )2# 1)/%'# /)# ,.2&%9'A# C3# -6),.)*&)# 5.)#/)34.+3#/)#\#>#183#3.;,.2&%9'3#".1)*&)# )2#*B1)6'#/)#7)1"3#5.)#3)#46'/.,)*#"#4"6&%6# /)#.*#)D42"*&'A#L'#)3#",'*3)#Z#3)1"*"3A Multiplicación del material ex vitro !"3# 42"*&"3# 2%;6)3# /)# 4"&>()*'3# /);)*# 3)6# 1.2&%42%,"/"3# ;"*A# _*"# 9)?# 6.3&%,"/"3# 7# "/"4&"/"3# *.)9"1)*&)# "# 2"3# ,'*/%ciones ex vitro# 4.)/)*# 3)6# 1.2&%42%,"/"3# ;"*A#C3&"#)&"4"#3)#)D&%)*/)#&'/'#)2#&%)14'#*),)3"6%'#@"3&"#';&)*)6# )2# *B1)6'# 6)5.)6%/'# /)# %*/%9%/.'3# ,'1'# 4"6"# 6)"2%?"6# .*"# 46'/.,,%>*# ,'1)6,%"2A# G%# )2# 86)"# 46'&)(%/"# )3&8# 2'# 3.0,%)*&)1)*&)# "2)()*'3# )*# 42"*&"3A#U)6'#3>2'#,'*#)2#)142)'#/)#"2&"3#&)14)6"&.6"3:# /%-=,%21)*&)# 3)# ,'*3%("*# 42"*&"3# 2%;6)3# /)# 9%6.3A# q"*&)*)6# 2"3# 42"*&"3# )*-)61"3# 4'6#4)6='/'3#46'2'*("/'3#"#"2&"3#&)14)6"&.6"3# /%31%*.7)#2"#,'*,)*&6",%>*#/)#9%6.3#)*#2"#42"*&":#4)6'#"2#22)9"62"3#*.)9"1)*&)#"#,'*/%,%'*)3# *'61"2)3:# )*# 4','# &%)14'# 6),.4)6"*# )2# *%9)2# original.

_*"# 468,&%,"# 1.7# .3"/"# )3# 2"# ,'1;%*",%>*# /)# 2"# &)61'&)6"4%"# 7# )2# ,.2&%9'# /)# 1)6%3&)1"3A# C3&'#%142%,"#1"*&)*)6#2"3#42"*&"3#)*#&)61'&)6"4%"#4'6#.*#4)6='/'#9"6%";2)#/)#&%)14'#7#&)14)6"&.6"# I)*&6)# ^Z# 7# ^X"C desde una a varias semanas), luego se realiza la extracción del meristema, se siembra en el medio de cultivo y 3)#,'*&%*."#,'*#2'3#4"3'3#,'*9)*,%'*"2)3#4"6"# su desarrollo. C3&"# 468,&%,"# *'# )3# )-),&%9"# 4"6"# &'/'3# 2'3# 9%6.3#4'6#%(."2:#/)4)*/)#/)2#9%6.3#7#/)2#@'34)dante. Se ha visto que un mismo virus en dis&%*&"3# )34),%)3# 3)# %*",&%9"# )*# -'61"# /%-)6)*&)A# i)*)6"21)*&)# )3&"# 468,&%,"# @"# 6)3.2&"/'# 183# )-),&%9"#)*#9%6.3#/)#4"6&=,.2"3#"2"6("/"3:#7#1)*'3#)0,%)*&)#4"6"#9%6.3#4'2%+/6%,'3A U'/6="# 3.4'*)63)# 5.)# ,."*&'# 183# 2"6('# )3# el tratamiento con calor sería más efectivo, sin )1;"6('#*'#6)3.2&"#3%)146)#"3=A#C*#,6%3"*&)1'# 7# "*:# 4)6'# 3.34)*/%/'# )2# &6"&"1%)*&'#3)#6),.4)6"#2"#,'*,)*&6",%>*#9%6"2A# Se han evaluado diferentes sustancias, la más utilizada es la Ribavirina (1-b-D-ribofuranosyl-1, \:# Z|&6%"?'2)|^O,"6;'D"1%/):# k%6"?'2)’# )3# )2# *'1;6)# ,'1)6,%"2QA# G%*# )1;"6('# .*# 46';2)1"# %14'6&"*&)#,'*#)3&)#,'14.)3&'#)3#3.#0&'&'D%,%/"/:#5.)#/)4)*/)#/)#2"#/'3%3#)142)"/"#7#/)#2"# )34),%)#&6"&"/"A#C2#+D%&'#/)2#46',)3'#)*#1.,@'3# casos requiere de varios meses de tratamiento 7#2"#0&'&'D%,%/"/#4.)/)#,'*3&%&.%6#.*"#/%0,.2&"/A

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 485

_*#1'/'#"/),."/'#/)#)142)'#/)#2'3#"*&%9%rales es la combinación con el cultivo de me6%3&)1"A#C*#"2(.*'3#,"3'3#@"*#3%/'#"42%,"/'3# directamente a los meristemas in vitro, colocando el antiviral en el medio de cultivo. Las 42"*&"3#3'*#1"*&)*%/"3#;"*#/)# )2),&6%,%/"/#46'/.,)#2"#/)(6"/",%>*#/)#2"3#4"6&=,.2"3# 7# 4+6/%/"# /)# %*-),&%9%/"/A# C3&"# &+,*%,"# @"#3%/'#%142)1)*&"/"#4"6"#2%;)6"6#/)#1'3"%,'# al almendro cv Caetanuccia. En este caso, bro&)3#/)#W:Y#11#3)#3'1)&%)6'*#"#Mff#k#4'6#&%)14'3#9"6%";2)3#7#2.)('#3)#%**#9%6"2A#C2#1+&'/'#&"1;%+*#@"#3%/'#)142)"/'#4"6"#)2%1%*"6#;",&)6%"3#/)#,"S"#/)#"?B,"6:# Potato leaf roll virus#/)#4"4":#Dasheen mosaic virus de araceas y Banana streak virus de ba*"*":# )*&6)# '&6"3A# !"# )0,%)*,%"# /)# 2"# &+,*%,"# 4.)/)# /)4)*/)6# /)2# ,.2&%9"6:# )2# 4"&>()*'# 7# )2# ()*'&%4'A Cultivo de domo proveniente del disco basal (del inglés, stem-disc dome cultureQA#C2#46',)/%1%)*&'#,'*3%3&)#)*#2"#';&)*,%>*#/)#42"*&"3# 2%;6)3#/)#9%6.3#"#4"6&%6#/)2#,.2&%9'#/)#)3&6.,&.6"3# ,'*#-'61"#/)#/'1':#/%-)6)*,%"/"3#"#4"6&%6#/)2# cultivo del disco basal de dientes de ajo. Se ha informado la diferenciación de 20-30 brotes "# 4"6&%6# /)2# ,.2&%9'# /)2# /%3,'# ;"3"2# /)# /%)*&)3# de ajo en 1 mes de cultivo. Originalmente, el método se llamó cultivo del disco basal (stemdisc cultureQA# _*"# 1'/%0,",%>*# 4'3&)6%'6# /)# esta técnica que consiste en la extracción de las estructuras con forma de domo y su cultivo )*# 1)/%'# "/),."/':# 4)61%&)# ';&)*)6# 42"*&"3# libres de virus. q%,6'%**#/)#42"*&"3#/)#*"6"*&%2'#/)# .*"#428*&.2"#46'9)*%)*&)#/)#3)1%22"#,6),%/"#in vitroA#G)#&6";"()*'A#!"#)2),,%>*#/)#2"#&+,*%,"#/)#"*82%3%3#/)4)*/)68#/)2#4"&>()*'#7#/)#2"3#4'3%;%2%/"/)3#4"6"# 6)"2%?"62"A#C3#%14'6&"*&)#)2#)142)'#/)#3%3&)1"3#

486 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

/)#"2&"#3)*3%;%2%/"/#5.)#*'3#4)61%&"*#/)&),&"6# los virus aún en bajas cantidades. Sin embargo *'#)D%3&)#.*"#46.);"#5.)#3)"#%*-"2%;2):#3%)146)# @"7#.*#2=1%&)#/)#,'*,)*&6",%>*#/)2#4"&>()*'#4'6# /);"*# 9%6"2#"#2'#2"6('#/)2#,%,2'#/)#,.2&%9':#4'6#2'#&"*&'# )3# ,'*9)*%)*&)# 6)"2%?"6# 2"3# 46.);"3# )*# 9"6%"3# ',"3%'*)3#'#;%)*:#3%#3)#,'*',):#)*#"5.)2#4.*&'# en que virus alcanza su mayor título. Esto es 3';6)&'/'#%14'6&"*&)#,."*/'#3)#46.);"#)2#1"&)6%"2#&6"*3-)6%/'#"#,"14'A $."*&'# 183# &)146"*'# /)3,"6&)1'3# 2"3# 42"*&"3#,'*&"1%*"/"3#183#3)(.6'#3)68#)2#3%3&)1"A#_*"#42"*&"#%*-),&"/"#3%)146)#)3#.*#-','# /)#,'*&"1%*",%>*:#7#4'6#183#,.%/"/'3#5.)#3)# &)*("*#3%)146)#3)#,'66)*#6%)3('3A#$."*/'#2"3# 42"*&"3# )3&8*# in vitro, en general, la concen&6",%>*# /)# 9%6.3# )3# 1.7# ;"*# "# 42"*&"3# %*/%,"/'6"3# 6)3.2&"# 2"# 46.);"# 183# )-),&%9"A# C*# )3&)#,"3'#3)#%*()*'A# U'6# ,'*3%(.%)*&):# /)4)*/%)*/'# /)# 2"# 3)*3%;%2%/"/# /)# 2"# &+,*%,"# 5.)# 3)# .3):# )2# 4'6,)*&"2'#,'*#)2#)142)'#/)2#,.2&%9'#/)#1)6%3&)1"A# C*#2"#E%(.6"#]#3)#/)3,6%;)#)2#46',)/%1%)*&'# .&%2%?"/'#4"6"#2"#';&)*,%>*#/)#2"3#42"*&"3#/)#"#/)#1"*)6"#4".2"&%*"#"#2"3#,'*/%,%'*)3# *"&.6"2)3#/)#@.1)/"/#7#&)14)6"&.6"#IE%(A#]KO CQA#!"3#42"*&"3#ex vitro#3)#46';"6'*#1)/%"*&)# KJGOC!FGJ#4"6"#,'*3&"&"6#3.#)3&"/'#3"*%&"6%':# y se mantuvieron bajo jaulas anti-vectores. Los bulbos cosechados se conservan en lugar fres,'#7#3),'#@"3&"#2"#+4',"#/)#3%)1;6"A#!"3#3.,)3%9"3#1.2&%42%,",%'*)3#3)#6)"2%?"6'*#)*##"*"2%?"*/'#2"3#42"*&"3:#1)/%"*&)#46.);"3#/)#KJGOC!FGJ#IE%(A#]EOiQA#!'3# ;.2;'3# 46'/.,%/'3# 3)# )*&6)("6'*# "# 3)1%22)6'3# 5.)#6)"2%?"*#2"#1.2&%42%,",%>*#)*#86)"3#"%32"/"3# de otros cultivos de Alliaceae, hasta obtener el *B1)6'#/)#;.2;'O3)1%22"#3.0,%)*&)#,'1'#4"6"# %*%,%"6#.*"#46'/.,,%>*#,'1)6,%"2A !"#%142)1)*&",%>*#/)#46'(6"1"3#&)*/%)*&)3# "# 2"# 46'/.,,%>*# /)# 42"*&"3# /)# "*# /)# 3)1%22"# /)# "*# 7# 2"# ,"2%/"/# /)# 2"# -6.&":# ,".3"*/'# 4+6/%/"#/)#9%('6#7#/)#2'*()9%/"/#/)#2"#42"*&"A# !"3# 46%*,%4"2)3# )*-)61)/"/)3# ,".3"/"3# 4'6# )3&)# &%4'# /)# 1%,6''6("*%31'3# 3'*# 43'6'3%3:# tristeza, exocortis y cachexia. Estas enferme/"/)3# 3)# @"*# )D&)*/%/':# /);%/'# "# 2"# 46'4"gación vegetativa de material infectado. Es normal encontrar varias virosis en una misma 42"*&"# 7# )*# 1.,@'3# 4"=3)3# ,'1'# J6()*&%*":# ,"3%# 2"# &'&"2%/"/# /)# 2"3# 42"*&"3# "/.2&"3# )3&8*# "-),&"/"3#4'6#"2(.*"#9%6'3%3A# !"#43'6'3%3#7#'&6"3#)*-)61)/"/)3#3)#&6"*3miten mediante el injerto de yemas. Una vez @),@'# )2# %**#/)#42"*&"3#,=&6%,"3#2%;6)3#/)# 9%6.3A#C*#46%1)6#2.("6#3)#3)2),,%'*"#.*"#42"*ta candidata en base a las introducciones de 9"6%)/"/)3# ,=&6%,"3# /)# ,'4"# 7# 4'6&"%**# /)2# 4'6&"%*3&%,'3#4"6"#,"/"#)*-)61)/"/#4.)/)*# 3)6# 9"6%"3# 4)6':# )*# ,"3'# 3)# )D%3&%6# '6("*%31'# nacionales o internacionales de referencia, es ,'*9)*%)*&)# )142)"6# "5.)22"3# 6),'*',%/"3# '# 6),'1)*/"/"3# 4'6#)22'3A#U'6#)*:# 46'/.,,%>*:# 1"*&)*%1%)*&'#7#/%3&6%;.,%>*#/)#4'6&"%**A _*# G%3&)1"# /)# $)6&%0,",%>*# G"*%&"6%"# /)# U2"*&"3#U)6)**)3#3)#-.*/"1)*&"#)*#46'/.,%6#)2# *B1)6'#/)#42"*&"3#6)5.)6%/"3#4'6#)2#1)6,"/'# "#4"6&%6#/)#.*"#Planta Inicial. Básicamente requiere:1) Obtener la Planta Inicial de cultivares 7R'#4'6&"%*1%,'3:# 4.6)?"# 9"6%)&"2# 7# 3.# )3&"/'# sanitario. Constituye el material fundacional del ,."2#/)6%9"68#&'/'#)2#1"&)6%"2#,)6&%0,"/'n#\Q#_*#

Monte Fundación. Plantas de reserva y donan&)#/)#1"&)6%"2)3#/)#46'4"(",%>*:#()*)6"21)*&)# ,'*3&%&.%/'#4'6#&6)3#42"*&"3#/)#,"/"#,.2&%9"6#'# 4'6&"%**:# 3'1)&%/"3# "# 6%(.6'3'3# controles sanitarios y varietales, anuales; 4) Producción de ?#*1$*3)N2($%>/*7*3)4"6"#9%9)6'3#)D4)*/)/'6)3#/)6%9"/"3#46'4"(",%>*#"(8mica de Plantas de Base. Obtención de la Planta Inicial. 1) Selec,%'*"6# 42"*&"3# 4'6# 3.# 4.6)?"# 9"6%)&"2# 7# ,'*/%ciones agronómicas candidata a Planta Inicial. 2) Determinar su estado sanitarios mediante &6"*31%3%>*#"#42"*&"3#%*/%,"/'6"3:#46.);"3#3)6'2>(%,"3:#1'2),.2"6)3#7R'#1%,6'3,'4%"#)2),&6>*%,"A#^Q#G%#*%*(.*"#/)#2"3#42"*&"3#6)3.2&"#2%;6)# /)#4"&>()*'3#3%3&+1%,'3:#"42%,"6#&)61'&)6"4%"# seguida de cultivo de meristemas. Los contro2)3#3"*%&"6%'3#/)#2"3#42"*&"3#6)()*)6"/"3#4)6mitirán seleccionar la Planta inicial. Termoterapia y cultivo de meristemas. 1) Enraizar en suelo estéril estacas /)#2"3#42"*&"3# 3)2),,%'*"/"3:#7R'#/)#4'6&"%*()*'A#o3,%2"#)*&6)#^#7#[# 3)1"*"3A#YQ#N)&%6"6#2"3#42"*&"3#/)#2"#&)61'&)6"4%"A#J#,'*&%*.",%>*#)D&6")6#2'3#1)6%3&)1"3#/)# las yemas desarrolladas durante el tratamiento y sembrar en medio de cultivo in vitro. Micropropagación. 1) Sembrar meristemas /)#f:^Of:M#11#I,'*#.*'#'#/'3#46%1'6/%'3#-'2%"6)3Q:#)#%/)*&%0,"6#)2#1"&)6%"2A#\Q#N)4%,"6#)#%/)*&%0,"6#%*/%9%/."21)*&)#,"/"#7)1"#/)2#7)1"6%'# '6%(%*"/'A#$"/"#.*"#'6%(%*"68#.*#,2'*A#^Q#N)4%car las yemas manteniendo la individualización /)2# ,2'*A# L'# 3.4)6"6# /%)?# ,%,2'3# /)# 1%,6'46'4"(",%>*A#ZQ#Control Sanitario. Antes de la ter,)6"# 1.2&%42%,",%>*:# &'1"6# "2# 1)*'3# ^# 42"*&"3# /)#,"/"#,2'*#7#"*"2%?"6#2"#46)3)*,%"#/)#2'3#4"-

492 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

tógenos que se estableció eliminar. Mantener )3&"3# 42"*&"3# "2# 1)*'3# .*"# 3)1"*"# -.)6"# /)# 2"# ,81"6"# /)# ,.2&%9':# ;"*# J(6"6%"A# K%4.&",%>*#i)*)6"2#/)#J6"(>*A#C34"S"A#44#^^A Hernandez R. et al:# \ff]A# aC2),&6'&@)6"4@7e# Technique eliminates viral and bacterial infection -6'1# 42"*&# 3@''&O&%4# ,.2&.6)3A# FLFkFT:# G"*&'# Domingo, Cuba. H.# $AyA# "*/# w"*(# UAsA# ]WX^A# q)6%3&)1# 3@''&# &%4:# "*/# ;./# ,.2&.6)3A# F*c# C9"*3# KAJA:# G@"64# wANA:# J11%6"&'# UAkA# "*/# y"1"/"# yA# I)/3QA# H"*/;''h# '-# 42"*&# ,)22# ,.2&.6)A# T),@*%5.)3# -'6# 46'4"("&%'*# "*/#;6))/%*(A#k'2#]#$'22%)6#q",1%22"*#U.;2%3@)63A# !'*/'*A#44#][[O\\[A t"6&@"# tAtA# ]WX]A# q)6%3&)1# ,.2&.6)# "*/# ,67'46)3)69"&%'*O1)&@'/3# "*/# "442%,"&%'*3A# F*c# T@'64)# JATA# I)/QA# U2"*&# &%33.)# ,.2&.6)# 1)&@'/3# "*/# "442%,"&%'*3# %*# "(6%,.2&.6)A# K)4"6&1)*&# '-# Biology, University of Calgary, Calgary, Alberta, $"*"/"A#44#]X]O\]]A t"6&@"#tAtA#]WXZA#C2%1%*"&%'*#'-#9%6.3A#F*#k"3%2#FAtA# (ed). Cell culture and somatic cell genetics of 42"*&3A#J,"/)1%,#U6)33:#F*,A#44#M[[OMXMA L"9"66'#!A#]W[WA#q%,6'%**#)*#42"*&"3# aún son estudiados y ajustados. !"3# )3&6"&)(%"3# )D42'6"/"3# )*# 2"# ;B35.)/"# /)#()*)3#5.)#4.)/)*#()*)6"6#6)3%3&)*,%"#"#%*3),&'3#)*#9)()&"2)3#3'*#/%9)63"3A#C2#)34),&6'# /)# ()*)3# ,"*/%/"&'3# "# "4'6&"6# 6)3%3&)*,%"# "# /%3&%*&"3#42"("3#4"6"#2"#"(6%,.2&.6"#4.)/)#46'venir de diversas fuentes, tanto vegetales como bacterianas. También se está investigando la 4'3%;%2%/"/#/)#,'*-)6%6#6)3%3&)*,%"#1)/%"*&)#)2# uso de técnicas que involucran interferencia de JNL# INLJ%QA# !'3# ()*)3# 5.)# 46'/.,)*# )*/'toxinas, como los Bt, derivados de la bacteria del suelo Bacillus thuringiensis, son los más )D42'6"/'3#7#2'3#B*%,'3#5.)#@"3&"#)2#1'1)*&'# &%)*)*#"42%,",%>*#,'1)6,%"2A# Dada la numerosa cantidad de genes rele9"/'3# )# %/)*&%0,"/'3# ,'1'# 4'3%;2)3# -.)*&)3# /)# 6)3%3&)*,%"# "# %*3),&'3:# 3)# 4'/6="*# "(6.4"6# según el origen de las secuencias candidatas en: i) genes de origen bacteriano (Bt); ii) genes /)# '6%()*# 9)()&"2# I%*@%;%/'6)3# /)# 46'&)"3"3:# quitinasas, avidina, lectina); iii) secuencias de insectos (estrategia de RNAi) i) Bacillus thuringiensis (Bt) El microorganismo Bacillus thuringiensis, comúnmente conocido como Bt, es una bacteria ")6>;%,":# (6"1# 4'3%&%9"# 5.)# 3)# )*,.)*&6"# *"turalmente en el suelo y ha sido utilizada como insecticida biológico desde hace más de medio 3%(2'A#K)3,.;%)6&"#)*#s"4>*#)*#]Wf\:#)3&"#;",&)6%"# 46'/.,)# 46'&)=*"3# /)# %*,2.3%>*# )*# -'61"# /)# ,6%3&"2)3:# 22"1"/"3# “O)*/'&'D%*"3# '# 46'&)=*"3#$67:#/.6"*&)#2"#)34'6.2",%>*A#C3&'3#,6%3&"2)3#3'*#)34),=0,"1)*&)#&>D%,'3#4"6"#%*3),&'3:# )34),%"21)*&)# 2'3# 2)4%/>4&)6'3A# !.)('# /)# 2"# ingestión de los cristales, las toxinas actúan a nivel del intestino de la larva. Los cristales son /%3.)2&'3# 4'6# 2'3# D%,"3#4"6"#@.1"*'3A# !"3# 46)4"6",%'*)3# /)# ,6%3&"2)3# 3'*# .3"/"3# ,'1'#%*3),&%,%/"#/)3/)#@",)#183#/)#Yf#"S'3#

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 495

)*#*.1)6'3'3#,.2&%9'3:#)34),%"21)*&)#)*#@.)6tas orgánicas. Los cristales individuales suelen ser una mezcla de toxinas, cada una de las ,."2)3#4'3))#)34),%0,%/"/#3';6)#.*#&%4'#/)#%*3),&'3A#N)34),&'#"#3.#.&%2%?",%>*#)*#;%'&),*'2'(=":#.*"#/)#2"3#9)*&"4&)6'3:# cry II 4"6"#!)4%/>4&)6'3#7#K=4&)6'3:#cry III#4"6"#$'2)>4&)6'3:#7#cry IV#4"6"#K=4&)6'3QA#C*#,"1;%':# la nomenclatura actual se basa en la identidad "1%*'",=/%,"#/)#2"#46'&)=*"A#T"1;%+*#3)#'4&># 4'6#,"1;%"6#2'3#*B1)6'3#6'1"*'3#4'6#"68;%('3# IU'6#)*A#U"6"#3'2.,%'*"6#)3&'3#%*convenientes se han mejorado las secuencias )2%1%*"*/'# "2(.*'3# 3%&%'3# /)# 4'2%"/)*%2",%>*:# 1)*# 4"6"# 2'3# ,'/'*)3# )# incrementando el contenido de GC. Estos cam;%'3#1)*# )D%&'3"# /)# 2"#&),*'2'(="#/)#6)3%3&)*,%"#1)/%"*&)#2"#)D46)3%>*# /)# ()*)3# /)6%9"/'3# /)# b&# 4.)/"# 4)64)&."63)#)*#)2#&%)14'#3)#/);)#,'*3%/)6"6#)2#.3'# /)# 6)-.(%'3A# !"# 4'3%;%2%/"/# 4'&)*,%"2# /)# /)3"66'22'# /)# 6)3%3&)*,%"# "# 2"3# 42"*&"3# %*3),&%,%/"3# )3# ,'*3%/)6"/'# .*'# /)# 2'3# &)1"3# 46%*,%4"2)3# /)#46)',.4",%>*#3';6)#)3&"#&),*'2'(=":#/);%/'# "#5.)#7"#@"*#"4"6),%/'#,"3'3#/)#6)3%3&)*,%"#"# 46'/.,&'3# 4"6"# )34'29'6)"6:# /)6%9"/'3# /)# b&A# U'6#)3&"#6"?>*:#)2#/)3"66'22'#/)#42"*)3#/)#1"nejo de la resistencia de insectos es de suma %14'6&"*,%"A# K)# 2"3# )3&6"&)(%"3# ,'*3%/)6"/"3:# 2"#183#)-),&%9"#)3#2"#"2&"#)D46)3%>*#/)#2"3#46'&)=*"3#)*&'1'&>D%,"3#)*#2"3#42"*&"3#*#/)#42"*&"3#/)#"2('/>*# b&:# ,'1;%*"# /'3# &%4'3# /)# 46'&)=*"3# %*3),&%,%/"3#4"6"#.*#1%31'#%*3),&'#;2"*,'A#C3&)# "4%2"1%)*&'#/)#()*)3#b&:#)*#,'1;%*",%>*#,'*# una buena estrategia de manejo de refugios, ,'*-)6%68#2"#18D%1"#,"4",%/"/#/)#46'&),,%>*#"# la tecnología Bt contra la resistencia de insectos. ii) Genes de origen vegetal Inhibidores de proteasasc# )2# /)3"66'22'# 4'tencial de resistencia a las toxinas derivadas /)# ()*)3# b&# )*# 2)4%/>4&)6'3# @"# /%34"6"/'# /%9)63"3# %*9)3&%(",%'*)3# 4"6"# ()*)6"6# *.)9"3# )3&6"&)(%"3#/)#,'*&6'2#/)#%*3),&'3#5.)#4.)/"*# "#3.#9)?#46)3)69"6#)3&"#;%'&),*'2'(="#"1%(";2)# 4"6"#)2#"1;%)*&)A#!'3#%*@%;%/'6)3#/)#46'&)"3"3# IFUQ# 3'*# ,"*/%/"&'3# 4'3%;2)3# 4"6"# 1)4&)6'3:#"(6)("*/'# 2"#4'3%;%2%/"/#/)#,'*&6'2#/)#,'2)>4&)6'3:#/=4&)ros y otros insectos. !'3#FU#3'*#4"6&)#/)2#3%3&)1"#/)#/)-)*3"#/)# 2"#42"*&"#,'*&6"#)2#"&"5.)#/)#2'3#%*3),&'3#7#3)# 4.)/)*# )*,'*&6"6# )*# @'*A# T)*%)*/'# )*# ,.)*&"# )3&"# 46),".,%>*:#2"#)D46)3%>*#/)#()*)3#5.)#,'/%0,"*#4"6"# FU# )*# 42"*&"3# 3)# 4.)/)# ,'*3%/)6"6# ,'1'# .*"# estrategia segura. C2# 46%1)6# )*# /)# ()*)3# %*@%;%/'6)3# /)# &6%43%*"# /)# ,".4=# ICpTi) )*#]WX[A#J#4"6&%6#/)#)3)#1'1)*&':#3)#@"*#%*&6'ducido numerosos genes IP en diferentes es-

4),%)3A#G)#@"#';3)69"/'#5.)#*'#3%)146)#)3&'3# genes actúan como antimetabolitos efectivos, sino que hay un gradiente de efectividad frente a diferentes insectos y que, además, muchas veces no son tan efectivos como los genes Bt. C*# ;"3)# "# )3&"3# ';3)69",%'*)3# 3)# /);)# '4&%mizar la interacción entre el IP introducida y la 46'&)"3"# ;2"*,'# /)2# %*3),&'# 4"6"# %*,6)1)*&"6# 2"#",,%>*#/)2#()*#)D46)3"/'#)*#2"#42"*&"#&6"*3génica. o&6"# )3&6"&)(%"# 4"6"# 1)*# /)# genes de endotoxinas con genes derivados de 42"*&"3:# ,'1'# 2'3# FU:# '-6),)# *.)9"3# '4'6&.*%/"/)3#7#)3&6"&)(%"3#4"6"#)2#,'*&6'2#/)#%*3),&'3A o&6'3# )*#/)#%*@%;%/'6)3#/)#&6%43%*"#/)#("6;"*?'#)*#"2('/>*#4"6"# ,'*&6'2# /)2# ,'2)>4&)6'# 4%,./'# /)2# "2('/'*)6'# Anthonomus grandis. O) Genes inhibidores de alfa amilasa: así como los IP, los inhibidores de P-amilasa 3'*#46'/.,%/'3#4'6#2"3#42"*&"3#,'1'#.*# mecanismo natural de defensa contra insectos. La toxicidad de los inhibidores de PO"1%2"3"#3)#46'/.,)#1)/%"*&)#2"#%*terferencia en la digestión de los carbohidratos. Recientemente se ha aislado el gen inhibidor de PO"1%2"3"#/)#,".4=#7# se ha demostrado el efecto tóxico sobre ('6('*#)34),=0,"#"#,"6;'@%/6"&'3A#C2#6'2#46%*,%4"2#5.)# se les atribuye es el fenómeno de reconocimiento biológico que involucra células 7# 46'&)=*"3A# U"6"# 3)6# ,2"3%0,"/"3# ,'1'# 2),&%*"3:#2"3#46'&)=*"3#/)#.*%>*#"#,"6;'@%/6"&'3#/);)*#4'3))6#4'6#2'#1)*'3#/'3# sitios de unión. Esta característica les 4)61%&)#"(2.&%*"6#'#46),%4%&"6#)3&6.,&.6"3# que contienen residuos de azúcares. Se ha determinado que algunas lectinas ve()&"2)3#4'3))*#.*#1"7'6#'#1)*'6#)-),&'# entomotóxico o actividad insecticida. La toxicidad sería consecuencia de la inte6",,%>*# ,'*# 2"3# (2%,'46'&)=*"3# %*&)3&%*"les. Las diferencias en el nivel de toxi,%/"/#3)#4.)/)*#/);)6#"#5.)#)9'2.&%9"1)*&)# 2"3# 42"*&"3# /)3"66'22"6'*# 46'4%)/"/)3#;%'5.=1%,"3#7#03%,'5.=1%,"3#/%-)6)*&)3:#,'1'#2"#)34),%0,%/"/#)*#2"#.*%>*# "# ,"6;'@%/6"&'3A# C2# )34),&6'# /)# 42"("3# 5.)#3)#4.)/)*#,'*&6'2"6#,'*#)3&'3#()*)3#

3)#"142="#*'&";2)1)*&)A#L.1)6'3'3#&6"bajos informan que ya se han introducido genes de lectinas (como la GNA, de Galanthus nivalis L. aglutinina) en cultivos 4"6"#)2#,'*&6'2#/)#%*3),&'3#2)4%/>4&)6'3:# /=4&)6'3:# ,'2)>4&)6'3# 7# @'1>4&)6'3A# _*# 1),"*%31'# /)# ",,%>*# 46'4.)3&'# ,'*# 2"# iLJ#)3#5.)#"2#3)6#3.,,%'*"/'#4'6#2'3#%*3),&'3:# 3)# .*)# "2# )4%&)2%'# /)2# %*&)3&%*'# 7# 4"3"#"#2"#@)1'2%*-":#",&."*/'#,'1'#)*&'1'&>D%,'A#CD46)3"*/'#2"3#iLJ#3)#@"*# 4'/%/'# ';&)*)6# 42"*&"3# &6"*3(+*%,"3# /)# 4"4"7"# 6)3%3&)*&)3# "# 8,"6'3A# CD46)3"*do lectinas de cebolla (llamadas ASAL) 3)# @"*# ,'*&6'2"/'# 80/'3# )*# 42"*&"3# /)# mostaza. Como en otros casos de genes 46'9)*%)*&)3#/)#42"*&"3:#2"3#2),&%*"3#4.)den combinarse con otros genes, como 4'6# )*#,'*#()*)3#b&# en trigo. Algunas lectinas tienen limitaciones en su "42%,",%>*#)*#"2%1)*&",%>*#/)#1"1=-)6'3#3.4)riores debido a su toxicidad, como en el caso de las contenidas en el germen de trigo, que 4'3))*#-.)6&)3#46'4%)/"/)3#%*3),&%,%/"3A#o&6"3# lectinas como la GNA se consideran no tóxicas 4"6"#)3&)#(6.4'#/);%/'#"#3.#;"4'/'3A# G)# encuentran en organismos que deben /%()6%6#3.#46'4%"#5.%&%*"#'#2"#/)#'&6'3#%*/%viduos como hongos o animales. Pueden -.*,%'*"6# ,'1'# &>D%,"3# 4"6"# %*3),&'3# 3%# 3'*#,"4",)3#/)#/)(6"/"6#2"#,"4"#/)#5.%&%*"# /)# 2"3# 1)1;6"*"3# 5.)# 46'&)()*# )2# )4%&)2%'# %*&)3&%*"2A# C*# 42"*&"3# 3.4)6%'6)3# 2"#)D46)3%>*#(+*%,"#/)#2"3#5.%&%*"3"3#3)# ",&%9"#4'6#2"#%*9"3%>*#/)#4"&>()*'3:#4'6# 2'#5.)#3)#,6))#5.)#,.142)*#.*#6'2#%14'6&"*&)#/)#/)-)*3"A#y"#3)#@"#,'146';"/'#

498 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

O)

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O)

la acción inhibitoria sobre el crecimiento /)#@'*('3:#4)6'#2"#"42%,",%>*#)*#)2#,'*trol de insectos aún no está fehaciente1)*&)#/)3,6%4&"A Avidina: )3# .*"# (2%,'46'6&)=*"# 5.)# 3)# encuentra en la clara del huevo de ga22%*"# 7# &%)*)# 2"# 46'4%)/"/# /)# 3),.)3&6"6# 2"#9%&"1%*"#;%'&%*"A#J2#3)6#%*()6%/"#4'6#)2# insecto en una concentración mayor a ]ff#441:#2"#"9%/%*"#4.)/)#',"3%'*"6#.*"# /)0,%)*,%"#2)&"2#/)#)3&"#9%&"1%*"#7#)9%&"6# el desarrollo de insectos durante el almacenamiento de granos. Por lo tanto, la "9%/%*"# )D46)3"/"# )*# 2'3# (6"*'3# 4.)/)# 3)6# )-),&%9"# ,'1'# ;%'4)3&%,%/"# 4"6"# .*# "142%'# )34),&6'# /)# )34),%)3# /)# %*3),tos. Los datos sobre la efectividad y es4),%0,%/"/#/)#",,%>*#/)#2"3#"9%/%*"3#*'# )3&8*#&"*#,'142)&'3#,'1'#)*#)2#,"3'#/)# 2"3#)*&'1'&'D%*"3#b&3:#4)6'#3)#,'*3%/)6"#5.)#4'/6="*#.3"63)#,'1'#"2&)6*"&%9"#'# ,'142)1)*&'#/)#)3&"#&),*'2'(="A#G)#@"# )D46)3"/'#)*#1"=?#4"6"#46'/.,%6#;%'1'2+,.2"3:#4)6'#4'/6="#.&%2%?"63)#)*#.*#-.&.6'#&"1;%+*#4"6"#;%','*&6'2A# Polifenol oxidasas: las enzimas llamadas 4'2%-)*'2# 'D%/"3"3# IUUo3Q# ,"&"2%?"*# 2"# 'D%/",%>*#/)#,'14.)3&'3#-)*>2%,'3#"#5.%nonas. Frecuentemente su inducción se "3',%"#,'*#2"#6)34.)3&"#/)#2"3#42"*&"3#"# 3)S"2)3#'#/"S'3#46'/.,%/'3#4'6#4"&>()nos o insectos. Por estas observaciones 3)#3.(%)6)#5.)#&)*/6="*#2"#,"4",%/"/#/)# conferir resistencia tanto a enfermeda/)3#46'9',"/"3#4'6#;",&)6%"3#,'1'#4'6# %*3),&'3A# $'1'# )*# ()*+&%,"# 3'*# 1.7# )34),=0,'3# '# "# 9),)3# 1)/%"*"1)*&)# )-),&%9'3A# U"6"# ,.;6%6# 183# 4'3%;%2%/"/)3# /)# ,'*&6'2# 7# )9%&"6# 2"3# 4'3%;2)3# "4"6%,%'*)3# /)# 6)3%3&)*,%":# )3# 6),'1)*/";2)# 42"*-

&)"6#3%3&)1"3#/)#"4%2"1%)*&'#/)#/%3&%*&'3# ()*)3#)*#2"#1%31"#42"*&"A#J3%1%31':#3)ría más efectivo combinar sistemas de ()*)3# 5.)# 4"6&%,%4)*# )*# 3%3&)1"3# 1)tabólicos diferentes. Para efectuar una sinergia efectiva entre la biotecnología y el mejoramiento genético, las distintas )3&6"&)(%"3# 42"*&)"/"3# /)# )D46)3%>*# /)# ()*)3# )*# 42"*&"3:# "# 3.# 9)?:# /);)*# 3)6# incluidas dentro del sistema de manejo %*&)(6"/'#/)#42"("3A# iii) Estrategias de ARN de interferencia (ARNi) !'3# '6("*%31'3# ).,"6%>&%,'3# 4'3))*# .*"# maquinaria común se silenciamiento génico de 3),.)*,%"3#)34),=0,"3#5.)#)3#/%34"6"/'#4'6#2"# 46)3)*,%"#/)#JNL3#/)#/';2)#,"/)*"#I/3NLJQA# C3&)# 46',)3'# 3)# ,'*',)# ,'1'# a%*&)6-)6)*,%"# /)2#NLJe#INLJ%Q#)*#"*%1"2)3#7#a3%2)*,%"1%)*&'# (+*%,'#4'3&#&6"*3,6%4,%'*"2e#)*#42"*&"3#IUTiGQA El silenciamiento de algunos genes esen,%"2)3# )*# %*3),&'3:# 1)/%"/'# 4'6# 2'3# /3NLJ:# 4.)/)#%*/.,%6#)2#,)3)#/)#2"#%*()3&%>*#7:#)9)*tualmente la muerte. La utilización de la estra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del gen de la ATPasa de Diabrotica virgifera virgiferaQ:# ;"*# ,'*#()*)3#b&:#&"*&'#4"6"#,'*&6'2#/)#2)4%/>4&)6'3# ,'1'# /)# ,'2)>4&)6'3:# 3)(B*# 2"# 3),.)*,%"# 5.)# 3)# %*&6'/.?,"# )*# 2"# 42"*&"A# U'6# )*# de la secuencia de la enzima que degrada el ('33%4'2#)*#2"#'6.("#I5.)#2)#4)61%&)#&'2)6"6#2"# 46)3)*,%"#/)#)3"#3.3&"*,%"Q#)3#)-),&%9"#4"6"#)2# ,'*&6'2#/)#2"#42"("A C3&"#*.)9"#)3&6"&)(%"#4"6"#)2#,'*&6'2#/)#%*3),&'3# 42"("# )*# 42"*&"3# 4"6),)# 3)6# 1.7# 46'metedora, ya que las secuencias génicas de 2'3#%*3),&'3#4"6"#.3"6#,'1'#;2"*,'#4.)/)*#3)6# 1.7#)34),=0,"3#7#6)2"&%9"1)*&)#-8,%2)3#/)#';tener. $.2&%9'3#b&#,'1)6,%"2%?"/'3O#;)*)0,%'3#/)#2"# tecnología Control biológico !'3# )*)1%('3# *"&.6"2)3:# ,'1'# 2'3# 46)/"/'6)3# 7# 4"6"3%&'%/)3:# ,.142)*# .*"# -.*,%>*# ),'2>(%,"# 7# ),'*>1%,"# %14'6&"*&)# )*# ,."*&'# "2# 1"*&)*%1%)*&'# /)# 2"# 4';2",%>*# /)# %*3),&'3# @)6;=9'6'3#4'6#/);"*#/)#42"(.%,%/"3 K.6"*&)#)2#"S'#\ffY#2'3#,.2&%9'3#iq#@"*#6)/.,%/'# 2"# "42%,",%>*# /)# 4)3&%,%/"3# )*# \XY# 1%22'*)3# /)# h(# I)5.%9"2)*&)# "# .*# Zfg# /)2# 9'2.1)*# /)# 4)3&%,%/"3# "*."2# "42%,"/'# )*# 2"# _*%>*# C.6'4)"Q:#/%31%*.7)*/'#"3=#)2#%14",&'#/)2#.3'# /)#4)3&%,%/"3#3';6)#)2#"1;%)*&)#)*#.*#]M:ZgA# Según una investigación de la IUPAC (Unión in&)6*",%'*"2#/)#}.=1%,"#U.6"#7#J42%,"/"Q#)*&6)# 2'3#"S'3#\ff\#7#\ff[:#2"#"/'4,%>*#/)#,.2&%9'3# resistentes a insectos redujo el uso de insec&%,%/"3:#)34),%"21)*&)#)*#)2#"2('/>*#b&#)*#C3tados Unidos, así como también en Australia, India, China y Sudáfrica. El algodón Bt se ha %*,'64'6"/'#"#2"3#468,&%,"3#/)#1"*)*#/)#,.2&%9'3#b
)*,%'*"*#,'1'# .*#4.*&'#/)#(6"*#6)2)9"*,%"#)2#".1)*&'#/)#2'3#

500 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

6%*/)3# )*# ,'14"6",%>*# ,'*# 2"3# &),*'2'(="3# ,'*9)*,%'*"2)3A# C*# 4"=3)3# ,'1'# J6()*&%*":# $@%*":# q+*#/)#2"#&),*'2'(="#1.,@"3#9),)3# 3)# 1%/)# )*# &+61%*'3# /)# ;)*)0,%'# ),'*>1%,'A# Pero se ha determinado que hay factores ins&%&.,%'*"2)3# 5.)# %*`.7)*# %*/%6),&"1)*&)# )*# )2# nivel y la distribución de las ganancias, como 2"#,"4",%/"/#/)#%*9)3&%(",%>*#)*#%*3&%&.&'3#*",%'*"2)3:#2"3#4'2=&%,"3#)*#/)6),@'#/)#46'4%)/"/# %*&)2),&."2:# 2"# ,"4",%/"/# /)# 6)(.2",%>*# )*# 3)guridad ambiental y alimenticia, y la existencia /)#1)6,"/'3#4)61)";2)3#"#)3&"3#&),*'2'(="3A Estados Unidos C2#46%1)6#4"=3#"/'4&"*&)#/)#"2('/>*#7#1"=?# b&#-.)#C3&"/'3#_*%/'3A#C2#;)*)0,%'#4'6#)2#.3'# de estos dos eventos fue de $19 millones en ]WWY#7#/)#”]Wf#1%22'*)3#)*#]WW[A#C*#)2#46%1)6# ciclo de cultivo de algodón Bt se redujeron en .*#[fg#2"3#"42%,",%'*)3#/)#%*3),&%,%/"3#7#@.;'# .*#%*,6)1)*&'#/)#[g#)*#)2#6)*/%1%)*&'A#J,&."21)*&)#)2#Mfg#/)#2'3#,.2&%9'3#oiq#&%)*)*#2.("6# )*# CC# __:# ',.4"*/'# 183# /)# Mf# 1%22'*)3# /)# hectáreas. India F*/%"# )3# )2# 4"=3# 5.)# 3%)1;6"# 2"# 1"7'6# 3.4)60,%)# /)# "2('/>*:# 7# /'*/)# Yf# 1%22'*)3# /)# 4)63'*"3#)3&8*#6)2",%'*"/"3#,'*#)3&)#,.2&%9'A# C*#)2#\ff\:#.*'3#MZAfff#"(6%,.2&'6)3#,.2&%9"6'*#

MfAfff# @),&86)"3# /)# "2('/>*# b&A# $%*,'# "S'3# /)34.+3:#)*#\ff[:#)2#86)"#/)#"2('/>*#b)(># "#Y:\#1%22'*)3#/)#@),&86)"3:#,.2&%9"/"3#4'6#^:X# 1%22'*)3#/)#4)5.)S'3#46'/.,&'6)3#7#/)#)3,"sos recursos. Cabe destacar que más de 9 de ,"/"# ]f# 46'/.,&'6)3# 5.)# 3)1;6"6'*# "2('/>*# b&#)*#\ffM:#&"1;%+*#2'#@%,%)6'*#)*#\ffY#7#)*# 2007. El algodón Bt ha aumentado los rendi1%)*&'3#@"3&"#)*#.*#Mfg:#@"#6)/.,%/'#)2#.3'# /)# %*3),&%,%/"3# "# 2"# 1%&"/:# ,'*# 2"3# ,'66)34'*/%)*&)3# ,'*3),.)*,%"3# 4"6"# )2# "1;%)*&)# 7# 2"# salud, y ha incrementado los ingresos de los 46'/.,&'6)3#)*#_G”#\Mf#'#183#4'6#@),&86)"A#J# nivel nacional, el incremento en los ingresos de 2'3#46'/.,&'6)3#/)6%9"/'3#/)2#.3'#/)2#"2('/>*# b&#-.)#)3&%1"/'#4"6"#\ffY#)*&6)#_G”#XZf#1%22'*)3#7#_G”#]:[#1%2#1%22'*)3A#J/)183:#2"#46'/.,,%>*#/)2#"2('/>*#3)#/.42%,>:#)#F*/%":#5.)#&)*="# uno de los rendimientos más bajos en el cultivo /)#"2('/>*:#4"3>#"#3)6#.*#)D4'6&"/'6:#)*#2.("6# /)#.*#%14'6&"/'6#/)#"2('/>*A Cabe mencionar que en India hay nuevos 46'/.,&'3# /)# 2"# ;%'&),*'2'(="# )*# /)3"66'22':# ,'1'# 2"# ;)6)**#b&#)*#\ff\:#3)%3#"S'3#/)34.+3#5.)# $@%*":#7"#)*#\ffY#F*/%"#@";="#42"*&"/'#f:^#1%llones de hectáreas de algodón Bt más que China, y 2,4 millones de hectáreas más que China )*# \ff[A# G%*# )1;"6(':# ,'1'# 2"3# 42"*&",%'*)3# /)#"2('/>*#3'*#1.,@'#183#4)5.)S"3#)*#$@%*"#I&%)*)*#)*#46'1)/%'#f:MW#@),&86)"3Q#5.)#)*# F*/%"#I]:Y^#@),&86)"3Q:#)2#*B1)6'#/)#4)5.)S'3# 46'/.,&'6)3#5.)#,.2&%9"6'*#"2('/>*#b&#)*#$@%*"# en 2007 (7,1 millones) fue casi el doble que en F*/%"#I^:X#1%22'*)3Q:#2'#5.)#)5.%9"2)#"2#YWg#/)# 2"3#M:M#1%22'*)3#/)#@),&86)"3#/)2#"2('/>*#,.2&%vadas en China. Según los estudios realizados 4'6# )2# $)*&6'# 4"6"# 2"# U'2=&%,"# J(6=,'2"# $@%*"#

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 501

$$JU:# )2# "2('/>*# b&# )*# $@%*":# )*# 46'1)/%':# ".1)*&"#)2#6)*/%1%)*&'#)*#.*#W:Yg:#6)/.,)#)2# .3'#/)#%*3),&%,%/"3#)*#.*#Yfg:#,'*#,'*3),.)*,%"3#4'3%&%9"3#&"*&'#4"6"#)2#"1;%)*&)#,'1'#4"6"# 2"#3"2./#/)#2'3#46'/.,&'6)3:#7#()*)6"#.*#%*,6)1)*&'#)*#2'3#%*(6)3'3#/)#_G”#\\f#4'6#@),&8rea. Además, China ya ha sembrado casi un cuarto de millón de álamos Bt. En un estudio realizado entre 2002 y 2007, se ha encontrado 5.)#"/)183#/)#,'*&6'2"6#)2#46%*,%4"2#2)4%/>4&)ro en el algodón (Helicoverpa armigera), reduce 2"#46)3)*,%"#/)#)3&"#42"("#)*#'&6'3#,.2&%9'3#*'# oiq:#/%31%*.7)*/'#2"#*),)3%/"/#/)#4.29)6%?"6# con insecticidas. Entre los desarrollos actuales se encuentra el arroz transgénico resistente a 42"("3# I2"69"3# /)# 2)4%/>4&)6'3Q# 5.)# .*"# 9)?# que se cultive comercialmente, aumentaría el 6)*/%1%)*&'# .*# \OYg# 7# 6)/.,%6="# )2# .3'# /)# %*3),&%,%/"3#)*#,"3%#.*#XfgA Irán C*#)2#"S'#\ffZ:#F68*#"46';>#2"#3%)1;6"#,'mercial de arroz resistente a insectos. Fue el 46%1)6# 4"=3# )*# "46';"6# "66'?# iq# 4"6"# ,.2&%9'# y consumo. El evento contiene el gen Cry1Ab, %*&6'/.,%/'# )*# 2"# 9"6%)/"/# 4'4.2"6# "6'18&%,"# 22"1"/"#Tarom molaii:#,'*06%+*/'2)#6)3%3&)*,%"#"#2"#'6.("#/)2#&"22':#42"("#5.)#"-),&"#)2#\Mg# /)# 2"# ,'3),@"# ,"/"# "S'A# K.6"*&)# \ffMO\ffY# Irán sembró unas 4000 hectáreas de arroz Bt. Se observó que esta variedad rinde 200 kg 183#5.)#3.#,'*&6"4"6&)#*'#oiqA#J,&."21)*&)# &'/"9="# *'# 3)# 46'/.,)# "66'?# iq# )*# -'61"# comercial. E%2%4%*"3 _*#)1%,"#I_”G#^\#1%22'*)3Q#)3#"&","/'#4'6#1.,@"3#42"("3#/)#%*3),&'3:#)*&6)#)22'3#)2#183#/)3&6.,&%9'#)3#)2#2)4%/>4tero L. orbonalis, Guenee. Para combatir esta 42"("# "2(.*'3# 46'/.,&'6)3# 4.29)6%?"*# %*3),&%,%/"3#@"3&"#/'3#'#&6)3#9),)3#4'6#3)1"*"A#G)# )3&8*#/)3"66'22"*/'#)9)*&'3#,'*#%*,'64'6",%>*# /)# ()*)3# b&:# 7# 46'*'3&%,"*# 5.)# 3.# "/'4,%>*# 3%(*%0,"68# .*# ".1)*&'# )*# )2# 6)*/%1%)*&':# 6)ducción de costos y de las labores, y un incre1)*&'#/)2#;)*)0,%'#/)#_”G#WfWR@"#,'14"6"/'# con las variedades de cultivo actual.

_*%>*#C.6'4)" C2#1"=?#b)#3)1;6>#4'6#46%1)6"#9)?#)*#C34"S"#)*#)2#]WWXA#C*&6)#]WWX#7#\ff\:#1)/%"*&)# .*# ,'*9)*%'# )*&6)# 46'/.,&'6)3# 7# ,'14"S="3# 3)1%22)6"3:#3)#3)1;6"6'*#4)5.)S"3#3.4)60,%)3# IMg#/)2#&'&"2#/)2#1"=?Q:#22)("*/'#"#MXfff#@"3# )*# \ffYA# C*# E6"*,%"# 3)# 3)1;6"6'*# 4)5.)S"3# 3.4)60,%)3:# "3=# ,'1'# )*# U'6&.("2# 7#J2)1"*%"# )*&6)#]WWX#7#\fffA#H"3&"#)2#"S'#\ffM#@.;'#4)queños incrementos en el área sembrada, y en )2# "S'# \ffY:# 3)# 3)1;6"6'*# "46'D%1"/"1)*&)# YMfff#@"3#/)#1"=?#b&#)*#3%)&)#C3&"/'3#q%)1;6'3# /)# 2"# _CA# C2# 46%1)6# %14",&'# /)# 2"# "/'4ción del maíz Bt se tradujo en mayores rindes I]fg#'#183Q#/);%/'#"2#,'*&6'2#/)#2'3#2)4%/>4&)6'3#42"("#183#%14'6&"*&)3#/)#)3"3#?'*"3:#)*# ,'14"6",%>*# ,'*# 2'3# 1"=,)3# ,'*9)*,%'*"2)3A# !"3# ("*"*,%"3# ()*)6"/"3# 4'6# )2# .3'# /)# 2'3# 1"=,)3#b&#-.)6'*#)*&6)#YM#7#]Z]#•R@"#183#5.)# en los cultivos convencionales. En algunas regiones además, se mejoró la calidad de grano 1)/%"*&)# .*"# 6)/.,,%>*# 3%(*%0,"&%9"# /)2# *%9)2# de micotoxinas. Argentina C*# )2# "S'# ]WWX# 3)# @"*# "46';"/'# 4'6# 46%mera vez en Argentina los eventos de maíz 7# "2('/>*# ,'*# 6)3%3&)*,%"# "# %*3),&'3# 4"6"# 3.# 46'/.,,%>*# 7# ,'1)6,%"2%?",%>*A#J# 4"6&%6# /)# "22=# 3)#"46';"6'*#'&6'3#)9)*&'3#b&#)*#1"=?A#!"#3.4)60,%)#3)1;6"/"#-.)#%*,6)1)*&8*/'3)#/)3/)# ]^#1%2#7#M#1%2#@"3#@"3&"#\:M#1%22'*)3#7#]Y\#1%2# @"3#)*#2"#,"14"S"#f[RfX#4"6"#1"=?#7#"2('/>*# 6)34),&%9"1)*&)A#C*#\ff[:#)2#%*,6)1)*&'#"*."2# ,'14"6"/'# ,'*# \ffY:# -.)# /)# ]:]# 1%22'*)3# /)# hectáreas, equivalentes a una tasa anual de ,6),%1%)*&'#/)2#YgA#C*#)2#,"3'#/)#1"=?#7"#3)# @"*# "46';"/':# 4"6"# 3.# ,.2&%9'# )*# 2"# ,"14"S"# f[RfX:# )9)*&'3# "4%2"/'3# /)# &'2)6"*,%"# "# @)6bicidas con resistencia a insectos. La tasa de "/'4,%>*#/)#)3&'3#)9)*&'3#4"6"#2"#46'/.,,%>*# 3)#4.)/)#';3)69"6#)*#2"#0(.6"#]A#C*#2"#&";2"#\# 3)#/)&"22"*#2'3#)9)*&'3#"46';"/'3#)*#2"#J6()*&%*"#@"3&"#"('3&'#/)#\ffXA O) Maíz Btc#)2#;)*)0,%'#/)#2"#"/'4,%>*#/)#2"# &),*'2'(="# b&# ,'*3%3&)# )*# 2"# 46)9)*,%>*# /)#2"3#4+6/%/"3#/)#6)*/%1%)*&'#,".3"/"3# 4'6# )2# "&"5.)# /)# Diatraea Saccharalis (barrenador del tallo) en su estado larval. G)#)3&%1"#5.)#2"3#4+6/%/"3#)*#2"#6)(%>*#

502 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

Figura 1.#G.4)60,%)#,'*#,.2&%9'3#b&#)*#J6()*&%*"A#E.)*&)c#J6()*;%'#\ffXA

O)

4"14)"*"# 4'6# )3&"# 42"("# "2,"*?"*# 2'3# 170 millones de dólares y que además, 2"#"/'4,%>*#/)#@=;6%/'3#b&#%*,6)1)*&>#)*# .*#]fg#)2#6)*/%1%)*&'#/)2#,.2&%9'#I)3#/),%6:#5.)#)9%&>#4+6/%/"/3#/)#46'/.,,%>*#/)# esa magnitud). Algodón Bt:# )2# "2('/>*# b&# 46'9))# 6)3%3&)*,%"# "2# ,'142)4&)6'3QA#G)#@"#/)&)61%*"/'#5.)#2"# reducción en la cantidad de insecticidas 4.29)6%?"/'3#/.6"*&)#)2#4)6='/'#/)#,.2&%9'#b&#'3,%2"#)*&6)#Z^g#7#MMgA#!"#1"7'ría de las reducciones son en insecticidas muy tóxicos (de clases I y II), como '6("*'-'3-'6"/'3:#,"6;"1"&'3#7#4%6)&6'%/)3#3%*&+&%,'3:#5.)#,".3"*#46';2)1"3#/)# 6)3%/.'3#7#3'*#&>D%,'3#4"6"#2'3#%*3),&'3# ;)*+0,'3A#G)#@"#)3&%1"/'#)2#%14",&'#/)# 2"#"/'4,%>*#/)#"2('/>*#b&#,'1'#)2#)5.%9"2)*&)# "# .*# ^fg# /)# ".1)*&'# *)&"# /)# 46'/.,,%>*#4'6#@),&86)"A#C2#".1)*&'#/)# 46'/.,,%>*# ,'66)34'*/)# "# 2"# 6)/.,,%>*#

/)#2"3#4+6/%/"3#,".3"/"3#4'6#"&"5.)3#/)# 2)4%/>4&)6'3A Lecturas recomendadas Baum J A, Bogaert T, Clinton W, Heck G R, Feldmann P, Ilagan O, Johnson S, Plaetinck G, q.*7%hr"# T:# U2)".# q:# k".(@*# T# ˆ# N';)6&3# sA# \ff[A#$'*&6'2#'-#,'2)'4&)6"*#%*3),)3&3#&@6'.(@# NLJ# %*&)6-)6)*,)A# L"&.6)# b%'&),@*'2'(7# \M:# ]^\\O]^\YA b6''h)3# iA# \ff[A# T@)# ;)*)0&3# '-# "/'4&%*(# ()*)&%,"227#1'/%0)/#%*3),)3%3&"*&#Ib&Q#1"%?)#%*# &@)#C.6'4)"*#_*%'*#IC_Qc#063)3.2&3#-6'1#]WWXO \ffYn# Ui# C,'*'1%,3# !&/# rrrA4(),'*'1%,3A co.uk. Christeller J T, Malone L A, Todd J H, Marshall R q:#b.6()33#C#U#s:#U@%2%4#b#JA#\ffMA#K%3&6%;.&%'*# "*/# 6)3%/."2# ",&%9%&7# '-# &r'# %*3),&%,%/"2# 46'&)%*3:# "9%/%*"*/# "46'&%*%*:# )D46)33)/# %*# &6"*3()*%,# &';",,'# 42"*&3:# %*# &@)# ;'/%)3# "*/# -6"33# '-# Spodoptera litura larvae following feeding. s'.6*"2#'-#F*3),&#U@73%'2'(7#M]:#]]][|]]\YA Farias L R, Costa F T, Souza L A, Pelegrini P B, Grossi-de-Sá MF, Neto S M, Bloch C Jr, Laumann R A, Noronha E F, Franco O L. 2007. Isolation '-# "# *'9)2# $"6%,"# 4"4"7"# O"172"3)# %*@%;%&'6# with deleterious activity toward Callosobruchus maculates. Pesticide Biochemistry and U@73%'2'(7:#X[:#\MM|\YfA F*&)(6"&%'*#'-#F*3),&ON)3%3&"*&#i)*)&%,"227#q'/%0)/# $6'43# r%&@%*# FUq# U6'(6"13# G)6%)3c# U6'(6)33# %*# b%'2'(%,"2# $'*&6'2:# k'2A# M# C/c# N'1)%3:# s‹6(n#

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 503

Tabla 2. C9)*&'3#,'*#6)3%3&)*,%"#"#%*3),&'3#"46';"/'3#)*#J6()*&%*"#I@"3&"#*#7#,"racterización molecular del mecanismo de resistencia de dicha maleza.

Aplicaciones biotecnológicas al .+"$U0,1$,.+-$6+&J,3?$"#0&,1$, resistencia a herbicidas en cultivos. Germán Ferrari Julio E. Delucchi Marcadores moleculares C3# 1.7# %14'6&"*&)# /)3&","6# 5.)# 2"# %*,.1;)*,%"#/)#2"#;%'&),*'2'(="#"42%,"/"#"2#1"*)1%,"# /)# 1"2)?"3# 7# 4"6"# el conocimiento de las relaciones genéticas )*&6)# 4';2",%'*)3:# )2# )3&./%'# /)2# 1'/'# /)# 6)46'/.,,%>*#7#/)2#`.*# 4'6# .*# @)6;%,%/"A# U'6# '&6"# 4"6&):# 2"# .&%2%?",%>*#/)#1%,6'#"66)(2'3#4)61%&)#)3&./%"6#"# *%9)2#()*>1%,'#2'3#)-),&'3#/)#a@)6;%,%/"3#,"*/%/"&'e#3';6)#2"#)D46)3%>*#(+*%,"A#C3&'3#/"&'3# /);)*#3)6#2.)('#,'*061"/'3#)*#)3&./%'3#46'teómicos. !"3# "42%,",%'*)3# /)# 2'3# 1"6,"/'6)3# 1'2),.2"6)3#3'*#1.7#/%9)63"3#7#)3#/)#)34)6"6#5.)# se les encuentren nuevos usos. Por ahora se están utilizando en la diferenciación de indivi/.'3:#/%3,6%1%*",%>*#)*&6)#,2'*)3:#"*82%3%3#02'()*+&%,'3#7#&"D'*>1%,'3:#1"4)'#/)#()*'1"3:# ,."*&%0,",%>*#/)#9"6%";%2%/"/#(+*%,"#%*&6"#)#%*&)6#)34),=0,":#1)*# "# 3.-6%62"3:# 2',"2%?",%>*# /)# 6)3%3&)*,%"# "# )*-)61)/"/)3# 7# /%34)63%>*#/)#)34),%)3#)*&6)#'&6"3A _*#)*#/)#2"3#46'&)=*"3:#%*,2.%/"#3.#-'61"# de actuar e interactuar dentro de las células. A 4"6&%6#/)2#,'*',%1%)*&'#46'-.*/'#/)2#1)&";'2%31'#,)2.2"6#)*#2"3#1"2)?"3#)3#4'3%;2)#2"#%/)*&%0,",%>*#/)#;2"*,'3:#&"*&'#4"6"#3%&%'#/)#",,%>*#/)# 2'3#@)6;%,%/"3#,'1'#4"6"#-.)*&)#/)#6)3%3&)*,%"## "42%,";2)3#"#,.2&%9'3A#U'6#1)/%'#/)#)3&"#&),*'logía fue detectada en el maíz la enzima Glutatión S-transferaza (GST) (Frear y Swanson, ]W[fQ:# 5.)# &%)*)# 2"# ,"4",%/"/# /)# /)&'D%0,"6:# 4'6#1)/%'#/)#,'*0,"#I3%3&)1"#/)#,.2tivo de in-vitro). Cultivo de tejidos, selección in vitro y mutagénesis para el desarrollo de cultivos con resistencia a herbicidas. Las técnicas de mutagénesis y selección in 9%&6'# '# "# ,"14':# @"*# 4)61%&%/'# )2# "%32"1%)*&'# de individuos con resistencia a herbicidas, que en muchos casos, han alcanzado el nivel de utilización comercial. La obtención de cultivos $2)"60)2/® (maíz, girasol, colza, trigo, arroz, )*&6)#'&6'3Q:#6)3%3&)*&)3#"#/%-)6)*&)3#46%*,%4%'3# activos de la familia de las imidazolinonas o la soja STS®, resistente a sufonilureas, ambos (6.4'3# %*@%;%/'6)3# /)# 2"# # )*?%1"# ",)&'2",&"&'#

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 507

sintetasa (de ahora en más en este texto, ace&'@%/6'D%8,%/'#3%*&)&"3":#'#JHJGQ:#3'*#)*:# 4'6# 2"# ",,%>*# /)# 2'3# 1)*,%'*"/'3# herbicidas, de los individuos resistentes. Cultivos resistentes a herbicidas obtenidos por ingeniería genética !"# %*()*%)6="# ()*+&%,"# 4)61%&)# 2"# %*&6'/.,,%>*#/)#9"6%";%2%/"/#()*+&%,":#B&%2#4"6"#)2#1)*#/)# genes individuales. J#4"6&%6#/)2#,'*',%1%)*&'#/)#2"3#3),.)*,%"3# ,'/%0,"*&)3# 5.)# 4./%)6"*# ,'*-)6%6# 6)3%3&)*,%"# "# ,%)6&'3# @)6;%,%/"3# )*# 42"*&"3# 7# /%34'*)6# /)# 2"3# @)66"1%)*&"3# 4"6"# 3.# ,'66),&"# )D46)3%>*:# fue factible la obtención de cultivos resistentes. G.1"/'# "# )3&':# .*# (6.4'# /)# )146)3"3# ,'*# 1"6,"/'#%*&)6+3#4'6#/%9)63%0,"63)#@",%"#)2#*)(',%'#/)#3)1%22"3:#4"6"#/)3"66'22"6#,.2&%9'3#6)sistentes a sus moléculas herbicidas, hicieron 4'3%;2)# 2"# ';&)*,%>*# /)# 42"*&"3# &6"*3(+*%,"3# con resistencia exclusiva a dichos herbicidas o bien, combinada con resistencia a insectos. G)(B*#.*#%*-'61)#/)2#FGJJJ#IG)69%,%'#4"6"# 2"#J/5.%3%,%>*# /)#J42%,",%'*)3#J(6'O;%'&),*'lógicas), en 2007, 114.3 millones de hectáreas )*#&'/'#)2#1.*/':#.*#]\g#183#5.)#)*#\ffY:# fueron sembradas con cultivos genéticamente 1'/%0,"/'3#IiqQA#C2#M[g#/)#)3&"3#@),&86)"3# ,'66)34'*/%)6'*#"#3'*#/)#()*)3#%142%,"#2"# obtención de organismos genéticamente mo/%0,"/'3:# )*# )3&)# ,"3'# 4"6&%,.2"6:# /)# ,.2&%9'3# &6"*3(+*%,'3A# C2# 46%1)6# ,.2&%9'# &6"*3(+*%,'# ';&)*%/'# 4'6# )3&)# 1+&'/'# -.)# 2"# /)*'1%*"/"# 3'*# "2# 1%31'# @)6;%,%/"# )*# 2"# )*?%1"# CUGUG# 1.&"*&)A# Fuente: Mentaberry, A. 2007

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 509

/"A#J#4"6&%6#/)#)3&'3#/)3,.;6%1%)*&'3:#3)#"%32># )2#()*#5.)#,'/%0,"#.*"#CUGUG#6)3%3&)*&)#"#(2%-'3"&'#46'9)*%)*&)#/)#2"#,)4"#CP4 de la bacteria Agrobacterium tumefaciens (cp4 epsps). J3%1%31':# 3)# /)1'3&6># )*# 9"6%"3# )34),%)3# 9)()&"2)3#I?"*"@'6%":#4)&.*%":#&";",':#"2-"2-"#7# soja) que la selección gradual con glifosato en ,.2&%9'3#,)2.2"6)3#4)61%&)#';&)*)6#2=*)"3#,)2.2"6)3#,'*#6)3%3&)*,%"#"2#@)6;%,%/"#1)/%"/"#4'6# .*#46',)3'#/)#"142%0,",%>*#(+*%,"A#

Figura 2. Estructura de la EPSP sintetasa de E. coli. Los residuos del sitio activo están marcados en azul. La región en rojo es una región altamente conservada. La conversión de la Gly 96 a Ala transforma a la enzima en resistente a glifosato. Mentaberry, A. 2007

K)3"66'22'#/)#42"*&"3#&6"*3(+*%,"3# resistentes a glifosato

Gen gox9,A7$,(01!*(+,-+,$"6!.+,2-!>0&+#0, oxidoreductasa C3&"# )3# 2"# )*?%1"# 6)34'*3";2)# /)2# 46',)3'# /)#/)(6"/",%>*#/)2#(2%-'3"&'#4'6#2"#6.&"#/)2#8,%do aminometilfosfónico (AMPA). Se observó 5.)#)2#(2%-'3"&'#)3#684%/"1)*&)#/)(6"/"/'#4'6# bacterias del suelo, el catabolismo de este her;%,%/"# 4.)/)# 46'/.,%63)# 4'6# 2"# 6.&"# /)# 2"# $OU# liasa (observada en Pseudomonas spAQ# '# 4'6# 2"#/)2#JqUJ#"#4"6&%6#Achromobacter sp. El gen gox:#,'/%0,"/'6#/)#2"#)*?%1"#(2%-'3"&'#'D%/'6)/.,&"3":#)3#';&)*%/'#"#4"6&%6#/)#2"#,)4"#LBAA de Achromobacter sp#7#4.)/)#3)6#%*,'64'6"/'# "2#()*'1"#9)()&"2#4"6"#3%*&)&%?"6#/%,@"#)*?%1"# 7# "3=# ,'*-)6%6# 6)3%3&)*,%"# 4'6# /)(6"/",%>*# /)2# 46%*,%4%'#",&%9'A La utilización del gen cp4 epsps#4"6"#';&)*,%>*#/)#42"*&"3#&6"*3(+*%,"3#&'2)6"*&)3#"#(2%-'3"&':#@"#6)3.2&"/'#183#)0,%)*&)#5.)#2"#/)2#()*# gox. Se han observado en varios casos que la )D46)3%>*#/)#)3&)#B2&%1':#)*#46)3)*,%"#/)2#@)6bicida, está asociada a síntomas que sugieren 0&'&'D%,%/"/#/)#2'3#46'/.,&'3#/)#/)(6"/",%>*A

EPSPS resistente a glifosato de la cepa CP4 de Agrobacterium tumefaciens (cp4 epsps). C2# ()*# 5.)# ,'/%0,"# 2"# CUGUG# 3)# ,2'*># %*%cialmente en bacterias y se demostró que el %*,6)1)*&'# /)# 3.# )D46)3%>*:# 2'(6"/'# 1)/%"*K)3"66'22'# /)# 46'/.,&'3# ,'1)6,%"2)3# 6)3%3&)# 2"# 2',"2%?",%>*# /)2# 1%31'# )*# .*# 42831%/'# 1.2&%,'4%":# ,'*0)6)# 6)3%3&)*,%"# "2# @)6;%,%/"A# tentes a glifosato ^, Sojac#46'1'&'6#\D^MG#R#3),.)*,%"#,'/%0G)# ';&.9%)6'*# "3=# 42"*&"3# &6"*3(+*%,"3# /)# cante cp4 epsps#I]WWYQA 4)&.*%"# 5.)# )D46)3";"*# .*#JKL,# ,'/%0,"*&)# ^, Canolac#U6'1'&'6#Eqk#IE%(r'6
'3"%,# 4"6"# 2"# 46)O46'&)=*"# ,'142)&"# CUGUG# /)# )3"# 9%6.3Q#R#3),.)*,%"#,'/%0,"*&)#cp4 epsps 1%31"# )34),%)# ;"*#46%1"6%"#,'146)*/)#)2#"1'*%'#'6%(%*"/'#"#4"6&%6#/)2#*%&6"&'#";3'6;%/'#/)2# 3.)2'#4'6#2"3#6"=,)3#7#2"#3),.*/"6%"#,'146)*/)# la reasimilación del amonio libre que se forma )*#2"#42"*&"#,'1'#,'*3),.)*,%"#/)#2"#/)"1%*",%>*#/)#"1%*'8,%/'3#7#2"#-'&'6)34%6",%>*A#C*# 2"3# 42"*&"3# &6"&"/"3# ,'*# (2.-'3%*"&':# 2"# %*@%;%,%>*# /)# 2"# 6)",,%>*# 5.)# 46'/.,)# (2.&"1%*"# "# 4"6&%6#/)2#(2.&"1"&'#,'*/.,)#"#.*"#684%/"#",.mulación de amonio, la fotosíntesis y la sínte3%3#/)#46'&)=*"3#/),6),)*A#C2#,'**#/)# Streptomyces hygroscopicus, se comercia2%?"# )*# s"4>*# /)3/)# ]WXZ# ;"#)*#CC__#2"#3'*#/)#",)tolactato sintetasa (ALS), es una enzima clave )*#2"#;%'3=*&)3%3#/)#2'3#"1%*'8,%/'3# 6"1%0,"dos leucina, valina e isoleucina (Fig. 3). Los herbicidas inhibidores de la AHAS se @"*# /%-.*/%/'# /);%/'# "# 5.)# 46)3)*&"*# 9"6%"3# ventajas: P# G)#.&%2%?"*#)*#/'3%3#1.7#;"*# /)# 2"# )*?%1"#JHJG# /)# Arabidopsis thaliana mostrando sus 4 sub-unidades idénticas. Fuente: Dr. Ronald G. Duggleby

Figura 4. G.;O.*%/"/#/)#JHJG#1'3&6"*/'#3.3#&6)3#3),&'6)3#*#/)#()*)3#)D&6"S'3#3%*'# que son mutantes seleccionados y desarrollados con variedades siguiendo el método clásico /)#0&'1)*# /)# ,+2.2"3# 3'18&%,"3# Sir-13 y 93R30B. Las sojas STS® (sulfonylurea-tolerant 3'7;)"*3Q# -.)6'*# ';&)*%/"3# )*# ]WW^# 4'6# 1+&'/'3#/)#3)2),,%>*#&6"/%,%'*"2#7#4'3))*#)2#()*# Als1#5.)#'&'6("#6)3%3&)*,%"#*"&.6"2#"#)3&)#&%4'# de herbicida. Mediante tratamientos mutagénicos de mi,6'34'6"3#7#4'3&)6%'6#,.2&%9'#7#3)2),,%>*#%*#9%&6':# 3)#@"*#';&)*%/'#42"*&"3#6)3%3&)*&)3#"#%1%/"?'2%nonas (colza), de esta misma manera, se obtu9%)6'*#42"*&"3#6)3%3&)*&)3#"#%1%/"?'2%*'*"3#4'6# 1.&"(+*)3%3# 5.=1%,"# /)# 3)1%22"3# 7# 4'3&)6%'6# 3)2),,%>*#"#,"14'#)*#"66'?:#&6%('#7#1"=?A#N)34),&'#/)#2"#';&)*,%>*#/)#42"*&"3#&6"*3(+*%,"3:# -.)6'*# ';&)*%/"3# 42"*&"3# /)# "2('/>*# 6)3%3&)*&)3#/);%/'#"#2"#)D46)3%>*#/)#.*"#JHJG#/)#&";",'#1.&"()*%?"/"#%*#9%&6'#7#2%*'#,'*#2"#)D46)3%>*# de una AHAS de Arabidopsis#344A# _$&!&#$"(!+,+,-+&,#%!+6!"+& !"#"4"6%,%>*#/)#2"#6)3%3&)*,%"#"#2"3#&6%"?%*"3# )*# "2(.*"3# )34),%)3# /)# 1"2)?"3:# "4'6&># .*"# ;.)*"#'4'6&.*%/"/#4"6"#/)3"66'22"6#,.2&%9'3#6)3%3&)*&)3#4'6#&+,*%,"3#/)#3)2),,%>*#,283%,"A##!"# -.)*&)#/)#()*)3#.&%2%?"/"#4'6#2'3#,6%"/'6)3#)3&";"#*'61"21)*&)#2%1%&"/"#4'6#2"3#;"66)6"3#6)46'/.,&%9"3#5.)#)D%3&)*#)*&6)#2"3#)34),%)3:#4)6'#2"# "4"6%,%>*#/)#.*#;%'&%4'#/)#Brassica campestris 6)3%3&)*&)# 4)61%&%># )2# /)3"66'22'# /)# 2"# ,"*'2"# 6)3%3&)*&)# "# 2"3# &6%"?%*"3A# C2# ,%&'42"31"# /)# B. Campestris resistente fue transferida a Brassica napus var. Oleífera#4'6#6)&6',6.?"3#,'1;%*"da con selección citogenética. Así OAC Triton® -.)#2"#46%1)6"#,"*'2"#6)3%3&)*&)#"#&6%"?%*"3#5.)# "4"6),%>#,'1)6,%"21)*&)#)*#$"*"/8A K)*&6'#/)#)3&)#(6.4':#2"#"&6"?%*"#)3#.*'#/)# los herbicidas más usados en el mundo, estos herbicidas son inhibidores fotosintéticos. Su

mecanismo de acción consiste en unirse a la 46'&)=*"# D1, ubicada en la membrana tilacoi/)#/)2#,2'6'42"3&':#%14%/%)*/'#"3=#3.#.*%>*#"#2"# 42"3&'5.%*'*"# 7# ;2'5.)"*/'# )2# &6"*34'6&)# /)# electrones hacia el Fotosistema I. La atrazina 3)#.3"#)*#,.2&%9'3#,'1'#1"=?#7#3'6(':#5.)#46)3)*&"*#6)3%3&)*,%"#"#2"#1%31"#4'6#&)*)6#,"4",%/"/#1)&";>2%,"#/)#/)&'D%0,"62'#4'6#1)/%'#/)# 2"#(2.&"&%'*O3O&6"*3-)6"3":#5.)#0;%,'3#,'1'#2"# atrazina. Este mecanismo, esta involucrado en el metabolismo de las triazinas y las cloracetanilidas. Una vez que el glutatión es unido al @)6;%,%/":#)3&)#3)#&6"*3-'61"#)*#.*#,'14.)3&'# no tóxico y es removido hacia la vacuola. Este )3#.*'#/)#2'3#1),"*%31'3#)*?%18&%,'3#/)#46'&),,%>*#-6)*&)#"#,'14.)3&'3#D)*';%>&%,'3:#.*"# de las estrategias de la resistencia a herbicidas. Selectividad por alteraciones en el sitio blanco del herbicida En el contexto de reiterado uso de triazinas )*# 1'*',.2&%9'# /)# 1"=?:# 3)# @"*# %/)*&%0,"/'# ;%'&%4'3#/)#1"2)?"3#,'*#6)3%3&)*,%"#"#2"3#1%3mas. Esta resistencia se basa en la alteración /)2#3%&%'#;2"*,'#/)#)3&'3#@)6;%,%/"3A#!"#46'&)=na D1# )3&8# ,'/%0,"/"# 4'6# )2# ()*# psb A, que )3&8# .;%,"/'# )*# )2# ()*'1"# /)2# ,2'6'42"3&'A# C*#9"6%"3#)34),%)3#9)()&"2)3#3)#@"#6)4'6&"/'# como base molecular de la resistencia a triazi*"3#.*"#1.&",%>*#/)#4.*&."2#)*#)2#,'/>*#264 /)2# 1)*,%'*"/'# ()*:# 5.)# 46'/.,)# .*"# 3.3titución de serina# 4'6# glicina# IE%(.6"# YQ# )*# 2"# -'61"# 6)3%3&)*&)A# _*# 6))142"?'# /)# isoleucina 4'6#Val219 en Poa annua#)3#2"#6)34'*3";2)#/)# 2"#6)3%3&)*,%"#/)#)3&)#;%'&%4'#"2#/%.6'*#7#1)&6%buzin. En Portulaca oleacea una sustitución de Ser264 a treonina#46'9))#6)3%3&)*,%"#"#2%*.6'*A# La resistencia de los inhibidores del fotosistema II basada en cambios del sitio de acción )3#/)#@)6)*,%"#1"&)6*":#4'6#3)6#'6%()*#/)#.*"# 1.&",%>*#/)2#JKL#/)2#,2'6'42"3&'A#C3&)#&%4'#/)# @)6)*,%"#)3#/)#;"*#7"# 5.)#*'#3)#/%3)1%*"*#4'6#1)/%'#/)2#4'2)*A !"#46'&)=*"#32 kDa#I46'&)=*"#/)#.*%>*#"#Qb o D1Q#-.)#%/)*&%0,"/"#,'1'#3%&%'#/)#.*%>*#/)#2"3# triazinas en Amaranthus hybridusA#C3&"#46'&)=na integra el núcleo del centro de reacción del Fotosistema II. En líneas resistentes de Amaranthus, se vio que las triazinas no se unían a

514 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

Figura 6. E6"(1)*&'#/)#2"#46'&)=*"#K]#5.)#)3#4.*&'#/)#.*%>*#/)#2"#42"3&'5.%*'*"#7#3%&%'#/)#",,%>*#/)#2"# s triazinas, mostrando la sustitución de serina#/)#2"#-'61"#3.3,)4&%;2)#4'6#glicina en la forma resistente a "&6"?%*":#)*#)2#,'/>*#\YZA#E.)*&)c#q"22'67OG1%&@:#\ffYA

2"#46'&)=*"#7#3)#)*,'*&6>#.*"#1.&",%>*#4.*&."2# de Ser a Gly#)*#2"#4'3%,%>*#\\XA#G)#';3)69"6'*# mutaciones similares de la Ser#\YZ#"#Gly en la 46'&)=*"# /)# ^\# hK"# /)# Chlamydomonas reinhardtii, Chenopodium album y Solanum nigrum. !"# ;B35.)/"# /)# 6)3%3&)*,%"# 4'6# %*()*%)6="# genética se ha orientado a la introducción de 46'&)=*"3#/)#^\#hK"#1.&"/"3#)*#42"*&"3#&6"*3(+*%,"3#7#"#2"#/)&'D%0,",%>*#/)#"&6"?%*"3#1)/%"*&)# 2"# %*&6'/.,,%>*# /)# .*# ()*# 5.)# ,'/%0,"# glutation-S-transferasa (GTS). El segundo enfoque ha dado mejores resultados. _$&!&#$"(!+,+,5!1%0D!I$"60"!#%!-0&, Los hidroxibenzonitrilos son también inhibi/'6)3#/)2#-'&'3%3&)1"#FF#)*#)34),%)3#/%,'&%2)/>*)"3A#U'6#)3&"#6"?>*:#,."*/'#3)#"42%,"*#3';6)# dicotiledóneas resistentes a los mismos, se suele incluir un herbicida de acción graminici/":#/)#1'/'#/)#"142%"6#)2#)34),&6'#/)#,'*&6'2# /)# 1"2)?"3A# G)# ';&.9%)6'*# 42"*&"3# &6"*3(+*%,"3#/)#"2('/>*:#,'2?"#7#&";",'#5.)#)D46)3"*# .*"# 3),.)*,%"# ,'/%0,"*&)# 4"6"# .*"# *%&6%2"3":#

obtenida de Klebsiella pneumoniae sub. sp. ozanaeA#C3&"3#42"*&"3#3'*#6)3%3&)*&)3#"#,"14'# a los herbicidas ioxynil y bromoxynil y han sido 2%;)6"/"3# ,'1)6,%"21)*&)# )*# "2(.*'3# 4"=3)3A# Al ser el glifosato menos costoso y de mayor )34),&6'# /)# ,'*&6'2# 5.)# 2'3# @%/6'D%;)*?'*%&6%los, en 2004 fue el último año de comercializa,%>*#/)#"2('/>*#bpL]#7#,'2?"#bpLA Resistencia a Dicamba Es un herbicida auxínico que se utiliza como 46)#7#4'3&#)1)6()*&)#)*#)2#,'*&6'2#/)#1"2)?"3# 2"&%-'2%"/"3#"*."2)3#7#4)6)**)3A#N),%)*&)1)*te se logró aislar el gen de la dicamba monooxigenasa (DMO) de Pseudomona maltophilia:#2"#,."2#,'*0)6)#&'2)6"*,%"#"#/%,"1;"A#C3&"# enzima está involucrada en la conversión del /%,"1;"# )*# .*# ,'14.)3&'# *'# &>D%,'# ,'1'# )2# 8,%/'#^:Y#/%,2'6'O3"2%,=2%,'A#!"#%*3)6,%>*#/)#)3&)# ()*# 46'9))# "# 2"3# 42"*&"3# 2"&%-'2%"/"3# 6)3%3&)*cia al herbicida. Actualmente se encuentra en /)3"66'22'#7#46',)3'#/)#%*3,6%4,%>*#)*#_GJ#2"# 3'*# /)# *.)9'3# '6("*%31'3# ()*+&%,"1)*&)# 1'/%0,"/'3# IoiqQ#)*#C.6'4"#!"#/)1"*/"#/)#2'3#46'/.,&'6)3# 4'6# 2'3# oiq# 4.)/)# 3)6# 1.7# "2&":# 4)6'# (2';"21)*&)#)2#,'146"/'6#/);)#&"1;%+*#*)(',%"6#6)34),&'#/)#2"#3%&.",%>*#/)#2'3#(';%)6*'3#7# 2"#3',%)/"/#4"6"#/)&)61%*"6#2"#9%";%2%/"/#/)#2'3# *.)9'3#)9)*&'3#&6"*3(+*%,'3A#!"#)D4"*3%>*#-.&.6"#)*#)3&"#86)"#/)4)*/)68#/)#,>1'#3)#6)34'*/"#"#)3&"3#,.)3&%'*)3A

Genes eucarióticos E.)6'*#';&)*%/"3#42"*&"3#/)#&";",'#5.)#)D46)3"*#.*"#(2.&"&%'*#GO&6"*3-)6"3"#/)#1"=?:#6)3%3&)*&)3# "# ,2'6'",)&"1%/"3:# 42"*&"3# &6"*3(+*%,"3#/)#4"4"#,'*#)D46)3%>*#,'*3&%&.&%9"#/)#^# 3),.)*,%"3# ,'/%0,"*&)3# 4"6"# ,%&',6'1'OUZMf# 1'*''D%()*"3"3# @.1"*"3A# G)# )D46)3># )*# 4"4":#;"D%,'#4"6"#,.2&%9'3:#1"1=-)6'3#)#%*9)6- Bijman, J and Bogaardt, MJ. 2000. AgrEvo &);6"/'3:#&)*)6#4',"#6)3%/."2%/"/#)*#)2#3.)2'#7# q'*'(6"4@A#L)&@)62"*/3c#J(6%,.2&.6"2#C,'*'1%,3# .*#,'3&'#/)#46'/.,,%>*#-"9'6";2)A#C*#)3&)#,'*Research Institute. Available on the World Wide Web at: @&&4cRR&),@*'2'(7A'4)*A",A.hR,&3R4%&"R texto, el desarrollo de cultivos con resistencia

516 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

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`)+&,1$,&$/+-!6+(!;",1$,-+&,%$&'7$&#+&P, Regulación de la expresión génica. !"3#42"*&"3#@"*#"/5.%6%/'#/.6"*&)#3.#)9'2.,%>*#2"#,"4",%/"/#/)#1'/%0,"6#)9)*&'3#)34),=0,'3#/)2#/)3"66'22'#,'1'#6)34.)3&"#"#2'3#,"1bios en las condiciones ambientales, y de este 1'/'#'4&%1%?"6#2"#.&%2%?",%>*#/)#2'3#*.&6%)*&)3# /%34'*%;2)3A# C3&"# 42"3&%,%/"/# 6)46)3)*&"# .*"# 9)*&"*#/)#2'3#()*)3#"#4"6&%6# /)#2'3#,."2)3#)3&"3#46'&)=*"3#3'*#3%*&)&%?"/"3A# !'3#46',)3'3#/)#",&%9",%>*#)#%*",&%9",%>*##3.)2)*#)3&"6#(';)6*"/'3#4'6#.*#2"/':#4'6#-",&'6)3# /)#&6"*3,6%4,%>*#7#4'6#'&6'#4'6#2"#46)3)*,%"#/)# )2)1)*&'3#46)3)*&)3#)*#2"3#6)(%'*)3#46'1'&'ras de los genes regulados. Además de este ni9)2#/)#6)(.2",%>*#/)#2"#)D46)3%>*#(+*%,"#I&6"*3,6%4,%'*"2Q:#)D%3&)*#'&6'3#4.*&'3#/)#6)(.2",%>*# 5.)#%*,2.7)*#2"3#9="3#/)#46',)3"1%)*&'#/)#2'3# JNL#1)*3"*# /)2# )3&6+3:# 2"# transducción de las señales, y la regulación de 2"#)D46)3%>*#/)#()*)3#)-),&'6)3A#C3&"3#,"3,"/"3#",&%9"*#1),"*%31'3#46'&),&'6)3#4"6"#6)3-

520 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

&";2),)6# 2"# @'1)'3&"3%3:# 7# 46'&)()6# 7# 6)4"6"6# biomoléculas y membranas dañadas (Figura ]QA#C*#,'*3),.)*,%":#2"#1"*%4.2",%>*#/)#()*)3# que ayuden a mantener las funciones de célu2"3# 7# ,'14'*)*&)3# 4'/6=":# )*# 46%*,%4%':# %*,6)1)*&"6#2"#&'2)6"*,%"#"#)3&6+3A#!"#1"7'6#4"6&)#/)# 2"3#)3&6"&)(%"3#)142)"/"3#4"6"#1)*#/)#4)602)3#/)#&6"*3,6%4&'3#7#"142%&./# ()*>1%,":#5.)#46'4'6,%'*"6'*#)2#,'*',%1%)*&'# %*/%34)*3";2)#4"6"#)2#/)3"66'22'#6",%'*"2#/)#&'lerancia a estrés. Diferentes fuentes de estrés (sequía, hela/"3:#3"2%*%/"/Q#/%34"6"*#.*"#6)34.)3&"#)*#,%)6&'#1'/'#B*%,":#5.)#4'3))#"#2"#9)?#)2)1)*&'3#

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 521

,'1.*)3#)#%/%'3%*,683%,'3#6)34),&'#"#'&6"3#6)34.)3&"3#7#"#9="3#1)&";>2%,"3#7#1'6-'()*+&%,"3# /)2# '6("*%31'A# CD%3&)# .*"# 3%(*%0,"&%9"# 3.4)64'3%,%>*#7#)*&6),6.?"1%)*&'#I/)2#%*(2+3#crosstalkQ#)*&6)#&"2)3#6)/)3#/)#/),%3%'*)3:#5.)#4.)/)# resultar sinérgica o antagónica. Aunque esta ';3)69",%>*# ";6)# 4'3%;%2%/"/)3# /)# ';&)*)6# &'lerancia cruzada a diferentes fuentes de estrés mediante una única intervención transgénica, también limita el número de intervenciones úti2)3:#7#"#1)*./'#6)5.%)6)#.*"#6)(.2",%>*#3'03&%,"/"#/)2#&6"*3(+*#4"6"#46)9)*%6#%14",&'3#%*/)seables en el crecimiento y desarrollo vegetal. Las estrategias de ingeniería genética em42)"/"3#4"6"#%*,6)1)*&"6#2"#3.4)69%9)*,%"#;"*#/)#3)S"2)3#/)#2"#6)34.)3&"#@"*#3%/'#%/)*&%0,"/'3#7# caracterizados exhaustivamente, incluyendo -'3-'2%4"3"3# 7# 5.%*"3"3# /)# 46'&)=*"3# 4)6&)*)cientes a las familias MAP (del inglés mitogenactivated protein), y SOS (del inglés salt-overlysensitiveQA#U.)3&'#5.)#'4)6"*#)*#.*#*%9)2#"2&'# /)# 2"# ,"3,"/"# /)# /),%3%'*)3# /)# 2"# 6)34.)3&":# ,'*3&%&.7)*# 4'6# /)0*%,%>*# )D,)2)*&)3# 4.*&'3# /)# %*&)69)*,%>*# 4"6"# ';&)*)6# &'2)6"*,%"# ()*)6"2%?"/"A#k"6%'3#/)#)3&'3#()*)3#@"*#3%/'#%*&6'/.,%/'3#)*#42"*&"3#6)3.2&"*/'#)*#2=*)"3#,'*#-)*'&%4'3#&'2)6"*&)3#"#/%9)63"3#-.)*&)3#/)#)3&6+3A J#&=&.2'#/)#)*#/)#2"#6)34.)3&"# "1;%)*&"2# 7# )2# 46'(6"1"# 1'6-'()*+&%,'# /)# 2"#42"*&"A#G)#&6"&"#/)#46'&)=*"3#5.)#",&B"*#)*# trans:# ,"4",)3# /)# 6),'*',)6# ;2"*,'3# /)# 3),.)*,%"3# )34),=0,"3# /)#JKL# I)2)1)*&'3# cis) 2',"2%?"/"3#)*#2"3#6)(%'*)3#46'1'&'6"3#/)#/)&)61%*"/'3# ()*)3A# !"# 6)(.2",%>*# /)# 2"# )D46)sión génica está gobernada en gran medida 4'6#2"#%*&)6",,%>*#/)#2'3#ET3#,'*#)3&"#,2"3)#/)# elementos cis:#%*/.,%)*/'#'#6)46%1%)*/'#/%3&%*tas vías de transducción de señales a través de un efecto dominó. C*# 42"*&"3:# 3)# @"*# %/)*&%0,"/'# 7# ,"6",&)6%?"/'#*.1)6'3'3#()*)3#5.)#,'/%0,"*#ET3A#K)# hecho, en Arabidopsis thaliana y Oryza sativa, ,.7'3# ()*'1"3# -.)6'*# ,'142)&"1)*&)# 3),.)*,%"/'3:#3)#%/)*&%0,"6'*#.*'3#]Mff#()*)3# 5.)#,'/%0,"6="*#ET3A#C3&"#%/)*&%0,",%>*#3)#6)"2%?>#)*#;"3)#"#2"#46)3)*,%"#/)#/'1%*%'3#'#1'tivos conservados, y caracterizados funcionalmente en FTs de otros reinos. Sin embargo, en 42"*&"3:#*'#183#/)#.*#]f#g#/)#)3&"3#3),.)*cias han sido aisladas y estudiadas fehacientemente, asignándoles la función de FT a las 46'&)=*"3# ,'/%0,"/"3A#J/)183# 3)# /);)# &)*)6# )*# ,.)*&"# 5.)# 2"# 3%1%2%&./# )*&6)# 46'&)=*"3# /)# '6("*%31'3#5.)#4)6&)*),)*#"#/%3&%*&'3#6)%*'3:# *'#*),)3"6%"1)*&)#%142%,"#5.)#3)#)*,.)*&6)*# involucradas en la regulación de los mismos eventos. !'3#ET3#9)()&"2)3#3)#,2"3%0,"*#)*#-"1%2%"3#7# subfamilias de acuerdo al grado de conservación de la secuencia de aminoácidos, al tamaS':#7#"#2"#,'14'3%,%>*#)3&6.,&.6"2#/)#2'3#()*)3# ,'/%0,"*&)3A

522 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

Algunos FTs fueron caracterizados funcionalmente y, en casi todos los casos, se observó que intervienen en varias vías se señalización. J3=# 4'6# )&%,'n# 1%)*&6"3#5.)#2"3#46'&)=*"3#/)#2"#-"1%2%"#wNty# 3)#6)2",%'*"*#&"*&'#,'*#2"#6)34.)3&"#"2#"&"5.)# 4'6#'6("*%31'3#4"&>()*'3:#,'1'#"#2"#6)34.)3ta frente a estrés abiótico. En las estrategias donde los FTs vegetales @"*#3%/'#3';6))D46)3"/'3:#)D46)3"/'3#/)#1"*)6"# ),&>4%,":# '# 3%2)*,%"/'3:# 3)# ';3)69># 5.)# 2"3# 42"*&"3# &6"*3-'61"*&)3# 46)3)*&";"*# 6)34.)3&"3#"2&)6"/"3#"#2"3#,'*/%,%'*)3#1)/%'"1;%)*&"2)3:#&"*&'#4'6#2"#",,%>*#/)#-",&'6)3#;%>&%cos como abióticos (ver Tabla 2). En algunos ,"3'3#2"#/.42%,",%>*#'#&6%42%,",%>*#/)#()*)3#5.)#

,'/%0,";"*# 46'&)=*"3# /)# &%4'# wNty:# 46'9',># 2"#-"2&"#/)#6)34.)3&"#)*#1.&"*&)3#3%2)*,%"/"3A# C*#'&6'3:#3)#';&.9%)6'*#42"*&"3#,'*#6)34.)3&"3# 1)&)3%3# /)# 5.)# 2'3# -",&'6)3# /)# &6"*3,6%4,%>*# ",&B"*# 3%1.2&8*)"mente en diferentes vías de señalización. K)*&6'# /)# 2'3# ET3# )34),=0,"1)*&)# 9%*,.2"/'3#"#6)34.)3&"3#"1;%)*&"2)3:#)D%3&)#.*#(6.4'# de genes bien caracterizados cuya acción se ubica en el inicio de la cascada de señalización )*#6)34.)3&"#"#)3&6+3#";%>&%,'A#C3&)#(6.4'#3)# )*,.)*&6"#6)46)3)*&"/'#4'6#Rd29A de A. thalianaA#C*#2'3#46'1'&'6)3#/)#2'3#()*)3#/)#)3&)# (6.4'#3)#%/)*&%0,"6'*#2"3#3),.)*,%"3#/)*'1%nadas ABRE (del inglés ABA-responsive element, )2)1)*&'# /)# 6)34.)3&"# "#JbJQ# 7# KNCR CRT (dehydration-responsive element/C-re-

Tabla 2.# o;&)*,%>*# /)# 42"*&"3# &'2)6"*&)3# "# /+0,%&# @=/6%,'# .&%2%?"*/'# -",&'6)3# /)# &6"*3,6%4,%>*# /)# '6%()*# 9)()&"2#IJ/"4&"/"#/)#_1)?"r"#7#,'2A:#\ff[Q Clasificación

Nombre del gen

Planta transformada

Planta de la cual proviene el gen

Familia AP2/ERF DREB1/CBF DREB1/CBF

DREB1A/CBF3 DREB1A/CBF3

Arabidopsis Arabidopsis

Arabidopsis Ara bidopsis

DREB1/CBF DREB1/CBF DREB1/CBF DREB1/CBF AP2/ERF DREB1/CBF

DREB1B/CBF1 CBF4 ZmDREB1A DREB1C/CBF2 SHN1/WIN1 DREB1A/CBF3

Tomat e Arabidopsis Arabidopsis Arabidopsis Arabidopsis Trigo

Arabidopsis Arabidopsis Maíz Arabidopsis Arabidopsis Arabidopsis

DREB1/CBF

DREB1A/CBF3

Tabaco

Arabidopsis

DREB1/CBF AP2/ERF DREB2

DREB1A/CBF3 WXP1 DREB2A (forma active con deleción interna)

Arroz Alfalfa Arabidopsis

Arabidopsis M. truncatula Arabidopsis

ABF3, AREB2/ABF4 AREB1/ABF2 ABF3 AREB1/ABF2 (forma active con una deleción interna) AREB1/ABF2 (forma active fosforilada)

Arabidopsis Arabidopsis Arroz Arabidopsis

Arabidopsis

AtMYC2, AtMYB2 CpMYB10 AtMYB60

Arabidopsis Arabidopsis Arabidopsis

ZPT2-3 CAZFP1 STZ

Petunia Arabidopsis Arabidopsis

HAHB4

Arabidopsis y maíz

Proteínas con dominio básico asociado a cierre de leucinas (bZIP) bZIP bZIP bZIP bZIP

bZIP)

MYB/MYC MYB, MYC MYB R2R3 -MYB Proteínas con dedos de zinc Cys2His2-type Cys2His2-type Cys2His2-type HD- Zip (homeodominio asociado a cierre de leucinas)

ANAC019/055/ 072

Sistema de expresión

Experimentos realizados

Parámetros medidos

Año

CaMV35SP Arabidopsis RD29AP CaMV35SP CaMV35SP CaMV35SP Knock out CaMV35SP Arabidopsis RD29AP Arabidopsis RD29AP MaízUbi -1P CaMV35SP CaMV35SP, Arabidopsis RD29AP

Retención de agua Retención de agua

Supervivencia Supervivencia

1998 1999

Retención de agua Retención de agua Disecación Disecación Retención de agua Retención de agua

Crecimiento y desarrollo Supervivencia Electrolitos Supervivencia Desarrollo Supervivencia

2002 2002 2004 2004 2004 2004

Retenció n de agua

Superviven cia y fototsíntesis

2004

Arabidopsis Arabidopsis Arabidopsis Arabidopsis

CaMV35SP CaMV35SP Maíz Ubi -1P CaMV35SP

Retención de agua Retención de agua Retención de agua Retención de agua, deshidratación

Arabidopsis

CaMV35SP

deshidratación

Retención de agua Retención de agua Retención de agua

Supervivencia Supervivencia Supervivencia

Crecimiento y supervivencia Supervivencia Fotosíntesis y supervivencia Supervivencia

2005 2005 2005

2002 2004 2005 2005

2005 Supervivencia

Arabidopsis C. plantagineum Arabidopsis

CaMV35SP CaMV35SP ARN de interferencia

Tratamiento con manitol Retención de agua Retención de agua

CaMV35SP CaMV35SP CaMV35SP

Deshidratac ión Retención de agua Retención de agua

girasol

CaMV35SP y promotor HAHB4

Deshidratación, ataque con insectos, retención de agua

Arabidopsis

CaMV35SP

Retención de agua

Petunia Pimie nto Arabidopsis

Electrolyte leakage Supervivencia, crecimiento y retención de agua

Supervivencia Supervivencia, contenido de clorofila Supervivencia, conductancia Supervivencia, área foliar, turgencia, desarrollo

2002 2004 2005

2003 2004 2004

2004

Arabidopsis Supervivencia

Otros NAC

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 523

peat, )2)1)*&'#/)#6)34.)3&"#"#/)3@%/6"&",%>*QA# Los FTs de la familia EREBE/AP2 unen las se,.)*,%"3# /)# &%4'# KNCR$NT# 7# 2'3# /)# 2"# -"1%2%"# ;O†FU# 2'3# )2)1)*&'3# JbNCA# !"# )D46)3%>*# /)# los genes de la familia EREBE/AP2 se induce "#;"*#/)#46'2%*"#7#)2#".1)*&'#/)# 2"#",&%9%/"/#,"&"2"3":#5.)#46'9',"#2"#6)/.,,%>*# en la acumulación de H2O2. Es interesante destacar que la transformación cruzada con genes homólogos de arroz dio como resultado el mis1'#)-),&'#46'&),&'6A _*#ET#5.)#",&B"#4'6#.*#1),"*%31'#/%-)6)*&)#)3#wpU]#4)6&)*),%)*&)#"#2"#-"1%2%"#JU\#/)# Medicago truncatulaA# $."*/'# 3)# )D46)3># /)# 1"*)6"# ),&>4%,"# )*# "2-"2-":# 2"3# 42"*&"3# &6"*3-'61"/"3#46)3)*&"6'*#&'2)6"*,%"#"#/+0,%&#@=/6%,'#9="#2"#3';6)46'/.,,%>*#/)#,)6"#)*#2"3#@'*# 4'6# &6"*34%6",%>*A# o&6'# )*# ,'*3&%&.&%9"# /)2# ()*# 46'9',># ,"1;%'3# 1'6-'2>(%,'3# 7# retraso en el desarrollo, eventos indeseables /)3/)# )2# 4.*&'# /)# 9%3&"# "(6'*>1%,'A# !"# ,'142)()*"3:#"2#1)*'3#)*#Arabidopsis. L.)9"1)*&):#2"#.&%2%?",%>*#/)#46'1'&'6)3#%*/.,%;2)3#)*#6))142"?'#/)#2'3#,'*3&%&.&%9'3#46)senta una alternativa viable. Cuando se modi0,"*#2'3#-",&'6)3#"/),."/'3:#2"#1'6-'2'(="#7#)2# 46',)3'#/)#/)3"66'22'#3)#&'6*"*#%*/%3&%*(.%;2)3# /)#2"3#42"*&"3#,'*&6'2)3#3%*#&6"*3-'61"6:#"2,"*zando buenos niveles de tolerancia. H%0#$)"+&,A7$,(0"*$%$",#0-$%+"(!+,+, estrés Muchas situaciones adversas como la se5.=":# )2# ,"2'6# )D&6)1'# 7# 2"# 3"2%*%/"/:# 4.)/)*# causar desnaturalización e inactivación de ;%'1'2+,.2"3A#!"3#HGU:#2"3#46'&)=*"3#!CJ#I22"1"/"3#"3=#4'6#3.#";.*/"*,%"#)*#2"#)1;6%'(+nesis tardía, del inglés late-embryogenesisabundantQ# 7# 2"3# ,@"4)6'*"3# 1'2),.2"6)3:# 3'*# ,"4",)3#/)#3.1%*%3&6"6#46'&),,%>*#,'*&6"#)3&'3# )-),&'3#-"9'6),%)*/'#)2#"/),."/'#42)("1%)*&'# 7# )*3"1;2"/'# /)# )*?%1"3# 7# '&6"3# 46'&)=*"3A# Los resultados de algunos ensayos señalan .*"#,'66)2",%>*#4'3%&%9"#)*&6)#2'3#*%9)2)3#/)#9"6%"3#,@"4)6'*"3#7#2"#&'2)6"*,%"#"#)3&6+3A#G)#';3)69>#&"1;%+*#5.)#2"#)D46)3%>*#/)#)3&'3#()*)3# )3# %*/.,%/"# /.6"*&)# )4%3'/%'3# /)# "/9)63%/"/# ambiental, y varios de ellos han sido utilizados 4"6"# /%3)S"6# 7# ()*)6"6# 42"*&"3# &6"*3(+*%,"3# &'2)6"*&)3# I9)6#T";2"# ]QA# U'6# )*# ".1)*&"/"# EROS también resulta frecuente frente a muchas situaciones de estrés. Las EROS cum42)*#.*#/';2)#6'2c#4"6&%,%4"*#)*#2"#&6"*3/.,,%>*# /)#3)S"2)3:#4)6'#"2#1%31'#&%)14'#,'*&6%;.7)*# "2#/"S'#4'6#'D%/",%>*#/)#1)1;6"*"3#7#;%'1'2+,.2"3:# )2# ,."2# )3# 6)34'*3";2)# /)# (6"*# 4"6&)# /)2#/)&)6%'6'#5.)#3.-6)#2"#42"*&"A#U'6#2'#&"*&':#2"# 1"*%4.2",%>*# /)# )*?%1"3# "*&%'D%/"*&)3# ,'1'# 4)6'D%/"3"3#7#/%31.&"3"3#'-6),)#'&6"#'4'6&.*%/"/#4"6"#46)9)*%6#2'3#/"S'3#'D%/"&%9'3#',"3%'*"/'3#4'6#)2#/)3"-='#"1;%)*&"2A#U'6#/)3(6",%":# 2"# "42%,",%>*# /)# )3&"# )3&6"&)(%"# )3&8# 2)2%,":#2%1%&"*/'#)2#4'&)*,%"2# de este enfoque. !'3# %*&)*&'3# /)# 3';6))D46)3"6# &6)@"2'3"# 7# 1"*%&'2#)*#"66'?#7#1"=?:#6)34),&%9"1)*&):#,'*dujeron a aumentos moderados en los niveles /)#)3&'3#,'14.)3&'3#,."*/'#3)#1"*%4.2>#.*"# B*%,"# )*?%1"A# !"# 1'/%0,",%>*# /)# 9"6%"3# )&"4"3#/)*&6'#/)#.*"#1%31"#9="#4.)/)#"7./"6#"2# ,'*&6'2#/)#2'3#`.*# /)# 4)602)3# 1)&";>2%,'3# (2';"2)3# )*# 42"*&"3# 3)# @"# ,'*9)6&%/'# )*# .*"# @)66"1%)*&"# %146)3,%*/%;2)#4"6"#,'146)*/)6#,"1;%'3#%*/.,%/'3#4'6#)3&6+3#)*#1)&";'2%&'3#46'&),&'6)3A Estrategias sustitutivas Un elemento común a muchas situaciones de )3&6+3#5.)#@"#3.6(%/'#/)#2'3#"*82%3%3#/)#"142%tud genómica en Arabidopsis es la declinación .*%9)63"2#/)#2"#46'&)=*"#/)#@%)66'O"?.-6)#-)66)doxina (Fd), resultado que además se ha con061"/'#4'6#)*3"7'3#;%'5.=1%,'3A#E/#*# de CO2, la asimilación de nitrógeno y azufre, el metabolismo de aminoácidos y la desaturación /)#8,%/'3#(6"3'3A#J/)183#4"6&%,%4"#)*#9"6%'3# 46',)3'3#6)(.2"&'6%'3#I9="#&%'66)/'D%*"Q:#/%3%4"&%9'3#7#1'6-'()*+&%,'3#I3=*&)3%3#/)#0&',6'1'3#7# de ácido jasmónico). La regulación negativa de 2"# )D46)3%>*# 1)/%"*&)# .*#JNL# "*&%3)*&%/'# @"# 4)61%&%/'#';3)69"6#2'3#)-),&'3#*)("&%9'3#/)#2"# ,"=/"#/)#E/c#2"3#42"*&"3#46)3)*&"6'*#-)*'&%4'3# cloróticos y enanos, indicando que su disminu,%>*# 4.)/)# 3)6# )D&6)1"/"1)*&)# /"S%*"# 4"6"# un organismo sometido a estrés. Por lo tanto, E/#,'*3&%&.7)#.*#)D,)2)*&)#,"*/%/"&'#4"6"#%*tervenciones transgénicas. K)3"-'6&.*"/"1)*&):#2"#4'3%;%2%/"/#/)#%*,6)mentar el contenido de Fd mediante ingeniería ()*+&%,"#)3&8#2%1%&"/"#4'6#2"#-.)6&)#6)(.2",%>*# 4'3&6"*3,6%4,%'*"2#/)#2"#)D46)3%>*:#5.)#/)4)*de de secuencias ubicadas dentro de la región ,'/'(+*%,":# 2'# 5.)# @",)# 9%6&."21)*&)# %14'3%ble la mutagénesis. Una alternativa atractiva

46'9%)*)#/)#)3&./%'3#6)"2%?"/'3#)*#1%,6''6("nismos fotosintéticos, cianobacterias y algas. C3&'3# '6("*%31'3:# "2# %(."2# 5.)# 2"3# 42"*&"3:# )3&8*# 3'1)&%/'3# "# )3&6+3# "1;%)*&"2# )34),%"2mente en los océanos donde las condiciones suelen ser extremas, y sufren disminuciones /)2#1%31'#&%4'#)*#2'3#*%9)2)3#/)#E/A En tales condiciones, algas y cianobacterias 6)34'*/)*# "2# /)3"-='# "1;%)*&"2# 1)/%"*&)# )3&6"&)(%"3# 3.3&%&.&%9"3A# G)# &6"&"# /)2# 6))142"?'# /)#2"3#46'&)=*"3#28;%2)3#"2#)3&6+3#4'6#'&6"3#6)3%3&)*&)3:# 1)/%"*&)# 2"# %*/.,,%>*# /)# 2"# )D46)3%>*# /)# 2'3# ()*)3# 5.)# 2"3# ,'/%0,"*A# C2# 6))142"?'# 183# ,'*34%,.'# )3# 46),%3"1)*&)# )2# /)# E/#4'6#`"9'/'D%*"#IE2/Q:#.*"#`"9'46'&)=*"#3'2.;2)# 5.)# ,'*&%)*)# 1'*'*.,2)>&%/'# /)# `"9%*"# 7# ,.7"3# 46'4%)/"/)3# ,'1'# &6"*34'6&"/'6"# /)# )2),&6'*)3# 3'*# 468,&%,"1)*&)# %/+*&%,"3# "# 2"3# de Fd. Sin embargo, a diferencia de Fd que se )*,.)*&6"#"142%"1)*&)#/%3&6%;.%/"#)*#42"*&"3:# "*%1"2)3#7#;",&)6%"3:#E2/#@"#/)3"4"6),%/'#/)2# ()*'1"#/)#2'3#).,"6%'&)3#3.4)6%'6)3:#%*,2.7)*/'#42"*&"3:#7#3.3#,'*3%/)6";2)3#9)*&"*#/)#2"#&%)66"#061)A C3# %*&)6)3"*&)# @",)6# *'&"6# 5.)# "# 4)3"6# /)# 2'3#)'*)3#/)#/%9)6()*,%"#)9'2.&%9"#)*&6)#42"*&"3#7#,%"*';",&)6%"3:#2"#46'&)=*"#E2/#"%32"/"#/)# )3&"3#B2&%1"3#)3#,"4"?#/)#%*&)6",&."6#46'/.,&%vamente con las enzimas homólogas, sugirien/'# 5.)# 4'/6="*# ",&."6# ,'66%(%)*/'# 2"3# ,'*3)cuencias negativas de la disminución de Fd en 42"*&"3#)3&6)3"/"3A Efectivamente, líneas transgénicas de tabaco que acumulan una Fld de cianobacteriana )*# ,2'6'42"3&'3# /)3"66'22"6'*# &'2)6"*,%"# ".mentada a diversas fuentes de estrés abiótico (incluyendo sequía, radiaciones, heladas, altas &)14)6"&.6"3# 7# "2&"# 2.?Q:# "3=# ,'1'# &"1;%+*# "# los efectos tóxicos del herbicida de contacto 4"6"5."#"#*%&6'/)6%9"/'3A#!"#&'2)6"*,%"#/)3"66'22"/"# -.)# /)4)*/%)*&)# /)# 2"# /'3%3:# 7# /)# 2"#,"4",%/"/#/)#2"#E2/#&6"*3(+*%,"#/)#%*&)6",&."6#,'*#2'3#3%3&)1"3#)*/>()*'3#/)#&6"*34'6&)# )2),&6>*%,':#6))142"?"*/'#"#E/#"#1)/%/"#5.)# esta declina como consecuencia del estrés. N)3.2&"/'3# 46)2%1%*"6)3# %*/%,"*# 5.)# 2'3# 1%31'3# *%9)2)3# /)# &'2)6"*,%"# 4.)/)*# ';&)*)63)# en cultivos de interés agronómico como maíz, ,);"/":#,'2?":#&'1"&)#7#4"4"#IT";2"#^QA

526 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

T";2"#^A#o;&)*,%>*#/)#42"*&"3#&'2)6"*&)3#"#/+0,%&#@=/6%,'#.3"*/'#,'1'#@)66"1%)*&"3#()*)3#%*9'2.,6"/'3# )*#2"3#9="3#/)#3)S"2%?",%>*#I"/"4&"/"#/)#_1)?"r"#7#,'2A:#\ff[Q Nombre del gen

Planta transformada

Planta de la cual fue aislado el gen

Sistema de expresión

Experimentos realizados

Parámetros medidos

Año

Proteinasquinasas CDPK

OsCDPK7

Arroz

Arroz

CaMV35SP

Retención de agua

2000

GSK3/Shaggy MAPKKK SnRK2

AtGSK1 NPK1 SRK2C

Arabidopsis Maíz Arabidopsis

Arabidopsis Tabaco Arabidopsis

CaMV35SP CaMV35SP CaMV35SP

Retención de agua Estrés hídrico Retención de agua

Crecimiento del tallo, expresión génica, marchitez, Supervivencia Número de hojas, tamaño de fruto Supervivencia, expression génica

Otros Medidor de calcio

CBL1

Arabidopsis

Arabidopsis

Retención de agua

Supervivencia, expression génica

2003

14-3-3 Proteina

GF14l

Algodón

Algodón

Agrobacterium MAS CaMV35SP

Retención de agua

2004

CC-NBS-LRR Farnesyltransferasa

ADR1 ERA1

Arabidopsis Arabidopsis, canola

Arabidopsis Arabidopsis

Senescencia, contenido de clorofila, fotosíntesis Supervivencia, expression génica Supervivencia, pérdida de agua, productividad de semilla, contenido de aceite

Clasificación

CaMV35SP CaMV35SP/ RD29AP (antisentido)

Retención de agua Retención de agua, ensayos a campot

2001 2004 2004

2004 2005

Del laboratorio al campo C*# 2"# ';&)*,%>*# /)# &'2)6"*,%"# "# ,"14':# )2# 46'*>3&%,'#3)#,'142%,"#"B*#183#/"/'#5.)#2"3# 42"*&"3#)*#3.#"1;%)*&)#*"&.6"2#)3&8*#3'1)&%/"3# a varias adversidades en forma simultánea, en lugar de una sola condición (tal como se estudia )*#)2#2";'6"&'6%'QA#C3&'#4.)/)#"(6"9"6#)2#/"S'# 5.)#3.-6)#4'6#)2#'6("*%31'#7#"2#1%31'#&%)14':# /)3)*,"/)*"6#6.&"3#46'&),&'6"3#/%-)6)*&)3#)#%*,2.3'#'4.)3&"3A#U'6#)*A# G%*# )1;"6(':# ,"2'6# 7#/)0,%)*,%"#/)#"(."#*'61"21)*&)#9"*#*# 2)&"2# /)# 9"6%'3#&%4'3#/)#)3&6+3A# _*"#)3&6"&)(%"#4'3%;2)#3)6="#2"#/)#"*"2%?"6#2"# )D46)3%>*#(+*%,"#)*#42"*&"3#5.)#"2#3)6#3'1)tidas a una combinación de estreses severos, 3';6)9%9"*#'#2'3#&'2)6)*#1)*# "# )3&)# ,'*,)4&'# 4'/)1'3# /)0*%6# 2'3# metabolitos secundarios como todos aquellos ,'14.)3&'3#5.)#*'#3'*#)3)*,%"2)3#per se#4"6"# 2"3# -.*,%'*)3# 9%&"2)3# /)# 2"3# 42"*&"3:# 4)6'# 5.)# *#/)#2'3# metabolitos secundarios es actuar como me/%"/'6)3#)*#2"3#%*&)6",,%'*)3#)*&6)#2"3#42"*&"3# y su medio ambiente. Muchos de estos com4.)3&'3#,.142)*#-.*,%'*)3#/)#/)-)*3"#,'*&6"# 46)/"/'6)3#7#4"&>()*'3:#",&B"*#,'1'#"()*&)3# "2)2'48&%,'3# I,'14.)3&'3# 5.)# 3'*# 2%;)6"/'3# 4"6"#)2%,'3# derivados de la vía del shikimato o del malonato. P# "2,"2'%/)3:#,'14.)3&'3#*%&6'()*"/'3#/)rivados de aminoácidos. !"# %14'6&"*,%"# ),'*>1%,"# /)# 2'3# 1)&";'2%tos secundarios se ha acrecentado en los últimos años, y ello ha estimulado el interés en )2# )3&./%'# /)# 3.# 1)&";'2%31'# 7:# )*# 4"6&%,.2"6:# )*# 2"# 1'/%0,",%>*# /)# ,%)6&"3# 6.&"3# ;%'3%*&+&%cas mediante técnicas de ingeniería genética. U'6# '&6"# 4"6&):# .*# 1"7'6# ,'*',%1%)*&'# /)# 2"3# 46'4%)/"/)3#;%'2>(%,"3#/)#1.,@'3#1)&";'2%&'3# secundarios ha llevado a la revalorización de )3&'3#,'14.)3&'3#,'1'#-.)*&)#/)#*.)9"3#/6'("3# 7# ,'14.)3&'3# /)# .&%2%/"/# 4"6"# 2"3# %*/.3trias farmacéutica (antibióticos, anticanceríge*'3Q:# "(6'4),."6%"# I%*3),&%,%/"3:# @)6;%,%/"3Q:# "2%1)*&%,%"# I4%(1)*&'3:# 3";'6%?"*&)3:# ,'*3)6vantes) y cosmética (esencias colorantes), entre otras. Ingeniería genética del metabolismo secundario en plantas. !"# %*()*%)6="# 1)&";>2%,"# 3)# 4.)/)# /)0*%6# como el redireccionamiento de una o más reacciones enzimáticas en una vía biosintética 4"6"# 46'/.,%6# *.)9'3# ,'14.)3&'3:# ".1)*&"6# 2"#46'/.,,%>*#/)#,'14.)3&'3#46))D%3&)*&)3:#'# /%31%*.%6#2"#46'/.,,%>*#/)#,'14.)3&'3#*'#/)3)"/'3A#G)#&6"&"#/)#.*#,"14'#/)#"42%,",%>*#6)2"&%9"1)*&)#*.)9'#5.)#)3#1.7#/)4)*/%)*&)#/)2# ,'*',%1%)*&'# ;%'5.=1%,'# 7# 03%'2>(%,'A# K);%/'# al uso de trazadores radioactivos, ya hacia ]W[M#3)#/%34'*="#/)#*',%'*)3#()*)6"2)3#"/),."/"3#3';6)#2"#6)2",%>*#46'/.,&'O3.3&6"&'#)*# 1.,@"3#9="3#1)&";>2%,"3A#C2#/)3"66'22'#684%/'# /)# )3&)# ,"14'# ',.66%># "# 4"6&%6# /)# 2"# /%34'*%bilidad de herramientas de biología molecular, ,'1'#)2#,2'*"/'#/)#()*)3:#)2#.3'#/)#46'1'&'res y las técnicas de transformación, las cuales

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 529

Figura 1. Vías generales del metabolismo secundario de las plantas.#G)#46)3)*&"*#2"3#&6)3# 46%*,%4"2)3#9="3#;%'3%*&+&%,"3#/)#2'3#1)&";'2%&'3#3),.*/"6%'3c#&)64)*'3:#,'14.)3&'3#-)*>2%,'3#'# -)*%246'4"*'%/)3#7#46'/.,&'3#*%&6'()*"/'3#'#"2,"2'%/)3A 4)61%&%)6'*# )D42'6"6# 2'3# 1),"*%31'3# 1'2),.2"6)3#5.)#6)(.2"*#2"#46'/.,,%>*#/)#1)&";'2%&'3# 3),.*/"6%'3A#K)#)3&"#-'61":#"#4"6&%6#/)#2"#/+,"/"#/)#2'3#Xf:#3)#2'(6>#.*#46'(6)3'#3%(*%0,"&%9'# en la disección de muchas vías biosintéticas y )*#2"#3';6))D46)3%>*#/)#()*)3#@)&)6>2'('3:#2'# 5.)#4)61%&%>#2'3#46%1)6'3#"9"*,)3A#K)3/)#)*tonces se han logrado numerosos resultados exitosos y un número aún mayor de resultados *'#)34)6"/'3A#C2#,'*',%1%)*&'#("*"/'#@"#,'*ducido a concebir el funcionamiento del metabolismo como el de una gran red de reacciones 5.=1%,"3#%*&)66)2",%'*"/"3:#)*#5.)#2"#1'/%0,",%>*# /)# .*# 3>2'# ,'14'*)*&)# 4.)/)# 46'/.,%6# .*# %14",&'# ,'*3%/)6";2)# )*# )2# 1)&";'2%31'# de todo el organismo. Aún así, el metabolis1'# 3),.*/"6%'# )3# .*# ;2"*,'# 4"6&%,.2"61)*&)# "&6",&%9'# 4"6"# 1)*# /)# .*# *.)9'# ,'14.)3&'# 5.)# *'# )3# *"&.6"21)*&)# 46'/.,%/'# 4'6#2"#1%31"A# U"6"# ".1)*&"6# 2"# 46'/.,,%>*# /)# .*# ,'14.)3&'#)3#*),)3"6%'#".1)*&"6#3.#;%'3=*&)3%3#'# disminuir su catabolismo. El aumento de la bio3=*&)3%3# 4.)/)# 6)"2%?"63)# 4'6# 3';6)46'/.,,%>*# /)#2"3#)*?%1"3#%142%,"/"3#)*#2"#9="#;%'3%*&+&%,"# '#;%)*#4'6#%*@%;%,%>*#/)#.*"#9="#,'14)&%&%9"#5.)# aumenta indirectamente la síntesis del com4.)3&'# 4'6# 6)/%6),,%'*"1%)*&'# /)# 1)&";'2%&'3A# !"# /%31%*.,%>*# /)2# ,"&";'2%31'# 3)# 2'(6"# 4'6# /%31%*.,%>*# /)# 2"# 46'/.,,%>*# /)# )*?%1"3# 5.)# .&%2%?"*# )2# ,'14.)3&'# /)3)"/'# 4"6"# 2"# ';&)*,%>*#/)#'&6'3#,'14.)3&'3A U"6"#/%31%*.%6#2"#46'/.,,%>*#/)#.*#,'14.)3to no deseado se debe aumentar su catabolis1'# '# /%31%*.%6# 3.# ;%'3=*&)3%3A# C3&'# 3)# 4.)/)# 2'(6"6# 4'6# 3';6)46'/.,,%>*# /)# )*?%1"3# /)# 2"# 9="#,"&";>2%,"#'#4'6#%*@%;%,%>*#/)#2"#46'/.,,%>*# de enzimas de la vía biosintética. El conocimiento de los genes involucrados )*# .*"# 9="# 1)&";>2%,"# 4)61%&)# ".1)*&"6# 2"3# ",&%9%/"/)3#/)#/%,@"3#)*?%1"3#4'6#3';6))D46)3%>*#/)#3.3#6)34),&%9'3#()*)3#"#4"6&%6#/)#46'1'&'6)3#%*/.,%;2)3#'#,'*3&%&.&%9'3A#U'6#'&6"#4"6te, la utilización de técnicas de ARN antisentido y, más recientemente, de ARN de interferencia IJNL%Q:#*'3#4)61%&)#/%31%*.%6#)34),=0,"1)*&)# 2"#)D46)3%>*#/)#/)&)61%*"/"3#)*?%1"3#"#&6"9+3# /)2#3%2)*,%"1%)*&'#4'3&6"*3,6%4,%'*"2#/)#2'3#()*)3#5.)#2"3#,'/%0,"*A Uso de los factores de transcripción en la manipulación del metabolismo secundario. G)#",)4&"#",&."21)*&)#5.)#)2#,'*&6'2#/)2#`.*#'#%*@%;%,%>*#/)#.*'3#4','3#()nes estructurales sea difícil de alcanzar. J# 4)3"6# /)# 2'3# )3-.)6?'3# 6)"2%?"/'3# 4"6"# %/)*&%0,"6# 2'3# 4"3'3# 2%1%&"*&)3# /)# /%-)6)*&)3#

9="3#1)&";>2%,"3:#2"#3';6))D46)3%>*#/)#()*)3# )3&6.,&.6"2)3#3>2'#@"#4)61%&%/'#';&)*)6#".1)*&'3# /)2# `.*#/)2#'#2'3#()*)3#5.)#,'/%0,"*#/%,@'3#-",&'6)3A#C3&"#)3&6"&)(%"#@"#4)61%&%/'#';&)*)6#".1)*&'3#/)2#`.*# /)# 2"# 1"7'6="# /)# 2'3# ()*)3# ,'146)*/%/'3# )*# .*"# 9="# /)&)61%*"/":# 4)61%&)*# )2./%6# 2"3# 6)3&6%,,%'*)3# ()*)6"/"3# 4'6# 2"# )D%3&)*,%"# /)# 4"3'3#2%1%&"*&)3A#J/)183:#2"#1'/.2",%>*#/)2#`.*:# "%32"1%)*&'# 7# caracterización molecular de los genes que ,'14'*)*#2"#9="#)*#,.)3&%>*A#G%*#)1;"6(':#2"# 1'/%0,",%>*#/)2#1)&";'2%31'#"#&6"9+3#/)#2"#)D46)3%>*#/)#-",&'6)3#/)#&6"*3,6%4,%>*#*'#)3#.*"# 4"*",)"#4"6"#6)3'29)6#&'/'3#2'3#46';2)1"3#/)# 2"# %*()*%)6="# 1)&";>2%,"# /)# 42"*&"3A# $'1'# )3# ';9%':#2'3#-",&'6)3#/)#&6"*3,6%4,%>*#*'#4.)/)*# %*/.,%6#9="3#1)&";>2%,"3#5.)#*'#)3&8*#46)3)*&)3#)*#2"#42"*&":#4'6#2'#5.):#)*#)3&'3#,"3'3:#)3# necesario introducir todos los genes necesa6%'3#4"6"#6),6)"6#2"3#1%31"3#)*#2"3#42"*&"3#/)# interés. Por esta razón, la ingeniería genética de genes estructurales continuará aún siendo *),)3"6%"#4"6"#6)3'29)6#1.,@'3#46';2)1"3#/)# la ingeniería metabólica. C*&6)# 2'3# 46%1)6'3# -",&'6)3# /)# &6"*3,6%4,%>*# /)3,6%4&'3# )*# 42"*&"3# 3)# )*,.)*&6"*# 2'3# factores R y C1, involucrados en el control de la biosíntesis de antocianinas de la aleurona de maíz. La inducción de la vía de la síntesis de antocianinas en células indiferenciadas de 1"=?#4./'#%*/.,%63)#4'6#3';6))D46)3%>*#/)#)3&'3#/'3#-",&'6)3#/)#&6"*3,6%4,%>*A#J3%1%31':#2"# 3';6))D46)3%>*#/)#)3&'3#-",&'6)3#)*#"66'?#46'dujo la activación de la vía de síntesis de las antocianinas, lo que se tradujo en un aumento /)#2"#6)3%3&)*,%"#/)2#"66'?#"#2"#%*-),,%>*#4'6#.*# 4"&>()*'#-B*(%,'A#C3&)#)*# del arroz transgénico rico en #-carotenos. La vitamina A es un nutriente esencial cuya caren,%"#)*#@.1"*'3#4.)/)#"-),&"6#3)9)6"1)*&)#2"# 9%3%>*:#2"#6)46'/.,,%>*#7#2"#-.*,%>*#%*1.*)A#G)# estima que en el mundo existen 124 millones /)# *%S'3# /)0,%)*&)3# )*# 9%&"1%*"#J# 7# 5.)# .*"# 46'9%3%>*#"/),."/"#4'/6="#)9%&"6#/)#]#"#\#1%llones de muertes anuales. El arroz es uno de 2'3#46%*,%4"2)3#"2%1)*&'3#4"6"#1%22'*)3#/)#4)63'*"3A# !"# 4"6&)# ,'1)3&%;2)# /)2# "66'?# ,'*3%3&)# ;83%,"1)*&)# )*# )2# )*/'34)61":# ,'14.)3&'# 4'6# (68*.2'3# /)# "21%/>*# 7# ,.)64'3# 46'&)%,'3:# 4)6'#,"6),)#/)#2'3#*.&6%)*&)3#)3)*,%"2)3#4"6"# )2#1"*&)*%1%)*&'#/)#2"#3"2./:#,'1'#)3#2"#46'O vitamina A (#-caroteno). El hecho que el arroz 3)"#2"#46%*,%4"2#-.)*&)#/)#"2%1)*&'3#/)#1.,@"3# 4';2",%'*)3#,'*&6%;.7)#"2#46';2)1"#/)#2"#/)0ciencia en vitamina A, convirtiéndose en un se6%'#46';2)1"#/)#3"2./#4B;2%,"A#C2#"66'?#46'/.,)# ()6"*%2O()6"*%2#/%-'3-"&':#46),.63'6#/)#2'3#,"6'&)*'3:#4)6'#,"6),)#/)#2"3#)*?%1"3#,'66)34'*/%)*&)3#"#)3&"#6.&"#;%'3%*&+&%,"A#U"6"#,'142)&"6# la vía de síntesis del #-caroteno es necesario

532 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

%*&6'/.,%6# 4'6# %*()*%)6="# ()*+&%,"# Z# )*?%1"3c# 2"# 0&')*'# 3%*&)&"3":# 2"# 0&')*'# /)3"&.6"3":# 2"# ,"6'&)*'# /)3"&.6"3"# 7# 2"# 2%,'4)*'# ,%,2"3"A#J2&)6*"&%9"1)*&):# 4"6"# 3%142%0,"6# )2# &6";"*# ,'*# Agrobacterium tumefaciens#4'6&"*/'#9),&'6)3# que contenían los siguientes genes: a) gen de 0&')*'# 3%*&)&"3"# Ipsy) de Narcissus pseudonarcissus ;"*# "# 4283&%/'3 ;"# el nombre de esta líneas transgénicas como "Arroz dorado" o en inglés "Golden rice".

Ingeniería metabólica de la síntesis 1$,:+?0"0!1$&P !'3# `"9'*'%/)3# 4)6&)*),)*# "# .*"# /)# 2"3# 46%*,%4"2)3#,2"3)3#/)#1)&";'2%&'3#3),.*/"6%'3A# G)# ,"6",&)6%?"*# 4'6# 3)6# ,'14.)3&'3# 4'2%-)*>2%,'3#/)#)3&6.,&.6"#"6'18&%,"#46)3)*&)3#)*#&'dos los tejidos vegetales. Son una familia muy /%9)63"# /)# ,'14.)3&'3# 5.)# 3)# ,"6",&)6%?"*# 4'6# 3)6# 3%*&)&%?"/'3# "# 4"6&%6# /)# .*"# 1'2+,.2"# de fenilalanina y 3 de malonil-CoA (Figura 3). C3&"# )3&6.,&.6"# 4.)/)# 3.-6%6# 1'/%0,",%'*)3# 7# "/%,%'*)3# /)# (6.4'3# -.*,%'*"2)3# I(2%,'3%2",%'nes, metilaciones o acetilaciones) generando .*"# (6"*# /%9)63%/"/# /)# `"9'*'%/)3A# H"3&"# )2# 46)3)*&):#@"*#3%/'#%/)*&%0,"/'3#183#/)#MAfff# `"9'*'%/)3# /%-)6)*&)3A# C3&'3# 3)# ,2"3%0,"*# 3)(B*#3.#)3&6.,&.6"#;"3)#)*#M#(6.4'3c#,@"2,'*"3:# `"9'*'*"3:#`"9'*'2)3:#/%@%/6'`"9'*'%/)3#7#"*&',%"*%*"3A Esta clase de metabolitos secundarios se encuentran 46)3)*&)3# )*# ,"3%# &'/"3# 2"3# -"1%2%"3# /)# 42"*&"3:# 46%*,%4"21)*&)# )*# 2"# )4%/)61%3# /)# @'*#I"#&6"9+3# tesis del geranil-geranil difosfato en arroz y la obtención de cadel color u olor que le dan las 6'&)*'3#4'6#3';6))D46)3%>*#)*#"66'?#/)#2"3#)*?%1"3#@)&)6>2'("3# "*&',%"*%*"3# "# 2"3# `'6)3Q# 7# )*# 0&')*'#3%*&)&"3":#0&')*'#/)3"&.6"3"#7#2%,'4)*'#3%*&)&"3"A

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 533

N!27%+,\P,`)+&,1$,&)"#$&!&,1$,-0&,:+?0"0!1$&P#!'3#`"9'*'%/)3#3)#,2"3%0,"*#3)(B*#3.#)3&6.,&.6"#,)*&6"2# "(2%,'*"#)*#M#(6.4'3c#,@"2,'*"3:#`"9'*'*"3:#`"9'*'%/)3:#/%@%/6'`"9'*'%/)3#7#"*&',%"*%*"3A

2"#3%1;%'3%3#9)()&"2#I4'6#%*/.,,%>*#/)#2"#*'/.2",%>*#/)#;",&)6%"3#0()*'QA C3&)#&%4'#/)#4'2%-)*'2)3#3'*#%14'6&"*&)3#),'*>1%,"1)*&)#4'65.)#,'*&6%;.7)*#"2#3";'6:#"6'ma y color de los alimentos y bebidas. Además en los últimos años han adquirido una gran im4'6&"*,%"#)*#2"#3"2./#@.1"*"#/);%/'#"#)3&./%'3# 5.)#3.(%)6)*#5.)#)3&'3#,'14.)3&'3#46)3)*&"*# .*# )-),&'# 46'&),&'6# -6)*&)# "# ,%)6&"3# )*-)61)/"/)3# 7# 4.)/)*# ",&."6# ,'1'# "*&%"2)6(+*%,'3A# K);%/'#"#2"3#46'4%)/"/)3#;)*+0,"3#4"6"#2"#3"2./#@.1"*"#7#"#3.#%14'6&"*,%"#),'*>1%,":#2"3# 9="3# ;%'3%*&+&%,"3# /)# 2'3# `"9'*'%/)3# @"*# 3%/'# )D&)*3"1)*&)#)3&./%"/"3A#C3&'#@"#4)61%&%/'#)2# /)3"66'22'#/)#2"#%*()*%)6="#1)&";>2%,"#"42%,"/"# al mejoramiento nutricional de ciertos cultivos ,'1'#&"1;%+*#"#2"#46'/.,,%>*#/)#`'6)3#/)#,'6&)A#_*"#/)#2"3#46%1)6"3#"42%,",%'*)3#/)#2"#%*()*%)6="# 1)&";>2%,"# -.)# 2"# 1"*%4.2",%>*# /)# 2"# 9="# /)# 3=*&)3%3# /)# `"9'*'%/)3# 7# "*&',%"*%*"3# 4"6"#,"1;%"6#)2#,'2'6#/)#2"3#`'6)3A#C3&'#3)#/);%># 46%*,%4"21)*&)# "# 5.)# )6"# .*"# /)# 2"3# 9="3# más conocidas y los resultados eran fácilmente observables. Es inusual encontrar la gama ,'142)&"#/)#,'2'6)3#/)*&6'#/)#2"3#)34),%)3#`'-

rales convencionales. En Petunia hybrida, una /)#2"3#42"*&"3#)*#5.)#2"#9="#/)#3=*&)3%3#/)#"*tocianinas ha sido más extensamente estudia/":#3)#46'/.,)*#/)6%9"/'3#/)#/)20*%/%*"3#7#/)# ,%"*%/%*"3#4)6'#*'#/)6%9"/'3#/)#4)2"6('*%/%*"A# C3&'# 3)# /);)# "# 2"# )34),%0,%/"/# /)# 2"# )*?%1"# /%@%/6'`"9'*'2#ZO6)/.,&"3"#/)#4)&.*%":#2"#,."2# *'#4.)/)#6)/.,%6#"2#46),.63'6#/)#4)2"6('*%/%*":# el dihidrokemferol, en kemferol. Sin embargo, hace casi dos décadas se obtuvo una variedad /)#4)&.*%"3#"*"6"**#/)2#,'2'6# /)# 2"3# `'6)3# 4'6# %*()*%)6="# ()*+&%,"A# C3&'# 3)# 2'(6># &6"*3-'61"*/'# .*"# 9"6%)/"/# /)# 4)&.*%"# ;2"*,"# ,'*# )2# ()*# /)# 2"# /%@%/6'`"9'*'2# ZO6)ductasa (dfrQ#/)#1"=?A#!"#9"6%)/"/#/)#4)&.*%"# blanca (mutante RLo1) acumula dihidrokemferol debido a que los genes f3’h I^m`"9'*'%/)# hidroxilasa) y f3’5’ I^mOMm`"9'*'%/)#@%/6'D%2"3"Q# 3)#@"22"*#"-),&"/'3#4'6#1.&",%'*)3n#)*#,'*3),.)*,%":# 46'/.,)# `'6)3# 5.)# *'# 1.)3&6"*# 4%(mentación. La transformación de esta variedad ,'*# )2# ()*# /)# 1"=?# ,'*/.*# 7# ",.1.2",%>*# /)# 4)2"6('*%/%*":# ';&)*%+*/'3)# `'6)3# /)# 4)&.*%"# ,'2'6# "*"6"**#/)#,.2&%9'3#,'1)3&%;2)3#5.)#46'/.?,"*# "2&'3# *%9)2)3# /)# `"9'*'%/)3A# _*'# /)# 2'3# 46%*,%4"2)3# ,"*/%/"&'3# 4"6"# /)3"66'22"6# )3&)# &%4'#/)#&),*'2'(="#)3#)2#&'1"&)A#C2#&'1"&)#46'/.,)#)*#3.#4%)2#4)5.)S"3#,"*&%/"/)3#/)#`"9'*'%/)3:#2'#,."2#*'3#,'*061"#2"#)D%3&)*,%"#/)#2"# 9="# /)# 3=*&)3%3# /)# `"9'*'%/)3# )*# )3&"# 42"*&"# 7#2"#4'&)*,%"2%/"/#/)#".1)*&"6#3.3#*%9)2)3#/)# 46'/.,,%>*A#J#4"6&%6#/)#2"#1"*%4.2",%>*#()*+&%,"#/)#2"#)D46)3%>*#/)#-",&'6)3#/)#&6"*3,6%4,%>*# se logró obtener líneas de tomate transgénicos ,"4",)3#/)#46'/.,%6#*%9)2)3#,%*,'#9),)3#1"7'6)3#/)#`"9'*'2)3#5.)#2"#9"6%)/"/#3"29"*# 3%3# /)# `"9'*'2)3# )*# /%9)63"3# 42"*&"3# -'61"*# del gen dfr /)# 1"=?# )*# .*"# 2=*)"# /)# 4)&.*%"# 5.)# 4"6&)#/)#/'3#-"1%2%"3#46%*,%4"2)3c#2"#-"1%2%"#$]:# acumula dihidrokemferol debido a dos mutaciones en los genes f3’h y f3’5’#%*/.,)#2"#3=*&)3%3#/)2#4%(- &%4'# qyb# 7# 2"# -"1%2%"# N:# &%4'# qy$A# !'3# ".&'1)*&'# 4)2"6('*%/%*"# I4)2"6('*%/%*"O^O(2.,>3%/'Q:# 6)3# 3';6))D46)3"6'*# )*# &'1"&)# 2'3# -",&'6)3# /)#,'2'6#2"/6%22'A#!"3#4)&.*%"3#;2"*,"3#*'#3%*&)&%?"* /)#&6"*3,6%4,%>*#$]#7#!]#/)#1"=?A#y#)*#-'61"#

4). Muchos de estos transformantes sufrieron %*)3&";%2%/"/# )4%()*+&%,"# I)D46)3%>*# %*)3&";2)# /);%/'# "# 2"# 1)&%2",%>*# /)2# 46'1'&'6Q:# *'# 4./%+*/'3)# ';&)*)6# ,.2&%9"6)3# .*%-'61)1)*&)# ,'2'6)"/'3:# 2'# ,."2# %14%/%># 3.# ,'1)6,%"2%zación. Sin embargo, los investigadores de la )146)3"# L'9"6&%3# 2'(6"6'*# ';&)*)6# 4)&.*%"3# "*"6"**#

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 535

3%1.2&8*)":#&6"*3-'61"6'*#42"*&"3#/)#&'1"&)3# ,'*#4"6)3#/)#,'*3&6.,,%'*)3#/%-)6)*&)3c#"Q#()*# C1#;"*# /)# 2'3# `"9'*'2)3#h)1-)6'2#7#*"6%*()*%*"A Ingeniería metabólica de la síntesis de alcaloides !'3# "2,"2'%/)3# 3'*# )2# (6.4'# /)# 1)&";'2%&'3# 3),.*/"6%'3# 183# 6)46)3)*&"&%9':# *.1)6'so y diverso en la naturaleza. Debido a esto 3'*#1.7#/%-=,%2)3#/)#/)0*%6#)*#-'61"#()*)6"2#7# 46),%3"A# G%*# )1;"6(':# )2# ,"68,&)6# ,'1B*# 5.)# 46)3)*&"*:#)3#5.)#)*#3.#)3&6.,&.6"#4'3))*#.*# anillo heterocíclico con uno o más átomos de *%&6>()*'A#G'*#3%*&)&%?"/'3#"#4"6&%6#/)#"1%*'8cidos o de sus derivados inmediatos y se clasi0,"*#3)(B*#3.#)35.)2)&'#,"6;'*"/'A#H"3&"#)2# 1'1)*&'#3)#@"#)3&%1"/'#5.)#2"3#42"*&"3#3'*# ,"4",)3#/)#46'/.,%6#]\Afff#)34),%)3#/)#"2,"loides diferentes. !"# %14'6&"*,%"# /)# 2'3# "2,"2'%/)3# /)*&6'# /)# 2"3#42"*&"3#6"/%,"#)*#5.)#,'*3&%&.7)*#.*#6)3)69'6%'#/)#*%&6>()*'#4"6"#2"#1%31"A#U'6#'&6'#2"/':# "2#%(."2#5.)#"2(.*'3#`"9'*'%/)3:#",&B"*#,'1'# 3.3&"*,%"3#"2)2'48&%,"3#)*#2"#/)-)*3"#-6)*&)#"# '&6"3# )34),%)3# 9)()&"2)3:# ,'1'# "3=# &"1;%+*:# -6)*&)#"2#"&"5.)#/)#,%)6&'3#4"&>()*'3#'#/)46)/"/'6)3A# T"1;%+*# ",&B"*# 46'&)(%)*/'# "# 2"3# 42"*&"3# /)2# )-),&'# /)# 2"3# 6"/%",%'*)3# .2&6"9%'letas.

!'3# "2,"2'%/)3# 46'/.,%/'3# 4'6# 2"3# 42"*&"3# ,'*3&%&.7)*# .*'# /)# 2'3# (6.4'3# /)# 46'/.,&'3# *"&.6"2)3#5.)#46'9))#1"7'6#,"*&%/"/#/)#,'14.)3&'3# -"61",'2>(%,"1)*&)# ",&%9'3A# C*# 2"# ",&."2%/"/#/%9)63'3#&%4'3#/)#"2,"2'%/)3#3'*#.&%lizados tanto en la medicina tradicional como )*#2"#@'1)'4"&="A#i)*)6"21)*&)#",&B"*#3';6)# el sistema nervioso central a nivel del sistema *)69%'3'# 4"6"3%148&%,'# 7# 3%148&%,'A# C*# 1)/%,%*":#3'*#.&%2%?"/'3#4"6"#)2#&6"&"1%)*&'#/)#)*-)61)/"/)3# 1)*&"2)3# ,'1'# "3=# &"1;%+*# 4"6"# calmar el dolor, ya que muchos de estos meta;'2%&'3# 3'*# ,'14.)3&'3# 43%,'",&%9'3c# 1'60*"# (Papaver somniferumQ:#"&6'4%*"#IAtropa belladonna), colchicina, entre otros. Existen otros &%4'3#/)#"2,"2'%/)3#5.)#3'*#&"1;%+*#-"61","2>(%,"1)*&)#%14'6&"*&)3#/);%/'#"#3.#.3'#)*#)2# tratamiento de tumores. Se trata de la vinblasti*":#9%*,6%3&%*"#7#2"#,"14&'&),%*"A#o&6'#"2,"2'%/)# de extrema relevancia en medicina es la quinina (N%1/4'1*)'+>/%1*#%3Q:#/6'("#46%*,%4"2#)*#)2# tratamiento de la malaria. !"#%*()*%)6="#()*+&%,"#"42%,"/"#"#2"#1"*%4.2",%>*# /)# 2"# ;%'3=*&)3%3# /)# )3&'3# ,'14.)3&'3# ha generado varios éxitos durante los últimos años. Uno de los casos más interesantes es el /)3"66'22'#/)#42"*&"3#/)#,"-+#&6"*3(+*%,"3#ICoffea canephora) con bajo contenido de cafeína. Existe una creciente demanda de café libre de cafeína debido a los efectos adversos que )3&)# ,'14.)3&'# 46'/.,)# )*# 4)63'*"3# 3)*3%bles. El café descafeinado que consumimos en 2"#",&."2%/"/#3)#';&%)*)#1)/%"*&)#.*#46',)3'# industrial costoso y que da como resultado un café con menos sabor. La biosíntesis de cafeí*"#)*#42"*&"3#/)#,"-+#%*9'2.,6"#&6)3#)*?%1"3c# $"pqT]:# $"qpqT]# I"1;"3# &)';6'1%*"# 3%*&)&"3"3Q# 7# $"KpqT]# I,"-)=*"# 3%*&)&"3"Q:# 5.)# "(6)("*#(6.4'3#1)&%2'3#"#2"#D"*&'3%*"#)*#-'61"# 3.,)3%9"# 4"6"# 46'/.,%6# ,"-)=*"A# !"# ';&)*,%>*# /)# 42"*&"3# /)# ,"-+# ,'*# 1)*'6# ,'*&)*%/'# /)# ,"-)=*"#-.)#2'(6"/"#4'6#%*@%;%,%>*#/)#2"#)D46)3%>*#/)#2"#)*?%1"#$"qpqT]A#!"#)D46)3%>*#/)# 2"# )*?%1"# -.)# %*@%;%/"# 4'6# 3';6))D46)3%>*# /)# ARNs de interferencia (ARNi) dirigidos contra 2"#6)(%>*#^m#*'#,'/%0,"*&)#/)2#()*#CaMXMT1. Las bacterias de A. tumefaciens conteniendo los vectores con las construcciones de ARNi, -.)6'*#.3"/"3#4"6"#&6"*3-'61"6#42"*&"3#/)#Coffea canephora. En las líneas transformadas se

536 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

"*"2%?"6'*#2'3#*%9)2)3#/)#)D46)3%>*#/)#2"3#&6)3# )*?%1"3# 4'6# NTOU$N# I&6"*3,6%4,%>*# 6)9)63"# O# 6)",,%>*#)*#,"/)*"#/)#2"#4'2%1)6"3"QA#C2#6)3.2&"/'#%*/%,>#*'#3>2'#2"#3.46)3%>*#/)#$"qpqT]# sino también de las otras dos enzimas. Esto se debió a la elevada homología entre las secuen,%"3#,'/%0,"*&)3#/)#2"3#)*?%1"3A#!"#6)/.,,%>*# )*# 2'3# *%9)2)3# /)# JNL1# /)# $"pqT]:# $"qpqT]#7#$"KpqT]#3.()6="#.*"#/%31%*.,%>*# en la actividad de las enzimas. Esto fue con061"/'#/%6),&"1)*&)#1%/%)*/'#2"3#,"*&%/"/)3# /)# 3.3# 46'/.,&'3:# &)';6'1%*"# 7# ,"-)=*":# 4'6# HPLC. Las hojas jóvenes de las líneas trans-'61"/"3# 46)3)*&"6'*# .*"# 6)/.,,%>*# /)2# ^f# O#Xfg#)*#)2#,'*&)*%/'#/)#&)';6'1%*"#7#.*#Mf# O#[fg#)*#)2#,'*&)*%/'#/)#,"-)=*"A#!'3#".&'6)3# &"1;%+*#@"*#2'(6"/'#42"*&"3#/)3,"-)%*"/"3#/)# Coffea arabica, )34),%)#/)#2"#5.)#3)#46'/.,)# )2#[fg#/)2#,"-+#,'1)6,%"2%?"/'#1.*/%"21)*&):# utilizando la misma técnica. o&6'#)*# /)# )3&'3#"2,"2'%/)3#-.)#2"#/)#3';6))D46)3"6#)2#()*# 5.)#,'/%0,"#2"#)*?%1"#3"2.&"6%/%*'2#[OO-acetiltransferasa (SalAT), involucrada en la vía de 3=*&)3%3#/)#2"#1'60*"#7#3.3#/)6%9"/'3A#!"#3';6))D46)3%>*#/)#)3&"#)*?%1"#)*#2"#1"7'6="#/)# las líneas transgénicas resultó en un aumento )*#2"3#,'*,)*&6",%'*)3# /)#1'60*":#,'/)=*"#7# tebaína en los frutos. La línea transgénica con 1"7'6#,'*&)*%/'#/)#)3&'3#,'14.)3&'3#".1)*&>#)*#.*#Z\g#3.#,'*&)*%/'#&'&"2#/)#)3&)#&%4'#/)# alcaloides.

'6%()*#'#)*#'&6"3#)34),%)3A#C*#"2(.*'3#,"3'3:# 2"#3';6))D46)3%>*#6)3.2&>#)*#.*#".1)*&'#/)#2"# ",.1.2",%>*#/)#2'3#,'14.)3&'3#/)3)"/'3A#G%*# embargo, en otros resultó sólo en el aumen&'#/)#2"#)*?%1"#,'/%0,"/"#4'6#)2#46'4%'#()*#':# 4)'6#"B*:#)*#2"#46'/.,,%>*#/)#,'14.)3&'3#*'# deseados. Estos resultados evidencian la com42)*# /)# 2"3# 9="3# 1)&";>2%,"3# 5.)# 3)# /)3)"*#1'/%0,"6A#C*#)3&)#3)*&%/':#2"#.&%2%?",%>*# /)# -",&'6)3# /)# &6"*3,6%4,%>*# 4"6"# ",&%9"6# 9="3# 1)&";>2%,"3#,'142)&"3#4"6),)#3)6#",&."21)*&)# .*"# )3&6"&)(%"# 46'1)&)/'6"A# C*# 2'3# 46>D%1'3# "S'3:# )2# 46%*,%4"2# /)3"-='# 3)68# ';&)*)6# 1"7'6# información acerca de la regulación metabólica a todos los niveles: genético, enzimático, de la ,'14"6&%1)*&"2%?",%>*:# /)2# &6"*34'6&)# 7# /)# 2"# acumulación. Dado que los metabolitos secun/"6%'3#3'*#)34),%)O)34),=0,'3:#2"#%*-'61",%>*# genética obtenida de Arabidopsis thaliana será /)# .&%2%/"/# 2%1%&"/":# 4'6# 2'# 5.)# 2"# 3),.)*,%",%>*#/)#'&6"3#)34),%)3#/)#%*&)6+3#3)68#/)#(6"*# 9"2'6#)*#)3&)#,"14'A#J#3.#9)?:#3)68#*),)3"6%'# integrar los datos obtenidos de los estudios ge*>1%,'3# ,'*# 2'3# /)# 2'3# )3&./%'3# 46'&)>1%,'3# 7# 1)&";'2>1%,'3:# 2'# 5.)# 4)61%&%68# ()*)6"6# .*# 4"*'6"1"# 183# ,'142)&'# /)2# ,'**# /)# 1'2+,.2"3# /)# %*&)6+3# )*# '6("*%31'3# ()*+&%,"1)*&)# 1'/%0cados), fortalecimiento nutricional y resistencia "#4"&>()*'3A

538 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

V. CAPÍTULO 14 Mejoras de calidad en alimentos Clara Rubinstein y Gabriela Levitus C*&6)#2"3#"42%,",%'*)3#;%'&),*'2>(%,"3#/)#2"# %*()*%)6="# ()*+&%,"# 4"6"# )2# 1)*#/)# cultivos con mayores cantidades de nutrientes )34),=0,'3:# )2# /)3"66'22'# /)# 9"6%)/"/)3# ,'*# 4)602)3#,'14'3%,%'*"2)3#183#3"2./";2)3#'#3)guros, y el desarrollo de alimentos funcionales, ,'*# /)&)61%*"/"# ",&%9%/"/# ;)*+0,"# 3';6)# 2"# salud. Asimismo, existen numerosos desarrollos 5.)#"4.*&"*#"#1)*# ,'*# 9%&"1%*"#J# 4"6"# .*#"S':##4"6"#^[:M#1%22'*)3#/)#,@%,'3#)*# )/"/#46)O)3,'2"6#)*#b"*(2"/)3@:#F*/%"#7# Pakistán. !"# -'6&%0,",%>*# ,'*# @%)66'# 4"6"# .*# "S':# 4"6"#^[M#1%22'*)3#/)##4)63'*"3:#"46'D%1"/"1)*&)# .*# ^fg# /)# 2"# 4';2",%>*# /)# Bangladesh, India, y Pakistán. El desarrollo y difusión de variedades 1)*#@.1"*"#7#46'9))# )2# ^fg# /)# 2"# %*()3&"# /)# )*)6(="# /)# 2"# 4';2"ción asiática. El maíz está en tercer lugar des4.+3#/)2##&6%('#,'1'#.*'#/)#2'3#&6)3##,.2&%9'3# 183#%14'6&"*&)3A#G%#;%)*#)2#(6"*'#/)#1"=?#)3# .3"/'# -.*/"1)*&"21)*&)# 4"6"# "2%1)*&",%>*## "*%1"2#)*#2'3#4"=3)3#/)3"66'22"/'3:#)3#2"#;"3)# /%)&"6%"# )*# 1.,@'3# 4"=3)3# /)#J1+6%,"# !"&%*"# 7#‰-6%,"A#o&6'3#,.2&%9'3:#,'1'#2"#;"&"&"#'#4"4"# /.2,):#3'*#,.2&%9'3#3),.*/"6%'3#&"1;%+*#%14'6&"*&)3#4"6"#4"=3)3#/)#C.6'4"#/)2#C3&)#7#‰-6%,":# 7# )*# 4"6&%,.2"6:# 4"6"# 2'3# "(6%,.2&'6)3# /)# 3.;3%3&)*,%"A#!"#1"7'6#4"6&)#/)#2'3#,.2&%9'3:#7#4'6# lo tanto los alimentos derivados de ellos, son /)0,%)*&)3#)*#.*'#'#183#*.&6%)*&)3#)3)*,%"2)3# I"5.)22'3#5.)#/);)*#3)6#%*,'64'6"/'3#"#&6"9+3# de la dieta). Por esto, la dieta de mucha gen&)#5.)#/)4)*/)#/)#)3&'3#,.2&%9'3#)*#4"=3)3#)*# /)3"66'22'#6)3.2&"#/)0,%)*&)#7#)3#4','#/%9)63":# 2'#5.)##".1)*&"#2'3#6%)3('3#/)#/)0,%)*,%"3#*.tricionales. El arroz dorado (Golden Rice), denominado "3=#4'6#3.#,'2'6#81;"6:#)3#.*#)*# /)# )3&)# "66'?:# 5.)# )D46)3"# 1"7'6)3# ,"*&%/"/)3# /)# ;)&"O,"6'&)*'# 6)34),&'# /)# 2"# 46%1)6"# 9)6-

540 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

3%>*#I.*"3#\f#9),)3#183Q:#7#5.)#4)61%&%6="#5.)# ,'*# ]R^# /)# &"?"# I[f# (6"1'3Q# 3)# 46'9)"*# \R^# de la ingesta diaria recomendada de vitamina J#4"6"#*%S'3#)*#)/"/#46))3,'2"6A# U"6"#2'(6"6#)3&"#1'/%0,",%>*:#3)#%*3)6&"6'*# dos genes: el gen psy# /)# 2"# 0&')*'# 3%*&)&"3"# de maíz y el gen crtl:#,'/%0,"*&)#4"6"#2"#,"6'&)no desaturasa de la bacteria Erwinia uredovora (Figura 1).

Figura 1.#F*3)6&'#46)3)*&)#)*#)2#i'2/)*#N%,)#\

a retinol. Esta bio-conversión es variable, de ",.)6/'# "# -",&'6)3# 5.)# /)4)*/)*# /)2# &%4'# /)# ,"6'&)*'%/):#2"#1"&6%?#)*#2"#,."2#)3#%*,'64'6"do, el estado nutricional del consumidor, etc. !"# ;%'/%34'*%;%2%/"/# /)2# ;)&"O,"6'&)*'# )D46)3"/'#)*#)2#i'2/)*#N%,)#\#3)#@"#)9"2."/':# 7#3)#)3&%1"#5.)#[f#(6"1'3#/)#"66'?#,6./'#4'/6="*#46'9))6#)2#Yfg#/)#2"#%*()3&"#6),'1)*/"/"#I)*#2'3#CC__Q#4"6"#2",&"*&)3#/)#]#"#\#"S'3# /)#)/"/A#!"#4'6,%>*#/)#"66'?#,'*9)*,%'*"2#46'1)/%'#4"6"#.*#*%S'#/)#)3"#)/"/#)*#T"%2"*/%":# 4'6#)*# 1)/%"/"# 4'6# Agrobacterium tumefaciens 4"6"# %*&6'/.,%6# 2"# construcción en arroz (Oryza sativa). El sistema de selección utilizado fue el método de la fosfomanosa isomerasa de E. coli (PMI), un sistema alternativo al uso de genes de resistenP# ,%"#"#"*&%;%>&%,'3A#C3&)#3%3&)1"#4)61%&)#"#2'3#&)jidos vegetales en cultivo utilizar manosa como -.)*&)#46%*,%4"2#/)#,"6;'*':#*'#/%34'*%;2)#4"6"# P# 2"3#42"*&"3#4'65.)#,"6),)*#/)#2"#)*?%1"#UqFA !"#0&')*'#3%*&)&"3"#,"&"2%?"#)2#4"3'#2%1%&"*&)# /)# 2"# ;%'3=*&)3%3# /)# ,"6'&)*'%/)3# )*# 42"*&"3:# 6)3.2&"*/'# 2"# /)2# 1"=?# 2"# 183# )0,%)*&)# /)3/)# P# )2# 4.*&'# /)# 9%3&"# /)# 2"# ",.1.2",%>*# /)# ,"6'tenoides totales y beta-caroteno en arroz. De hecho, el Golden Rice 1 contiene cerca de ]:Y#˜(#/)#,"6'&)*'%/)3#&'&"2)3R(6"1'#/)#4)3'# seco de grano, mientras que el Golden Rice 2 ,'*&%)*)##@"3&"##^[#˜(R(6"1'#/)#4)3'#3),'#/)# (6"*':#/)#2'3#,."2)3#^]#˜(R(#)3#—O,"6'&)*'A# L%*(B*# ,.2&%9"6# /)# "66'?# 46'/.,)# ,"6'&)*'%/)3#)*#)2#)*/'34)61":#3%#;%)*#4.)/)*#46'/.,%6# )2#46),.63'6#()6"*%2O()*"6%2#/%-'3-"&'A#!"#0&')*'# 3%*&)&"3"# ,'*9%)6&)# )3&)# ,'14.)3&'# "# 0&')*':# )2# 46),.63'6# %*1)/%"&'# /)2# ;)&"O,"6'&)*'# )*# 42"*&"3A Figura 2:#$'14"6",%>*#)*&6)#)2#"66'?#,'*9)*,%'*"2# U"6"#4'/)6#3)6#.&%2%?"/"#,'1'#9%&"1%*"#J:#)2# (izq), Golden Rice 1 (centro) y Golden Rice (der). beta-caroteno debe ser absorbido y convertido IT'1"/'#/)#U"%*)#)&#"2:#\ffYQA

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 541

4'6#JNL#/)#%*&)6-)6)*,%"#@"*#3%/'#"42%,"/"3#"# 2"#6)/.,,%>*#/)#"2+6()*'3#)*#/%-)6)*&)3#)34),%)3:#,'1'#2"#46'&)=*"#U^Z#/)#3'/*/%01)21)#*)/'!='3%/%01)72)#'3) Asimismo, existen desarrollos que se enfoaceites y"#)D%3&)*#)*#)2#1)6,"/'#/%-)6)*&)3#9"6%)/"- can en la eliminación de toxinas naturalmen/)3#/)#'2)"(%*'3"3#5.)#46'/.,)*#",)%&)3#,'*# &)#46)3)*&)3#)*#"2(.*'3#,.2&%9'3#"2%1)*&"6%'3:# 4)602)3#/)#8,%/'3#(6"3'3#183#3"2./";2)3:#"2(.- ,'1'#2'3#(2%,'"2,"2'%/)3#/)#2"#4"4"#'#2'3#,'1*"3#/)#)22"3#&6"*3(+*%,"3A#!"3#1'/%0,",%'*)3# 4.)3&'3#,%"*'(+*%,'3#/)#2"#1"*/%',"A %*&6'/.,%/"3#"4.*&"*#"#';&)*)6#1)*'6#,"*&%/"/# El caso del maní de ácidos grasos saturados (los menos saludaUtilizando la tecnología de ARN de interfe;2)3Q:#7#)*6%5.),)6#2"#,'14'3%,%>*#/)#2'3#",)%6)*,%"#)3#4'3%;2)#3%2)*,%"6#"#2'3#"2+6()*'3#183# &)3#)*#8,%/'3#(6"3'3#1'*'#'#4'2%O%*3"&.6"/'3# 4'&)*&)3#/)2#1"*=A#_*#&6";"# I183# /)3)";2)3# /)3/)# )3&)# 4.*&'# /)# 9%3&"QA# 5.)#)3#4'3%;2)#3.46%1%6#2"#)D46)3%>*#/)#J6"#@# C3&"3# 1'/%0,",%'*)3# %*&6'/.,)*# 4"3'3# 1)&"\#7#J6"#@#Y#)*#-'61"#)34),=0,"#.&%2%?"*/'#)3&"# ;>2%,'3#".3)*&)3#'#;%)*#3%2)*,%"*#4"6&)3#/)#.*"# tecnología. vía metabólica, logrando derivar la síntesis a G)# @"*# # %/)*&%0,"/'# '*,)# 46'&)=*"3# "2)6(+2'3#46'/.,&'3#/)3)"/'3A# nicas en el maní (denominadas Arah 1- 11). U'6# )*#)3#*),)3"6%'#4"6"# ,%"/'3#)*#42"*&"3#&6"*3(+*%,"3:#7#2"3#46.);"3# )3&";%2%?"6#2'3#",)%&)3#'#4"6"#,'*3)(.%6#(6"3"3# /)#.*%>*#"#%*1.*'(2';.2%*"#C#,'*061"6'*#.*"# 3>2%/"3# 4"6"# /%-)6)*&)3# "42%,",%'*)3# "2%1)*&"- reducción en el binding#"#)3&"3#46'&)=*"3:#3)rias. Reducir el nivel de ácido linolénico o bien (B*#2'#)34)6"/':#3.(%6%)*/'#5.)#)3&"3#&+,*%,"3# aumentar la cantidad de ácidos grasos como el ,'*3&%&.7)*#.*"#)3&6"&)(%"#46'1%3'6%"#4"6"#/)esteárico, son dos de las estrategias de mejo- 3"66'22"6#1"*=#7#'&6'3#,.2&%9'3#@%4'"2)6(+*%,'3A## 6"1%)*&'#.&%2%?"/"3#4'6#2'3#%*9)3&%("/'6)3#5.)# =01!*(+(!0"$&,>7"(!0"+-$& están desarrollando estas semillas. Además de agregar nuevos nutrientes, es 4'3%;2)#&"1;%+*#".1)*&"6#2'3#;)*)0,%'3#4"6"#2"# Eliminación de alérgenos y toxinas C*#,."*&'#"2#4'&)*,%"2#"2)6(+*%,'#/)#,%)6&'3# salud de los denominados alimentos funciona"2%1)*&'3:#2"#;%'&),*'2'(="#&"1;%+*#4.)/)#,'*- les. Estos son alimentos que contienen niveles 3%(*%0,"&%9'3# /)# ,'14'*)*&)3# ;%'2>(%,"1)*&)# tribuir a mejorar la seguridad de las materias ",&%9'3#5.)#,'*0)6)*#;)*)0,%'3#5.)#9"*#183# 46%1"3A# C2# WMg# /)# 2"3# "2)6(%"3# "2%1)*&"6%"3# allá de cubrir las necesidades básicas de ca4.)/)#3)6#"&6%;.%/"#"#.*#(6.4'#/)#',@'#"2%1)*lorías, aminoácidos o ácidos grasos esenciatos, entre los que se encuentran el maní, la le2)3:# 9%&"1%*"3# '# 1%*)6"2)3A# J2(.*'3# )*#/)#.*"#3)6%)#/)#46'&)=*"3#"2)6(+*%,"3# 1)*&"*#2"#6)34.)3&"#%*1.*)#'#6)/.,)*#)2#,'6)34'*3";2)3#/)#)3&"3#%*&'2)6"*,%"3:#3%*'#5.)# 2)3&)6'2#'#;%)*#2'3#(2.,'3%*'2"&'3#46)3)*&)3#)*# también se ha tenido éxito en bloquear o eli- 2"3# ,'2)3:# 5.)# )3&%1.2"*# )*?%1"3# ,'*# 46'4%)1%*"6# ()*)3# ,'/%0,"*&)3# 4"6"# "2+6()*'3A# C*# dades anti-cancerígenas. Del mismo modo, los efecto, las técnicas de silenciamiento mediado antioxidantes encontrados en alimentos como

542 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

el té verde, el vino, el chocolate, etc., son tam;%+*#,'*3%/)6"/'3#,'14'*)*&)3#-.*,%'*"2)3A El caso del tomate Investigadores de la Universidad de Purdue 7#/)2#K)4"6&"1)*&'#/)#J(6%,.2&.6"#/)#2'3#CC__# lograron tomates que contienen una cantidad &6)3#9),)3#1"7'6#/)2#"*&%'D%/"*&)#2%,'4)*'#5.)# las variedades convencionales. El consumo de 2%,'4)*'#3)#@"#"3',%"/'#,'*#.*#1)*'6#6%)3('# /)#,8*,)6#/)#46>3&"&"#7#1"1":#7#,'*#1)*'6)3# *%9)2)3#)*#3"*(6)#/)#,'2)3&)6'2#a1"2'eA# También en tomate, se está trabajando en el aumento de antocianinas, del mismo modo "3',%"/"3#"#*.1)6'3'3#)-),&'3#;)*+0,'3#4"6"# la salud. Dos genes (Del y Ros1) originarios /)2#()*'1"#/)#.*"#42"*&"#'6*"1)*&"2#Ia,'*)jito”, Antirrhinum majus) fueron introducidos en 42"*&"3# /)# &'1"&)# ,'*9)*,%'*"2A# C3&'3# ()*)3# %*/.,)*# 2"# )D46)3%>*# /)# )*?%1"3# ,2"9)# )*# 2"# 3=*&)3%3# 7# )2# &6"*34'6&)# /)# "*&',%"*%*"3# "# 2"3# vacuolas de las células del tejido que conforma 2"#4.24"#/)2#&'1"&)A#C2#6)3.2&"/'#0*"2#)3#.*#".mento de tres veces en el contenido de estas "*&',%"*%*"3:#5.)#3)#6)`)*:#&6"*34'6&)# y lavado de suelos, la extracción, bombeo y tratamiento de aguas contaminadas y el trata1%)*&'#/)#"(."3#,'*&"1%*"/"3#1)/%"*&)#46),%4%&",%>*:#%*&)6,"1;%'#%>*%,':#>31'3%3#6)9)63"# 7# 1%,6'02&6",%>*A# T'/'3# )3&'3# 46',)/%1%)*&'3# 3'*#"2&"1)*&)#,'3&'3'3#)#%146",&%,";2)3#3%#3)# &6"&"#/)#(6"*/)3#3.4)60,%)3#/)#&%)66"#'#9'2B1)nes de agua. Los métodos biológicos más utilizados se basan agregar o estimular el crecimiento de bacterias que degraden o transformen el contaminante a tratar. Para que este enfoque resulte exitoso, se deben considerar factores &"2)3# ,'1'# 2"# ,"4",%/"/# /)# 3.4)69%9)*,%"# /)# los microorganismos, la accesibilidad o bio/%34'*%;%2%/"/# /)2# ,'14.)3&'# ,'*&"1%*"*&)# 7# 2"# 46)3)*,%"# /)# %*/.,&'6)3# /)# 2"3# 6)34),&%9"3# ",&%9%/"/)3# )*?%18&%,"3A# q.,@'3# ,'14.)3&'3# orgánicos son recalcitrantes a la degradación 7#*'#4.)/)*#3)6#.&%2%?"/'3#,'1'#-.)*&)#/)#,"6;'*'# 4'6# 2'3# 1%,6''6("*%31'3# %*9'2.,6"/'3A# Además, los contaminantes son generalmen&)#1)&";'2%?"/'3#4'6#)*?%1"3#5.)#.&%2%?"*#'&6'# 3.3&6"&'#*"&.6"2:#4'6#2'#5.)#2"#46)3)*,%"#/)#+3&)# 4.)/)#3)6#*),)3"6%"#4"6"#%*/.,%6#2"#)D46)3%>*# /)#2'3#()*)3#,'66)34'*/%)*&)3A#U'6#'&6"#4"6&):# )2#+D%&'#/)#.*#46',)3'#/)#;%'66)1)/%",%>*#/)4)*/)#/)#2"#46)3)*,%"#/)#-.)*&)3#/)#,"6;'*'# 7#)*)6(="#3.0,%)*&)3#)*#)2#3%&%'#"#&6"&"6:#4'6#2'# que usualmente se requiere adicionar conside6";2)3#,"*&%/"/)3#/)#*.&6%)*&)3#4"6"#46'1'9)6# el crecimiento bacteriano.

Introducción La autotrofía es una de las características 183# %14'6&"*&)# /)# 2"3# 42"*&"3:# /"/'# 5.)# 2)3# 4)61%&)#.&%2%?"6#2"#)*)6(="#3'2"6#7#)2#$o2 como -.)*&)3#/)#)*)6(="#7#,"6;'*':#6)34),&%9"1)*&)A#$'1'#,'*3),.)*,%":#2"3#1%31"3#/)4)*/)*# /)#3.3#6"=,)3#4"6"#%*,'64'6"6#"(."#/)2#1)/%'# 5.)#2"3#6'/)"#7:#,'*#)22":#,'14.)3&'3#1%*)6"les, nitrógeno y otros nutrientes. Junto con és&'3:# 2"3# 42"*&"3# ";3'6;)*# ,'14.)3&'3# &>D%,'3# /)# '6%()*# 9"6%"/'# 4'6# 2'# 5.):# "# 2'# 2"6('# /)# 2"# evolución, han generado mecanismos de de&'D%0,",%>*#5.)#2)3#4)61%&)*#3';6)9%9%6#)*#"1;%)*&)3#"/9)63'3A#C3&'3#1),"*%31'3#4./%)6'*# @";)63)#'6%(%*"/'#"#4"6&%6#/)#3%3&)1"3#*"&.6"les de defensa contra aleloquímicos liberados 4'6# '6("*%31'3# ,'14)&%/'6)3:# %*,2.7)*/'# 1%,6''6("*%31'3:#%*3),&'3#7#'&6"3#42"*&"3A# !"# a0&'66)1)/%",%>*e# ,'*3%3&)# )*# 2"# .&%2%?",%>*# /)# 2"3# 42"*&"3# 7# /)# 2'3# 1%,6''6("*%31'3# "3',%"/'3#"#2"3#1%31"3#,'*#0*)3#/)#/)3,'*taminación del medio ambiente. En este con&)D&':# 2"3# 42"*&"3# 4.)/)*# ,'*3%/)6"63)# ,'1'# sistemas naturales de extracción y tratamiento de contaminantes. A diferencia de los métodos de tratamiento tradicionales, la energía reque6%/"#4"6"#3.#-.*,%'*"1%)*&'#46'9%)*)#/)2#3'2:#)2# costo de mantenimiento es reducido y los efectos indeseados son mínimos. Muchas actividades humanas, como la mi*)6=":#2"#"(6%,.2&.6":#2"#%*/.3&6%"#7#2"3#'4)6",%'*)3#1%2%&"6)3:#@"*#46'9',"/'#2"#,'*&"1%*",%>*# /)# (6"*/)3# 3.4)60,%)3:# %*,2.7)*/'# 3%&%'3# ,'*# "2&'3#*%9)2)3#/)#,'*,)*&6",%>*#/)#,'14.)3&'3# &>D%,'3#I4'6#)*:#3),.)3&6'# '#9'2"&%2%?",%>*A#J2(.*'3#)*#/)#)3&"# clase de contaminantes incluyen, entre otros, macronutrientes vegetales (nitratos y fosfatos), elementos traza (Cr, Cu, Fe, Mn, Mo, Zn), elementos no esenciales (Cd, Co, F, Hg, Se, Pb, k# 7# wQ:# )# %3>&'4'3# 6"/%'",&%9'3# I\^XU, 137Cs y 90 G6QA# q.,@'3# /)# )3&'3# ,'14.)3&'3# 3'*# *'61"21)*&)#*),)3"6%'3#4"6"#)2#/)3"66'22'#/)#2"3# 42"*&"3:#4)6'#,."*/'#3)#",.1.2"*#)*#)D,)3'# generan estrés oxidativo dañando a las células vegetales. Más allá de la naturaleza química del con&"1%*"*&):#2"#0&'66)1)/%",%>*#4.)/)#.&%2%?"63)# 4"6"#/)&'D%0,"6#3.3&6"&'3#/)#*"&.6"2)?"#3>2%/":# 2=5.%/"#'#("3)'3"A#C*&6)#2"3#46%*,%4"2)3#"42%,",%'*)3#/)#)3&"#&+,*%,"#4.)/)*#1)*,%'*"63)#)2# tratamiento de: O) Sustratos sólidos: sitios militares (meta2)3:#)D42'3%9'3Q:#3.)2'3#"(6=,'2"3#I@)6;%-

,%/"3:#4)3ticidas, metales, selenio), sitios %*/.3&6%"2)3#I,'14.)3&'3#'6(8*%,'3:#1)tales), minas (metales) y sitios de tratamiento de maderas (hidrocarburos aro18&%,'3#4'2%,=,2%,'3Qn O) Sustratos líquidos: aguas residuales (nutrientes, metales), drenajes agrícolas I*.&6%)*&)3:# -)6&%2%?"*&)3:#J3:# G):# b:# 4)3&%,%/"3:#@)6;%,%/"3Q:#)`.)*&)3#%*/.3&6%"2)3# I1)&"2)3Q:#)`.)*&)3#/)#1%*)6="#I1)&"2)3Qn# O) Sustratos gaseosos: aire (óxidos de nitrógeno, SO2, ozono, CO2, gases neurotóxi,'3:# 4"6&=,.2"3# /)# @'22=*:# @%/6',"6;.6'3# volátiles). !"# 0&'66)1)/%",%>*# 46)3)*&"# .*"# 3)6%)# /)# ventajas sobre otras técnicas de descontami*",%>*# 5.)# 4'/6="*# 6)3.1%63)# /)# 2"# 3%(.%)*&)# manera: a) costos energéticos muy inferiores /);%/'# "2# .3'# /)# )*)6(="# 3'2"6n# ;Q# )142)'# /)# tratamientos in situ, con las consiguientes re/.,,%'*)3#/)#,'3&'3#7#6%)3('3#4"6"#2'3#@.1"*'3n#,Q#"/"4&";%2%/"/#4"6"#2"#/)3,'*&"1%*",%>*# /)# (6"*/)3# 3.4)60,%)3# '# 4"6"# 2"# j0*"2%?",%>*j# /)#86)"3#6)3&6%*(%/"3#)*#42"?'3#46'2'*("/'3n#/Q# 1"7'6# 9)2',%/"/# /)# /)(6"/",%>*# 4"6"# )2# ,"3'# /)# /)&)61%*"/'3# ,'14.)3&'3n# )Q# 1)*'6# 46'ducción de residuos secundarios. J3%1%31':#)3#%14'6&"*&)#,'*3%/)6"6#&"1;%+*# las limitaciones inherentes a esta técnica, entre 2"3# ,."2)3# 4.)/)*# %*,2.%63)c# "Q# 2"# 0&'&'D%,%/"/# 4.)/)# 2%1%&"6# )2# ,6),%1%)*&'# /)# 2"3# 42"*&"3# )*# 86)"3#-.)6&)1)*&)#,'*&"1%*"/"3n#;Q#2"#4)*)&6"ción de las raíces restringe la utilidad de la téc*%,"#"#46'-.*/%/"/)3#/)#@"3&"#^OZ#1:#7#"2#&6"&"1%)*&'#"(."3#4','#46'-.*/"3n#,Q#)*#"2(.*'3# ,"3'3#)2#46',)3'#/)#6)1)/%",%>*#3.)2)#3)6#1.7# 46'2'*("/':#3%)*/'#183#2)*&'#)*#2'3#3.)2'3#5.)# )*#2'3#,.)64'3#/)#"(."n#/Q#2"#;%'/%34'*%;%2%/"/# /)# 2'3# ,'14.)3&'3# '# 1)&"2)3# 4.)/)# ,'*3&%&.%6# .*#-",&'6#2%1%&"*&)#4"6"#.*"#,"4&",%>*#)0,"?n#)Q# 2"3# ,'*&"1%*",%'*)3# 4'&)*,%"2)3# /)# 2"3# ,"/)*"3# "2%1)*&"6%"3# 7# /)# 2"3# *"4"3# /)# "(."# 3'*# riesgos que deben considerarse seriamente; f) 2'3#46'/.,&'3#/)#/)(6"/",%>*#in planta#I46',)3'3#/)#0&'/)(6"/",%>*Q#*'#)3&8*#;%)*#)3&";2)cidos en muchos casos; g) el marco regulatorio 4"6"#46',)3'3#/)#0&'66)1)/%",%>*#3)#@"22"#"B*# )*#46',)3'#/)#)2";'6",%>*A# Algunas de las limitaciones mencionadas 4.)/)*# "&)*."63)# %*&6'/.,%)*/'# 1'/%0,",%'*)3# "# 2"3# &+,*%,"3# .&%2%?"/"3A# U'6# )2'# .*# f:Mg# /)2# 1)6,"/'# &'&"2# /)# 6)1)/%",%>*# I2"# ;%'66)1)/%",%>*#)*#3.#,'**#/)#2'3#,'3&'3#/)#/)3,'*&"1%*",%>*#4"6"#/%-)6)*&)3#,'14.)3&'3#&>D%,'3#,'*# /%3&%*&"3#)3&6"&)(%"3A#$'1'#4.)/)#9)63):#)*#)2# ,"3'#/)#2'3#,'*&"1%*"*&)3#2%3&"/'3#2"#0&'66)1)/%",%>*#6)3.2&"#2"#'4,%>*#1)*'3#,'3&'3"A#

gias se resumen en la Figura 1 y se detallan a ,'*&%*.",%>*A#G.#.3'#/)4)*/)#/)#2"#3.4)60,%)# y características del ambiente a remediar y de 2"#*"&.6"2)?"#/)2#,'*&"1%*"*&):#3%)*/'#4'3%;2)# %142)1)*&"6#,'1;%*",%'*)3#/)#2"3#1%31"3#)*# algunos casos P* M$.",>.:'&&$()Q esta estrategia tiene ,'1'# 0*# ,'*,)*&6"6# )2# ,'*&"1%*"*&)# )*# &)*#4.)/)#%*9'2.,6"6#9"6%'3# 46',)3'3c#2'3#,'*&"1%*"*&)3#)*#)2#3.)2'#7#)*#)2#"(."#3.;&)668*)"#4.)/)*#3)6#%*,'64'6"/'3#"#2'3#&)*Qn#2'3#,'*&"1%*"*&)3#/)*&6'#/)#2"#42"*&"# 4.)/)*#3)6#&6"*3-'61"/'3#4'6#)*?%1"3#9)()&"2)3#I0&'&6"*3-'61",%>*Q:#'#9'2"&%2%?"/'3#7#2%;)6"/'3#"#2"#"&1>3-)6"#I0&'9'2"&%2%?",%>*Qn#2'3#,'*&"1%*"*&)3#/)2#3.)2'#4.)/)*#3)6#/)(6"/"/'3#4'6#1%,6''6("*%31'3#/)# 2"#6%?>3-)6"#I;%'66)1)/%",%>*#6%?'3-+6%,"Q:#'#%*,'64'6"/'3#"2#1"&)6%"2#/)2#3.)2'#I0&')3&";%2%?",%>*QA#J/"4&"/'# /)#9"*#Jh)*:#\ffX

P*

P*

M$.",8.'A$/$I'&$()Q esta estrategia se ;"3"# )*# .&%2%?"6# 42"*&"3# 4"6"# )3&";%2%zar in situ los contaminantes del suelo. U'6# )3&)# 1)/%':# 3)# 46)9%)*)# )2# 02&6"/'# '#)3,"4)#/)#2'3#,'*&"1%*"*&)3#"#,"4"3# 183#46'-.*/"3#'#"#*"4"3#/)#"(."#7#3)# los convierte en formas menos biodis4'*%;2)3# I4'6# )3-)6"QA# U"6"# %142)1)*&"6# )3&)# )*-'5.)# 4.)/)*# 42"*&"63)# ,';)6&.6"3# vegetales en sitios contaminados, o árboles que actúan como barreras hidráuli,"3:#&"*&'#4"6"#,'*&"1%*"*&)3#'6(8*%,'3# como inorgánicos. M$."#,+:'#'&$()R9$.".:')89":6'&$()Q 1)/%"*&)#)3&"#)3&6"&)(%":#2"3#42"*&"3#/)gradan los contaminantes orgánicos me-

548 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

P*

/%"*&)# ",&%9%/"/)3# )*?%18&%,"3# 46'4%"3:# ()*)6"*/'# "3=# 3.;46'/.,&'3# *'# &>D%,'3# '#1)*'3#&>D%,'3A#C2#46',)/%1%)*&'#@"#6)3.2&"/'# B&%2# 4"6"# ,'14.)3&'3# '6(8*%,'3# que se movilizan fácilmente en los teji/'3#/)#2"#42"*&":#,'1'#2'3#@)6;%,%/"3:#)2# trinitrotolueno, y el tricloroetileno. M$."4"/'.$/$I'&$()R%.".:')89":6'&$()Q )*# )3&)# ,"3':# 2"3# 42"*&"3# %*,'64'6"*# )2# contaminante y lo convierten a formas volátiles que se liberan luego a la atmós-)6"# "# &6"9+3# /)# 2"# &6"*34%6",%>*A# C3&)# 46',)/%1%)*&'# 4)61%&)# )D&6")6# )2)1)*tos como el selenio y algunas formas /)2# 1)6,.6%'# /)# ;"66'3# 7# 3.)2'3:# 4"6"# luego liberarlos a la atmósfera como va4'6# /)&'D%0,"/'A# U.)/)# .&%2%?"63)# 4"6"#

P*

,'14.)3&'3#'6(8*%,'3#,'*#-'61"3#9'28&%2)3# I&6%,2'6')&%2)*'Q# 7# 4"6"# ,'14.)3&'3# %*'6(8*%,'3#5.)#4.)/)*#)D%3&%6#)*#-'61"# volátil, como Se y Hg. S$I"%/.:'&$():# )3&)# 46',)/%1%)*&'# ,'*siste en la eliminación de tóxicos de ambientes acuáticos mediante el sistema 6"/%,.2"6# /)# 2"# 42"*&"A# C*# )3&)# 46',)3':# 2"3# 42"*&"3# 3'*# ,6),%/"3# )*# @%/6'4'*%"# 4"6"#2.)('#3)6#&6"*342"*&"/"3#"2#,.)64'# de agua contaminado, donde adsorben y acumulan metales en sus raíces. Si el 46',)3'# 3)# 6)"2%?"# )*# ,'*&)*)/'6)3:# )3# 6)2"&%9"1)*&)#,"6'#/)#%142)1)*&"6:#3%)*/'#183#;%)*#"46'4%"/'#4"6"#9'2B1)*)3# 4)5.)S'3#/)#"(."3#6)3%/."2)3#,'*&"1%*"/"3:#4'6#)*#/)#2"#)34),%)#9)()&"2. C*#()*)6"2:#3)#.&%2%?"*#)34),%)3#/)#684%/'#,6)-

N!27%+,EP,3&A7$.+&,1$,*#0%%$.$1!+(!;",'+%+,#%+#+%,1!>$%$"#$&,&7&#%+#0&,(0"#+.!"+10&P,Tecnologías /)#0&'66)1)/%",%>*#.&%2%?"/"3#4"6"#6)1)/%"6#/%3&%*&'3#3.3&6"&'3#,'*&"1%*"/'3c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cimiento microbiano. CD%3&)*#)34),%)3#/)#42"*&"3#,'*',%/"3#,'1'# a@%4)6",.1.2"/'6"3e# 5.)# &%)*)*# 2"# ,"4",%/"/# /)#",.1.2"6#,'14.)3&'3#0&'&>D%,'3#I4"6&%,.2"61)*&)#1)&"2)3Q#)*#,'*,)*&6",%'*)3#)*&6)#Mf#7# Mff#9),)3#3.4)6%'6)3#"#.*"#42"*&"#46'1)/%'A#C2# "2&'#4'/)6#/)#,'*,)*&6",%>*#/)2#,'14.)3&'#&>D%,':#3.1"/'#"#.*#3%3&)1"#)0,%)*&)#/)#&6"*34'6&)# /)3/)#2"#6"=?#"2#&"22':#,"2%0,"#"#2"3#@%4)6",.1.2"/'6"3#,'1'#,"*/%/"&"3#46'1%3'6%"3#4"6"#,%)6&'3# 46',)3'3#/)#/)&'D%0,",%>*#IT";2"#\QA# Procesos biológicos que afectan -+,*#0%%$.$1!+(!;" C2# 46',)3'# /)# 0&'66)1)/%",%>*# /)4)*/)# /)# .*"#3)6%)#/)#46',)3'3#;%'2>(%,'3c#"5.)22'3#6)lacionados con las interacciones a nivel rizos-+6%,'n#2'3#1),"*%31'3#/)#,"4&",%>*:#&6"*32',",%>*#7#&'2)6"*,%"#46)3)*&)3#)*#2"#42"*&"n#2"#46)sencia de quelantes vegetales involucrados en &6"*34'6&)#7#"21",)*"1%)*&':#7#)2#1'9%1%)*&'#

Tabla 2.#J/"4&"/"#/)#$@)6%"*:#\ffM

Hiperacumuladoras

Metal

Thlaspi caerulescens

zinc(Zn), cadmio (Cd)

Berkheya coddii

níquel (Ni)

Astragalus racemosus

selenio (Se)

Pteris vittata

arsénico (As)

Ipomoea alpina

cobre (Cu)

Haumaniastrum robertii

cobalto (Co)

Iberis intermedia

talio (Tl)

Gysophila spaerocephala

boro (B)

Plantas comunes

Contaminantes y entorno

Metales pesados, selenio y radionucleótidos en el suelo Solventes clorados y nitratos álamo en aguas subterráneas, metales pesados en el suelo Solventes clorados en agua Álamo carolino subterráneas; metales, nitratos Desechos explosivos en Lenteja de agua aguas subterráneas Hidrocarburos aromáticos mora policíclicos (PAHs) en el suelo Radionucleótidos en aguas girasol subterráneas Metales pesados e pastos hidrocarburos en el suelo Hidrocarburos en suelos y alfalfa, enebro aguas subterráneas Mostaza parda

Adaptada de Cherian, 2005

550 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

de los contaminantes en los ecosistemas ha,%"#*%9)2)3#&6>0,'3#3.4)6%'6)3A#J2(.*'3#/)#2'3# 4"681)&6'3#183#%14'6&"*&)3#6)2",%'*"/'3#,'*# )3&'3#46',)3'3#3)#,'1)*&"*#"#,'*&%*.",%>*c P* T$"#$87")$A$/$#'#*#,/*&").'6$)').,Q la ;%'/%34'*%;%2%/"/#/)#.*#,'*&"1%*"*&)#/)4)*/)# -.)6&)1)*&)# /)# 3.3# 46'4%)/"/)3# 5.=1%,"3:#)*#4"6&%,.2"6#/)#3.#@%/6'-';%,%/"/#7#9'2"&%2%/"/A#U'6#)*# asistida) y el agregado de surfactantes 4"6"#,'*&"1%*"*&)3#@%/6'->;%,'3A P* U:"&,8"8* :$I"89-:$&"8Q en la rizósfera, 2"#?'*"#,'146)*/%/"#@"3&"#]#11#/)#/%3tancia de la raíz, existe una mayor concentración de microorganismos como consecuencia de la liberación de foto3%*&"&'3A# q.,@'3# 4'3))*# ,"4",%/"/# 6)mediadora y la liberación de metabolitos 3),.*/"6%'3#4'6#4"6&)#/)#2"#42"*&"#4.)/)# ",&%9"6#)*#)22'3#2"#)D46)3%>*#/)#()*)3#6)-

P*

P*

lacionados con la degradación de conta1%*"*&)3A#C*#2"#6%?>3-)6"#',.66)*#46',)3'3#5.)#4.)/)*#,'*&6%;.%6#"#%*,6)1)*&"6# 2"#;%'/%34'*%;%2%/"/#/)2#,'*&"1%*"*&)A#J2(.*'3#);%,'3n#;Q#2"#2%;)6",%>*# /)# )D./"/'3# 9)()&"2)3# 5.)# 46'1.)9)*# la síntesis de biosurfactantes bacterianos; c) la liberación de enzimas vegeta2)3# 7# ;",&)6%"*"3# ,"4",)3# /)# 1'/%0,"6# "2(.*'3# ,'14.)3&'3# '6(8*%,'3# ".1)*&"*/'# 3.# ;%'/%34'*%;%2%/"/n# /Q# 2"# 2%;)6",%>*#/)#5.)2"*&)3#4'6#4"6&)#/)#42"*&"3#7# bacterias (sideróforos, ácidos orgánicos 7#-)*>2%,'3Q#5.)#4)61%&)*#%*,6)1)*&"6#2"# /%34'*%;%2%/"/#/)#1)&"2)3n#)Q#2"#)D&6.3%>*# /)#46'&'*)3#4'6#2"3#42"*&"3#4"6"#",%/%0car el suelo; f) la liberación de enzimas vegetales que convierten los metales en -'61"3#1)*'3#&>D%,"3#'#183#;%'/%34'*%;2)3#I4'6#)*# /)4)*/)# /)# 2"# *"&.6"2)?"# /)2# ,'*&"1%*"*&)A#U'6#2'#()*)6"2:#2"3#42"*&"3# *'# 4'3))*# &6"*34'6&"/'6)3# )34),=0,'3# 4"6"# 2'3# ,'*&"1%*"*&)3# '6(8*%,'3:# 2'3# ,."2)3#3'*#)*#3.#1"7'6="#46'/.,&'3#/)# la actividad humana. De acuerdo con su (6"/'# @%/6'-';%,%/"/:# )3&'3# ,'14.)3&'3# difunden a través de los tejidos vegetales. En cambio, los contaminantes inorgá*%,'3# 3'*# %*,'64'6"/'3# 1)/%"*&)# &6"*34'6&"/'6)3# /)# 1)1;6"*"# 46))D%3&)*&)3# debido a que son naturalmente utilizados como nutrientes o guardan relación con ,'14.)3&'3# *'61"21)*&)# ,"4&"/'3# 4'6# 2"3#42"*&"3A#U'6#)*#3)(.%/'3#4'6#)2#3),.)3&6'#",&%9'# /)2# ,'142)*:# )3# *),)3"6%'# )3&";2),)6#-)@",%)*&)1)*&)#)2#&%4'#/)#,'*&"1%*",%>*A#$'*#)2#0*#/)#.&%2%?"6#)2#3%3&)1"# 183# "46'4%"/':# 4.)/)*# 6)"2%?"63)# )*3"7'3#"#4)5.)S"#)3,"2"#4"6"#,'14"6"6# 2"# )-),&%9%/"/# /)# /%3&%*&"3# )34),%)3# /)# 42"*&"3A#C3#*),)3"6%'#"*"2%?"6#&"1;%+*#2"# cantidad y las características de los com4.)3&'3#5.)#2"#42"*&"#46'/.,)#7R'#2%;)6"A P* Esquema y densidad de las plantaciones: 2"# /)*3%/"/# /)# 42"*&",%>*# /)4)*/)68# /)# 2"# 42"*&"# .&%2%?"/"# 7# /)2# &%4'# /)# "42%,",%>*A# C3# %14'6&"*&)# ,"2,.2"6# 2"# ,"*&%/"/#/)#;%'1"3"#46'/.,%/"#4'6#.*%/"/#/)#3.4)60,%)#"#2'#2"6('#/)2#&%)14'#7:# 3%#)3#*),)3"6%'#6)"2%?"6#42"*&",%'*)3#3.,)3%9"3#5.)#4)61%&"*#"2,"*?"6#&"3"3#/)# descontaminación adecuadas. P* X'8'*#,*&'7.'&$()*#,/*&").'6$)').,*B* .$,67"*#,*/$67$,I'*:,Y5,:$#"Q el tiem4'# &'&"2# 6)5.)6%/'# 4"6"# .*# /)&)61%*"/'# )35.)1"#/)#0&'66)1)/%",%>*#/)4)*/)68# /)#2"3#9"6%";2)3#"4.*&"/"3#"*&)6%'61)*&)A# !"# &"3"# /)# /)3,'*&"1%*",%>*# 4.)/)# /)&)61%*"63)# "42%,"*/'# /%3&%*&"3# ),.",%'*)3#/)3"66'22"/"3#)34),%"21)*&)#,'*# )3&)#0*A P* =::$+'&$()Z* $)856"8* '+:")(6$&"8* B* mantenimiento: la frecuencia y cantidad de las lluvias y las características del cli1"#6)(%'*"2#3'*#-",&'6)3#5.)#4'/6="*#/)&)61%*"6#2"#*),)3%/"/# /)#"(."#4"6"#6%)(':#2'#5.)#46)3.4'*)#2"#)D%3&)*,%"#,'3&'3# "/%,%'*"2)3#4"6"#2'3#46',)3'3#/)#0&'66)1)/%",%>*# &)66)3&6)A# C3# %14'6&"*&)# "*"2%?"6#2'3#46',)3'3#/)#1'9%1%)*&'#7#/)3&%*",%>*# 0*"2# /)2# "(."A# U'6# )*A# o&6'3# ,'3&'3# %14'6&"*&)3# a considerar en el esquema son los de %142"*&",%>*:# -)6&%2%?",%>*:# 1"*&)*%1%)*to y control, y tareas de cosecha y recolección. Finalmente, no debe excluirse la ocurrencia de eventos recurrentes en la "(6%,.2&.6":# &"2)3# ,'1'# 42"("3:# 3)5.="3:# @)2"/"3# '# 2"# /)46)/",%>*# 4'6# "*%1"2)3:# 2'3#5.)#4.)/)*#%*&6'/.,%6#3%&.",%'*)3#*'# 46)9%3&"3#)*#)2#)35.)1"#42"*&)"/'A#U'6# )3&"# 6"?>*:# )3# 6),'1)*/";2)# /%34'*)6# /)#)3&6"&)(%"3#/)#,'*&%*()*,%"#4"6"#"3)(.6"6#)2#+D%&'#/)2#46'(6"1"A# 3&#%+#$2!+&,'+%+,!"(%$.$"#+%,-+,$*(!$"(!+, 1$,-+,*#0%%$.$1!+(!;" G)#@"*#42"*&)"/'#/%-)6)*&)3#)3&6"&)(%"3#4"6"# 1)*#@",%)*/'#.3'#/)#42"*&"3#&6"*3(+*%cas. Algunas de estas estrategias son: a) au1)*&'# /)# 2"# %*,'64'6",%>*# /)# ,'*&"1%*"*&)3# mediante la 3';6))D46)3%>*# 7R'# "2&)6",%>*# /)# 2"#)34),%0,%/"/#/)#/%3&%*&'3#&6"*34'6&"/'6)3#/)# 1)1;6"*":#'#2"#)D46)3%>*#7#3),6),%>*#/)#46'&)=*"3#'#,'14.)3&'3#5.)2"*&)3n#;Q#".1)*&'#/)# 2"#)0,%)*,%"#/)#/)(6"/",%>*#/)#,'*&"1%*"*&)3# '6(8*%,'3# 1)/%"*&)# 3';6))D46)3%>*# /)# )*?%1"3# )34),=0,"3n# ,Q# ".1)*&'# /)# 2"# ",.1.2",%>*#/)#1)&"2)3#4)3"/'3:#1)/%"*&)#)D46)3%>*# /)#)*?%1"3#,"4",)3#/)#-"9'6),)6#3.#,'**# 46'vienen de animales o de microorganismos, ya 5.)#+3&'3#4'3))*#)2#,'142)1)*&'#)*?%18&%,'# *),)3"6%'# 4"6"# /)(6"/"6# 7R'# 1%*)6"2%?"6# 2"3# 1'2+,.2"3#'6(8*%,"3:#,'142)1)*&"*/'#"3=#2"3# ,"4",%/"/)3#1)&";>2%,"3#/)#2"3#42"*&"3A#C*#2"# medida en que se diluciden las bases molecu2"6)3# 7# 03%'2>(%,"3# /)# 2'3# 46',)3'3# /)# ,"4&",%>*:#&6"*34'6&)#7#",.1.2",%>*#/)#2'3#,'*&"1%*"*&)3# )*# 2"3# 42"*&"3# 0&'66)1)/%"/'6"3:# 3)68# 4'3%;2)# )*,"6"6# *.)9"3# )3&6"&)(%"3# /)# 1'/%0,",%>*# ()*+&%,"# )*# '&6"3# )34),%)3# 9)()&"2)3A# o&6"3# 2=*)"3# /)# %*9)3&%(",%>*# 46'1%3'6%"3# "4.*&"*#"#%*,6)1)*&"6#2"#)0,%)*,%"#/)2#46',)3'# /)# 0&'66)1)/%",%>*# 1)*#,'1;%*"/"#/)#2'3#()*)3#merB y merA )*/>0&'3:# 7"# 3)"*# *"&.6"2)3# '# ()*+&%,"1)*&)# )*#.*"#1%31"#42"*&"#@"#4)61%&%/'#2"#';&)*,%>*# 1'/%0,"/'3A# de líneas que resisten concentraciones de fenilmercurioacetato 100 veces mayores a las que 3U$.'-0&,1$,*#0%%$.$1!+(!;" 6)3%3&)*#2"3#42"*&"3#*'#&6"*3(+*%,"3#IE%(.6"#ZQA# !"# 0&'66)1)/%",%>*# 4"6"# 2"# /)3,'*&"1%nación de aguas, suelos y aire ha resultado exitosa en un número considerable de casos. !'3#)(%,"# /)# -)*'2)3# 1)/%"*&)# )2# .3'# /)# 4)6'D%/)2# 1)6,.6%'# I1)&%21)6,.6%"2)3Q:# )*# ,'14.)3- dasas y oxidasas. Sin embargo, se necesitan tos más inocuos (mercurio iónico y metano); (6"*/)3# ,"*&%/"/)3# /)# )*?%1"3# 4"6"# 2'(6"6# 1%)*&6"3#5.)#2"#3)(.*/"#4)61%&)#&6"*3-'61"6#)2# .*"#)0,%)*,%"#/)#/)3,'*&"1%*",%>*#"/),."/":# mercurio iónico en mercurio elemental. La ex- 2'#5.)#/%0,.2&"#3.#"42%,",%>*#"#)3,"2"#%*/.3&6%"2A#

554 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

_*"#)3&6"&)(%"#4"6"#3.4)6"6#)3&"#2%1%&",%>*#)3# )2#.3'#/)#42"*&"3#)*&)6"3#,'1'#a&6"*3-'61"/'ras” de fenoles. _*"# 4'3%;2)# @)66"1%)*&"# 4"6"# 46',)3'3# /)# 0&'66)1)/%",%>*#)3#)2#,.2&%9'#/)#6"=,)3#&6"*3-'6madas con Agrobacterium rhizogenes ("raíces en cabellera"). Las raíces de tomate tratadas con esta bacteria contienen altos niveles de 4)6'D%/"/"3:# 7# )*# ,'*3),.)*,%"# 3'*# ,"4",)3# de remover fenoles. En un trabajo realizado en )2#"S'#\ffM:#)*#2"#_*%9)63%/"/#/)#N='#$."6&'# (Córdoba, Argentina), se obtuvieron raíces en cabellera transgénicas de tomate (Lycopersicum esculentum Mill. cv. Pera) que sobreex46)3"*#)2#()*#tpx1#IE%(.6"#MQA#C3&)#()*#,'/%0,"# .*"# 4)6'D%/"3"# ;83%,"# 5.)# 3)# 2',"2%?"# )*# 2"# 4"6)/#,)2.2"6#/)#2"3#6"=,)3#/)#&'1"&)A#G)#"*"2%?>#2"#,"4",%/"/#/)#/%,@"3#6"=,)3#4"6"#6)1'9)6# fenol utilizando como controles raíces en ca;)22)6"#/)#42"*&"3#*'#&6"*3(+*%,"3A#!"3#6"=,)3# &6"*3(+*%,"3#-.)6'*#,"4",)3#/)#6)1'9)6#@"3&"# .*#XMg#/)2#-)*'2#"/%,%'*"/':#1%)*&6"3#5.)#2'3# controles no transgénicos sólo removieron un ]MgA# C3&'3# 6)3.2&"/'3# 3.(%)6)*# 5.)# 2"3# 6"=,)3#)*#,";)22)6"#4'/6="*#6)3.2&"6#@)66"1%)*&"3# 1.7#B&%2)3#4"6"#2"#2%14%)?"#/)#)`.)*&)3#,'*&"minados.

7#"63)*%&'#IJ3#FFFQA#C2#46%1)6'#%*&)60)6)#,'*#46'cesos celulares como la fosforilación oxidativa y la síntesis de ATP, mientras que el segundo 3)#.*)#"#(6.4'3#3.2-@%/6%2'#)*#/)&6%1)*&'#/)#2"# -.*,%>*# 46'&)%,"# )*# ()*)6"2A# !"# 1"7'6# -.)*&)# de contaminación del agua bebible y de la cadena alimentaria son los cursos de agua, suelos y sedimentos contaminados con As. Esto ha causado envenenamientos masivos que, entre otros síntomas, generan lesiones y cán,)6)3#)*#2"#4%)2A# En la naturaleza, las actividades geoquímicas y microbianas contribuyen también a la movilización del As hacia el ambiente. Sin embargo, es la actividad humana la que más contribuye a )3&)#46',)3':#)D",)6;"*/'#"3=#)2#46';2)1"A#C*# India y Bangladesh, la contaminación de aguas ,'*#J3#4'*)#)*#6%)3('#2"#"2%1)*&",%>*#;"3"/"# en cultivos tales como el arroz y el maíz. Es&"3# )34),%)3# 3'*# ,"4",)3# /)# ",.1.2"6#J3# )*# 3.3#(6"*'3:#2'#5.)#()*)6"#6%)3('3#4'&)*,%"2)3# 4"6"#2'3#,'*3.1%/'6)3#@.1"*'3A#!'3#1+&'/'3# -=3%,'3# 7# 5.=1%,'3# "42%,"/'3# @"3&"# @'7# 4"6"# disminuir las contaminaciones de As no han resultado exitosos. En este contexto, las algas y 42"*&"3#",.8&%,"3#@%4)6",.1.2"/'6"3#/)#J3#3)# 46)3)*&"*#,'1'#.*"#'4,%>*#46'1)&)/'6"A C*# )2# "S'# \ff\# .*# (6.4'# /)# %*9)3&%("/'6)3# /%3)S># .*# 3%3&)1"# /)# 0&'66)1)/%",%>*# /)# J3#;"3"/'#)*#42"*&"3#/)#Arabidopsis thaliana &6"*3(+*%,"3:#,"4",)3#/)#,'*9)6&%6#)2#"63)*"&'# en arsenito, el cuál era luego secuestrado en 2"3#@'*#/)#J3#3)#@"#.&%2%?"/'#4"6"#/)3,'*&"1%*"6#"(."#.&%2%?"*/'#.*#3%3&)1"#/)#0&'02&6"ción. Pteris vittata#4.)/)#6)/.,%6#2"#,'*,)*&6",%>*#/)#J3#46)3)*&)#)*#)2#"(."#/)3/)#,'*,)*&6",%'*)3#/)#\ff#1(R!#"#1)*'3#/)#Mf#1(R!#)*# 3>2'#\#/="3:#4)61%&%)*/'#2"#6)1',%>*#,'142)&"# al cabo de 3 días. Tratamiento de aguas residuales urbanas !'3# 3".,)3# 4.)/)*# 3)6# .&%2%?"/'3# ,'*# 0*)3#/)#0&'66)1)/%",%>*#4"6"#)2#&6"&"1%)*&'#/)# aguas residuales urbanas que contienen altas concentraciones de nitrógeno y fósforo. Estas sustancias forman una solución nutritiva que 4.)/)#3)6#.&%2%?"/"#4"6"#)2#6%)('#/)#/%,@'3#86;'2)3:#7#"3=#3'*#a;%'&6"*3-'61"/"3e#)*#;%'1"3"#B&%2A#C*#C*h‹4%*(:#.*"#,%./"/#/)#G.),%"#,'*# unos 20.000 habitantes, se utiliza un sistema /)#0&'66)1)/%",%>*#4"6"#&6"&"6#)2#"(."#6)3%/."2# 6%,"# )*# *%&6>()*'# 46',)/)*&)# /)2# -"*('# /)# "2,"*&"6%22"/'#I46)9%"1)*&)#&6"&"/"#)*#.*"#42"*&"# /)4.6"/'6"QA#C2#)`.)*&)#3)#/%3&6%;.7)#4'6#.*"# 42"*&",%>*#/)#3".,)3#/)#[M#@),&86)"3#/.6"*&)# )2#4)6='/'#/)#,6),%1%)*&'#IE%(.6"#[QA#!"3#"(."3# ,'*&"1%*"/"3#,'*&%)*)*#.*'3#Xff#1(R!#/)#*%trógeno. El sistema trata unas 11 toneladas de nitrógeno y 0,2 toneladas de fósforo al año en un volumen de 200.000 m3 de aguas residua2)3A# !'3# 4'3%;2)3# 6%)3('3# 1)/%'"1;%)*&"2)3:# como emisiones de óxido nitroso (N2O) a la atmósfera, son analizados continuamente; los 6)3.2&"/'3#';&)*%/'3#@"3&"#)2#46)3)*&)#%*/%,"*# que los mismos son mínimos.

Figura 6. EdenfernTM

556 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

Figura 7.#G%3&)1"#/)#0&'66)1)/%",%>*#5.)#.&%2%?"#.*"#42"*&",%>*#/)#[M#@),&86)"3#/)#3".,)3#)*#C*h‹4%*(:# G.),%"A#U2"*&"#/)#&6"&"1%)*&'#/)#"(."3#6)3%/."2)3#I46%1)6#42"*'Q:#4%2)&"3#4"6"#"21",)*"6#2"3#"(."3#)*# %*9%)6*'#I"2#-'*/'Q#7#,"14'3#/)#3".,)3#6)("/'3#,'*#)`.)*&)3#/)#-"*('3A#UA#J6'*33'*

Lecturas recomendadas b)**%,)22%#N:#G&)4*%)r3h"#†:#b"*",@#J:#G?"*#)*#G.),%"A#_*"3729"# \\]:#MY:#Z[OMfA# Pilon-Smits E. 2007. Phytoremediation. Ann N)9#U2"*&#b%'2'(7:#MY:#]MO^WA Gh%**)6# t:# w6%(@&# L:# U'6&)6Oi'--# CA# \ff[A# q)6,.67#.4&"h)#"*/#",,.1.2"&%'*#;7#-'.6#34),%)3#'-#"5."&%,#42"*&3A#C*9%6'*1)*&"2#U'22.&%'*:# ]ZM:#\^ZO\^[A k"*#Jh)*#bA#\ffXA#T6"*3()*%,#42"*&3#-'6#4@7&'6)1)/%"&%'*c# @)24%*(# *"&.6)# &'# ,2)"*# .4# )*9%'*1)*&"2# 4'22.&%'*A#T6)*/3# %*# b%'&),@*'2'(7:# \Y:#\\MO\\[A Wevar Oller AL, Agostini E, Talano MA, Ca4'?.,,"# $:# q%26"/# GN:# T%(%)6# HJ:# q)/%*"# qFA# \ffMA# o9)6)D46)33%'*# '-# "# ;"3%,# 4)6'D%/"3)# in transgenic tomato (Lycopersicon esculentum# q%22A# ,9A# U)6"Q# @"%67# 6''&3# %*,6)"3)3# 4@7&'6)1)/%"&%'*# '-# 4@)*'2A# U2"*&# G,%)*,):# ]YW:# ]]f\|]]]]A CKCLGUJ$Cc#@&&4cRRrrrA)/)*34",)A,'1 k%/)'# )D42%,"&%9'# /)# 2"# Environmental Protection Agency (EPA, USA), Crozet Phytorremediationc#@&&4cRRrrrA)4"A('9R')664"()R3.4)6-.*/R1%3,R,6'?)&‡4@7&'A@&1

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 557

558 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

V . CAPÍTULO 16 Plantas como biorreactores Fernando Almonacid Bravo; Sonia Wirth; María Eugenia Segretin; Mauro Morgenfeld; Ezequiel Matías Lentz Introducción En los últimos años, la demanda y el uso de 4+4&%/'3# 7# 46'&)=*"3# &)6"4+.&%,'3# )*# 2"# 1)/%,%*"#@.1"*"#7#9)&)6%*"6%"#@"*#)D4)6%1)*&"/'# un marcado incremento. El mercado mundial /)#;%'-861",'3#4"6"#.3'#@.1"*'#"2,"*?"#",tualmente los 30.000 millones de dólares, y se )3&%1"#5.)#3)#/.42%,"68#4"6"#)2#"S'#\f]fA#q83# /)#\ff#46'/.,&'3#3)#)*,.)*&6"*#)*#)9"2.",%>*# ,2=*%,":#2%/)6"/'3#4'6#2'3#"*&%,.)64'3#1'*',2'nales de los cuales unos 70 se estarían comer,%"2%?"*/'# )*# 2'3# 46>D%1'3# "S'3A# G>2'# ,."&6'# 1'2+,.2"3# ,'146)*/)*# )2# [Mg# /)# 2"# 46'/.,,%>*#",&."2#7:#3%#2"3#46)/%,,%'*)3#3'*#,'66),&"3:# 2"# /)1"*/"# 4'/6="# 3.4)6"6# 2"# ,"4",%/"/# /)# manufactura, a menos que se desarrollen nue9'3#3%3&)1"3#/)#46'/.,,%>*A# J,&."21)*&):# 2"# 46'/.,,%>*# /)# ;%'-861",'3# se realiza utilizando básicamente dos sistemas: microorganismos y cultivo de células de mamífero. N)34),&'#"2#46%1)6#3%3&)1":#)D%3&)#2"#/%0,.2&"/# "3',%"/"# "# 2"# %*,"4",%/"/# 5.)# &%)*)*# 2"3# ;",&)6%"3#7#@'*('3#/)#46'/.,%6#)*#2"3#46'&)=*"3# "*%1"2)3#,%)6&"3#1'/%0,",%'*)3#5.)#)*#2"#1"7'6="#/)#2'3#,"3'3#3'*#%*/%34)*3";2)3#4"6"#3.# -.*,%'*"2%/"/:#,'1'#4'6#)*#%*%,%"2#7#)2#,'3&'#4"6"#)2#".1)*&'#)*#2"# )3,"2"#/)#46'/.,,%>*#3'*#6)2"&%9"1)*&)#;"()*'3# animales, endotoxinas bacterianas o secuen,%"3#/)#JKL#'*,'(+*%,"3#7#4.)/)#"46'9),@"6-

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 559

3)# )2# ,'*',%1%)*&'# 46)9%'# /)# 2'3# 3%3&)1"3# /)# 1'2%)*/"# 7# )D&6",,%>*# )*# 2"3# 46%1)6"3# )&"4"3# /)2# 46',)3'# /)# 4.6%0,",%>*A# _*"# 9)*&"*:# &6"*34'6&)# 7# /%3&6%;.,%>*A# q83# "B*:# 2'3# 1),"*%31'3# /)# 3=*&)3%3# 7# 1'/%0,",%'*)3# 4'3&)6%'6)3# 3'*# 2'3# 46'4%'3# /)# 2"3# ,+2.2"3# /)# 1"1=-)6'3:# 4)61%&%)*/'# 2"# 46'/.,,%>*# 7# )*3"1;2"/'#/)#46'&)=*"3#1.2&%1+6%,"3:#,'1'#2'3# "*&%,.)64'3A# C3# %14'6&"*&)# 6),"2,"6# 5.)# )D%3&)*#/%-)6)*,%"3#)*&6)#42"*&"3#7#"*%1"2)3#)*#2"# (2%,'3%2",%>*# /)# 46'&)=*"3:# )3&"3# /%-)6)*,%"3# 4.)/)*#"-),&"6#2"#)3&";%2%/"/:#2"#",&%9%/"/#;%'2>(%,"#7#2"#"*&%()*%,%/"/n#)*#6)3.1)*#4'/6="*# "-),&"6#2"#".&)*&%,%/"/#/)2#46'/.,&'#0*"2A $."*/'#3)#,'14"6"*#2'3#,'3&'3#/)#46'/.,,%>*# /)# 46'&)=*"3# 6),'1;%*"*&)3# )*# /%3&%*&'3# sistemas se demuestra que, a menos que los *%9)2)3# /)# 46'&)=*"# 6),'1;%*"*&)# "2,"*?"/'3# 3)"*#)D,)3%9"1)*&)#;"*A#J2#6)34),&':#2"3#42"*&"3#4'3))*# 9)*&"*:#;Q#6)/.,%6# 2'3# ,'3&'3# /)# 4.6%0,",%>*:# 7# ,Q# 2'(6"6# .*# 46'ducto de características idénticas o similares al sintetizado en el sistema nativo (autenticidad).

/)#2"#46'&)=*"#6),'1;%*"*&)#4.)/)#2'(6"63)#3%guiendo diversas estrategias. La elección de la 1%31"# '# ,'1;%*",%>*# /)# )22"3# /)4)*/)68# /)# 2"3# ,"6",&)6=3&%,"3# /)# 2"# 46'&)=*"# "# 3%*&)&%?"6:# /)#2"#)34),%)#9)()&"2#.&%2%?"/"#7#/)#2"3#*),)3%/"/)3#/)#46'/.,,%>*A#i)*)6"21)*&):#)3#/%-=,%2# 46)/),%6#,.82#/)#)3&'3#"34),&'3#&)*/68#1"7'6# %14",&'# 4"6"# 46'/.,%6# ,'*# +D%&'# .*"# 46'&)=*"# 4"6&%,.2"6A# C22'# 6)5.%)6):# 4'6# 2'# &"*&':# )*3"7"6# 1B2&%42)3#9"6%";2)3#4"6"#2'(6"6#*%9)2)3#>4&%1'3# /)#46'/.,,%>*A#!'3#)2)1)*&'3#"#&)*)6#)*#,.)*&"# 3'*# 2"# )2),,%>*# /)2# 3%3&)1"# /)# )D46)3%>*# 7# /)2# ()61'42"31"# "# &6"*3-'61"6:# 7# )2# .3'# /)# herramientas moleculares (secuencias regula/'6"3# /)# 2"# )D46)3%>*Q# 4"6"# )2# /%3)S'# /)# 2"3# construcciones genéticas que contengan las 3),.)*,%"3#/)#2"3#46'&)=*"3#"#)D46)3"6A

3/,&&$()*#,/*8$8.,6'*#,*,>7:,8$() En cuanto a la elección del sistema de ex46)3%>*:#2"3#'4,%'*)3#,'146)*/)*#/'3#(6"*/)3# (6.4'3c#3%3&)1"3#%*&)(6"&%9'3#7#*'#%*&)(6"&%9'3A# C2#46%1)6#(6.4'#3)#6)0)6)#"#"5.)22'3#3%3&)1"3# 5.)#4)61%&)*#2"#%*&)(6",%>*#)3&";2)#/)#2"#,'*3trucción genética en el genoma vegetal, tanto en el núcleo como en las organelas. El resultado es una transformación estable y heredable, 6)5.%)6)#)&"4"3#/)#,.2&%9'#/)#&)*#*.,2)"6#46)3)*&"#2"#9)*&"*#@'1'2'(":#4)61%&%)*/'#/%6%(%6#"2# !"#'4&%1%?",%>*#/)#2'3#*%9)2)3#/)#46'/.,,%>*# &6"*3(+*# "# .*# )34",%'# %*&)6(+*%,'# 7:# @"3&"# )2#

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1'1)*&':# *'# 3)# @"*# 6)4'6&"/'# )*# ,2'6'42"3&'3#)-),&'#/)#4'3%,%>*#'#3%2)*,%"1%)*&'#(+*%,'A# q83#"B*:#"2#*'#&6"*31%&%63)#2'3#,2'6'42"3&'3#"2# 4'2)*#)*#2"#1"7'6="#/)#2"3#42"*&"3:#3)#/%0,.2&"# )2# `.*:#3=# )D%3&)*#2%1%&",%'*)3# /)#)D46)3%>*#/);%/'#"#3%2)*,%"1%)*&'#4'3&O&6"*,6%4,%'*"2A Recientemente, mediante el uso de vectores virales de nueva generación, se han logrado *%9)2)3#/)#)D46)3%>*#1.7#"2&'3:#)*#.*#3%3&)1"# /)*'1%*"/'#amagninfection”. 3/,&&$()*#,*/'*,87,&$,*4,+,.'/ C*#,."*&'#"#2"#)34),%)#9)()&"2:#)D%3&)*#/%3&%*&"3# 42"*&"3# 5.)# @"*# 3%/'# .&%2%?"/"3# ,'1'# 42"&"-'61"#)*#2'3#;%'66)",&'6)3:#)*&6)#2"3#5.)# 3)#%*,2.7)*#&";",':#4"4":#&'1"&):#1"=?#)&,A#C*# 46%*,%4%'# *'# )D%3&)# .*"# 6)(2"# 5.)# 4)61%&"# )2)(%6#2"#42"*&"#%/)"2#4"6"#.*#/)&)61%*"/'#';*#&6"*3%&'6%'3:#-",%2%/"/#/)# cultivo a gran escala, rendimiento de bioma3":# )3&";%2%/"/# /)# 2"# 46'&)=*"# )*# 2'3# /%3&%*&'3# &)*:# 7"# 5.)# 3)# 4.)/)# "21",)*"6# )2# (6"*'# @"3&"# )2# 1'1)*&'# 5.)#3)"#*),)3"6%'#,'1)*?"6#,'*#)2#46',)3'#/)# 4.6%0,",%>*A# !"# /)39)*&"*# ;"3"/'3# )*# -6.&"3#7#@'6&"2%?"3:#4)61%&)*#.&%2%?"6#/%6),&"1)*&)# )2# &)*# /)# .*# )3&%1.2'# -=3%,'# '# 5.=1%,'# )D&)6*':# 4)61%&%)*/'# sión, e incluyen: P# la elección de elementos genéticos re- 46'/.,%6#46'&)=*"3#5.)#4'/6="*#3)6#/)2)&+6)"3# (.2"/'6)3# 4"6"# )D46)3"6# 2"# 46'&)=*"# )*# 4"6"# 2"# 42"*&"A# o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a tabla 1 muestra algunos de los sistemas .&%2%?"/'3#7#3.3#46%*,%4"2)3#,"6",&)6=3&%,"3A

Figura 1. N%?'3),6),%>*# )*# 42"*&"3# &6"*3(+*%,"3A U2"*&"3# &6"*3(+*%,"3# /)# &";",'# 5.)# )D46)3"*# @CiE:# creciendo en medio MS sobre un disco de nitrocelulosa (izquierda), ensayo de root blot realizado sobre )3&"3#1)1;6"*"3#7#6)9)2"/'#,'*#.*#"*&%,.)64'#"*&%O@CiE#I/)6),@"QA

Tomate

Consumo crudo de los frutos. Disponibilidad de promotores específicos para la expresión en frutos. Cultivo en invernaderos a escala industrial bien establecido. Contenido proteico en frutos relativamente bajo.

Cereales

Tecnología de producción ampliamente establecida. Almacenamiento estable de la proteína recombinante en las semillas. Procesamiento industrial de las semillas bien establecido.

Alfalfa

Alto contenido proteico en hojas. Producción de biomasa abundante.

Lemna (lenteja Alta eficiencia de proliferación clonal. de agua) Alta tasa de duplicación de la biomasa. Rizosecresión muy eficiente. Physcomitrella Genoma completamente secuenciado. (musgo) Transformación por recombinación homologa.

562 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

3.#)D&6)1'#LO&)61%*"2#4"6"#5.)#3)"#&6"*34'6&"/"# "2# 6)&=,.2'# )*/'42"318&%,'n# /)# *'# ,'*&"6# ,'*# '&6"# 3)S"2# 2"# 46'&)=*"# 3)(.%68# 3.# ,"1%*'# 7#2.)('#/)#4"3"6#4'6#)2#i'2(%#3)68#)*9%"/"#"2# )34",%'# %*&)6,)2.2"6# '# )34",%'# "4'4283&%,'A# G%# 4'3))#2"#3)S"2#/)#6)&)*,%>*#IHRtKC!Q:#2"#46'teína será entonces retenida en retículo y se )9%&"#"3=#5.)#3)#46'/.?,"*#2"3#(2%,'3%2",%'*)3# 183#,'142)1%,"3Q# '# /%6%(%62"3# /)3/)# )2# ,%&'3'2# "# 2'3# ,2'6'42"3&'3# .&%2%?"*/'# señales amino-terminales adecuadas como, 4'6#)*#/)#.*"#/)&)61%*"/"#46'&)=*"#)*#/%-)6)*&)3# ,'14"6&%1)*&'3A# K)# )22"3# 3)# /)/.,)# 2"#*),)3%/"/#/)#)*9%"6#2"#46'&)=*"#6),'1;%*"*&)# "# "5.)2# )34",%'# %*&6",)2.2"6# /'*/)# "2,"*,)# .*# ,'66),&'# 42)("1%)*&'# 7:# )*# ,'*3),.)*,%":# 1)*:# "2# /%6%(%6# 2"# )D46)3%>*# /)# @CiE# "2# )34",%'# %*&)6,)2.2"6# I"4'42"3&'Q:# 46';";2)1)*&)# 3)# /);"# "# 5.)# "2# &6"*3%&"6#"#&6"9+3#/)2#3%3&)1"#/)#3),6),%>*#4"3"*/'#4'6#6)&=,.2':#4.)/)*#-'61"63)#,'66),&"1)*&)#2'3#4.)*&)3#/%3.2-.6'#46)3)*&)3#)*#)3&"# 46'&)=*"#5.)#3'*#*),)3"6%'3#4"6"#"2,"*?"6#3.# ,'*-'61",%>*#183#)3&";2)A#E%*"21)*&):#2"#46'teína es secretada al medio que rodea a las 6"=,)3#I6%?'3),6),%>*Q:#@),@'#5.)#4)61%&%6="#4.6%0,"6#@CiE#6),'1;%*"*&)#/)2#1)/%'#/)#,.2&%9'# en el cuál se encuentran inmersas las raíces /)#42"*&"3#&6"*3(+*%,"3#,6),%)*/'#)*#.*#3%3&)1"#@%/6'4>*%,'#I0(.6"#]QA Por último, otro factor a tener en cuenta a la @'6"# /)# 42"*&)"6# .*"# )3&6"&)(%"# /)# )D46)3%>*# /)#46'&)=*"3#@)&)6>2'("3#)*#42"*&"3:#)3#)2#&)*# %*`.%68# )*# )2# 1)*# /)# 46'&)=*"3# 6),'1;%*"*&)3# /)# "42%,",%>*# &)6"4+.&%,"# '# %*/.3&6%"2A#J.*5.)# 4"6"# ,"/"# 46'&)=*"# )*# 4"6&%cular se deban evaluar distintas alternativas hasta encontrar aquella en la que los niveles /)#)D46)3%>*#3)"*#>4&%1'3:#)3#/)#)34)6"6#5.)# "#,'6&'#42"?'#2"#.&%2%?",%>*#/)#2"3#42"*&"3#,'1'# ;%'66)",&'6)3#3)"#2"#'4,%>*#183#"&6",&%9"A Estrategias para reducir los costos de '7%!*(+(!;" _*"# )3&6"&)(%"# ,'1B*1)*&)# .&%2%?"/"# 4"6"# 6)/.,%6# 2'3# ,'3&'3# /)# 4.6%0,",%>*# ,'*3%3&)# )*# ",.1.2"6#2"#46'&)=*"#3%*&)&%?"/"#)*#)2#)34",%'# )D&6",)2.2"6# '# "4'42"3&'A# C2# )*9='# "2# )34",%'# extracelular se logra fusionando el extremo ,'66)34'*/%)*&)# "2# "1%*'# &)61%*"2# /)2# ()*# /)#

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 563

interés a una secuencia señal que dirige el &6"*34'6&)#/)#2"#46'&)=*"#"2#6)&=,.2'#)*/'42"3mático y de allí a la vía de secreción. Estos &%4'3#/)#4+4&%/'3#3)S"2#3)#@"22"*#"142%"1)*&)# ,'*3)69"/'3#)*#3.#-.*,%>*#7#3'*#46',)3"/'3# )*# -'61"# ,'O&6"/.,,%'*"2# 4'6# .*"# 4)4&%/"3"# )34),=0,"# 46)3)*&)# )*# )2# 2.1)*# /)2# 6)&=,.2'# )*/'42"318&%,'A#C2#"4'42"3&'#9)()&"2#)3&8#)*# contacto directo con el medio externo, de manera tal que si la raíz está creciendo en un 3%3&)1"#@%/6'4>*%,':#2"#46'&)=*"#6),'1;%*"*&)# se acumulará en el medio. Como el número de 46'&)=*"3# 3),6)&"/"3# )3# ()*)6"21)*&)# ;"*#/)#2"# 46'&)=*"#/)#%*&)6+3#"#.*"#'2)'3%*"A#!"3#'2)'3%*"3#3'*#46'&)=*"3#4)5.)S"3#5.)#3)#)*,.)*&6"*# %*3)6&"/"3# )*# 2"# 1'*',"4"# /)# -'3-'2=4%/'3# /)# 2'3# ,.)64'3# (6"3'3A# C3&"3# 46'&)=*"3# 3)# ",.1.2"*# )*# 2"3# 3)1%22"3# /)# 2"3# 42"*&"3# oleaginosas a niveles elevados. En colza, re46)3)*&"*#)*&6)#)2#X#7#)2#\fg#/)2#&'&"2#/)#2"3# 46'&)=*"3# /)# 2"# 3)1%22"A# !"3# ,'*3&6.,,%'*)3# incluyen una secuencia de reconocimiento es4),=0,"#4"6"#.*"#46'&)"3"A#_*"#9)?#6)"2%?"/"# 2"#4.6%0,",%>*:#2"#46'&)=*"#/)#%*&)6+3#3)#6)3,"&"#/)#2"#-.3%>*#4'6#&6"&"1%)*&'#,'*#2"#46'&)"3"# 5.)#6),'*',)#)3&"#3),.)*,%"#4)4&=/%,"A !"# 4.6%0,",%>*# /)# 2"# 46'&)=*"# -.3%'*"/"# "# '2)'3%*"3# )3# 3.1"1)*&)# 3)*,%22"# 7# 4)61%&)# ,'*,)*&6"6# 9"6%"3# 9),)3# )2# 46'/.,&'# /)# %*&)6+3A#b83%,"1)*&):#,'*3%3&)#)*#)2#46',)3"/'#7# homogeneización del material vegetal (semi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

Autenticidad del producto obtenido: glicosilación q.,@"3# 46'&)=*"3# &)6"4+.&%,"3# 3'*# (2%,'46'&)=*"3:#)*#2"3#,.82)3#2"#(2%,'3%2",%>*#4.)/)# afectar características fundamentales, como su resistencia a la desnaturalización térmica, /)(6"/",%>*# 46'&)'2=&%,":# 3'2.;%2%/"/# 7# ",&%9%dad biológica. _*"# /)# 2"3# /%-)6)*,%"3# 183# %14'6&"*&)3# )*# 2"3# 1'/%0,",%'*)3# 4'3&O&6"/.,,%'*"2)3# )*&6)# 42"*&"3# 7# "*%1"2)3# )3# )2# 4"&6>*# /)# LO(2%,'3%2",%>*A#!"3#46'&)=*"3#6),'1;%*"*&)3#@.1"*"3# 3%*&)&%?"/"3# )*# 42"*&"3# ,'*&%)*)*# (6.4'3# ,"6;'@%/6"&'3# /)2# &%4'# —# I]:\QOD%2'3"# ".3)*&)# )*# 46'&)=*"3#@.1"*"3:#7#,'*&%)*)*#.*"#1'2+,.2"# /)#-.,'3"#.*%/"#4'6#.*#)*2",)#/)2#&%4'##I]:^Q# )*#2.("6#/)##I]:YQ#,'1'#',.66)#)*#@.1"*'3A# Además, carecen de residuos terminales de galactosa y ácido siálico (ácido N-acetilneura*=1%,'Q#)*,'*&6"/'3#)*#1.,@"3#46'&)=*"3#*"tivas humanas. Aunque algunos trabajos han demostrado 5.)# "*&%,.)64'3# )D46)3"/'3# )*# 3%3&)1"3# 9)()&"2)3# ,'*&)*%)*/'# (2%,"*'3# )34),=0,'3# /)# 42"*&"3# *'# 3'*# %*1.*'(+*%,'3# )*# 1"1=-)6'3:# 7#5.)#2"3#46'&)=*"3#6),'1;%*"*&)3#)D46)3"/"3# en otros sistemas animales (incluyendo células )*#,.2&%9'#/)#1"1=-)6'#,'1'#2"3#$HoQ#46)3)*&"*#/%-)6)*,%"3#)*#2'3#4"&6'*)3#/)#(2%,'3%2",%>*# 6)34),&'#/)2#@.1"*':#)2#.3'#&)6"4+.&%,'#3)(.6'# %14'*)# 46'/.,%6# 46'&)=*"3# ,'*# 2"3# 1%31"3# características. Por ello, se ha dedicado un gran esfuerzo en /%3)S"6#)3&6"&)(%"3#5.)#4)61%&"*#2"#[email protected]"*%?",%>*e#/)#2"#(2%,'3%2",%>*#/)#2"3#46'&)=*"3#3%*&)&%?"/"3#)*#42"*&"3A#C3&"3#)3&6"&)(%"3#%*,2.7)*c# "Q#)D46)3%>*#/)#2"#—I]:ZQO("2",&'3%2&6"*3-)6"3"# @.1"*"# )*# 42"*&"3# &6"*3(+*%,"3# 4"6"# 2"# 46'/.,,%>*# /)# "*&%,.)64'3# 6),'1;%*"*&)3# ,'*# glicanos extendidos en galactosa; b) retención /)# 2"# 46'&)=*"# )*# )2# 6)&=,.2'# )*/'428318&%,'# I2"#/%-)6)*,%",%>*#)*#2'3#4"&6'*)3#/)#(2%,'3%2",%>*#)*&6)#42"*&"3#7#1"1=-)6'3#',.66)*#"#*%9)2# /)2#"4"6"&'#/)#i'2(%:#9)6#0(.6"#\Qn#,Q#%*",&%9",%>*#/)#2"#I]:^QO-.,'3%2&6"*3-)6"3"#7#2"#—I]:\QO D%2'3%2&6"*3-)6"3"# /)# 42"*&"3A# C3&'# B2&%1'# @"# sido logrado recientemente en Lemna minor 1)/%"*&)#3%2)*,%"1%)*&'#4'3&O&6"*3,6%4,%'*"2#7# en el musgo Physcomitrella patens mediante el "4"("/'# '# knock-out del gen en cuestión. Al-

564 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

Figura 2. J/%,%>*#7#46',)3"1%)*&'#/)#LO(2%,"*'3#)*#)2#6)&=,.2'#)*/'42831%,'#ICNQ#7#"4"6"&'#/)#i'2(%#)*# células vegetales y de mamíferos. _*#'2%('3",86%/'#46),.63'6#)*3"1;2"/'#)*#.*#&6"*34'6&"/'6#/)#2=4%/'3# )3#&6"*3-)6%/'#"#6)3%/.'3#J3*#)34),=0,'3#)*#)2#4'2%4+4&%/'#)*#3=*&)3%3A#K.6"*&)#2'3#)9)*&'3#/)#1"/.6",%>*# &"6/='3#)*#)2#i'2(%:#3)#()*)6"*#/%-)6)*,%"3#)*#)2#46',)3"1%)*&'#/)#2'3#LO(2%,"*'3#,'142)*#/)#"*&=()*'3#)*# tejidos comestibles (vacunas comestibles). La 46'/.,,%>*#/)#46'&)=*"3#"*&%(+*%,"3#)*#2'3#&)*A#!"#)D46)3%>*#)*#&)*#/)#

2"3# 9",.*"3# )*# 1.,@"3# 6)(%'*)3# ()'(680,"3# /)2# 1.*/'A# G%*# )1;"6(':# *'# 3)# 4.)/)# ';9%"6# )2# 46%*,%4"2# /)3"-='# )*# 2"# 46'/.,,%>*# /)# .*"# 9",.*"#5.)#&'/'#3%3&)1"#/)#46'/.,,%>*#/);)# enfrentar; esto es, que el antígeno debe conservar su integridad estructural y actividad fun,%'*"2#4"6"#%*/.,%6#.*"#6)34.)3&"#%*1.*)#46'&),&'6"A#C3#%14'6&"*&)#1)*,%'*"6#5.):#/"/"#2"# *),)3%/"/#/)#"42%,"6#/'3%3#,'*&6'2"/"3#/)#2'3# ,'14.)3&'3#-"61",'2>(%,'3:#3)#42"*&)"#2"#46'/.,,%>*#/)#,843.2"3#,'*#&)*# /)# "*&=()*'3# 4"6"# 9",.*"3# ,'*&6"# "()*&)3#4"&>()*'3#;",&)6%"*'3#,'1'#Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Baci-

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 565

llus anthracis# 7# )2# 4"683%&'# 6)34'*3";2)# /)# 2"# malaria, Plasmodium falciparum, entre otros. Algunos de estos antígenos ya se evaluaron en ensayos clínicos en humanos, incluyendo 2"# %*1.*%?",%>*# 4'6# %*()3&%>*# /)# @'#"2(B*#&%4'#/)#6)34.)3&"#%*1.*):#&"*&'# 3%3&+1%,"#,'1'#)*#1.,'3"3:#"2)*&"*/'#2"#4'sibilidad de desarrollar vacunas orales contra +3&'3# 7# '&6'3# 4"&>()*'3# @.1"*'3A# N),%)*&)1)*&)#2"#)146)3"#K'rJ(6'G,%)*,)#';&.9'#2"# "46';",%>*:#)*#2'3#C3&"/'3#_*%/'3#/)#J1)6%,":# 4"6"#,'1)6,%"2%?"6# .*"#9",.*"#,'*&6"#)2#9%6.3# /)#2"#)*-)61)/"/#/)#L)r,"3&2):#46'/.,%/"#)*# células de tabaco cultivadas in-vitro. Si bien esta vacuna no ha sido introducida al mercado, )3#,'*3%/)6"/'#.*#4"3'#%14'6&"*&)#5.)#4.)/)# 3)6#.&%2%?"/'#,'1'#6)-)6)*,%"#4"6"#-.&.6"3#2%;)raciones comerciales. o&6'3#)*#,'1'#"*&%,'*,)4&%9'3:#"*&%O%/%'&%4'3#/)2#2%*-'1"#*'#H'/h%*3# 7#6)",&%9'3#4"6"#/%"(*>3&%,'#/)2#HFkA#K)*&6'#/)# esta clase de moléculas cabe destacar el caso de una IgA (inmunoglobulina A) secretoria ex46)3"/"#)*#&";",'#5.)#6),'*',)#.*#"*&=()*'# de Streptococcus mutans:# )2# 46%*,%4"2# "()*&)# causal de la caries dental. En ensayos clínicos llevados a cabo en humanos, en los que 3)#"42%,>#)3&)#"*&%,.)64'#)*#-'61"#&>4%,"#2.)('# /)2# &6"&"1%)*&'# ,'*# .*# "*&%3+4&%,':# 3)# 9)6%0,># .*"# 46'&),,%>*# )-),&%9"# 7# )34),=0,"# ,'*&6"# 2"# 6),'2'*%?",%>*# 4'6# S. mutants durante al menos cuatro meses. Recientemente el Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología de La H";"*":#$.;":#@"#2'(6"/'#46'/.,%6#)*#42"*&"3# &6"*3(+*%,"3# /)# &";",'# .*# "*&%,.)64'# 1'*',2'*"2# 5.)# )3&"# 3%)*/'# .&%2%?"/'# 4"6"# 2"# 4.6%0,",%>*# /)# .*# "*&=()*'# 4"6"# 2"# 46'/.,,%>*# /)# 9",.*"# ,'*&6"# 2"# @)4"&%&%3# bA# C*# ,'14"6",%>*#

,'*#2"#9"6%"*&)#&6"/%,%'*"2#/)#46'/.,,%>*#"#4"6tir de líquido ascítico de ratón, la obtención del "*&%,.)64'#)*#42"*&"3#/)#&";",'#&6"*3(+*%,"3:# que crecen en condiciones de invernadero, ofrece ventajas tales como un mayor nivel de seguridad y mejor escalado industrial. J/)183# /)# 2'3# "*&=()*'3# 7# "*&%,.)64'3:# )D%3&)*# /%9)63'3# )*#4"6"#46'/.,%6#46'&)=*"3#6),'1;%*"*&)3#)*#42"*&"3:#,'1'#3)#1.)3&6"#)*# la tabla 2. Marco regulatorio C2#.3'#/)#42"*&"3#,'1'#;%'66)",&'6)3#)*-6)*tará dos marcos regulatorios diferentes: uno 6)2",%'*"/'#,'*#)2#/)#2"3#42"*&"3#&6"*3(+*%,"3:# y el otro el que tiene que ver con el desarrollo

566 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

Tabla 2. J2(.*"3#,'14"S="3#5.)#.&%2%?"*#42"*&"3#,'1'#3%3&)1"#/)#)D46)3%>*A

Compania SemBioSys Genetics Biolex Therapeutics Meristem Therapeutics Ventria Bioscience Cobento Planet Biotechnology Down Agro Science CIGB (Cuba) Chlorogen Bayer (Icon Genetics)

Plataforma

Tecnología utilizada

Cártamo Lemna Maiz Arroz Arabidopsis Tabaco Células de Tabaco Tabaco Tabaco Tabaco

Transgénicas Transgénicas Transgénicas Transgénicas Transgénicas Transgénicas Transgénicas Transgénicas Transplastómicas Vectores Virales

/)#*.)9'3#-861",'3A#C2#46%1)6'#)3#183#,'*',%/'# 7# )D%3&)*# "*&),)/)*&)3# )*# *.)3&6'# 4"=3:# el último marco aún esta siendo desarrollado )*# 9"6%'3# 4"=3)3# /)2# 1.*/'# 7# *'# )D%3&)*# 4'6# )2#1'1)*&'#4".&"3#/)0*%&%9"3#/"/'#)2#;"*#/)#-861",'3A

Lecturas recomendadas b',h:# NA# \ff[A# U2"3&%/# ;%'&),@*'2'(7c# 46'34),&3# for herbicide and insect resistance, metabolic engineering and molecular farming. Curr Opin Biotechnol#]Xc]ffO]fYA $@"//# HA# "*/# $@"1'r# GA# \ff]A# T@)6"4).&%,# "*&%;'/7#)D46)33%'*#&),@*'2'(7A#Current Opinion in Biotechnology,#]\c]XXO]WZA K"*%)22#HA:#G&6)"&0)2/#GA#"*/#w7,'--#tA#\ff]A#q)/%,"2# 1'2),.2"6# -"61%*(c# 46'/.,&%'*# '-# "*&%;'/%)3:# ;%'4@"61",).&%,"23#"*/#)/%;2)#9",,%*)3#%*#42"*&3A# Trends in Plant Science:#Yc#\]WO\\YA K"*%)22:#HA#\ffYA#U6'/.,&%'*#'-#;%'4@"61",).&%,"23# "*/#9",,%*)3#%*#42"*&3#9%"#&@)#,@2'6'42"3&#()*'1)A# Biotechnol J 1:1071-1079. Fischer R., Stoger E., Schillberg S., Christou P. "*/# Tr71"*# NA# \ffZA# U2"*&O;"3)/# 46'/.,&%'*# '-# ;%'4@"61",).&%,"23A# Current Opinion in Plant Biology:#[c]M\O]MXA Floss D., Falkenburg D. and Conrad U. 2007. U6'/.,&%'*#'-#9",,%*)3#"*/#&@)6"4).&%,#"*&%;'/%)3# -'6#9)&)6%*"67#"442%,"&%'*3#%*#&6"*3()*%,#42"*&3c#"*# overview. Transgenic Res#]Yc^]MO^^\A i%//%*(3:# iA# \ff]A# T6"*3()*%,# 42"*&3# "3# 46'&)%*# factories. Current Opinion in Biotechnology, ]\cZMfOZMZA i'1'6/# k:# $@"1;)62"%*# U:# s)--)6%3# N# "*/# E"7)# !A# \ffMA# b%'4@"61",).&%,"2# 46'/.,&%'*# %*# 42"*&3c# 46';2)13:# 3'2.&%'*3# "*/# '44'6&.*%&%)3A# T6)*/3# b%'&),@*'2:#\^cMMW|MYMA i'1'6/# kA# "*/# E"7)# !A# \ffZA# U'3&&6"*32"&%'*"2# 1'/%0,"&%'*# '-# &@)6"4).&%,# 46'&)%*3# %*# 42"*&3A# $.66#o4%*#U2"*&#b%'2:#[c][]|]X]A

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 567

!%)*"6/# KA:# G'.66'.%22)# $A:# i'1'6/# kA# "*/# E"7)# !A# \ff[A# U@"61%*(# "*/# &6"*3()*%,# 42"*&3A# b%'&),@*'2'(7#J**."2#N)9%)r:#]^c]]MO]Z[A q"#sA:#K6"h)#UA:#"*/#$@6%3&'.#UA:#\ff^A#T@)#46'/.,&%'*# '-#6),'1;%*"*@"61",).&%,"2#46'&)%*3#%*#42"*&3A# Nature Reviews Genetics,#Zc#[WZOXfMA Maliga P. 2004. Plastid transformation in higher 42"*&3A#Annu. Rev. Plant Biol.,#MMc\XWO^]^A q"6%22'**)&#GA:#T@')6%*()6#$A:#t"*/?%"#NA:#t2%17.h# k# "*/# i2);"# yA# \ffMA# G73&)1%,# J(6';",&)6%.1# tumefaciens-mediated transfection of viral 6)42%,'*3# -'6# )-0,%)*&# &6"*3%)*&# )D46)33%'*# %*# 42"*&3A#Nat Biotechnol:#\^c[]XO[\^A Plantas Biofactoria. Informe de vigilancia tecnológica. i)*'1"# C34"S"A# G),&'6#J(6'"2%1)*&"6%'A# @&&4cRR rrrA()*O)3A'6(R]\‡4.;2R/',3RU!JLTJG‡ bFoEJ$ToNFJA4/N7;%,h%#CA#\ffWA#U2"*&O46'/.,)/#9",,%*)3c#46'1%3)# and reality. Drug Discov Today#]Zc]YO\ZA G4'h#JA:#Tr71"*#NA:#E%3,@)6#NA:#q"#sA#"*/#G4"66'r# UA# \ffXA# C9'2.&%'*# '-# "# 6)(.2"&'67# E6"1)r'6h# -'6# 4@"61",).&%,"23# /)6%9)/# -6'1# ()*)&%,"227# 1'/%0)/#42"*&3A#T6)*/3#%*#b%'&),@*'2'(7#\YcMfYO M][

Twyman R., Stoger E., Schillberg S., Christou P. and E%3,@)6#NA#\ff^A#q'2),.2"6#-"61%*(#%*#42"*&3c#@'3&# 373&)13# "*/# )D46)33%'*# &),@*'2'(7. Trends in Biotechnology:#\]c#M[fOM[XA Tr71"*# NAqA:# G,@%22;)6(# GA:# E%3,@)6# NA# \ffMA# T6"*3()*%,# 42"*&3# %*# &@)# ;%'4@"61",).&%,"2# 1"6h)&A#CD4)6&#o4%*A#C1)6(A#K6.(3#]f:#]XM|\]X w"23@# i# "*/# s)--)6%3# NA# \ffYA# U'3&O&6"*32"&%'*"2# 1'/%0,"&%'*3#%*#&@)#,'*&)D&#'-#&@)6"4).&%,#46'&)%*3A# L"&#b%'&),@*'2:#\Zc]\Z]|]\M\A Wirth S., Calamante G., Mentaberry A., Bussmann L., Lattanzi M., Barañao L. and Bravo-Almonacid EA# \ffZA# CD46)33%'*# '-# ",&%9)# )4%/)61"2# (6'r&@# -",&'6#I@CiEQ#%*#&';",,'#42"*&3#;7#%*&)(6"&%9)#"*/# non-integrative systems. Mol. Breeding,#]^c#\^O^MA

568 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

PARTE VI Manejo responsable de la tecnología

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570 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

VI. CAPÍTULO 1 Bioseguridad y Regulación de Organismos Vegetales !"#$%&'()"#%"*+,-&.'(-,/* (OVGM) Clara Rubinstein 01&%"1&,/*0&"#%2.',/*3(1(*4(*56(47('&8#* de la Bioseguridad de Organismos !"#$%&'()"#%"*+,-&.'(-,/. 9(*34(/%&'&-(-*&#%12#/"'(*-"*4,/*:"#,)(/* 6":"%(4"/* 4"/* ',#."1"* 7#(* (4%(* (-(3%(;&4&-(-* (* 4(/* 34(#%(/&("&)&>.*&)+.)(,)>&+)',",*0#+&'.) 7,$#-*.() /!&+"#1/&5$,() ,+) $.() GHD() ,("!'#&dos. De hecho, en la práctica, en caso de iden"#1/&*(,),?,/".()&'4,*(.(:),(".()/!$"#4.()+.)(,) autorizarían para su salida al mercado. Por todo lo anterior, se ha desarrollado para los OGMs un enfoque que ha sido utilizado para otros casos de alimentos y que se basa en la ',)3(1('&8#* -"4* #7"6,* (4&)"#%,* ,* '74%&6,* ',#* "4* %1(-&'&,#(4)"#%"* 7%&4&A(-,* =* considerado seguro. Este enfoque se ha desarrollado consensuadamente con la colaboración de diferentes organismos internacionales (OECD, FAO ,OMS, International Life Sciences Institute o ILSI) que periódicamente convocan a paneles de expertos que revisan y actualizan las recomendaciones de acuerdo a los avances tecnológicos y el estado del conocimiento.

Es oportuno aclarar que estas técnicas no en todos los casos van a tener como resultado la expresión de un transgén, sino que hay otras estrategias experimentales - silenciamiento mediado por RNA de interferencia o anulación ',)$&)&/"#4#'&')',)!+)-,+)7.*);B+./B).!"=)I)C!,) si bien involucran manipulación in vitro y transformación, no resultan en la adición de un gen y/o una proteína nuevos. 9(* ;(/"* -"* "/%(* "/%1(%":&(* 3(1(* "/%(;4"'"1* &#,'7&-(-* -"* #7"6,/* (4&)"#%,/* "/* 4(* L&/%,1&(*-"* 7/,* /":71,* -"4* '74%&6,*3(1"#%(4** M"/*-"'&1*(B7"4*B7"*"/*4(*;(/"*-"*4(*),-&.cación) .

-Qué se compara y por qué F()/$&*.)C!,)".'&)0.'#1/&/#9+)"#,+,)!+).5jetivo, ya sea obtener una mejora de tipo agronómica como resistencia a plagas o enfermedades, una mejora nutricional o de calidad o bien la síntesis de un producto en particular, desde un fármaco hasta biocombustibles, pasando por vacunas comestibles. Es decir, que $&) 0.'#1/&/#9+) "#,+,) ,?,/".() intencionales medibles, que se traducen en una carácterís%&'(*>"#,%23&'(*-(-(. Por otro lado, es posible que se produzcan efectos no intencionales) ',) $&) 0.'#1/&/#9+:) que pueden o no tener un impacto negativo en $&)(,-!*#'&')',)$&)7$&+"&)0.'#1/&'&:)7,*.)C!,) es pertinente estimar. Y es aquí donde el análisis comparativo tiene un papel relevante. Los impactos no deseados de la introducción de un gen o secuencia en el genoma de una planta, comprenden diferentes aspectos que son examinados durante el proceso de evaluación: J) Toxicidad o alergenicidad de la(s) proteínas expresadas Z?*54*5#>,B7"*0,)3(1(%&6,*=*4(* J) K+L!,+/#&)',)$.()7*.'!/".()',),M7*,(#9+) 5B7&6(4"#'&(*K7/%(#'&(4 sobre el metabolismo de la planta, que En 1993 la OECD formuló el concepto de lleve a cambios en el valor nutricional o 5B7&6(4"#'&(* K7/%(#'&(4. Este concepto no la concentración de tóxicos o alérgenos ',#/%&%7="*"#*/2*4(*"6(47('&8#*-"*&#,'7&-(-"1"#'&("'%,/* /,;1"* ,1:(#&/),/* #,d;4(#',* (caso de cultivos con incorporación de genes de resistencia a insectos). El conocimiento insu1/#,+",) (.5*,) ,(7,/#,() &0,+&%&'&() ',) ,M"#+/#9+) N72,@2:) #+(,/".() 5,+"'%&6()"#%"* 31"/"#%"* "#* "4* :"#,)(* %1(#/>,1)(-,, cuya naturaleza y consecuencias (geno- y fenotípicas) caracterizan al OGM como tal. Al OGM o conjunto de OGMs con un dado &#/"1%,* /"* 4,/* -"#,)&#(* ',4"'%&6()"#%"* "6"#%,. Varios OGMs pueden contener el mismo evento, y por lo tanto sus análisis de riesgo serán equivalentes. Ocasionalmente, en etapas tempranas del desarrollo de un OGM, se admite que el evento puede no estar inequívocamente caracterizado, en el sentido de que no se ha ',1+#'.),$)#+(,*".)/.+)$&)',5#'&)7*,/#(#9+)N7.*) ejemplo, el inserto puede estar en diferentes posiciones en el genoma del vegetal). En estos casos, el análisis se enfoca en la construcción genética utilizada en la %1(#/>,1)('&8#. )_,1+#0.()/.0.)"*&+(?.*0&/#9+:),$)0,'(*"#*(B7"44(/*'(1('%"12/%&'(/*B7"*&#%"1"/(#*"#*4(*"6(47('&8#*-"4*31,-7'%,*(y no del proceso de su obtención), en el sentido de que ,(&()/&*&/",*6("#/&()(,),+/.+"*&*O+)1+&$0,+",) en el OGM obtenido. Otra característica del marco regulatorio administrado por la CONABIA es que considera cada producto o liberación caso por caso. Si bien los antecedentes (si los hubiera) se tienen ,+)/!,+"&:)3)$.()/&(.()(#0#$&*,()(.+)#',+"#1/&dos y considerados como objetos de información válida para la evaluación, los datos no /,#* %1(#/>"1&;4"/, y cada caso y/o solicitan",) ',5,+) (,*) /.>,*,+",() 3) &!".(!1/#,+",() ,+) cuanto a la información que provee a la Comi(#9+2) R&) ',1+#/#9+) ',) caso es entonces rele4&+",2)`+)/&(.),("O)',1+#'.)7.*Q g* 9(*")31"/(*,*"#%"*/,4&'&%(#%". J) El "6"#%,*-"*%1(#/>,1)('&8#*(es decir:

g*

/', &'0*"1#, )*$'&)# introducido en el genoma de la planta, admitiéndose un conjunto de eventos con un único vector en las etapas muy preliminares del desarrollo del OGM). 9(*"/'(4(*-"*4(*4&;"1('&8#.

Cualquiera de estas condiciones que no se conserve (p.ej., el mismo evento presentado por dos empresas o entes diferentes) representará un caso diferente. La normativa puesta en práctica es 31,('%&6(, en el sentido de que requiere un análisis previo de todas las previsibles consecuencias de una liberación antes de que tal liberación sea autorizada. Como mencionamos antes, Argentina dispone desde 1991 de un marco regulatorio para el Análisis y la Gestión de los Riesgos asociados con los Ensayos a Campo de Organismos Ge+?'=0*(/').,3.0*,)*,*-.%/.4&5'-. (Ver Figura 1) Q1&)"1(*](/"*-"*56(47('&8#f* 5#/(=,/*"R3"1&)"#%(4"/ Los solicitantes deben presentar un legajo -"* &#>,1)('&8#* "/3"'2.'(,1)('&8#* !"#"1(4 sobre la liberación y sobre el OGM en cuestión y de un apartado sobre las Condiciones de Bioseguridad que se pondrán en práctica. El campo del análisis de los riesgos abarcado por estas informaciones, que debe proveer el solicitante, es amplio, e incluye tanto las '(1('%"12/%&'(/*-"*4(*4&;"1('&8#*',),*4(/*-"4* OGM. Con respecto a las características de la liberación, la _#>,1)('&8#* !"#"1(4 sometida al análisis incluirá: J) Si el material es importado: status regulatorio en el país de origen. J) Propósito de la liberación (objetivo, cronograma, protocolos, antecedentes). Si es a escala de invernadero o a campo J) Operaciones de transporte de OGM (ingreso al país, transportes internos). J) Cantidad y tipo de material a liberar, antecedentes en otros países. J) Lugar de la liberación. J) Detalles operativos para auditar la liberación (fechas, instituciones, personas). Con respecto a las características del OVGM, se analizará el :"#,%&3, del evento (es decir, 4(/*#7"6(/*'(1('%"12/%&'(/*:"#$%&cas introducidas), para lo cual el solicitante debe proveer información con respecto a: J) Descripción de la biología molecular del sistema donante-vector-receptor

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 587

J) J)

Método de transformación utilizado Genes principales (y sus organismos donantes). Genes auxiliares (marcadores de selección). Secuencias regulatorias (promotores, terminadores, enhancers, etc.). Otros elementos genéticos introducidos. Productos de expresión, tejidos de la planta en los que se expresan, niveles de expresión. Homologías de secuencia con proteínas tóxicas o alergénicas. Descripción fenotípica del organismo receptor, centros de origen o diversidad genética. Estabilidad fenotípica y número de gene*&/#.+,(),+)$.()C!,)(,)4,*#1/92))

ro: métodos o estructuras de contención contra el ingreso de vectores potenciales de material genético. b) 5#* 4,/* ),6&)&"#%,/* -"* )(%"1&(4"/: semillas, material vegetal acompañante, así J) /.0.) $.() $!-&*,(:) +.*0&() ,) #',+"#1/&/#9+) ',$) material que sea almacenado. J) c) 5#* 4,* 1"4('&,#(-,* ',#* "4* -"/%&#,* -"4* material cosechado: el solicitante deberá informar sobre su utilización, aclarando si será local o si será exportado o destruído, e idenJ) "#1/&+'.) $.() $!-&*,() ',) (!) &$0&/,+&@,) 1+&$) .) transitorio. d) 5#*4,*1"4('&,#(-,*',#*4(*-&/3,/&'&8#* J) .#(4* MN!+* =* )(%"1&(4"/* 1")(#"#%"/Pf* En lo relacionado con la -&/3,/&'&8#* .#(4* del OGM y de los materiales remanentes, se reEn cuanto a la sección sobre las Condi- quiere información sobre el tratamiento del ciones de Bioseguridad, la información soli- suelo post-cosecha, el uso futuro del terreno, citada depende de la escala de la liberación: los controles posteriores (detección de plandesde laboratorio/invernadero hasta pruebas a tas voluntarias) y su duración. campo. En el caso de eventos que aún no han "P*5#*"4*'(/,*-"*7#*"6"#%7(4*"/'(3"*-"4* obtenido la autorización de comercialización N!+* =^,* -"* '7(4B7&"1* )(%"1&(4* (/,'&(-,: en el país, es decir, "6"#%,/* 1":74(-,/< que El solicitante debe exponer con claridad los se siembran a gran escala para 31,-7''&,#"/* procedimientos que seguirá en el caso de de semilla en contra-estación para el hemis- 7#* "6"#%7(4* "/'(3"* -"4* N!+* y/o de cual?,*#.)W.*",:)).)/.+)."*.()1+,(:),M#(",)!+)31,%,- quier material asociado. Normalmente, esto ',4,*"/3"'2.',*B7"*"/*#"'"/(1&,*31"/"#%(1* #+/$!3,) 0"1"#'&(*-"*:"#"/*-"/-"*"4*N!+*(4* (P*E71(#%"*4(*4&;"1('&8#: Descripción y ubi- ();&"#%"*;&8%&',. cación del lugar o instalación donde se realig) c/,/*31"6&/%,/*-"4*%"11"#,*',#*3,/%"zará la liberación. Localización precisa (mapas 1&,1&-(-*(*4(*4&;"1('&8#*/,4&'&%(-(. Control detallados): distancia a caminos, lugares tran- posterior de la parcela, duración de los consitados, límites del predio bajo control del so- troles post-cosecha. licitante. Características constructivas de bioseguridad (laboratorio o invernadero) y normas Una vez completados los ensayos, es rede acceso. Tamaño y número de parcelas, su quisito indispensable para poder acceder a '#(,P.:) 7$&+.) ',) (#,05*&) 3) (!7,*1/#,) &) (,0- nuevas autorizaciones, la entrega de un Inbrar. Medidas de aislamiento >,1)"*-"*0&"11"*-"*4(*9&;"1('&8#*6&17/ 1"/&/%(#%* e1(//&'(* #(37/?* * 5#6&1,#* e&,/(>"%=* b"/*aMHPfSZXnSaI cK5QD* MSTTUP* !7&-"4&#"/* >,1* "',4,:&'(4* 1&/Y* Como se presenta en el esquema corres(//"//)"#%"%=^31,%,',4?/L%)4: Protocolo de Bioseguridad esta etapa de evaluación son similares a las lll?'%#;&,?:,6?;1: sitio de la Comisión de que lleva adelante CONABIA, y basa sus conBioseguridad de Brasil clusiones en toda la información presentada a CONABIA, más otra serie de datos, evidencias www.oecd.orgf*N1:(#&A('&8#*3(1(*"4*E"/(11,44,* =*4(*0,,3"1('&8#*5',#8)&'( experimentales y estudios que deben ser prelll?>-(?:,6: Agencia de Drogas y Alimentos (,+"&'.(),(7,/61/&0,+",),+)*,$&/#9+)/.+)$.() -"*4,/*55cc (/3"'%,/*#7%1&'&,#(4"/*=^,*%,R&',48:&',/ del lll?>(,?,1:f* D:"#'&(* 3(1(* 4(* D:1&'74%71(* =* 4(* OVGM en cuestión, de acuerdo a los requisitos Alimentación de la Naciones Unidas ',)$&)*,(.$!/#9+).1/#&$2 lll?1"-;&,?,1:f* &1* (* * +(1',* b":74(%,1&,,1* %L"* _#%"1#(%&,#(4* K"16&'"* >,1* F(%&,#(4** D:1&'74%71(4*b"/"(1'L*M_KFDbP,*con cultivos tradicionales u orgánicos se rebicidas o resistencia a plagas, características quieren medidas adecuadas durante el cultivo, ciertamente favorables en ecosistemas agríco/.(,/>&:)"*&+(7.*",)3)&$0&/,+&0#,+".:)&)1+)',) las. Se denomina escape a la diseminación no evitar la mezcla accidental de materiales GM y intencional de la construcción genética de un no GM. Engels y col. (2006) citan ejemplos de CGM hacia otras poblaciones, mediante mecacontaminación de lotes de semilla y mezclas nismos biológicos naturales como la reproducfísicas en colza y tomate. Las recomendacioción sexual o la transferencia horizontal. La renes tendientes a evitarla consisten en: a) mediproducción sexual implica la unión de gametos das a tomar dentro del establecimiento, como femeninos y masculinos, mientras que la transrespetar las distancias de aislamiento, colocar ferencia génica horizontal o lateral consiste en barreras a la dispersión del polen, o intercalar el intercambio de material genético no sexual lotes con cultivo de una especie distinta. b) y ocurre generalmente en microorganismos. cooperación entre establecimientos vecinos En el caso de las plantas, el escape génico a sobre planes de siembra, o uso de variedades través del polen es el mecanismo natural. La /.+) "#,07.) ',) L.*&/#9+) '#?,*,+",2) /E) !(.) ',) pérdida de semillas durante el transporte y su servicios de extensión agrícola para informar a establecimiento en banquinas y vías de comulos productores, monitoreo, intercambio de innicación es muy importante en la dispersión formación técnica y servicios de alarma. de plantas fuera del cultivo. La semilla puede R.() "*&+(-,+,() C!,) /.+1,*,+) ".$,*&+/#&) trasladarse grandes distancias y sobrevive a herbicidas, resistencia a insectos o a patódurante mucho más tiempo que el polen. En genos podrían transmitir las mismas caracteregiones donde crecen parientes silvestres, se espera que ocurra hibridación espontánea con rísticas a plantas silvestres relacionadas, deel cultivo transgénico, a menos que las plantas terminando una mayor supervivencia bajo la GM estén especialmente diseñadas para limi- presión de selección natural (insectos herbívo"&*),$)L!@.)-&)(!*-#'.)/.0.)/.+(,/!,+/#&)',)*,/.+./,*)$&)'#1/!$"&')C!,)#07$#/&*6&),$) control de esas poblaciones. También podrían tener efectos adicionales sobre poblaciones de insectos o patógenos. No obstante, la probabilidad de introgresión de elementos transgénicos dentro de otras variedades o germoplasmas dependerá de la biología de reproducción, fertilidad de los híbridos, dispersión de semilla y presión de selección. Para que ocurra introgresión de genes, cultivos sexualmente compatibles o parientes silvestres deben estar presentes y cercanos al ;/!$"#4.) ?!,+",=:) ,$) ,+"*,/*!%&0#,+".) ',5,) (,*) posible y los resultantes híbridos y sus respectivas retrocruzas tienen que ser fértiles. La introgresión de genes es mayor en especies alógamas, como maíz y es menor en autógamas, como soja y arroz, siendo mínima en especies de propagación vegetativa, como papa. Aún en estos casos los transgenes pueden ser introducidos sin intención mediados por mezclas físicas de semillas o propágulos. La evaluación del riesgo de escape de transgenes comprende tres etapas: a) Investigación de barreras genéticas o -,.-*O1/&()7&*&),$),(/&7,)',$)"*&+(-.+-.) Sclerotinia, +.)&!0,+"9)(#-+#1/&"#4&0,+",)$&)?,/!+'#'&')',) plantas de girasol silvestre, sugiriendo que su diseminación sería prácticamente neutral luego de un escape hacia poblaciones naturales. En Brassica rapa un transgén Bt adquirido por cruzamiento con colza transgénica disminuyó su agresividad como maleza en un 20% comparado con B. rapa no GM. Estos son ejemplos contrastantes de los efectos de transgenes sobre la aptitud y comportamiento ecológico de poblaciones silvestres. cU90.),("#0&*)$.()/.(".()3)5,+,1/#.()',)!+) transgén para la aptitud biológica de una especie silvestre? En este caso, los genotipos a comparar son el que ha adquirido el transgén por hibridación con el cultivo y el que no lo ha adquirido, o sea el genotipo silvestre de la po5$&/#9+) ,+) &!(,+/#&) ',) L!@.) -&+/,()?,/!+'#"3)#+)e#$')(!+L.e,*(2)F/.$.-#/&$) Applications 13: 279-286 Spencer LJ, Snow AA (2001) Fecundity of transgenic wild-crop hybrids of Cucurbita pepo (Cucurbitaceae): implications for crop-to-wild Lecturas recomendadas -,+,)L.e2)f,*,'#"3)gYQ)YhiIj\[ Vacher C, Weis AE, Hermann D, Kossler T, Young 8'&0:) _2) [\\X2) Z*&+(-,+#/) /*.7) "*#&$d() -,+,) L.e) C, Hochberg ME (2004) Impact of ecological turns weeds into wimps. Nature 421:462. factors on the initial invasion of Bt transgenes into Ahl Goy P, Duesing JH. 1996. Assessing the wild populations of birdseed rape (Brassica rapa). environmental impact of gene transfer to wild Theor Appl Genet 109: 806-814 relatives. Biotechnology 14: 39-40. Warwick SI, Légère A, Simard MJ, James T (2008) Burke JM, Rieseberg LH. 2003. 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cuidadosamente el riesgo de escape de transgenes para cada uno de ellos. Esa evaluación, realizada por equipos multidisciplinarios, debería considerar los siguientes aspectos: a) Presencia de especies silvestres sexualmente compatibles con el cultivo y la probabilidad de que el transgén difunda en ellas. b) Cambios en las características de poblaciones de patógenos, insectos y malezas relacionadas con el cultivo GM y medidas para evitar o retardar la aparición de biotipos resistentes. c) Cambios en la dinámica de poblaciones de otras especies vegetales y animales que comparten el hábitat (polinizadores, parásitos y predadores, 0#/*.L.*&)3)?&!+&)',$)(!,$.E2)

600 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

VI. CAPÍTULO 4 Detección de OGM en la Cadena Agroalimentaria Florencia Longo; Ana Vicario

Introducción En el año 1996 se aprobó para su comercialización en Argentina la primera variedad vegetal mejorada que llevaba una característica transgénica. Se trató de una variedad de soja con tolerancia a un herbicida. A partir de ese momento y hasta la actualidad Argentina ha aprobado 10 eventos transgénicos más: 9 en maíz y 2 en algodón. A grandes rasgos, una planta genéticamente 0.'#1/&'&),()&C!,$$&)&)/!3.)-,+.0&)(,)>&+) incorporado uno o más transgenes mediante alguna de las técnicas de ingeniería genética. Estos transgenes poseen una secuencia +!/$,."6'#/&) ,(7,/61/&) 3) &$-!+.() ',) ,$$.() (,) expresan generando una proteína nueva en el organismo, lo cual le va a conferir un nuevo fenotipo, o característica especial a la planta. V,-b+)$&)',1+#/#9+)',)$&)U.0#(#9+)W&/#.+&$) Asesora de Biotecnología Agropecuaria (COW8AK8E:) !+) .*-&+#(0.) -,+&)#+(,*"&'.)',)0&+,*&)',1+#'&) 3)/.+"*.$&'&),+),$)-,+.0&).*#-#+&$=2 Mundialmente existen otros eventos aprobados por distintos países, en otras especies como colza, alfalfa, papaya y tomate, entre otros (www.ISAAA.org). Según datos de la International Service for the Acquisition of Agribiotech Applications (ISAAA), en el año 2007 existían 23 países que cultivan semillas transgénicas, siendo los ocho principales Estados

Unidos, Argentina, Brasil, Canadá, India, China, Paraguay y Sudáfrica. Dentro de los países de la Unión Europea se encuentran Francia, España y Polonia quienes cultivan semillas con algunos de los eventos existentes. En total suman 114,3 millones de hectáreas OGMs para sembradas con la campaña 2007/2008. La aplicación de la biotecnología moderna en la cadena de producción de los alimentos ha generado grandes controversias en todo el mundo. Esto ha provocado que muchos países, especialmente los de la Unión Europea, impongan restricciones al ingreso de productos C!,)/.+",+-&+).*-&+#(0.()0.'#1/&'.()-,+#,*,+)&),$$&)N$.) que se conoce como “annealing=E)7,*0#"#,+'.) #+#/#&*) $&) *,&//#9+) ',) &07$#1/&/#9+2) _#("#+".() “primers=)(.+)/&7&/,()',)7,-&*(,),+)'#?,*,+tes zonas del fragmento de ADN introducido. Estas zonas son cuatro: secuencias promotoras o terminadores que suelen ser comunes a varios eventos; el gen)C!,)/.+1,*,),$)/&*O/",*) ,(7,/61/.a) !+&) *,-#9+) ',+.0#+&'&) ;construc3"A%' #)*#3B13&=) C!,) ,() &C!,$$&) C!,) 4#+/!$&) distintos elementos del fragmento de ADN introducido, por ejemplo la región promotora y el gen; y lo que se denomina “#4#%,.'#)*#3B13.=) que es una región que vincula el fragmento introducido con el genoma original de la planta. El ensayo de PCR puede ser de tipo cualitativo, lo que se conoce como PCR convencional .) ,+) "#,07.) 1+&$:) .) /!&+"#"&"#4.:) *,1*#&3)7*.'!/".()',)&07$#1/&/#9+E)>&(ta la zona donde se leerá el resultado (zona "sucia"). En el primer cuarto se realiza la preparación -y en aquellos caso que se requiera- molienda de la muestra, en el segundo se realiza la ,M"*&//#9+)3)7!*#1/&/#9+),$)8_W:),+)!+)",*/,*.) se prepara la reacción de PCR y en el último (,)7*.'!/,)$&)&07$#1/&/#9+)N3).5(,*4&/#9+)',$) resultado en el caso de la PCR cuantitativa) y luego la electroforesis. En este último paso, 7&*&),$)0&+)',(&**.$$&'.) bajo el Acuerdo de Viena donde la Comisión Europea de Normas (CEN) es quien lidera el desarrollo normativo. En la actualidad 5 normas han sido publicadas bajo el Acuerdo y una F(7,/#1/&/#9+)Z.()/#,+"61/.()3)&05#,+"&$#("&() como muy prematuro. La mayor preocupación era que se carecía de información sobre la forma de evitar que las especies blanco generaran resistencia al carácter introducido, ya que existían evidencias de que éste fenómeno podía ocurrir en el laboratorio. Esto implicaba

no sólo un riesgo en cuanto a la efectividad de los cultivos Bt, sino que también en cuanto a la pérdida de uno de los más exitosos insecticidas microbianos con los que se contaba hasta ese momento. Se consideró necesario entonces crear un programa de “manejo integrado ',) 7$&-&(=) ,(7,/61/&0,+",) '#(,P&'.) 7&*&) ,$) sector agropecuario, que prevenga justamente el aumento de la resistencia en las poblaciones de insectos que se quería atacar. El programa de manejo mas conocido que se aplica en la actualidad es el de “alta dosis + *,?!-#.=)&)"*&4&()#+'#/&+)C!,)$.()#+(,/".()7!,',+)/#*/!J) las generaciones de inlar libremente entre las regiones con plantas transgénicas Bt sectos no se superponen. y con plantas libres de Bt, o refugios. J) las poblaciones son de ta0&P.)#+1+#".2 J) el apareamiento es al azar. J) no existe migración. los distintos fenotipos sensibles y resistentes. J) no existe mutación. De este modo, es posible predecir bajo distinJ) $.()/.,1/#,+",()',)(,$,//#9+)(.+)(#0#$&tas condiciones ambientales, como será la evores en ambos sexos. lución del carácter en cuestión y estimar valoA continuación se deducirá el cambio en la res de fundamental importancia para el sector agropecuario, como lo es el porcentaje mínimo frecuencia del alelo R luego de una genera',)(!7,*1/#,)$#5*,)',)A")C!,)(,)*,C!#,*,)/!$"#4&*) ción de selección, siguiendo el modelo clásico descrito en Hartl y Clark (1989) (tabla 1). En la 7&*&),4#"&*)C!,),$)&$,$.)',)*,(#(",+/#&)(,)1@,2 El propósito de este capítulo es explicar des- -,+,*&/#9+);"=)(,)7&*",)',)-&0,"&()7.*"&'.*&() de una perspectiva genético-poblacional los del alelo de resistencia R y gametas portadoras fundamentos de estos modelos teóricos y su del alelo de sensibilidad S, en frecuencias p y q valor como herramienta predictiva en progra- respectivamente. Debido a que existe apareamas de manejo integrado de plagas. Asimismo, miento aleatorio, las frecuencias de los zigotos otro objetivo es el de describir los elementos que se formen responderán a las frecuencias típicos que componen un plan de manejo de del equilibrio de Hardy Weinberg: p2 , 2pq y q2. resistencia de insectos y por último, presentar Sin embargo, sobre esos zigotos actuará la seun panorama sobre la manera en que estos lección natural (ejercida en este caso particular 7.*)$.(),?,/".()',)$&)".M#+&)A"E)0.'#1/&+'.)$&) planes se aplican en Argentina. contribución de adultos a esa generación t + 1 de los genotipos RR, SR y SS en un factor que +,-"4,/*3,;4('&,#(4"/*=*4(* dependerá del valor adaptativo (W) de cada "6,47'&8#*-"4*:"#*-"*1"/&/%"#'&( Como se mencionó previamente, los mode- uno de ellos (WRR, WSR y WSS respectivamente) $.() (.+) (#07$#1/&/#.+,() ',) !+&) *,&$#'&') C!,) (tabla 1). Las frecuencias genotípicas relativas ,() ',) 7.*) (6) /.07$,@&2) F("&() (#07$#1/&/#.+,() se calculan dividiendo por el valor adaptativo implican supuestos que se deben cumplir si se medio de la población (W M) que es igual a: C!#,*,)C!,),$)0.',$.),?,/"#4&0,+",)*,L,@,),(&) WM = p2 W RR +2pq W SR + q2 W SS = p (p W RR realidad. En el caso particular que se trata en este capítulo se trabajará con una población + q W SR) + q (q W SS + p W SR) de insectos que presenta variabilidad para el Las frecuencias de las gametas de cada tipo /&*O/",*);*,(#(",+/#&)&)$&)".M#+&)A"=:)3)(,)&+&lizará, mediante modelos matemáticos, como (p y q) en la generación t + 1 se calculan meevolucionaría ese carácter a través de las ge- diante la fórmula:

612 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

`(;4(*S? Cambio en las frecuencias genotípicas relativas luego de una generación de selección.

Generación

Estadio del ciclo de vida

t

Gametas Frecuencia de las gametas Genotipos Frecuencia de los genotipos (zigotos) Fitness (viabilidad)

t+1

Frecuencias

R

S

p

q

RR

SR

SS

p2

2pq

q

W RR

W SR

W SS

2

Contribución ponderada 2 2pq W SR p2 W RR q W SS (adultos) Frecuencia relativa de cada genotipo luego de p2 W RR / W M 2pq W SR / W M Q2 W SS / W M una generación de selección

p= frecuencia relativa de homocigotos RR + ½ de la frecuencia relativa de het. SR q= frecuencia relativa de homocigotos SS + ½ de la frecuencia relativa de het. SR Reemplazando de acuerdo a la tabla 1, se obtiene: pt+1= (p2 WRR + ½ 2pq WSR ) / WM = (p (p WRR + q WSR))/ WM qt+1= (q2 WSS + ½ 2pq WSR) / WM = (q (q WSS + p WSR)) / WM El cambio en la frecuencia génica luego de una generación de selección para el alelo R, m7:)(,*O),+".+/,(Q

5/%&)('&8#*-"*4,/*6(4,1"/*(-(3%(%&6,/ Los valores adaptativos de los homocigotas susceptibles y resistentes serán distintos dependiendo del origen de dichos individuos. El valor adaptativo medio de estos dos genotipos deberá tener en cuenta entonces el porcentaje relativo de refugio y plantas Bt cultivado, como sigue: WRR = ref (WRR/ref ) + Bt (WRR/Bt ) WSS = ref (WSS/ref ) + Bt (WSS/Bt )

ec.2 ec.3

que es lo mismo que, m7n)N7)C)N7)NoRR - WSR) + q (WSR – WSS))) / ec.1 WM

donde ref y Bt (= 1- ref ) son las proporciones de hectáreas cultivadas de refugio y plantas Bt, respectivamente; WRR/ref y WRR/Bt son los valores adaptativos de los individuos RR en el refugio y en los campos con plantas Bt, respectivamente; y WSS/ref y WSS/Bt son los valores adaptativos de los individuos SS en el refugio y en los campos con plantas Bt, respectivamente.

De este modo se llega a un modelo poblacional que permitirá estimar cómo será el cambio en la frecuencia del gen de resistencia, el cual dependerá de su frecuencia inicial y de los valores adaptativos de los tres genotipos.

Si bien existen distintos valores de dominancias funcionales para el alelo resistente, se considerará para todos los cálculos que la resistencia es recesiva. De hecho, las altas

m7)n)7t+1 – pt =((p (p WRR + q WSR)) / WM ) - p

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II kSH

dosis de toxina Bt tienen por objeto llevar a la dominancia funcional del resistente a cero, lo que favorece el retraso en el aumento de la frecuencia de este alelo en las poblaciones. Por lo tanto, se considerará que WSS = WRS. En Tabashnik y col. (2005) se describe detalladamente cómo calcular empíricamente los costos selectivos, lo cual se lleva a cabo, en términos generales, analizando la supervivencia relativa de las larvas de líneas sensibles y resistentes sobre plantas Bt y libres de Bt, tanto en el campo como en estaciones experimentales. 5/%&)('&8#*-"4*3,1'"#%(@"*-"* 1">7:&,*"#*',#-&'&,#"/*-"* "B7&4&;1&, En genética de poblaciones se denomina ;/.+'#/#9+) ',) ,C!#$#5*#.=) &C!,$$&) ,+) $&) C!,) +.) existe un cambio neto en las frecuencias alélicas de un determinado carácter a través de las generaciones. En el caso particular de los cultivos transgénicos Bt, el objetivo que se quiere lograr es el de llegar a ese equilibrio, manteniendo estable la frecuencia del alelo de resistencia en las poblaciones de insectos, con el 1+)',)C!,)+.)(,)'#$!3&),$),?,/".)#+(,/"#/#'&)',$) A"2)F$);7*.-*&0&)',)*,?!-#.(=:)C!,)#07$#/&)/!$tivar zonas con plantas libres de Bt junto a los campos con plantas Bt, persigue justamente ese objetivo: el de generar un microambiente en donde los valores selectivos de los individuos sensibles a la toxina Bt sea máximo, asegurando de este modo que el alelo S nunca se pierda. El problema que surge entonces para el productor agrícola es cuál será el porcentaje mínimo que se debe cultivar con plantas libres de Bt para que el programa funcione, ya que es obvio que el rendimiento económico de estas plantas susceptibles de ser atacadas por los lepidópteros será menor. El porcentaje de refugio necesario para que se alcance la condición de equilibrio se puede deducir de la ecuación 1 (ec.1) como sigue: m7n)N7)C)N7)NoRR - WSR) + q (WSR – WSS))) / WM = 0

por lo tanto en el equilibrio p (WRR - WSR) + q (WSR – WSS) = 0 ec.4 Si se supone que el alelo de resistencia es completamente recesivo, entonces WSS = WSR por lo tanto el segundo término de la ecuación 4 se anula, y al reemplazar WSR por WSS en el primer término, esta ecuación se reduce a: p (WRR - WSS) = 0

ec.5

Sustituyendo WRR y WSS según las ecuaciones 2 y 3 del apartado anterior, se obtiene: p ((ref (WRR/ref ) + Bt (WRR/Bt )) – (ref (WSS/ref ) + Bt (WSS/Bt ))) = 0 Teniendo en cuenta que p>0, y que el valor selectivo de los individuos homocigotas susceptibles en los campos Bt (WSS/Bt) es 0, entonces, ref (WRR/ref ) + Bt (WRR/Bt ) – ref (WSS/ref )= 0 es decir, Bt (WRR/Bt) - ref (WSS/ref - WRR/ref) = 0 ec.6 La resistencia se mantendrá estable, entonces, cuando el efecto neto de la selección para resistencia que favorece a los RR en los campos Bt sea igual al efecto neto de los costos de selección en contra de ese mismo genotipo en los refugios. La frecuencia de la resistencia disminuirá si aumenta el porcentaje de refugio, disminuye el valor selectivo de los resistentes en campos libres de Bt, y aumenta la desventaja de los resistentes en los campos Bt en relación a los campos libres de Bt. Por lo tanto, el porcentaje de refugio adecuado para que el alelo de resistencia se mantenga estable se puede estimar mediante la ecuación 6 siempre y cuando se conozcan los distintos valores selectivos. Por ejemplo, en un estudio realizado en campos de algodón de Arizona entre los años 1997 y 2004, Tabashnik y col. (2005) estimaron que, de acuerdo a valores selectivos empíricos medios de los RR en los refugios, y en los campos Bt de esa región, la frecuencia del alelo de resistencia se

614 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

el porcentaje de refugio para las dos primeras regiones de 39%, y para Carolina del Norte del 82%. Con estos tamaños, H. zea)1@&*6&)$&)*,(#(tencia en 9 años en Arkansas y Missisipi, y en mucho mas de 20 años en Carolina del Norte. Es evidente entonces que el porcentaje más alto de refugio, está impidiendo que la resistencia evolucione más rápidamente en poblaciones de H. zea de Carolina del Norte. Altos porcentajes de refugios también retardaron la evolución de la resistencia de H. armigera a Cry1Ac en Australia y China, de P. gossypiella +,-"4,/*%"81&',/*6/?*-(%,/*1"(4"/f* en Arizona, y de S. nonagrioides en España. p>7#'&,#(#*4,/*1">7:&,/q Un estudio recientemente publicado que En Australia, el tamaño del refugio fue del 70%, recavó información de monitoreo de la evolu- en China del 87-95%, en Arizona, del 50% y ción de la resistencia en distintos países de en España fue de alrededor del 95%. Sin emtodo el mundo, demostró que la estrategia de bargo, en estas especies una ventaja adiciolos refugios es en general efectiva y que los nal con respecto a H. zea fue la dominancia modelos teóricos son herramienta útiles para funcional (h) del gen de resistencia, que en la predecir dicha evolución bajo distintos escena- mayoría de ellas es completamente recesivo rios. El estudio se basó en resultados previos (h=0) y en H. zea tiene un valor alto (h=0,826) de análisis de la resistencia a Bt en campos ?&4.*,/#,+'.)$&)1@&/#9+)*O7#'&)',)$&)*,(#(",+/#&2) Por último, cabe destacar que un estudio de Australia, China, Japón, España y Estados Unidos, de seis de las principales plagas de reciente de simulación que aplica modelos geinsectos: C#("3.4#$*&'&$0"/#$&D'CE'F#&D'C#(".- nético poblacionales como los expuestos aquí, ,5")' 4"$#)3#%)D' G),$"%&' %+!"(&(")D' H#3,"%.*5.$&' pero que contemplan un mayor número de pagossypiella y Sesamia nonagrioides. Sólo en rámetros en el cálculo de los valores adaptaC#("3.4#$*&'F#& se observó evolución para la tivos (por ejemplo la reducción en la tasa de resistencia, medida mediante bioensayos, los mortalidad de los genotipos sensibles a medique demostraron un aumento en la concen- da que aumenta la edad de la planta y dismitración media letal (LC50) de toxina Bt Cry 1Ac nuye la expresión de la toxina, o la mortalidad para poblaciones coleccionadas en campos inducida por insecticidas químicos fumigados cultivados con plantas Bt, en comparación con en la zona de refugios) demuestra de manera /,7&() ,(7,/61/&() ',) $&5.*&".*#.) C!,) +!+/&) teórica que los refugios siguen siendo esenciahabían sido expuestas a una dieta Bt. Cuando les incluso en el caso de cultivos de algodón se incorporaron los parámetros reales iniciales que expresan dos toxinas. Estos cultivos “dodel monitoreo (frecuencias iniciales, porcenta- 5$,() A"=) (,) /.0,+%&*.+) &) /.0,*/#&$#%&*) >&/,) je de refugio, valores selectivos) a los modelos relativamente poco tiempo, por lo que faltan alteóricos, se obtuvieron resultados similares en gunos años para poner a prueba mediante dael cambio esperado teórico en dichas frecuen- tos de monitoreo a campo estas simulaciones cias que las obtenidas al cabo de unos años teóricas y demostrar, una vez mas la efectivide observación, demostrando la efectividad de dad real de los refugios. los modelos para la predicción futura en pro54")"#%,/*%23&',/*-"*7#*34(#*-"* gramas de manejo integrado de plagas. manejo de resistencia Los modelos teóricos predicen que H. zea El desarrollo de resistencia en las poblacioevolucionará mas rápido para resistencia que las otras plagas antes mencionadas. De hecho, nes de insectos, consecuencia del proceso nael aumento en la frecuencia del alelo de resis- tural de evolución, surge como adaptación a tencia en esta especie fue mayor en Arkansas las prácticas de manejo y por ende no se limita y Missisipi que en Carolina del Norte, siendo a un sistema particular de cultivo. Los insectos mantendrá estable con valores de porcentaje de refugios que ronden el 23%. Sin embargo, este valor obtenido de tamaño de refugio para el equilibrio, que como veremos mas adelante es un valor relativamente bajo en comparación a los que se consideran en la práctica valores efectivos de tamaños de refugios, se basó en estimas de valores selectivos de los individuos resistentes en los campos Bt (WRR/Bt) que también fueron bajos.

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 615

pueden adaptarse a cualquier práctica de manejo dependiendo de la presión de selección ejercida sobre ellos. Hay numerosos ejemplos de este fenómeno en insectos que han desa**.$$&'.) 0,/&+#(0.() ',) ',?,+(&) 1(#.$9-#/.(:) de comportamiento y metabólicos frente a insecticidas químicos, agentes de control biológico y controles culturales. En el caso particular de la tecnología Bt la presencia de la proteína durante todo el período de crecimiento del cultivo, aumenta la presión de selección y hace necesaria la incorporación de refugios para el manejo de resistencia de insectos (IRM) y como parte integrada del método de manejo de plagas. En todos los países donde esta tecnología se encuentra disponible se han desarrollado programas de manejo de resistencia de insectos. Estos programas son desarrollados en forma local y en colaboración entre los sectores académicos y de investigación, los gobiernos y la industria, (.5*,) 5&(,() /#,+"61/&() 3) &+&$#%&+'.) $&) (#"!&ción local en cuanto a plagas presentes y el ambiente agroecológico. Los elementos típicos de un plan de manejo de resistencia incluyen: SP*_#6"/%&:('&8#. Las características de los refugios están dadas por su tamaño (porcentaje sobre el total del área sembrada con maíz), distancia entre ellos y forma. Si bien generalmente en todos los países se utilizan recomendaciones similares que garantizan ampliamente un correcto manejo de resistencia de insectos, las características de los refugios estarán dadas entre otras cosas por las plagas objetivo presentes, por lo tanto los programas se sustentan sobre ensayos que permiten ampliar las herramientas disponibles para evaluar las recomendaciones de IRM dadas al productor. 2) Comunicación. Debido al papel clave del conocimiento del productor en el logro de un manejo exitoso y responsable de los maíces Bt, la comunicación es uno de los pilares de los programas de IRM. Los materiales educativos, la difusión en los medios especializados y la capacitación directa a los productores son algunas de las herramientas más utilizadas para lograrlo. Por otra parte es importante el

diagnóstico de la situación con respecto a la adopción de los refugios, no sólo para medir la aplicación real de la práctica, sino también como herramienta para ajustar la estrategia de comunicación dirigida al productor. Las encuestas periódicas son una herramienta utilizada en muchos países para estas mediciones. HP* +,#&%,1",. El objetivo del monitoreo es ',",/"&*)3)/.+1*0&*)/!&$C!#,*)7.(#5$,)',(&**.$$.) ',) *,(#(",+/#&) /.+) $&) (!1/#,+",) &+",$&/#9+) como para implementar medidas de remediación que permitan retrasar o prevenir la difusión de la resistencia y evitar que se pierda la capacidad de control de los maíces Bt. La herramienta apropiada para monitorear la resistencia a campo depende del patrón de evolución de la resistencia. El patrón espacial de evolución de la resistencia en el campo puede surgir en un foco localizado que evoluciona rápidamente y se expande, o a partir de una población donde la resistencia está dispersa y evoluciona lentamente con un incremento más gradual en la frecuencia de alelos resistentes. Es improbable que el muestreo al azar de la población permita detectar resistencia localizada, a menos que se lleve a cabo a una escala impracticable. En estos casos es mejor utilizar /.0.) >,**&0#,+"&) ',) 0.+#".*,.) $&) #',+"#1/&ción de lotes del cultivo con daños no esperados en las plantas. Para esto es fundamental que los productores estén capacitados para informar a la empresa proveedora de semilla la presencia de plantas del lote con daños de larvas. Una vez detectado e informado el daño +.),(7,*&'.:)(,)',5,*O)/.+1*0&*)C!,)$&)7$&+"&) es una planta Bt, que se esté expresando en sus tejidos el nivel de proteína esperado y que el daño no haya sido producido por otra especie no susceptible al maíz Bt o por cuestiones climáticas. Por otra parte, si la resistencia evoluciona lentamente a partir de áreas dispersas, los daños no esperados sólo podrán ser detectados cuando una gran proporción de la población se haya vuelto resistente. En este caso, la herramienta de monitoreo apropiada es el muestreo al azar de la población y el análisis en laboratorio para detectar frecuencias relativamente bajas de alelos de resistencia. 4) Remediación2)F+)/&(.)',)/.+1*0&*(,)$&) aparición de resistencia, deberá aplicarse un plan de remediación que permita reducir la fre-

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cuencia de insectos resistentes. Cuando la resistencia se detecta a través de la aparición de plantas con daños no esperados en el cultivo, es esperable que la proporción de resistencia ,+)$&)7.5$&/#9+)',)#+(,/".()(,&)(#-+#1/&"#4&2)F+) este caso las acciones a tomar podrán incluir la aplicación de insecticidas químicos para reducir la frecuencia de insectos resistentes e incluso la suspensión de la aplicación de cultivos Bt en la zona afectada. Por el contrario, si a través de un programa de monitoreo al azar y del análisis en laboratorio se detectara la presencia de alelos de resistencia en una población de insectos, pero la resistencia no se hubiera manifestado aún a campo, se podrían tomar otras medidas para caracterizar la resistencia y, de ser necesario, disminuir su dispersión. F("&() 0,'#'&() 7.'*6&+) #+/$!#*) $&) /.+1*0&/#9+) de la heredabilidad de la resistencia, determinar si la resistencia es recesiva o dominante, su frecuencia, etc.

que permita retrasar cualquier potencial desarrollo de resistencia y detectar inmediatamente cualquier cambio en la susceptibilidad de la población de insectos. ^&*&)/!07$#*)/.+),$).5@,"#4.)7*.7!,(".:)8V8)1nancia estudios locales realizados por del INTA, la Estación Agro Industrial Obispo Colombres, y profesionales de laboratorios privados, que permiten ampliar la comprensión de la bioecología de las plagas objetivo y contar con herramientas para monitorear su susceptibilidad a las proteínas Bt actualmente en el mercado. Con respecto a la comunicación hacia el productor y a la difusión del manejo adecuado de la tecnología Bt, ASA hace especial hincapié en la '#?!(#9+)',)!+)0,+(&@,)!+#1/&'.),+"*,)".'&()$&() empresas quienes se encuentran activamente comprometidas con el programa, como sigue: Los refugios deben sembrarse con un maíz no Bt de ciclo similar en la misma fecha de siembra que el lote Bt. F$)*,?!-#.)',5,)(,*),$)]\p)',)$&)(!7,*1/#,)',$) 54*)(#"@,*-"*4(*1"/&/%"#'&(*( lote. Por ejemplo, cada 9 hectáreas sembradas insectos en Argentina En Argentina, el Programa de Manejo de Re- con maíz Bt, debemos sembrar 1 hectárea con sistencia de Insectos (MRI) en maíz Bt apro- maíz no Bt. Los refugios deben sembrarse en bloque en bado por la Comisión Nacional Asesora de uno de los bordes del lote. Si el lote mide más Biotecnología Agropecuaria (CONABIA) en 1999, es llevado a cabo por la Asociación de de 1500 m de lado, el bloque de refugio deberá Semilleros Argentinos (ASA) entidad que nu- sembrarse en el centro del mismo, para aseguclea a todas las empresas que comercializan rar que los insectos del refugio puedan volar y maíz Bt en el país. El objetivo del programa es cruzarse con cualquier potencial sobreviviente promover un uso responsable de la tecnología, ',$)0&6%)A"2)N1-!*&)[E2 Tratamientos químicos: a) No deben realizarse aplicaciones de insecticidas para el control del barrenador del tallo (Diatraea saccharalis) en los refugios. b) En caso de detectarse ataque de gusano cogollero (Spodoptera frugiperda) por encima del umbral de acción, pueden aplicarse insecticidas. El mejor control del gusano cogollero se obtiene con aplicación de insecticidas en los primeros estadios del cultivo. De esta forma, además de facilitarse el trabajo, se disminuye la presión de la Figura 2: Distribución del refugio en el lote de acuerdo a las plaga en estadios más avanzados, dimensiones del mismo. Bt= zona sembrada con maíz Bt. preservando la función del refugio. Ref.= zona de refugio.

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Lecturas recomendadas

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VI. CAPÍTULO 6 Resistencia de malezas a L"1;&'&-(/f*"6,47'&8#*=* estrategias de manejo

especial atención, por constituir una alternativa ante el uso excesivo de herbicidas. Una de las opciones más conocidas y aplicadas es la rotación de cultivos con diferente ciclo y hábito de crecimiento, la elección de cultivares competiti4.(:)$&)0.'#1/&/#9+)',)$&)?,/>&)',)(#,05*&)3),$) Danie l Tuesca; Luisa Nisensohn; acortamiento de la distancia entre surcos a los Mario R Sabbatini; Guillermo Chantre 1+,() ',) &!0,+"&*) $&) >&5#$#'&') /.07,"#"#4&) ',) los cultivos frente a las malezas. Introducción En las últimas décadas el enfoque alternaEn los agroecosistemas la presencia de tivo más utilizado para solucionar el problema 0&$,%&() #+",*1,*,) '#1/!$"&+'.) $&() "&*,&() ',) de las malezas consistió en el control químico siembra y cosecha y generando pérdidas de utilizando herbicidas. Una de las razones de rendimiento por competencia con los cultivos. este predominio radica en la relativa simpliciLa magnitud de estas pérdidas varía en fun- dad de la tecnología, que permite su empleo ción de la interacción de numerosos factores aún con conocimientos escasos de los fundatales como la composición de la comunidad de mentos en que se sustenta. La elección de esmalezas, la abundancia relativa de cada una trategias de reducción o de erradicación de made las especies que la integran, las condicio- lezas en reemplazo de estrategias de prevennes ambientales, la modalidad de conducción ción y contención se vio favorecida no sólo por del cultivo, entre otros. Los niveles de pérdida ?&/".*,() ",/+.$9-#/.(:) /.0.) $&) ,1/&/#&) ',) $.() causados por las malezas pueden oscilar en- principios activos y la tecnología de aplicación, tre 0 y 30% para especies poco agresivas con sino también por factores económicos y sociobajos niveles de infestación hasta un 80% para culturales como la disminución de los costos malezas más competitivas, en densidades muy relativos, el aumento de la escala productiva altas y frecuentemente coexistiendo con el cul- y las características de los actores involucrativo durante todo su ciclo. dos en el proceso de producción. A pesar de la La reducción del grado de abundancia de las continua generación y sustitución de diversos poblaciones de malezas que acompañan los herbicidas en las últimas dos décadas no fue cultivos puede efectuarse mediante el control posible erradicar a las malezas sino que por el mecánico, empleando diversas herramientas contrario se seleccionaron biotipos tolerantes de labranza; el control biológico, que utiliza y/o resistentes a algunos principios activos. La agentes biocontroladores (fundamentalmente resistencia de diferentes biotipos de insectos insectos y hongos) que afectan malezas es- a diversos plaguicidas es el mayor desafío del 7,/61/&(; el control cultural, donde se aprove- control de plagas desde hace medio siglo en chan las características propias de los cultivos todo el mundo. En los últimos años, este misque integran la secuencia, y el control químico, mo desafío se ha trasladado al control de maque involucra el empleo de herbicidas. Actual- lezas, fundamentalmente en aquellos cultivos mente, el control mecánico tiene una utilidad en los que se aplican intensamente herbicidas. limitada debido a la adopción masiva de sisEn el manejo de malezas en cultivos se han temas con labranza mínima o directamente diferenciado dos conceptos que se relacionan sin labranza (siembra directa). El control bio- con la capacidad que tienen algunas plantas lógico, si bien es una metodología de mane- de sobrevivir a los tratamientos con herbicidas. jo de plagas altamente recomendado por su 8(6:),$)",**&0#,+"&),1/#,+",) para el control de la maleza.

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La detección de biotipos resistentes no es inmediata; este proceso sólo comienza a percibirse cuando los individuos resistentes representan aproximadamente el 30% de la población. Uno de los requisitos para la evolución de resistencia en las poblaciones de malezas es la presencia de variación genética heredable para la resistencia. Así, en poblaciones no seleccionadas se pueden distinguir dos situaciones: $&)7.5$&/#9+)+.)7.(,,)&$,$.()C!,)/.+1,*,+)*,sistencia al herbicida cuando se inicia el proceso de selección. En este caso la probabilidad de que la población adquiera resistencia a través de mutación, dependerá de i) la frecuencia de mutación, ii) las desventajas selectivas de los &$,$.().)-,+,()C!,)/.+1,*,+)*,(#(",+/#&),+)!+) ambiente sin selección y iii) el tamaño de la población. preexistencia de genes resistentes. En este /&(.)$.()&$,$.()C!,)/.+1,*,+)*,(#(",+/#&),("O+) presentes en la población antes de aplicarse el herbicida, aunque en una frecuencia muy baja para ser detectados. En esta situación, la evolución de la resistencia será más rápida que en 1. Mecanismos de resistencia Existen tres mecanismos por los cuales se &+!$&)$&)&/"#4#'&')1"."9M#/&)',$)>,*5#/#'&)',+"*.) de la planta y se genera resistencia: +,-&.'('&8#*-"4*/&%&,*-"*(''&8#?*Se producen cambios estructurales en la molécula que constituye el sitio de acción del herbicida. De esta manera, el herbicida no puede unirse a '#/>&) 0.$#5,) ,$) ,?,/".) 1"."9M#/.) (ej.: resistencia a las triazinas o a los inhibidores de ALS). E"%,R&.'('&8#* 3,1* )"%(;,4&A('&8#?* Se 7*.'!/,+)/&05#.(),+)$&)"&(&)',)',".M#1/&/#9+) del herbicida. En una planta resistente, el her5#/#'&)(,)',-*&'&)&)0,"&5.$#".()+.)1"."9M#/.() en forma más rápida que en una planta susceptible (ej.: algunos casos de resistencia a los inhibidores de la síntesis de ácidos grasos). b"-7'&-(* (;/,1'&8#+)+''&(%)#")*,/)&%53"%'&+#,!"/