TPNº 2 – Química Biológica II – 2011 Expresión y purificación de proteínas recombinantes Introducción: Los avances en los conocimientos básicos de química, bioquímica y biología molecular, sobre todo en el entendimiento del flujo de la información genética en las células permitieron que se desarrollen poderosas técnicas de ingeniería genética. La clonación de genes1 permite la obtención de copias idénticas de fragmentos de ADN insertados en una molécula de ADN de mayor tamaño (vector de clonación) que se puede introducir en una célula y autoreplicarse. Si el ADN insertado en ese vector de clonación es un gen se puede obtener además la expresión de la proteína codificada por el gen. Las moléculas de ADN formadas por fragmentos de ADN provenientes de otras moléculas unidos covalentemente se conocen como ADNs recombinantes y las proteínas codificadas en moléculas de ADNs recombinantes se conocen como proteínas recombinantes. Las proteínas recombinantes pueden ser expresadas y purificadas en distintos sistemas controlando muy bien el momento de la expresión. La purificación puede ser preparatoria o analítica. Las purificaciones preparatorias apuntan a producir una cantidad relativamente grande de proteínas para su uso subsecuente. Los ejemplos incluyen la preparación de productos comerciales como ser enzimas (por ej. lactasa), proteínas alimenticias (por ej. proteína de soja aislante) y hormonas (por ej. insulina). La purificación analítica produce una cantidad relativamente pequeña de proteína para ser usada en estudios bioquímicos, biofísicos, estructurales o propósitos analíticos, incluyendo la identificación, la cuantificación y estudios de la estructura de la proteína, modificaciones post-traduccionales y de la función. Para expresar y purificar una proteína recombinante existen distintos sistemas por los que podemos optar. Básicamente tenemos que elegir: el huésped en el que se expresará la proteína, el vector de expresión y el sistema de purificación (ver figura 1). Huéspedes: Los principales huéspedes que se usan para producir las proteínas son: bacterias, levaduras, hongos filamentosos, cultivos de células eucariotas y animales o plantas transgénicas. En los últimos años se han desarrollado sistemas libres de células que tienen la gran ventaja con respecto a la expresión en huéspedes celulares de ser mucho más rápidos, 2 horas contra 24 - 48 horas. Además se puede manipular el medio en el que se sintetizarán las proteínas y otorga mayor facilidad para la expresión de proteínas que pudieran resultar tóxicas a las células. La gran desventaja es que todavía son muy caros.
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un clon es una copia idéntica
Figura 1. Tomada y modificada de Koolman, Color Atlas of Biochemistry, 2nd Edition © 2005 Thieme. En ella se pueden ver el vector de expresión y la célula huésped. El vector de expresión (plásmido) se introduce a la célula huésped en un proceso que se denomina transformación luego de clonar en él el gen de interés. Las células se multiplican y se induce la expresión de la proteína en el citoplasma de las bacterias. Luego de romper las células se purifica la proteína de interés del extracto celular.
Cada huésped tiene características específicas, ventajas y desventajas que se deben evaluar y su elección dependerá fundamentalmente en que tipo de proteína necesitamos expresar, el uso que se le dará y que cantidad necesitaremos de la proteína recombinante. Las bacterias son los huéspedes más versátiles y los más usados. En particular Escherichia coli es usada universalmente por la facilidad de su manipulación genética, la sencillez y el bajo costo de su cultivo y la gran cantidad de proteínas que se pueden obtener en cultivos líquidos de la bacteria. Es el huésped que usaremos en este trabajo práctico. En general los sistemas de expresión usan a la bacteria como una fábrica celular y las proteínas recombinantes se recuperan desde el citoplasma de las células productoras. El principal problema es que es incapaz de introducir modificaciones posttraduccionales en las proteínas, como las fosforilaciones o glicaciones que llevan muchas proteínas de eucariotas. Otro punto muy importante a tener en cuenta en el momento de la elección del huésped es la toxicidad de la proteína que queremos expresar. Esto es de particular relevancia cuando se trata de proteínas que incluso pueden no ser tóxicas a bajas concentraciones, pero al momento en que se induce una hiperexpresión pueden producir alteraciones en la célula productora que afectan su crecimiento y por consiguiente el rendimiento en la expresión. Por otro lado, el lipopolisacárido que es el componente principal de la membrana externa de E. coli debe ser eliminado con gran eficiencia al momento de la purificación de proteínas que serán administradas a humanos ya que causa efectos adversos. Las cepas de E. coli más usadas son E. coli BL21 y cepas derivadas de BL21 que permiten una mejor expresión de proteínas de membrana, proteínas tóxicas o que tienen puentes disulfuros en su estructura.
Las expresión en bacterias Gram (+) es muy usada para obtener proteínas que se secretan al medio de cultivo y por consiguiente tienen una gran ventaja en el momento de la purificación ya que no hay que separarla de todas las proteínas citoplasmáticas. Los bacterias Gram (+) más usadas son Bacillus subtilis y Lactococcus lactis. L. lactis es una bacteria láctica (BAL), y es considerada un huésped noble ya que no se conoce ninguna cepa de esta especie bacteriana que sea patógena para humanos. Muchas BAL son consideradas generalmente como seguras y muchas son probióticas. Por ese motivo a la hora de producir proteínas que serán usadas en alimentos o en la industria farmaceútica L. lactis es muy confiable. Los sistemas de células eucariotas (levaduras, cultivos celulares o organismos transgénicos) permiten en general la introducción de diferentes modificaciones post-traduccionales a las proteínas recombinantes, pero son mucho más costosos, más difíciles de manipular y el rendimiento obtenido de la proteína pura es mucho menor (< masa de proteína obtenida/biomasa). Vectores de expresión: Una vez definido el huésped tenemos que elegir el vector de expresión que vamos a usar, lo primero que tenemos que ver es que sea compatible con el huésped. Los vectores de expresión son moléculas de ADN que se autoreplican en las células receptoras. En el trabajo práctico usaremos un plásmido derivado de un vector de expresión pET para E. coli. Los plásmidos son elementos genéticos extracromosomales que replican autónomamente. Contribuyen en gran medida a la plasticidad y diversidad de la genética bacteriana. Normalmente le aportan a la bacteria genes que si bien no son esenciales para su vida en algún momento le otorgan alguna ventaja con respecto a la bacteria que no lo tiene. Un ejemplo claro lo constituyen plásmidos que llevan genes para resistencia a antibióticos e incluso algunos pueden llevar un sistema genético que codifica para un péptido antimicrobiano y además le otorga a la célula portadora inmunidad al péptido. Todos los plásmidos cuentan con un origen de replicación, que es el sitio donde se inicia la replicación de la molécula, gobernada por lo que se denomina el replicón. Un replicón en el plásmido determina que se pueda replicar o no en la célula huésped y la cantidad de copias del plásmido que existirán en cada célula. Para poder seleccionar las células que tienen el plásmido, los vectores de expresión que se usan en biología molecular contienen normalmente un gen de resistencia a un antibiótico (marcador). El plásmido que usamos en el trabajo práctico como vector de expresión tiene un gen que codifica para una proteína que otorga resistencia a ampicilina. Los vectores de expresión más usados en E. coli tienen un promotor que controla la expresión del gen de interés que se denomina en nuestro caso T7lac. Estos plásmidos tienen un operador lac entre el promotor denominado T7 y el gen de interés. El promotor normalmente se encuentra entre 10 y 100 pares de bases antes de la secuencia de unión al ribosoma (RBS). La RBS tiene aproximadamente 54 nucleótidos e incluye la secuencia denominada Shine-Dalgarno
(SD) que interacciona con el ARN ribosómico en el inicio de la transcripción. Luego de la secuencia SD los vectores de expresión tienen intercalado un sitio de clonado múltiple cuya secuencia es reconocida por muchas enzimas de restricción2 y sirve para introducir mediante corte y ligación el gen de nuestro interés. El gen queda ubicado luego de la secuencia SD. Entre 5 a 13 bases más adelante (hacia el extremo 3´) se encuentra el codón de iniciación de la traducción cuya secuencia es AUG para la mayoría de los ARNm. Este codón codifica para el primer aminoácido de la proteína (metionina). A partir de acá tenemos los tripletes de nucleótidos que codifican cada codón que será reconocido por un ARNt específico según el código genético de E. coli hasta llegar al terminador de la transcripción o codón STOP.
RBS P -35 R LacI TTGACA(N)I7
-10 P
TT SD
AmpR
Ori
Trun3
T7lac TATAAT
START AUG (91 %)
STOP Codon UAAU
ARNm 5´UAAGGAGG 16S ARNr 3´AUUCCUCC
Representación esquemática del vector de expresión empleado el trabajo práctico. Figura 2.Fig.2Representación esquemática del vector de expresión empleado en elentrabajo práctico. La La transcripción se inicia en el promotor P en la dirección indicada por la flecha. El sitio de unión RBS consiste en la secuencia Shine-Dalgarno (SD) seguido por un espacio rico en A+T de aproximadamente 8 pares de bases. La secuencia SD interactúa con el final 3´del rRNA 16S durante la iniciación de la traducción. La transcripción se inicia en la posición +1, antes de la secuencia SD y finaliza en la secuencia terminadora TT. La traducción se inicia en el codón START y finaliza en el codón STOP.
En el plásmido se encuentra también el gen que codifica para la proteína represora LacI. Al promotor T7 se une específicamente la ARN-polimerasa del bacteriófago T7. El gen de la ARNpolimerasa del fago T7, bajo el control del promotor lacUV5 se incorpora al cromosoma de las bacterias huépedes, mediante un bacteriófago lisogénico denominado DE3. De hecho la cepa huésped que vamos a usar en el trabajo práctico es la BL21 (DE3), que indica que tiene el genoma del fago incorporado. El sistema funciona así: cuando no hay lactosa en el medio, el represor LacI codificado por el plásmido se encuentra unido a los promotores T7lac (que controla el gen de interés en el plásmido) y al promotor lacUV5 que controla la expresión de la polimerasa de T7 en el cromosoma. Ambos genes no se transcriben. Al momento que se agrega el inductor IPTG, éste se une al represor LacI que se despega de los promotores y se activa la transcripción de ambos genes, 2
Una enzima de restricción es aquella que puede reconocer una secuencia característica de nucleótidos dentro de una molécula de ADN y cortar el ADN en ese punto en concreto
primero el que codifica para la ARN polimerasa de T7. Apenas comienza a haber disponible polimerasa de T7, ésta se une al promotor fuerte T7 y comienza la trascripción del gen de interés. De hecho la polimerasa de T7 sólo transcribirá éste gen en la célula ya que es el único que posee el promotor específico. Más aún, si agregamos un inhibidor de la ARN-polimerasa de E. coli que no inhiba la ARN-polimerasa de T7, como el antibiótico rifampicina, lo que conseguiremos en la práctica es que el gen de nuestro interés sea transcripto casi exclusivamente por la célula. El ARNm transcripto en gran cantidad se une al ribosoma mediante la secuencia RBS y comienza la traducción de la proteína de interés. La proteína se acumula en el periplasma. Algunas veces en forma soluble, pero otras forma los denominados cuerpos de inclusión. Se cosechan las células del medio de cultivo por centrifugación y luego se las rompe por pulsos de ultrasonido o con el uso de una prensa de French3. Se centrifuga a alta velocidad para eliminar los restos celulares y la fracción de membrana y la proteína se purifica a partir del extracto celular soluble presente en el sobrenadante. Purificación de una proteína marcada con etiqueta: La adición de una etiqueta a la secuencia de una proteína, le otorga una afinidad obligatoria que no la tenía antes. La proteína recombinante “etiquetada” es generalmente la única proteína en la mezcla con esta afinidad, lo cual ayuda en la separación. Las etiquetas más usadas son la de histidinas o polihistidinas (etiqueta-His), la de glutation S-transferasa (etiqueta-GST) y la etiqueta FLAG. Todas permiten el reconocimiento por un anticuerpo4 específico y son fácilmente inmobilizadas en distintos tipos de soportes sólidos lo que facilita su purificación. La etiqueta-His consiste en introducir generalmente en los extremos de las proteínas una secuencia de al menos 6 histidinas consecutivas, que le otorga a la proteína afinidad hacia iones de níquel o cobalto. Inmovilizando los iones de níquel o de cobalto en una resina, se puede crear una herramienta que atrape específicamente por afinidad a las proteínas etiquetadas con histidina. Puesto que la proteína de interés es la única con una etiqueta-His interaccionará con el ión metálico de la matriz y el resto de las proteínas pasarán de largo, en teoría, a través de la columna. La proteína etiquetada luego será eluída, con una solución de imidazol, que compite con las proteínas etiquetadas ya que las histidinas tienen un anillo imidazólico en la cadena lateral. La proteína etiquetada de interés ahora es el componente de proteína principal en la mezcla eluída de la columna, y se puede separar fácilmente de cualquier contaminante indeseado por un segundo paso de la purificación, por ejemplo cromatografía de exclusión por tamaño o RP-HPLC. Además del etiquetado, muchas proteínas son fusionadas a otras proteínas para facilitar su purificación, se recuperan de los extractos celulares como proteínas de fusión. Luego se cortan con
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Dispositivo usado para romper la membrana de las celulas pasandolas a traves de una válvula estrecha a alta presión. Los anticuerpos son proteínas que tienen una alta especificidad de reconocimiento de moléculas biológicas.
enzimas proteolíticas que reconocen secuencias de aminoácidos específicas, como trombina, factor Xa o enteropeptidasa para recuperar la proteína tal cual es. El proceso de purificación se monitorea mediante electroforesis SDS-PAGE. Se siembran en un gel fracciones de los extractos celulares y de cada paso de purificación, concentración o diálisis. Se siembran simultáneamente patrones de masa molecular conocida y se puede estimar la masa de la proteína recombinante. Los geles se revelan con Coomasie Blue. Una vez obtenida la proteína pura debemos estar seguros del grado de pureza, de la identidad y de la integridad de la misma. Para ello debemos correr en una electroforesis SDS-PAGE una buena cantidad de la proteína pura y revelar el gel con plata. La tinción con plata es la más sensible y si vemos una sola banda en el gel, correspondiente a nuestra proteína podemos decir que la hemos purificado a homogeneidad. Además la muestra debe ser enviada a espectrometría de masa, para determinar que se trata de nuestra proteína y que se encuentra completa. Un único pico en una espectrometría de masa es también un buen criterio de pureza. Durante toda la purificación debemos cuidar a nuestra proteína. Las proteínas pueden agregar y precipitar si se encuentran en condiciones que no favorecen su solubilidad. Por ello se deben elegir con cuidado los tampones y el pH que se utilizan. Hay que controlar que no se forme un precipitado blanco que podría indicar que nuestra proteína ha agregado en esas condiciones. Normalmente se suelen agregar sustancias estabilizantes como glicerol y concentraciones altas de sales pero cada proteína se comporta de manera diferente y muchas veces es cuestión de prueba y error hasta que encontramos las mejores condiciones para conservar y proteger a nuestra proteína.
PARTE PRÁCTICA OBJETIVOS: En este práctico se llevará a cabo la expresión y purificación de la enzima Trun-3. Ésta es una variante citosólica de la enzima NADH deshidrogenasa-2 de E. coli (NDH-2), una flavoproteína de membrana que forma parte de la cadena respiratoria. Por medio de mutagénesis sitio-dirigida, se eliminó la región C-terminal de NDH-2, responsable de la unión de la enzima a la membrana. La adición de una etiqueta a la proteína da a la misma una afinidad obligatoria que no tendría de otra manera. En nuestro caso, se utilizará el plásmido pET que permite la fusión del gen que codifica para NDH-2 con una secuencia que codifica para una cola (o etiqueta) de polihistidina (6xHis) hacia el 5´ del codón de iniciación (pETtrun-3). Esto permitirá la purificación de la enzima por cromatografía de afinidad (columna de Ni-NTA). La expresión del gen está bajo el control del promotor T7lac, por lo que el vector recombinante fue transformado en la cepa BL21 (DE3).
PROTOCOLO DE TRABAJO: 1.- Control de inducción de Trun-3 con IPTG Con el fin de observar la inducción con IPTG de la expresión de Trun-3 en un cultivo de E. coli BL21 (DE3) transformado con el plásmido pETrun-3 se llevara a cabo el siguiente protocolo: De un cultivo en fase exponencial de crecimiento de la cepa E. coli BL21 (DE3) tomamos 2 alícuotas de 1 ml y les agregamos:
Alicuota 1: control (sin ningún agregado) Alicuota 2: 10 µl de solución 10 mM de IPTG
Incubar una hora a 37 ºC con agitación. Tomar 100 µl de cada cultivo, centrifugar a 8000 rpm 1 minuto y descartar el sobrenadante. Resuspender las células en 10 µl buffer de siembra para SDS-PAGE. Agregar 10 µl de agua destilada. Calentar a 95 ºC 10 min y almacenar para su posterior análisis por electroforesis.
2.- Expresión de la proteína Trun-3 y preparación del extracto celular
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Iniciar 1 L de cultivo de la cepa BL21 transformada con el plásmido pET Trun-3.
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Luego de 2 hs, cuando la DO del cultivo es aproximadamente 0,3, inducir la expresión de la proteína agregando el agente inductor isopropil-1-tio-b-D-galactopiranosido (IPTG) 0,1 mM. Incubar a 37 ºC durante 4 hs.
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Cosechar las células, centrifugando a 6500 g durante 10 min. Lavar las células con buffer fosfato de potasio 50 mM, pH 7,5 (KPB) (resuspensión y centrifugación) dos veces.
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Resuspender en 10 ml las células con KPB (100X) y lisarlas, pasándolas tres veces a través de la Prensa French.
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Una vez obtenido el lisado celular, centrifugar a 30000 g durante 1 h para eliminar la fracción de membrana.
3.- Purificación: Se llevará a cabo en columna, empleando una resina Níquel-IMAC (Cromatografía de Afinidad por Metales Inmovilizados). Se procederá de la siguiente manera
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Lo primero que debemos hacer es equilibrar la columna en el buffer de partida. Para ello lavar la columna con 3 volúmenes de KPB. Luego equilibrar con 3 volúmenes de buffer de lavado 10 mM.
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Sembrar 100 µl de la muestra en la columna
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Separar las proteínas que no interaccionaron con la resina agregando 3 volúmenes de buffer de lavado 10 mM (Lavado 1)
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Separar las proteínas que interaccionan débilmente con 5 volúmenes de buffer de lavado 20 mM (Lavado 2).
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Eluir la proteína Trun-3 con 3 volúmenes de buffer de elución 100 mM. (Eluido)
IMPORTANTE: Todas las fracciones serán almacenadas para seguir el proceso de purificación mediante SDS-PAGE. Esto nos permitirá monitorear las proteínas presentes en cada paso.
Composición de Buffers usados en la purificación de la proteína: KPB: buffer fosfato de potasio 50 mM, pH 7,5. Buffer de lavado 10 mM: KPB + NaCl 1 M + glicerol 10% + imidazol 10 mM. Buffer de lavado 20 mM: KPB + NaCl 1 M + glicerol 10% + imidazol 20 mM. Buffer de elución 100 mM: KPB + NaCl 1 M + glicerol 10% + imidazol 100 mM. NaCl: previene interacciones iónicas. Glicerol: previene interacciones hidrofóbicas entre proteínas. Imidazol: se une a Ni-NTA y compite con los residuos de Histidina de la cola 6xHis. 4.-
4.- Seguimiento de la purificación de Trun-3 mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
Para visualizar las proteínas presentes en cada paso de la purificación de Trun-3 se sembraran las distintas fracciones colectadas durante la inducción y purificación de la proteína en un gel de 15 calles de SDS-PAGE discontinuo al 10% de acrilamida.
Calle 1: Alícuota 1 control de E. coli sin inducir Calle 2: Alícuota 2 E. coli inducido con IPTG Calle 3: Lavado 1 de la columna de afinidad (Proteínas del extracto que no interaccionan) Calle 4: Lavado 2 de la columna de afinidad (Proteínas del extracto que interaccionan débilmente) Calle 5: Eluido de la columna de afinidad (Proteínas del extracto que interaccionan fuertemente) Calle 6: Patrón de masas moleculares Procedimiento 1- Preparar el gel de corrida como se vio en el práctico de electroforesis de Química Biológica I. 2- Sembrar las calles en el orden que se indica mas arriba 3- Correr el gel en la cuba de electroforesis durante 1 hora a 180 VOLTS 4- Colocar el gel en la solución fijadora por 15 min. 5-Tratar con la solución colorante durante 20-30 min. 6-Enjuagar con agua destilada 1 vez 7-Tratar el gel con el líquido de lavado hasta eliminación del exceso de colorante y hasta el adecuado contraste de las bandas con el fondo. 8-Una vez finalizada la decoloración el gel puede secarse para un registro definitivo.
Reactivos para electroforesis
¡¡¡ !!!
Solución stock de acrilamida-bis-acrilamida (30:08) Acrilamida 30 g Bis- acrilamida 0,8 g NEUROTOXICO Agua bidestilada c.s.p. 100 ml Filtrar por filtro Whatman Nº1 Buffer Tris-HCL 3M, pH 8,8 (1x) Tris base 36,3 g HCL 1 M 48 ml Agua bidestilada c.s.p. 100 ml Buffer Tris-HCL 0,5M, pH 6,8 (1x) Tris base 6g HCL 1 M 48 ml Agua bidestilada c.s.p. 100 ml Solución SDS 10% SDS Agua bidestilada
10 g 100 ml
Buffer de corrida: Tris-glicina, pH 8,3 (1x) Tris base 2,1 g Glicina 1M 10,7 g SDS 10% 7 ml Agua destilada c.s.p. 700 ml Buffer de muestra (1x) BufferTris-HCL 0,5M pH 6,8 Glicerol 100% SDS 10% Azul de bromofenol 1% β-mercaptoetanol 100% Proporción de carga Muestra Buffer de muestra Agua bidestilada
180 µl 60 µl 120 µl 3 µl 12 µl
10 µl 12,4 µl 17,5 µl
Preparación del gel separador 10% Agua bidestilada 2,55 ml Buffer Tris-HCl 3M, pH 8,8 0,65 ml Sol. stock de acril.-bis-acril. (30:08) 1,7 ml SDS 10% 50 µl Persulfato de amonio 10% 50 µl TEMED 2 µl Debe prepararse luego del armado de todo el sistema, en el momento de usar
Preparación del gel concentrador 5% Agua bidestilada Buffer Tris-HCl 0,5M, pH 6,8 Sol. stock de acril.-bis-acril. (30:08) SDS 10% Persulfato de amonio 10% TEMED
1,15 ml 0,5 ml 0,33 ml 20 µl 20 µl 2 µl
Coloración del gel con Coomassie Blue R-250 Reactivos Fijador Metanol 50 ml Acido acético 10 ml Agua destilada 40 ml Coomassie Blue R-250 0.3 g Metanol 40 ml Acido acético 10 ml Agua destilada 50 ml Líquido de lavado Metanol Acido acético Agua destilada
40 ml 10 ml 50 ml
NOTAS DE SEGURIDAD Algunos de los materiales usados en el laboratorio representan graves riesgos para la salud. Se recomienda utilizar los elementos de protección adecuados al manipularlos (guantes, barbijos, anteojos de protección). A continuación se mencionan brevemente la toxicidad y primeros auxilios. Ante un accidente se debe contactar al medico en todos los casos. Metanol: Manipular bajo campana. Fácilmente inflamable. Toxico por inhalación, ingestión y en contacto con la piel. En caso de contacto lavar abundantemente con agua. En caso de ingestión no inducir el vomito, tomar un vaso de whisky (el etanol compite con el metanol y lo desplaza). Acrilamida: Utilizar barbijos, guantes y lentes. La sustancia irrita los ojos, la piel y el tracto respiratorio. Puede causar efectos nocivos en el sistema nervioso y el hígado. En caso de contacto lavar con abundante agua y en caso de ingestión inducir el vómito. Beta-mercapto etanol: Manipular bajo campana. Toxico por inhalación, ingestión y a través del contacto con la piel. Severo irritante ocular. Se absorbe fácilmente por piel. TEMED: Fácilmente inflamable. Nocivo por inhalación y por ingestión. Provoca quemaduras. En caso de contacto lavar con abundante agua. En caso de ingestión no inducir vómito. Persulfato de amonio: Nocivo por ingestión. Irrita los ojos, la piel y las vías respiratorias. Inhalación: retirarse al aire fresco. Ingestión: NO INDUCIR EL VOMITO. Dar cantidades grandes de agua. Contacto con la Piel y ojos: lave inmediatamente con agua abundante
