“Aaislamiento

y caracterización de Escherichia coli diarreigénico a partir de muestras clínicas”




ETEC – E. coli enterotoxigénico




EPEC – E. coli enteropatogénico




EAEC – E. coli enteroagregativo




EIEC – E. coli enteroinvasivo




EHEC – E. coli enterohemorrágico




DAEC – E. coli de adherencia difusa

Microorganismo Escherichia coli

Flora normal

Categorías de E. coli diarreigénico

Factores de virulencia específicos

Detección de Categorías de DEC •Serotipificación •Ensayos con animales -Asa ligada de conejo (ETEC) -Sereney (EIEC) •Ensayos fenotípicos que correlacionan con factores de virulencia -Adherencia cultivo celular (EPEC, EAEC, DAEC) -ELISA (EIEC, ETEC, STEC) •Detección molecular -Hibridación sondas genéticas (EPEC, EAEC, STEC y DAEC)

EPEC Adherencia localizada

Adherencia de EAggEC

Adherencia difusa

Toma de muestra para el diagnóstico de la infección por DEC Muestra para realizar coprocultivo Evacuación espontanea •Recolectar 2 g de materia fecal con una espátula y colocarla en un recipiente estéril. Conservar refrigerada a 4ºC hasta su procesamiento. •Si la muestra no es procesada dentro de las 2 horas de recolectada, utilizar medio de transporte (Cary-Blair, Stuart,) conservar a 4ºC. Hisopado rectal • Tomar la muestra con hisopo, conservarlo en un medio de transporte y mantenerlo a 4°C hasta su procesamiento. •Si el niño usa pañal, tomar la muestra que queda en el mismo con hisopo o con espátula. Recomendaciones a)Recolectar la materia fecal lo antes posible después del establecimiento de la diarrea. b)El paciente no debe estar con tratamiento antibiótico. Recolectar la muestra después de suspender la antibioticoterapia por no menos de 48 horas.

Sistema de triple envase para el envío de material infeccioso

Las muestras deben ser enviadas según las Normas de Bioseguridad que corresponden al transporte de muestras clínicas.

Algoritmo para el diagnóstico y caracterización de STEC, EPEC, ETEC, EIEC y EAEC Materia fecal (suspensión) Agar MacConkey (MAC)

Agar MacConkey Sorbitol (SMAC)

37ºC x 18 h

eae (+) Aislamiento EPEC

lt / sth / stp (+) Aislamiento ETEC

•PCR Confirmación •Identificación Bioquímica •Serotipificación

aggR (+) Aislamiento EAEC

37ºC x 6 h

SMAC

SMAC

+

•PCR Confirmación

PCR Nº2 Positiva IpaH (+) Aislamiento EIEC

37ºC x 6 h

Tamizaje PCR múltiple stx1 / stx2 / rfbO157

Tamizaje PCR múltiple Nº2 IpaH / aggR / stx1 / stx2 zona de confluencia Poolles colonias

PCR Nº1 Positiva

CT-CTS

37ºC x 18 h

-

Tamizaje PCR múltiple Nº1 eae / lt / sth / stp zona de confluencia Pooles de colonias

CTS

•Identificación Bioquímica

stx1 / stx2 (+) Aislamiento STEC

•Serotipificación

Notificar al SIVILA Derivar aislamiento al LNR

Estrategia de detección Cultivo y PCR múltiple

Hisopado rectal Siembra directa ..... .... Agar MAC Incubación a 37º por 18 hs

PCR

Toma de muestra para realizar PCR múltiple Nº1 (eae / lt / stp/ sth) y Nº2 (aggR / IpaH / stx1 / stx2)

Placa de MAC

.. ... ....

•Muestra de zona de cultivo confluente

•Pool de colonias no fermentadoras de lactosa

•Pool de colonias fermentadoras de lactosa PCR Tamizaje

MAC Grillado

EPEC / ETEC

stp lt

Primers Sk1 / Sk2 LT-L / LT-R

eae sth

Tamaño del Fragmento (pb) 864

STh-f / STh-r

322 120

STp-f / STp-r

166

Referencias •Karch H,. J Clin. Microbiol. 1993; 31: 1200-5. •Tamanai-Shacoori Z, J. Microbiol. 1994; 40: 243-9. •Rodas CJ Clin. Microbiol. 2009; 47: 1218-20. •Woodward MJ, Vet. Microbiol. 31: 251-61.

STEC / EIEC / EAEC PCR múltiple aggR / ipaH / stx1 / stx2 stx1

stx2

ipaH aggR

Primers

Tamaño del Fragmento (pb)

IpaH8B / IpaH15B

619

aggRks1 / aggRkas2

254

stx1a / stx1b

130

stx2a / stx2b

346

Referencias •Scethabutr O, l Dis. Res. 994; 12: 265-9. •Ratchtrachenchai OA,. Dep. Med. Sci. 1997.39: 211-20. •Pollard DR,. J. Clin. Microbiol. 1990; 28:540-5

Resultados posibles de la PCR múltiple Nº1 (eae / lt / st) y Nº2 (aggR / IpaH / stx1 / stx2) 1º grilla Confluencia y pool de colonias positivas

PCR de colonias individuales

Confluencia positiva y pool de colonias negativas

PCR seleccionando nuevas colonias 2º grilla

Confluencia y pool de colonias negativas

Muestra negativa

Algoritmo para el diagnóstico y caracterización de ETEC, EPEC, EAEC, EIEC, y STEC Materia fecal (suspensión) Agar MacConkey (MAC) 37ºC x 18 h Tamizaje PCR múltiple Nº1 eae / lt / st p / sth zona de confluencia colonias lactosa (-) y lactosa (+)

Tamizaje PCR múltiple Nº2 aggR / IpaH / stx1 / stx2 zona de confluencia colonias lactosa (-) y lactosa (+)

PCR Nº2 Positiva

PCR Nº1 Positiva eae (+) Aislamiento EPEC

lt / st (+) Aislamiento ETEC

aggR (+) Aislamiento EAEC

•PCR Confirmación •Identificación Bioquímica •Seroagrupamiento

IpaH (+) Aislamiento EIEC

stx1 / stx2 (+) Aislamiento STEC

Identificación bioquímica Pruebas Bioquímicas

Categoría

Medio de cultivo

EPEC /ETEC/ EAEC

Fermentación de

+

(TSI)

glucosa Fermentación de

Agar triple azúcar y hierro

+

TSI

+

TSI

-

TSI

lactosa Fermentación de sacarosa Formación de H2S Producción de gas

+

TSI

Utilización del citrato

-

Citrato de Simmons

Producción de indol

+

Sulfuro, indol, movilidad (SIM)

Movilidad Actividad

Móvil / no móvil

SIM

+

Disco con glucurónido

+ (90) *

Lisina Hierro Agar (LIA)

+ (95)

Movilidad, indol, ornitina.

β-glucuronidasa Actividad lisina decarboxilasa Actividad ornitina decarboxilasa

(MIO)

Según Manual of Clinical Microbiology (7°ed). 1999

Porcentaje de positividad (%) PRUEBA BIOQUIMICA Triptofano SH2 (SIM)

EIEC

E. coli *

Shigella spp.*

100

98,0

50,0

0

0

0

Producción de indol

80,0

98,0

50,0

ONPG

100

95,0

2,0

0

95,0

0

Movilidad Rojo de Metilo

100

100

100

Voges-Proskauer

0

0

0

Citrato de Simmons

0

0

0

Citrato de Christensen

26,4

76,4

2,0

Acetato (utilización)

68,6

90,0

2,0

Mucato (fermentación)

10,8

10,8

0

Esculina (hidrólisis)

5,9

35,0

0

Arginina dihidrolasa

33,3

17,0

5,0

Lisina descarboxilasa

39,2

90,0

0

Ornitina descarboxilasa

59,8

65,0

1,0

Arabinosa (fermentación)

96,1

99,0

60,0

Dulcita (fermentación)

14,7

60,0

2,0

Glucosa (ácido)

100

100

100

Glucosa (gas)

100

95,0

2,0

Lactosa (fermentación)

78,4

95,0

30,0

Maltosa (fermentación)

97,0

95,0

50,0

Rafinosa (fermentación)

29,4

50,0

50,0

Ramnosa (fermentación)

72,5

80,0

5,0

Sacarosa (fermentación)

16,7

50,0

0

Salicina (fermentación)

15,7

40,0

0

* Datos obtenidos de Manual of Clinical Microbiology. Murray et al. 2003

PRUEBA S RECOMENDADAS Morfología MAC SMAC Bioquímica TSI SIM Citrato de Simmons ß-glucuronidasa Sorbitol LIA MIO Lactosa ONPG Citrato de Christensen Mucato Acetato

Seroagrupamiento Incubar colonias caracterizadas en un medio de cultivo como agar TSA.

Realizar suspensión bacteriana con SF y hervir 1 hora.

Realizar seroagrupamiento con antisueros polivalentes y monovalentes según disponibilidad y categoría.

Fundamento: los anticuerpos del antisuero aglutinan con el antígeno flagelar. Procedimiento:
Estimulación de la movilidad por 7 días en el medio de movilidad de Craigie.
Siembra de agar tripticasa de soja a partir del medio de movilidad Craigie.
Aglutinación en placa o en tubo.

Siembra del 1º pasaje

Siembra del segundo pasaje

Cepa Móvil

Cepa no Móvil

Detección de DEC por PCRm1 y PCRm2 a partir de cultivo de materia fecal. nº=299

Identificación Sin por PCR identificación

PCR + con aislamiento PCR + sin aislamiento

22%

78%

52%

48%

Diarreas, Identificación de DEC. Argentina, 2014 100% 90% 80%

49,2

45,5

Total de casos: 299

% de casos

70% 60% 50%

0

1,2

23,5

25,7

20%

14,4

10,2

10%

5,3 7,6

10,2

Diarrea

Diarrea sanguinolenta

40% 30%

0%

7,2

Tipo de diarrea

Sin detección ETEC STEC EIEC EAEC EPEC

Total diarreas: 132

Total diarreas sanguinolentas: 167

Escherichia coli productor de toxina Shiga