ISSN 0325-7541

216 ACTUALIZACIÓN

Revista Revista Argentina Argentina de de Microbiología Microbiología (2012) (2012) 44: 44: 216-230 216-230

Avances en el desarrollo de vacunas contra la neosporosis bovina YANINA P. HECKER1*, MARÍA C. VENTURINI2, CARLOS M. CAMPERO1, ANSELMO C. ODEÓN1, DADÍN P. MOORE1 Patología Veterinaria, Estación Experimental Agropecuaria, Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), CC 276 (7620) Balcarce; 2Laboratorio de Parasitología e Inmunoparasitología, Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Nacional de La Plata (UNLP), 60 y 118 (1900) La Plata, Argentina. *Correspondencia. E-mail: [email protected]

1

RESUMEN La neosporosis es una enfermedad que ocasiona abortos en bovinos y está causada por un protozoo intracelular obligado denominado Neospora caninum. Las graves pérdidas económicas que provoca en los sistemas de producción de bovinos justifica la necesidad de avanzar en el desarrollo de vacunas. La resistencia a parásitos Apicomplexa está asociada a una respuesta inmune T helper 1 mediada por linfocitos T CD4 citotóxicos y a la producción de interferón-gamma, interleuquina-12, factor de necrosis tumoral e inmunoglobulina G2. La disminución de la transmisión vertical en las sucesivas preñeces y el bajo nivel de repetición de abortos en animales infectados sugieren la existencia de mecanismos inmunitarios de protección. Hasta el momento se conoce que la inoculación pre-servicio con taquizoítos vivos protege contra la infección y el aborto. Los antecedentes de desarrollo de vacunas vivas contra otros protozoos estimulan a los investigadores a continuar en la búsqueda de una vacuna de este tipo contra N. caninum de buena eficacia. Por otra parte, una vacuna inactivada, aun con una baja eficacia, es útil en la prevención del aborto en aquellos establecimientos donde la enfermedad es epizoótica. Una vacuna contra la neosporosis debería evitar el aborto, la transmisión transplacental y la persistencia de la infección. Este trabajo menciona los diversos tipos de vacunas que han sido evaluados hasta el momento, incluyendo inmunógenos inactivos, taquizoítos vivos, antígenos recombinantes y vacunas en vectores. Palabras clave: Neospora caninum, bovinos, aborto, vacuna

ABSTRACT Advances in the development of vaccines for bovine neosporosis. Neosporosis, a disease caused by the obligate intracellular protozoan Neospora caninum, produces abortions in cattle. The severe economic losses in cattle industry justify the need to develop control measures for preventing bovine abortion. Apicomplexan parasitic resistance is associated with T helper 1 immune response mediated by CD4 cytotoxic T lymphocytes, the production of interferon-gamma, interleukin-12, tumor necrosis factor and immunoglobulin G 2. The reduction of vertical transmission in subsequent pregnancies and the low levels of abortion repetition suggests the existence of protective immune mechanisms. Inoculation with live tachyzoites before mating protects against infection and abortion. Antecedents of the development of live vaccines against other protozoa stimulate research to develop a live vaccine against N. caninum. On the other hand, an inactivated vaccine with low efficacy against neosporosis is useful in the prevention of abortion in farms with epizootic disease. A neosporosis vaccine should avoid abortion, transplacental transmission and infection persistence. In the present work, advances in vaccine development including lysate of tachyzoites, live parasites, recombinant antigens and vaccine vectors are reviewed. Key words: Neospora caninum, bovines, abortion, vaccine

INTRODUCCIÓN Generalidades de la enfermedad La neosporosis es una enfermedad que ocasiona abortos en bovinos y está causada por un protozoo intracelular obligado denominado Neospora caninum. Su ciclo de vida es heteroxeno e involucra tres estadios parasitarios reconocidos: taquizoítos, bradizoítos y esporozoítos (22). Los taquizoítos y bradizoítos se

encuentran en hospedadores intermediarios (bovinos, ovinos, caprinos, búfalos, ciervos, equinos y otras especies de sangre caliente), mientras que los esporozoítos contenidos en esporocistos se eliminan dentro de ooquistes en las heces de los hospedadores definitivos (perros, dingos y coyotes) (8, 26, 35, 48). El ganado bovino se puede infectar de forma horizontal, por ingestión de ooquistes eliminados por el hospedador definitivo, y vertical o transplacental,

Vacunas contra la neosporosis

cuando la madre infectada transmite a su cría la infección durante la gestación. Trees y Williams (81) propusieron el uso del término transmisión transplacental endógena para definir la infección fetal a partir de la reactivación de una infección crónica latente y así diferenciarlo de la transmisión transplacental exógena, que alude a la infección fetal que ocurre como resultado de la infección de la madre por ingestión de ooquistes durante la preñez. Cualquiera de estas vías de transmisión conduce a la infección del feto y, ocasionalmente, al aborto. El aborto es la principal manifestación clínica en la neosporosis bovina y se puede producir en forma enzoótica, asociado a frecuentes infecciones crónicas ver ticales, o epizoótica, en relación con infecciones agudas posnatales (22). Medidas de control Desde el punto de vista económico, Reichel y Ellis (70) mencionan que establecimientos con prevalencias de N. caninum iguales o menores del 21 % pueden convivir con la enfermedad sin implementar medidas de control. Las medidas de lucha contra la neosporosis bovina pueden sustentarse en limitar el ciclo parasitario, en la quimioterapéutica y/o en el desarrollo de vacunas. Para limitar el ciclo parasitario se debe controlar el ingreso de perros a las fuentes de agua y de alimento de los bovinos, también es preciso eliminar fetos abortados y realizar el control de roedores (22). La eliminación de todos los animales infectados, aunque económicamente inviable, sería desde el punto de vista sanitario la opción más eficaz (70). Sin embargo, no existen garantías de minimizar el riesgo de infección posnatal y tormentas de aborto teniendo un rodeo libre de N. caninum (22). Por otro lado, se ha mencionado el empleo de transferencia embrionaria (12) y la reposición selectiva con animales seronegativos como otra posible forma de control (22). En relación con la quimioterapéutica, la aplicación de drogas in vitro ha llevado a resultados variables, y es escasa la información acerca de tratamientos in vivo para bovinos (22, 32). Experimentalmente se ha evaluado el efecto del toltrazuril sobre N. caninum con resultados alentadores, aunque el uso de esta droga en la práctica diaria es una opción económicamente inviable (70). Se han evaluado diversos tipos de vacunas. Las vacunas inactivadas son seguras, pero han demostrado baja eficacia (25 a 60 %) y no previenen la transmisión vertical (74, 83). Sin embargo, son una

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herramienta económicamente viable en hatos donde la seroprevalencia es superior al 21 % (70). En contraposición, la vacunación con parásitos vivos en la hembra bovina genera protección no solo contra la transmisión vertical, sino también contra el aborto (30, 87), pero produce infecciones crónicas en el animal (71). Por otra parte, los resultados obtenidos hasta el momento en trabajos donde se emplearon proteínas recombinantes y vectores no han sido alentadores (1, 15, 39, 61, 71, 78). Una vacuna contra la neosporosis debería evitar el aborto, la transmisión transplacental y la persistencia de la infección. Situación actual de la enfermedad en el país La situación de la neosporosis en la Argentina ya fue revisada previamente (53); sin embargo, desde entonces se han realizado algunos estudios de diagnóstico, epidemiología y desarrollo de inmunógenos experimentales. En 2008, se implicó como causa de aborto a N. caninum en 10 % de 666 fetos que presentaban lesiones histopatológicas compatibles y resultaron positivos mediante inmunofluorescencia indirecta (IFI) (fluido fetal >1:25) y/o inmunohistoquímica y/o nested-PCR (55). Posteriormente, Moore et al. (56) demostraron que la prevalencia hallada en bovinos (IFI >1:200) fue diferente de acuerdo con la categoría analizada. En las categorías vaquillona de reposición y vaca para carne se hallaron prevalencias del 2,6 % (n = 265) y 17,3 % (n = 1190), respectivamente. Por otra parte, en el ganado para leche se observó una prevalencia en la vaquillona de reemplazo del 18,8 % (n = 2501), y en la vaca en ordeñe del 39,8 % (n = 291). Avalando la hipótesis acerca de la transmisión horizontal, Moré et al. (58) describen que 9/19 terneros seronegativos precalostrales evidenciaron seroconversión cuando fueron evaluados a los 7 meses (IFI >1:25).

BASES DE LA RESPUESTA INMUNITARIA EN LA ENFERMEDAD NATURAL Y FACTIBILIDAD DE UNA VACUNA La resistencia a parásitos Apicomplexa está asociada a una respuesta inmunitaria T helper 1 (Th1) mediada por linfocitos T CD4 + citotóxicos, con producción de IFN-γ (interferón-gamma), IL-12 (interleuquina-12), FNT (factor de necrosis tumoral) e IgG2 (inmunoglobulina G2) (30, 31, 87). La respuesta Th1 desencadenada por el parásito al comienzo de la preñez genera una serie de

218

procesos inmunopatológicos que son incompatibles con el mantenimiento de la gestación. Por otro lado, en la gestación tardía, cuando la respuesta Th1 es moderada, la lesión en la placenta es menor y el feto sobrevive (31). La disminución de la transmisión vertical en las sucesivas preñeces y el bajo nivel de repetición de abortos en animales infectados sugieren la existencia de mecanismos inmunitarios adaptativos de protección (31, 49). Williams et al. (86) desafiaron hembras preñadas crónicamente infectadas y no infectadas, y hallaron que los fetos de las hembras no infectadas murieron a las 3-5 semanas posdesafío; sin embargo, las hembras con infección crónica parieron terneros sin signos clínicos, pero congénitamente infectados. Resultados similares obtuvieron Andrianarivo et al. (6), quienes observaron que vaquillonas naturalmente infectadas parieron terneros infectados, a pesar de haber sido inmunizadas con anterioridad con parásitos inactivados. También, Williams et al. (87) inmunizaron hembras bovinas a las 9 semanas pre-servicio y luego las desafiaron (día 70 de la gestación), y observaron que la vacunación con taquizoítos vivos previno eficientemente el aborto. Los estudios mencionados alientan la posibilidad de desarrollar una vacuna contra esta enfermedad. Hay referencias del desarrollo y empleo de vacunas vivas contra otros protozoos. Existe en el mercado una vacuna contra Toxoplasma gondii elaborada a partir de taquizoítos vivos de la cepa S48, atenuados luego de sucesivos pasajes. Esta vacuna presenta una elevada eficacia y un adecuado nivel de protección contra el aborto durante 18 meses (10). Otros ejemplos de vacunas vivas son las existentes contra la coccidiosis aviar y la babesiosis bovina, que presentan una eficacia de 80-90 % (32, 33, 71). Por otro lado, también existen en el mercado vacunas inactivadas con buena eficacia contra otros protozoos que afectan a los caninos, como es el caso de la giardiosis y la leishmaniosis (33, 71). Modelos experimentales murinos La realización de ensayos experimentales en bovinos implica un alto costo e insume tiempo debido al período gestacional de esta especie. Por eso se ha recurrido al uso de modelos experimentales murinos antes de pasar a la experimentación en bovinos. En los modelos experimentales se han preferido especies de corta gestación y bajo costo de mantenimiento, como ratones y meriones (Tabla 1). Se han

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utilizado varias cepas de ratones, entre ellas los ratones BALB/c y C57BL/6, porque los animales enfermos manifiestan signos clínicos característicos, cambios en el peso corporal y lesiones histopatológicas considerables (40). La transmisión transplacental fue evaluada desafiando ratones Quackenbush (Qs), los que tienen la particularidad de ser resistentes a N. caninum, son muy prolíficos y pueden transmitir eficazmente la infección a sus fetos in utero (51). Rojo-Montejo et al. (72) describieron una cepa de N. caninum poco patógena en ratones. Esta fue posteriormente evaluada en bovinos, en los que se obtuvieron similares resultados. Se ha sugerido la utilización de esta cepa para el desarrollo de una vacuna viva en bovinos, considerando que el desarrollo de la vacuna contra T. gondii con la cepa S48 fue posible gracias a la atenuación que se produjo luego de más de 3000 pasajes en ratón (10, 11). Estudios en bovinos Debido a que el efecto de N. caninum sobre la hembra bovina gestante varía según el período gestacional que esté cursando (85), varios autores han realizado trabajos experimentales en diferentes momentos de dicho período, para evaluar la respuesta inmunitaria y sus consecuencias (Tabla 2). Algunos autores han inoculado taquizoítos vivos en el primer tercio de la gestación y han observado el aborto entre las 3 y las 6 semanas posinfección (44, 73, 85, 86). En contraste, en otros trabajos donde se inoculó N. caninum en el segundo tercio de la gestación, la infección fetal fue el hallazgo más común y raramente se produjeron abortos (20, 45). La inoculación en el último tercio de la gestación demostró que la respuesta inmunitaria fetal puede controlar la infección y evitar el aborto, aunque los terneros nacen persistentemente infectados (85). Además de las vías de inoculación convencionales para taquizoítos vivos (endovenosa, intramuscular, subcutánea), se han probado otros modelos experimentales basados en la ingestión oral de ooquistes. Estos han demostrado que la infección del animal depende de la dosis ingerida (27, 80). En adición, se han estudiado también las vías de infección venérea y conjuntival. Serrano et al. (75, 76) concluyeron que si bien vaquillonas inseminadas con semen infectado con taquizoítos seroconvirtieron, es poco probable que esto ocurra naturalmente debido a que la dosis infectante usada en el semen fue muy alta (22). Por otra parte, de Yaniz et al. (20) desafiaron vaquillonas seronegativas con 5 meses de gestación por vía

No No

rNcSAG1 y rNcSRS2

pc (3)NcGRA7

FIA(7) VSA(8) Saponina

CpG-ODN (4) Liposoma

rNcGRA1, rNcGRA2, rNcMIC10, rNcp24b;

rNcROP2; rNcROP2+NcMIC1, rNcROP2+rNcMIC3, y rNcROP2+rNcMIC1+ rNcMIC3

Lisado de N. caninum, NcESA

rNcGRA7

Cerebral

No realizada

Cerebral

Cerebral

Cerebral

Cerebral Fetal

Cerebral

No se evaluó

ON, IL-2 e IFN-γ

(89) (19)

ip (5): rNcROP2 alto rNcMAG1 moderado, rNcPDI bajo. in (11): rNcPDI alto, rNcROP2 moderado, rNcROP2 alto.

(1)

(62)

(71)

(18)

(23)

(17)

(78)

(68)

(7)

(82)

(65)

(64)

(28)

(15)

(2)

(34)

Se evaluó inmunogenicidad

Nulo

Moderado

IgG1 IgG2 IFN-γ IgG IFN-γ/IL-10IFN-γ

Lisado (con o sin adyuvante) moderado; NcESA bajo

Moderado Moderado

IgG1, IL-4 IgG1, IL-4

IgG2, IgG1, IL-12, IFN-γ.

rNcMIC10+rNcp24b moderado

Moderado

IgG1, IgG2 IgG1, IgG2

rNcMIC4 moderadopc(3)rNcMIC4: bajo

RB51-rNcSRS2 moderado y RB51-rNcMIC3 moderado

Moderado

RB51-rNcSRS2 alto RB51rGRA7 moderado

Bajo

Alto

Moderado en rNcSRS2rNcDG1 y bajo en rNcDG1-NcDG2. Alto

IgG1, IgG2

Ig G, IFN-γ e IL-10

IgG e IgM

Desafío letal ip(5) Transmisión congénita

IFN-γ

IgG2 , IFN-γ, IgG 1

Cerebral

Cerebral

IgG

Moderado Moderado

(39)

(13)

(14)

(43)

(43)

Cita (N.º)

219

(1) Grado de protección: Nulo: 0 %, Bajo: 25 %, Moderado: 50-75 %, Alto: > 75 %; (2)RIBI: emulsión de copolímeros no iónicos; (3)pc: plásmido de ADN; (4)CpG –ODN: oligodinucleótidos; (5)ip: intraperitoneal; (6)FCA: adyuvante de Freund; (7)FIA: adyuvante incompleto de Freund; (8)VSA: emulsión de agua en aceite; (9)NcESA: antígeno de secreción/excreción; (10)ON: óxido nítrico; (11)in: intranasal.

Saponina; toxina colérica

Saponina,

rNcROP2

rNcPDI, rNcROP2, rNcMAG1

RIBI

Nc-MIC4, rNcMIC4, pc (3)rMIC4

VSA

No

rNcMIC1, rNcMIC3,rNcGRA2,rN cGRA6 y rNcSRS2 en RB51

FCA(6)

No

Taquizoítos vivos atenuados

rNcSAG4 y rNcGRA7

No

rNcSRS2 y rNcGRA7 expresadas en RB51

rNcSRS2-ADN vacuna

Transmisión congénita

ISCOMs

rNcSRS2

(8)

Cerebral

ISCOMs

rNcSRS2

IgG 1 e IL-4

Transmisión congénita

FCA(6) Cerebral

No se evaluó

Desafío letal ip(5)

No

No se evaluó

rNcSAG1,rNcSRS2, rNcDG1,rNcDG2 rNcSRS2

Transmisión congénita

Moderado

Alto

No se evaluó

IgG total, IgG1 e IgG2

IgG

RIBI(2)

Cerebral Transmisión congénita

Alto

Moderado

Bajo

Grado de protección(1)

IgG1

IFN-γ

IFN-γ

Respuesta inmune evaluada

Cerebral

CpG –ODN

pc NcGRA7

rNcMIC1 ; pc(3)NcMIC1

(4)

RIBI(2)

rNcMIC3

(3)

Cerebral

Quil A

Lisado de taquizoítos

Cerebral Cerebral

ISCOMs

Lisado de taquizoítos

Modelo de infección

Adyuvante

Tipo de antígeno

Tabla 1. Diferentes inmunógenos experimentales utilizados en ratones y meriones, respuesta inmune lograda y grado de protección contra N. caninum

Vacunas contra la neosporosis

IgG 1 e IgG2, linfoproliferación, IFN-γ

Montanide ISA 773

Polygen

Havlogen, BayR1005

No se usó

Aceite mineral + RIBOZIN (3)

Havlogen

No se usó

VSA(4)

Quil-A

FCA (5)

ISCOMs

Taquizoíto entero muerto

Taquizoíto entero muerto

Taquizoíto entero muerto

Taquizoitos vivos (pre servicio)

Taquizoítos entero muerto

Taquizoítos entero muerto

Taquizoítos vivos

Lisado de taquizoítos

Lisado de taquizoítos

rNcSRS2-ácido palmítico

Fracción soluble de lisado de taquizoítos Terneros

Vaquillonas

Vaquillona gestante

Novillos

Vaquillona gestante

Vaquillona gestante

Vaquillona no gestante

Vaquillona gestante

Respuesta humoral, IFN-γ

IgG 1, IFN-γ

Respuesta humoral

Respuesta humoral, IFN-γ

No se evaluó

IgG1 e IgG2, IFN-γ

Solo se evaluó inmunogenicidad

Se evaluó inmunogenicidad

Bajo

Bajo

Alto

No se evaluó

Solo se evaluó inmunogenicidad

Alto

IgG, IgM, linfoproliferación, IFN-γ

Nulo Se evaluó inmunogenicidad

Respuesta humoral

IgG1 linfoproliferación IFN-γ

No provocó respuesta humoral ni celular significativa

Respuesta humoral.

Grado de protección: Nulo: 0 %, Bajo: 25 %, Moderado: 50-75 %, Alto: > 75 %; (2)Aceite mineral: mezcla de Arlacel, Marcol 52 y Tween 80; RIBOZIN: fracción ribosomal de E. coli; (4)VSA-3: emulsión de agua en aceite; (5)FCA: adyuvante de Freund.

(3)

(1)

Respuesta humoral

Bay R-1005 + Havlogen

Taquizoíto entero muerto

(2)

Polygen

Linfoproliferación

Havlogen

Taquizoíto entero muerto

Se evaluó inmunogenicidad

Respuesta humoral, linfoproliferación, IFN-γ

Taquizoíto entero muerto

Vaquillona no gestante

No se usó

Taquizoítos vivos

Grado de protección (1)

Respuesta inmune lograda

Adyuvante

Tipo de antígeno

Sexo y Estado fisiológico

Tabla 2. Ensayos con inmunógenos experimentales, respuesta inmunitaria y grado de protección para controlar la infección por N. caninum en bovinos

(57)

(71)

(87)

(71)

(53)

(30)

(16)

(5)

(4)

Autor y año cita (N.º)

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Vacunas contra la neosporosis

conjuntival con taquizoítos vivos de N. caninum y observaron que estas desarrollaron anticuerpos al sexto mes de gestación, pero revirtieron su condición serológica al final de la preñez. Para la evaluación de inmunógenos experimentales en bovinos se han utilizado modelos de vacunación/ desafío que permiten mejorar el conocimiento de la inmunopatología de la enfermedad y evaluar la seguridad y eficacia de la vacuna. Innes et al. (30) utilizaron un modelo de vacunación pre-servicio y desafío a mitad de la gestación en hembras bovinas seronegativas. Dicho estudio mostró que la respuesta inmunitaria generada evitó la transmisión congénita al feto. Por otra parte, Williams et al. (87) observaron que hembras bovinas inmunizadas pre-servicio con taquizoítos vivos no abortaron cuando fueron desafiadas al día 70 de gestación, y las madres no llegaron a infectarse persistentemente.

VACUNAS EXPERIMENTALES El desarrollo de los primeros inmunógenos experimentales en bovinos se sustentó en formulaciones con lisados completos de taquizoítos más la utilización de diversos adyuvantes, capaces de ocasionar una respuesta inmunitaria similar a la producida por la enfermedad (4, 5, 16, 53, 57). Considerando la secuencia cronológica de estas investigaciones, revisaremos brevemente el concepto de adyuvantes, para luego detallar los últimos avances en la producción y evaluación de antígenos. Adyuvantes Los adyuvantes se utilizan para la formulación de vacunas, combinados con los antígenos para aumentar su inmunogenicidad e inducir mecanismos inmunitarios asociados a la protección (60). Existe una gran variedad de compuestos químicos y biológicos con propiedades adyuvantes; los más utilizados en medicina veterinaria son las emulsiones de aceite mineral (agua en aceite o aceite en agua) y los adsorbentes (hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio). En la actualidad, son cada vez más usados los sistemas de transporte de antígenos como los complejos inmunoestimulantes (ISCOM, por sus siglas en inglés) y los liposomas. La descripción y caracterización de cada uno de ellos exceden los objetivos de este trabajo, sin embargo, se mencionarán aquellos utilizados en el desarrollo de inmunógenos experimentales para controlar la neosporosis.

221

Las sales de aluminio son adyuvantes relativamente débiles que principalmente inducen respuesta del tipo Th2, con producción de IL-4, IL-5, IL-10, IL13 e IgG1. Dicha característica hace que no sean adecuados para protozoos intracelulares como N. caninum, en los que la respuesta Th1 con producción de IFN-γ, IL-12, FNT e IgG2 es fundamental para la protección. Con este tipo de adyuvantes son poco frecuentes los efectos adversos, por lo general relacionados con reacciones alérgicas y granulomas en el sitio de inoculación (60, 77). Dentro del grupo de adyuvantes oleosos se encuentran las emulsiones de aceite en agua o agua en aceite, como Montanide 773, Marcol 52 y VSA-3. Dichos compuestos inducen una respuesta inmunitaria tanto Th1 como Th2. Sin embargo, pueden provocar reacciones adversas en el sitio de inyección, con formación de granulomas, a causa de su limitada biodegradabilidad y biocompatibilidad (60, 77). Las saponinas son una mezcla de glicósidos triterpenoides derivados del extracto crudo de la corteza de un árbol llamado Quillaja saponaria, que tienen efectos adyuvantes pero son de elevada toxicidad. Quil A es una mezcla parcialmente purificada de este extracto crudo, de menor toxicidad, que es usada en medicina veterinaria en vacunas para bovinos, porcinos, equinos, caninos y felinos. El fraccionamiento de Quil A llevó a la obtención de 28 fracciones, de las cuales las identificadas como QS21 y ISCOPREP 703 son las que más han sido estudiadas. Las saponinas inducen una importante respuesta Th1 al activar la vía endógena de procesamiento de antígenos, con producción de IL-2 e IFN-γ. La seguridad de estos compuestos depende de la ruta de administración, la especie y la saponina específica que se administra (25, 60, 77). Otro grupo de adyuvantes que se han usado en medicina veterinaria son los adyuvantes de Freund, de los cuales existen dos tipos: completo e incompleto. El adyuvante incompleto de Freund (FIA) consiste en una solución acuosa en la que se incluye el antígeno, más un aceite mineral y un agente dispersante. Por otro lado, el adyuvante completo de Freund (FCA) presenta la misma composición que el incompleto, pero se le añade una suspensión de micobacterias muertas por calor. Estos compuestos han sido utilizados durante muchos años y siguen empleándose, especialmente cuando se dispone de cantidades limitadas de antígenos o cuando estos presentan baja inmunogenicidad. El FCA provoca una mejor activación de macrófagos que liberan IL-1, al

222

inducir la respuesta Th1 debido a la incorporación del muramil dipéptido. Sin embargo, este compuesto puede provocar efectos adversos (60, 77). Una serie de polímeros sintéticos pueden ser usados como adyuvantes dada su baja toxicidad, con una buena respuesta Th1 (77). Como ejemplo de este tipo de compuestos se mencionan Polygen® y Havlogen ®. Este último se prepara mezclando Carbopol (resina soluble en agua) con detergentes, como el Tween 80 o el Span 20, y finalmente se añade un aceite para producir la emulsión. El adyuvante Polygen® es una base de polímeros de bajo peso molecular, que pueden formar enlaces cruzados en solución para convertirse en un gel de alto peso molecular. Sin embargo, los resultados obtenidos con vacunas experimentales de N. caninum utilizando Polygen® y Havlogen® como adyuvantes no fueron satisfactorios (4, 5). El empleo de los adyuvantes que incluyen secuencias CpG resulta una opción interesante. Este tipo de secuencias de nucleótidos se halla presente en el ADN bacteriano y en el eucariota, pero en el segundo son de baja expresión y se encuentran metiladas. Debido a esto, cuando las secuencias CpG ingresan al organismo son reconocidas como un agente extraño por el sistema inmunitario, por receptores de la familia Toll-like tipo 9. La elaboración de oligodeoxinucleótidos sintéticos (ODN) que expresan motivos CpG (CpG-ODN) resulta una opción interesante en situaciones donde la cantidad de inmunógenos utilizada en la elaboración de vacunas es subóptima. Este tipo de compuestos despiertan específicamente una respuesta Th1 con producción de IFN-γ, el cual estimula la producción de IgG2 y facilita el desarrollo de una respuesta citotóxica (36). Los ISCOM son micropartículas esféricas huecas de 40 nm de diámetro, que están constituidas por lípidos, saponinas y antígenos. En general, la saponina es Quil A, los lípidos pueden ser una mezcla de colesterol y fosfatidilcolina o bien fosfatidiletanolamina, y el antígeno puede ser una proteína con un dominio transmembrana. Los ISCOM promueven la formación de anticuerpos y estimulan reacciones de hipersensibilidad retardada y citotoxicidad. La producción prominente de IL-12 en el sistema inmunitario es una reacción típica inducida por los ISCOM, que tiene como consecuencia una importante respuesta Th1 (59). Los liposomas son micropartículas lipídicas sintéticas que contienen encapsulado al antígeno para evitar su rápida degradación. Se han obtenido buenos resultados utilizando liposomas con antígenos de los agentes que

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ocasionan la malaria y el cólera (60). En general, los liposomas generan mejor respuesta inmunitaria cuando se asocian con otros adyuvantes (77).

ANTÍGENOS UTILIZADOS Vacunas a base de lisado de taquizoítos Uno de los primeros trabajos realizados con lisados de taquizoítos fue el de Andrianarivo et al. (4), quienes evaluaron la respuesta inmunitaria en bovinos utilizando tres adyuvantes sintéticos (Havlogen®, Polygen® y un tercero, que era la combinación de Havlogen® con Bay R-1005®), y también uno oleoso (Montanide ISA 773). En este estudio, la formulación con Polygen® fue uno de los productos que generó máxima respuesta de anticuerpos, con niveles de IFN-γ similares a los presentes en vaquillonas infectadas con taquizoítos vivos. Posteriormente, el mismo grupo de trabajo evaluó la prevención de la infección fetal en vaquillonas preñadas inmunizadas al día 35 de gestación con una vacuna a base de lisado de taquizoítos y Polygen® (5). Las vaquillonas fueron desafiadas posteriormente con taquizoítos vivos. Los resultados mostraron que la formulación no fue efectiva y que todos los fetos resultaron infectados. La respuesta proliferativa celular y la producción de IFN-γ luego del desafío fueron semejantes a las obtenidas posinmunización. En ese mismo año, Choromansky et al. (16) evaluaron la respuesta inmunitaria humoral inducida por un lisado de taquizoítos en Havlogen® y Bay R 1005 ®. Los autores concluyeron que las formulaciones no generaron reacciones en el sitio de inoculación y que todos los animales vacunados generaron anticuerpos específicos contra N. caninum, especialmente luego de la segunda dosis vacunal. Existe en el mercado una única vacuna comercial disponible (Neoguard®, Intervet, Millsboro, Estados Unidos), que está formulada con lisado de taquizoítos en Havlogen® y se aplica antes del servicio o 2 veces en el primer trimestre de gestación, con un intervalo de 4 semanas. Romero et al. (74) llevaron a cabo una prueba a campo de esta vacuna sobre dos rodeos lecheros de Costa Rica. Los resultados mostraron una incidencia de abortos del 11,2 % (49/438) y 20,8 % (91/438) al comparar los animales que fueron vacunados con aquellos que solo recibieron el placebo (solución fisiológica), respectivamente. Este estudio demostró que la vacuna tuvo un efecto

Vacunas contra la neosporosis

razonable sobre el porcentaje total de abortos en rodeos lecheros de Costa Rica, aunque no se realizaron estudios para caracterizar los abortos producidos, por lo cual queda un margen de duda sobre su eficacia real. Dicho inmunógeno también se utilizó en Nueva Zelanda en 5 rodeos lecheros, donde se observó un efecto significativo en 2 de los 5 hatos evaluados. La eficacia de la vacuna varió entre el 30 y el 54 %. En uno de esos establecimientos, donde hubo frecuentes abortos por N. caninum, la utilización de la vacuna fue beneficiosa, con una eficacia del 61 % (83). Vacunas vivas La utilización de las vacunas vivas para controlar la neosporosis bovina, si bien ha demostrado ser efectiva, se encuentra limitada debido a la posibilidad de generar infecciones crónicas con posterior transmisión vertical (70). No obstante, la protección que genera este tipo de vacunas las convierte en una opción interesante como herramienta de lucha contra la enfermedad. A este fin, sería deseable contar con una cepa de N. caninum de escasa virulencia que no provoque infección crónica en el animal vacunado, que no se transmita verticalmente al feto y que no implique riesgo de reversión de virulencia (32). Como se mencionó previamente, existe en el mercado una vacuna contra T. gondii elaborada a partir de la cepa S48, que perdió su capacidad para diferenciarse a bradizoítos. El mecanismo por el cual se produjo este cambio aún no es comprendido, y persiste la chance de que esta cepa vuelva a cambiar sus características (10, 11, 33). En adición, esta vacuna fue usada en un modelo de vacunación/ desafío en hembras ovinas gestantes desafiadas al día 90 de gestación, con el objeto de evaluar la existencia de reactividad cruzada entre T. gondii y N. caninum. Si bien los resultados evidenciaron la existencia de mecanismos inmunitarios comunes a ambos agentes, la vacuna contra T. gondii no protegió del aborto inducido por el desafío con N. caninum (32). En contraposición, Penarete Vargas et al. (63) reportan que ratones vacunados con una cepa de T. gondii de baja virulencia (MIC1-3KO) resistieron el desafío letal con N. caninum. Una vacuna viva, en general, se logra sobre la base de poblaciones de parásitos que han sido atenuados en una o más de sus características fenotípicas. Las mutantes sensibles a temperaturas y los taquizoítos irradiados son algunos ejemplos de estas poblaciones, y ambos tipos han sido empleados

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en experimentos en ratones (41, 66). No se han publicado aún pruebas de inmunización usando dichas mutantes en bovinos. La cepa atenuada Nc-Nowra fue aislada de terneros sin signos clínicos, en Australia (50). Esta cepa no es patógena en ratones. Miller et al. (60) realizaron un ensayo con esta cepa inoculando ratones antes de la preñez y obtuvieron una reducción de la transmisión transplacental. En otro trabajo realizado en bovinos por Williams et al. (87), también se vacunó con Nc-Nowra antes de la preñez, y se determinó la existencia de protección contra la muerte fetal luego del desafío al día 70 de gestación con la cepa patógena Nc Liverpool. Estos animales tuvieron una respuesta inmunitaria celular con altos niveles de IFN-γ antes del desafío con la cepa fetopatogénica. Otra cepa bovina de baja virulencia que ha sido aislada y caracterizada es la Nc-Spain 1H (72, 73). Esta se aisló del cerebro de un ternero naturalmente infectado asintomático. La patogenicidad de esta cepa fue examinada en ratones BALB/c. No se observaron signos clínicos y/o muerte, y el ADN del parásito no fue detectado durante el estadio crónico de la infección en el cerebro de los ratones. Utilizando el modelo de ratón preñado, dicha cepa evidenció un porcentaje de sobrevivencia de las crías de madres infectadas del 95 %, con detección de ADN de N. caninum solo en una cría (72). Posteriormente, esta cepa fue inoculada también en hembras bovinas gestantes al día 70 de gestación. No se observó muerte fetal, ni lesiones histopatológicas moderadas o graves, como así tampoco presencia de ADN (73). Los resultados obtenidos en estos dos últimos trabajos crean expectativas favorables para el desarrollo de una vacuna viva atenuada. Vacunas a subunidades El desarrollo de vacunas con proteínas recombinantes es otra de las posibilidades para la obtención de un inmunógeno para mejorar el control de la neosporosis; no obstante, su participación en los ensayos vacunales es aún limitada (Tabla 3). La localización y la función celular son criterios importantes que deben ser considerados al momento de la elección de un inmunógeno para el desarrollo de una vacuna (71). Proteínas de superficie como inmunógenos Las proteínas de superficie de todos los parásitos intracelulares obligados son las primeras en inte-

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Tabla 3. Antígenos de Neospora que se han evaluado como inmunógenos Localización

Proteínas

Cita (N.º)

Proteínas de superficie

SAG 1

(1) (14) (15)

Proteínas del

Micronema

complejo apical

SAG 4

(1)

SRS2

(13) (15) (28) (61) (64) (65) (68) (82) (89)

MIC1

(2) (17) (68)

MIC3

(14) (18) (68)

MIC4

(78)

MIC10

(23)

Roptrias

ROP2

(17) (18) (19)

Gránulos densos

GRA1

(15) (23)

GRA2

(15) (23) (68)

GRA6

(68)

GRA7

(1) (34) (39) (82)

ractuar con la célula del hospedador y con los componentes del sistema inmunitario, por lo que juegan un papel crítico en la infección (18, 61) y en la invasión celular (29, 88). NcSAG1 y NcSRS2 son dos de las proteínas de superficie localizadas en la membrana del parásito que más se han estudiado hasta el momento (24). NcSRS2 es una proteína de superficie de taquizoítos y bradizoítos también presente en T. gondii (71). Pinitkiatisakul et al. (65) observaron que la proteína NcSRS2 acoplada a una matriz de tipo ISCOM biotinilada indujo una importante respuesta celular que se relacionó con la baja carga parasitaria hallada en el cerebro de los ratones vacunados. Cho et al. (15) evaluaron el grado de protección inducido por la vacunación con diferentes antígenos recombinantes, y hallaron que la combinación de NcSRS2 con NcDG1 (proteína de gránulos densos) tuvo el mayor efecto protector sobre los animales (67,5 % ratones sobrevivieron). Además, la proteína NcSRS2 formulada en adyuvante FIA fue evaluada también en un modelo de transmisión transplacental murino (28). Los resultados evidenciaron que el porcentaje de transmisión congénita fue del 24 % en ratones vacunados, contra un 45 % en los no vacunados. Estos hallazgos se relacionaron con la elevada relación IL-4/IFN-γ, lo que indica una respuesta inmunitaria predominante del tipo Th2. La proteína NcSAG1 solo está presente en la superficie de taquizoítos y es análoga a la proteína TgSAG1, hallada en T. gondii. Esta ha sido utilizada como inmunógeno vacunal en un modelo murino de

infección cerebral y generó protección en el 75 % de los animales vacunados (13). Asimismo, NcSAG4, una proteína solo presente en la superficie de los bradizoítos, también ha sido evaluada recientemente como inmunógeno vacunal en un modelo murino, aunque la protección conferida fue baja (1). Proteínas del complejo apical como inmunógenos Las proteínas de los micronemas han sido consideradas como posibles candidatos vacunales debido a que son secretadas en el momento en que se produce la interacción física entre la superficie del parásito y la célula del hospedador (14). Algunas de las proteínas que han sido identificadas son NcMIC1, NsMIC2, NcMIC3, NcMIC4 y NcMIC10 (2, 14, 21, 71, 78). Cannas et al. (14) evaluaron en un modelo de infección cerebral murino una vacuna formulada con NcMIC3 recombinante, que confirió protección al 75 % de los animales inmunizados. La protección se asoció a una respuesta del tipo Th2 con niveles significativos de IgG1 cuando se inoculó solo NcMIC3 nativa y niveles significativos de IgG 1 e IgG 2a cuando se inoculó una proteína recombinante de NcMIC3 (rNcMIC3). Utilizando la proteína NcMIC4 en forma nativa y recombinante, asociada a la producción de IgG1 y de IgG1-IgG2, respectivamente, se registró un 80 % de protección con ambos antígenos (78). Recientemente, la proteína NcMIC10 fue evaluada en un modelo de transmisión transplacentaria murino (21). Los resultados evidenciaron que además de

Vacunas contra la neosporosis

resultar inmunogénica, la combinación de NcMIC10 con otra proteína recombinante (rNcp24B) produjo protección parcial contra la infección transplacentaria. Las roptrias son organelas secretorias que se liberan en el momento de la invasión al hospedador y su contenido facilita la propulsión del parásito dentro de la célula una vez producido su ingreso. Hasta el momento, solo una proteína de roptria (NcROP2) de N. caninum ha sido investigada como un posible candidato vacunal (17, 18). Debache et al. (17) realizaron un ensayo en ratones utilizando una proteina recombinando NcROP2 (rNcROP2) con adyuvante FIA y saponinas. Los animales vacunados no manifestaron signos clínicos luego del desafío y desarrollaron anticuerpos contra rNcROP2. La presencia de parásitos en el cerebro de los animales vacunados, evaluada mediante PCR, se redujo en un 93 % cuando se usaron saponinas, con predominio de IgG1, y un 75 % cuando se usó como adyuvante FIA, con predominio de IgG 2. En otro trabajo en ratones se evaluó la proteína rNcROP2, sola o en combinación con rNcMIC1 y rNcMIC3, con saponina como adyuvante. No se hallaron parásitos viables en el cerebro de los animales vacunados con rNcROP2/NcMIC3 y se observó un 100 % de transmisión vertical en todos los grupos vacunados, con bajo porcentaje de crías muertas al nacer (6 %) en el grupo inmunizado con rNcROP2/NcMIC1/ NcMIC3. La mortalidad neonatal fue de 50 % en animales vacunados con rNcROP2 y de 35 % en los grupos inmunizados con rNcROP2/NcMIC1/NcMIC3 (18). Recientemente, Debache et al. (19) utilizaron rNcROP2 como inmunógeno aplicándolo vía intraperitoneal e intranasal en ratones, y obtuvieron 70 % y 60 % de protección posdesafío, respectivamente. Los gránulos densos están unidos a la membrana del parásito y son también organelas secretorias de tamaño variable, con un importante papel en la formación y mantenimiento de la vacuola parasitófora. Algunas de las proteínas de los gránulos densos evaluadas hasta el momento son la NcDG1, la NcDG2, la NcNTPasa, la NcGRA2 y la recientemente identificada NcGRA7 (3, 37, 71). Cuando las proteínas NcDG1 y NcDG2 fueron utilizadas en su forma nativa como inmunógenos en un modelo de infección cerebral en meriones, el nivel de protección desarrollado fue bajo (15). En dos trabajos en los que se inocularon ratones con la proteína NcGRA7, se registraron similares parámetros de inmunidad (IgG1/IgG2a y producción de IFN-γ), pero los niveles

225

de protección fueron contradictorios (1, 62). Dicha diferencia podría deberse a la utilización de diferentes formulaciones y adyuvantes. Aguado Martínez et al. (1) describieron un porcentaje de sobrevida menor del 8 %; en tanto que Nishikawa et al. (62) obtuvieron un porcentaje de sobrevida de crías de 68,6 % cuando se usaron liposomas recubiertos con manotriosa (trímero de la manosa). Esto podría deberse a que, si bien la respuesta Th1 con producción de IFN-γ asociada a una baja relación IgG1/IgG2a es deseable para limitar las infecciones por N. caninum en ratones o en bovinos, otras variables de la respuesta inmunitaria tales como la producción de IL-4, IL-10, IL-12, FNT (sistémicas o placentarias) tendrían diferente significado en estas especies (5, 22, 33, 71). Vacunas de ADN Las vacunas de ADN constituyen una promisoria herramienta en inmunógenos contra N. caninum, basada en la inmunización con un plásmido que contiene la información genética de uno o varios genes que codifican proteínas inmunogénicas del parásito. Cannas et al. (13) inmunizaron ratones con un plásmido que expresaba NcSRS2 y NcSAG1, y posteriormente realizaron un booster en el que solo incluyeron los antígenos recombinantes correspondientes. Los resultados demostraron que la vacuna protegió durante el desafío experimental. La inmunogenicidad de una vacuna de ADN que expresaba la proteína NcSRS2 en ratones BALB/c fue evaluada luego de ser aplicada en 2 dosis con adyuvante FCA. Esta indujo inmunidad celular con incremento significativo de las concentraciones de óxido nítrico, expresión de IL-2 e IFN-γ y proliferación de linfocitos. Por otro lado, se comparó el efecto de una vacuna de ADN que codificaba la proteína NcSRS2. Los resultados evidenciaron que la vacuna de ADN no indujo activación de células T ni producción de IFN-γ (9). Lidell et al. (39) vacunaron ratones antes de la preñez con un plásmido que codificaba la proteína NcGRA7 (pCMVi-NcGRA7) o la NcsHSP33 (pCMViNcsHSP33). Posteriormente, desafiaron los animales y observaron que el 54 % de las crías de los animales inmunizados con pCMVi-NcGRA7 y el 47 % de los vacunados con pCMVi-NcsHSP33 fueron negativos a PCR, por lo tanto, se concluyó que esta vacuna confirió protección parcial contra la neosporosis congénita. Jenkins et al. (34) hallaron que una vacuna basada en un plásmido de ADN que codificaba NcGRA7, con

226

CpG (ImmunoEasy®, Quiagen, Tokio, Japón) como adyuvante (pNcGRA7+CpG), incrementó al doble el nivel de protección de la transmisión congénita en relación con una vacuna formulada solo con pNcGRA7. Sin embargo, Srinivasan et al. (78) informaron que después de la inmunización de ratones con un plásmido que codificaba la proteína recombinante NcMIC3 (pcDNA-MIC3), los animales no desarrollaron respuesta humoral anti-MIC3, y el 60 % de ellos murieron tres semanas después del desafío. Vacunas en vectores Los vectores biológicos recombinantes representan también una opción interesante para el transpor te de antígenos de N. caninum al sistema inmunitario del hospedador susceptible. Entre los virus que actúan como vectores de expresión, el Herpevirus recombinante y el virus vaccinia han demostrado ser eficientes para infecciones parasitarias por protozoos (61, 72). Se realizó un trabajo inmunizando caninos vía nasal con Herpesvirus canino recombinante que expresaba la proteína de superficie NcSRS2 y se logró la producción de anticuerpos IgG contra N. caninum. (71). Otro virus que se ha utilizado como vector es el de vaccinia. En un trabajo se realizó la vacunación con virus vaccinia recombinante que expresaba NcSAG1 o NcSRS2. Los resultados evidenciaron que la inmunización con este recombinante pudo proteger a los ratones ante el desafío con N. caninum (61). Más tarde, en otro ensayo en ratones, la vacunación de las madres con vaccinia recombinante que expresaba NcSRS2 confirió protección efectiva contra la transmisión vertical a las crías de ratones BALB/c “y” no se detectó ADN de parásitos en el cerebro de los animales analizados (61). También se han utilizado vectores bacterianos para la expresión de antígenos recombinantes. En varios estudios se usó la cepa de Brucella abortus RB51 como vector para diferentes antígenos de N. caninum, como NcMIC1, NcMIC3, NcGRA2, NcGRA6 y NcSRS2 (67, 68, 82). En ratones C57BL vacunados con la cepa RB51 recombinante que expresa NcMIC1 o NcGRA6, se logró protección completa de la infección cerebral contra el desafío (68). En otro trabajo en el que se emplearon ratones BALB/c con una cepa RB51 recombinante que expresa NcSRS2 o NcGRA7, se concluyó que los ratones vacunados con RB51-NcSRS2 mostraron resistencia a la infección cerebral luego del desafío con taquizoítos de N. caninum (71). También

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Ramamoorthy et al. (68) usaron una cepa de B. abortus RB51 que expresaba diversas proteínas recombinantes, solas o en conjunto, en un modelo de transmisión vertical en ratones C57BL/6. Este trabajo evidenció que la transmisión vertical varió desde un 94 % al vacunar con RB51-NcSRS2, hasta un 62 % cuando se empleó RB51-NcMIC3, y que fue del 78 % para la cepa RB51 que expresaba todas las proteínas recombinantes evaluadas en este estudio. Los animales que recibieron RB51-NcSRS2 desarrollaron una respuesta mixta de IgG1 e IgG2a asociada a una mortalidad incluso superior a la de los controles. La relación IgG1 / IgG2a inducida por ciertos antígenos favorecería (RB51-NcMIC3) o no (RB51-NcSRS2) la protección o eficacia del inmunógeno. Sin embargo, desde el punto de vista veterinario es necesario considerar las implicancias del uso de B. abortus RB-51 como vector en bovinos, teniendo en cuenta que si bien presenta baja virulencia en el hombre, esta cepa es zoonótica. Por otra parte, debería considerarse también que la cepa RB-51 es resistente a la rifampicina, que es el antibiótico usado en la terapéutica de la enfermedad. Como contraparte, N. caninum también ha sido usado como vector de antígenos de T. gondii. Zhang et al. (88) informan que la inmunización con una cepa de N. caninum que expresa la proteína de superficie TgSAG1 protegió a los ratones cuando estos fueron desafiados letalmente con T. gondii. Ensayos de inmunógenos en el país El primer trabajo fue publicado por Moore et al. en 2005 (54). En este estudio se vacunaron vaquillonas con lisado de taquizoítos en un adyuvante oleoso (13 % Arlacel, 85 % Marcol 52 y 2 % Tween 80) durante el segundo trimestre de gestación y se comparó la respuesta inmunitaria a N. caninum con vaquillonas naturalmente infectadas sin vacunar que no abortaron. Los títulos de IgG 1 e IgG2 fueron semejantes en animales inmunizados, pero difirieron cuando se los comparó con aquellos de los animales naturalmente infectados. Los niveles de IFN-γ fueron semejantes en ambos grupos; sin embargo, no se observó respuesta celular en el grupo vacunado. Recientemente Moore et al. (57) utilizaron una formulación experimental que contenía antígenos de N. caninum formulados con ISCOM en terneros, y compararon la respuesta inmunitaria obtenida con aquella observada en animales que habían sido inoculados con taquizoítos vivos. En la segunda semana posinoculación, se observó que los animales

Vacunas contra la neosporosis

inoculados con el inmunógeno desarrollaron anticuerpos específicos contra N.caninum en niveles similares a aquellos del grupo inoculado con taquizoítos vivos. Sin embargo, al utilizar la vacuna experimental hubo una respuesta de anticuerpos predominante del subisotipo IgG1, mientras que los que recibieron parásitos vivos desarrollaron niveles superiores de IgG2. Por otro lado, los niveles de IFN-γ fueron semejantes en ambos grupos de animales.

PERSPECTIVAS Y CONCLUSIONES Si bien en la actualidad no hay disponible en el mercado una vacuna eficaz contra la neosporosis bovina, en los últimos 5 años se han producido avances notables en busca de un inmunógeno experimental contra la enfermedad. Hasta el momento se conoce que la inoculación pre-servicio con taquizoítos vivos protege contra la infección y el aborto. Teniendo en cuenta los antecedentes en el desarrollo de vacunas vivas contra otros protozoos, sería factible pensar en una vacuna de este tipo contra N. caninum. Por otra parte, se ha avanzado en el estudio de vacunas inactivadas y recombinantes en modelos murinos; sin embargo, se necesitan más trabajos experimentales en bovinos. Considerando las ventajas de las vacunas inactivadas, se requieren futuras investigaciones para tratar de mejorar su eficacia. Por último, se debe tener en cuenta que la vacunación no es la única forma de lucha contra la enfermedad, y que resulta necesario implementar medidas integrales de control y manejo. Agradecimientos: al Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas de la República Argentina por el financiamiento otorgado a YP Hecker durante su formación de posgrado. La presente revisión bibliográfica se enmarca en los proyectos PICT 2008-1880 (otorgado a DP Moore) e INTA AESA 3597 (otorgado a CM Campero).

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Recibido: 8/11/2011 – Aceptado: 19/6/2012