PCO case scores (Gower General Similarity Coefficient) 008A 027A1 122N 053R 021A2 017A 126(2)N200V

220C

0.43 020A 282(1)C

085M 054R

172Ta

120P

043D

0.35

030D2

089M1 022A 021A1 073SE 168Ta2 024A1 037D 052R 076M 202V174SJ

030D1

023A2 143N 210C 029D 005A

212C 077M 0.26 039D 016A 079M2 006A

082M 097M 0.17 096M2

028D 078M 032D 090M 034D1 027A2 019A 018A1 098P

038D 034D2

010 A2 014A 137N 102P 117P 012018A2 A2 012 A1 010 A1 185SJ 219C 112P 144N154Ta 107P025A 209V 094M 134N 004A 081M2 088M 026A 023A1 042D 0.09 105P 146T1 128N 101P 161Ta 158Ta 011A 033D 050D1 031D 048D 109P 041D 150T153T118P 100P 069SE 115P 226(2)C 111P 169Ta 280C 155Ta152T1 015A 238T 195V 092M 079M1 268(2)SE 096M1 099P 024A2 282(2)C 103P 146T2 135N 035D 106P 123N 147T 089M2 156Ta 189V 104(2)P 235T -0.35 -0.26 -0.17 -0.09 0.09 0.17157Ta 0.26 0.35 084M 236T 036D 246(1)T 183SJ 159Ta 196V 206V 160Ta 257(2)V 275SE 268(3)SE 261SE 136N 141N 047D 149T 201(1)V 121P 056R 124N 083M 239T 181SJ -0.09 226(3)C 148T 049D 116P168Ta1 046D 081M1 093M 060R 050D2 247SJ 197V 129(1)N 152T2 151T 044D 087M 003SJ 062R2 108P 125N 051D 110(2)P 065R 198V 067R1-0.17 246(2)T 268(1)SE 002SJ 187(2)SJ 269(2)SE 045D175SJ 067R2 127N 163Ta 129(2)N 176SJ 113(2)P 131N 70SE 061R 245T 177SJ 071SE -0.26 188V 064R 222C 132N 252V 237T 250SJ 062R1 066R 182(2)SJ 130N 179SJ 207V 243T 240T 180SJ -0.35 182(1)SJ

Axis 2

086M1 214C 171Ta 217C 170Ta 126(1)N 257(1)V 191V 213C 086M2 273SE 72SE 068SE 186SJ 269(1)SE 251V 253V 203V 276SE

-0.43

187(1)SJ 1SJ 201(2)V 184SJ

0.43

104(1)P -0.43

Axis 1

Figura 13. Representación gráfica del análisis de coordenadas principales (primeras dos dimensiones) para variables morfológicas de 236 cepas de M. roreri. 5.5. Análisis isoenzimático.

5.5.1. Condiciones para la evaluación de la actividad enzimática Las condiciones establecidas para la producción de micelio fueron óptimas y permitieron obtener suficiente masa miceliar (2.5 gr/cepa en promedio) para el desarrollo de todos los ensayos. En la fase de extracción proteica, la consistencia del micelio favoreció la manipulación de las muestras durante la maceración lográndose soluciones homogéneas.

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Se observo diferencias en el tiempo de detección de la actividad de las enzimas durante el proceso de revelado. En la enzima Malato deshidrogenasa se detectó actividad a los 30 minutos, en tanto que para las peptidasas el tiempo de revelado fue de 3 a 5 horas. 5.5.2. Sistemas enzimáticos y buffers de corrida. Las 30 enzimas presentaron actividad en varios de los buffers evaluados, sobresaliendo el buffer Tris-Citrato pH 7 el cual permitió detectar la actividad en 15 enzimas del total evaluadas (Tabla 20). Tabla 20. Enzimas que presentaron actividad enzimática en los nueve buffers empleados.

BUFFERS

ACTIVIDAD ENZIMATICA

Tris Citrato pH 7.0

15

Tris Citrato pH 8.0

7

Tris-Malato-EDTA

6

Borato (discontinuo)

7

Chipp

5

Litio-Borato/Tris Citrato

11

fosfato-Citrato Continuo

7

PGI fosfato

6

Poulik

4

Tris-Citrato-EDTA

5

ABREVIATURA ACOH, AK, Est (a-NA), FDH, GPI, GTDH, G-3-PDH, IDDH, LDH, MDH, ODH, PEP-A, PEP-B, PGM, SOD. AK, Est (a-NA), FDH, GPI, MDH, PEP-A, PGM. Est (a-NA), FBA, GCDH, MDH, LDH, ODH. AK, Est (a-NA), GPI, MDH, ODH, PEP-A, PGM. Est (a-NA), GCDH, GTDH, MDH, PEP-A. CK, Est (a-NA), GCDH, GTDH, IDDH, LDH, MDH, ODH, PEP-A, PEP-B, SOD. AAT, Est (a-NA), LDH, MDH, PEP-B, PGDH, SOD. Est (a-NA), LDH, MDH, GCDH, FBA, SOD. Est (a-NA), MDH, PEP-B, SOD. Ak, Est (a-NA), MDH, GPI, Est (a-NA), PGM.

Las pruebas preliminares demostraron que la edad del micelio no influya de forma significativa en la actividad de las enzimas evaluadas, los resultados mostraron que

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el patrón electroforético de las mismas, no sufr sufrió cambios significativos a medida que el hongo envejeció.. Por esta razón se llevaron a cabo todos las l extracciones a partir de micelio de 15 días de edad, con el propósito de obtener mayor cantidad de éste y de obtener suficiente filtrado para el desarrollo de los procesos (Figura 14).

Figura 14. Efecto fecto de la edad del micelio (10, 15 y 20 días) de M. roreri sobre los patrones electroforéticos de la enzima MDH en el buffer Tris Tris-Citrato Citrato pH 7.5, para una cepa de San Jerónimo (003SJ) y dos de Dabeiba (039D y 047D). Las enzimas ADH, DDH, FBP, GTDHP, IDH, LGL, ME, PNP y XDH no presentaron ninguna actividad en M. roreri, luego de ser evaluadas bajo los sistemas de buffer Litio-Borato/Tris Borato/Tris Citrato, Tris Citrato pH 7.0 y Poulik, el resto (18 enzimas) fueron monomórficas (Figura 15 15)) y solamente tres presentaron polimórfismo: MDH, Esterasa y PEP-B, B, resultado que indica muy poca variación. La actividad de las enzimas MDH y Esterasa, fue mayor con el buffer Tris Tris-MalatoEDTA pH 7.4 y la de PEP PEP-B B en el buffer Borato Discontinuo pH 8.0/8.6. respectiva va nomenclatura enzimática. enzimát La Figura 15 muestra las tres enzimas con su respecti En PEP-B se detectaron ron dos locus, con una distancia electroforética diferente, donde el primer loci es monomórfico y con una movilidad electroforética menor para las 236 cepas, y el segundo loci fue polimórfico.

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Las enzimas en las cuales se detectó actividad en M. roreri fueron evaluadas más de dos veces con el fin de comprobar la reproducibilidad de los resultados y confirmar los datos obtenidos.

Figura 15. Actividad enzimática de los locus a) MDH, b) Esterasas y c) PEP PEP-B, en los recuadros se delimita el locus PEPB PEPB-1 (E)) y el locus PEPB PEPB-2 (D), con su respectivo fenotipo electroforético: banda lenta (B), banda rápida (A) y las dos bandas en la misma muestra (C). En d) se presentan los tres loci monomórficos en

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orden descendente: PGM, ODH y GPI, representando el mismo patrón obtenido con las otras 15 enzimas monomórficas evaluadas. 5.5.3. Análisis de diversidad genética de las poblaciones de M. roreri en Antioquia El análisis estadístico de los datos de caracterización isoenzimática de los aislamientos de M. roreri de Antioquia, mediante el empleo del índice de Shannon y el porcentaje de loci polimórficos, reveló un nivel bajo de variabilidad genética de las poblaciones del hongo en esta zona cacaotera (Tabla 21). Al analizar de forma separada los resultados obtenidos para cada municipio, se observó que los aislamientos provenientes de Valdivia conformaron una población con la mayor diversidad genética según el índice de Shannon, Porcentaje de loci polimórficos, Número de alelos por locus y heterocigosidad promedio de individuos (I: 0.28%, %P: 75, A: 1.75 y H: 0.17) seguidos de aquellos aislamientos procedentes de Remedios (I: 0.27, %P: 50, A: 1.5 y H: 0.18). Las poblaciones con el más bajo índice fueron Nariño (0.03), Támesis (0.05) y San Jerónimo (0.05) con un 50% de loci polimórficos y el municipio de Tarazá, presentó el índice de diversidad más bajo correspondiente a 0.000. En general para todas las poblaciones, se pudo determinar el nivel de diversidad genética utilizando el índice de Shannon y Heterocigocidad promedio de individuos, indicando un bajo nivel de variabilidad genética de las poblaciones en el departamento (I =0.2, H=0.11). Al desglosar los resultados, se puede observar que los municipios de Valdivia y Remedios presentaron el mayor índice de diversidad genética, como se mencionó anteriormente.

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Tabla 21. Resultados del Índice de Shannon y porcentaje de loci polimórficos de las doce poblaciones evaluadas. (los valores más representativos sobresalen en cursiva). Municipio

Índice de Shannon

Apartado 0.13 Dabeiba 0.08 Remedios 0.27 Segovia 0.1 Maceo 0.1 Puerto Berrío 0.15 Nariño 0.03 Támesis 0.05 Tarazá 0 San Jerónimo 0.05 Valdivia 0.28 Chigorodó 0.12 Total 0.2 *%P: Porcentaje de loci polimórficos. *H: Heterocigocidad promedio de individuos. *A: Número de alelos por locus.

% P*

H*

A*

25 25 50 50 50 25 25 25 0 25 75 25 75

0.09 0.04 0.18 0.05 0.05 0.1 0.012 0.02 0 0.02 0.17 0.07 0.11

1.25 1.25 1.5 1.5 1.5 1.25 1.25 1.25 1 1.25 1.75 1.25 1.75

La prueba de homogeneidad fue significativa para los tres locus (MDH-X2= 192.3, P