CÁTEDRA DE QUÍMICA ORGÁNICA- 2012 Trabajo Práctico N° 5: Aminoácidos y Proteínas Carrera: Agronomía Objetivo del Trabajo Práctico: I) Realizar reacciones de caracterización de proteínas: coagulación y precipitación II) Evaluar el comportamiento de proteínas y aminoácidos mediante reacciones de coloración. III) Extraer y reconocer proteínas de origen vegetal. IV) Realizar determinaciones cuantitativas de proteínas utilizando el método colorimétrico de Biuret Fuente de aminoácidos: Se trabajará con soluciones patrón de leucina, triptófano y alanina. Fuente de Proteínas de Origen Vegetal: Se trabajará con proteínas extraídas de harina de trigo, harina de arveja y harina de gluten. I. Ensayos de coagulación y reacciones de precipitación Fundamento: Las proteínas debido al gran tamaño de sus moléculas forman con el agua soluciones coloidales que pueden precipitar formándose coágulos al ser calentadas a temperaturas superiores a 70ºC o al ser tratadas con soluciones salinas, ácidos, alcohol, etc. La coagulación de las proteínas es un proceso irreversible y se debe a su desnaturalización por los agentes indicados que al actuar sobre la proteína la desordenan por destrucción de sus estructuras secundaria y terciaria. Técnica: Tomar una serie de cinco tubos de ensayo y colocar en cada un volumen determinado de solución de albúmina extraída de harina de trigo y observar. a) 3 mL Albúmina Vegetal

+

calor --------------------------> Observar

b) 3 mL Albúmina Vegetal

+

4 mL CH3 – CH2 OH -------->

c) 3 mL Albúmina Vegetal

+

2 mL HCl 10% --------------->

d) 3 mL Albúmina Vegetal

+

2 mL HNO3 20% ------------>

e) 3 mL Albúmina Vegetal

+

2 mL NaOH conc.----------->

1

II. Reacciones de coloración: A - Reacción de Biuret: El reactivo de Biuret está formado por CuSO4 y NaOH. Fundamento: El reactivo de Biuret pone de manifiesto la presencia de enlaces peptídicos (aunque no es específica) por lo tanto la reacción es positiva para las proteínas y sus productos de hidrólisis parcial y negativa para los aminoácidos. El nombre de la reacción proviene del hecho que un compuesto simple llamado Biuret (se obtiene por calentamiento de urea) da también esta reacción, ello se debe a que tiene un enlace parecido al peptídico. Es probable que la coloración se deba a la formación de complejos de coordinación de Cu como:

2-

HOH -

OC NH NH

O

HN C Cu

NH

C NH

HN C

O-

O-

2 Na+

HOH

Técnica: Colocar en tubo de ensayo 3 mL de solución de albúmina vegetal y agregar igual volumen de NaOH 10% Luego se añade 1 mL de CuSO4 aI 1%. Observar el color. Repetir el ensayo con solución de un aminoácido. Esta reacción es útil para determinar el grado de hidrólisis de una proteína según la coloración observada. Proteínas

+

Reactivo de Biuret ---------------------> Azul Violeta

Proteosas

+ Reactivo Biuret ----------------------------> Rosa

Peptonas

+ Reactivo de Biuret ------------------------> Rosa

Péptidos

+ Reactivo de Biuret ------------------------> Rosa

Aminoácidos + Reactivo de Biuret ----------------------> Color propio de los reactivos

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B- Reacción xantoproteica: Fundamento: La reacción es dada por los aminoácidos que contienen el radical fenilo y también darán reacción positiva las proteínas que posean dichos aminoácidos. La causa del color es la nitración del núcleo bencénico. Técnica: Colocar en un tubo de ensayo 3 mL de solución de albúmina vegetal, agregar gotas de HNO3 conc y calentar. La reacción es positiva cuando aparece un precipitado blanco que por acción del calor pasa a amarillo. Realizar la misma reacción con aminoácidos aromáticos y alifáticos. Aminoácidos Aromáticos OH

NH

CH2 HO

C

CH

CH2

CH2 NH2

O

HO

C

CH

NH2

HO

C

NH2

O

O

Tirosina

CH

Triptofano

Fenilalanina

OH

OH

I

I

I

I

O

I

I CH2 HO

C

CH

NH2 CH2

O

3,5-diyodotirosina

HO

C O

CH

NH2

Tiroxina

C- Reacción de la ninhidrina

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Fundamento: La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) es un reactivo muy sensible y específico de los α aminoácidos. Las proteínas y los α aminoácidos dan positiva esta reacción. Técnica: Colocar en un tubo de ensayo 3 mL de solución de ovoalbúmina vegetal y 0.5 mL de ninhidrina 0.1%. La mezcla se calienta a ebullición durante 1 o 2 minutos. Dejar enfriar. Se origina una intensa coloración azul-violeta. III. Extracción de Proteínas Vegetales. - Albúminas: Proteínas simples y globulares. Son solubles en agua y en soluciones acuosas salinas. Técnica de Extracción: Colocar 10 g de Harina de Trigo en un vaso de precipitación y añadir 40 mL de H2O destilada. Dejar decantar durante 1 hora. Técnica de Reconocimiento: Recuperar el sobrenadante y colocar 2 mL en dos tubos de ensayo. Al primer tubo de ensayo se le debe agregar 2 mL de NaOH y 1 mL de CuSO4 (Biuret). Al segundo tubo de ensayo calentar a la llama con cuidado, enfriar y filtrar mediante papel de filtro, al filtrado recuperado realizar la reacción de Biuret y observar - Globulinas: Proteínas simples y globulares. Son insolubles o escasamente solubles en agua; solubles en soluciones acuosas salinas diluidas. Técnica de Extracción: Colocar 10 g de Harina de Arveja en un vaso de precipitación y añadir 20 mL de NaCl 10%. Dejar decantar durante 1 hora. Técnica de Reconocimiento: Recuperar el sobrenadante y colocar 2 mL en un tubo de ensayo. Al tubo de ensayo se le debe agregar 2 mL de NaOH y 1 mL de CuSO4 (Biuret) y observar. - Prolaminas: Proteínas simples insolubles en agua; solubles en soluciones acuosas de alcoholes de bajo peso molecular. Técnica de Extracción: Colocar 10 g de Harina de Trigo en un vaso de precipitación y añadir 50 mL de etanol 70% Dejar decantar 1 hora. Técnica de Reconocimiento: Tomar 8 mL del sobrenadante y colocar en 4 tubos de ensayo, alícuotas de 2mL. Tubo N° 1: Agregar 2 mL de NaOH y 1 mL de CuSO4 (Biuret). Observar Tubo N° 2: Calentar a llama directa. Obsevar

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Tubo N° 3: Agregar 2 mL de Etanol al 100%. Observar Tubo N° 4: Agregar 2 mL de agua destilada. Observar - Glutelinas: Proteínas simples insolubles en agua, soluciones salinas o alcoholes. Son solubles en soluciones diluidas de ácidos y bases. Técnica de Extracción: Colocar 10 g de Gluten en un vaso de precipitación y añadir 50 mL de NaOH 10%. Dejar decantar durante 1 hora. Técnica de Reconocimiento: Recuperar 4 mL del sobrenadante y colocar 2 mL en dos tubos de ensayo. Al primer tubo de ensayo se le debe agregar 2 mL de NaOH y 1 mL de CuSO4 (Biuret) y observar; mientras que al segundo tubo se debe neutralizar con el agregado de HCl y obsevar.

IV. Determinación cuantitativa de proteínas por método fotocolorimétrico Fundamento: Consiste en determinar la concentración de proteínas de una muestra problema empleando el reactivo de Biuret. Como dicho reactivo pone en manifiesto los enlaces peptídicos, podemos decir que la intensidad de color obtenida será directamente proporcional a la concentración de proteínas. Técnica: Preparar 3 tubos de ensayos de la siguiente manera Tubo Blanco (B): 0,1 mL de H2O destilada + 5 mL NaOH 10% + 0,5 mL CuSO4 1% Tubo Problema (P): 0,1 mL solución de albúmina vegetal (dilución 1/20) + 5 mL NaOH 10% + 0, 5 mL CuSO4 1% Tubo Testigo (T): 0,1 ml solución de proteínas de concentración conocida + 5 mL NaOH 10% + 0,5 mL CuSO4 1%. Resultados: Se determinará la Absorbancia de los tubos de ensayo usando un espectrofotómetro. -

Con el Tubo Blanco, calibrar a cero de absorbancia el aparato. Determinar la Absorbancia del Tubo Problema. Determinar Absorbancia del Tubo Testigo.

Cálculos: Realizar los siguientes cálculos: Absorbancia del Tubo Testigo

Concentración de Proteínas (g%)

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X

Absorbancia del Tubo Problema

X (g%) = Absorb Tubo Problema x Concentración de Proteínas (g%) / Absorb Tubo Testigo Factor (F)

X (g%) = Absorb Tubo Problema x Factor

X (g%) = Absorb Tubo Problema x Factor x inversa Dilución Es decir para nuevos dosajes bastará determinar Absorbancia de la muestra Problema y multiplicar por el factor y la dilución correspondiente de la muestra en caso que se hiciere.

CUESTIONARIO 1- Mencione el reactivo que permite reconocer el grado de hidrólisis de una proteína. Como está formado dicho reactivo? 2- Fundamento de la reacción Xantoproteica. Que aminoácidos dan positiva dicha reacción? 3- Explique el fundamento de la determinación cuantitativa de proteínas. 4- Calcule la concentración proteica de la muestra problema; conociendo que la solución testigo tiene una concentración de 20 g/L de proteínas y una Absorbancia de 0,50 mientras que la muestra problema tiene una Absorbancia de 0,25. 6-Aminoácidos esenciales I) Definición. Ejemplos 7- Punto isoeléctrico. I) Definición II) El punto isoeléctrico del aminoácido Treonina es 6,16. Si en el laboratorio se prepara una solución del mismo y el pH de dicha solución es 5,45. ¿Qué carga neta presentaría dicho aminoácido y hacia que polo migraría en un campo eléctrico?

6

8-Aminoácido Leucina. I) Escribir fórmula como ión dipolar. II) Conociendo que el pI de dicho aminoácido es 5,98. ¿Con qué valores de pH se debería trabajar en el laboratorio para asegurar que dicho aminoácido en un campo eléctrico migre hacia el ánodo? 9- Carácter anfótero del aminoácido Alanina. Ecuaciones. 10- Comportamiento en medio ácido y en medio alcalino del aminoácido glutamato. Fórmulas 11- I) a) Nombre del siguiente α aminoácido. b) Qué características presenta? II) a) A qué polo migraría en un campo eléctrico. Justifique. b) En que medio debería encontrarse dicho aminoácido para migrar hacia el polo negativo.

12- I) Escriba el siguiente tripéptido: Leucilalanilglicina. II) a) Marque el residuo amino terminal. b) Marque los enlaces peptídicos que lo estabilizan. 13-I) Escriba el siguiente tripéptido: Leucilfenilalanilisoleucina. II) a) Marque el residuo carboxilo terminal. b) Marque las cadenas laterales. 14- Mencione cuatro funciones de las proteínas. Ejemplos. 15- Describa la estructura primaria de las proteínas. Tipo de enlace que la estabiliza 16- Explique la estructura secundaria de una proteína. Mencione los tipos de enlaces que la estabilizan. 17- Explique la conformación β de una proteína. Tipos de enlaces que la estabilizan.

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18- Proteínas I) Definición II) Complete la siguiente tabla Proteína

Según su forma

Según su estructura química

Según su función

Ovoalbúmina Queratina

19Desnaturalización de proteínas. I) Definición II) Mencione dos agentes químicos y explique el mecanismo de acción de los mismos. 20- Desnaturalización de proteínas: I) Definición. II) a) Estructuras que se ven afectadas durante la desnaturalización proteica b) Mencione dos ejemplos de agentes desnaturalizantes. 21- Clasifique las proteínas según su forma. Explique. Ejemplos 22- Clasifique las proteínas según su estructura química. Explique. Ejemplos. 23- Complete el siguiente cuadro: Proteína Miosina Inmunoglobulinas Hemoglobina Enzimas Ovoalbúmina

Función general

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